Analyse de l`efficacité thérapeu que d`un inhibiteur de LIM

SCHIZOKIN: Analyse de l'efficacité thérapeu=que d'un inhibiteur de LIM Kinase sur un modèle animal de schizophrénie Projet porté par L. Lafanechère (Equipe Polarité, Cancer
et Développement, Grenoble, Institut Albert Bonniot)
Partenaires :
•  Equipe Physiopathologie du Cytosquelette (Grenoble,
GIN): A. Andrieux
•  Equipe Dynamique et structure neuronale (ESCPI,
Paris): Zsolt Lenkei
•  Unité conception, synthèse et vectorisation de
molécule (IC, Paris) Chi-Hung Nguyen
1
Contexte :Cytosquelette et Schizophrénie!
tubulin/actin
De plus en plus données indiquent que les
maladies neurodégénératives et
psychiatriques sont associées avec des
altérations du cytosquelette dans les
neurones.
V. Small
Des protéines impliquées dans la schizophrénie comme
•  DISC1 (Disrupted-In-Schizophrenia 1)
•  Dysbindin
•  Neuregulin
se lient aux microtubules et régulent leur dynamique
Inversement, la suppression chez la souris de MAP6 (STOP), protéine qui
interagit avec les microtubules et les stabilise, se traduit par une altération
des fonctions neuronales intégrées, reliées à la schizophrénie.
2
Les souris MAP6/STOP null mice: un modèle animal qui
récapitule de nombreux aspects de la schizophrénie!
Equipe A. Andrieux
Hyperactivité
locomotrice,
désorganisée et sans
but.
Hyper-sensibilité à la
nouveauté
et au stress.
Déficit de la mémoire à
court et à long terme.
D’Amato & Saoud, Lyon
Diminution du maternage, de l'interaction
sociale, de la motivation.
Anhédonie
L’administration de neuroleptiques améliore les troubles comportementaux des souris
3
L’administration d’un agent modulant la dynamique des microtubules,
l’Epothilone D provoque une amélioration des symptômes!
Equipe A. Andrieux
L’Epo D agit aussi bien que les neurolep4ques sur les symptômes des souris invalidées pour MAP6 èles drogues agissant sur la dynamique des microtubules peuvent avoir des effets psychotropes • International Patent : INSERM-CEA-GBF. Number 04 290 249.4 30.01. 2004
•  Andrieux, D. Job, A. Schweitzer and G. Hofle. “Use of epothilones in the treatment of psychotic disorders
with neuronal connectivity defects.”
4
4
Identification of a selective inhibitor of LIMK using phenotypic screening!
30,080
molecules
Equipe L. Lafanechère
Cell-based assay for microtubule
stability
increase of Detyr-tubulin
Selection of
pyridocarbazolone
LIMK identification
LIMK
LIM-Pyr1
Inhibition of only one
kinase out of 110 kinases
tested!
Prudent et al., Cancer Res., 2012
5
LIMK : a signaling node that controls both actin and microtubules dynamics!
TGFβ
VEGF
EGF
Receptor
Cdc42
Rac
Rho
Cdc42
Pak 1, 2 & 4
ROCK I & II
MRCKα
LIMK
?
Cofilin Cofilin Microtubules dynamics
Actin dynamics
Stabilized microtubules
Severed microfilaments
P
6
Intérêt de cibler la LIMK pour tenter de traiter la
schizophrénie!
•  Effet bénéfique des agents modulant la dynamique
du cytosquelette sur l’homéostasie neuronale.!
!
•  Modèle souris surexprimant la Neuregulin 1: LIMK1
impliquée dans les défauts de transmission
glutamatergique (Yin et al., Neuron, 2013)!
•  LIMK vient d’être identifiée comme une des
enzymes clé mutée dans la schizophrénie (Zhao et
al. 2014. Transcriptome sequencing and genomewide association analyses reveal lysosomal
function and actin cytoskeleton remodeling in
schizophrenia and bipolar disorder. Mol
Psychiatry).!
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Objectifs du projet!
v Tester l’efficacité thérapeu4que poten4elle de LIM-­‐Pyr1 sur un modèle animal de schizophrénie (A. Andrieux) Ø  LIM-­‐Pyr1 est efficace en thérapie an4cancéreuse (Prudent et al. Cancer Research, 2012) et bien toléré par les souris Ø  Peut passer (à très faible dose) la BHE. v Comprendre le mode d’ac4on de LIM-­‐Pyr1: •  À l’échelon cellulaire (Z. Lenkei, A. Andrieux) •  À l’échelon moléculaire (L. Lafanechère) v Améliorer chimiquement le ciblage cérébral de LIM-­‐Pyr1 et sa capacité à traverser la BHE (C-­‐H Nguyen) v Améliorer la stabilité de LIM-­‐Pyr1 (C-­‐H Nguyen/ L. Lafanechère) Ø  Connaissance de la SAR de LIM-­‐Pyr1 8
Analyse de l’efficacité thérapeutique de LIM-Pyr1 sur le
modèle MAP6 KO!
Placebo (15) Dose B : Dose A : 100mg/kg/sem 30mg/kg/sem (10) (10) Placebo (12) Dose B : Dose A : 100mg/kg/sem 30mg/kg/sem (8) (8) 2 injections par semaine sur 7 semaines (+ 1 la 8ème semaine = 15 injections)
9
Tests comportementaux réalisés!
v Tests évaluant les performances cognitives :!
•  Y-Maze (évalue la mémoire à très court terme !
•  Reconnaissance d'objet(évalue la mémoire à court
terme)!
!
v Tests évaluant des symptômes négatifs :!
•  Interaction sociale : intrus anesthésié !
•  Splash test!
!
v Test évaluant l'anxiété : nouvel environnement!
!
Equipe A. Andrieux
v Nage forcée (état dépressif)!
10
Test évaluant des symptômes négatifs : interaction sociale
Interaction sociale : intrus anesthésié (mâles)
120
Film pendant 3 min
temps d'exploration (sec)
Quantifie : le temps d’exploration de l’intrus anesthésié
** 100
80
WT
60
KO
40
20
0
Ko/Wt : moins
d’exploration de l’intrus
11
Test évaluant des symptômes négatifs : interaction sociale
Tests évaluant des symptômes négatifs : interaction sociale
Temps d'exploration de l'intrus
*
120,00
100,00
temps d'exploration (sec)
Mâles
Temps d'exploration de l'intrus (sec)
** 120
Quantifie : le temps d’exploration de l’intrus anesthésié
100
80
WT
60
KO
40
20
0
Ko/Wt : moins
d’exploration de l’intrus
80,00
60,00
40,00
n=12
20,00
0,00
Moyenne (sec)
placebo
30mg/kg/sem
n=7
n=7
placebo
30mg/kg/sem
100mg/kg/sem
76,75
89,25
102,14
100mg/kg/sem
Equipe A. Andrieux
Amélioration de l’interaction sociale pour la dose la plus élevée pour les mâles
12
LIM-­‐Pyr1 a un effet sur les symptômes néga4fs (forte dose, mâles)
Equipe A. Andrieux
Ko / Wt
Placebo
30mg/kg
100mg/kg
Y-maze
Entrées
= alternance
spontanée
=
=
=
Nouvel objet
Pas de
discrimination
AO/NO
Moins
d’exploration
total
F=
F=
F=
Interaction
sociale
exploration
=
=
Splash-test
Latence
Toilettage
=
=
Nouveauté
hypersensible
s
=
=
FST (forced
swimming
test)
Climbing
Latence
=
=
M
exploration
F =
=
M
crottes
=
13
Engagement de la cible: analyse en WB
Equipe L. Lafanechère
14
Engagement de la cible: quan4fica4on des WB
Préfrontaux
Equipe L. Lafanechère
15
LIM-­‐Pyr1 (H06) : peu soluble et instable
Instabilité aux
estérases
Faible solubilité
16
16
Synthèse d’un dérivé benzyloxy (H03)!
Equipe C-H NGuyen
Schéma de synthèse de H-03 via le couplage de Stille
CH3
Cl
Cl
LDA
N
R
CH3
N
O
CH3CHO
Br
Bn
R
H 3C
O
Bn
O
Bn
N
O
H3C
O
N
Couplage de
+
Stille
Br
N
MgBr
R = H (88%)
Br
N
H
N
H
R = Cl (63%)
R = SO2CH3 (87%)
OEt
R = OCH3 (83%)
Plus stable
CH3
Bn
O
O
H3C
H+
O
N
O
H3C
NH
AcONa/AcOH
86%
82%
N
H
5
N
H
CH3
CH3
H-03
Diversité structurale: Synthèse des nouveaux analogues diversement substitués sur le C-5 via la métallation
Electrophile = DMF, exemple
Modulable
CH3
CH3
H3C
O
CH3
O
N
(idem)
1. NaH
2. BuLi
CH3
H3C
O
CH3
O
CH3
O
O
H 3C
N
N
3. DMF
3 étapes
N
H
Br
N
H
[O]
R
R = CHO
R = COOH
N
H
H+
5
R
R = H (21%, 2 étapes, rendement moyen de 45%)
R = OH (9%, 3 étapes, rendement moyen de 44%)
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Activité H03!
Equipe L. Lafanechère
H03 est au moins aussi puissant
que LIM-Pyr1
Tubuline détyrosinée
DMSO
Ø  Analyse de H03 et de LIM-Pyr1
sur physiologie du neurone
H06 LIM-Pyr1
H03
18
LIMK et Physiologie du neurone!
Evaluation of the effect of LIMK Inhibition on
neuronal growth cone advance and retraction
Equipe de Z. Lenkei 19
Previous Data in the Lab
A
B
C
D
E
"   CB1R ac4va4on induces retrac4on of ac4n-­‐rich growth cones. "   CB1R-­‐induced retrac4on does not depend of the microtubule polymeriza4on. "   CB1R-­‐induced retrac4on depends of polymerized ac4n and the 20 µm
Roland et al., Unpublished data
ATPase ac4vity of non-­‐muscle myosin II. Could be the LIM-­‐kinase/cofilin pathway implicated in the CB1-­‐mediated growth cone retrac=on? 20
LIM-Pyr1 (H06) Effect in Neuronal Growth Cone Retraction
"   Results: Neuronal Growth Cone Retraction
Treatment
Pretreatment // Treatment
Pretreatment
Distance from the origin ( µ m)
POST
PRE
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
-40
-45
-50
-55
-60
-65
Vehicle // WIN 100nM (n=77)
Active Blebb 25uM // WIN 100nM (n=100)
H06 25uM // WIN 100 nM (n=59)
Active Blebb 25uM and H06 25uM // WIN
100 nM (n=109)
-30
-20
-10
0
+10
+20
+30min
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LIMKi Effect in Neuronal Growth Cone Retraction
"   Conclusions: "   The H06 (10 µM or 25 µM) seems to a5enuate the contrac9on induced by WIN but this effect is not significant. "   H03 blocked the contrac9on induced by WIN, this effect is concentra9on-­‐dependent. (10 µM or 25 µM)
"   The pre-­‐treatment with taxol (5 µM) did not block the growth cone retrac9on induced by WIN. "   Remarks for H03:
"  After H03 treatment many neurons and the astrocytes analyzed seem to be frozen.
"   H03 presents an important toxic effect, 19/49 neurons died after treatment with H03 at 10µM and 20/51 at
25µM.
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Mode d’ac4on de LIM-­‐Pyr1 à l’échelon moléculaire : recherche de la cible microtubulaire Equipe L. Lafanechère
2 hypothèses:
1. La cible est une protéine associée aux microtubules
•  analyse protéomique de fractions solubles ou stables de
cellules +/- LIM-Pyr1 : pas de différence
2.  LIMK cible directement la tubuline
•  In vitro, la tubuline est substrat de LIMK
•  Identification de sites phosphorylés par analyse
phosphoprotéomique : Tyrosines, sur la face exposée de
la tubuline
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Perspec4ves
•  Analyse de la toxicité de H03 chez l’animal
•  Définition d’une posologie optimale (time course)
•  Mesure de la concentration de H03 dans le cerveau
•  Analyse comportementale de l’effet de H03
•  Analyse de la morphologie de neurones issus de souris KO traités par
H03 sur coupes de cerveaux: restauration d’une morphologie normale?
•  Analyse de l’effet de phosphorylation de la tubuline par LIMK sur la
dynamique des microtubules cellulaires
•  Synthèse d’analogues plus aptes à passer la BHE, dans une optique
de valorisation
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Impact du Defi ITMM
•  Réalisation d’une preuve de concept
•  Projet réalisé sur ressources humaines propres : en plus
de ce qu’on fait, intérêt et bonne volonté
•  Interdisciplinarité :
•  prise de conscience des délais,
•  meilleure compréhension des contraintes de
l’autres discipline
•  faire confiance à l’expert
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