Principes généraux Méthodes d`étude
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Hématopoïèse Principes généraux Méthodes d’étude L. Garçon [email protected] Le sang Paraît totalement liquide, mais est composé de 2 phases : - éléments figurés : (≈ 45%) cellules en suspension - plasma : liquide jaune ambrée Le sang Prélèvement sanguin • Prélèvement de sang veineux (ou artériel) pour réaliser des examens au laboratoire • réalisé par une infirmière, un technicien de laboratoire ou un biologiste (médecin ou pharmacien) • Choix du tube ++++ • identification du prélèvement +++ (Nom prénom, date de naissance du patient) • Feuille de demande d’examen (identification patient, nature des examens, renseignements cliniques) Le sang Prélèvement sanguin • Nombreux tubes de prélèvements « sec » « anticoagulants » (EDTA, citrate, héparine…) identifiés par la couleur de leur bouchon choix en fonction des analyses à effectuer (sinon examen non réalisable) • Deux types de liquides obtenus sur prélèvement sanguin : tube avec « anticoagulant » : plasma tube « sec » : sérum (= partie du plasma qui reste liquide après coagulation) Coagulation = formation d’un caillot pour arrêter les saignements Tube avec anticoagulant (EDTA, citrate) Sédimentation ou Sang total PLASMA Centrifugation ELEMENTS FIGURES Tube sec (sans anticoagulant) Sérum Sang total 30 min Caillot 100% Plasma 45% • Globules Blancs • Plaquettes Éléments figurés • Globules rouges Cellules : éléments figurés Les globules blancs (ou leucocytes) Défense immunitaire innée • présente dès la naissance • non spécifique : ne tient pas compte de l’agent combattu • rapide Leucocytes impliqués : • monocytes • polynucléaires neutrophiles • lymphocytes NK Les globules blancs (ou leucocytes) Défense immunitaire adaptative • acquise, au fil des ans en fonction des pathogènes rencontrés • spécifique : reconnaissance de l’agent combattu • retardée • mise en mémoire : réponse plus rapide et efficace en cas de deuxième contact (utilisé pour la vaccination) Leucocytes impliqués : • lymphocytes B : synthèse d’anticorps • lymphocytes T Les différents éléments figurés du sang: Les leucocytes (1) Défense de l’organisme neutrophiles 1.5 à 7G/L (bactéries, levures) Durée de vie courte: 6-8 heures (sang) < 3 jours (tissus) Défense de l’organisme Polynucléaires éosinophiles (Parasites, Allergies) 0.05 à 0.5G/L Durée de vie courte: 8-12 heures (sang) < 10 jours (tissus) basophiles < à 0.1G/L Inflammation et allergie Globules blancs : polynucléaire neutrophile (PNN) • Cellule à noyau polylobé • Granulations neutrophiles • Durée de vie courte dans le sang (6-8 h) • Diamètre ~ 15 microns • Défense innée (infections bactériennes) • Peut passer dans les tissus vers les sites inflammatoires • Capable de phagocytose (= capture et ingestion de particules solides du milieu extérieur ; mécanisme essentiel de la défense innée) Globules blancs : polynucléaire éosinophile (PNE) • Cellule à noyau bilobé • Granulations éosinophiles (< grains fixent le colorant acides : l’éosine) • Demi-vie courte dans le sang (<12h) • Passage tissulaire ++ (8-10 jours) peau, poumon, tractus digestif • Hypersensibilité immédiate et retardée = réactions allergiques • Défense innée contre les parasites Globules blancs : polynucléaire basophile (PNB) • Cellule à noyau bilobé souvent masqué par les grains • Grosses granulations métachromatique (< grains fixent le colorant basophiles) • Hypersensibilité immédiate et retardée (réactions allergiques) Les différents éléments figurés du sang: Les leucocytes (2) Défense de l ’organisme, surveillance immunitaire Monocytes 0.1 à 1 G/L Durée de circulation courte (2 jours) Migration tissulaire (Macrophages) Natural Killer Lymphocytes Immunité cellulaire Cellule T 1.5 à 4 G/L Cellules B Immunité humorale Les différents éléments figurés du sang: Globules rouges et plaquettes Plaquettes Hémostase (« primaire ») Durée de vie 8-11 jours 150 à 400 G/L Erythrocytes Transport de l’oxygène aux tissus Durée de vie 120 jours 4.2 à 6 T/L Les globules rouges (ou hématies ou érythrocytes) * Disque biconcave déformable * Diamètre : 7-8 microns (8µ) * Épaisseur : 3 microns (3µ) 1 micron = 0,000001 mètres (10-6 m) Diamètre d’un cheveu ~ 80 microns (μ) * Durée de vie : 120 jours * GR jeune : réticulocyte Les plaquettes (ou thrombocytes) * Durée de vie : 8 à 12 jours * Forme de disque * Diamètre : 1,5 µ * Épaisseur : 0,5 à 2µ 1 micron = 0,000001 mètres (10-6 m) Globule rouge : 8 microns Diamètre d’un cheveu ~ 80 microns (μ) Les plaquettes (ou thrombocytes) • Formation du « clou plaquettaire » pour colmater les blessures vasculaires => activation de la cascade de la coagulation aboutissant au caillot sanguin Définition de l’hématopoïèse Morphologies différentes Expressions Géniques différentes Fonctions différentes elles sont figées dans leur différenciation Elles proviennent toutes d’une même cellule souche Hématopoïèse: ensemble des processus hiérarchiques permettant une production régulée ET constante des différents éléments figurés du sang à partir d’une cellule souche hématopoïétique Erythrocytes: 200.109 par jour PN Neutrophiles: 50.109 par jour Plaquettes: 100.109 par jour Représentation schématique de l’hématopoïése LT-HSC (Long-Term-HSC) Cellules souches ST-HSC (Short-Term HSC) CLP Common Lymphoid progenitor CMP Common myeloid progenitor MEP Mega-erythroid progenitor GMP Ganulo-monocytic progenitor Progéniteurs Précurseurs MATURATION TERMINALE: Acquisition des propriétés fonctionnelles Cellules matures Erythrocytes Plaquettes O R G A N E S Polynucléaire éosinophile Polynucléaire neutrophile Mastocyte Monocyte Lymphcyte B Lymphcyte T H E M A T O P. S A N G Quatre compartiments cellulaires auto renouvellement cellules souches progéniteurs précurseurs cellules matures Lieu de l’hématopoïèse: deux vagues successives LB BFU-E CLP LT CSH MEP CMP GMP Hématopoïèse définitive Foie 16j Sac vitellin 27j Aorte Gonade Mésonéphros Hématopoïèse primitive Potentiel - myéloïde - érythroïde 30j MK Plaquettes P. éosinophiles P. basophiles P. neutrophiles Monocytes Rate 20 sem Naissance Lieu de l’hématopoïèse Lieux de l’hématopoïèse après la naissance Où ? Dans les organes hématopoïétiques Moelle osseuse = os plats 20% : crâne 30% : thorax (sternum, côtes, vertèbres, omoplates) clavicules, 40% : rachis lombaire et ceinture pelvienne (sacrum, os iliaques) 10% : fémur => Myélopoïèse et lymphopoïèse B Lieux de l’hématopoïèse Où ? Dans les organes hématopoïètiques Thymus =>Lymphopoïèse T(différenciation primaire) Organes lymphoïdes secondaires * ganglions, rate, amygdales, intestin, bronches, glandes salivaires, peau => Lymphopoïèse B (maturation) La moelle osseuse hématopoïétique Possibilité d’hématopoïèse extramédullaire chez l’adulte: PATHOLOGIQUE Exemple 1: La splénomégalie myéloïde (syndrome myéloprolifératif) - Fibrose médullaire - Hématopoïèse extramédullaire (rate+++) Exemple 2: hémolyse constitutionnelle Thoracique, vertébrale (compression), hépatique, splénique Syndrome thalassémique+++, drépanocytose, Déficit en PK... Les cellules souches hématopoïétiques LT-HSC (Long-Term-HSC) Cellules souches ST-HSC (Short-Term HSC) CLP Common Lymphoid progenitor CMP Common myeloid progenitor Progéniteurs Précurseurs MEP Mega-erythroid progenitor GMP Ganulo-monocytic progenitor MATURATION TERMINALE: Acquisition des propriétés fonctionnelles Cellules matures Erythrocytes Plaquettes O R G A N E S Polynucléaire éosinophile Polynucléaire neutrophile Mastocyte Monocyte Lymphcyte B Lymphcyte T H E M A T O P. S A N G La cellule souche hématopoïétique Till et Murdoch (1961) Irradiation sublétale 100% Mortalité (aplasie) 5.106 cellules Survie: -Reconstitution hématopoïétique -Obtention de colonies spléniques multipotentes - Cellule rare, représentant 0,01 à 0,05% des cellules médullaires - Non identifiable cytologiquement (morphologiquement) -Non adhérente dans la moelle osseuse - Capable cependant de générer toute l’hématopoïèse tout au long de la vie -Source cellulaire des greffes en hématologie (elles peuvent se congeler dans l’azote liquide) Concept de cellules souches Deux propriétés fondamentales in vivo: AUTORENOUVELLEMENT Maintien d’un pool de cellule souches Production d’une cellule fille identique POOL DE CSH (90%) Prolifération G1/S/G2/M Autorenouvellement Division asymétrique Quiescence G0 DIFFERENCIATION multipotente Production régulée d’éléments matures Différenciation Progéniteur engagé Hiérarchie de cellules « souches » selon l’étendue de cette différenciation Importance de l’environnement cellulaire: Notion de niche hématopoïétique -L’hématopoïèse ne se fait pas partout en condition physiologique: chez l’homme, après la naissance, elle se fait dans la moelle osseuse car le microenvironnement lui est favorable - Plusieurs partenaires: A- Eléments cellulaires: -Ostéoblastes -Ostéoclastes -Cellules mésenchymateuses -Cellules SN sympathique -Fibroblastes -Cellules endothéliales -Adipocytes B- Matrice extracellulaire: protéoglycane, collagène, fibronectine.... C- Chémokines, facteurs de croissance (paracrine/membranaire), hormones (PTH...) D- Facteurs environnementaux (PO2, Calcium...) Niche endostéale Ncad/Beta catenine VCAM Wnt1 TPO/Mpl SCF/c-kit Ang1/Tie2 Niche vasculaire Cellules endothéliales nombreuses Chémokines (CXCL-12/SDF1) MEC CSH Quiescente CSH En cycle Fibroblastes Ostéoclastes Ca2+ Progéniteurs Adipocytes Ostéoblastes Travées SNS Cellules souches mésenchymateuses Ca2+ Po2 Le homing des CSH Greffe de cellules souches hématopoïétiques: injection par voie IV de cellules souches hématopoïétiques: - Autologue: autogreffe: support transfusionnel Exemple: myélome multiple Traitement intensif++ Aplasie très prolongée Recueil de CSH Chimiothérapie de réduction Colonisation de la MO Production de cellules matures Sortie d’aplasie - Non autologue: allogreffe: Remplacement d’une système hématopoïétique pathologique d’un receveur par un système hématopoïétique d’un donneur sain, effet immunologique antitumoral Graft Versus Leukemia. * Donneur compatible intrafamilial/fichier * Sang de cordon Obtention des CSH Par ponction de moelle osseuse Par prélèvement de sang placentaire Par prélèvement de cellules souches périphériques: mobilisation dans le sang après chimiothérapie/Facteur de croissance G-CSF: Cellule endothéliale Cellules réticulaires productrices de SDF1 Cellules souches mésenchymateuses CSH SDF-1 Ostéoblaste CXCR4 MEC Plerixafor Sortie sanguine des CSH G-CSF Cytaphérèse Exploration des CSH humaines - Cellules rares dans la moelle osseuse - Ne se reconnaissent pas morphologiquement -Se définissent par des propretés fonctionnelles -AUTO RENOUVELLEMENT: uniquement in vivo Comment les identifier? Comment les quantifier? Comment les étudier? 1- Reconstitution hématopoïétique multilignée à long terme/cellule multipotente - Lymphoïde - Myéloïde (GR-Plaquettes-lignée granulomonocytaire) CSH (Moelle) In vivo: Xénogreffe Etude de la reconstitution hématopoïétique à 6 mois Présence de cellules hématopoïétiques humaines dans la moelle/rate de souris Irradiation subléthale cellules hématopoïétiques humaines NOD-SCID CD45 humain CSH (Moelle) In vitro: LTC-IC 5 à 10 semaines Cellules stromales MS5 Tests clonogéniques Milieu semisolide + Facteurs de croissance (EPO, TPO, GM-CSF, SCF) 1 cellule LTC-IC/100000 Colonies de GR, de GB, ou des deux (mixtes) 2- Reconnaissance de l’expression de marqueurs de surface: le CD34+ (Glycosialine) HSC Progéniteurs Cellules matures Différenciation CD34 1% des cellules médullaires Détection et quantification par cytométrie en flux Anticorps anti CD34 Couplé à un fluorochrome CD34 Sang placentaire Cytaphérese Quantification des CD34+ circulantes Sang de cordon - Cytaphérèse Excitation Emission Perspectives des CS en médecine régénérative CD34+ In vivo CD34+ In vitro Différenciation/prolifération +++ Quiescence +++ Autorenouvellement +++ Différenciation/prolifération +++ Quiescence Autorenouvellement – (transitoire) Différence=microenvironnement cellulaire=NICHE Intérêt dans le futur de disposer in vitro d’un modèle de cellules souches « immortelles » capables de proliférer à l’état indifférencié de façon illimitée - Banques de CSH - Production in vitro de GR /plaquettes fonctionnelles (thérapie transfusionnelle) - Etude de pathologies rares =La révolution des iPSCs Cellules souches reprogrammées Shinya Yamanaka Cell, 131, 861-872, November 30, 2007 Pluripotence Oct4/KLF4/c-Myc/Sox2 Endoderme Ectoderme Cellules somatiques iPSCs Mésoderme Renouvellement HEMATOPOÏESE Pourquoi des iPSCs? 1- Intérêt des iPSCS comme source illimitée de cellules porteuses de la mutation dans les pathologies constitutionnelles de l’érythrocyte Modélisation Criblage de molécules Thérapie génique 2- Intérêt des iPSCs comme source illimitée de cellules matures fonctionnelles en thérapie cellulaire/transfusionnelle: production de GR in vitro à but transfusionnel. Le compartiment des progéniteurs LT-HSC (Long-Term-HSC) Cellules souches ST-HSC (Short-Term HSC) CLP Common Lymphoid progenitor CMP Common myeloid progenitor Progéniteurs MEP Mega-erythroid progenitor GMP Ganulo-monocytic progenitor Précurseurs MATURATION TERMINALE: Acquisition des propriétés fonctionnelles Cellules matures Erythrocytes Plaquettes O R G A N E S Polynucléaire éosinophile Polynucléaire neutrophile Basophile Monocyte Lymphcyte B Lymphcyte T H E M A T O P. S A N G Les progéniteurs hématopoïétiques Cellules restant rares dans la moelle osseuse (0,5 à 1%) Non identifiables cytologiquement Haut potentiel de prolifération Ne s’autorenouvellent pas PROLIFERATION Myéloïde Lymphoïde CFU- GEMM Ou CMP Potentialité large CLP Common myeloid progenitor CFU- GM Ou GMP Granulo Monocytic progenitor CFU- M CFU- G Common Lymphoid progenitor MEP Mega-Erythro Progenotor BFU-E Monopotente CFU-E Mégacaryopoïèse Monocytes Polynucléaires Précurseurs: Maturation terminale Erythropoïèse MATURATION DIFFERENCIATION LT LB Bipotente CFU-MK NK Cellules identifiables cytologiquement Les progéniteurs hématopoïétiques Identification par tests clonogéniques en milieu semi-solide + cytokines 7 à 14 jours Colonies hématopoïétiques 14 jours Intermédiaires entre les cellules souches et les cellules matures CFU = Colony Forming Unit CFU-GM Le compartiment des précurseurs: la maturation terminale LT-HSC (Long-Term-HSC) Cellules souches ST-HSC (Short-Term HSC) CLP Common Lymphoid progenitor CMP Common myeloid progenitor Progéniteurs Précurseurs MEP Mega-erythroid progenitor GMP Ganulo-monocytic progenitor MATURATION TERMINALE: Acquisition des propriétés fonctionnelles Cellules matures Erythrocytes Plaquettes O R G A N E S Polynucléaire éosinophile Polynucléaire neutrophile Mastocyte Monocyte Lymphcyte B Lymphcyte T H E M A T O P. S A N G Le compartiment des précurseurs et la maturation terminale obtention de cellules matures qui ne se divisent pas Majorité des éléments médullaires: 95% Cellules MONOPOTENTES Amplification initiale puis diminution du nombre de mitoses Acquisition des propriétés fonctionnelles: reconnaissance morphologique Lymphopoïèse B/T : cf. cours dédié Granulopoïèse: production des polynucléaires neutrophiles, éosinophiles et basophiles Mégacaryopoïèse: production de plaquettes Erythropoïèse: production d’érythrocytes (GR) Granulopoïèse neutrophile Myéloblaste Promyélocyte Progéniteurs <1% Myélocyte Précurseurs 40-60% Métamyélocyte PNN 40-60% Moelle osseuse: 12 jours Sang Potentiel mitotique: 4 mitoses Réserve médullaire (mobilisable: CTC, infections) :90% 3 compartiments: Pool marginal (mobilisable: CTC, effort, repas, stress, tabac):50% Pool circulant (Hémogramme): 50% M O S A N G Régulation de la granulopoïèse -Facteurs intrinsèques -Facteurs de transcription: AML1, CEBPα, PU-1.... -Epigénétique -MiRNA -Facteurs de croissance --SCF, Flt3: non spécifique -GM-CSF: acrion sur progéniteurs GM -G-CSF: action sur la lignée granuleuse Infection, inflammation G-CSF en thérapeutique: aplasie/mobilisation de CSP Programme de différenciation Expression des gènes myéloïdes - activation de récepteurs membranaires - Survie - Prolifération Exemple de dérégulation: Leucémies aigues myéloblastiques Évènement 1: Dérégulation de facteurs de transcription Ex: translocation t(8;21) aboutissant à une protéine de fusion AML1-ETO: Perte de la fonction de AML1, important dans la différenciation myéloïde Évènement 2: Mutations des voies de signalisation des activées par les facteurs de croissance Ex: Duplication Flt3: activation constitutive de voies de signalisation anti-apoptotiques et proligératives Prolifération clonale d’une cellule Immature bloquée dans sa différenciation ENVAHISSEMENT MEDULLAIRE Etouffement de l’hématopoïèse normale Mégacaryopoïèse: production de plaquettes Moelle osseuse ? Sang Fragmentation du cytoplasme Facteur Willebrand GpIIb/IIIa GPIb/VI PF4 Progéniteur: rares++ CD34 PROCESSUS ENDOMITOTIQUE MEP Progéniteur bipotent Précurseur monopotent Erythrocytes Plaquettes - Division nucléaire Absence de cytokinèse Cellules de très grande taille Peu nombreuses Polyploïdes De 2N jusqu’à 16-32N 1MK16N donne plus de 1000 plaquettes Hémostase primaire Régulation de la mégacaryopoïèse -Facteurs intrinsèques -Facteurs de transcription:GATA1, NFE2, FOG1, AML1.... -Epigénétique -MiRNA -Facteurs de croissance --SCF, Flt3: non spécifique -TPO: thrombopoïetine Hormone produite par le foie Stimule la production plaquettaire Dégradée par la masse de MKs et de plaquettes: feed-back négatif Implication en thérapeutique: Agonistes de la TPO Programme de différenciation Expression des gènes MK - activation de récepteurs membranaires - Survie - Prolifération TPO Erythropoïèse: production d’érythrocytes (GR) Progéniteur <1% Proérythroblaste Erythroblaste basophile Erythroblaste polychromatophile Précurseurs 20-40% Erythroblaste acidophile Réticulocyte 24 à 48H 40-60% GR Sang Moelle osseuse: 6 jours Potentiel mitotique: 4 mitoses CD71 Glycophorine A R-EPO Synthèse hémoglobine++ CD34 PERIPHERIQUE:Perte de GR matures dans le sang (ex: hémolyse) Anémie: baisse de l’hémoglobine: 2 mécanismes Augmenté TAUX DE RETICULOCYTES CENTRALE: Diminution de la production médullaire Non Augmenté Particularité de l’érythropoïèse: organisation anatomique en ilot érythroblastique (se voit mal sur le myélogramme) Macrophage central, nourricier Erythroblastes les plus immatures au centre Rôle essentiel dans la régulation de l’érythropoïèse: - Le macrophage apporte des nutriments et du Fer - Régulation de l’apoptose selon les besoins de l’organisme -Phagocyte les noyaux après expulsion Régulation de l’érythropoïèse 1- Facteurs de transcription/miRNA/Epigénétique (GATA1, KLF1, TAL1....) 2- Facteurs de croissance hématopoïétique 3- Facteurs vitaminiques: Vitamines B9, B12 avant tout 4- Fer et autres éléments de la synthèse de l’hémoglobine 5-Autres (TSH, cortisol, angiotensine….) Facteurs de croissance hématopoïétique Érythropoïèse précoce Progéniteurs Érythropoïèse tardive Précurseurs TNF-IFN MEP BFU-E p CFU-E BFU-E m IL3 Erythrocyte SCF Erythropoietine Erythropoïétine élément clé de l’érythropoïèse 1- Hormone glycopeptidique produite majoritairement par le rein 2- Production sous le contrôle de l’hypoxie locale 3- Agit en se fixant sur des récepteurs spécifiques à la surface de cellules cibles 4-Facteur majeur de régulation de l’érythropoïèse Anémie: baisse du taux d’Hb Hypoxie des cellules endothéliales juxta tubulaires Augmentation de la production de GR Ex1. IRC (cl<30mL/mn) Ex2. Ins. resp.chron. Stimulation de l’érythropoïèse médullaire Erythropoïèse EPO PO2 Augmentation de la Production d’EPO EPO ANEMIE Erythropoïèse POLYGLOBULIE Examens permettant d’explorer l’hématopoïèse (hors organes lymphoïdes secondaires) Avant tout • Étude des cellules matures dans le sang : Numération Formule Sanguine (NFS), Réticulocytes • Étude cellules de la moelle osseuse : Myélogramme (cytologie) Biopsie osteo-medullaire (histologie ) LEUCOCYTES La Numération Formule Sanguine 4-10 G/L (adulte) (soit 4 000 à 10 000 /mm3) Globules rouges Cf. cours dédié JAMAIS EN % PLAQUETTES 150-400 G/L = 150000 à 400000/mm3 Visualisation de l’hématopoïèse médullaire Myélogramme : principe et technique = analyse cytologique quantitative et qualitative des frottis de moelle osseuse réalisés après ponction/aspiration * Sous anesthésie locale (patch Emla ou xylocaïne) * Au niveau du sternum ou en iliaque en cas de contre-indications * Ponction à l’aiguille fine de la moelle osseuse puis aspiration(s) pour étalement sur lame (cytologie) et examens complémentaires Ponction sternale au niveau du manubrium Ponction de la crête iliaque en cas de contre-indication (rares) ou de biopsie associée frottis puis coloration (MGG, peroxydase, estérase) et décompte au microscope Myélogramme : répartition normale des différentes lignées Blastes indifférenciés 0,5 – 1 % cellules souches, progéniteurs Précurseurs et cellules matures myéloïdes mégacaryocytaires présents érythroblastiques 8 – 25% granuleuses 55 – 75% monocytaires 0 – 5% Cellules matures lymphoïdes lymphocytes 3 – 15% plasmocytes 0 – 2% Biopsie osteo-medullaire(BOM) * Prélèvement d’une carotte d'os (> 1cm) * Sous anesthésie locale en crête iliaque postérieure * Fixation (Bouin) puis décalcification, déshydratation, inclusion en paraffine, découpage, coloration et immunomarquage * Délai de réponse > 48 heures * Analyse histologique (anatomo-pathologie) : richesse, structures de soutien, infiltrat cellulaire anormal Biopsie osteo-medullaire : indications Ce n’est pas un examen anodin : - peut être douloureux - complications parfois graves => l’indication doit être formelle: - Échec du myélogramme (myélofibrose) - Évaluation richesse de la moelle (aplasie) - Recherche d’envahissement (lymphome, métastases) Myélogramme versus biopsie osteo-medullaire Myélogramme Cytologie BOM histologie Geste Simple Plus technique Complications rares possibles Délai réponse 2-24 h > 48 heures Identification cellulaire +++ + Appréciation richesse + +++ Évaluation fibrose - +++ Évaluation architecture - +++ Myélogramme et BOM sont complémentaires et non substitutifs
