Thèse de Pouneh KHALILZADEH

THÈSE
En vue de l’obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par L’Université Paul Sabatier (Toulouse III)
Discipline : Microbiologie
Présentée et soutenue par Pouneh KHALILZADEH
Le 22 septembre 2009
Titre :
Formation de Biofilm à Pseudomonas aeruginosa:
évaluation d’inhibiteurs potentiels
du Quorum Sensing
Jury
Mme BELLON-FONTAINE M.N., Pr. INRA (Massy), Président, Rapporteur
Mme BADET C., MCU-PH, UFR D’Odontologie (Bordeaux 2), Examinateur
Mme MERCIER-BONIN M., CR INRA, INSA (Toulouse), Membre invité
Mme BAZIARD G., Pr. d’Université (Toulouse), Directrice de thèse
Mme ROQUES Ch., Pr. d’Université (Toulouse), Directrice de thèse
Ecole doctorale : SEVAB
(Sciences Ecologiques Vétérinaires Agronomiques Bioingénieries)
Unité de recherche : LU 49, UFR des sciences Pharmaceutiques
Directrices de Thèse : Mme Christine ROQUES, Mme Geneviève BAZIARD
Rapporteur : M. Jean FRENEY, Pr. d’Université (Lyon 1)
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Remerciements
Remerciements
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Remerciements
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Remerciements
Remerciements
Tout d’abord mes remerciements s’adressent à mes deux directrices de thèse, Madame le Professeur
Christine ROQUES, de l’Université Paul Sabatier, et Madame le Professeur Geneviève BAZIARD, de
l’Université Paul Sabatier, pour m’avoir offert l’opportunité d’entamer ce travail de recherche dans un
domaine aussi passionnant que porteur d’espoir. Les multiples discussions et échanges dont elles m’ont fait
bénéficier, m’ont permis de mener à bien ces travaux de recherche et développement. Leurs longues et
irremplaçables expériences gracieusement mises à ma disposition, m’ont guidée judicieusement tout au long
de ce travail de thèse. Je tenais, une fois encore, à leur exprimer toute ma reconnaissance pour m’avoir
permis de me confirmer dans cette voie scientifique.
Je tiens à exprimer ma sincère gratitude à Madame le Professeur Marie-Nôelle BELLONFONTAINE, de l’unité de Bioadhésion et d’Hygiène des Matériaux (INRA) à Massy, pour l’intérêt qu’elle
a porté à ce travail en acceptant d’en être l’un des rapporteurs et de présider ce jury.
J’adresse mes remerciements à Monsieur le Professeur Jean FRENEY, de la faculté pharmacie de
l’Université de Claude Bernard Lyon 1 et praticien hospitalier de Lyon, pour avoir accepté d’en être l’un
des rapporteurs de cette thèse.
J’adresse mes plus vifs remerciements à Madame le Docteur Cécile BADET, MCU-PH, UFR
d’Odontologie de l’Université Bordeaux 2, qui m’a fait l’honneur de participer au jury.
Je tiens remercier à Madame Muriel MERCIER-BONIN, chargée de recherche à INRA de INSA
de Toulouse, qui m’a fait l’honneur d’être un membre l’invité.
Je suis très reconnaissante à Monsieur le Professeur Jean BARBEAU, de la faculté de médecine
dentaire et de la faculté de médecine de l’Université de Montréal à Québec, pour l’intérêt porté à ce travail,
qu’il veuille bien trouver ici l’expression de ma profonde gratitude.
Je voudrais également remercier Madame Salomé EL HAGE, Maître de Conférences de
l’Université Paul Sabatier et Madame Barbora LAJOIE, Maître de Conférences de l’Université Paul
Sabatier, pour leur aide continuelle et leurs expertises incontournables en chimie.
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Remerciements
Je tiens remercier à Madame Laïla HADDIOUI, responsable d’études du secteur culture cellulaireimmunologie à la Fonderephar, et Mademoiselle Haouaria BELKHELFA, technicienne supérieure du
secteur culture cellulaire-immunologie à la Fonderephar, qui m’ont formée sur les essais réalisés sur les
cellules eucaryotes.
Je voudrais aussi remercier Monsieur Alain JAUNEAU, Ingénieur de Recherches au CNRS et
Madame Cécile POUZET, Ingénieur d'Etudes au CNRS, dont l’assistance technique en microscopie
confocal a été déterminante.
Un grand merci à Monsieur Mathieu BERGE, Maître de Conférences de l’Université Paul
Sabatier, pour m’avoir offert sa grande disponibilité jamais démentie.
Je ne peux oublier Monsieur Saïd MIRDAMADI, chef du département de microbiologie de
l’institut de biotechnologie de Téhéran, pour avoir su me donner l’impulsion scientifique déterminante qui
m’a guidée tout au long de mes études supérieures.
Merci à mon ami Monsieur Christian HEDAYAT, chef de département R&D à l’Institut
Fraunhofer, pour ses conseils et pour le soutien qu’il m’a apporté pour la mise en forme de ce manuscrit.
Un grand merci aussi à Mademoiselle Christel PIGASSE, assistante à la recherche à l’Université
Paul Sabatier, pour bien avoir voulu m’aider dans la mise en forme de ce manuscrit, ainsi que dans
l’amélioration du style d’écriture.
Comment ne pas remercier Monsieur Cédric PANIZZUTTI, technicien à la Fonderephar, pour son
soutien continu et sans failles tout au long de ces 5 années dans le délicat domaine de l’informatique.
Un grand merci à toutes les personnes que j’ai côtoyées au laboratoire durant cette thèse et qui
m’ont apporté leur soutien individuel et commun : Hélène RESSAULT, Cathy FEUILLOLAY, Sophie
PECASTAINGS, Julien GRIMOUD, Amandine COURNET, Laurence TELLIER, Jecelyne BACARIA,
Nathalie GORRET, Sabine BROUSSE, Sylvie BECKER, Sandra HUC, Laurence VAUGIEN, Carole
MICHEL, Elisabeth GIACOMEL, Delphine LALANDE, Paméla DAUBOEUF, Aurélie FURIGA,
Audrey BAYLAC, Alain SIGNOLES et Martine MAITRE. Ce fût pour moi très intéressant de vous
côtoyer jour après jour dans une ambiance sympathique et détendue.
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Remerciements
Enfin, mes chers parents, Maryam et Tarivérdi pour leur soutien inestimable et ainsi que mon frère
Péyman pour sa présence et ses encouragements sans faille. Je vous suis grandement reconnaissante d’avoir
cru en moi, en mes choix de vie et d’orientation scientifique et professionnelle.
Supportée par vous tous, j’ai pu achever ce travail de thèse.
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Remerciements
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Liste des communications
Liste des communications
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Liste des communications
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Liste des communications
Liste des communications
Posters:
1) “Validation of an in vitro model for selecting inhibitors of Pseudomonas aeruginosa
biofilm formation”, ISME, Vienna, Austria (2006)
2) “Criblage of potent inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm formation”, 4th ASM
conference on biofilms (2007)
3) “New potent inhibitors of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing and biofilm
formation”, XXIV ième journée Chimie Biologie, Toulouse, France (2008)
4) “New potent inhibitors of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing and biofilm
formation, 44èmes Chimie thérapeutiques, Angers, France (2008)
5) “Synthetic analogs of N-acyl-homoserine lactone as inhibitors of Pseudomonas
aeruginosa biofilm formation”, Journée Grand Sud-Ouest (SFC), Pau, France (2008)
6) “Attenuation of Pseudomonas aeruginosa biofilm by a N-Acyl-Homoserine Lactone
analogs”, 49th ICAAC, San Francisco, USA (2009)
Publication:
“Attenuation of Pseudomonas aeruginosa biofilm by a N-butanoyl-Homoserine Lactone
analog”. Pouneh Khalilzadeh, Barbora Lajoie, Salomé El Hage, Geneviève Baziard,
Mathieu Berge, and Christine Roques, Canadian Journal of Microbiology, (en cours de
correction).
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Liste des communications
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Table des Matières
Table des Matières
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Table des Matières
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Table des Matières
Table des Matières
Remerciements…………………………………………………………………………………3
Liste des communications……………………………………………………………………...9
Tables des matières…………………………………………………………………………...13
Abréviation…………………………………………………………………………….……..17
Résumé ……………………………………………………………………………………….21
Introduction ………………………………………………………………………………......25
chapitre I: Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing………………………29
Sommaire des titres……………………………………………………………………..….....31
Sommaire des tableaux et figures………………………………………………………….....33
chapitre II: Matériels et méthodes généraux……………………………………………....91
Sommaire des titres…………………………………………………………………………..93
Sommaire des tableaux et schémas…………………………………………………………..95
chapitre III: Révision/modification du modèle en flux continu: études préliminaires...105
Sommaire des titres………………………………………………………………………….107
Sommaire des tableaux et figures………………………………………………………...…109
chapitre IV: Mise au point du modèle en microplaque……………………………….....121
Sommaire des titres………………………………………………………………………….123
Sommaire des tableaux et figures…………………………………………………………...125
chapitre V: Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque...161
Sommaire des titres…………………………………………………………………………163
Sommaire des tableaux et figures…………………………………………………………...165
chapitre VI: Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes……….…...181
Sommaire des titres……………………………………………………………………….…183
Sommaire des tableaux……………………………………………………………………...185
Discussion…………………………………………………………………………………..201
Sommaire des tableaux et figures…………………………………………………………...203
Références bibliographiques……………………………………………………………...235
Annexe……………………………………………………………………………………...299
Publication………………………………………………………………………………….301
Titre et résumé en anglais…………………………………………………………………328
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Table des Matières
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Abréviations
Abréviations
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Abréviations
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Abréviations
Abréviations
AHLs: Acyl Homosérine Lactones
AI: Auto Indcuteur
ATCC: American Type Culture Collection
BB: Bouillon Biofilm
BBM: Bouillon Biofilm Modifié
CASFM: Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie
CFTR: Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
CMB: Concentration Minimale Bactéricide
CMI: Concentration Minimale Inhibitrice
CPM: Coups Par Minute
DCC: N, N-DiCyclohexylCarbodiimide
DCM: DiChloroMéthane
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO: Di-Méthyl Sulfoxide
DO: Densité Optique
EDS: Eau Distillée Stérile
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
EPPI: Eau pour Préparation Injectable
EPS: Extra Polymeric Substance
HSL: Homo Sérine Lactone
IP: Iodure de propidium
IPTG: Isopropyl-beta-thio-galactoside (C9H18O5S)
LPS: Lipo Poly Saccharide
LRP: protéine régulatrice à leucines
M: Molaire
mL: Millilitre
mM: milliMolaire
nm: Nanomètre
PBS: « Phosphate Buffer Saline», tampon phosphate salin
PCR: « Polymerase Chain Reaction », réaction de polymérisation en chaine
PQS: Pseudomonas Quinolone Signal
QS: Quorum Sensing
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Abréviations
rpm: Rotation Par Minute
SDS: Sodium dodecyl sulfate
SVF: Sérum de Veau Fœtal
TSA-B: Bouillon Trypcase-Soja
TSA-D: Gélose Trypcase-Soja
UFC: Unité Formant Colonie
XTT:Tétrazolium-3,3-[1-[(phénylamino) carbonyl]-3,4-trétrazolium] bis (4-méthoxy-6-nitro)]
benzène sulfonique hydraté
µL: Microlitre
°C: Degré Centigrade
3O-C12-HSL: N-(homosérine lactone-3-yl) 3-oxo-dodécanamide
C4-L-HSL: N-L-(homosérine lactone-3-yl)-butanamide
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Résumé
Résumé
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Résumé
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Résumé
Résumé
La découverte des systèmes de communication de type Quorum Sensing (QS) régulant
la virulence bactérienne a fourni une nouvelle opportunité pour contrôler les bactéries
infectieuses autrement qu’en interférant avec la croissance sous forme planctonique.
Pseudomonas aeruginosa est fréquemment impliqué dans la formation de biofilms
(milieux industriels et hospitaliers).La résistance de ces biofilms aux protocoles de nettoyage
ont conduit au développement de nouvelles approches en relation avec le contrôle du biofilm,
en particulier l’inhibition du système du QS.
Les furanones ont été précédemment décrites comme des inhibiteurs potentiels de la
formation de biofilms à Pseudomonas aeruginosa de part leur analogie avec les
N-Acyl Homo Serine Lactones (AHLs), autoinducteurs du QS.
Notre objectif a été de cribler des analogues des AHLs pour leur capacité à inhiber la
formation des biofilms.
Dans ce but, nous avons tout d’abord mis au point une méthode originale de criblage.
Des essais en microplaques ont été choisis et les conditions optimisées afin de
promovoir l’adhésion et la structuration du biofilm à Pseudomonas aeruginosa.
Dans ces conditions, la 4-bromo-5-(bromométhylène)-2-(5H)-furanone considérée ici
comme contrôle positif, présente un effet dose dépendant sur la formation du biofilm.
Dans un deuxième temps, 11 nouveaux analogues ont été criblés pour leur capacité à
perturber la formation du biofilm dans le but d’étudier la relation entre la structure des
analogues des HSL et leur activité.
Ces dérivés sont caractérisés par des modifications du cycle lactone, qui a été
remplacé par différents carbocycles et hétérocycles qui modulent l’encombrement stérique et
les effets électroniques.
Tous les composés sont caractérisés par une absence d’activité antimicrobienne sur les
cellules planctoniques [détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) et des
Concentrations Minimales Bactéricides (CMB)]. En utilisant notre modèle, un composé a été
capable de modifier la cinétique de formation du biofilm et de réduire le nombre de cellules
adhérées. Une étude des relations structure-activité a été réalisée pour le produit sélectionné.
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Résumé
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Introduction
Introduction
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Introduction
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Introduction
Dans l’environnement naturel, les micro-organismes sont attachés à une surface,
organisés en communautés structurées, et englobés dans une matrice d’exopolymères. Ce
mode de développement, appelé biofilm, a pris une importance toute particulière lorsqu’il a
été établi qu’il était impliqué dans un grand nombre d’infections bactériennes.
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie opportuniste responsable d’infections
parfois incurables et mortelles, notamment chez les malades souffrant de mucoviscidose. Le
processus infectieux est caractérisé par une colonisation progressive de la muqueuse
pulmonaire ; au stade de l’infection, un biofilm est constitué avec mise en jeu de nombreux
facteurs de virulence. Parallèlement, le mode de croissance sous forme sessile conduit à une
diminution de la sensibilité bactérienne que ce soit aux défenses de l’hôte ou aux agents
antimicrobiens. Ces modifications phénotypiques (formation de biofilm et résistance)
importantes sont corrélées, entre autres, à un « shift » au niveau génomique, impliquant des
systèmes senseurs et un mode de régulation avec communication entre bactéries ou « Quorum
Sensing ». Celui-ci est actuellement considéré comme un mécanisme de régulation clé dans
l’adaptation écologique et la pathogénie, notamment chez P. aeruginosa.
Au cours de ces dernières années, un intérêt particulier a été porté à la caractérisation
de nouvelles cibles potentielles, spécifiques des bactéries attachées aux surfaces. Le choix du
système du Quorum Sensing comme cible est validé par sa position en amont de l’expression
des facteurs de virulence et de la synthèse d’exopolymères.
Le présent travail a pour objectif initial de développer une recherche de nouveaux
inhibiteurs du QS. Les premières approches concernent la synthèse et l’évaluation de
molécules analogues des auto-inducteurs impliqués dans le Quorum Sensing chez P.
aeruginosa, les HomoSérine Lactones. L’objectif est ici de sélectionner des molécules
originales, ne présentant pas d’activité antimicrobienne classique intrinsèque (absence
d’activité inhibitrice de croissance et/ou bactéricide), mais capable de modifier ou du moins
d’intervenir sur certaines séquences de la formation de biofilm à P. aeruginosa.
Notre choix s’est porté sur des analogues de l’homosérine lactone en C4, considérée
antérieurement comme secondaire dans le processus (formation de biofilm,…), mais dont des
travaux récents ont démontré l’importance in vivo, dans les poumons de patients atteints de
mucoviscidose.
27
Introduction
L’étude de l’impact de ce type de molécule sur la formation de biofilm nécessite des
outils adaptés que ce soit en terme de criblage ou d’évaluation des mécanismes impliqués.
Ainsi, une première phase de notre travail a consisté à ré-évaluer les conditions
d’obtention de biofilms à P. aeruginosa dans un modèle en flux continu mis au point et validé
antérieurement au Laboratoire. Les essais de modifications ont notamment porté sur la
composition du milieu de culture et la surface à coloniser.
La synthèse d’analogues de la C4-HSL nous a amené dans un second temps à évaluer
les méthodes de criblage en microplaque présentées dans la littérature. Les difficultés
d’obtention d’un biofilm structuré et de suivi de la cinétique de formation de biofilm nous ont
conduits à proposer un modèle original caractérisé par l’utilisation d’un milieu synthétique
avec des apports limités et C et N, un inoculum faible, un renouvellement régulier du milieu
permettant la limitation de la phase planctonique, l’élimination des métabolites et l’apport de
nouveaux nutriments de manière séquentielle. Au final, ce modèle a été validé avec la
furanone, composé naturel « anti-biofilm » reconnu.
L’évaluation des composés synthétisés nous a alors permis de démontrer l’intérêt d’une
molécule caractérisée par l’absence d’activité antibactérienne sur bactéries planctoniques, et
un effet « anti-biofilm » significatif.
Enfin, une évaluation de la cytotoxicité du composé sélectionné et de la furanone, ainsi
que de l’impact de ces molécules sur l’adhésion de P. aeruginosa aux cellules de la muqueuse
pulmonaire.
L’originalité de ce travail repose sur le choix de molécules en C4, non halogénées afin
de limiter la toxicité in vivo, et la validation d’un modèle de criblage permettant une première
évaluation phénotypique de l’impact des molécules sur les différentes phases de formation du
biofilm.
28
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Chapitre I
Pseudomonas aeruginosa:
Biofilm et Quorum Sensing
29
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
30
Sommaire du chapitre I: Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Sommaire du chapitre I: Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et
Quorum Sensing
I-1-Pseudomonas aeruginosa..................................................................................................39
I-1-1-Description et identification…………………………………………………...39
I-1-2-Pathogénicité…………………………………………………………..40
I-1-2-1-Facteurs de virulence cellulaires……………………………………..41
I-1-2-1-1-Flagelle et pili……………………………………………...42
I-1-2-1-2-Lipopolysaccharide (LPS)…………………………………43
I-1-2-1-3-EPS (Extra Polymeric Substances).......................................44
I-1-2-2-Facteurs de virulence sécrétés………………………………………..45
I-1-2-2-1-Les lectines solubles……………………………………….45
I-1-2-2-2-Exotoxine A………………………………………………..46
I-1-2-2-3-Les élastases………………………………………………..46
I-1-2-2-4-Les phospholipases C……………………………………...47
I-1-2-2-5-La pyocyanine……………………………………………...47
I-1-2-2-6-La pyoverdine……………………………………………...47
I-1-2-2-7-Les toxines sécrétées via le système de sécrétion
de type III…………………………………………………..48
I-1-2-3-Régulation de l’expression des facteurs de virulence………………...49
I-2-Biofilm……………………………………………………………………………………50
I-2-1-Description des biofilms bactériens………………………………………….…51
I-2-1-1-Définition………………………………………………………….…51
I-2-1-2-Formation des biofilms…………………………………………….…51
I-2-1-2-1-Transfert des bactéries vers le support………………….….52
I-2-1-2-2-Etape d’adhésion initiale…………………………………...53
I-2-1-2-2-1-Adhésion initiale réversible……………………....54
I-2-1-2-2-2-Adhésion initiale irréversible…………………….58
I-2-1-2-3-Colonisation de la surface………………………….59
I-2-1-2-4-Maturation du biofilm……………………………....61
31
Sommaire du chapitre I: Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-2-2-Evolution et plasticité du biofilm……………………………………………....62
I-2-3-Détachement et mort cellulaire………………………………………………...63
I-3-Communication intercellulaire………………………………………………………...64
I-3-1-Le Quorum Sensing chez les bactéries à Gram négatif………………………...69
I-3-1-1-Les auto-inducteurs de type 1: acyl-homosérines lactones (AHLs)….70
I-3-1-2-Les synthases………………………………………………………....71
1-3-1-3-Les régulateurs R…………………………………………………….72
I-3-2-Communication inter-espèces: signal AI-2 et synthèse LuxS………………….72
I-3-3-Quorum Sensing chez Pseudomonas aeruginosa……………………………....73
I-3-4-Quorum Sensing, biofilm et infections à P. aeruginosa………………………..78
I-3-5-Quorum Sensing: cible potentielle dans le traitement des infections
à P. aeruginosa………………………………………………………………...82
I-3-5-1-Echecs thérapeutiques et résistance…………………………………..82
I-3-5-2- Quorum Sensing: nouvelle cible thérapeutique……………………...85
32
Sommaire des tableaux et figures du chapitre I: Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Sommaire des tableaux et figures du chapitre I: Pseudomonas
aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
•
Figure 1. Pseudomonas aeruginosa: (a) colonies sur agar, (b) coloration de Gram (x1000)
(Salton & Kim, 1996),(c) Observation au microscope électronique à balayage d’un biofilm à
Pseudomonas aeruginosa CIP A 22 après 72 heures de formation (Campanac et al. 2002)
•
Figure 2. Facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosa: a) liés à la cellule : flagelle,
pili, autres adhésines, alginate/constitution d’un biofilm, lipopolysaccharide [LPS]; b)
excrétés : protéases, hémolysines, exotoxine A, exoenzyme S, pyocyanine (Van Delden &
Iglewski, 1998)
•
Figure 3. Représentation schématique de la formation d’un biofilm par Pseudomonas
aeruginosa présentant les différentes phases (Filloux & Vallet, 2003)
•
Figure 4. Structures cellulaires conditionnant les premières étapes de l’adhésion
(Flemming & Wingender, 2001)
•
Figure 5. Biofilm constitué d’une souche de P. aeruginosa mobile (blanc) et d’une souche
mutante ayant perdu sa mobilité (noir), Barre: 20µm (Klausen et al. 2003)
•
Figure 6. Les trois principaux groupes de quorum sensing: LuxI/R, Oligopeptides et
systèmes hybrides. Les pentagones représentent les acyl homosérines lactones (AHLs) ; les
lignes
les oligopeptides et les triangles l’autoinducteur 2 (AI-2). Les principaux
autoinducteurs et systèmes ou contrôlés par le quorum sensing, les plus étudiés sont exposés
sous chaque groupe. HPt, histidine phosphotransférase; P, phosphate ; Rr, régulateur de
réponse; SHK, senseur histidine kinase (Henke & Bassler, 2004)
•
Figure 7. Biosynthèse des homosérines lactones et des auto-inducteurs de type 2 (Xavier
& Bassler, 2003)
•
Figure 8. Structures des AHLs et de PQS chez P. aeruginosa (Juhas et al. 2005)
33
Sommaire des tableaux et figures du chapitre I: Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
•
Figure 9. Mécanisme moléculaire du Quorum sensing chez P. aeruginosa. Deux systèmes
de Quorum sensing ont été identifiés chez P. aeuginosa : le système las et rhl. Le système est
constitué d’un gène régulateur lasR codant pour la protéine LasR, d’un gène lasI codant pour
une synthase auto-inductrice LasI participant à la synthèse d’une petite molécule de la famille
des homosérines lactones : 3-oxo-C12-HSL. Le complexe LasR/3-oxo-C12-HSL est
activateur transcriptionnel de gènes de virulence (indiqué en bas de la figure) et de lasI. Selon
le même modèle, le système rhl est constitué de gènes rhlR, rhlI et d’une autre HSL : C4HSL. Ce système active des gènes en commun avec le système las et propre comme le
rhamnolipide. Le système las contrôle le système rhl. Le système las est contrôlé
négativement par le produit du gène rsaL et positivement par GacA et Vfr. Récemment, 97
gènes dont la majorité ont une fonction hypothétique viennent d’être impliqués dans le QS
(Ruimy & Andremont, 2004)
•
Figure 10. Réseaux de régulation contrôlant les facteurs de virulence de P. aeruginosa
(Lazdunski, 2003)
•
Figure 11. Représentation schématique des stratégies de défens au niveau pulmonaire: a)
La surface de l’épithélium est « surveillée » par des PMNs et des macrophages, qui
phagocyter les bactéries planctoniques rapidement et facilement. b) Les phagocytes
alvéolaires sont incapables de phagocytée les bactéries présentes sous forme de biofilm,
même si celles-ci sont marqués par des anticorps spécifiques. c) Les fragments de biofilm
croissent et bourgeonnent dans le poumon colonisé et libèrent occasionnellement des cellules
planctoniques qui réagissent avec des anticorps et sont phagocytées. d) Le biofilm mature
atteint un équilibre avec le système immunitaire; des parties de la communauté bactérienne se
« calcifient » pour former un « réservoir » à long terme. (Costerton et al. 2003)
♦ Tableau 1. Homologues LuxR/Luxl, Al-1 synthétisés et phénotype régulé chez un certain
nombre d’espèces bactériennes (De Kievit & Iglewski, 2000)
♦ Tableau 2. Phénotypes et gènes régulés par LuxS (Al-2) chez un certain nombre d’espèces
bactériennes (Xavier & Bassler, 2003)
34
Sommaire des tableaux et figures du chapitre I: Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
♦ Tableau 3. Structure des auto-inducteurs (McClean et al. 1997)
♦ Tableau 4. Fonctions régulées par le quorum sensing chez P. aeruginosa (Juhas et al.
2005)
♦ Tableau 5. Structure des composés envisagés
35
Sommaire des tableaux et figures du chapitre I: Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
36
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Pseudomonas aeruginosa, autrement connue sous le nom de bacille pyocyanique, est
une bactérie à Gram négatif, opportuniste, vivant à l’état naturel dans l’eau, les sols humides
et sur les végétaux. Dans son habitat naturel, P. aeruginosa peut être trouvé sous forme
planctonique, mobile ou en biofilm, attaché à une surface inerte ou un substrat, ainsi qu’ aux
tissus vivants.
P. aeruginosa peut être responsable de nombreux processus néfastes liés à sa capacité
à coloniser les surfaces sous forme de biofilm.
Ainsi, cette bactérie est impliquée dans les phénomènes de corrosions microbiennes,
de contamination et dégradation de différents hydrocarbures (Dagher et al. 1997), créant des
masses gélatineuses sombres parfois appelées à tort "algues".
C’est par ailleurs un pathogène opportuniste capable d’infecter un large spectre
d’hôtes : hommes, animaux, plantes (D’Argenio et al. 2001; Pukatzki et al. 2002).
Chez les plantes, P. aeruginosa induit des symptômes de pourriture molle (soft rot)
chez Arabidopsis thaliana et la laitue (Letuca sativa) (Rahme et al. 1995; Rahme et al.
1997). C'est un agent pathogène puissant chez Arabidopsis (Walker et al. 2004) et chez
certains animaux: Caenorhabditis elegans (Mahajan-Miklos et al.1999; Martinez et al. 2004),
Drosophila (D'Argenio et al. 2001) et Galleria mellonella[ (Miyata et al. 2003)]. Les
associations de facteurs de virulence paraissent les mêmes pour les infections végétales et
animales (Rahme et al. 2000; Rahme et al. 1995).
Chez les animaux supérieurs, P. aeruginosa est une bactérie commensale de la peau et
du système digestif notamment des mammifères.
Inoffensive pour les individus dits « sains », elle peut être à l’origine de différentes
infections chez les personnes souffrant de déficiences immunitaires ou présentant des
pathologies favorisant le développement d’une infection (diabète, grands brûlés,…).
Elle est fréquemment impliquée dans les infections nosocomiales du fait de la
colonisation de l’environnement hospitalier (robinets, réseaux de distribution d’eau,..), de sa
résistance à de nombreux antiseptiques et aux antibiotiques (Livermore, 2002), entraînant la
sélection de véritables souches hospitalières.
Les formes de pathologie qu'elle engendre sont diverses (Rolston et al. 1999), en
liaison avec sa capacité à coloniser de nombreux tissus : infections de l'œil, des plaies, surtout
brûlures et plaies opératoires, infections urinaires (surtout après sondages), pneumonies (par
exemple après bronchoscopie) (Brewer et al. 1996; Dunn & Wunderink 1995), méningites
d'inoculation, voire septicémies (Edmond et al. 1999) comme stade terminal d'infections
37
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
graves ou complication chez des malades soumis à un traitement immunodépresseur ou
leucémiques (Bodey et al. 1993).
Dans de nombreux processus infectieux liés à cette bactérie opportuniste, une étape clé
est constituée par la phase de colonisation, permettant à la bactérie de développer une
biomasse dense à la surface des muqueuses et secondairement de mettre en place différents
facteurs impliqués dans la pathogénicité de P. aeruginosa.
L’exemple typique est représenté par la mucoviscidose, maladie génétique liée à une
mutation de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator).
Cette protéine localisée sur les membranes des cellules épithéliales des voies respiratoires,
intestinales, reproductrices, ainsi qu’au niveau des glandes de sécrétion externe (sudorales,
pancréatiques et salivaires) est un canal de régulation du passage des ions chlorures à travers
les membranes (Quinton, 1983). Elle module également de nombreux autres canaux ioniques
et protéines de transport (Briel et al. 1998; Schreiber et al. 1999; Sugita et al. 1998).
Dans les poumons, le défaut de fonctionnement de la protéine CFTR et donc du
transport des ions chlorure s’accompagnent d’une absorption accrue de sodium et au final
d’une déshydratation du mucus. L’épaississement du mucus va conduire à un défaut de
fonctionnement de l’ascenseur muco-ciliaire et de l’activité antimicrobienne exercée par
différents composants de surface (Smith et al. 1996; Tager et al. 1998), théoriquement
capables d’éliminer les bactéries présentes au niveau pulmonaire.
Chez les patients atteints de mucoviscidose, le battement des cils est bloqué par la
viscosité élevée du mucus et les bactéries peuvent persister (Lyxczak et al. 2002). P.
aeruginosa transmis par le matériel médical, l’environnement ou par d’autres patients va
pouvoir coloniser la surface des muqueuses très tôt (vers l’âge de 10 ans) et ce, de façon
définitive (Aebi et al. 1995). Le stade infectieux n’apparaît que secondairement en liaison
avec le développement de la bactérie sous forme de biofilm, l’expression de divers facteurs de
virulence et de systèmes de sécrétion qui y sont associés, conduisant à une infection chronique
(Govan & Deretic, 1996). L’échec des thérapeutiques anti-pyocaniques classiques (Wood &
Smyth, 2006) conduit au développement de nouvelles approches ayant pour cible le biofilm et
l’expression des facteurs de virulence.
Le séquençage complet du génome de P. aeruginosa (Stover et al. 2000) indique qu’il
s’agit du plus grand génome bactérien connu à ce jour, codant pour 5570 cadres de lecture. De
nombreux gènes sont impliqués dans des systèmes de régulation et des fonctions
métaboliques expliquant le caractère ubiquitaire de cette bactérie et sa capacité à se
développer dans des systèmes pauvres en nutriments.
38
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
La sécrétion des facteurs de virulence est également sous le contrôle de mécanismes
de régulation complexes tel que le « Quorum Sensing » permettant à la bactérie d’adapter son
phénotype au milieu dans lequel elle se trouve, notamment en fonction de la densité
bactérienne.
Nous aborderons donc dans ce chapitre bibliographique la présentation de P.
aeruginosa, la génèse des biofilms et le rôle particulier du QS, afin de positionner clairement
nos objectifs.
I-1-Pseudomonas aeruginosa
I-1-1-Description et identification
Pseudomonas aeruginosa, bactérie à Gram négatif, se présente sous forme de bacilles
fins, droits et très mobiles grâce à un flagelle polaire (ciliature monotriche), dépourvus de
spores et de capsule. Ils apparaissent la plupart du temps isolés ou en diplobacilles.
(a)
(b)
(c)
Figure 1. Pseudomonas aeruginosa: (a) colonies sur gélose ordinaire, (b) coloration de Gram (x1000) (Salton &
Kim , 1996), (c) Observation au microscope électronique à balayage d’un biofilm à Pseudomonas aeruginosa
CIP A 22 Après 72 heures de formation (Campanac et al. 2002)
39
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
La température optimale est de 37°C avec croissance à 41-42°C, mais aucune culture
n'est obtenue à 4 C ou à 46°C. La température optimale de croissance est comprise entre 30°C
et 37 C. Cette bactérie présente un métabolisme aérobie, mais peut utiliser les nitrates comme
accepteurs d’électrons en conditions anaérobies.
Comme d'autres Pseudomonas, P. aeruginosa sécrète un certain nombre de pigments,
entre autres la pyocyanine (bleu-vert), la fluorescéine (jaune vert fluorescent) et la pyorubine
(brun-rouge). C'est une bactérie dépourvue d'enzymes dégradant le lactose et dégageant une
odeur de raisin ou seringa in vitro. L’identification repose, après observation macroscopique
et microscopique (figure 1), sur la présence des enzymes de type oxydase, élastase et protéase
notamment, que cette bactérie sécrète. La production des deux pigments pyocyanine et
fluorescéine, et la température de croissance optimale de 42°C confirme l'identification.
P. aeruginosa utilise son flagelle pour la mobilité, des systèmes introduisant des
protéines effectrices dans les cellules hôtes, et un lipopolysaccharide qui supprime les
réponses immunitaires des hôtes en plus d'intervenir directement dans l'établissement
d'infections persistantes (Cryz et al. 1984). Parmi les molécules sécrétées par P. aeruginosa
on trouve des protéines (élastase et protéase) qui détruisent l'intégrité des tissus de l'hôte en
dégradant les protéines constitutives telles que l'élastine, le collagène et les transferrines
(Aumercier et al. 1990; Kawaharajo et al. 1975). On trouve aussi des toxines de faible poids
moléculaire comme la pyocyanine, affectant différents sites dans la cellule hôte (Lau et al.
2004a; Ran et al. 2003).
I-1-2-Pathogénicité
La virulence de P. aeruginosa dépend des facteurs dits cellulaires, c’est-à-dire
associés à la bactérie et principalement impliqués dans l’adhérence et la motilité et ceux dits
extracellulaires, correspondant aux toxines et protéases sécrétées (figure 2).
Pseudomonas aeruginosa utilise ainsi plusieurs systèmes de sécrétion pour mettre en
contact les toxines produites et les cellules. Les quatre systèmes de sécrétion, ubiquitaires
chez les bactéries à Gram négatif, ont été décrits chez P. aeruginosa. Deux de ces systèmes
sont particulièrement impliqués dans la pathogénicité de la bactérie.
Le système de sécrétion de type II secrète des exo-produits (toxines et enzymes) dans
l’environnement proche des cellules. Les protéines concernées sont des ATPases, des
protéines chaperones et des peptidases. Parmi celles-ci, l’élastase, la phosphatase alcaline,
40
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
l’exotoxine A et la phospholipase C participent à la cytotoxicité et à l’invasion tissulaire par
destruction du mucus protecteur recouvrant l’épithélium bronchique.
Le système de sécrétion de type III, activé lors du contact cellulaire, permet une
injection des toxines directement dans le cytoplasme de la cellule hôte (Kipnis et al. 2006). La
translocation des toxines depuis la bactérie s’effectue par le biais d’un appendice traversant la
membrane bactérienne et capable de percer la membrane de la cellule eucaryote.
Pili
LPS
Flagelle
alginate/constitution d’un biofilm
Autres adhésions
Produits excrétés:
-protéase
-Hémolysines
-exotoxine A
-exoenzyme S
-pyocyanine
Figure 2. Facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosa: a) liés à la cellule : flagelle, pili, autres adhésines,
alginate/constitution d’un biofilm, lipopolysaccharide [LPS]; b) excrétés : protéases, hémolysines, exotoxine A,
exoenzyme S, pyocyanine (Van Delden & Iglewski, 1998)
I-1-2-1-Facteurs de virulence cellulaires
Les membranes cellulaires présentent de nombreux glycoconjugués, marqueurs et
récepteurs potentiels de la cellule considérée. Ces molécules sont capables d’interagir de
manière plus ou moins spécifique avec des protéines ou des glycoprotéines de type lectine.
Ces lectines peuvent être bactériennes, virales, végétales ou animales.
L’adhésion bactérienne aux cellules de l’hôte est généralement la première étape du
processus infectieux. Les adhésines participant à cette phase sont ainsi capables d’interférer
avec le système immunitaire, de participer à l’introduction de molécules toxiques dans la
cellule hôte, de favoriser l’invasion bactérienne et sont donc considérées comme des facteurs
de virulence. Elles peuvent être associées aux fimbriae, aux toxines ou être libres en solution.
41
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-1-2-1-1-Flagelle et pili
La mobilité en liaison avec les variations de l’environnement est un phénomène
primordial dans le processus de colonisation et d’infection. Les bactéries sont ainsi dotées
d’appendices cellulaires, flagelles et pili (ou fimbriae), leur permettant de « sonder » les
surfaces et de se déplacer dans le milieu.
Le flagelle polaire confère à la bactérie la capacité de se déplacer non seulement en
milieu aqueux, mais également sur des surfaces semi-solides (swarming) (Kohler et al. 2000).
Il présente une forte homologie structurale avec le système de sécrétion de type III et se
compose d’une partie enchâssée dans la membrane assurant la rotation par transport de
protons et une partie libre. Celle-ci est constituée en partie de monomères de flagelline
(FlicC) (Bardy & Jarrell, 2003).
Le flagelle est impliqué dans la reconnaissance et l’adhérence aux surfaces épithéliales
(Simpson et al. 1992) et abiotiques, ainsi qu’à la formation de microcolonies et au
développement « normal » d’un biofilm (O’Toole & Kolter, 1998). La flagelline est ainsi
capable d’interagir avec les glycolipides GM1, les asialo-GM1 (Feldman et al. 1998) et les
mucines (Lillehoj et al. 2002) présentes à la surface de l’épithélium bronchique.
Le flagelle participe également à la virulence en induisant une réponse inflammatoire
dépendante de NFκB via les récepteurs Toll, TLR5 et TLR2, et une production d’IL-8
(Adamo et al. 2004, Di Mango et al. 1995).
Des mutants dépourvus de flagelle ont ainsi une virulence atténuée (Feldman et al.
1998; Tang et al. 1996) et l’utilisation d’anticorps antiflagellaires permet de réduire la
symptomatologie lors de pneumonies à P. aeruginosa chez le rat (Landsperger et al. 1994).
La nature antigénique du flagelle est impliquée dans les réponses de l’hôte. Cependant,
lors d’infections chroniques, et notamment au cours de la formation du biofilm, P. aeruginosa
est capable de sélectionner des mutants non-flagellés pour échapper aux défenses de l’hôte
(Mahenthiralingam et al. 1994).
La mobilité implique également les pili de type IV. Constitués essentiellement de
monomères de piline (PilA), leur capacité de rétraction permet une mobilité de type
« twiching » et « swarming », permettant une dispersion sur les surfaces humides (Mattick,
2002). Ils sont également connus pour jouer un rôle crucial dans l'adhérence aux surfaces
muqueuses et leur colonisation (Hahn et al. 1997b). Une altération de ces pili conduit à une
diminution de l’adhérence aux cellules épithéliales in vitro (Comolli et al. 1999; Hahn et al.
42
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
1997a). Leurs sites de liaison correspondent aux asialo-GM1 et asialo-GM2 des membranes
cellulaires épithéliales (Gupta et al. 1994).
Ces constituants bactériens cellulaires sont nécessaires pour l’expression de la
virulence de P. aeruginosa dans un certain nombre de modèles infectieux (Cryz et al. 1983,
Feldman et al. 1998; Holder, 1985; Pier et al. 1992; Tang et al. 1995; Tang et al. 1996).
De nouveaux appendices de surface de la famille des pili de type IVb ont été
récemment mis en évidence (De Bentzman et al. 2006).
D’autres types de pili récemment mis en évidence chez P. aeruginosa sont impliqués
dans l’adhérence aux surfaces inertes et dans la formation du biofilm. Il s’agit notamment des
pili de type I dépendant d’une protéine chaperone CUP (Vallet et al. 2001; Ruer et al. 2007).
Les domaines terminaux présentent des homologies avec des adhésines de souches
uropathogènes d’E. coli.
I-1-2-1-2-Lipopolysaccharide (LPS)
Le LPS est le constituant lipidique majeur situé à la face externe de la membrane. Il
est constitué de trois parties : une partie hydrophobe, le lipide A, inséré dans la bi-couche
phospholipidique membranaire, un noyau oligosaccharidique et un polysaccharide antigène-O
caractéristique de la bactérie.
Le lipide A ou endotoxine est impliqué dans la stimulation excessive du système
immunitaire et peut ainsi être à l’origine de chocs septiques (Ernst et al. 2003).
La région polysaccharidique ramifiée (antigène O) présente sur toute la surface de la
bactérie, est en contact direct avec les tissus de l’hôte, jouant ainsi un rôle clé dans la réponse
inflammatoire.
Son expression est variable (phénotypes « lisse » ou « rugeux ») permettant à
certaines souches d’échapper à la phagocytose médiée par le complément (Goldberg & Pier,
1996).
Le LPS est également impliqué dans l’adhésion aux cellules via les asialo-GM1
(Gupta
et al. 1994) et la reconnaissance par le complexe TLR4/CD14 ou TLR4/MD-2
(Backhed et al. 2003; Hajjar et al. 2002). La protéine CFTR pourrait également jouer le rôle
de récepteur, induisant l’internalisation de la bactérie par les cellules épithéliales pulmonaires
et activant ainsi la réponse inflammatoire. L’absence ou le dysfonctionnement de la CFTR
chez les patients atteints de mucoviscidose, ainsi que les modifications de l’antigène O
43
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
pourraient retarder ainsi la réponse immunitaire et l’élimination des bactéries, conduisant
secondairement à leur installation (Goldberg & Pier 1996; Pier, 2002; Schroeder et al. 2002).
Dans la mucoviscidose, des mutants de P. aeruginosa présentant des modifications du
lipide A ont pu être observés, conduisant à une résistance aux peptides antimicrobiens et à une
activation TLR4 (Ernst et al. 2003).
I-1-2-1-3-EPS (Extra Polymeric Substances)
De nombreux composés, dont essentiellement des oses, font partie de l’environnement
immédiat de la bactérie et interviennent dans la formation et la structure du biofilm que nous
développerons dans le chapitre suivant. Ils participent ainsi au processus infectieux.
La matrice extracellulaire retrouvée dans le biofilm contient des protéines, des sels et
des exopolysaccharides représentant 50 à 90% de la matière organique totale (Wingender et
al. 1999). L’importance de P. aeruginosa en tant qu’opportuniste et agent responsable
d’infections nosocomiales explique que le biofilm et, notamment, la composition des EPS de
ce microorganisme, soient parmi les plus étudiées.
Chez P. aeruginosa, les EPS sont caractérisés par la présence d’alginate,
polysaccharide linéaire également produit par certaines algues brunes. Il est constitué d’acides
L-guluronique et D-mannuronique liés par des liaisons β-1,4 (Evans & Linker, 1973). Durant
son transfert périsplasmique, l’alginate subit une acétylation et une épimérisation pour
conduire à trois types d’organisation, homopolymères de chaque acide ou des
hétéropolymères (Remminghorst & Rehm, 2006). L’alginate, comme le LPS, joue un rôle
d’adhésine. Une surproduction d’alginate est observée chez les souches issues de patients
atteints de mucoviscidose, certainement en liaison avec les conditions inflammatoires
rencontrées dans les poumons de ces patients. Ceci conduit à une différenciation en souches
dites « mucoïdes » (Mathee et al. 1999). L’alginate participerait à la structuration du biofilm
(Hentzer et al. 2001; Boyd & Chakrabarty, 1995), mais son importance réelle est encore
controversée (Wozniak et al. 2003). Cette surexpression protège P. aeruginosa de la
phagocytose, des agents antimicrobiens et des réponses de l’hôte.
D’autres composés matriciels riches en glucose et mannose ont été récemment mis en
évidence (Friedman & Kolter, 2004a, 2004b).
Le système Pel a été décrit beaucoup plus récemment (Vasseur et al. 2005; Vasseur et
al. 2007). Il s’agit d’un système de synthèse et d’exportation d’une matrice
exopolysaccharidique participant à la structuration du biofilm. D’autres systèmes
44
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
indépendants du système Alg (responsable de la synthèse d’alginate) ont été mis en évidence,
dont le système Ps1 (Friedman & Kolter, 2004a, 2004b; Branda et al. 2005).
I-1-2-2-Facteurs de virulence sécrétés
Ils interviennent dans la dissémination de la bactérie au niveau des tissus et dans
l’atténuation des défenses de l’hôte.
I-1-2-2-1-Les lectines solubles
Parmi les facteurs de virulence sécrétés par la bactérie, deux lectines solubles ont été
identifiées, dont l’activité est dépendante du calcium. Elles peuvent être détectées au niveau
du cytoplasme ainsi qu’au niveau de la membrane externe de la bactérie.
La lectine PA-IL (galactophilic LecA), protéine de 12,7 kDa, interagit spécifiquement
avec le D-galactose (Garber et al. 1992). Ainsi, elle fixe un grand nombre de glycoprotéines
et de glycosphingolipides.
L’expression de PA-IL est régulée directement par le système RhlR/C4-HSL du QS et sa
production dépend de la phase de croissance (Winzer et al. 2000). L'étude de Boteva et al.
(2004) prouve que PA-IL a deux modes de fonctionnement (basé sur sa capacité de carbonenuissance), peut adapter à AHLS. D’autres systèmes de contrôle seraient également impliqués
(Diggle et al. 2003).
Le rôle de cette lectine durant le processus infectieux serait multiple. Elle pourrait
faciliter la formation d’agrégats ou de colonies bactériennes par l’intermédiaire des dérivés de
galactose présents sur les LPS (Sadovskaya et al. 1998), protégeant ainsi les bactéries des
défenses immunitaires. De la même manière, elle serait impliquée dans la formation et la
stabilisation du biofilm, comme le montre les expériences réalisées après délétion du gène
lecA ou après addition d’IPTG (Isopropyl-beta-thio-galactoside) (Diggle et al. 2006).
PA-IL intervient également dans l’adhérence de P. aeruginosa aux cellules
épithéliales ou à la fibronectine. Elle est capable de modifier la perméabilité des cellules
intestinales de souris aux exoproduits toxiques (Laughlin et al. 2000). Elle est également
directement cytotoxique pour les cellules épithéliales respiratoires (Bajolet-Laudinat et al.
1994).
45
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
PA-IIL (fucophilic LecB) présente une forte affinité pour le L-fucose (Garber et al.
1987) et de manière moindre pour le L-galactose, le D-arabinose et le D-fructose.
La production de cette lectine est également sous le contrôle du QS (Schuster et al.
2003, Wagner et al. 2003; Winzer et al. 2000). In vitro, elle inhibe le battement ciliaire des
cellules pulmonaires (Adam et al. 1997) et participe également à la formation du biofilm
(Tielker et al. 2005). En s’associant aux glycoconjugués présents à la surface de la bactérie,
elle participerait aux interactions bactérie-hôte ou bactérie-bactérie (Tielker et al. 2005).
I-1-2-2-2-Exotoxine A
C’est la protéine la plus cytotoxique produite par P. aeruginosa jouant un rôle majeur
dans la virulence de la bactérie (Miyazaki et al. 1995). Un mutant déficient en ExoA est 20
fois moins virulent chez la souris que la souche sauvage (Miyazaki et al. 1995). Il s’agit d’une
toxine de type AB contenant un domaine A catalytique et un domaine B interagissant
spécifiquement avec la cellule hôte. Sécrétée sous forme de pro-toxine inactive dans l’espace
intercellulaire via le système de sécrétion de type II, sa liaison au LRP (LDL related protein)
induit son clivage et l’internalisation de la partie active dont la cible est le facteur
d’élongation E2, perturbant ainsi la synthèse protéique et entraînant la mort cellulaire par
nécrose (Wick et al. 1990). Elle diminue également la réponse de l’hôte (Schultz et al. 2001).
I-1-2-2-3-Les élastases
L’élastase (lasB) est une métalloprotéinase à zinc sécrétée par P. aeruginosa à
l’intérieur de l’espace cellulaire via le système de sécrétion de type II. Cette protéine exerce
son rôle toxique par dégradation de l’élastine, composant majeur de l’épithélium respiratoire.
Ceci conduit à une perméabilisation de l’épithélium facilitant l’action d’autres facteurs
(Azghani et al. 2000). LasA est également impliquée dans la dégradation de l’élastine.
LasB modifierait également la réponse immune en détruisant les surfactants A et D
(Mariencheck et al. 2003), en augmentant la production d’IL-8 (Kon et al. 1999) et en
inactivant d’autres protéines comme les IgA, les IgG et des composés du complément (Heck
et al. 1990; Hong & Ghebrehiwet 1992).
46
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-1-2-2-4-Les phospholipases C
Egalement sécrétées par le système de sécrétion de type II, elles présentent différentes
spécificités de substrats (Stonehouse et al. 2002) et ont particulièrement pour cible la partie
lipidique de la membrane des cellules eucaryotes. L’action des phospholipases est facilitée
par les rhamnolipides bactériens.
Les rhamnolipides sont des biosurfactants de type amphiphile, capables d’agir sur les
phospholipides des membranes eucaryotes facilitant ainsi l’accès aux phospholipases. Ces
rhamnolipides participent également à la structuration du biofilm, notamment dans l’évolution
des microcolonies et le détachement des bactéries du biofilm (Boles et al. 2005; Caiazza &
O’Toole, 2003).
Les phospholipases C participent (Konig et al. 1996) à l’inflammation s’en attaquant
aux phosphatidylcholines (Holm et al. 1991). Par ailleurs, certaines présentent une activité
hémolytique (PlcN et PlcH) et jouent un rôle dans la mobilité de type « twiching » (PlcB:
Barker et al. 2004). Elles sont capables de supprimer la réponse oxydative des neutrophiles
(Terada et al. 1999).
I-1-2-2-5-La pyocyanine
La pyocyanine est un pigment bleu sécrété par la bactérie et impliqué dans de
nombreux mécanismes de pathogénicité (Lau et al. 2004a). Elle réprime la réponse
immunitaire de la cellule hôte, induit l’apoptose des neutrophiles (Allen et al. 2005) et induit
la production d’IL-8 (Denning et al. 1998).
Son importance dans la virulence de P. aeruginosa a été démontrée lors d’infections
sur modèle animal (Lau et al. 2004b). Ses propriétés oxydoréductrices lui permettent
d’oxyder la glutathione, d’inactiver la catalase des cellules épithéliales bronchiques et ainsi de
participer aux lésions liées au stress oxydatif (O’Malley et al. 2004).
I-1-2-2-6-La pyoverdine
La pyoverdine est un sidérophore jouant également un rôle important dans la virulence
de P. aeruginosa (Takase et al. 2000), notamment par régulation de l’expression d’autres
facteurs de virulence comme l’exotoxine A (Lamont et al. 2002).
47
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-1-2-2-7-Les toxines sécrétées via le système de sécrétion de
type III
Le système de sécrétion de type III induit la nécrose des cellules de l’immunité innée
(polynucléaires neutrophiles et macrophages) et permet ainsi à la bactérie d’échapper au
système immunitaire. Par ailleurs, il provoque une destructuration du cytosquelette des
cellules épithéliales. Il joue donc un rôle primordial dans la phase de colonisation et
probablement dans la progression de l’infection pulmonaire chez les patients atteints de
mucoviscidose (Corech et al. 2005; Dacheux et al. 1999; Jaine et al. 2004). Le système de
sécrétion de type III existerait, selon les souches, sous deux états, inductible ou non inductible
(Dacheux et al. 2001; Feltman et al. 2001; Jaine et al. 2004).
Plusieurs toxines sont maintenant connues pour être sécrétées via le système III:
ExoY, ExoS, exoT et exoU. Toutes les souches de P. aeruginosa n’expriment pas l’ensemble
de ces toxines (Feltman et al. 2001). Il semble notamment que les gènes exoS et exoU soient
rarement retrouvés chez une même souche.
-
ExoS et exoT sont des cytotoxines présentant 76% d’homologie de séquence et
comprenant deux domaines actifs : une ADP-ribosyltransférase en C-terminal et un
domaine activateur de la Rho GTPase (GAP, GTPase activating protein) en Nterminal. Les protéines Rho étant impliquées dans le maintien du cytosquelette
d’actine, ces toxines engendrent un dérèglement de son organisation. La partie Cterminale est quant à elle impliquée dans l’inhibition de l’internalisation de P.
aeruginosa par les cellules épithéliales et les macrophages (Shaver & Hauser, 2004;
Barbieri & Sun, 2004).
-
ExoY est une adénylate cyclase directement injectée dans le cytoplasme de la cellule
hôte. Via l’intervention de cofacteurs eucaryotes, elle augmente le niveau d’AMPc
intracellulaire et conduit à la formation de pores membranaires et à la détérioration des
cellules endothéliales pulmonaires (Sayner et al. 2004). En perturbant le cytosquelette
d’actine, elle interviendrait en début d’infection en modifiant l’invasion des cellules
épithéliales par
-
P. aeruginosa (Cowell et al. 2005).
ExoU possède une activité phospholipase/lysophospholipase de type PLA2
(Sato et al. 2005), dégradant la membrane cellulaire une fois injectée dans le
cytoplasme et activée par des cofacteurs eucaryotes. ExoU possède une cytotoxicité
48
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
100 fois supérieure à celle d’exoS (Lee et al. 2005) et est associé à une forte
pathogénicité sur modèle animal (Hauser et al. 1998; Sawa et al. 1998).
Ces facteurs de virulence extracellulaires ou sécrétés, se sont également avérés
nécessaires pour l’expression de la virulence de P. aeruginosa dans des modèles animaux
(Blackwood et al. 1983; Hauser et al. 1998; Holder 1985; Nicas & Iglewski, 1985; Sawa et al.
1998).
I-1-2-3-Régulation de l’expression des facteurs de virulence
La synthèse et la sécrétion de la plupart des facteurs de virulence décrits sont
modulées en fonction du stade de croissance de la bactérie (phase exponentielle ou
stationnaire), du mode de développement (planctonique ou biofilm) et des conditions
environnementales dans lesquelles se trouve la bactérie, facteurs étroitement liés. Les
systèmes senseurs permettant à P. aeruginosa d’adapter son expression protéique aux
changements d’état et d’environnement sont principalement les systèmes à deux composants,
dont le Quorum Sensing (QS).
Les systèmes de régulation à deux composants permettent, grâce à la détection et la
transduction de signaux extérieurs, une réponse rapide de la bactérie face à des modifications
de l’environnement. Ils sont classiquement constitués de deux protéines liées par un transfert
de phosphate pour la transduction du signal:
-
une protéine kinase, généralement située dans une des membranes, appelée senseur.
En réponse à un signal, cette protéine s’autophosphoryle.
-
un régulateur de réponse sur lequel est transféré le groupement phosphate à partir du
senseur. Il possède un domaine de fixation à l’ADN et régule la transcription.
P. aeruginosa possède de nombreux systèmes de régulation à deux composants. Parmi
ceux-ci le QS permet une adaptation à l’environnement (stress nutritionnel, …) particulière
(formation de biofilm) et l’expression coordonnée de nombreux facteurs de virulence en
fonction notamment de la densité cellulaire. Ce système sera particulièrement détaillé dans le
chapitre I-3.
49
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-2-Biofilm
La capacité des microorganismes à coloniser les surfaces biotiques et abiotiques est un
processus universel. Ce processus conduit à la formation de dépôts plus ou moins structurés,
regroupés sous le terme générique de « biofilm ». Ce comportement des bactéries apparaît
comme une réponse adaptative à un environnement plus ou moins hostile, ou du moins peu
favorable à une croissance sous forme planctonique. Cette « différenciation » bactérienne
conduit à des modifications drastiques du comportement cellulaire, avec modification des
fonctions métaboliques et de l’expression des facteurs de virulence, ainsi qu’une sensibilité
diminuée aux moyens de défense naturels ou non de l’hôte, confèrant ainsi aux bactéries de
nombreux avantages (Davey & O'Toole, 2000):
-
protection
vis-à-vis
des
conditions
environnementales
grâce à la matrice
d’exopolymères qui structure le biofilm, assurant une homéostasie du milieu,
-
nutrition et coopération métabolique : des canaux aqueux sont présents dans toute la
structure du biofilm, permettant l’échange de nutriments et de métabolites entre les
espèces du biofilm et avec l’extérieur,
-
échange de matériel génétique : la proximité des cellules favorise ces échanges,
tendant vers une stabilisation de la structure du biofilm.
Dans le cadre des infections opportunistes, et notamment pour P. aeruginosa,
l’adhésion et secondairement la colonisation constituent des étapes clés précédant l’infection.
P. aeruginosa, comme certaines autres bactéries à Gram négatif, produit des agrégats
structurés ou biofilms (O'Toole et al. 2000), constitués d’une matrice essentiellement
composée de polysaccharides complexes dans laquelle sont insèrées les bactéries. Ces
biofilms forment une barrière physique contre l'entrée d'agents antimicrobiens (Costerton
2001; O'Toole et al. 1999), et sont considérés comme pathognomiques des infections
pulmonaires chroniques chez les patients atteints de mucoviscidose (Costerton 2001; HallStoodley et al. 2004; Singh et al. 2000).
50
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-2-1-Description des biofilms bactériens
I-2-1-1-Définition
Le biofilm est constitué d’une communauté de micro-organismes fixés à une surface et
généralement inclus dans une matrice extracellulaire (Carpentier & Cerf, 1993). Plus
généralement, est considérée comme biofilm toute association de micro-organismes adhérant
entre eux ou à une surface (Costerton, 1995). Cette définition regroupe des situations très
différentes, depuis quelques bactéries adhérentes à une surface, à des biofilms épais
présentant une diversité écologique importante, en passant par la flore commensale de la peau.
On admet généralement que dans un écosystème donné le nombre de bactéries attachées aux
surfaces est 1000 à 10 000 fois plus important que le nombre de bactéries planctoniques
(Watkins & Costerton, 1984).
La matrice extracellulaire est constituée d’exopolymères bactériens, de matière
organique et non organique, ainsi que de macromolécules du milieu environnant.
Ces biofilms, de par leurs caractéristiques physiologiques et génomiques, ainsi que de
par leur importance quantitative dans les écosystèmes, constituent une interface primordiale
physiologiquement active (Campanac et al. 2002a).
I-2-1-2-Formation des biofilms
Ce chapitre présente les étapes clés du processus de formation du biofilm.
Quatre grandes étapes peuvent être distinguées, une étape de transport ou transfert des
bactéries vers le support, l’adhésion initiale aux surfaces, une étape de prolifération
aboutissant à la formation de microcolonies et une étape de structuration du biofilm (figure 3).
A partir du biofilm, des bactéries ou plutôt des agrégats bactériens vont pouvoir se
détacher et secondairement coloniser des surfaces adjacentes.
51
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Figure 3. Représentation schématique de la formation d’un biofilm par Pseudomonas aeruginosa
présentant les différentes phases (Filloux & Vallet, 2003)
I-2-1-2-1-Transfert des bactéries vers le support
Depuis les observations de Zobell (1943), la préférence des bactéries pour une
croissance en mode sessile plutôt qu’en suspension dans des milieux aqueux est un
phénomène reconnu. Cependant, les bactéries ne peuvent pas orienter leur déplacement vers
les surfaces à coloniser sur de longues distances. Elles peuvent par contre reconnaître des
changements dans leur environnement chimique, notamment à proximité d’une surface ou
interface (Costerton, 1999). L’interaction bactérie-surface est influencée par une étape
préalable de transfert vers la surface cible (Rijnaarts et al. 1993; Van Loosdrecht et al. 1990).
Les bactéries peuvent entrer en contact avec le support grâce à différents moyens :
diffusion passive résultant des mouvements Browniens, transport passif via le fluide circulant,
ou mouvements actifs grâce à des structures telles que les flagelles (Van Loosdrecht et al.
1990).
-
Le transport par diffusion met en jeu les mouvements browniens qui permettent à la
bactérie d’atteindre une surface en conditions statiques « au hasard ». Ces
mouvements sont négligeables par rapport aux autres types de transfert excepté à
proximité d’un support où ils prédominent.
-
Le transport par convection, plus rapide, est en relation avec le flux dynamique de la
solution aqueuse (agitation du milieu et forces d’écoulement).
-
Enfin le rôle de la mobilité spécifique de la bactérie lors de cette étape de transfert doit
être envisagé. Théoriquement, les bactéries possédant des flagelles et pili vont pouvoir
52
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
se déplacer et se rapprocher plus facilement des surfaces, notamment par
chimiotactisme. Cette capacité à orienter son déplacement ne peut intervenir pour de
longues distances mais peut être mise à profit sur de courtes distances, notamment à
proximité d’une surface, lorsqu’il existe un gradient de concentration des nutriments.
Ceci a été démontré pour des bactéries flagellées telles que Altermonas sp.,
Alcaligenes sp. ou Vibrio alginolyticus, avec une augmentation du taux d’adhésion
corrélée à la vitesse de déplacement des bactéries (Morisaki et al. 1999). Cependant,
ce concept n’est pas généralisable et lors de la même étude, la souche de P.
aeruginosa testée ne montrait pas de variation de taux d’adhésion en fonction de la
vitesse de déplacement. Dans ce cas, la faible affinité de P. aeruginosa pour une
surface en verre était prédominante par rapport au facteur mobilité.
Un phénomène important pour l’étape d’adhésion des bactéries est le conditionnement
des surfaces. En effet l’immersion d’un support vierge de toute contamination dans un liquide
est immédiatement suivie par une adsorption de sels, de protéines, de glycoprotéines,… Cette
adsorption peut être en partie conditionnée par les propriétés physico-chimiques de la surface
et des molécules. La formation rapide d’un film contenant des matières organiques entraîne
une modification des propriétés de surface, et éventuellement une modification de l’affinité
des bactéries pour cette surface (Carpentier & Cerf, 1993). Ces dépôts organiques ou non
organiques n’étant pas répartis de manière homogène sur la surface immergée, la colonisation
bactérienne sera plus ou moins influencée.
La résultante des différentes forces décrite est un rapprochement plus ou moins aléatoire de la
bactérie de la surface.
I-2-1-2-2-Etape d’adhésion initiale
Les bactéries sont capables de se fixer à de nombreux supports de natures différentes
(inerte ou vivant) (Singh et al. 2000). Les premières espèces colonisatrices seraient des
bactéries possédant des mécanismes extrêmement efficaces d’acquisition des nutriments,
capables de se multiplier dans des milieux très pauvres (Szewzyk et al. 2000). Ainsi,
l’adhésion bactérienne va mettre en jeu différents mécanismes physico-chimiques et
biologiques.
53
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-2-1-2-2-1-Adhésion initiale réversible
Les premières étapes de l’interaction des cellules avec la surface constituent
l’adhésion réversible. Une simple agitation du milieu ou une variation de sa composition ou
une modification de la température peut éloigner la bactérie du support. Cette étape est très
rapide et n’impose pas que la particule soit « vivante ». Ainsi, tout matériau en contact avec
un fluide véhiculant des bactéries inactivées les verra quand même se déposer à sa surface.
L’adhésion initiale est la résultante de différents types de forces opérant entre la
surface inerte et la surface de la bactérie elle-même: (1) les forces d’attraction de Van der
Waals, (2) les forces électrostatiques (souvent répulsives car la plupart des bactéries et des
surfaces inertes sont chargées négativement), (3) les interactions hydrophobes pouvant
conduire à une attraction ou à une répulsion, (4) les interactions stériques toujours répulsives.
La faible énergie de ces liaisons explique la notion de « réversibilité » par simples
mouvements Browniens des bactéries.
Trois théories ont été proposées pour décrire ce phénomène:
-
La théorie de Derjaguin, Landau, Verwey et Overbeek (DLVO) ne prend en compte
que les forces électrostatiques de Coulomb, généralement répulsives, et les forces de
London-Van der Waals, attractives (Marshall et al. 1971). La résultante de ces
interactions conduit à l’attraction ou à la répulsion. Lorsqu’il s’approche à 10nm du
substrat, le micro-organisme adhère de manière réversible. A 5nm, la résultante des
forces devient positive, ce qui correspond au passage de la barrière de répulsion. Les
filaments d’expolymères synthétisés par la bactérie franchissent cette zone, ce qui
permet au microorganisme d’atteindre le minimum secondaire à environ 2nm, et
d’adhérer irréversiblement. Cependant, la théorie DLVO ne permet pas d’expliquer les
adhésions observées sur des surfaces non chargées négativement ou dans des solutions
très électrolytiques.
-
La théorie du mouillage, basée sur la thermodynamique des surfaces (Morra &
Cassinelli, 1997), prend en compte les forces de Van der Waals, les forces
électrostatiques et dipôle-dipôle en les considérant globalement sous le terme
d’enthalpie. Il y aurait adhésion des micro-organismes aux surfaces si la variation
d’énergie libre du système est négative. Cette théorie est essentiellement applicable
aux systèmes clos à énergie constante (sans apport extérieur et sans consommation
interne), ce qui n’est pas le cas dans un système comportant une phase biotique.
54
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
-
La théorie DLVO étendue (Jucker et al. 1998; Hermansson 1999) complète les
modèles précédents en prenant en compte d’autres interactions, notamment les
interactions acide-base de Lewis, les interactions stériques et les interactions
hydrophiles/hydrophobes (Van Oss, 1996; Grasso et al. 2002). Bien que plus
rigoureuse, cette théorie ne constitue qu’une ébauche d’explication du processus
complexe d’adhésion.
Après quelques heures de mise en contact du fluide véhiculant les bactéries et de la
surface, il est possible de montrer qu’une fraction des microorganismes est adsorbée et en
équilibre avec ceux présents dans la phase aqueuse (une modélisation de type Freundlich est
alors possible). Ces microorganismes ne sont pas stricto sensus en contact immédiat avec la
surface du matériau mais immobilisés à une dizaine de nanomètres (pour un milieu aqueux de
force ionique moyenne) et peuvent être libérés dans le milieu ambiant par une agitation
mécanique modérée, lors d’une variation de pH, de force ionique (Van Loosdrecht et al. 1987),
ou de température. A cet égard l’adhésion est dite réversible.
Les propriétés physico-chimiques des surfaces en présence vont jouer un rôle clé lors
de la phase d’adhésion initiale. Les propriétés généralement impliquées sont la balance
hydrophile/hydrophobe, la densité de charge, la perméabilité hydrodynamique.
Les matériaux ainsi que les enveloppes cellulaires possèdent des domaines hydrophiles
et des domaines hydrophobes ce qui explique la notion de balance hydrophile/hydrophobe
plutôt que de caractère hydrophobe.
La mesure de ce paramètre peut se faire grâce à différentes techniques, dont la
méthode MATH (Test d’Adhésion Microbienne aux Hydrocarbures) (Rosenberg et al. 1980)
ou la méthode MATS (Microbial Adhesion Test to Solvents) (Bellon-Fontaine et al. 1996),
applicables aux cellules bactériennes. Dans ce dernier cas, l’adhésion bactérienne est
considérée comme la résultante d’interactions électrostatiques, de van der Waals et donneuraccepteur d’électrons.
En ce qui concerne la densité de charge, la notion de surface portant des charges est
difficilement applicable à une bactérie du fait des EPS et LPS conduisant à une répartition des
charges non homogène que ce soit sur le plan bi ou tri-dimensionnel. Cependant, ce paramètre
est considéré comme très important dans le processus d’adhésion (Hayashi et al. 2001; Lytle
et al. 2004; Van der Mei et al. 1993) du fait des charges globales négatives des deux
structures en présence (cellule bactérienne et cellule eucaryote). Classiquement, l’évaluation
de cette caractéristique repose sur la mesure des mobilités électrophorétiques.
55
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
L’hydrophobicité des bactéries varie en fonction des espèces considérées, elle est
attribuée à différents composés (Figure 4):
•
Des protéines présentant des régions hydrophobes : ainsi, l’hydrophobicité de surface
de Streptococcus pyogenes est due à la présence de protéines de surface ou de
glycolipides complexés et orientés par ces protéines de surface (Ofek et al. 1983)
•
L’acide lipotéichoique (LTA) est impliqué dans les interactions hydrophobes des
bactéries à Gram + : le LTA libéré dans la paroi, à partir de son site initial à la surface
de la membrane cytoplasmique, peut adopter une conformation dans laquelle les
interactions ioniques entre sa chaîne polyglycérophosphate et des composants de la
paroi orientent la portion lipidique du LTA vers la surface externe, conférant des
propriétés hydrophobes à la bactérie (Ofek et al. 1983).
•
La présence de quantités importantes de lipides à la surface des cellules
d’Actinomycetaceae, rendant cette surface hydrophobe.
Figure 4. Structures cellulaires conditionnant les premières étapes de l’adhésion (Flemming & Wingender, 2001)
Par ailleurs cette hydrophobicité varie aussi en fonction des souches étudiées. Ainsi les
souches de Klebsiella pneumoniae exprimant le cluster de gènes mrk codant pour la synthèse
de pili de type 3 sont plus hydrophobes, plus adhérentes aux surfaces inertes (verre,
56
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
polypropylène) et plus à même de former des biofilms que les souches n’exprimant pas ce
cluster mrk (Di Martino et al. 2003).
Une même souche peut présenter un polymorphisme intraclonal : Pseudomonas sp.
CM 10 cultivée sur gélose forme d’abord des colonies mucoïdes qui génèrent ensuite une
forme secondaire non mucoïde plus hydrophobe et plus mobile (Matz et al. 2002).
Différents facteurs peuvent modifier les charges de surface des microorganismes et
donc les interactions électrostatiques:
•
La phase de croissance dans laquelle se trouvent les microorganismes: Echerichia coli
porte une charge négative plus faible en phase exponentielle, alors que Klebsiella
aerogenes a une charge plus importante dans cette phase (James & Djavan, 1982).
•
La production d’appendices cellulaire tels que les fimbriae: E.coli cultivée sur gélose
nutritive et produisant des fimbriae a une charge plus importante que la même bactérie
n’en produisant pas (James & List, 1966).
Les propriétés décrites sont la conséquence de la composition physico-chimique de
chaque interface, mais aussi du liquide environnant. Les facteurs environnementaux: pH,
température, composition en nutriments, force ionique du milieu, présence de biocides, … ont
une répercussion importante sur les propriétés de surface et / ou sur l’expression de structures
extra cellulaires des bactéries, donc sur l’adhésion aux supports. Le pH du milieu conditionne
la densité de charge des surfaces. La plupart des bactéries ont un point isoélectrique inférieur
à 7 ce qui conduit à une charge globale négative à des pH neutres (Lytle et al. 2004; Van
Loosdrecht et al. 1987). Les travaux de Gaboriaud et al. (2006) ont permis de mettre en
évidence que l’accroissement du pH du milieu entraîne une augmentation des forces de
répulsion associée à une augmentation de l’hydratation de l’enveloppe bactérienne
(modification de la balance hydrophile/hydrophobe), ce qui conduit au final à une forte
diminution de l’adhésion bactérienne aux surfaces hydrophobes.
En plus de modifier l’hydrophobicité et la charge des bactéries, les organites extracellulaires ont un rôle majeur dans deux processus essentiels lors de l’adhésion : la mobilité
des bactéries et l’attachement aux surfaces. Les flagelles leur permettent de se déplacer en
milieu liquide ou semi-solide et ils augmentent la probabilité d’accéder au support (Pratt &
Kolter, 1998). Les pili sont des adhésines majeures chez de nombreuses espèces bactériennes,
leur petite taille leur permet de passer facilement la barrière de répulsion et d’assurer la liaison
de la bactérie au support. Certains présentent une spécificité pour des ligands eucaryotes et
deviennent alors caractéristiques de souches pathogènes (ex: E. coli uropathogènes,…). Ils
57
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
sont aussi impliqués dans certaines formes de mobilité des bactéries à la surface des supports
solides « twitching mobility », qui sont sans doute plus importantes dans les étapes de
maturation du biofilm (Chiang et al. 2003).
I-2-1-2-2-2-Adhésion initiale irréversible
Le rapprochement de la bactérie du support va conduire au franchissement du
minimum secondaire avec mise en place d’autres types d’interactions conduisant à une
adhésion irréversible de la bactérie. La notion d’ « irréversibilité » est ici liée aux multiples
points d’interaction créés à ce stade conduisant à une liaison de forte énergie.
L’adhésion irréversible des bactéries implique le fait que les organismes immobilisés
soient vivants (ce qui n’était pas une condition clé dans l’étape réversible), capables de
reconnaître leur position proche d’une surface, sans doute à l’aide d’osmorécepteurs comme le
système EnvZ-OmpR (Vidal et al. 1998), d’exprimer un certain nombre de gènes et de
synthétiser en particulier une grande quantité d’exopolymères organiques impliqués dans «
l’ancrage irréversible » des bactéries à leur support (Davies et al. 1993; Stoodley et al. 1994).
Le terme « irréversible » implique que l’arrachage des bactéries de la surface nécessite alors une
force capable de rompre ces exopolymères ou de les dégager de leurs multiples points
d’interaction avec le matériau.
Cette étape est dépendante du temps et nécessite que les microorganismes soient capables
d’exprimer un certain nombre de gènes conduisant à l’acquisition de nouvelles structures
adhésives. Ces éléments sont également importants dans la mise en place des interactions entre
bactéries et dans la structuration du biofilm. Les gènes impliqués dans la synthèse de ces
structures ont été caractérisés chez de nombreuses espèces bactériennes incluant des bactéries à
Gram positif: Staphylococcus epidermidis (McKenney et al. 1998), des bacilles à Gram négatif:
E. coli, Pseudomonas aeruginosa (Davies et al. 1993), Vibrio cholerae (Wai et al. 1998) et des
mycobactéries.
Flagelle, pili et LPS constituent des éléments clés dans la mise en place de la phase
d’adhésion irréversible de P. aeruginosa aux cellules épithéliales, étape initiale indispensable
à la colonisation de l’épithélium respiratoire.
Parmi ces structures, les exopolymères synthétisés de novo par la bactérie jouent
également un rôle clé. L’immobilisation de la bactérie sur une surface (matériau ou cellule)
58
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
détermine l’expression de gènes spécifiques, laf chez Vibrio parahaemolyticus (McCarter et al.
1992), ica chez Staphylococcus epidermidis (McKenney et al. 1998), algC chez Pseudomonas
aeruginosa (Davies et al. 1993). Vidal et al. (1998) ont pu observer une hyperproduction de curli
(un type particulier de pili) par un mutant d’Escherichia coli présentant une capacité accrue
d’adhésion aux surfaces inertes régulée par le système EnvZ-OmpR. De la même manière, May
et al. (1991) ont démontré que des modifications microenvironnementales telles que les fortes
concentrations en NaCl et la déshydratation au niveau des poumons mucoviscidosiques
pouvaient activer la synthèse d’alginate par P. aeruginosa. Parallèlement, certains travaux
indiquent une différence entre les polymères impliqués au cours de la phase d’adhésion initiale et
ceux constituant la matrice du biofilm, hypothèse initialement soutenue par Crisp en 1972. Ainsi,
McKenney et al. (2000) démontrent la synthèse par S. epidermidis d’un polysaccharide (PS/A)
impliqué dans l’adhésion aux matériaux et d’un polysaccharide (PIA) impliqué dans les liaisons
intercellulaires.
Ces polymères organiques jouent sans doute un grand rôle dans la stabilité des activités
des bactéries fixées et de l’écosystème biofilm en confinant les activités exoenzymatiques, en
retenant l’eau, en protégeant contre les agressions toxiques et biologiques, mais aussi en
participant à la virulence exprimée par le microorganisme. Ainsi le phénotype mucoïde de
certaines souches de
P. aeruginosa est classiquement associé aux infections respiratoires de
patients atteints de mucoviscidose et surtout à leur degré de sévérité (Lyczak et al. 2002).
I-2-1-2-3-Colonisation de la surface
L’adhésion irréversible va conduire à la présence de cellules isolées, voire d’agrégats,
à la surface du matériau ou de la muqueuse. L’étape de colonisation consiste en une
accumulation plus ou moins intense et rapide par division cellulaire des bactéries adhérées,
mais aussi par recrutement continu de bactéries planctoniques. La colonisation peut être
divisée en 5 phases, caractéristiques d’une croissance de biomasse (Capdeville & Nguyen,
1990):
-
Phase de latence qui inclut la phase d’adhésion initiale avec adaptation des cellules
bactériennes à leurs nouvelles conditions de vie,
59
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
-
Phase d’accélération caractérisée par une forte augmentation de la biomasse fixée et
par une consommation élevée des nutriments (azote et oses) en liaison avec les
réponses adaptatives,
-
Phase d’accumulation linéaire qui correspond aux vitesses et taux maximaux de
production de biomasse, de protéines et de polysaccharides au sein de la structure,
-
Phase de ralentissement conditionnée par la nature et la disponibilité en substrats au
sein de la phase liquide, mais également au sein de la structure (Samrakandi et al.
1997), par la surface disponible (Belkhadir et al. 1988), l’hydrodynamique du
système,
-
Enfin, la phase de stabilisation apparente caractérisée par un équilibre dynamique
entre la perte de biomasse (mortalité bactérienne et détachement) et la persistance
d’une multiplication bactérienne.
Ce processus correspond donc à une occupation progressive de la surface disponible
(colonisation horizontale) et à un développement en épaisseur, conduisant à la formation
typique de microcolonies.
Parmi les polysaccharides, les acides uroniques et les acides hexuroniques peuvent être
retrouvés en proportions variables. Par ailleurs ces polysaccharides peuvent être porteurs de
différents groupements organiques (acétyle, succinyle, pyruvyle) ou inorganiques (sulfate) qui
modifieront leurs propriétés physico-chimiques. D’autres types de macromolécules sont
retrouvés dans cette matrice extra-cellulaire: lipides, protéines, acides nucléiques, en quantités
et en proportions variables suivant les biofilms étudiés (Flemming & Wingender, 2001). Les
protéines peuvent être substituées par des acides gras ou glycosylées, elles contribuent aux
propriétés hydrophobes de la matrice extra-cellulaire en raison de la présence d’acides aminés
hydrophobes. Les acides uroniques, les acides aminés acides et les nucléotides porteurs de
groupements phosphates sont impliqués dans les interactions électrostatiques avec des cations
multivalents
(Ca 2+, Mg2+, Fe3+) qui régulent et stabilisent la structure de la matrice (Chen et
al. 2002). La quantité d’EPS produite ainsi que la nature et les propriétés de ces EPS varient
en fonction des conditions environnementales: quantités de nutriments, présence de biocides,
hydrodynamique (Michaud et al. 2003; Olofsson et al. 2003).
L’EPS et notamment l’alginate sont considérés comme des facteurs clés dans la
structuration du biofilm de P. aeruginosa et dans certaines de ses propriétés. Cependant, la
présence d’alginate ne serait pas cruciale pour le développement d’une forme biofilm par
P. aeruginosa (Wozniak et al. 2003).
60
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-2-1-2-4-Maturation du biofilm
La phase de stabilisation apparente, correspond à un équilibre dynamique avec perte
de biomasse (mortalité et décrochement) et multiplication concomitante d’une partie de la
biomasse fixée. Le point important est la diminution de l’activité métabolique globale. Celleci met en jeu des mécanismes qui peuvent expliquer, au moins en partie, la résistance des
biofilms à certains antimicrobiens et son évolution en fonction de l’âge du biofilm. Ainsi, la
biomasse adhérée est caractérisée par un taux de croissance faible qui selon certains auteurs
(Nguyen et al. 1989; Jacquelin et al. 1994) serait corrélé à l’existence d’une masse active en
« surface » du biofilm et d’une masse peu active à l’intérieur du biofilm. Les microcolonies
formées, véritables entités structurales et biologiques, pourraient également exprimer une
immunogénicité spécifique.
Au sein du biofilm, l’activité métabolique globale ralentit et l’architecture se modifie.
Des canaux aqueux se créent entre les colonies permettant une circulation des nutriments,
enzymes et déchets. Un gradient de nutriments et d’oxygéne se créée, les cellules les plus
proches du support étant les moins alimentées, en « dormance » et donc les mieux protégées
vis-à-vis des agressions extérieures.
Le biofilm va donc acquérir une structure tridimensionnelle caractéristique et très bien
décrite dans le cas de P. aeruginosa. Les unités de base ont été décrites comme des structures
en forme de « champignons » (Dunne, 2002), au sein desquels les bactéries ne représentent
que 10 à 15% associées à 75% à 90% de matrice extracellulaire (Costerton et al. 1999).
Tout au long du processus de formation du biofilm, l’expression génomique est
modifiée (Costerton et al. 2003). Ceci conduit à des modifications phénotypiques drastiques
que ce soit en terme de taille, de profil des protéines membranaires, d’hydrophobicité de
surface,…
Les échanges avec le milieu environnant persistent, conduisant à un remaniement
constant de l’expression des gènes et donc du comportement et de la structure du biofilm.
A ce stade, et bien qu’en perpétuelle évolution, le biofilm est caractérisé par une perte
de sensibilité aux défenses immunitaires de l’hôte et aux traitements antimicrobiens qu’ils
soient de nature physique ou chimique (Gray et al. 1984; Duguid et al. 1992; Costerton, 1984;
Campanac et al. 2002).
61
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-2-2-Evolution et plasticité du biofilm
Le biofilm n’est pas une structure figée: plusieurs études montrent que les bactéries
peuvent s’y déplacer. Stoodley et al. (1994) ont observé en microscopie confocale, un biofilm
polymicrobien soumis à un régime turbulent (Re>1 400): ils ont démontré que des
microcolonies se déplaçaient à une vitesse maximale de 800µm/h à la surface du biofilm. Le
même type d’observation a été faite par Rice et al. (2003) sur un biofilm de P. aeruginosa,
sous un régime d’écoulement laminaire (Re=5). Certaines cellules métaboliquement plus
actives migraient à une vitesse de 1,5µm/h. L’étude de Klausen et al. (2003) a consisté à
cultiver des biofilms composés de deux souches de P. aeruginosa: la souche sauvage mobile
et un mutant pour les pili de type IV ayant perdu sa motilité. Des structures particulières, de
type “champignon”, se sont développées: la base de la structure était constituée de bactéries
immobiles tandis que le chapeau était constitué de bactéries mobiles (Figure 5).
Figure 5. Biofilm constitué d’une souche de P. aeruginosa mobile (jaune) et d’une souche
mutante ayant perdu sa mobilité (bleu), Barre: 20µm (Klausen et al. 2003)
L’échange de matériel génétique entre espèces au sein du biofilm est également
fréquent. II contribuerait à la stabilisation du biofilm (Molin & Tolker-Nielsen, 2003) et à la
diffusion de la résistance aux traitements antibiotiques ou de désinfection (Schwartz et al.
2003a, 2003b). Le transfert conjuguatif de plasmide a été étudié dans plusieurs types de
biofilms simples, généralement composés de quelques espèces seulement. Ce type de transfert
nécessitant un contact entre les cellules donneuses et réceptrices, son efficacité dépendrait du
ratio surface/volume (Molin & Tolker-Nielsen, 2003). II pourrait donc intervenir lors des
62
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
étapes précoces de la formation du biofilm (Licht et al. 1999), tandis que dans le cas de
structures matures la conjugaison n’aurait lieu qu’avec les cellules de la couche extérieure du
biofilm (Haagensen et al. 2007). L. pneumophila est ainsi capable de transfert conjuguatif
d’ADN chromosomique codant notamment pour le système dot/icm impliqué dans
l’expression de la virulence (Miyamoto et al. 2003).
L’autre mécanisme d’acquisition de matériel génétique (ADN chromosomique ou
plasmidique) est la transformation, qui a lieu chez des bactéries compétentes. L’induction de
cet état de compétence peut avoir lieu chez la plupart des espèces bactériennes et
s’accompagne généralement d’une lyse d’une partie de la population et d’une libération
d’ADN (Steinmoen et al. 2002). Dans le cas de Streptococcus mutans, Li et al. (2002) ont
démontré que la transformation a lieu essentiellement lors des étapes précoces de la formation
du biofilm (8 à 16 heures). Elle peut toucher jusque 1% de la population, soit 10 à 600 fois
plus que pour la transformation des bactéries en suspension. Elle est régulée par des signaux
cellulaires dépendant de la densité des bactéries présentes et permet le transfert de gènes de
résistance aux antibiotiques. Hendrickx et al. (2003) ont mis en évidence une transformation
plasmidique très efficace dans les biofilms d’Acinetobacter spp. Le taux de transfert le plus
élevé est obtenu avec des biofilms jeunes dans lesquels les cellules se multiplient activement,
et avec des concentrations d’ADN transformant élevées. La présence de cellules dans la phase
planctonique aurait un impact négatif sur le taux de transfert. Stone & Kwaik (1999) ont
démontré que L. pneumophila est naturellement compétente pour la transformation par de
l’ADN plasmidique ou de l’ADN chromosomique.
Les pili de type IV, impliqués dans l’attachement aux cellules eucaryotes et aux
protozoaires, sont également nécessaires à l’expression de cette compétence (Stone & Kwaik,
1999).
I-2-3-Détachement et mort cellulaire
Le détachement des cellules du biofilm est un phénomène complexe, peu exploré,
faisant intervenir de nombreux mécanismes simultanément. Ceux du quorum sensing, déjà
cités, sont sans doute impliqués via la régulation de l’expression de gènes, notamment ceux
impliqués dans la synthèse du rhamnolipide chez P. aeruginosa (Davey et al. 2003). La
diminution de la quantité de nutriments pourrait aussi entraîner un détachement des cellules.
Allison et al. (1998) ont montré que dans un biofilm constitué de l’espèce P. fluorescens la
63
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
diminution de la quantité de nutriments entraîne la sécrétion d’une polysaccharide lyase qui
dégrade la matrice du biofilm, facilitant ainsi la libération des bactéries. Chez E. coli K-12, la
protéine régulatrice CsrA (Carbon storage regulator A) sert d’activateur de la dispersion des
biofilms dans des conditions de culture variées (Jackson et al. 2002). Sur-exprimée chez E.
coli ou chez d’autres entérobactéries, cette protéine entraîne une inhibition de la formation des
biofilms. Chez la souche sauvage, l’expression de la protéine diminue lors du développement
du biofilm, puis augmente à nouveau dans le biofilm mature, entraînant un détachement des
cellules. L’expression de CsrA est liée à la synthèse du glycogène, donc à la quantité de
nutriments disponibles pour permettre cette synthèse. Par ailleurs les auteurs ont observé que
l’addition de glucose au milieu bloque la dispersion du biofilm via CsrA. L’hydrodynamique
a aussi un rôle important: Stoodley et al. (2001) ont montré qu’en cas de régime turbulent de
gros amas de cellules peuvent se détacher.
La mort des cellules du biofilm fait aussi partie du processus de renouvellement et de
dispersion de la biomasse. Un mécanisme original régissant l’autorégulation de la population
des biofilms est proposé par Webb et al. (2003). Les auteurs ont observé que dans un biofilm
constitué de l’espèce P. aeruginosa la mort d’un grand nombre de cellules intervient
régulièrement. Dans les effluents provenant du biofilm ils ont détecté un phage filamenteux
capable d’infecter et de lyser une partie de la population du biofilm, tandis que l’autre partie
des cellules semble résistante. Ce phage étant présent sous forme de prophage dans le génome
de P. aeruginosa, les auteurs formulent l’hypothèse qu’il constituerait un mécanisme de
différentiation des cellules à l’intérieur des microcolonies, facilitant la dispersion d’une souspopulation résistant à la lyse (Webb et al. 2003).
I-3-Communication intercellulaire
Face à une modification de leur environnement, les bactéries ont besoin de coordonner
la réponse de l’ensemble de la population présente en modifiant l’expression d’un grand
nombre de gènes (Bassler & Waters, 2005). La découverte de signaux de communication
extracellulaires sécrétés par de nombreuses espèces bactériennes est récente. Comme dans des
organismes supérieurs, l'information fournie par ces molécules est critique pour synchroniser
les activités de grands groupes de cellules. Dans les bactéries, la communication chimique
implique de produire, libérer, détecter, et répondre à ces signaux. Ce processus, nommé
quorum sensing (QS), permet à des bactéries de surveiller l'environnement, notamment la
64
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
présence d'autres bactéries, et de modifier leur comportement à l’échelle de la population en
réponse aux changements. La plupart des processus contrôlés par le quorum sensing sont
improductifs une fois entrepris par une bactérie individuelle agissant seule, mais deviennent
efficients une fois mis en jeu simultanément par un grand nombre de cellules. Ainsi, pour
certains auteurs (Bassler & Waters, 2005), la détection du quorum confond la distinction entre
les procaryotes et les eucaryotes puisqu'elle permet à des bactéries d'agir en tant
qu'organisations multicellulaires.
Ce système a un impact très large. Ainsi, les molécules impliquées dans le QS sont
capables de moduler l’expression des gènes chez des bactéries de la même espèce mais aussi
chez des bactéries appartenant à des espèces différentes (Fong et al. 2001; Riedel et al. 2001),
voire même chez des espèces eucaryotes (Mathesius et al. 2003; Sperandio et al. 2003).
Les bactéries produisent des molécules de signalisation diffusibles qui s’accumulent
dans le milieu au cours de la croissance. Le mécanisme de quorum sensing repose sur
l’interaction de ces signaux moléculaires diffusibles avec un régulateur transcriptionnel
protéique qui couple l’expression de certains gènes avec la densité de la population
bactérienne.
Chaque cellule sera alors capable de réagir à ces véritables « phéromones » bactériennes
lorsqu’une certaine densité de population est atteinte. Ce mécanisme de régulation global va
alors permettre aux bactéries de coordonner rapidement l’expression de certains gènes au sein
de l’ensemble de la population.
Décrit pour la première fois chez Vibrio fischeri, ce phénomène a été depuis identifié
chez des espèces bactériennes à Gram négatif et à Gram positif. Il est impliqué dans des
processus d’adaptation physiologique et métabolique (Van Delden et al. 2001), ainsi que dans
l’expression des facteurs de virulence et la formation de biofilm (De Kievit & Iglewski, 2000;
Withers et al. 2001).
Les systèmes mis en jeu peuvent être classés en trois grands groupes : le système
LuxI/R chez les bactéries à Gram négatif, utilisant généralement des homosérines lactones
comme molécule signal, le système utilisant des oligopeptides modifiés comme
autoinducteurs chez les bactéries à Gram positif et enfin, des systèmes hybrides (Henke &
Bassler, 2004). La figure 6 présente ces différents systèmes et les acteurs en jeu (Henke &
Bassler, 2004).
65
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Figure 6. Les trois principaux groupes de quorum sensing : LuxI/R, Oligopeptides et systèmes hybrides. Les
pentagones représentent les acyl homosérines lactones (AHLs) ; les lignes
les oligopeptides et les triangles
l’autoinducteur 2 (AI-2). Les principaux autoinducteurs et systèmes ou contrôlés par le quorum sensing, les plus
étudiés sont exposés sous chaque groupe. HPt, histidine phosphotransférase; P, phosphate ; Rr, régulateur de
réponse; SHK, senseur histidine kinase (Henke & Bassler, 2004)
Différentes familles de molécules signal ont donc été identifiées dont deux familles
retrouvées fréquemment chez de nombreuses espèces: les auto-inducteurs de type 1(Al-1) et
les auto-inducteurs de type 2 (Al-2). Les Al-1 sont essentiellement retrouvés chez des espèces
à Gram négatif appartenant aux protéobactéries (De Kievit & Iglewski 2000; Whitehead et al.
2001) (Tableau 1), tandis que les Al-2 semblent plus universels (Tableau 2).
66
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Homologues
LuxR/I
AhyR, AhyI
AHL majeur
Phénotype régulé
C4-HSL
AsaR, AsaI
C4-HSL
Protéase extra-cellulaire, formation du
biofilm
Protéase extra-cellulaire
TraR, TraI
3-oxo-C8-HSL
Conjuguasion
CepR, CepI
CvilR, CviI
C8-HSL
C6-HSL
EagR, EagI
3-oxo-C6-HSL
Protéase, sidérophore
Antibiotiques, violacéine, exoenzymes,
cyanure
Inconnue
CarR, ExpR
ExpI (Carl)
ExpR, ExpI
(EchR, EchI)
SdiA
3-oxo-C6-HSL
Carbapeneme, exoenzymes
3-oxo-C6-HSL
Pectinases
Inconnue
Division cellulaire
Nitrosomas europaea
Obesumbacterium
prteus
Pantoea stewartii
Pseudomopnas
aeruginosa
Unknown
OprR, OprI
3-oxo-C6-HSL
3-oxo-C6-HSL
Emergance de la phase lag
Inconnue
EsaR, EsaI
LasR,LasI
RhIR, RhII
(VsmR,Vsml)
3-oxo-C6-HSL
3-oxo-C12-HSL
C4-HSL
Pseudomopnas
aureofaciens
RhzR, PhzI
C6-HSL
Exopolysaccharide
Exoenzymes, Xcp, formation du
biofilm, RhlR, espaces inter-cellulaires
Exoenzymes, cyanure, RpoS, lectines,
pyocyanine, rhamnolipide, pili de type 4
Phenazine
Pseudomopnas
fluorescens
Pseudomopnas
syringae pv. Tabaci
Ralstonia
solanacearum
Rhizobium etli
RhzR,PhzI
Inconnue
Phenazine
PsyR, PsyI
Inconnue
Inconnue
SolR, SolI
C8-HSL
Inconnue
RaiR, Rail
Inconnue
Restriction du nombre denodules
Rhizobium
leguminosarum
Rhodobacter
sphaeroides
Serratia liquefaciens
RhiR
CerR, CerI
3-hyrdoxy-7-C14HSL
7-cis-C14-HSL
Nodulation, bacteriocine, suivie en
phase statinnaire
Echappement
SwrR, SwrI
C4-HSL
Swarming, protéase
Vibrio anguillarum
Vibrio ficheri
Xenorhabdus
nematophilus
VanR, VanI
LuxR, LuxI
Unknown
Inconnue
Bioluminescence
Virulence, lipase
Yersinia
enterocolitica
Yersinia pestis
Yersinia
pseudotuberculosis
Yersinia rukeri
YenR, YenI
3-oxo-C10-HSL
3-oxo-C6-HSL
3-hyrdoxy-C4HSL or an
agonist
C6-HSL
YpeR, YpeI
YpsR, YpsI
YtbR, YtbI
YukR, YukI
Inconnue
3-oxo-C6-HSL
C8-HSL
Inconnue
Inconnue
Motilité, clumping
Inconnue
Inconnue
Espèces
Aeromonas
hydrophila
Aeromonas
salmonicida
Agrobacterium
tumefaciens
Burkholderia cepacia
Chromobacterium
violaceum
Enterobacter
agglomerans
Erwinia carotovora
subsp carotovora
Erwinia chrysanthemi
Escherichia coli
Inconnue
Tableau 1. Homologues LuxR/Luxl, Al-1 synthétisés et phénotype régulé chez un certain nombre d’espèces
bactériennes (De Kievit & Iglewski, 2000)
67
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Espèce
Fonctions régulées par luxS
Génes régulés par luxS
Aggregatibacter
(Actinobacillus)
actinomycetemcomitans
Facteurs de virulence: leucotoxine,
acquisition du fer
afuA
Borrelia burgdorferi
Expression de nombreuses protéines sur
gels Bidimensionnels : ErpA, -I et –N
Motilité
Facteurs de virulence: toxines alpha, kappa,
theta
Division cellulaire, traitement de l’ADN,
forme de la cellule et morphologie
Facteurs de virulence: sécrétion de type II,
toxine Shiga, flagelles, motilité, division
cellulaire
Motilité (expression du flagelle)
Campylobacter jejuni
Clostridium perfringens
Escherichia coli W3110
Escherichia coli EHEC
(O 157:H7)
Escherichia coli EPEC
(O 127:H6)
Neisseria meningitides
Photorhabdus
luminescens
Bactériémie
Biosynthèse du carbapénème
pfo
242 gènes (puce ADN)
Opéron LEE, stx, ptsN, sulA, flhD
fliA, fliC, motA, qseA, qseBC, 404
gènes
cpm
Porphyromonas
gingivalis
Facteurs de virulence: protéase,
hémagglutinine, acquisition de l’hémine
Salmonella typhi
Biofilms
Salmonella typhimurium
Système de transport AI-2 ABC
Shigella flexneri
Facteur de transcription impliqué dans la
virulence
Facteurs de virulence: hémolysine protéase
virB
Facteurs de virulence: toxine cholérique,
pilus
tcpP, tcpA, ctxAB
env. 70 gènes de virulence
(puce ADN)
luxCDABE
Streptococcuse
pyogenes
Vibrio cholerae
Vibrio harveyi
Production de lumière, morphologie des
colonies
uvrB, hasF
speB, sagA
Tableau 2. Phénotypes et gènes régulés par LuxS (Al-2) chez un certain nombre d’espèces bactériennes
(Xavier & Bassler, 2003)
Les deux types de molécules dérivent de la S-adénosylméthionine (SAM) (Xavier &
Bassler, 2003) (figure7). Les enzymes de type Luxl forment les Al-1 à partir de la SAM et de
protéines acyl-acyl-transporteurs spécifiques (Acyl-ACPs). Ces réactions produisent aussi la
méthylthioadénosine (MTA) qui est ensuite transformée en 5’méthylthioribose (MTR). De
nombreuses méthyltransférases agissent sur la SAM et transfèrent un groupe méthyle sur des
substrats variés. Ces réactions produisent aussi la S-adénosylhomocystéine (SAH). La Pfs
hydrolyse l’adénine de la SAH pour former la S-ribosylhomocystéine (SRH). LuxS agit sur la
SRH et produit la 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD) et l’homocystéine. La DPD se
cyclise pour former le pro-A12, auquel est ajouté un atome de bore pour former l’Al-2. Chez
68
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
les bactéries ne possédant pas LuxS, la SAH est détoxifiée grâce à une hydrolase qui la
convertit en adénosine et homocyséine.
Figure 7. Biosynthèse des homosérines lactones et des auto-inducteurs de type 2 (Xavier & Bassler, 2003)
I-3-1-Le Quorum Sensing chez les bactéries à Gram négatif
Il s’agit du système LuxI/luxR médié par des acyl-homosérines lactones (AHLs)
produites par une synthase (I) et reconnues par un régulateur (R). A faible densité cellulaire,
la synthase est également faiblement exprimée. Les AHLs vont s’accumuler dans le milieu
extra-cellulaire au cours de la croissance et lorsque leur concentration atteint un seuil, vont
interagir avec leur récepteur spécifique. La formation du complexe récepteur/AHL entraîne la
modulation de l’expression des gènes cibles dont le gène de la synthase, d’où le nom d’autoinducteurs donné aux AHLs. Cette boucle d’auto-induction conduit à l’activation du système
chez les bactéries voisines, expliquant la notion de réponse coordonnée de l’ensemble de la
population.
69
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
I-3-1-1-Les auto-inducteurs de type 1: acyl-homosérines
lactones (AHLs)
Ces auto-inducteurs de type 1 sont composés d’un noyau lactone sur lequel est greffé
une chaîne N-acyl dont la longueur varie de 4 à 16 carbones, et qui peut être substituée par un
–OH, un –O ou un –H en position 3 (Fuqua & Greenberg, 2002) (Tableau 3). Le mode de
transport vers le milieu extra-cellulaire différerait en fonction de la longueur de la chaîne acyl.
Les AI-1 ont pour la première fois été mis en évidence chez Vibrio fischeri, espèce
symbiotique de nombreux poissons et calmars. Ces bactéries colonisent l’organe lumineux de
leur hôte, à l’intérieur duquel elles peuvent se multiplier en grand nombre. Quand la
population bactérienne, et donc la quantité de molécule signal est suffisamment importante, il
y a activation de la luminescence de V. fischeri. Chez cette espèce l’Al-1 (3-oxo-C6homosérine lactone) est synthétisé grâce au produit du gène luxl, et il diffuse librement à
travers les membranes de la cellule. Le récepteur est encodé par luxR, c’est un activateur
transcriptionnel cytoplasmique.
O
X
R
N
H
O
70
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
R
CH2CH2CH2
X
0
CH3CH2CH2
S
CH3COCH2
O
PhCH2COCH2
O
CH3(CH2)4
O
CH3(CH2)4
S
CH3(CH2)2COCH2
O
CH3(CH2)2COCH2
O
CH3(CH2)2COCH2
S
CH3(CH2)6
O
CH3(CH2)4COCH2
O
CH3(CH2)8
O
CH3(CH2)6COCH2
O
CH3(CH2)10
O
CH3(CH2)8COCH2
O
CH3(CH2)12
O
CH3(CH2)10COCH2
O
Nom chimique
N-Butanoyl-L-homosérine
lactone
N-Butanoyl-L-homosérine
thiolactone
N-(3-Oxobutanoyl)-Lhomosérine lactone
N-Benzoylaceryl-Lhomosérine lactone
N-Hexanoyl-L-homosérine
lactone
N-Hexanoyl-L-homosérine
thiolactone
N-(3-Oxohexanoyl)-Lhomosérine lactone
N-(3-Oxohexanoyl)-Dhomosérine lactone
N-(3-Oxohexanoyl)-Lhomosérine thiolactone
N-Octanoyl-L-homoserine
lactone
N-(3-Oxo-octanoyl)-Lhomosérine lactone
N-Decanoyl-L-homoserine
lactone
N-(3-Oxo-octanoyl)-Lhomosérine lactone
N-Decanoyl-L-homosérine
lactone
N-(3-Oxododécanoyl)-Lhomosérine lactone
N-Tetradecanoyl-Lhomosérine lactone
N-(3-Oxotetradécanoyl)-Lhomosérine lactone
Abréviation
BHL
BHL
OBHL
BAHL
HHL
HHT
OHHL
(D)OHHL
OHHT
OHL
OOHL
DHL
ODHL
dDHL
OdDHL
rDHL
OrDHL
Tableau 3. Structure des auto-inducteurs (McClean et al. 1997)
I-3-1-2-Les synthases
Trois familles de synthases d’acyl-HSL ont été décrites en fonction de leur homologie
de séquence.
La classe I regroupe les enzymes possédant une similarité avec LuxI de V. fischeri
(Fuqua & Greenberg, 1998). La classe II regroupe les enzymes LuxM, AinS et VanM (Milton
et al. 2001). La classe III est représentée par HdtS, isolé de P. fluorescens (Laue et al. 2000).
Quelque soit l’enzyme considérée, le mécanisme de synthèse des AHSL est
globalement identique. Ces synthases catalysent la liaison de la S-adénosyl-méthionine avec
la chaine d’acide gras d’une acyl-acyl-carrier protein (acyl-ACP).
71
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
1-3-1-3-Les régulateurs R
Deux classes de régulateurs ont été décrits:
-
Classe I ou de la famille LuxR qui agissent sous forme dimérique et sont constitués
d’un domaine de liaison à l’AHLs en partie N-terminale et d’un domaine régulateur de
la transcription avec un motif de fixation à l’ADN. La liaison AHLs/régulateur rend le
domaine régulateur accessible et fonctionnel.
-
Classe II, actuellement observée chez le genre Vibrio et constituée de protéines
homologues aux senseurs-régulateurs hybrides intervenant dans les systèmes de
régulation à deux composants.
Les systèmes de type LuxI/R paraissent relativement spécifiques d’espèce. Cependant,
des mécanismes de communication inter-espèces ont également pu être mis en évidence.
I-3-2-Communication inter-espèces: signal AI-2 et synthèse LuxS
En 1999, Surette & Bassler ont mis pour la première fois en évidence l’existence d’un
système de communication inter-espèces (entre E. coli, S. typhimurium et V. harveyi),
différent de celui impliquant les AHLs ou les oligopeptides. Depuis, ce type de signal,
dénommé AI-2 a été décrit aussi bien chez des bactéries à Gram + que chez des bactéries à
Gram -, avec une voie de synthèse identique et la nécessité de la présence de la protéine LuxS.
Ce signal serait impliqué dans la formation de biofilms mixtes et dans la régulation de
facteurs de virulence entre espèces (Fong et al. 2001; McNab et al. 2003).
Le rôle des auto-inducteurs de type 2 dans les processus de formation et de maturation
des biofilms a essentiellement été étudié dans le cadre des biofilms formant la plaque
dentaire. De nombreuses espèces isolées à partir de cet écosystème sont capables de sécréter
des Al-2 (Fong
et al. 2001). Streptococcus mutans est une espèce Gram positif cariogène
qui possède un gène luxS codant pour un Al-2 important dans la formation du biofilm. Un
mutant luxS - forme des structures granulaires dispersées plutôt qu'un biofilm d'aspect lisse et
confluent observé chez la souche sauvage (Merritt et al. 2003).
Le cas de Vibrio cholerae est particulier car les deux systèmes Al-1 et Al-2 coexistent
de la même façon que chez V. harveyi. Cette co-existence se traduit par l'existence de
cascades de régulation faisant intervenir des complexes communs aux deux régulateurs. Le
72
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
complexe LuxO joue un rôle charnière dans ce système. Lorsque la densité cellulaire est
faible il y a phosphorylation de LuxO qui en retour active un répresseur X (inconnu) qui
réprime l'expression de hapR (homologue de luxR de V. harveyi). V. cholerae exprime alors
un phénotype virulent et est à même de former des biofilms (Hammer & Bassler, 2003).
Inversement lorsque la densité cellulaire (donc la quantité d'autoinducteurs) est importante,
les voies de signalisation entraînent une déphosphorylation de LuxO, hapR est alors activé et
V. cholerae exprime un phénotype non virulent et incapable de former des biofilms, mais
exprime en revanche une hémagglutinine protéase.
Duan et al. (2003) ont observé, lors d’infections pulmonaires par P. aeruginosa chez
le rat, des lésions plus importantes en présence de flore oropharyngée.
I-3-3-Quorum Sensing chez Pseudomonas aeruginosa
Le Quorum Sensing est un système de régulation primordial dans l’expression de la
virulence de P. aeruginosa. En effet, son impact a été démontré à différents niveaux, de la
phase d’adhésion à la formation du biofilm, dans l’expression des facteurs de virulence et
dans la persistance de la bactérie au niveau pulmonaire (Imamura et al. 2005; Smith &
Iglewski, 2003). Les auto-inducteurs mis en évidence pour la communication inter-cellulaire
chez P. aeruginosa correspondent à des AHLs et des molécules proches des quinolones
(Pseudomonas Quinolone Signal : PQS) (Juhas et al. 2005) (Figure 8).
Figure 8. Structures des AHLs et de PQS chez P. aeruginosa (Juhas et al. 2005)
Chez P. aeruginosa, deux systèmes effecteur/récepteur impliquant les AHLs
coexistent et interviennent dans la régulation de l'expression d'un très grand nombre de gènes
73
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
(Figure 9).
Le système LasI/R fait intervenir une 3-oxo-C12-homosérine lactone (3O-
C12-HSL), le système RhlI/R une C4-homosérine lactone (C4-HSL). C4-HSL diffuse
librement à travers la structure pariétale bactérienne, alors que la 3-oxo-C12-HSL fait
intervenir un transport actif par pompes d’efflux (Pearson et al. 1999).
LasI, appartenant à la famille des synthases de type LuxI, synthétise la 3-oxo-C12HSL (Pseudomonas autoinducer 1: PAI1) qui se lie au régulateur LasR, homologue de LuxR
(Gambello & Iglewski, 1991; Pearson et al. 1994). Le couple LasR/PAI1 régule l’expression
de nombreux gènes, dont notamment ceux correspondant à des facteurs de virulence comme
LasA, LasB et l’exotoxine A. Par ailleurs, il régule positivement certains gènes impliqués
dans l’appareil de sécrétion de type II, couplant ainsi l’expression et l’export de certaines
toxines (Smith & Iglewski, 2003). La fixation de PAI1 sur LasR induit également une
activation de lasI créant une boucle d’auto-induction (Seed et al. 1995).
Le second système de régulation est codé par les gènes rhlI et rhlR. RhlI permet la
synthèse de PAI2 ou C4-HSL (Ochsner & Reiser, 1995) qui se lie au régulateur RhlR.
L’activation de ce dernier permet la régulation de gènes impliqués dans la synthèse des
rhamnolipides et la production de métabolites secondaires, tels que la pyocyanine.
Ces deux systèmes interagissent, et il existe une hiérarchie dans cette interaction:
LasI/R est requis pour l'induction de rhlI/R et certains promoteurs reconnus par RhlR peuvent
aussi être reconnus par lasR (Fuqua & Greenberg, 2002). La régulation de ces systèmes fait
appel à différents mécanismes; ainsi les synthases produisent d’autres homosérines que PAI1
et PAI2 capables de moduler les interactions autoinducteur-récepteur (Pearson et al. 1994;
Winson et al. 1995); de même PAI1 est capable d’entrer en compétition avec PAI2 pour la
liaison à RhlR, résultant en un complexe inactif (Pesci & Iglewski, 1997).
74
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Figure 9. Mécanisme moléculaire du Quorum sensing chez P. aeruginosa. Deux systèmes de Quorum sensing
ont
été identifiés chez P. aeuginosa : le système las et rhl. Le système est constitué d’un gène régulateur lasR
codant
pour la protéine LasR, d’un gène lasI codant pour une synthase auto-inductrice LasI participant à la synthèse
d’une
petite molécule de la famille des homosérines lactones : 3-oxo-C12-HSL. Le complexe LasR/3-oxo-C12-HSL
est
activateur transcriptionnel de gènes de virulence (indiqué en bas de la figure) et de lasI. Selon le même modèle,
le
système rhl est constitué de gènes rhlR, rhlI et d’une autre HSL : C4-HSL. Ce système active des gènes en
commun
avec le système las et propre comme le rhamnolipide. Le système las contrôle le système rhl. Le système las est
contrôlé négativement par le produit du gène rsaL et positivement par GacA et Vfr.
Récemment, 97 gènes dont la majorité ont une fonction hypothétique viennent d’être impliqués dans le QS
(Ruimy & Andremont, 2004)
Les travaux de Davies et al. (Davies et al. 1998) sur les biofilms de P. aeruginosa indiquent
l’implication de signaux intercellulaires de type « quorum-sensing » (homosérines lactones)
dans le développement de cette structure. Une souche sauvage de P. aeruginosa et un mutant
lasI sont capables d’adhérer et de proliférer sur une surface de verre. Cependant, le biofilm
formé par le mutant présente une architecture très différente, beaucoup plus uniforme et plus
fine, indiquant que ces systèmes participent à la différenciation finale. L’hypothèse est donc
l’induction d’une différenciation structurale du biofilm en liaison avec une production
suffisante du signal «quorum-sensing » par la biomasse. Les homosérines lactones produites
sont alors capables d’activer différents gènes de virulence.
75
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Figure 10. Gènes cibles du QS de P. aeruginosa (Lazdunski, 2003)
En fait, la régulation de l’expression des différents gènes est relativement complexe
(Figure 10) et ce à deux niveaux:
-
Certains gènes vont être régulés par un seul des deux AI, d’autres nécessitent les deux
AI simultanément pour voir leur expression modifiée,
-
L’organisation en cascade des deux systèmes du QS se traduit par une expression
séquentielle de gènes, à des stades différents de la croissance bactérienne et de
l’organisation de la population (Wagner et al. 2003, 2004), conduisant à des activités
précoces ou tardives lors de l’infection.
Contrairement aux deux systèmes précédents, pour lesquels les concentrations en
AHLs sont maximales lors de la transition entre la phase exponentielle et la phase stationnaire
de croissance, la concentration en PQS dans le milieu extra-cellulaire est maximale à forte
densité cellulaire (McKnight et al. 2000). En fait, la synthèse de PQS est sous la dépendance
des systèmes LasI/R (effet positif) et RhlI/R (effet négatif) qui contrôlent l’expression du
gène pqsR (Wade
et al. 2005). Le régulateur PqsR contrôle l’expression de nombreux
gènes impliqués dans la virulence dont ceux des opérons phnAB et pqsABCDE (Déziel et al.
2005; Wade et al. 2005).
Les trois systèmes de communication inter-cellulaire décrits sont donc imbriqués et
impliqués dans la pathogénicité de P. aeruginosa.
76
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
A ce jour, aucun signal de type AI-2 n’a été mis en évidence chez P. aeruginosa.
Cependant, cette espèce est capable de répondre au signal AI-2 par expression de gènes
coudant pour certains facteurs de virulence, comme LasB et l’exotoxine T (Duan et al. 2003).
Enfin, il faut souligner le rôle du facteur de transcription sigma alternatif RpoS,
classiquement mis en jeu à l’entrée en phase stationnaire de croissance et lors de différents
stress. RpoS est activé par RhlR couplé à la C4-HSL et stimule en retour la transcription de
LasR et de rhlR (Schuster et al. 2004). Un autre facteur sigma alternatif semble être impliqué
dans la régulation du QS. Il s’agit de RpoN, responsable de l’adaptation du métabolisme lors
d’une carence en azote et qui serait capable de réguler positivement RhlI en fonction de
l’environnement nutritionnel (Thompson et al. 2003). Ceci conduirait à une régulation de
certains gènes impliqués dans la virulence, dont la formation des pili ou la production
d’alginate (Ishimoto & Lory, 1989; Kimbara & Chakrabarty, 1989).
D’autres systèmes pourraient être impliqués dans la régulation du QS, comme le
système de signalisation impliquant les polyphosphoguanosines synthétisées par la protéine
RelA
(Van Delden et al. 2001).
Les mécanismes régulant positivement le QS comprennent un système à deux
composants impliquant les protéines LemA et GacA (Reimmann et al. 1997) et un système
utilisant
l’AMPc (Vrf) (Albus et al. 1997). GacA est un régulateur de réponse global,
appartenant au système à deux composants GasS/GasA. Ce système contrôle l’expression des
trois gènes lasR, rhlR et qscR et la production de nombreux facteurs de virulence en fonction
des signaux de l’environnement. Le circuit de régulation dépendant de l’AMPc et de Vfr
implique parallèlement que la régulation des gènes du QS est également sous la dépendance
du statut énergétique et métabolique de la cellule (Bleves et al. 2005).
Un autre régulateur, QscR, réprime l’expression des gènes QS dépendant en phase
exponentielle de croissance (Chugani et al. 2001) en formant des dimères avec LasR et RhlR
(Ledgham et al. 2003).
D’autres systèmes de régulation négatifs ont été observés, allant de la production de
compétiteurs (protéine RsaL capable de se fixer sur le promoteur de lasI) (De Kievit et al.
1999) à la modification de la perméabilité des membranes bactériennes et à la sécrétion de
lactonases capables de dégrader les AHLs (Fagerlind et al. 2003; Aendekerk et al. 2005;
Köhler et al. 2001).
77
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Le QS constitue ainsi un système de régulation de la réponse adaptative bactérienne,
dépendant de la densité bactérienne mais également d’autres facteurs, et dont l’impact est très
large.
Les Al-1 ont un rôle essentiel dans la régulation de la virulence de la bactérie in vivo:
chez un modèle animal, des mutants déficients en Acyl Homosérine Lactone (AHL) sont
nettement moins virulents lors d'essais d'infections pulmonaires ou d'infections sur brûlures
sévères et lors d'infections pulmonaires aiguës (Rumbaugh et al. 2000). Enfin lors de
l'infection expérimentale de Dictyostelium discoideum par P. aeruginosa, les mutants rhl
présentent aussi une virulence atténuée par rapport à la souche sauvage, tandis que les
mutants las restent virulents (Cosson et al. 2002). Les techniques récentes d’étude des
protéines (électrophorèse bi-dimensionnelle) ou des gènes exprimés ont permis de mettre en
évidence 27 protéines directement régulées
(Arevalo-Ferro et al. 2003) et 616 gènes
(soit plus de 10% des cadres ouverts de lectures de P.aeruginosa (Wagner et al. 2003)
directement ou indirectement régulés via le système de quorum sensing.
I-3-4-Quorum Sensing, biofilm et infections à P. aeruginosa
La capacité de P. aeruginosa à former des biofilms in vitro et in vivo a conduit à
considérer ce mode de vie comme une étape clé dans certains processus infectieux à P.
aeruginosa (Ruimy & Andremont, 2004). Ainsi, au niveau pulmonaire, de nombreux patients
peuvent présenter une étape de colonisation. Le développement d’une forme biofilm, avec
multiplication des bactéries adhérées, correspond au passage au stade infection.
Différents travaux ont mis en évidence le lien entre QS et pathologie liée à P.
aeruginosa. Ainsi, dans le modèle de pneumopathie à P. aeruginosa chez la souris nouveaunée, la souche PAO1 produit des lésions pulmonaires inflammatoires avec un infiltrat de
polynucléaires. Le mutant correspondant lasR est responsable d’une pneumonie moins sévère,
avec une mortalité réduite (Pearson et al. 2000; Tang et al. 1996). De manière globale, une
réduction de la virulence est observée chez les mutants affectant les gènes du QS. La même
implication du QS est notée pour des modèles d’infection cutanée à P. aeruginosa
(Rumbaugh et al. 2000).
Lors d’une étude récente sur souris C57BL/6 instillées par un inoculum de P.
aeruginosa inclut dans des billes d’agarose, Pierre et al. (2008) ont étudié la cinétique
d’expression de trois gènes de virulence de P. aeruginosa appartenant à des systèmes de
78
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
régulation différents
(exoS, lasI et algD) durant les 7 premiers jours de l’infection. Les
auteurs ont observé une diminution progressive de l’expression du gène exoS et une
augmentation de l’expression des gènes algD et lasI. Ces observations sont en accord avec
une perte progressive de la fonctionnalité du système de sécrétion de type III et un
développement du phénotype mucoïde avec production d’alginate au cours de l’infection. Les
principales fonctions régulées par les systèmes QS et impliquées dans la pathologie de P.
aeruginosa sont présentées dans le tableau 4
(Juhas et al. 2005).
Contrôle par las
Contrôle par rhl
Contrôle par PQS
Synthèse de PQS
Système rhl
Synthèse de PQS
Système rhl
Rhamnolipides
Rhamnolipides
Formation de Biofilm
Formation de Biofilm
Protéase alcaline
Protéase alcaline
Elastase
Elastase
Elastase
Pyocyanine
Pyocyanine
Lipase
Lipase
Lectines A et B
Cyanure d’Hydrogène
Cyanure d’Hydrogène
Sécrétion de Xcp
Sécrétion de Xcp
Lectines A et B
Chitinase
RpoS
Exotoxine A
Neuraminidase
Pvds-reg. endoprotéase
Catalase
Superoxyde dismutase
Aminopeptidase
Swimming
Exoenzyme S
Swarming
Swarming
Twitching
Twitching
Tableau 4. Fonctions régulées par le quorum sensing chez P. aeruginosa (Juhas et al. 2005)
La capacité à former des biofilms de P. aeruginosa représente la principale cause de
persistance des pneumopathies chez les patients mucoviscidosiques (Costerton et al. 1999).
Lors de la formation du biofilm, la quantité d'Al-1 ne peut être suffisante pour
déclencher l'activation de l'expression de gènes que lorsque les bactéries sont déjà nombreuses
Davies et al. (1998) ont observé la formation de biofilms chez des mutants lasl et rhl de P.
79
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
aeruginosa, montrant que lors des étapes précoces de la formation du biofilm les deux
mutants étaient capables d'adhérer au support et de former des micro-colonies semblables à
celles observées avec la souche sauvage. En revanche, pendant la phase de maturation seul le
mutant rhl formait des biofilms semblables à ceux observés avec la souche sauvage, tandis
que le mutant las formait des biofilms moins épais, sensibles à l'action du SDS 0.2%.
L'addition d'Al-1 dans le milieu restaure le phénotype sauvage. L'étude de Sauer et al. (2002)
a permis de distinguer cinq étapes différentes lors du développement de P.aeruginosa sous
forme de biofilms en milieu minimum: l'attachement réversible, l'attachement irréversible,
deux étapes de maturation et la dispersion (Sauer et al. 2002). A chacune de ces étapes
correspond l'expression de phénotypes particuliers, différant entre eux par l'expression d'au
moins 500 protéines. Par ailleurs les auteurs ont aussi observé que l'expression de lasI est plus
importante dans les étapes de maturation du biofilm. Le mutant lasI présente une matrice exopolysaccharidique nettement différente de celle observée chez la souche sauvage: EPS
essentiellement en surface des cellules, ne remplissant pas les espaces interstitiels du biofilm.
L'étude récente de Davey et al. (2003) confirme et apporte des explications à ces
observations. Elle semble démontrer que la différentiation du biofilm en une forme mature
"vascularisée" grâce à la formation de canaux aqueux serait due à la sécrétion de
rhamnolipide (biosurfactant) par P. aeruginosa. Le rhamnolipide ne serait pas nécessaire à la
formation de canaux, en revanche il empêcherait la colonisation de ces canaux par les cellules
en phase planctonique et pourrait avoir un rôle dans le détachement de micro-colonies du
biofilm. L'expression du gène codant pour le rhamnolipide étant régulée par les systèmes
Rhll-RhlR et Lasl-LasR, ces observations permettent d'expliquer les études précédentes
(Espinosa-Urgel, 2003).
L'importance des Al-1 dans la formation des biofilms a été mise en évidence chez
d'autres espèces : Chromobacterium violaceum (Martinelli et al. 2004), Aeromonas
hydrophila (Lynch et al. 2002), Burkholderia cepacia (Conway et al. 2002),… Chez ces
espèces, les AI-1 interviennent aussi dans les étapes de maturation des biofilms.
Au niveau des alvéloles pulmonaires, cette structuration en biofilm est primordiale.
La maturation peut ainsi se traduire par une calcification progressive expliquant l’inefficacité
des défenses de l’hôte, ainsi que des thérapies chimiques (Figure 11) (Costerton et al. 2003).
80
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Figure 11. Représentation schématique des stratégies de défenes au niveau pulmonaire: a) La surface de
l’épithélium est « surveillée » par des PMNs et des macrophages, qui phagocytent les bactéries planctoniques
rapidement et facilement. b) Les phagocytes alvéolaires sont incapables de phagocyter les bactéries présentes
sous forme de biofilm, même si celles-ci sont marquées par des anticorps spécifiques. c) Les fragments de
biofilm croissent et bourgeonnent dans le poumon colonisé et libèrent occasionnellement des cellules
planctoniques qui réagissent avec des anticorps et sont phagocytées. d) Le biofilm mature atteint un équilibre
avec le système immunitaire; des parties de la communauté bactérienne se « calcifient » pour former un
« réservoir » à long terme. (Costerton et al. 2003)
Parallèlement, Riedel et al. (2001) ont mis en évidence la possibilité d'une
communication entre espèces bactériennes d'un biofilm via un Al-1. Ils ont étudié des
biofilms intrapulmonaires chez la souris. Ces biofilms étaient constitués de deux espèces: P.
aeruginosa et B. cepacia (Riedel et al. 2001), qui sont fréquemment isolées lors d'infections
pulmonaires chez des patients atteints de cystite fibreuse. Lors de ces infections, P.
aeruginosa se développe dans les secrétions bronchiques et forme des structures apparentées
aux biofilms, sécrétant notamment des homosérines lactones de type 1 (Singh et al. 2000).
Les auteurs ont montré que les homosérines sécrétées par P. aeruginosa peuvent réguler
l'expression de protéases de B. cepacia impliquées dans la virulence, tandis que les
homosérines serétées par B. cepacia n'interagissent pas avec
P. aeruginosa (Riedel et al.
2001).
L’action du QS peut également s’exprimer au niveau de l’hôte. Ainsi, Williams et al.
ont démontré en 2004 que les AI de P. aeruginosa sont capables d’altérer la réponse
81
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
immunitaire sur cellules eucaryotes. Ainsi, la 3-oxo-C12-HSL stimule la production d’IL8 par
les cellules épithéliales pulmonaires (Smith et al. 2002) et influence également le processus
d’apoptose des macrophages et polynucléaires neutrophiles (Tateda et al. 2003).
Différentes études cliniques ont été réalisées afin de démontrer l’importance du QS
dans
les
infections
broncho-pulmonaires
à
P.
aeruginosa
chez
des
patients
mucoviscidosiques.
Storey et al. (1998) ont ainsi démontré que les niveaux des trancrits dans les
expectorations de lasR et de lasI sont corrélés entre eux et avec ceux de toxA, lasA et lasB. De
la même manière, Erickson et al. (2002), Geisenberger et al. (2000) et Singh et al. (2000) ont
démontré la présence des deux AHLs dans les expectorations et les biopsies transbronchiques
de la plupart des patients atteints de mucoviscidose. L’ensemble de ces données démontre le
lien entre QS, formation de biofilm et pneumopathies à P. aeruginosa et constitue
l’introduction à une nouvelle approche thérapeutique ciblée sur le QS et/ou la formation de
biofilm. Les travaux de Favre-Bonté et al. (2002) démontrent un ratio C4-HSL/3-oxo-C12HSL supérieur à 100 au niveau des bronches infectées de patients mucoviscidosiques,
soulignant l’importance d’un travail sur les analogues de la C4-HSL.
I-3-5-Quorum Sensing: cible potentielle dans le traitement des
infections à P. aeruginosa
I-3-5-1-Echecs thérapeutiques et résistance
P. aeruginosa est une bactérie naturellement très résistante aux antibiotiques et
s'adaptant rapidement aux attaques médicamenteuses. Ainsi, sans sélection ni renforcement
par des antibiothérapies antérieures, il ne sera souvent sensible qu’à quelques
antibiotiques: ticarcilline/acide clavulanique, gentamicine, ciprofloxacine, ceftazidine, et
pipéracilline seule ou avec ajout de tazobactam. Si l'infection survient chez un patient qui a
récemment reçu plusieurs antibiotiques, la bactérie sera vraisemblablement encore plus
résistante et d'autant plus dangereuse. La résistance de P. aeruginosa aux antibiotiques est liée
à l’existence ou l’apparition de différents mécanismes : production de β-lactamases,
sélectivité ou modification des porines, pompes d’efflux notamment dans sa forme biofilm,
expulsant activement les composants antimicrobiens (Aeschlimann, 2003; De Kievit et al.
2001; Poole, 2001).
82
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
La résistance naturelle ou acquise de P. aeruginosa n’explique pas à elle seule les
échecs thérapeutiques observés. Dans la revue présentée par Mayaud & le Groupe ECRIR en
2007, les principes thérapeutiques préconisés sont:
-
« le recours à une association d’antibiotiques à posologie élevée et guidée par
l’antibiogramme au moment de la primo-colonisation à P. aeruginosa et des périodes
d’exacerbation aiguë,
-
l’administration récurrente d’antibiotiques, quelle que soit la modalité, nécessitant une
attention particulière aux effets secondaires. »
Ce consensus actuel repose donc sur l’idée de détecter au plus tôt la primocolonisation à la période où l’éradication est jugée encore possible et de la traiter pour éviter
le passage à la chronicité. Cependant, cette approche thérapeutique reste un « pis-aller » dans
la mesure où les échecs restent fréquents, que ce soit en terme d’éradication de P. aeruginosa
ou de limitation de passage à la chronicité (Smith et al. 2003).
Dans tous les cas, l’antibiothérapie est donc associée à des mesures d’hygiène
(limitation des contaminations d’origine environnementale) et d’autres prises en charge
(kinésithérapie,…).
L’absence de réponse à un traitement théoriquement adapté (antibiogramme) doit laisser
suspecter une perte de sensibilité des bactéries sous forme biofilm. Cette résistance des bactéries
en biofilm est très étendue puisqu’elle concerne aussi bien les défenses immunitaires que les
traitements antimicrobiens au sens large qu’ils soient chimiques (antibiotiques, antiseptiques,
désinfectants) ou physiques (UV, température,…) (Costerton 1984; Wai et al. 1998). Ce
phénomène de résistance concerne tous les types de biofilms, à différents stades, que ce soit sur
biofilm mature (Saby et al. 2001), ou dès la phase d’adhésion initiale (Tresse et al. 1998).
La limitation des transferts de masse au sein de la matrice d’exopolymères a été
largement mise en cause dans cette perte de sensibilité, ainsi que les modifications de vitesse de
croissance bactérienne. Cependant, l’apparition de nouveaux concepts concernant les
changements physiologiques des bactéries incluses et leur régulation génétique mettent en cause
d’autres phénomènes, tels que des modifications de structure pariétale et des cibles des
antimicrobiens.
La matrice exopolysaccharidique peut exclure et/ou influencer la pénétration des agents
antimicrobiens (Darouiche et al. 1994; Nichols, 1991). Il a également été démontré que la partie
abiotique du biofilm joue un rôle dans la résistance en raison de son effet de neutralisation sur
83
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
beaucoup de composés. La complexité, ainsi que la nature fortement hydrophile et polyanionique
du matériel extra-cellulaire intervient dans les problèmes de transfert de molécules, ainsi que de
transfert de chaleur jusqu’au(x) cible(s) bactérienne(s). Au niveau des canaux aqueux, le transfert
est favorable aux molécules hydrophiles. Ici, la taille intervient relativement peu si l’on
considère que même des billes de polystyrène de 0,3µm sont capables d’atteindre la surface
colonisée (Stewart et al. 2000). Parallèlement, les charges négatives des exopolymères
limiteraient la diffusion de molécules chargées positivement, ce qui est le cas par exemple des
aminoglycosides (Hoyle & Costerton 1991).
Le rôle des exopolymères dans le phénomène de résistance des biofilms a été démontré
par différents travaux. Le changement de substrat carboné (nature et/ou concentration) se traduit
par une modification de la densité des exopolysaccharides (Samrakandi et al. 1997) et de la
sensibilité de biofilms d’E. coli et de P. aeruginosa (souche mucoïde et son mutant non
muqueux) (Marty et al. 1992) à l’hypochlorite de sodium et à la monochloramine. L’addition de
Ca2+ lors de la formation de biofilm à P. aeruginosa se traduit également par une augmentation
de la résistance, en liaison avec une modification de synthèse des exopolymères (Deretic et al.
1990), voire de structure de l’alginate (Hoyle & Costerton, 1991). Enfin, les différents travaux de
Alasri (1992) et Samrakandi (1996) indiquent que le niveau de résistance augmente avec l’âge
du biofilm, démontrant une évolution permanente de la structure, que ce soit en termes de
synthèse d’exopolysaccharides, d’accumulation locale de matières organiques (Xu et al. 1996) et
minérales (Anwar et al. 1992b) ou de modifications du métabolisme bactérien. Cependant, Jass
et al. (1990) ont démontré une résistance à la pipéracilline et la ticarcilline au sein des biofilms
malgré des concentrations locales théoriquement efficaces ce qui sous-entend l’intervention
d’autres paramètres dans le phénomène de résistance des biofilms.
Les modifications phénotypiques des bactéries liées à la formation de biofilm et à la
réponse de type QS ont ainsi plus récemment été impliquées dans la perte de sensibilité aux
désinfectants et aux antibiotiques.
L’adhésion et la structuration des biofilms se traduisent par des modifications de taille,
de profils des protéines membranaires (Tresse et al. 1998), d’hydrophobicité de surface des
cellules bactériennes, spécifiques d’espèce (Campanac et al. 2002). Différents travaux
soulignent le parallèle entre ces modifications et la diminution de sensibilité des bactéries du
biofilm.
La diminution du taux de croissance a été corrélée à la résistance des biofilms à certains
antibiotiques (β-lactamines, tobramycine, quinolones), ainsi qu’à certains biocides (ammoniums
84
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
quaternaires, phénols, biguanides) (Allison et al. 1990, Brown et al. 1998, Gilbert et al. 1990).
Par ailleurs, dès 1995, Costerton indiquait que les changements phénotypiques observés
pour les biofilms à P. aeruginosa sont sous la dépendance d’un facteur sigma similaire à ceux
régulant la sporulation, la réponse au(x) stress, ainsi que les variations de phase « rough-smooth
». Ce facteur sigma est impliqué dans la régulation du gène algC intervenant dans la synthèse
d’alginate et exprimé très rapidement après la phase d’adhésion (Davies et al. 1993), indiquant
que la simple adhésion induit des changements drastiques de synthèse protéique et par là-même
de cibles potentielles pour les antimicrobiens. Les travaux de Tresse et al. (1998) démontrent que
l’immobilisation d’E. coli se traduit par une modification de la composition en protéines de la
membrane externe, caractérisée par une sous-expression de OmpF. Celle-ci pourrait alors, pour
partie, expliquer la résistance des biofilms aux antibiotiques hydrophiles. De la même manière,
la diminution d’expression d’ompF pourrait être impliquée dans la résistance à certains biocides
(Campanac et al. 2002). Pour Tresse et al. (1998) et Vidal et al. (1998), les modifications
observées (sous-expression des porines, synthèse des curli) correspondent à une réponse de la
bactérie aux conditions environnementales à l’interface eau-matériau (Brown et al. 1985;
Costerton, 1998).
La structuration finale du biofilm ou sa maturation semble également jouer un rôle clé
dans la résistance. Ainsi, Davies et al. (1998) notent un détachement du biofilm P. aeruginosa
mutant lasI après 5 minutes de contact avec 0,2 % de SDS, alors que ce traitement n’a aucun
effet sur le biofilm formé par la souche sauvage et exprimant normalement le système « quorumsensing » (Chapitre I-2).
Cette notion de résistance des bactéries en biofilm et notamment de P. aeruginosa lors
de la colonisation progressive des poumons de patients atteints de mucoviscidose explique le
développement de nouvelles approches. Des approches vaccinales ont ainsi été envisagées
vis-à-vis de nombreux facteurs de pathogénicité exprimés par P. aeruginosa (Kipnis et al.
2006). Le rôle central du QS dans l’expression de ces facteurs a conduit à considérer celui-ci
comme une cible thérapeutique de choix (Le Berre et al. 2006).
I-3-5-2- Quorum Sensing: nouvelle cible thérapeutique
Le traitement traditionnel des maladies infectieuses est basé sur les composés qui
visent à tuer ou empêcher la croissance bactérienne planctonique. Les problèmes majeurs avec
cette approche sont le développement fréquemment observé de la résistance aux composés
85
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
antimicrobiens et l’inadéquation entre l’efficacité observée in vitro sur bactéries
planctoniques et in vivo sur bactéries en biofilm.
La découverte des systèmes de communication inter-bactéries, qui orchestrent des événements
temporels importants pendant le processus infectieux, a permis d’envisager des moyens
originaux d'améliorer la gestion de l'infection bactérienne différents de la simple notion
d'inhibition de croissance.
A l’heure actuelle, trois cibles potentielles sont envisagées (Ruimy & Andremont, 2004):
-
la synthèse et l’activité des HSL
-
la formation des complexes LasR et RhlR avec les HSL correspondantes
-
la transcription de lasR/lasI et rhlR/rhlI par les activateurs GacA et Vfr.
Des composés capables d’interagir au niveau de la signalisation bactérienne ont ainsi
pu être caractérisés (Hentzer & Givskov, 2003).
Le cas le plus typique est celui des macrolides, notamment l’azithromycine,
antibiotiques non anti-pyocyaniques, qui sont maintenant présentés en tant que traitement
efficace dans les infections à P. aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose.
L’efficacité observée n’est liée ni à un effet inhibiteur de croissance, ni bactéricide, mais
associe certainement différents modes d’action. Ainsi, l’azithromycine jouerait un rôle antiinflammatoire et, du fait de son action sur la synthèse protéique, modulerait la production de
certains facteurs de virulence par P. aeruginosa. Plus récemment, son rôle a été mis en cause
en tant qu’inhibiteur du QS et du biofilm (Tateda et al. 2001). Le traitement par
azithromycine a ainsi été associé à une amélioration clinique pour des patients avec des
infections de plus de 6 ans et chroniquement atteints par P.aeruginosa (Saiman et al. 2003).
Van Delden et al. (2003) ont démontré une interaction entre l’azithromycine et la C4-HSL,
remettant en cause le rôle secondaire donné à cette HSL dans la formation du biofilm.
Par ailleurs, l’instabilité des AHL notamment à pH alcalin, avec lactonolyse, a été
mise à profit. Ainsi, plusieurs espèces bactériennes dont Bacillus sp. possèdent naturellement
des lactonases capables de cliver le cycle des AHLs (Dong et al. 2002). L’introduction du
gène aliA codant pour une lactonase dans une souche de P. aeruginosa a été réalisée. Son
expression conduit à une diminution de C4-HSL et de 3-oxo-C12-HSL, limitant la
transcription des facteurs de virulence. Cependant, cette approche est limitée par la
réversibilité de la réaction et par la taille des enzymes rendant difficile leur utilisation par voie
86
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
systémique. D’autres approches concernent l’utilisation d’anticorps anti-3-oxo-C12-HSL
(Smith et al. 2003) ou la modification du métabolisme des acides gras (Hoang et al. 1999).
Une voie potentielle d’inhibition du QS consiste en l’utilisation d’oligonuléotides
antisens capables de s’hybrider aux ARNm des gènes lasR, rhlR ou rhlI, technique encore peu
appliquée aux bactéries. Par ailleurs, la démonstration de l’intervention d’autres facteurs de
régulation du QS ouvre la voie à de nouvelles perspectives (Ruimy & Andremont, 2004).
Enfin, la dernière approche concerne l’inhibition de la formation des complexes LasR
ou RhlR avec les AHL correspondantes. Différents antagonistes ont été mis en évidence et
évalués sur la virulence de P. aeruginosa (Smith et al. 2003).
Les premières découvertes dans ce domaine sont issues du monde marin. Au début des
années 1990, Peter Steinberg s’est étonné de voir la capacité de l’algue marine Delisea
pulchra à rester libre de toute colonisation dans des eaux pourtant infestées de bactéries. Dès
1997, un composé halogéné de type furanone, a été isolé de la macroalgue marine (Kjelleberg
et al. 1997). Par la suite, Manefield et al. (1999) ont pu démontrer que la molécule qui
prévient la contamination de l’algue a une structure très proche des HSL et se comporte
comme un antagoniste des AHLs.
Les furanones isolées d’algues déplacent la liaison LuxR-AHL et empêchent la
colonisation de l’algue par des bactéries. Leur action se traduit par une inhibition de la
transcription de gènes de virulence chez P. aeruginosa (Hentzer et al. 2002). Dans un modèle
de pneumopathie chez la souris, l’administration d’une furanone halogénée synthétique se
traduit par une réduction du nombre de bactéries dans les poumons et prolonge de manière
significative la période de survie des souris (Wu et al. 2004).
L'atténuation de la virulence bactérienne plutôt que la destruction du microorganisme
pathogène constitue un nouveau concept pour le contrôle des infections bactériennes
(Givskov
et al. 1996). Ce mode d'action pourrait limiter la pression sélective et donc le
développement de la résistance bactérienne.
Cette diminution de la virulence, avec réduction de la colonisation bactérienne et de la
réponse inflammatoire in vivo (Smith et al. 2002; Telford et al. 1998), est associée à une
inhibition de la formation de biofilm.
La conception de divers inhibiteurs de ce type pourrait faire l’objet de la synthèse de
médicament anti-biofilm. Le fait de bloquer la formation du biofilm, ou bien de le démanteler,
peut certainement aider à traiter efficacement les infections bactériennes liées à ce type de
structures (Filloux & Vallet, 2003).
87
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
Ainsi, parmi les nouvelles approches thérapeutiques envisagées, le système du QS
pourrait se révéler particulièrement intéressant ; les inhibiteurs du QS pouvant constituer une
nouvelle classe d’agents antibactériens (Spring et al. 2004).
Différents travaux portent sur la synthèse d’analogues des HSL impliqués dans le QS
de différentes espèces bactériennes (Geske et al. 2007, 2008). En ce qui concerne P.
aeruginosa, les publications font essentiellement état d’une recherche d’analogues de l’oxo-3C12-HSL (système las).
Nos travaux s’inscrivent dans cette lignée. Nous avons initié une recherche
comportant :
-
la conception et la synthèse d’analogues des acyl-homosérine lactones décrites chez
P. aeruginosa. Ces composés sont caractérisés par la présence d’une chaîne alkyle et
d’un hétérocycle.
CH3
(CH2)
2
C
O
NH
O
chaîne alkyle
CH3
(CH2)
8
C4-HSL
CH2
O
O
cycle lactone
C
C
O
NH
O
chaîne alkyle
O
cycle lactone
C12-HSL
Sur la base des données bibliographiques précédemment rapportées, notre intérêt s’est
porté spécifiquement sur les dérivés de la C4-HSL. Les composés que nous avons
sélectionnés (Tableau 5), sont caractérisés par la modification du cycle lactone qui est
l’élément commun à tous les auto-inducteurs produits chez les bactéries à Gram négatif. Le
cycle lactone a été remplacé par différents cycles ou hétérocycles à 5 ou 6 chaînons de
manière à moduler l’encombrement stérique. Ce sont des cycles aromatiques ou non et des
hétérocycles comportant un ou deux hétéroatomes (N, O ou S). Les hétérocycles azotés ont
été choisis en particulier en raison de la capacité des atomes d’azote à former des liaisons
hydrogène, plus facilement que les atomes de soufre. Ceci afin de vérifier si la présence d’un
atome accepteur de liaison hydrogène adjacent au groupement amine serait suffisante pour se
lier et activer le système rhlR/lasR.
88
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
CH3 - (CH2)2 – CO – NH – R
N
N
OH
S
S
N
O
CH3
N
R
N
S
N
O
O
N
N
N
S
Tableau 5. Structure des composés envisagés
Les synthèses ont été réalisées au laboratoire de Chimie Pharmaceutique de la Faculté
des Sciences Pharmaceutiques de Toulouse.
- l’évaluation des composés en C4 selon une méthode de criblage mise au point
dans le cadre de ce travail et reposant sur la mise en évidence d’un réel effet anti-biofilm avec
évaluation de l’impact des molécules sur les différentes étapes de formation du biofilm. Ce
travail, basé sur l’analyse des données de la littérature et des connaissances du laboratoire,
correspond à la sélection des conditions de milieu, d’inoculation, de renouvellement du milieu
et de visualisation de l’activité antibactérienne. Tous les essais ont été réalisés avec comme
contrôle, la furanone, afin de sélectionner des molécules originales actives également sur la
formation du biofilm. L’originalité de cette approche repose sur la sélection des composés
actifs sur des données directement phénotypiques in vitro, dans la perspective de
développements in vivo (Felix & Sternberg, 1997; Legouis et al. 2000; Tan & Ausubel, 2000;
Labrousse et al. 2000; Cash et al. 1979; Hentzer et al. 2003; Pierre et al. 2008). Un test de
cytotoxicité et un test d’inhibition d’adhésion aux cellules ont été réalisés sur cellules
eucaryotes correspondant à une lignée d’origine pulmonaire humaine pour définir l’intérêt
potentiel du composé sélectionné dans le traitement préventif ou curatif des infections à P.
aeruginosa.
Par ailleurs, les composés sélectionnés peuvent constituer des outils pertinents pour
l’étude du QS, ou plutôt du rôle réel de la C4-HSL au cours du processus de colonisation et
d’infection par P. aeruginosa. Ces analogues originaux de C4 sont structurellement différent
89
Chapitre I – Pseudomonas aeruginosa: Biofilm et Quorum Sensing
de la furanone, n'ont aucun atome d'halogène et certainement moins toxique (Martinelli et al.
2004).
Parallèlement, des modifications du modèle en flux continu utilisé au laboratoire de
Microbiologie Industrielle ont été initiées.
Les deux structures universitaires impliquées dans ce projet sont regroupées au sein de
l’EAD « Adhésion bactérienne et formation de biofilm » (LU 49), en cours de rattachement
au Laboratoire de Génie Chimique (LGC, UMR 5503).
90
Chapitre II- Matériels et méthodes généraux
Chapitre II
Matériels et méthodes généraux
91
Chapitre II- Matériels et méthodes généraux
92
Sommaire du chapitre II: Matériels et méthodes généraux
Sommaire du chapitre II: Matériels et méthodes généraux
II-1-Matériels……………………………………………………………………………….97
II-2-Milieux et solution de récupération…………………………………………………..97
II-3-Souches tests…………………………………………………………………………...98
II-3-1-Conservation, entretien et identification des souches…………………………....98
II-3-2-Préparation des suspensions bactériennes……………………………………….99
II-4-Produits testés…………………………………………………………………………99
II-5-Méthodes………………………………………………………………………………102
II-5-1-Dénombrement des Unités Formant Colonies (UFC)…………………………..102
II-5-2-Détermination de l’activité inhibitrice de croissance et bactéricide
des différentes molécules sur bactéries planctoniques ………………………….102
II-5-3-Observation par Microscopie confocale………………………………………...103
93
Sommaire du chapitre II: Matériels et méthodes généraux
94
Sommaire des tableaux et figures du chapitre II: Matériels et méthodes généraux
Sommaire des tableaux et figures du chapitre II: Matériels et
méthodes généraux
♦ Tableau 1. Produits synthétisés
Schéma 1. Méthode de synthèse des N-hétéroaryl-butanamides
Schéma 2. Méthode de synthèse de la furanone
95
Sommaire des tableaux et figures du chapitre II: Matériels et méthodes généraux
96
Chapitre II – Matériels et méthodes généraux
Ce premier chapitre présente les matériels et méthodes généralement utilisés et mis en
œuvre lors des différents essais.
II-1-Matériels
- Bain thermostaté maintenu à 30°C (Grant®, UK)
- Microplaques stériles 24 puits (Becton DICINSON®, USA)
- Microplaques stériles 96 puits (fond rond et fond plat) (Nunc®)
- Pompes péristaltiques (Masterflex®)
- Tube Tygon® (Tygon® standard 3603, réf.A87225, Masterflex®, Bioblock Scientific)
- Leica® confocal software, LCS) (INRA, Auzeville, IFR 40)
II-2-Milieux et solution de récupération
Il s’agit des milieux pour le dénombrement des bactéries et des milieux de formation
de biofilms.
- Bouillon Trypcase-Soja (TSA-B) (Biomérieux®, Crapon, France)
- Gélose Trypcase-Soja (TSA-D) (Biomérieux®, Crapone, France)
- Bouillon biofilm (BB) (Alasri et al. 1992):
Acides Aminés (Vitamin assay casamino acids, Difco)
0,1 g/L
Extrait de levure (Difco®)
0,1 g/L
MgSO4, 2H2O (Sigma® Aldrich)
0,2 g/L
FeSO4, 7H2O (Sigma® Aldrich)
Na2HPO4 anhydre (Sigma® Aldrich)
KH2PO4 (Sigma® Aldrich)
Lactose (Prolabo®)
0,0005 g/L
1,25 g/L
0,5 g/L
0,025 g/L
97
Chapitre II – Matériels et méthodes généraux
-
Bouillon Biofilm modifié (BBM):
MgSO4, 2H2O
FeSO4, 7H2O
Na2HPO4 anhydre
0,0005 g/L
1,25 g/L
KH2PO4
0,5 g/L
(NH4)2SO4 (Sigma® Aldrich)
0,1 g/L
Glucose (Fluka®)
-
0,2 g/L
0,05 g/L
Solution pour la récupération des bactéries adhérées présentes à la surface interne du
tube Tygon®:
Eau distillée stérile
q.s.p. 1000 ml
NaCl (Sigma® Aldrich)
8,5g
Tween 80 (Sigma® Aldrich)
5ml
II-3-Souches tests
Les souches tests correspondent à:
- Pseudomonas aeruginosa PAO 1 (Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France)
- Pseudomonas aeruginosa CIP A22 (Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France)
- Pseudomonas aeruginosa CIP 103407 (ATCC 15442) (Collection de l’Institut Pasteur,
Paris, France)
- Un isolat clinique provenant d’un sujet atteint de mucoviscidose et caractérisé mucoïde:
7844 M et son révertant non muqueux 7844 S (Laboratoire de Bactériologie – CHU Rangueil
– Toulouse).
II-3-1-Conservation, entretien et identification des souches
La conservation des souches est réalisée par congélation à -80 °C en bouillon Eugon
(Biomérieux®) additionné de 5% de glycérol (AES).
Avant toute manipulation, chaque souche est décongelée à température ambiante et
repiquée deux fois sur gélose trypcase-soja selon les recommandations de la norme NF EN
98
Chapitre II – Matériels et méthodes généraux
12353 (Antiseptiques et désinfectants chimiques. - Conservation des organismes test utilisés
pour la détermination de l'activité bactéricide, mycobactéricide, sporicide et fongicide). Les
milieux ensemencés sont incubés à 37°C en aérobiose pendant 24 heures.
L’identification des souches est contrôlée, après vérification de leur pureté, par l’étude
des caractères morphologiques macroscopiques et microscopiques (forme des colonies,
mobilité, coloration de Gram) et biochimiques (test oxydase, test catalase, API 20NE
(Biomérieux®).
II-3-2-Préparation des suspensions bactériennes
Les suspensions bactériennes sont réalisées extemporanément dans de l’eau distillée
stérile. La concentration bactérienne est évaluée par mesure néphélométrique à 640nm.
Une transmission de 77% correspond à une suspension titrant environ 1 à 3.108
UFC/mL. Selon les inoculi utilisés, des dilutions de raison 10 sont réalisées dans de l’eau
distillée stérile à partir de la suspension mère.
II-4-Produits testés
Le
laboratoire
de
Chimie
Pharmaceutique.
(LU49,
Faculté
des
Sciences
Pharmaceutiques, Toulouse, France) a réalisé la synthèse de la C4-L-HSL de P. aeruginosa,
de la 4 bromo-5- (bromométhylène) - 2 (5H) – furanone (appelée furanone dans la suite du
document) ainsi que des 21 analogues originaux des HSL (Tableau 1).
Le composé C4-L-HSL a été synthétisé selon la méthode décrite par Marner & Moore
(1978) en faisant réagir à température ambiante la L- homosérine lactone hydrobromée
(Sigma Aldrich) avec le chlorure d’acide butyrique dans le dichlorométhane (DCM) en
présence de pyridine.
Les dérivés 2 - 12 ont été obtenus de manière similaire par acylation de l’amine
correspondante
avec
l’acide
butyrique
dans
le
DCM
en
présence
de
N,N-
dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ou à partir du chlorure d’acide butyrique dans la pyridine
(Schéma 1).
99
Chapitre II – Matériels et méthodes généraux
R-NH2 + CH3-(CH2)2-COOH
DCC
DCM
CH3 -(CH2)2-CO-NH-R
R-NH2 + CH3-(CH2)2-COCl
pyridine
Schéma 1. Méthode de synthèse des N-hétéroaryl-butanamides (2-12)
La 4-bromo-5-bromométhylène-2-(5H)-furanone a été préparée par cyclisation de
l’acide 3,5-dibromolévulinique avec de l’acide sulfurique concentré selon la méthode décrite
par Manny et al (1997) (Schéma 2).
Br
Br
COOH
O
Br2
COOH
Br
H2SO4
H
O
O
Br
O
Schéma 2. Méthode de synthèse de la furanone
Les formules et les poids moléculaires des différents composés sont présentés dans le
tableau 1.
100
Chapitre II – Matériels et méthodes généraux
N°
R
Formule
PM
C5H2O2Br2
furanone
254
Br
H
1
Br
O
O
CH3 - (CH2)2 – CO – NH – R
2
S
C8H13NO2S
187
C7H12N2OS
172
C7H10N2OS
170
C11H12N2OS
220
C8H12N2O2
168
C10H13NO
163
C10H13NO2
179
C9H12N2O
164
C9H12N2O
164
C8H11N3O
165
C8H16N2O2
172
O
N
3
S
N
4
S
N
5
S
CH3
6
O
N
7
OH
8
9
N
N
10
N
11
N
12
N
O
Tableau 1. Produits synthétisés
Les solutions mères de produit sont préparées extemporanément à une concentration
maximale de 10-3 M dans l’eau pour préparation injectable (EPPI) pour les produits
hydrosolubles, en présence de 10% de DMSO pour les produits non hydrosolubles.
101
Chapitre II – Matériels et méthodes généraux
II-5-Méthodes
II-5-1-Dénombrement des Unités Formant Colonies (UFC)
A partir des différentes suspensions obtenues, des dilutions de raison 10 sont réalisées
en eau distillée stérile. Le milieu Trypcase-Soja gélosé est utilisé pour les différentes phases
de dénombrement par inclusion (1 mL des différentes dilutions). Les milieux ensemencés sont
incubés à 37°C en aérobiose durant 24 à 48 heures et les UFC sont dénombrées.
II-5-2-Détermination de l’activité inhibitrice de croissance et
bactéricide des différentes molécules sur bactéries
planctoniques
Les CMI (Concentrations Minimales Inhibitrices) ont été déterminées par
microméthode selon les indications du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de
Microbiologie (CASFM 2008) et de l’International Laboratory Standards (ILS, 2008). 100µL
de milieu de culture liquide sont déposés dans les 96 puits d’une microplaque stérile à fond
rond. 100µL de la solution-mère de chaque produit à tester sont déposés dans le premier puits
de 2 lignes (essais en double).
Après homogénéisation, des dilutions de raison 2 sont réalisées de la colonne 1 à la
colonne 10 incluse. L’inoculation a été réalisée par dépôt de 100µL de la suspension mère du
microorganisme test ajustée à environ 108 bactéries/mL ou à différentes concentrations, dans
chaque puits d’une seconde microplaque. L’ensemencement est réalisé à l’aide d’un
ensemenceur multipoint Denley (dépôt de 1
à 3 µL/puits : concentration finale 10 6
bactéries/mL pour un inoculum initial à 108/mL).
Les colonnes 11 et 12 servent respectivement de témoin stérilité du milieu (sans
produit et sans microorganisme) et de témoin croissance du microorganisme (sans produit et
avec microorganisme).
Après 24 heures d’incubation à 37°C, les CMI sont déterminées comme les plus
petites concentrations molaires avec absence de croissance visible.
Les CMB (Concentrations Minimales Bactéricides) sont obtenues par repiquage à
l’aide de l’ensemenceur multipoint de la microplaque de CMI vers un milieu gélosé.
102
Chapitre II – Matériels et méthodes généraux
Après 24 heures d’incubation à 37°C, les CMB sont définies comme les plus petites
concentrations molaires avec absence de croissance visible ou présence de 3 colonies ou
moins.
II-5-3-Observation en Microscopie confocale
L’étude par microscopie confocale permet de visualiser le biofilm. L’observation des cellules
vivantes et mortes est réalisée à l’aide de deux marqueurs différents. Le SYTO 9®
(Invitrogen® SARL, France, Europe) pour observer l’ensemble des cellules et l’iodure de
propidium (Invitrogen® SARL, France, Europe) pour les cellules mortes. 1µL de marqueur
est ajouté directement dans chaque puits, sans rinçage préalable.
L’acquisition des images est faite avec un système de balayage confocal laser SP2
(Leica®, Allemagne). Un faisceau de laser à argon à 488nm est utilisé pour l’excitation. La
fluorescence émise par l’iodure de propidium est collectée à une longueur d’onde de 543nm.
L’émission de fluorescence du SYTO 9® est recueillie entre 500nm et 540nm. Les images
sont intégrées par la projection de 150 images planes acquises sur l’axe z, avec une distance
de 0,4µm entre chaque plan (Leica® confocal software, LCS) (Alain JAUNEAU & Cécile
POUZET, INRA, Auzeville, IFR 40).
103
Chapitre II – Matériels et méthodes généraux
104
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
Chapitre III
Révision/modification du modèle en flux continu:
études préliminaires
105
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
106
Sommaire du chapitre III: Révision/modification du modèle en flux continu: études préliminaires
Sommaire du chapitre III: Révision/modification du modèle en
flux continu: études préliminaires
III-1-Présentation du modèle……………………………………………………………..112
III-1-1-Montage expérimental…………………………………………………………112
III-1-2-Inoculation du circuit………………………………………………………….113
III-1-3-Evaluation de la population adhérée…………………………………………..113
III-1-4-Evaluation de la population planctonique……………………………………..113
III-2-Evaluation de nouvelles conditions expérimentales……………………………….114
III-2-1-Modification de la longueur de la boucle Tygon®……………………………114
III-2-2-Evaluation d’une nouvelle composition du bouillon biofilm………………….115
III-4-Conclusion……………………………………………………………………………118
107
Sommaire du chapitre III: Révision/modification du modèle en flux continu: études préliminaires
108
Sommaire des tableaux et figures du chapitre III:
Révision/modification du modèle en flux continu: études préliminaires
Sommaire
des
tableaux
et
figures
du
chapitre
III:
Révision/modification du modèle en flux continu: études
préliminaires
•
Figure 1. Dispositif expérimental de formation des biofilms
•
Figure 2. Evolution des UFC/cm² de P. aeruginosa 7844 S (moyenne sur 3 essais
indépendants +/- écart-type) selon les métrages de tube Tygon®
•
Figure 3. Cinétiques de formation de biofilm (UFC/cm2: moyenne sur 2 essais
indépendants +/- écart-type) pour les deux milieux de culture avec la souche P.
aeruginusa 7844 S
♦ Tableau 1. Estimation de la quantité de carbone et d’azote apportées par le vitamin assay
casamino acid, l’extrait de levure et le lactose dans la formule du BB
♦ Tableau 2. Estimation de la quantité de (NH4)2SO4 et de glucose à ajouter dans le milieu
BB sans lactose, sans extrait de levure et sans vitamin assay casamino acids pour
conserver les apports en C et N
♦ Tableau 3. Compositions des milieux BB et BBM
109
Sommaire des tableaux et figures du chapitre III:
Révision/modification du modèle en flux continu: études préliminaires
110
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
Le modèle de formation de biofilm sur support inerte utilisé est un modèle en flux
continu mis au point au laboratoire et permettant l’obtention d’un biofilm à P. aeruginosa
reproductible et structuré. La cinétique de formation du biofilm ainsi que son intérêt en terme
d’outil pour l’étude du comportement du biofilm ont fait l’objet de différentes publications
(Alasri et al. 1992, Samrakandi et al. 1997, Campanac, 2002).
Ce modèle est caractérisé par l’utilisation d’une boucle de Tygon® de 190cm de
longueur. Les essais antérieurs réalisés (Pineau, 1996, Campanac et al. 2002) ont permis de
démontrer la difficulté de récupération d’un matériel suffisant, selon les temps d’analyse, pour
l’étude des composants du biofilm (malgré une zone de récupération de 90cm de longueur).
Par ailleurs, la composition du Bouillon Biofilm mise au point antérieurement pour la
formation de biofilm pour différentes espèces bactériennes, était caractérisée par la présence
de lactose, ose non utilisé par l’espèce P. aeruginosa.
Ainsi, nous avons étudié différentes modifications qui portent sur deux points:
- l’évaluation de différentes longueurs de tube Tygon® dans les conditions initiales
validées antérieurement, permettant d’une part la comparaison du nombre de cellules
adhérées sur le tube en début, au milieu et en fond de boucle, et d’autre part, une
extension de la surface disponible pour la formation du biofilm afin d’optimiser les
quantités de biofilm récupérées pour analyses secondaires (identification et
quantification de certaines molécules, extraction des ARNm,…),
- la modification de la composition du Bouillon Biofilm (BB), de manière à avoir un
système mieux adapté au métabolisme de P. aeruginosa tout en conservant les
caractéristiques jugées essentielles pour l’obtention d’un biofilm structuré (milieu
minimum, taux de renouvellement du milieu et d’élimination des bactéries
planctoniques,…).
Ces essais ont été réalisés avec la souche de P. aeruginosa 7844 S, antérieurement
étudiée au laboratoire et dont la cinétique de formation de biofilm en BB était connue.
Cette partie de nos travaux ne constitue qu’une étape préliminaire par rapport aux
objectifs.
111
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
III-1-Présentation du modèle
III-1-1-Montage expérimental
Le dispositif expérimental initial permettant d’obtenir la formation de biofilm présenté
dans la figure 1, est constitué d’une boucle en tube Tygon® de 6,4mm de diamètre interne et
d’une longueur totale de 190 cm (reliant les points A-B-P2-A).
Deux raccords en T relient le bioréacteur à un réservoir d’alimentation et à une
évacuation des effluents. La boucle est placée dans un bain thermostaté maintenu à 30°C ; le
biofilm étudié correspond à la zone comprise entre les points A et B (zone immergée). La
pompe P1 est une pompe d’alimentation en substrat à un débit de 2,5 à 3 mL/min et la pompe
P2 sert à l’homogénéisation du milieu au sein du circuit (100mL/min).
Figure 1. Dispositif expérimental de formation des biofilms
112
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
III-1-2-Inoculation du circuit
Après avoir rempli le circuit avec le milieu de culture, les débits des pompes P1 et P2
sont réglés.
L’inoculation est ensuite réalisée en injectant au niveau du point B, 5 à 10 mL d’une
suspension bactérienne contentant environ 108 UFC/mL. Le volume de l’inoculum est calculé
de façon à obtenir au sein de la boucle, une concentration en micro-organismes de l’ordre de
107 UFC/mL pour les conditions initiales.
III-1-3-Evaluation de la population adhérée
Pour chaque temps d’analyse, une portion de tube Tygon® est prélevée stérilement
sous hotte à flux laminaire après désinfection externe du tube Tygon® à l’alcool à 90°, et
coupée longitudinalement. L’intérieur est gratté au scalpel dans une solution de récupération.
Le dénombrement des bactéries cultivables est ensuite réalisé selon la méthode des UFC
(UFC/cm²).
La formule qui permet d’obtenir les résultats est la suivante:
Log UFC/cm2 de tube Tygon® = Log [(N × 1/D × V) / (2 × л × R × L)]
N: nombre de colonies dénombrées
1/D: inverse de la dilution
V: volume de solution de grattage
R: rayon du tube Tygon® (0,32cm)
L: longueur de la portion de tube (2cm)
III-1-4-Evaluation de la population planctonique
Un échantillon d’effluent est éventuellement prélevé à chaque temps d’analyse et les
UFC/mL sont déterminées.
113
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
III-2-Evaluation de nouvelles conditions expérimentales
III-2-1-Modification de la longueur de la boucle Tygon®
Trois essais indépendants ont été réalisés avec la longueur initiale (190cm) et une
longueur de 300cm lors du même essai (boucles Tygon® montées en parallèle). Ces essais ont
été réalisés en conditions initiales standard, à savoir en Bouillon Biofilm avec lactose (BB).
Sur la base des cinétiques de formation de biofilm précédemment définies pour P.
aeruginosa, la comparaison a porté sur les phases initiales jusqu’à l’obtention d’une
population adhérée cultivable « stable », avec les mêmes débits de pompes pour les deux
boucles et le même inoculum.
Les échantillons sont prélevés aux deux extrémités et au milieu des deux boucles en
même temps, ceci afin de vérifier l’homogénéité du biofilm sur toute la longueur de chaque
boucle.
La figure 2 présente les résultats obtenus concernant l’évaluation de l’impact de la
longueur de boucle (190cm et 300cm) sur la cinétique de formation du biofilm par la souche
7844 S en terme de population adhérée (UFC/cm2). Les résultats sont exprimés en
logarithmes décimaux des UFC/cm2 en fonction du temps de fonctionnement du modèle (2h,
5h et 7h). Etant donné l’absence de différences significatives entre les 3 sites de prélèvement
par boucle, quelles que soient des conditions d’essai, les valeurs indiquées correspondent à la
moyenne sur 3 essais indépendants avec prise en compte des 3 sites de prélèvement par
boucle.
114
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
Log UFC/cm2
9
8
7
6
5
Moyenne 190cm
4
Moyenne 300cm
3
2
1
0
0
2
4
6
8
Temps (h)
Figure 2. Evolution des UFC/cm² de P. aeruginosa 7844 S (moyenne sur 3 essais indépendants +/- écart-type)
selon les métrages de tube Tygon®
Ces résultats montrent que la longueur de la boucle n’induit pas de différences
significatives en terme de nombre de cellules cultivables adhérées, quelque soit le temps
d’analyse (2h, 5h et 7h) (test apparié, p>0.1) et quelque soit la localisation du site de
prélèvement (extrémités et milieu).
Les dénombrements réalisés sur les effluents démontrent également l’absence de
différence significative entre les deux cinétiques (BB et BBM).
Ces essais devront être complétés par des observations en microscopie confocale afin
de confirmer une structuration identique du biofilm, y compris pour des temps de formation
de biofilm supérieurs.
III-2-2-Evaluation d’une nouvelle composition du bouillon
biofilm
Notre objectif était ici double, d’une part remplacer les composants de composition
non ou mal définie tels que l’extrait de levure et d’autre part avoir un apport de carbone et
d’azote indépendants et en rapport avec le métabolisme de P. aeruginosa.
Dans une première phase, le remplacement du « Vitamin assay casamino acids » et de
« l’extrait de levure » par du (NH4)2SO4 (en tant que source d’azote) et du glucose (en tant
115
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
que source carbonée) a été évalué. De plus, le lactose, non utilisé par P.aeruginosa, a été
éliminé de la formule ; le glucose constituant un substrat assimilable par la bactérie. Les
apports en carbone et azote ont été respectés par rapport au BB initial avec un maintien du
ratio C/N. Ces modifications prennent au compte les données de la littérature concernant les
fonctions respiratoires de
P. aeruginosa et le fonctionnement du modèle en aérobiose
limitée.
Le tableau 1 indique les valeurs en pourcentages et en mM.L-1 de milieu de carbone et
d’azote amenées par le « Vitamin assay casamino acids », « l’extrait de levure » et le lactose
présents dans le BB initial.
Carbone
Azote
Pourcentage
mM.L
Pourcentage
mM.L-1
3,4
0,28
9,3
6,64
Extrait de levure
17,5
1,46
10,9
7,8
Lactose
42,11
0,88
-
-
Vitamin Assay casamino
-1
Acid
Total
2,62
1,44
Total sans lactose
1,74
1,44
Tableau 1. Estimation de la quantité de carbone et d’azote apportées par le « vitamin assay casamino acid »,
l’extrait de levure et le lactose dans la formule du BB
Le tableau 2 présente l’estimation des quantités de (NH4)2SO4 et de glucose capables
de remplacer les composés précédents avec maintien du ratio C/N.
Carbone (mM.L-1)
(NH4)2SO4
(PM=132)
Glucose
(PM=180)
Quantités (g.L-1)
Azote (mM.L-1)
Valeur calculée en
C
Valeur calculée en
produit
Valeur calculée en
N
Valeur calculée en
produit
-
-
1,44
0,72
1,74
0,29
-
-
0,05
0,1
Tableau 2. Estimation de la quantité de (NH4)2SO4 et de glucose à ajouter dans le milieu BB sans lactose, sans
extrait
de levure et sans « vitamin assay casamino acids » pour conserver les apports en C et N
Sur cette base, un Bouillon Biofilm Modifié (BBM) a été proposé. Sa composition est
présentée dans le tableau 3, en comparaison à celle du BB.
116
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
g.L-1
Bouillon Biofilm (BB)
Acides Aminés
(Vitamin assay casamino
acids)
Extrait de levure
Mg SO4, 2H2O
FeSO4, 7H2O
Na2HPO4 (anhydre)
KH2PO4
Lactose
g.L-1
Bouillon Biofilm Modifié
(BBM)
0,1
-
-
0,1
0,2
0,0005
1,25
0,5
0,025
(NH4)2SO4
MgSO4, 2H2O
FeSO4, 7H2O
Na2HPO4 (anhydre)
KH2PO4
Glucose
0,1
0,2
0,0005
1,25
0,5
0,05
Tableau 3. Compositions des milieux BB et BBM
Une comparaison a été réalisée entre les cinétiques de formation de biofilm en terme de
bactéries cultivables/cm2 de surface, en milieu initial (BB) et en bouillon synthétique calculé
(BBM).
Sur la base des cinétiques de formation de biofilm précédemment définies pour
P. aeruginosa, deux essais indépendants ont été réalisés avec une longueur initiale de boucle
de 190cm. Les deux boucles Tygon® alimentées par les 2 milieux sont montées en parallèle,
avec un même débit des 2 pompes et un même inoculum (P. aeruginosa 7844 S). La
comparaison a porté sur les phases initiales jusqu’à l’obtention d’une population adhérée
cultivable « stable ». Les résultats sont présentés sur la figure 3. Ils sont exprimés en Log des
UFC/cm2 en fonction du temps de fonctionnement du modèle (jusqu’à 52 heures).
9
8
Log UFC/cm2
7
6
5
BB
4
BBM
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
Temps (h)
Figure 3. Cinétiques de formation de biofilm (UFC/cm2 : moyenne sur 2 essais indépendants +/- écart-type)
pour les deux milieux de culture avec la souche P. aeruginusa 7844 S
117
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
Les différences observées entre les deux essais (BB et BBM) en terme de bactéries
adhérées cultivables, sont non significatives (test apparié, p>0,1), sur l’ensemble de la
cinétique, permettant d’envisager le nouveau milieu (BBM) pour des essais complémentaires
en modèle en flux continu (dosage et caractérisation des EPS).
Les dénombrements réalisés sur les effluents démontrent également l’absence de
différence significative entre les deux cinétiques (BB et BBM).
III-4-Conclusion
La formule initiale du BB permettait une formation de biofilm par différentes souches
aérobies (Alasri, 1992). Cependant, dans le cas de P. aeruginosa la présence de lactose en tant
que source de carbone est non justifiée étant donné la non assimilation de cet ose par cette
espèce.
Par ailleurs, la sélection de molécules d’intérêt en tant qu’inhibiteurs de formation de
biofilm (chapitre V) devrait nous conduire à une étude plus précise des mécanismes mis en
jeu et de ce fait à limiter les interférences du substrat avec les méthodes de caractérisation du
biofilm et plus particulièrement des EPS. Ainsi, la composition du milieu de formation du
biofilm a été modifiée, en conservant les apports de C et N sous forme de substrats définis.
Les essais présentés ne constituent qu’une étape préliminaire dans la validation de
nouvelles conditions de fonctionnement du modèle en flux continu. La validation finale
nécessite:
-
une confirmation quantitative ou semi-quantitative de la population adhérée
-
une comparaison qualitative des biofilms obtenus.
Ceci pourra être réalisé par microscopie confocale couplée à un dosage et une
caractérisation des EPS.
Cette première phase de nos travaux nous a cependant conduit à valider des
modifications primordiales du modèle biofilm en flux continu, plus adaptées à nos objectifs,
avec une optimisation de la composition du milieu par rapport à P. aeruginosa et de la surface
à coloniser pour augmenter la biomasse récupérée.
118
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
Ces nouvelles conditions pourront ainsi être mises en application, après la phase de
criblage, pour le (ou les) composés capables d’inhiber la formation de biofilm. Ceci devrait
nous permettre de mieux définir les mécanismes mis en jeu (étape non réalisée lors de cette
thèse).
119
Chapitre III- Révision/ modification du modèle en flux continu: études préliminaires
120
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Chapitre IV
Mise au point du modèle en microplaque
121
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
122
Sommaire du chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Sommaire du chapitre IV: Mise au point du modèle en microplaque
IV-1-Activité antibactérienne de la furanone sur bactéries planctoniques……………129
IV-1-1- Détermination des CMI et CMB en milieu TSA…………………………….129
IV-1-2- Evaluation de l’activité antimicrobienne en milieu BBM……………………130
IV-2-Optimisation des conditions de criblage……………………………………………130
IV-2-1-Essais en milieu liquide TSA-B……………………………………………….132
IV-2-1-1-Méthode d’évaluation de la biomasse adhérée:
mesure spectrophotométrique…………………………………........132
IV-2-1-2-Evaluation de la biomasse adhérée en fonction du temps
d’incubation………………………………………………………...134
IV-2-1-3-Evaluation de la biomasse adhérée: microplaques à 96 et 24 puits....136
IV-2-2-Comparaison entre TSA-B et BBM (5X) en microplaques à 96 et 24 puits....139
IV-2-3-Comparaison de la formation de biofilm sur microplaques 24 puits en
BBM X et 5X.Evaluation de la biomasse adhérée par numération des UFC…142
IV-2-4-Influence du renouvellement du milieu sur la formation du biofilm en
microplaque 24 puits en BBM (X)……………………………………………144
IV-2-5-Influence de l’inoculum sur la cinétique de formation du biofilm sur
microplaques à 24 puits en BBM (X)………………………………………....146
IV-2-6-Optimisation du protocole - Choix du protocole final…………………….......147
IV-3-Validation du modèle en microplaque : effet anti-biofilm de la furanone………..150
IV-3-1-Influence de la concentration en furanone…………………………...………151
IV-3-2-Etude cinétique de l’effet inhibiteur de formation de biofilm de la furanone...152
IV-3-3-Etude de l’interaction Furanone /C4-HSL………………………………….....156
IV-4-Conclusion………………………………………………………………………........158
123
Sommaire du chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
124
Sommaire des tableaux et figures du chapitre IV:
Mise au point du modèle en microplaque
Sommaire des tableaux et figures du chapitre IV: Mise au point
du modèle en microplaque
•
Figure 1. Protocole de formation de biofilm en TSA-B, en microplaque de 96 puits.
•
Figure 2. Evaluation de la biomasse adhérée à différents temps d’incubation avec la
bactérie P. aeruginosa 7844S (moyenne +/- écart-type, n = 6).
•
Figure 3. Valeurs des DO à 600 nm (moyenne +/- écart-type, n = 3) avec les différents
types de microplaques, après 8h et 24h d’incubation en bouillon TSA-B pour la souche 7844
S. (P: fond plat, R: fond rond)
•
Figure 4. Observation en microscopie confocale d’un biofilm de 24 heures (400X) (P.
aeruginosa 7844 S) obtenu en milieu TSA-B (X)
•
Figure 5. Evaluation de la biomasse adhérée après 24h en microplaques à 24 puits en
BBM (5X) pour les souches 7844 S, PAO 1, CIP 103407 (moyenne +/- écart-type, n = 3)
•
Figure 6. Évaluation de la biomasse adhérée après 48 et 72h de culture, en TSA-B et/ou
BBM (5X) en microplaques à 96 ou 24 puits, avec la souche P. aeruginosa PAO1 (moyenne
+/- écart-type, n = 3)
•
Figure 7. Numérations (UFC/mL)) des cellules adhérées (a) et planctoniques (b) sur
microplaques de 24 puits en BBM (X) ou (5X) - Souche PAO1 (105 UFC et 106 UFC) avec
changement de milieu à 24h (moyenne +/- écart-type, n = 3)
•
Figure 8. Numérations (UFC/mL) des cellules adhérées (a) et planctoniques (b) sur
microplaques à 24 puits en BBM avec ou sans renouvellement de milieu sur les souches 7844
S, PAO 1, CIP 103407 et CIP A22, inoculum à 106 CFU, (moyenne +/- écart-type, n = 3)
125
Sommaire des tableaux et figures du chapitre IV:
Mise au point du modèle en microplaque
•
Figure 9. Numération (UFC/mL) des cellules adhérées et planctoniques après 24h sur
microplaques à 24 puits en BBM pour les trois suspensions de PAO1 (moyenne +/- écarttype,
•
n = 5)
Figure 10. Etude en microscopie confocale de la formation du biofilm dans les conditions
expérimentales sélectionnées (400X): a) à 4h b) à 6h, c) à 24h et d) à 48h et les numérations
(UFC/mL) des cellules adhérées sur microplaques à 24 puits en BBM avec la souche
P. aeruginosa PAO 1(moyenne +/- écart-type, n =3)
•
Figure 11. Etude en microscopie confocale de l’effet de la formation du biofilm dans les
conditions expérimentales sélectionnées après 48h en présence de SYTO 9® et d’iodure de
propidium (400X)
•
Figure 12. Numérations (UFC/mL) des cellules adhérées (a) et planctoniques (b) en BBM
sur microplaques à 24 puits avec une suspension de PAO 1 (102 UFC) en présence des
différentes concentrations de furanone (moyenne +/- écart-type, n = 3)
•
Figure 13. Etude en microscopie confocale de l’effet de la furanone sur la formation du
biofilm (400X): a) Témoin à 4h et a’) Furanone (5.10-5M) à 4h, b) Témoin à 6h et b’)
Furanone (5.10-5M) à 6h, c) Témoin à 24h et c’) Furanone à 24h, d) Témoin à 48h et d’)
furanone à 48h
•
Figure 14. Etude en microscopie confocale de l’effet de la furanone sur la formation du
biofilm après 48h en présence d’iodure de propidium (400X): a) Témoin à 48h et a’)
Furanone (5.10-5M) à 48 heures
•
Figure 15. Pourcentages d'inhibition de formation de biofilm (moyenne +/- écart-type; n =
3) en présence de furanone et C4-HSL ajoutées aux différents temps de renouvellement du
milieu, numérations à 20h, 24h et 48h: (a) cellules adhérées, (b) cellules planctoniques
126
Sommaire des tableaux et figures du chapitre IV:
Mise au point du modèle en microplaque
♦ Tableau 1. Valeurs des CMI (M) et CMB (M) de la furanone vis-à-vis des 4 souches test.
♦ Tableau 2. Caractéristiques de certains protocoles de criblage de souches bactériennes
pour leur capacité d’adhésion et/ou de formation de biofilm
♦ Tableau 3. Présentation des conditions expérimentales du protocole I
♦ Tableau 4. Valeurs des DO (moyenne +/- écart-type, n = 3) obtenues à 600 nm et 490 nm
après culture en TSA-B en plaques de 96 puits à fond rond de P. aeruginosa 7844 S
♦ Tableau 5. Présentation des conditions expérimentales du protocole II
♦ Tableau 6. Présentation des conditions expérimentales du protocole III
♦ Tableau 7. Présentation des conditions expérimentales des protocoles IV et V
♦ Tableau 8. Présentation des conditions expérimentales du protocole VI.
♦ Tableau 9. Présentation des conditions expérimentales des protocoles VII et VIII
♦ Tableau 10. Présentation des conditions expérimentales du protocole IX
♦ Tableau 11. Présentation des conditions expérimentales du protocole X
♦ Tableau 12. Schéma d’addition de la furanone
♦ Tableau 13. Pourcentages d'inhibition de formation de biofilm (moyenne +/- écart-type;
n = 3) en présence de furanone ajoutée à différent temps de renouvellement du milieu,
numérations à 20h, 24h et 48h (100% de réduction signifie réduction > 6 log): (a) cellules
adhérées, (b) cellules planctoniques
127
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
128
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Notre volonté d’explorer l’effet inhibiteur potentiel de différentes molécules synthétiques
dans les différentes phases de formation du biofilm nous a conduit à développer un nouvel
outil spécifique au criblage en microplaque.
Ainsi, la mise au point et la validation d’un nouveau modèle d’évaluation de la
cinétique de formation de biofilm à P. aeruginosa en microplaque font l’objet du présent
chapitre.
Ce nouveau modèle est issu de la comparaison de différents protocoles de criblage en
microplaque rapportés dans la littérature et présentés comme permettant un criblage de
différentes souches et mutants, en terme de capacité d’adhésion et /ou de formation de
biofilms, et des données du laboratoire concernant le modèle en flux continu précédemment
décrit.
La validation repose sur l’évaluation d’un composé de référence connu pour son
impact sur la formation de biofilm par P. aeruginosa: la furanone (Martinelli et al. 2004).
Notre objectif étant de cibler une activité spécifiquement « anti-biofilm », nous avons
souhaité nous affranchir d’une activité antimicrobienne classique. De ce fait, nous avons en
premier lieu défini les valeurs de CMI (concentration minimale inhibitrice) et CMB
(concentration minimale bactéricide) de la furanone sur bactéries planctoniques.
IV-1-Activité antibactérienne de la furanone sur bactéries
planctoniques
IV-1-1-Détermination des CMI et CMB en milieu TSA
La détermination des CMI en TSA-B et la détermination des CMB sur TSA-D de la
furanone a été réalisée vis-à-vis de 4 souches de Pseudomonas aeruginosa (PAO1, CIP A22,
7844 S, 7844 M) pour une suspension à 108 bactéries/mL, selon le protocole décrit au chapitre
II, soit un inoculum final à 106 UFC/mL. Le tableau 1 présente les valeurs obtenues exprimées
en molarité (M).
129
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
CMI (M)
Furanone
1,25.10
-4
CMB (M)
5.10-4
Tableau 1. Valeurs des CMI (M) et CMB (M) de la furanone vis-à-vis des 4 souches test.
La furanone présente une activité antimicrobienne, de type inhibition de croissance
jusqu’à la concentration 1,25.10-5 M. Une activité bactéricide est détectée à la plus haute
concentration d’essai, 5.10-4 M.
IV-1-2-Evaluation de l’activité antimicrobienne en milieu BBM
Une deuxième série d’essais a concerné l’évaluation de l’activité antimicrobienne de
la furanone vis-à-vis de la souche PAO1, en BBM, selon le même protocole.
Dans les conditions d’essai décrites, les CMI n’ont pu être déterminées visuellement.
En effet, les caractéristiques du BBM ne permettent pas une croissance optimale des
bactéries sous forme planctonique. L’allongement du temps d’incubation ne conduit pas à un
développement de la biomasse planctonique visuellement détectable.
Le repiquage sur milieu TSA-D, à partir des microplaques en milieu BBM conduit
cependant à une détermination des CMB. Les résultats obtenus confirment les résultats
présentés dans le tableau 1: la furanone se révèle bactéricide à 5.10-4 M.
IV-2-Optimisation des conditions de criblage
Dans le cadre d’un criblage d’effet sur l’adhésion et/ou la formation de biofilm, la
littérature rapporte différents protocoles sur microplaques. Cependant, la plupart de ces
modèles sont utilisés pour une évaluation de la formation finale de biofilm ou du moins à un
instant t, sans connaissance de l’impact au niveau des autres phases. Leur mise en route nous
a permis de révéler leurs limites, par rapport à nos attentes, et de définir ainsi la nécessité de
modifications drastiques pour une approche plus ciblée et plus sensible.
Les données principales de la littérature concernant les méthodes classiques
d’évaluation d’un effet anti-adhésion et/ou anti-biofilm en microplaque sont présentées dans
le tableau 2.
130
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Ces modèles utilisent des milieux considérés comme minimums, mais avec des
apports carbonés et azotés qui restent relativement élevés, ainsi les concentrations en glucose
sont comprises entre 0,1 et 0,5% (TSA-B, M63 complémenté ou CAMHB). De ce fait, la
croissance sous forme planctonique est non négligeable, voire supérieure à celle des bactéries
adhérées. De même, des inoculi élevés (105 à 108 UFC) permettent un passage rapide en phase
exponentielle de croissance de la forme planctonique.
La détection de la biomasse adhérée est alors classiquement réalisée par simple
colorimétrie.
Conditions
expérimentales
Milieu
Microplaques
Inoculi
Souches
Modèle 1
(Filloux & Vallet, 2003)
M63
0,2 % Glucose
0,5 % Casamino acid
1mM MgSO4
96 puits
108 CFU
Cristal violet 1%
400 µL éthanol 95%
+ 600 µL EDS
Temps d’incubation 10-12h
37°C
Température
D’incubation
DO 600 nm
Evaluation de la
biomasse
Coloration
Quantification
Modèle 2
Modèle 3
Modèle 4
(Kadurugamuwa et al. 2003) (Eleaume, 2005) (Moskowitz et al. 2004)
TSA-B
TSA-B
CAMHB
Glucose 0,25%
Glucose 0,1%
ou MMB
96 puits
106 CFU
Safranine 1 %
Rinçage
96 puits
105 CFU
S. epidermidis
S. carnosus
Cristal violet
NaCl 0.9%
96 puits
24 h
37 °C
1-24 h
37 °C
Cristal violet 0.1 %
CAMHB
+ 0,1 % Triton x-100
20 h
37 °C
DO 490 nm
DO 492 nm
DO 590 nm
-
Tableau 2. Caractéristiques de certains protocoles de criblage de souches bactériennes pour leur capacité
d’adhésion et/ou de formation de biofilm
Ces modèles semblent plus adaptés à l’étude de mutants, notamment d’adhésion, qu’à
l’étude du comportement de P. aeruginosa en conditions réelles de colonisation des surfaces
qu’elles soient inertes ou qu’il s’agisse de muqueuses. En effet, dans ces conditions, le
processus dynamique inclut l’élimination au moins partielle des bactéries planctoniques et
métabolites et une accumulation limitée des AI dans les première phases.
Notre objectif étant de détecter une activité anti-biofilm de molécules synthétiques
analogues des homosérines lactones identifiées chez P. aeruginosa, nous avons réalisé
différents essais avec évaluation de la biomasse adhérée et incluant comme référence la
furanone (Martinelli et al. 2004), afin de contrôler et de définir les conditions optimales de
mise en évidence d’une activité anti biofilm.
131
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Nos essais ont porté sur l’évaluation de l’impact de différents paramètres:
-
Milieu de culture
-
Surface à coloniser
-
Temps d’incubation
-
Méthode de caractérisation de la biomasse adhérée
-
Inoculum
-
Renouvellement du milieu
IV-2-1-Essais en milieu liquide TSA-B
Une première série d’essais a été réalisée afin de définir les conditions optimales
d’évaluation de la biomasse adhérée, selon un protocole de formation de biofilm en milieu
TSA-B, en utilisant des microplaques de 96 puits à fond rond.
IV-2-1-1-Méthode d’évaluation de la biomasse adhérée : mesure
spectrophotométrique
Selon le protocole I décrit dans la figure 1 (Filloux & Vallet, 2003; Kadurugamuwa et
al. 2003), l’évaluation de la formation du biofilm en fin d’incubation a été réalisée par
spectrophotométrie, à deux longueurs d’onde: 600 nm (Filloux & Vallet, 2003) ou 490 nm
(Kadurugamuwa et al. 2003). Les caractéristiques principales du protocole sont résumées
dans le tableau 3. Les essais concernent la souche P. aeruginosa 7844 S.
132
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
100 µL de TSA-B
Microplaque de 96 puits fond rond
+ P. aeruginosa (inoculateur multi points)
(Suspension à 108 UFC/mL – concentration finale à 106 UFC/mL)
Incubation à +37 °C (24h)
1- Enlever le milieu
2- Rincer 4 fois (NaCl à 0,09%)
Incubation (NaCl à 0,09%) à +37°C (60mn)
Ajouter le cristal violet à 1% (10 min à +30 °C)
Rincer 3 fois (NaCl à 0,09%)
1-Ajouter 150 µL d’éthanol à 95 %
2-Transférer l’éthanol de chaque puits dans une cuve de
spectrophotomètre
3-Répétition de 1 à 2 (soit 300 µL d’éthanol à 95%)
Ajouter 600 µL d’EDS dans chaque cuve
Mesure de la DO à 600 nm ou 490 nm
Figure 1. Protocole de formation de biofilm en TSA-B, en microplaque de 96 puits.
Conditions expérimentales
Protocole I
TSA-B
Milieu
96 puits fond rond
Microplaques
P. aeruginosa 7844 S
Souche
108 UFC/mL (final 106 UFC)
Inoculum
24h à 37°C
Incubation
Cristal violet 1%
Coloration
300 µL ethanol 95% + 600µL d’EDS
Quantification
DO 600nm / 490nm
Evaluation de la biomasse
Tableau 3. Présentation des conditions expérimentales du protocole I
Ces premiers essais ont été réalisés dans une microplaque 96 puits fond rond avec la
souche de P. aeruginosa 7844 S, dans les conditions définies, à savoir: un inoculum élevé
(108 UFC/mL), un milieu de croissance (TSA-B) favorable aux bactéries planctoniques et un
temps d’incubation de 24 heures. Le tableau 4 présente les valeurs moyennes de DO +/- écarttype (n = 3) aux deux longueurs d’onde testées, 490 et 600 nm.
133
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Longueur d’onde
7844 S
λ = 600 nm
λ = 490nm
DO +/- ET
0,234 +/- 0,040
DO +/- ET
0,017 +/- 0,013
Tableau 4. Valeurs des DO (moyenne +/- écart-type, n = 3) obtenues à 600 nm et 490 nm
après culture en TSA-B en plaques de 96 puits à fond rond de P. aeruginosa 7844 S
Dans ces conditions, une lecture à 490 nm conduit à une valeur de DO faible (0,017)
avec un écart-type élevé par rapport à la valeur moyenne, indiquant la faible reproductibilité
et sensibilité des essais.
La lecture à 600 nm conduit à des valeurs de DO plus élevées ; l’écart-type reste
important. Les mesures ultérieures seront cependant réalisées à cette longueur d’onde.
Ces premiers résultats nous ont conduit à évaluer selon le même protocole l’impact
des autres paramètres (différents temps d’incubation, différents types de microplaques,
méthode d’évaluation de biomasse, …) sur la formation du biofilm et donc sur la capacité du
modèle à évaluer des inhibiteurs potentiels du QS.
IV-2-1-2-Evaluation de la biomasse adhérée en fonction du
temps d’incubation
Selon le protocole précédent (Tableau 3), différents temps d’incubation correspondant
à différentes phases supposées de formation du biofilm ont été testés, pour 6 souches de
Pseudomonas aeruginosa (7844 M, 7844 S, CIP A22, PAO 1). Les nouvelles conditions
expérimentales sont présentées dans le tableau 5 versus le protocole I (Tableau 3).
Les temps d’analyse sélectionnés sont : 2h, 6h, 8h, 22h, 24h et 48h. Des temps
inférieurs à 22-24 heures, temps classiques retrouvés dans tous les essais de sélection de
mutants non adhérents, ont été choisis afin de valider leur intérêt potentiel pour l’évaluation
des inhibiteurs du QS.
L’évaluation
finale
de
la
biomasse
adhérée
a
été
réalisée
par
mesure
spectrophotométrique à 600nm, après coloration au cristal violet, sur la base des résultats
précédents; les différences entre les deux protocoles étant mentionnées en gras.
134
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Protocole I
96 puits fond rond
TSA-B
P.aeruginosa 7844 S
108 UFC/mL (final 106 UFC)
24h - 37°C
Cristal violet 1%
300 µL ethanol 95%
+ 600µL d’ED-S
DO 600nm / 490nm
Evaluation de la biomasse
Tableau 5. Présentation des conditions expérimentales du protocole II
Conditions expérimentales
Microplaques
Milieu
Souche
Inoculums
Incubation
Coloration
Quantification
Protocole II
96 puits fond rond
TSA-B
P.aeruginosa (4 souches)
108 UFC/mL (final 106 UFC)
2h à 48h - 37°C
Cristal violet 1%
300 µL ethanol 95%
+ 600µL d’ED-S
DO 600nm
0,45
0,4
Abs (600nm)
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
2h
6h
8h
22h
24h
48h
Figure 2. Evaluation de la biomasse adhérée à différents temps d’incubation avec la bactérie P. aeruginosa
7844S (moyenne +/- écart-type, n = 6).
La figure 2 indique les valeurs de DO observées pour la souche P. aeruginosa 7844 S
(moyenne +/- écart-type, n = 6) aux différents temps d’incubation. Aux temps 2h, 6h et 8h, les
valeurs de DO sont faibles. Le même résultat est observé pour toutes les souches : valeurs de
DO inférieures à 0,1 avec des écart-types supérieurs à la valeur moyenne.
Une phase de croissance est observée au-delà du temps 8h, avec obtention d’un plateau
entre 24 et 48h pour toutes les souches testées. Cependant, les valeurs de DO observées
manquent encore de reproductibilité. Ce phénomène est notamment en liaison avec la
formation d’un film à la surface du milieu de culture, difficile à éliminer de manière
reproductible par simple rinçage. Ce film peut être assimilé à une formation de biofilm à
135
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
l’interface air/liquide. L’objectif du protocole étant une évaluation de la biomasse adhérée aux
surfaces solides (rinçage des puits) plus en rapport avec le type de biofilm observé in vivo
(Rice et al. 2008), nous avons donc considéré que ce film pouvant interférer avec l’évaluation
spectrophotométrique devait être éliminé. Ainsi, une série d’essais a été réalisée en essayant
d’améliorer l’élimination de ce film (enlèvement à l’écouvillon et rinçage). Aucune de ces
méthodes n’a conduit à une amélioration significative des résultats.
Les problèmes rencontrés, notamment en terme de reproductibilité des résultats
concernant l’évaluation de la biomasse adhérée par mesure spectophotomètrique après
coloration au cristal violet, nous ont conduit à évaluer l’impact de la surface de formation du
biofilm. Pour cela nous avons comparé les microplaques à 96 puits à fond rond aux
microplaques à 96 puits à fond plat et aux microplaques à 24 puits à fond plat, ces dernières
présentant des surfaces supérieures et des volumes plus importants permettant ainsi des
rinçages plus efficaces, sans résidus de film de surface.
IV-2-1-3-Evaluation de la biomasse adhérée: microplaques à 96
et 24 puits
Les essais ont été réalisés avec la souche 7844 S, présentant une cinétique de
croissance en biofilm détectable selon les essais antérieurs (microplaque à 96 puits à fond
rond, protocole décrit dans le tableau 4, lecture à 600 nm après coloration au cristal violet).
Les suspensions bactériennes sont ajustées à 108 bactéries/mL. L’inoculation a été réalisée à
l’aide d’un ensemenceur multipoints pour les microplaques à 96 puits et avec 500µL de la
même suspension diluée au 1/100 pour les microplaques à 24 puits, afin de conserver un ratio
milieu /bactéries comparable. L’évaluation de la biomasse adhérée a été réalisée après 8
heures et 24 heures d’incubation à 37°C, temps sélectionnés sur la base de nos essais
précédents.
Le tableau 6 résume les conditions expérimentales du protocole III; les différences
sont mentionnées en caractères gras.
136
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Conditions expérimentales
Microplaques
Protocole I
96 puits fond rond
Protocole II
96 puits fond rond
TSA-B
P.aeruginosa 7844 S
TSA-B
P.aeruginosa
(4 souches)
108 CFU
108 CFU
Inoculums
24h - 37°C
2h à 48h - 37°C
Incubation
Cristal
violet
1%
Cristal
violet 1%
Coloration
300 µL ethanol 95%
300 µL ethanol 95%
Quantification
+ 600 µLd’ED-S
+ 600µL d’ED-S
DO 600 / 490 nm
DO 600 nm
Evaluation de la biomasse
Tableau 6. Présentation des conditions expérimentales du protocole III
Milieu
Souche
Protocole III
96 puits : fond plat et
rond
24 puits : fond plat
TSA-B
P.aeruginosa 7844 S
108 CFU
8h à 24h - 37°C
Cristal violet 1%
300 µL ethanol 95%
+ 600 µL d’ED-S
DO 600 nm
La figure 3 indique les valeurs de DO (moyenne +/- écart-type) pour trois essais
indépendants dans les trois conditions après 8h et 24h d’incubation (souche 7844 S).
0,8
.
0,7
0,6
Abs (600nm)
0,5
24 puits
0,4
96 puits (P)
96 puits ( R )
0,3
0,2
0,1
0
8h
24 h
** p <0.001
Figure 3. Valeurs des DO à 600 nm (moyenne +/- écart-type, n = 3) avec les différents types de microplaques,
après 8h et 24h d’incubation en bouillon TSA-B pour la souche 7844 S. (P: fond plat, R: fond rond)
Les résultats observés indiquent des valeurs de DO significativement supérieures pour
les essais réalisés en microplaques à 24 puits aux deux temps d’analyse. Par ailleurs,
l’élimination du film de surface est facilement obtenue par les rinçages (surface plus
importante et moins de forces de liaison aux parois). D’après ces essais, la biomasse adhérée
(ou du moins la DO mesurée) est significativement supérieure à 24h (Figure 3).
137
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Nous avons donc au final validé cette modification dans la conduite du protocole :
culture en microplaque à 24 puits et augmentation des volumes réactionnels (500µL de
milieu (2X) + 500µL de dilution de 1/100, P. aeruginosa à 106 UFC).
Les observations en microscopie confocale (Figure 4) indiquent une colonisation de la
surface des puits. Cependant, cette colonisation n’est pas accompagnée d’une structuration en
microcolonies et ne correspond pas aux descriptions récentes des biofilms observés in vivo
chez les patients atteints de mucoviscidose (Yoon et al. 2002 ; Worlitschz et al. 2002).
Figure 4. Observation en microscopie confocale d’un biofilm de 24 heures (400X)
(P. aeruginosa 7844 S) obtenu en milieu TSA-B (X)
La figure 4 semble en faveur d’une adhésion des bactéries, y compris de celles issues
de la croissance en phase planctonique, avec une implication limitée de la multiplication
secondaire des bactéries adhérées (absence de microcolonies).
Par ailleurs, dans les conditions d’essai impliquant le milieu TSA-B, aucune variation
significative de DO n’a pu être observée en présence de furanone, invalidant ces conditions
pour l’évaluation de molécules anti-biofilm.
De ce fait, l’étape ultérieure des essais concerne l’évaluation de l’impact du milieu de
culture. Nous nous sommes intéressés à un milieu moins nutritif, préalablement validé pour
la formation de biofilms sur support Tygon, le BBM (Chapitre III), milieu significativement
moins riche que ceux utilisés dans la plupart des modèles actuels, que ce soit en apport
carboné ou azoté (Tableau 3).
138
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
IV-2-2-Comparaison entre TSA-B et BBM (5X) en microplaques
à 96 et 24 puits
Un essai préliminaire comparatif a été réalisé en BBM (5X) après 24h de culture pour
les trois souches : 7844 S, PAO 1, CIP 103407 en reprenant les conditions du protocole III
avec des microplaques à 24 puits. Le choix d’un milieu 5 fois concentré est basé sur le fait de
réaliser des essais en conditions statiques au contraitre du modèle en flux continu. Les
résultats des évaluations de biomasses adhérées après 24 heures d’incubation sont présentés
dans la figure 5.
1,6
1,4
DO 600nm
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
7844 S
PAO 1
CIP 103407
Figure 5. Evaluation de la biomasse adhérée après 24h en microplaques à 24 puits en BBM (5 X) pour les
souches 7844 S, PAO 1, CIP 103407 (moyenne +/- écart-type, n = 3)
Ces résultats indiquent des valeurs faibles de DO liées à une faible quantité de
biomasse adhérée pour les souches P. aeruginosa PAO 1 et CIP 103407 par rapport à la
souche 7844 S.
La souche de P. aeruginosa PAO1 a donc été choisie pour la suite des essais, afin
d’optimiser l’ensemble des conditions expérimentales sur une souche de référence largement
employée dans l’étude des phénomènes liés à la formation des biofilms.
139
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
La souche P. aeruginosa 7844 S est une souche de croissance plus facile (DO
supérieures), mais la formation d’un film en surface du milieu de culture conduit à des écarttypes plus élevés par rapport à PAO 1 quelles que soient les conditions d’essai (microplaques
96 puits ou 24 puits).
Une deuxième série d’essais a été réalisée avec une culture initiale en TSA-B (24h)
suivie d’un rinçage et remise en culture en TSA-B ou BBM et ce dans les deux conditions
testées précédemment, c'est-à-dire en utilisant des microplaques à 96 puits fond rond
(protocole IV) et 24 puits (protocole V). Le changement de milieu après 24h d’incubation a
été introduit afin d’éliminer la biomasse planctonique.
Les conditions expérimentales des protocoles IV et V sont rapportés dans le tableau 7.
Protocole IV
Conditions expérimentales
Microplaques
96 puits fond rond
TSA-B
Milieu
P.aeruginosa PAO 1
Souche
108 CFU
Inoculums
72h - 37°C
Incubation
TSA-B (X)
TSA-B (X)
Rinçage après 24h
(avec NaCl 0,1 %)
TSA-B (X)
BBM (5X)
DO 600 nm
Evaluation de la biomasse
Tableau 7. Présentation des conditions expérimentales des protocoles IV et V
Protocole V
24 puits
TSA-B
P.aeruginosa PAO 1
108 CFU
72h - 37°C
TSA-B (X)
TSA-B (X)
BBM (5X)
TSA-B (X)
DO 600 nm
La figure 6 indique les résultats obtenus après 48h d’incubation (24h en TSA-B + 24h
en TSA-B ou BBM 5X) et 72h d’incubation (24h en TSA-B + 48h en TSA-B ou BBM 5X),
sur des microplaques à 96 puits fond rond et à 24 puits.
140
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
2,5
Abs (600nm)
2
1,5
TSB
BBM
1
0,5
0
96 puits
24 puits
96 puits
48h
24 puits
72h
Biofilm
**p<0,01
Figure 6. Évaluation de la biomasse adhérée après 48 et 72h de culture, en TSA-B et/ou BBM (5X) en
microplaques à 96 ou 24 puits, avec la souche P. aeruginosa PAO1 (moyenne +/- écart-type, n = 3)
Nous notons
une différence significative entre les essais réalisés avec des
microplaques à 96 puits ou 24 puits en TSB, confirmant nos résultats antérieurs. Cette
différence est retrouvée pour les essais en BBM (5X).
La mise en place du renouvellement du milieu a été instaurée pour éliminer la
biomasse planctonique après adhésion et multiplication. Cette phase d’élimination et de
renouvellement de milieu permet l’obtenir de valeurs de DO supérieures à celles notées lors
des essais antérieurs (Protocole III, Tableau 6) pour la souche 7844 S et a fortiori pour la
souche PAO 1.
Après 48h d’incubation (soit 24h après renouvellement du milieu), nous notons une
différence significative entre les deux milieux testés que ce soit sur microplaque 96 puits fond
rond ou 24 puits. Dans les deux conditions, des valeurs de DO plus élevées et donc des
biomasses adhérées plus importantes sont notées avec un renouvellement par du milieu BBM
(5X).
Après 72h d’incubation (soit 48h après renouvellement du milieu) nous notons une
diminution significative de la biomasse adhérée en microplaque 96 puits fond rond. En
microplaque 24 puits, les DO restent stables. La différence entre les deux milieux testés n’est
plus notable.
141
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Le milieu de culture BBM semble donc plus favorable à la formation d’une phase
bactérienne adhérée en microplaque et sera donc le milieu de culture adopté pour la suite
de nos travaux.
Etant donné nos objectifs concernant le suivi de la cinétique de formation de biofilm et
des éventuelles modifications induites par différentes molécules, l’optimisation de la méthode
de détection de la biomasse adhérée parait primordiale. Nous nous sommes donc intéressés à
une technique plus reproductible permettant de détecter un faible nombre de bactéries
adhérées.
Parallèlement, les conditions d’obtention d’un biofilm structuré ont été optimisées.
IV-2-3-Comparaison de la formation de biofilm sur
microplaques 24 puits en BBM X et 5X. Evaluation de la biomasse
adhérée par numération des UFC
Ces essais concernent l’optimisation de l’utilisation du BBM à des concentrations 2X
ou 10X soit des concentrations finales respective de X ou 5X dans les puits de microplaques à
24 puits. Le changement de milieu après 24h d’incubation a été conservé afin d’éliminer et de
limiter la biomasse planctonique. Parallèlement étant donné les problèmes de détection de la
biomasse par mesure spectophotométrique après coloration au cristal violet (faibles valeurs de
DO aux temps courts d’incubation), les évaluations ont ici été effectuées par numération des
UFC adhérées.
Ainsi, à chaque temps de contrôle, 1mL de l’échantillon est prélevé pour dénombrer
les cellules planctoniques. Ce dénombrement a pour objectif de contrôler l’évolution de la
phase planctonique (très importante en milieu TSA-B) par rapport à la phase adhérée. Les
puits sont rincés avec 1mL d’eau distillée stérile. Les fonds des puits sont grattés à l’aide
d’une spatule stérile et transférés dans 1mL d’eau distillée stérile pour le dénombrement des
cellules adhérées. Le nombre d’UFC est obtenu après inclusion d’1mL de suspension ou des
dilutions de raison 10 en TSA-D à 37°C pendant 48h.
Les numérations des bactéries adhérées et planctoniques ont été réalisées après 4h, 6h
et 24h d’incubation, puis 24h après renouvellement du milieu (soit 48h). Les conditions
expérimentales du protocole VI sont résumées dans le tableau 8.
142
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Conditions expérimentales
Microplaque
milieu
Souche
Inoculums
Renouvellement de milieu
(sans bactéries) après 24h
Incubation
Evaluation de la biomasse
Protocole VI
24 puits
BBM (X) et (5X)
P. aeruginosa PAO 1
105 UFC et 106 UFC
BBM (X)
BBM (X)
BBM (5X)
BBM (5X)
48h - 37°C
Numération des bactéries adhérées
et planctoniques
Tableau 8. Présentation des conditions expérimentales du protocole VI
Les résultats sont présentés en log UFC/mL aux quatre temps d’analyse et pour deux
inoculi initiaux (105 et 106 UFC) dans la figure 7.
10
9
UFC/mL (Log))
8
7
4h
6
5
6h
24h
4
48h
3
2
1
0
BBM(X)
PAO1(10E6)
BBM(X)
PAO1(10E5)
BBM(5X)
PAO1(10E6)
BBM(5X)
PAO1(10E5)
(a) Biofilm
10
9
UFC/mL (Log))
8
7
4h
6
6h
5
24h
4
48h
3
2
1
0
BBM(X)
PAO1(10E6)
BBM(X)
PAO1(10E5)
BBM(5X)
PAO1(10E6)
BBM(5X)
PAO1(10E5)
(b) Planctonique
Figure 7. Numérations (UFC/mL)) des cellules adhérées (a) et planctoniques (b) sur microplaques de 24 puits en
BBM (X) ou (5X) - Souche PAO1 (105 UFC et 106 UFC) avec changement de milieu à 24h (moyenne +/- écarttype, n = 3)
143
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
La biomasse adhérée et planctonique est détectée dés 4h d’incubation à des taux
supérieurs à 4 log d’UFC/mL. Après 48h, les taux détectés sont de l’ordre de 8 log en
biomasse adhérée et planctonique.
En ce qui concerne les variations des conditions expérimentales. Ces essais
démontrent que:
-
la concentration du BBM (X ou 5X) influe peu sur les résultats. L’augmentation de
concentration des éléments nutritifs (BBM 5X) n’entraîne aucune amélioration. Les
essais ultérieurs seront donc être réalisés en BBM (X),
-
la variation d’inoculum, de 106 à 105 UFC, ne se traduit pas par une modification
significative de la biomasse adhérée et de la cinétique globale de formation du biofilm.
IV-2-4-Influence du renouvellement du milieu sur la formation
du biofilm en microplaque 24 puits en BBM (X)
Cet essai complémentaire de l’utilisation du BBM à une concentration finale de X,
dans les puits de microplaques à 24 puits a été réalisé sur quatre souches test afin de confirmer
ou d’infirmer l’intérêt du renouvellement du milieu sur la cinétique de formation du biofilm et
sa structuration.
Conditions expérimentales
Microplaques
Milieu
Souche
Protocole VII
Protocole VIII
24 puits
24 puits
BBM (X)
BBM (X)
P.aeruginosa (PAO1, CIP 103407, P.aeruginosa (PAO1, CIP 103407, 7844
7844 S et CIP A22
S et CIP A22
106 UFC
106 UFC
Inoculum
Renouvellement de milieu
BBM (X)
BBM (X)
sans renouvellement de milieu
(sans bactéries)
4h, 24h et 48h
72h - 37°C
72h - 37°C
Incubation
Numération des bactéries adhérées et
Evaluation de la biomasse
Numération des bactéries
planctoniques
adhérées et planctoniques
6h, 24h, 48h et 72h
6h, 24h, 48h et 72h
Tableau 9. Présentation des conditions expérimentales des protocoles VII et VIII
Deux protocoles ont été comparés sans renouvellement (Protocole VIII) ou avec
renouvellement de milieu BBM au concentration X soit des concentrations finales respective
de X/2 dans les puits de microplaques à 24 puits, à 4h, 24h et 48h d’incubation (Protocole
VII). Les autres conditions expérimentales sont présentées dans le tableau 9.
144
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Les numérations d’UFC adhérées et planctoniques ont été réalisées aux temps 6h, 24h,
48h et 72h d’incubation. Les résultats sont présentés sur la figure 8.
8
U FC /m L (Log) )
7
6
6h
5
24h
4
48h
3
72h
2
1
0
+
-
+
7844 S
PAO1
+
-
+
CIP 103407
(a) Biofilm
CIP A22
(+): Avec changement de milieu à 4h, 24h et 48h
(-): Sans changement de milieu
8
UFC/mL (Log) )
7
6
6h
5
24h
4
48h
3
72h
2
1
0
+
7844 S
+
PAO1
+
-
CIP 103407
+
CIP A22
(b) Planctonique
Figure 8. Numérations (UFC/mL) des cellules adhérées (a) et planctoniques (b) sur microplaques à 24 puits en
BBM avec ou sans renouvellement de milieu sur les souches 7844 S, PAO 1, CIP 103407 et CIP A22,
inoculum à 106 CFU, (moyenne +/- écart-type, n = 3)
Le renouvellement de milieu à 4h conduit à une absence de détection d’UFC adhérées
et planctoniques à 6h (valeurs non significatives < 1 log UFC/mL).
145
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Aux temps ultérieurs, les biomasses détectées sont relativement comparables et plutôt
en faveur du protocole avec changement de milieu quelle que soit la souche testée et ce dés
24h d’incubation.
Par ailleurs, nous notons des quantités de biomasses adhérées supérieurs ou égaux à
ceux des biomasses planctoniques dans les conditions de renouvellement du milieu, pour les 4
souches testées.
Ces résultats indiquent qu’une incubation de 4h est suffisante pour la mise en place de
la phase d’adhésion, avec un taux de bactéries cultivables adhérées faible ou du moins non
quantifiable, mais suffisante pour une colonisation secondaire de la surface (croissance sous
forme de microcolonies).
Un changement régulier de milieu devrait donc nous permettre de mieux
différencier les différences étapes de formation de biofilm : adhésion, multiplication,
structuration, en éliminant régulièrement les bactéries planctoniques ou faiblement
adhérées ou qui se détachent. Notre choix s’est donc porté vers cette méthodologie.
IV-2-5-Influence de l’inoculum sur la cinétique de formation du
biofilm sur microplaques à 24 puits en BBM (X)
Afin d’optimiser au mieux les conditions expérimentales, une dernière série d’essais a
été réalisée en faisant varier l’inoculum. En effet, les résultats obtenus avec le protocole VII
indiquent un nombre de bactéries adhérées lors de la première phase d’incubation (4h) très
faible par rapport à l’inoculum initial. Nous avons donc testé des inoculi inférieurs, de 102 à
104 UFC.
Les nouvelles conditions expérimentales sont présentées dans le tableau 10 (Protocole
IX).
Conditions expérimentales
Microplaque
Milieu
Souche
Inoculums
Renouvellement de milieu
(sans bactéries)
Incubation
Evaluation de la biomasse
Protocole IX
24 puits
BBM (X)
P. aeruginosa PAO 1
104, 103 et 102 UFC
BBM (X)
BBM (X)
4h
24h - 37°C
Numération des bactéries adhérées
et planctoniques
Tableau 10. Présentation des conditions expérimentales du protocole IX
146
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
La figure 9 présente les résultats de la numération (log UFC/mL) des bactéries adhérées et
planctoniques après 24h d’incubation pour les trois inoculi testés.
10
9
UFC/mL (Log)
)
8
7
6
susp°10E4
susp°10E3
5
susp°10E2
4
3
2
1
0
Cellules adhérées
Cellules planctoniques
Temps (24h)
Figure 9. Numération (UFC/mL) des cellules adhérées et planctoniques après 24h sur microplaques à 24 puits
en BBM pour les trois suspensions de PAO1 (moyenne +/- écart-type, n =5)
Les résultats indiquent que les biomasses adhérées et planctoniques ne sont pas
directement dépendantes de la taille de l’inoculum. Des quantités de biomasse supérieures
sont même observées pour l’inoculum 102 par rapport aux inoculi 103 et 104.
IV-2-6-Optimisation du protocole - Choix du protocole final
Afin d’optimiser les conditions expérimentales, une dernière série d’essais a été
réalisée en effectuant un changement régulier de milieu (2h, 4h, 6h et 24h), afin de mieux
suivre la cinétique de formation du biofilm, avec différenciation des étapes. Dans ce cadre
l’apport de nutriments et l’élimination des métabolites a été réalisée de manière séquentielle,
afin de simuler un modèle non statique. Les étapes de changement de milieu ont pour objectif
de caractériser spécifiquement la phase d’adhésion, la phase de multiplication initiale des
bactéries adhérées, la phase de formation des micros ou « macro » colonies avec maturation.
Les nouvelles conditions expérimentales sont présentées dans le tableau 11 (Protocole
X).
147
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Conditions expérimentales
Microplaques
Milieu
Souche
Inoculum
Renouvellement de milieu
(sans bactéries)
Incubation
Evaluation de la biomasse
Protocole X
24 puits
BBM (X)
P. aeruginosa PAO 1
102 UFC
BBM (X)
BBM (X)
2h, 4h, 6h et 24h
48h - 37°C
Numération des bactéries
adhérées et planctoniques
Tableau 11. Présentation des conditions expérimentales du protocole X
La figure 10 présente les observations en microscopie confocale aux différents temps
de changements de milieu (4h, 6h, 24h et 48h), avec annexés les valeurs des dénombrements
(Log des UFC/mL) des cellules adhérées.
Aux temps courts (2h et 4h) une adhésion des bactéries sous forme isolées et
dispersées est observée sans multiplication bactérienne entre ces deux temps. Ainsi, après 4h,
les cellules bactériennes sont toujours sous forme isolées (Figure 10a).
A 6h, la multiplication des bactéries adhérées est initiée (Figure 10b).
Après 24h d’incubation, des microcolonies bien structurées sont observées (Figure
10c).
L’allongement du temps d’incubation se traduit par une augmentation de la densité et
de l’épaisseur des colonies pouvant aller jusqu’à environ 100 µm de hauteur (Figure 10d).
148
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Numération à T (h) / Temps cumulé (h)
Log (UFC/mL)
4h
0
Numération à T (h) / Temps cumulé (h)
Log (UFC/mL)
6h
0
Numération à T (h) / Temps cumulé (h)
Log (UFC/mL)
24h
6,072 (± 0,06)
Numération à T (h) / Temps cumulé (h)
Log (UFC/mL)
48h
7,477(± 0,005)
20 µm
a)
20 µm
b)
40 µm
c)
75 µm
d)
Figure 10. Etude en microscopie confocale de la formation du biofilm dans les conditions expérimentales
sélectionnées (400X): a) à 4h b) à 6h, c) à 24h et d) à 48h et les numérations (UFC/mL) des cellules adhérées
sur microplaques à 24 puits en BBM avec la souche P. aeruginosa PAO 1(moyenne +/- écart-type, n =3)
Ces observations en microscopie confocale confirment bien la distinction des
différentes phases de formation du biofilm.
149
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
40 µm
Figure 11. Etude en microscopie confocale de l’effet de la formation du biofilm dans les conditions
expérimentales sélectionnées après 48h en présence de SYTO 9® et d’iodure de propidium (400X)
L’observation après coloration par le SYTO 9® et l’iodure de propidium indique la
présence de bactéries endommagées ou mortes plutôt en partie centrale (Figure 11).
Ces différentes observations nous ont conduits à proposer un modèle de formation de
biofilm en microplaque basé sur une optimisation et différenciation de la phase d’adhésion
initiale, avec élimination séquentielle des bactéries planctoniques afin de favoriser la
multiplication des bactéries initialement adhérées.
Le protocole X correspond à la méthode de criblage utilisée pour la suite de nos
travaux (Tableau 11).
IV-3-Validation du modèle en microplaque : effet anti-biofilm de
la furanone
Afin de valider l’ensemble des conditions expérimentales définies lors des essais
antérieurs (et rapportées dans le tableau 10), une série d’expériences a été réalisée avec la
furanone, connue pour son activité anti-biofilm (Martinelli et al. 2004).
Ces essais concernent l’étude de l’effet de la furanone:
-
en fonction de la dose
-
en fonction du moment d’introduction dans le cycle de formation du biofilm
Des essais ont également été réalisés en présence de la C4-HSL afin de confirmer
l’interaction de la furanone avec le système du quorum sensing.
150
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
IV-3-1-Influence de la concentration en furanone
La furanone a été testée à des concentrations inférieures aux CMI et CMB
préalablement déterminées et rapportées dans le chapitre II, soit entre 5.10-5 et 5.10-7 M. La
furanone est rajoutée à chaque renouvellement de milieu selon les conditions expérimentales
du protocole X (Tableau 11). Le milieu est renouvelé après 2h, 4h, 6h avec un inoculum
initial par une suspension à 102 UFC/mL de PAO1. Les résultats sont présentés dans la figure
12 en log UFC/mL de bactéries adhérées et planctoniques.
8
7
UFC/mL (log)
6
Témoin
5
F (5.10E-5 M)
4
F (5.10E-6 M)
3
F (5.10E-7 M)
2
1
0
24h
48h
Temps d'incubation (h)
(a) biofilm
* p < 0,05 ** p < 0,001
8
7
UFC/mL (Log)
6
5
Témoin
F (5.10E-5 M)
4
F (5.10E-6 M)
F (5.10E-7 M)
3
2
1
0
24h
48h
Temps d'icubation (h)
(b) Planctonique
* p < 0,05 ** p < 0,001
Figure 12. Numérations (UFC/mL) des cellules adhérées (a) et planctoniques (b) en BBM sur microplaques
à 24 puits avec une suspension de PAO 1 (102 UFC) en présence des différentes concentrations de furanone
(moyenne +/- écart-type, n = 3) aux temps 24h et 48h.
151
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Les changements de milieu aux temps courts (2h, 4h et 6h) se traduisent par une non
détection de biomasse adhérée et planctonique que ce soit en absence de furanone (témoin) ou
en présence des différentes concentrations de furanone.
Après 24h d’incubation, le témoin est caractérisé par une biomasse adhérée et
planctonique détectable et qui augmente à 48h d’incubation.
L’addition de furanone à 5.10-5M se traduit par une inhibition totale de la formation de
biofilm corrélée à une absence de détection de bactéries planctoniques après 24h et 48h
d’incubation.
A 5.10-6M, l’effet de la furanone est diminué. Un effet significatif est noté après 24h
d’incubation sur la biomasse adhérée et après 24h et 48h d’incubation sur les bactéries
planctoniques.
A 5.10-7M, l’effet diminue encore, démontrant un effet-dose important.
Compte tenu de ces résultats, la furanone sera utilisée à la concentration de 5.10-5 M
dans les essais ultérieurs.
IV-3-2- Etude cinétique de l’effet inhibiteur de formation de
biofilm de la furanone
Les essais ont été réalisés dans les conditions générales du protocole X (Tableau 11).
L’inoculation initiale est réalisée avec une suspension de PA01 à 10² UFC/mL et le milieu de
culture BBM est renouvelé toutes les 2h, 4h, 6h, 24h et 48h. L’addition de la furanone (5.105
M) se fait aux différentes étapes de formation du biofilm, à chaque renouvellement du milieu
selon le schéma expérimental présenté dans le tableau 12. Les numérations des cellules se font
à 20h, 24h et 48h selon le protocole habituel.
Temps (h) de renouvellement du milieu/ Temps cumulé (h) après l’addition de la furanone
T (h)
T0
T2
T4
T6
T 20
T 24
0
2
4
6
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
20
24
+
+: addition de la furanone / blanc: uniquement renouvellement du milieu
Tableau 12. Schéma d’addition de la furanone
152
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Le tableau 13 indique les pourcentages d’inhibition de formation du biofilm (13a) et
des cellules planctoniques (13b) pour chaque condition et chaque temps d'incubation.
Le pourcentage d’inhibition est calculé versus contrôle selon la formule suivante:
[(CFU contrôle – CFU essai) / CFU contrôle] x 100
Temps d’addition de la
% d’inhibition du biofilm par la Furanone
Furanone (h)
Numération à T (h) / Temps cumulé (h)
20h
24h
48h
0
100%
100%
100%
2
100%
100%
100%
4
100%
100%
100%
6
100%
100%
100%
20
-
100%
100%
24
-
-
100%
(a) Biofilm
Temps d’addition de la
% d’inhibition des cellules planctoniques par la Furanone
Furanone (h)
Numération à T (h) / Temps cumulé (h)
20h
24h
48h
0
100%
100%
100%
2
100%
100%
100%
4
100%
100%
100%
6
100%
100%
81,9% (± 0,05)
20
-
100%
99,3% (± 0,01)
24
-
-
92,0% (± 0,05)
(b) Planctonique
Tableau 13. Pourcentages d'inhibition de formation de biofilm (moyenne +/- écart-type; n = 3) en présence de
furanone ajoutée à différent temps de renouvellement du milieu, numérations à 20h, 24h et 48h (100% de
réduction signifie réduction > 6 log): (a) cellules adhérées, (b) cellules planctoniques
L'addition de la furanone (5.10-5M) à T = 0h, 2h, 4h, 6h, 20h ou 24h conduit à une
réduction des cellules adhérées supérieure à 6 Log, même après 48h d’incubation.
Cet effet inhibiteur de formation de biofilm s’accompagne d’une réduction des
bactéries planctoniques. Cependant, sur la phase planctonique, une inhibition de 100% est
153
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
observée pour les temps d’addition de la furanone à T 0h, 2h et 4h, et ce jusqu’à 48h
d’incubation. Pour les temps d’adhésion 6h, 20h et 24h, nous notons une inhibition de 100%
après 20h et 24h d’incubation. Apres 48h d’incubation, la méthode de dénombrement permet
à nouveau une détection d’UFC (% d’inhibition < 100%).
L’effet inhibiteur de la formation de biofilm de la furanone est confirmé par l’étude
réalisée en microscopie confocale.
La figure 13 présente les différentes observations versus les observations témoin.
- Au temps T 4h, l’aspect est similaire entre le témoin et la furanone avec distinction de
bactéries viables dispersées à la surface du puits (Figures 13a et 13a’),
- A 6h, l’effet furanone est déjà notable, caractérisé par une absence de multiplication des
bactéries adhérées (Figures 13b et 13b’),
- Cet effet est confirmé au temps 24h (Figures 13c et 13c’) et 48h (Figures 13d et 13d’).
Le double marquage par le SYTO 9® et l’iodure de propidium (Figure 14a et 14a’)
indique que les bactéries encore présentes à la surface des puits sont endommagées ou mortes.
L’ensemble de ces résultats est en faveur d’un effet de la furanone rapide, après la
phase d’adhésion. Cet effet inhibiteur de la multiplication des bactéries adhérées a été observé
à concentrations infra-inhibitrices sur bactéries planctoniques. Cependant, l’effet antibactérien
de la furanone pourrait être impliqué à concentrations plus faibles sur bactéries sessiles.
154
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
20 µm
a)
20 µm
à)
20 µm
b)
40 µm
b’)
20 µm
40 µm
c)
c’)
75 µm
75 µm
d)
d’)
Figure 13. Etude en microscopie confocale de l’effet de la furanone sur la formation du biofilm (400X): a)
Témoin à 4h et a’) Furanone (5.10-5M) à 4h, b) Témoin à 6h et b’) Furanone (5.10-5M) à 6h, c) Témoin à 24h
et c’) Furanone (5.10-5M) à 24h, d) Témoin à 48h et d’) furanone (5.10-5M) à 48h
155
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
40 µm
40 µm
a)
a’)
Figure 14. Etude en microscopie confocale de l’effet de la furanone sur la formation du biofilm après 48h
en présence d’iodure de propidium (400X): a) Témoin à 48h et a’) Furanone (5.10-5M) à 48 heures
Ainsi, dans les conditions décrites, la furanone peut totalement empêcher la
prolifération de P. aeruginosa en mode adhérent aussi bien que planctonique, avec un effet
dose-dépendant très significatif et reproductible.
IV-3-3- Etude de l’interaction Furanone /C4-HSL
Pour évaluer l’interaction entre la furanone et l’auto-inducteur C4-HSL, une dernière
expérience a été
effectuée en ajoutant dans le milieu les deux composés à la même
concentration de 5.10-5M:
- soit ensemble en début de cycle (T = 0h)
- soit en séquentiel sur la base des cinétiques précédemment observées :
* la furanone à T = 0h et la C4-HSL à partir de T = 6h
* la C4-HSL à T = 0h et la furanone à partir de T = 6h
Les comptages des UFC ont été réalisés après 48h d’incubation et les pourcentages
d'inhibition ont été calculés en utilisant comme contrôle le résultat de la numération lors de
l’addition de la C4-HSL seule. L’essai est réalisé dans les conditions générales du protocole X
(Tableau 11).
Les résultats sont rapportés dans la Figure 15.
156
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
% Inhibition des cellules adhérées
.
100
80
60
48h
40
20
0
F(0h)
C4(0h)+F(0h)
C4(0h)+F(6h)
F(0h)+C4(6h)
.
(a) Biofilm
% Inhibition des cellules planctoniques
100
80
60
48h
40
20
0
F(0h)
C4(0h)+F(0h)
C4(0h)+F(6h)
F(0h)+C4(6h)
(b) Planctonique
Figure 15. Pourcentages d'inhibition de formation de biofilm (moyenne +/- écart-type; n = 3) en présence de
furanone et C4-HSL ajoutées aux différents temps de renouvellement du milieu, numérations à 20h, 24h et 48h:
(a) cellules adhérées, (b) cellules planctoniques
Les résultats montrent que la furanone inhibe partiellement l’adhésion des cellules
(62,99%) en présence de la C4-HSL lorsque les deux composés sont ajoutés en même temps
en début de cycle (T 0h).
157
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Cet effet est encore diminué
(50,77±18,03% d’inhibition des cellules adhérées)
lorsque la furanone est introduite au bout de 6h sur un biofilm déjà formé en présence de la
C4-HSL.
Par contre la furanone est capable d’inhiber l’adhésion des cellules à 82,72±0,52%
quand on ajoute la C4-HSL seulement à partir de T = 6h.
Sur les cellules planctoniques, l’effet de la furanone est moins marqué. Le taux
d’inhibition est voisin de 10% lorsque la furanone et la C4-HSL sont soit introduites ensemble
dans le milieu à T = 0h, soit la C4-HSL à 0h et la furanone 6h plus tard. L’effet est
partiellement restauré (≈ 60%) lorsque la furanone est ajoutée au milieu à T = 0h et la C4HSL à partir de T = 6h.
IV-4-Conclusion
L’analyse de la littérature indique différents protocoles en microplaques permettant
d’évaluer la biomasse adhérée. Ces protocoles utilisent des conditions dites minimales.
Cependant, les inoculi et les milieux de croissance utilisés ne peuvent être considérés comme
minimum. En effet, des apports en source carbonée assimilable par P. aeruginosa sont
relativement élevés (0,1 à 0,5%) et les conditions apparaissent donc favorables à une
croissance en mode planctonique, même si une biomasse adhérée peut être détectable.
L’application de ces conditions de culture, ou du moins de celles en trypcase soja, ne
nous a pas permis d’obtenir une structuration importante du biofilm (recouvrement de la
surface sans croissance importante des bactéries adhérées). Par ailleurs, les conditions
d’évaluation de la biomasse décrites dans la plupart des protocoles sont basées sur une
approche colorimétrique qui se traduit à la fois par une faible reproductibilité et une faible
sensibilité. Ainsi, la furanone, molécule décrite pour un effet anti-biofilm significatif, n’induit
aucune variation significative de DO dans ces conditions. Celles-ci semblent tout à fait
applicables à la sélection de mutants d’adhésion, mais ne paraissent pas suffisantes à une
évaluation de l’impact de molécules sur la cinétique de formation de biofilm.
158
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Ainsi, l’utilisation de conditions plus stringentes a été évaluée. Les différents essais
réalisés nous ont permis de confirmer:
-
l’intérêt d’utiliser un milieu « pauvre », caractérisé par des apports très limités en C et
N et que nous avions déjà validé dans le chapitre II, sur le modèle en flux continu,
-
l’impact limité de l’inoculum dans ces conditions d’essai, avec une formation de
biofilm structuré même à très faible inoculum (102 UFC),
-
la possibilité de différencier les différentes phases de formation du biofilm par un
renouvellement séquentiel du milieu et donc une élimination également séquentielle
des bactéries planctoniques,
-
une optimisation de la formation du biofilm en anaérobiose ménagée (surface
inférieure du puits) et non pas à l’interface air/eau.
Ces différentes conditions nous permettente d’obtenir un biofilm structuré, se
rapprochant de la description des micro ou plutôt « macrocolonies » observées in vivo
chez les patients infectés.
Enfin, le protocole défini a permis de mesurer et d’observer l’effet anti-biofilm de la
furanone.
Ainsi, à concentrations infra-inhibitrices de croissance vis-à-vis des bactéries
planctoniques, la furanone est capable d’inhiber la formation du biofilm. Cet effet apparaît
spécifiquement au-delà de la phase d’adhésion. L’addition de la furanone à l’une
quelconque des étapes ultérieures de la formation du biofilm (formation des
microcolonies, maturation) se traduit par un effet significatif, allant même jusqu’à la
déstructuration du biofilm formé.
Le marquage à l’iodure de propidium nous a permis d’observer un endommagement
cellulaire important.
L’étape finale de ce chapitre a concerné la démonstration de l’antagonisme entre la
furanone et la C4-HSL, cible impliquée dans la littérature.
L’addition différée des deux composés est bien en faveur d’un antagonisme entre
ceux-ci, conduisant à une perte d’efficacité de la furanone après addition de la C4-HSL et
à une diminution de la structuration du biofilm liée à la C4-HSL après addition de la
furanone.
159
Chapitre IV- Mise au point du modèle en microplaque
Ainsi le modèle actuel développé sur microplaques à 24 puits, combinant un milieu
synthétique, un faible inoculum, l’évaluation des cellules adhérées ou planctoniques par
numération, validé par nos essais en présence de la furanone, constitue un modèle de
criblage original pour l’évaluation de composés potentiels anti-biofilm.
Le chapitre suivant concerne donc
l’évaluation de l’activité de molécules
synthétiques analogues des acyl-homosérines lactones et plus particulièrement de la
C4-HSL, dans les conditions définies, sur les différentes phases de formation du biofilm.
160
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
Chapitre V
Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du
QS en microplaque
161
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
162
Sommaire du chapitre V: Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
Sommaire du chapitre V: Criblage de l’activité anti-biofilm des
analogues du QS en microplaque
V-1-Activité antibactérienne des molécules synthétisées sur bactéries planctoniques...169
V-1-1-Détermination des CMI et CMB en milieu TSA……………………………....169
IV-1-2-Évaluation de l’activité antimicrobienne en milieu BBM……………………169
V-2-Évaluation de l’activité « anti-biofilm » des analogues de la C4- HSL …………...169
V-3-Étude de l’activité « anti-biofilm » du composé 11………………………………...170
V-3-1-Influence de la concentration en composé 11……………………………….…170
V-3-2-Étude de l’impact sur la cinétique de formation de biofilm…………………....171
V-3-3-Étude de l’interaction C4-HSL / composé 11………………………………….175
V-4-Conclusion…………………………………………………………………………….178
163
Sommaire du chapitre V: Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
164
Sommaire des figures et les tableaux du chapitre V:
Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
Sommaire des figures et les tableaux du chapitre V: Criblage de
l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
•
Figure 1. Pourcentages d’inhibition de bactéries adhérées lors d’essais en BBM sur
microplaques à 24 puits avec une suspension de PAO 1 (102 UFC) en présence des
différentes concentrations du composé 11 (moyenne +/- écart-type, n = 2)
•
Figure 2. Formation de biofilm de P. aeruginosa dans BBM (400X): a) Témoin à 4h et a’)
composé 11 (5.10-4 M) à 4h, b) Témoin à 6h et b’) composé 11 à 6h, c) Témoin à 24h et
c’) composé 11 à 24h, d) Témoin à 48h et d’) composé 11 à 48h
•
Figure 3. Etude en microscopie confocale de l’effet de la formation du biofilm dans les
conditions expérimentales sélectionnées après 48h en présence de SYTO 9® et d’iodure
de propidium (400X): a) furanone, b) composé 11
•
Figure 4. Pourcentages d'inhibition de formation de biofilm (moyenne ± écart type ; n = 3)
observés pour les différents protocoles d’addition du composé 11 et de la C4-HSL (5.104
•
M), après 48h de formation de biofilm: (a) cellules adhérées, (b) cellules planctoniques
Figure 5. Etude en microscopie confocale de l’effet du composé 11 et de la C4-HSL sur la
formation du biofilm après 48h (400X): a) C11 (5.10-4 M) et C4 (5.10-4 M) des T 0h, b)
C11 (5.10-4 M) à T 0h et C4 (5.10-4 M) à T 6h
♦ Tableau 1. Structure des molécules synthétisées (analogues de la C4 - HLS)
♦ Tableau 2. Evaluation d’inhibition de biofilm en présence des 11 analogues hydrosolubles
de la C4-HSL à 5.10-4 M versus la furanone à 5.10-5 M
♦ Tableau 3. Schéma d’addition du composé 11
♦ Tableau 4. Pourcentages d'inhibition de formation de biofilm (moyenne ± écart type;
n = 3) en présence de composé 11 (5.10-4M) ajouté aux différent temps de renouvellement
165
Sommaire des figures et les tableaux du chapitre V:
Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
du milieu; numérations à 20h, 24h et 48h (100% de réduction signifie réduction > 6 log):
(a) cellules adhérées, (b) cellules planctoniques
166
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
Ce chapitre concerne l’évaluation de l’activité potentielle « anti-biofilm » des différents
analogues de la C4-HSL synthétisées et dont les structures sont rappelées dans le tableau 1.
Il comporte deux parties sur la base de nos objectifs:
-
La première partie concerne l’évaluation de l’activité antibactérienne des différentes
molécules sur bactéries planctoniques. Cette phase est indispensable à la mise en évidence
secondaire d’un effet spécifique sur la cinétique de formation de biofilm à concentration infrainhibitrice de croissance.
-
La deuxième
partie présente les résultats du criblage réalisé pour les molécules
hydrosolubles, selon le modèle de suivi de cinétique de formation de biofilm en microplaque 24
puits, mis au point, et validé lors du chapitre IV.
167
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
CH3 - (CH2)2 – CO – NH – R
N°
R
Formule
PM
C8H13NO2S
187
C7H12N2OS
172
C7H10N2OS
170
C11H12N2OS
220
C8H12N2O2
168
C10H13NO
163
C10H13NO2
179
C9H12N2O
164
C9H12N2O
164
C8H11N3O
165
C8H16N2O2
172
2
S
O
N
3
S
N
4
S
N
5
S
CH3
6
N
O
7
O
8
9
N
N
10
N
11
N
12
N
O
Tableau 1. Structure des molécules synthétisées (analogues de la C4-HLS)
168
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
V-1-Activité antibactérienne des
molécules synthétisées sur
bactéries planctoniques
V-1-1-Détermination des CMI et CMB en milieu TSA
La détermination des CMI en TSA-B et la détermination des CMB sur TSA-D des
composées 2-12 a été réalisée vis-à-vis de 4 souches de Pseudomonas aeruginosa (PAO1,
CIP A22, 7844 S, 7844 M) pour une suspension à 108 bactéries/mL, selon le protocole décrit au
chapitre II, soit un inoculum final à 106 UFC/mL.
Pour les composés 2-12, aucune activité antimicrobienne (inhibition de croissance ou
bactéricidie) n’a été détectée à la plus haute concentration d’essai (5.10-4 M) et ce quelle que
soit la souche-test sous forme planctonique.
IV-1-2-Évaluation de l’activité antimicrobienne en milieu BBM
Une deuxième série d’essais a concerné l’évaluation de l’activité antimicrobienne des
molécules synthétisées vis-à-vis de la souche PAO1 en BBM.
Dans les conditions d’essai décrites, en bouillon BBM, les CMI n’ont pu être
déterminées visuellement.
En effet, les caractéristiques du BBM ne permettent pas une croissance optimale des
bactéries sous forme planctonique. L’allongement du temps d’incubation ne conduit pas à un
développement de la biomasse planctonique visuellement détectable.
Le repiquage sur milieu TSA-D, à partir des microplaques en milieu BBM, confirme les
résultats précédents: absence d’activité bactéricide des 11 produits synthétisés à 5.10-4 M.
V-2-Évaluation de l’activité « anti-biofilm » des analogues
de la C4-HSL
Les biofilms bactériens sont développés à 37°C en microplaque de 24 puits, contenant
du BBM, en présence ou absence d’analogues des HSL à 5.10-4M. L’objectif de nos travaux
étant de cribler des molécules agissant spécifiquement sur le biofilm, nous avons validé
169
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
l’absence d’activité antibactérienne des 11 analogues synthétisés de C2 à C12 sur bactéries
planctoniques à la concentration 5.10-4M, afin de travailler à concentration infra-inhibitrice de
croissance et infra-bactéricide.
Une premier série d’essai a été réalisée avec évaluation de la biomasse adhérée et
planctonique après 24h et 48h de contact sans renouvellement de milieu et produits testés
(Tableau 2).
Temps
24h
48h
Produits testés
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
-
-
-
-
-
-
-
-
C10
-
C11
+
+
C12
-
Furanone
+
+
Tableau 2. Evaluation d’inhibition de biofilm en présence des 11 analogues hydrosolubles de la C4-HSL à 5.10-4
M versus la furanone à 5.10-5 M
Parmi les 11 antagonistes potentiels examinés, seul le composé 11 à 5.10-4M montre un
effet inhibiteur significatif sur les cellules adhérées ou cellules planctoniques après 24h et 48h
de contact. Aucun effet agoniste n’a été observé.
L’ensemble des autres composés présente le même comportement que le témoin.
V-3-Étude de l’activité « anti-biofilm » du composé 11
V-3-1-Influence de la concentration en composé 11
Le composé 11 a été testé à des concentrations inférieures aux CMI et CMB
préalablement déterminées et rapportées dans le chapitre II, soit entre 5.10-3 et 5.10-6 M. Le
composé 11 est ajouté à chaque renouvellement de milieu selon les conditions expérimentales
du protocole X (Chapitre IV, Tableau 11). Le milieu est renouvelé après 2h, 4h, 6h avec un
inoculum initial par une suspension de PAO1 à 102 UFC. Les résultats sont présentés dans la
figure 1 en pourcentages d’inhibition des bactéries adhérées.
170
% In h ib itio n d e s c e llu le s a d h é ré e s
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
120
100
80
C11 (5.10E-6 M)
C11 (5.10E-5 M)
60
C11 (5.10E-4 M)
C11 (5.10E-3 M)
40
20
0
20h
24h
48h
Temps d'incubation (h)
Figure 1. Pourcentages d’inhibition de bactéries adhérées lors d’essais en BBM sur microplaques à 24 puits avec
une suspension de PAO 1 (102 UFC) en présence des différentes concentrations du composé 11 (moyenne +/écart-type, n = 2)
L’addition du composé 11 à 5.10-3M se traduit par une inhibition totale de la formation
de biofilm après 20h, 24h et 48h d’incubation. A 5.10-4M, un effet inférieur est noté à 20h et
24h, avec 100% d’inhbition à 48h.
Compte tenu de ces résultats, le composé 11 sera utilisé à la concentration de 5.10-4 M
dans les essais ultérieurs, concentration plus proche de la concentration efficace testée en
furanone.
V-3-2-Étude de l’impact sur la cinétique de formation de biofilm
La méthode d’évaluation du composé 11 est identique à celle utilisée pour évaluer les
propriétés anti-biofilm de la furanone et décrite dans le chapitre IV (Protocole X, Tableau 11).
Les numérations des cellules adhérentes et planctoniques ont été réalisées à différentes
étapes de formation du biofilm. Le produit à tester a été ajouté à chaque renouvellement du
171
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
milieu (0h, 2h, 4h, 6h, 20h, 24h) et les numérations ont été effectuées après 20h, 24h et 48h de
culture.
Le tableau 3 présente le schéma expérimental d’addition du composé 11 aux différents
temps de renouvellement du milieu.
Temps (h) de renouvellement du milieu/ Temps cumulé (h) après l’addition du composé 11
T (h)
T0
T2
T4
T6
T 20
T 24
0
+
2
4
6
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
20
+
24
+: addition du composé 11 / blanc: uniquement renouvellement du milieu
Tableau 3. Schéma d’addition du composé 11
Le tableau 4 indique les pourcentages d’inhibition de formation de biofilm et des
cellules planctoniques en fonction de la période d’introduction du produit et pour chaque temps
d’incubation.
Le pourcentage d’inhibition est calculé versus contrôle selon la formule suivante:
[(CFU contrôle – CFU essai) / CFU contrôle] x 100
Le composé 11 est testé à la dose de 5.10-4 M.
172
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
Temps s’addition de
% d’inhibition du biofilm par composé 11
Composé 11 (h)
Numération à T (h) / Temps cumulé (h)
20h
24h
48h
0
100%
100%
100%
2
100%
100%
100%
4
100%
100%
100%
6
93,0% (± 0,66)
47% (± 5,14)
20
-
46% (± 4,07)
6,3% (± 10,81)
24
-
-
6,3% (± 10,90)
0% (± 0.7)
(a) Biofilm
Temps s’addition de
% d’inhibition des cellules planctoniques par composé 11
Composé 11 (h)
Numération à T (h) / Temps cumulé (h)
20h
24h
48h
0
100%
100%
100%
2
100%
100%
100%
4
100%
100%
100%
6
74,0% (± 4,18)
90,0% (± 1,44)
12,0% (± 7,74)
20
-
6,7% (± 7,91)
7,4% (± 7,65)
24
-
-
7,3% (± 9,10)
(b) Planctonique
Tableau 4. Pourcentages d'inhibition de formation de biofilm (moyenne ± écart type; n = 3) en présence de
composé 11 (5.10-4M) ajouté aux différent temps de renouvellement du milieu; numérations à 20h, 24h et 48h
(100% de réduction signifie réduction > 6 log): (a) cellules adhérées, (b) cellules planctoniques
L’addition du composé 11 dès T 0h, 2h et 4h conduit à une réduction significative
(supérieure à 6 log par rapport au témoin) des cellules adhérentes ou planctoniques, d’une
manière identique à ce qui a pu être observé avec la furanone (Figure 10, Chapitre IV). On note
une perte progressive de l’activité du composé 11 lorsqu’il est additionné au milieu après 6h,
20h et 24h ce qui indique que ce composé a peu d’effets sur un biofilm mature.
La figure 3 présente les images obtenues en microscopie confocale versus témoin.
Au temps 4h, la colonisation de la surface est similaire à celle observée pour le témoin
(Figure 2a et 2a’) et pour la furanone (Chapitre IV, Figure 11).
Des images identiques sont observées à T 6h indiquant une limitation de la multiplication
des bactéries adhérés (Figures 2b et 2b’).
A 24h (Figure 2c et 2c’) et 48h (Figure 2d et 2d’) d’incubation les observations indiquent
une multiplication des bactéries limitée avec formation de rares colonies mal structurées.
173
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
20 µm
(a)
20 µm
(a’)
40 µm
20 µm
(b)
(b’)
75 µm
40 µm
(c)
(c’)
75 µm
75 µm
(d)
(d’)
Figure 2. Formation de biofilm de P. aeruginosa dans BBM (400X): a) Témoin à 4h et a’) composé 11 (5.10-4 M)
à 4h, b) Témoin à 6h et b’) composé 11 à 6h, c) Témoin à 24h et c’) composé 11 à 24h, d) Témoin à 48h et d’)
composé 11 à 48h
174
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
Ces observations en microscopie confocale confirment bien la distinction des
différentes phases de formation du biofilm.
40 µm
(a)
75 µm
(b)
Figure 3. Etude en microscopie confocale de l’effet de la formation du biofilm dans les conditions expérimentales
sélectionnées après 48h en présence de SYTO 9® et d’iodure de propidium (400X): a) furanone, b) composé 11
Le double marquage au SYTO 9® et à l’iodure de propidium confirme la viabilité des
bactéries présentes (Figures 3b), par opposition aux observations faites après contact avec la
furanone (Figure 3a).
V-3-3-Étude de l’interaction C4-HSL / composé 11
Afin d’étudier l’antagonisme qui pourrait exister entre le composé 11 et le C4-HSL, une
troisième expérience a été menée, identique à celle réalisée avec la furanone (Figure 14,
Chapitre IV-3-3).
Les deux composés (composé 11 et C4-HSL) à la même concentration de 5.10-4M, ont
été introduits soit ensemble dans le milieu à T 0h, soit le composé 11 à T 0h et C4-HSL à T 6h
ou la C4-HSL à 0h et le composé 11 à 6h.
L’essai est réalisé dans les conditions générales du protocole X du chapitre IV (Tableau
11) avec renouvellement du milieu à chaque temps (plus produits testés) sur trois essais
indépendants. Les comptages des UFC ont été réalisés après 48h de culture. Les pourcentages
d’inhibition de formation de biofilm ont été calculés en utilisant comme valeur témoin, la
valeur obtenue avec le C4-HSL à T 0h. Les résultats sont rapportés dans la
figure 4.
175
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
% Inhibition des cellules adhérées / C4
120
100
80
60
40
20
0
C11 (0h)
C4(0h)+C11(6h)
C4(0h)+C11(0h)
C11(0h)+C4(6h)
(a) Biofilm
120
100
80
60
40
20
0
C11 (0h)
C4(0h)+C11(6h)
C4(0h)+C11(0h)
C11(0h)+C4(6h)
(b) Planctonique
Figure 4. Pourcentages d'inhibition de formation de biofilm (moyenne ± écart type ; n = 3) observés pour les
différents protocoles d’addition du composé 11 et de la C4-HSL (5.10-4M), après 48h de formation de biofilm: (a)
cellules adhérées, (b) cellules planctoniques
176
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
Dans les conditions décrites, l'effet inhibiteur du composé 11 se trouve altéré lorsque
les deux composés (C4-HSL et 11) sont ajoutés ensemble : 54,27±1,89% d’inhibition pour les
cellules adhérées et 60,33±1,89% dans le cas de cellules planctoniques. Lorsque le composé 11
est ajouté sur un biofilm de 6h, obtenu en présence de C4-HSL dès T 0h, on note des
pourcentages d’inhibition plus faibles 33,32±0,45% et 56,42±1,13% respectivement pour le
biofilm et les cellules planctoniques. Quand le composé 11 est ajouté à T 0h mais que l'addition
de C4-HSL est retardée de 6h, alors l'activité du C11 est mieux préservée et le pourcentage
d’inhibition des cellules adhérées est de 62,6±7,9% et de 73,45%±3,70% pour les cellules
planctoniques.
Des images en microscopie confocale ont été obtenues après addition du composé 11
-4
(5.10 M) et de la C4-HSL (5.10-4 M), à T 0h, après 48h d’incubation (Figures 5a), après
addition du composé 11 (5.10-4M) à T 0h et de la C4-HSL (5.10-4 M) à T 6h après 48h
d’incubation (Figure 5b).
40 µm
40 µm
(a)
(b)
Figure 5. Etude en microscopie confocale de l’effet du composé 11 et de la C4-HSL sur la formation du
biofilm après 48h (400X): a) C11 (5.10-4 M) et C4 (5.10-4 M) des T 0h, b) C11 (5.10-4 M) à T 0h et C4 (5.10-4 M)
à T 6h
Lorsque le composé 11 et la C4-HSL sont ajoutés en même temps dans le milieu
(Figure 5a), on constate une diminution de l’effet du composé 11 observé en l’absence de la
C4-HSL (Figure 2d’).
Lorsque la C4-HSL est introduite sur un biofilm de 6h constitué en présence du
composé 11 (Figure 5b).
177
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
V-4-Conclusion
Les travaux réalisés nous ont permis de sélectionner un composé (C11) présentant une
activité spécifique anti-biofilm. L’effet observé s’exprime lorsque le produit testé est présent
dès les premières phases de formation de biofilm (de 0h à 6h), c'est-à-dire à la phase d’adhésion
et/ou de formation des microcolonies.
Dans notre protocole, la phase d’adhésion correspond aux deux premières heures. En
effet à T 2h, le milieu est renouvelé et les cellules planctoniques, éliminées. A ce stade, la
méthode de détection de la biomasse adhérée n’est pas assez sensible pour détecter des
différences entre le témoin et le composé 11. Cependant, les observations en microscopie
confocale soulignent bien que la densité bactérienne à la surface du puits est similaire, à cette
observée dans le cas de la furanone. Ces deux composés n’agissent donc pas sur la phase
d’adhésion.
Selon la figure 1, nous notons une inhibition d’environ 100% de la formation de biofilm
si le produit testé sélectionné est ajouté à T 2h ou T 4h. Ceci indique que le composé 11 ne joue
pas sur la phase d’adhésion mais sur les phases ultérieures de multiplication des bactéries
adhérées. Ceci est confirmé par les observations en microscopie confocale. De T 2h à T 4h/T
6h, nous avons une phase de multiplication des bactéries adhérées (début de la croissance en
microcolonies). A ce stade, le composé 11 induit une limitation de la prolifération, au même
titre que la furanone. Cet effet conduit à une inhibition significative de la formation de biofilms
aux temps d’incubation 24h et 48h.
Si le composé 11 est ajouté sur un biofilm structuré, en cours de maturation, c’est-à-dire
à partir de 20h, il perd rapidement tout effet inhibiteur, au contraire de la furanone.
Ces observations sont confirmées par les essais d’antagonisme réalisés avec la C4-HSL.
Ceux-ci confirment un antagonisme C4-HSL / composé 11. La perte significative de l’effet du
composé 11 pourrait correspondre à une interaction faible avec le ligand de C4-HSL,
conduisant même à un déplacement du composé 11 en présence de C4-HSL. Ce phénomène
parait moins marqué avec la furanone (Figure 14, Chapitre IV).
178
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
Cette dernière remarque est cependant à modérer si l’on considère l’activité
antibactérienne intrinsèque de la furanone sur bactéries planctoniques, mais également sur
bactéries adhérées, comme le démontre la perte de viabilité observée par microscopie
confocale, après marquage à l’iodure de propidium.
Ces premiers résultats sont donc en faveur d’un effet anti- rhl du composé 11, au même
titre que la furanone.
Cependant, la complexité des systèmes de régulation du QS doit nous faire considérer
ces résultats avec précaution et nécessite des expériences complémentaires pour vérifier la cible
potentielle.
Il faut considérer qu’il s’agit du premier représentant d’une structure de base
d’analogues de la C4-HSL non halogénés. Sur cette base, de nouveaux composés sont en cours
de conception afin d’améliorer l’efficacité « anti-biofilm » et l’antagonisme avec la C4-HSL.
179
Chapitre V- Criblage de l’activité anti-biofilm des analogues du QS en microplaque
180
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Chapitre VI
Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules
eucaryotes
181
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
182
Sommaire du chapitre VI: Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Sommaire du chapitre VI: Cytotoxicité et inhibition d’adhésion
aux cellules eucaryotes
VI-1-Souche test…………………………………………………………………………..187
VI-2-Lignée cellulaire…………………………………………………………………….187
VI-2-1-Origine………………………………………………………………………..187
VI-2-2-Entretien……………………………………………………………………...187
VI-2-2-1-Milieux et réactifs………………………………………………….187
VI-2-2-2- Méthode…………………………………………………………...188
VI-3-Matériels et réactifs…………………………………………………………………189
VI-4-Produits testés……………………………………………………………………….189
VI-5-Test de cytotoxicité………………………………………………………………….189
VI-5-1-Méthode………………………………………………………………………190
VI-5-1-1-Lecture…………………………………………………………….190
VI-5-1-2-Interprétation………………………………………………………191
VI-5-2-Résultats des tests de cytotoxicité de la furanone…………………………….191
VI-5-3-Résultats des tests de cytotoxicité du Composé 11…………………………..192
VI-6-Test d’inhibition d’adhésion………………………………………………………..193
VI-6-1-Méthode………………………………………………………………………193
VI-6-1-1-Lecture……………………………………………………………...194
VI-6-1-2-Interprétation……………………………………………………….194
VI-6-2-Test d’inhibition d’adhésion: Protocole 1……………………………………195
VI-6-3-Test d’inhibition d’adhésion: Protocole 2 – contact préliminaire
cellules/produit………………………………………………………………196
183
Sommaire du chapitre VI: Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
VI-6-4-Test d’inhibition d’adhésion: Protocole 3 - contact préliminaire
cellules/produit – élimination produit……………………………………….197
VI-6-5-Test d’inhibition d’adhésion: Protocole 4 - contact préliminaire
bactéries/produit……………………………………………………………...198
VI-7-Conclusion…………………………………………………………………………...199
184
Sommaire des tableaux et figures du chapitre VI: Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Sommaire des tableaux et figures du chapitre VI: Cytotoxicité et
inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
♦ Tableau 1. Cytotoxicité de la furanone après 2h de contact avec les cellules MMRC-5
(ATCC-CCL-171, lot : 3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par
rapport au témoin sur la base de la moyenne des DO ± écart-type (n= 3). Référence positive
phénol (Ph).Concentration maximale testée en furanone =5.10-5 M
♦ Tableau 2. Cytotoxicité de la furanone après 24h de contact avec les cellules MRC-5
(ATCC-CCL-171, lot: 3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par
rapport au témoin sur la base de la moyenne des DO ± écart-type (n= 3). Référence positive
phénol (Ph). Concentration maximale testée en furanone =5.10-5 M
♦ Tableau 3. Cytotoxicité du composé 11 après 2h de contact avec les cellules MRC-5
(ATCC-CCL-171, lot : 3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par
rapport au témoin sur la base de la moyenne des DO ± écart-type (n= 3). Référence positive
phénol (Ph). Concentration maximale testée en composé 11=5.10-4 M
♦ Tableau 4. Cytotoxicité du composé 11 après 24h de contact avec les cellules MRC-5
(ATCC-CCL-171, lot: 3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par
rapport au témoin sur la base de la moyenne des DO ± écart-type (n= 3). Référence positive
phénol (Ph). Concentration maximale testée en composé 11=5.10-4 M
♦ Tableau 5. Protocole 1-Pourcentages d'adhésion de la souche de PAO 1 radiomarquée
(108 UFC/mL en DMEM sans SVF) en présence de furanone et de composé 11 après 24 h
heures d’incubation à 37°C sous 5% de CO2 , après 2h de contact avec le tapis de cellules
MRC-5
(ATCC-CCL-171, lot : 3929229) (moyenne +/- écatr-type, n= 2)
♦ Tableau 6. Protocole 2- Pourcentages d'adhésion de la souche PAO 1 radiomarquée (108
UFC/mL en DMEM sans SVF) en présence de furanone ou de composé 11 après 24 h
d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, de contact sur les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171,
lot : 3929229) (moyenne +/- écart-type, n= 2)
185
Sommaire des tableaux et figures du chapitre VI: Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
♦ Tableau 7. Protocole 3- Pourcentages d'adhésion de la souche PAO 1 radiomarquée (108
UFC/mL en DMEM sans SVF) mise en contact de furanone et du composé 11 après 24 h
d’incubation à 37°C sous 5% de CO2 en présence des cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171,
lot : 3929229), (moyenne +/- écart-type, n= 2)
♦ Tableau 8. Protocole 4- Pourcentages d'adhésion de la souche PAO 1 radiomarquée (108
UFC/mL en DMEM sans SVF) en présence de furanone et du composé 11 après 24 h
d’incubation à 37°C sous aérobiose, contact après lavage sur les cellules MRC-5 (ATCCCCL-171, lot: 3929229). (moyenne +/- écart-type, n= 2)
186
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Afin de définir l’intérêt potentiel du composé sélectionné dans le traitement préventif
ou curatif des infections à P. aeruginosa, deux types d’essais ont été réalisés sur cellules
eucaryotes correspondant à une lignée d’origine pulmonaire humaine:
-
un test de cytotoxicité
-
un test d’inhibition d’adhésion aux cellules.
VI-1-Souche test
La souche utilisée est Pseudomonas aeruginosa PAO1 (Collection de l’Institut
Pasteur, Paris, France). La conservation, l’entretien, l’identification et les dénombrements des
UFC sont réalisés selon les indications du chapitre II.
VI-2-Lignée cellulaire
VI-2-1-Origine
La lignée cellulaire utilisée pour les tests de cytotoxicité et d’adhésion bactérienne aux
cellules est la lignée MRC-5 (ATCC-CCL-171 : lot 3929229). Elle a été obtenue auprès de
l’American Type Culture Collection (ATCC). Il s’agit d’une lignée de fibroblastes
pulmonaires humains d’origine cancéreuse.
VI-2-2-Entretien
VI-2-2-1-Milieux et réactifs
-
Acides Aminés Non Essentiels (NEAA Lonza®)
-
Bleu trypan (Sigma®)
-
Diméthylsulfoxide (Sigma®)
-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – Lonza®)
-
L-glutamine (Lonza®)
-
Mélange Pénicilline-Streptomycine (Lonza®)
187
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
-
PBS (Tampon Phosphate à 0,0067M en PO42-, Lonza®)
-
Sérum de veau fœtal (SVF) (Lonza®)
-
Sodium Dodecyl Sulfate (Sigma®)
-
Trypsine-EDTA (Trypsine-Ethylenediaminetetraacetic acid, Lonza®)
VI-2-2-2-Méthode
La lignée de cellules pulmonaires est conservée à –195°C dans l’azote liquide dans un
mélange contenant du sérum de veau fœtal (SVF) décomplémenté (concentration finale 90%)
et du Diméthylsulfoxyde (DMSO) (concentration finale 10%) à raison d’une concentration
cellulaire comprise entre 5.106 et 1.107 cellules/mL. Avant chaque essai, les cellules sont
mises à incuber à 37°C sous 5% de CO2 dans du milieu de culture DMEM supplémenté avec
une solution d’acides aminés non essentiels (concentration finale à 1%), de la L-glutamine
(concentration finale à 2mM/mL) et un mélange pénicilline-streptomycine (concentration
finale à 10 unités internationales/mL) et du SVF décomplémenté (concentration finale 10%).
Après 48 heures de culture en flacon, les cellules deviennent confluentes et forment un
tapis cellulaire en monocouche. Le milieu de culture est éliminé et le tapis cellulaire est lavé
une fois avec du tampon phosphate avant d’ajouter 5mL de trypsine-EDTA (enzyme
protéolytique) afin de décoller les cellules du flacon. La culture est mise à incuber 5 minutes à
37°C jusqu’à ce que le tapis commence à se détacher du flacon. Les cellules sont mises en
suspension dans 10mL de milieu de culture complet (10% SVF) et centrifugées à 1600 rpm
pendant 5 minutes à 20°C. Le culot cellulaire obtenu est récupéré et mis en suspension dans 1
mL de milieu de culture complet.
Après un test de viabilité cellulaire au bleu trypan en cellule de Malassez:
♦ une partie de la suspension cellulaire est ajustée à 1.105 cellules/mL dans 20mL de
milieu DMEM supplémenté avec 10% SVF pour le repiquage cellulaire en flacon
de culture,
♦ l’autre partie est ajustée à 2.105 cellules /mL dans un volume suffisant pour
déposer 100µL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits pour le test de
cytotoxicité ou 500µL dans chaque puits d’une plaque de 24 puits pour le test
d’adhésion.
188
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Les flacons de culture cellulaire ainsi que les plaques de test sont incubés à 37°C sous
5% de CO2 dans une atmosphère humide.
VI-3-Matériels et réactifs
-
Adénine tritiée (Sigma®)
-
Centrifugeuse (Hereaus®)
- Compteur béta (appareil de lecture de la radioactivité émise par les échantillons)
-
Flacons à scintillation
-
Formazan (Merck®)
-
Liquide de scintillation (Ready safe, Beckman Coulter)
-
Microspectrophotomètre Multiskan (à 450 nm) (Titretek®)
-
Poste de Sécurité Microbiologique de classe II (PSM)
-
Qoezyme Q
-
Sodium 3,3’-[1-[(phénylamino) carbonyl]-3,4-trétrazolium]-bis (4-méthoxy-6-nitro)]
benzène sulfonic acid hydrate (XTT, Merck) ou en français: sel de sodium de l’acide
3,3-[1-[(phénylamino) carbonyl]-3,4-trétrazolium] bis (4-méthoxy-6-nitro)] benzène
sulfonique hydraté.
-
Sodium dodecyl sulfate (SDS) (Sigma®)
VI-4-Produits testés
Les deux essais ont été réalisés avec le composé sélectionné (composé 11) versus la
furanone.
Dans le cas du test de cytotoxicité, une référence positive, le phénol (10 mg/mL), est
évaluée en parallèle, permettant la validation de chaque série d’expérimentations.
VI-5-Test de cytotoxicité
La cytotoxicité du composé 11 et de la furanone sur la lignée MRC-5 (ATCC-CCL171 : lot 3929229) a été étudiée selon le test du XTT.
189
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique d’un sel de
tétrazolium3,3-[1-[(phénylamino)
carbonyl]-3,4-trétrazolium]
bis
(4-méthoxy-6-nitro)]
benzène sulfonique hydraté soit XTT, en un produit coloré, le formazan.
Le XTT est réduit par les déshydrogénases mithochondriales des cellules vivantes en
présence d’un agent couplant d’électrons, le coenzyme Q, en un composé hydrosoluble
jaune/orangé, le formazan, dosable par spectrophotométrie à 450 nm.
VI-5-1-Méthode
Les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171 : lot 3929229) sont conservées dans l’azote
liquide. Après amplification en milieu de culture DMEM, la suspension est ajustée à 2.105
cellules par mL par numération en cellule de Malassez.
Avant chaque essai, une microplaque de 96 puits à fond plat est ensemencée sous un
volume de 100µL + 100 µL de milieu de culture enrichi par 10% de SVF.
Après incubation à 37°C sous 5% de CO2 pendant 18 à 24 h, le milieu est éliminé et
l’ensemble de la microplaque est rincé avec 100 µL de PBS par puits. Le PBS est éliminé.
En parallèle, des dilutions des produits à tester, la furanone (à partir de 5.10-5M), le
composé 11 (à partir de 5.10-4M) et le phénol (10 mg/mL) (référence positive de la
cytotoxicité) sont réalisées en milieu de culture (DMEM sans SVF) sur une seconde
microplaque de 96 puits.
Les dilutions de produit sont transférées sur le tapis cellulaire lavé, à l’exception de la colonne
12 (témoin cellules non traitées).
Nombre d’essais lors d’une expérimentation (8).
Après incubation à 37°C sous 5% de CO2 pendant 2h ou 24 h, les puits de la
microplaque sont rincés avec 100 µL de PBS.
Après élimination du PBS, 50 µL d’une solution de XTT (0,5 mg/mL) et de
Coenzyme Q (40 µg/mL) sont ajoutés à chaque puits.
VI-5-1-1-Lecture
Après une incubation à 37°C pendant 3 heures, 100 µL d’une solution aqueuse à 10%
de SDS (Merck) sont ajoutés à chaque puits et la densité optique est immédiatement lue à 450
nm au microspectrophotomètre Multiskan®.
190
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
VI-5-1-2-Interprétation
La densité optique relevée est proportionnelle à la population cellulaire.
Ce test nous permet donc d’analyser à partir d’une densité optique correspondant au
témoin, une toxicité cellulaire lorsque la densité optique est inférieure à celle du lot témoin.
Le pourcentage de viabilité est calculé de la façon suivante:
% de viabilité = [(DO Témoin - DO Traité)/DO Témoin] x 100
Si le pourcentage de viabilité est inférieur ou égal à -30%, le produit est considéré
comme significativement cytotoxique (valeur définie lors d’essais intra-laboratoire).
Entre -30% et +30%, le composé est considéré comme non toxique; au delà de +30%,
il est considéré comme prolifératif.
VI-5-2-Résultats des tests de cytotoxicité de la furanone
Les résultats des tests de cytotoxicité de la furanone, pour des temps de contact de 2h
et 24h, sont rapportés dans les tableaux 1 et 2.
[Furanone]
DO
Moyenne
Ecart type
% de
viabilité
5.10-5
M
2,5.10-5
M
1,25.10-5
M
1,110
1,130
0,938
0,018
0,106
63,21
66,15
6,25.10-6
M
3,125.10-6
M
1,156.10-6
M
7,8.10-7
M
3,9.10-7
M
1,95.10-7
M
0,842
0,835
0,765
0,719
0,720
0,700
0,001
0,680
0,101
0,082
0,110
0,099
0,084
0,057
0,032
0,013
0,062
37,93
23,81
22,68
12,42
5,62
5,88
2,83
-99,85
Ph
1mg
Témoin
Tableau 1. Cytotoxicité de la furanone après 2h de contact avec les cellules MMRC-5 (ATCC-CCL-171, lot:
3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par rapport au témoin sur la base de la moyenne des
DO ± écart-type (n= 3). Référence positive phénol (Ph).Concentration maximale testée en furanone =5.10-5 M
[Furanone]
5.10-5
M
2,5.10-5
M
1,25.10-5
M
DO
Moyenne
0,551
0,548
0,886
Ecart type
0,164
0,094
% de
viabilité
-20,85
-21,32
6,25.10-6
M
3,125.10-6
M
1,156.10-6
M
7,8.10-7
M
3,9.10-7
M
0,809
0,648
0,684
0,640
0,725
0,125
0,112
0,092
0,061
0,041
27,17
16,12
-6,93
-1,76
-8,18
1,95.10-7
M
Ph 1mg
Témoin
0,805
-0,010
0,697
0,026
0,052
0,008
0,092
4,09
15,58
-101,44
Tableau 2. Cytotoxicité de la furanone après 24h de contact avec les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot:
3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par rapport au témoin sur la base de la moyenne des
DO ± écart-type (n= 3). Référence positive phénol (Ph). Concentration maximale testée en furanone =5.10-5 M
191
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Les tableaux indiquent les valeurs moyennes de DO ± écart-type observées sur 3 essais
indépendants, respectivement pour des temps de contact furanone/cellules de 2 heures et 24
heures.
Les pourcentages de viabilité cellulaire calculés à partir de ces données sont supérieurs
à -30% quelles que soient les conditions d’essai (temps de contact – concentration en
furanone).
Ces résultats indiquent donc une absence d’activité cytotoxique significative de la
furanone dans ces conditions (concentration ≤ 5.10-5M).
Cependant, pour un temps de contact cellules/furanone de 2 heures, nous notons une
activité dite proliférative (augmentation d’activité) aux plus fortes concentrations testées
(5.10-5 M à 1,25.10-5M).
Après 24 heures de contact, cet effet disparaît. Des valeurs inférieures à -20% sont
alors notées aux plus fortes concentrations (5.10-5 M et 2,5.10-5 M).
VI-5-3-Résultats des tests de cytotoxicité du Composé 11
Les résultats des tests de cytotoxicité du composé 11, pour des temps de contact de 2h
et 24h, sont rapportés dans les tableaux 3 et 4.
[Composé 11]
5.10-4
M
2,5.10-4
M
1,25.10-4
M
6,25.10-5
M
3,125.10-5
M
1,156.10-5
M
7,8.10-6
M
3,9.10-6
M
1,95.10-6
M
DO
Moyenne
0,798
1,073
0,948
0,836
0,780
0,817
0,750
0,660
0,645
0,001
0,603
0,067
0,063
0,044
0,041
0,048
0,055
0,033
0,037
0,040
0,013
0,021
32,38
77,86
57,21
38,60
29,39
35,49
24,34
9,45
6,88
-99,83
Ecart type
% de
viabilité
Ph
1mg
Témoin
Tableau 3. Cytotoxicité du composé 11 après 2h de contact avec les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot:
3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par rapport au témoin sur la base de la moyenne des
DO ± écart-type (n= 3). Référence positive phénol (Ph). Concentration maximale testée en composé 11=5.10-4 M
[Composé 11]
DO
Moyenne
Ecart type
% de
viabilité
5.10-4
M
2,5.10-4
M
1,25.10-4
M
6,25.10-5
M
3,125.10-5
M
1,156.10-5
M
7,8.10-6
M
3,9.10-6
M
1,95.10-6
M
0,724
0,670
1,192
1,147
1,088
0,966
1,029
0,944
0,914
-0,010
0,836
0,088
0,076
0,065
0,058
0,071
0,064
0,075
0,048
0,036
0,008
0,024
-13,42
-19,91
42,48
37,19
30,04
15,49
23,05
12,83
9,24
-101,2
Ph
1mg
Tableau 4. Cytotoxicité du composé 11 après 24h de contact avec les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot:
3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par rapport au témoin sur la base de la moyenne des
DO ± écart-type (n= 3). Référence positive phénol (Ph). Concentration maximale testée en composé 11=5.10-4 M
192
Témoin
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Les tableaux indiquent les valeurs moyennes de DO ± écart-type observées sur 3 essais
indépendants, respectivement pour des temps de contact composé 11 / cellules de 2 heures et
24 heures.
Les pourcentages de viabilité cellulaire calculés à partir de ces données sont supérieurs
à -30% quelles que soient les conditions d’essai (temps de contact – concentration en
composé 11).
Ces résultats indiquent donc une absence d’activité cytotoxique du composé 11 dans
ces conditions (concentration ≤ 5.10-4 M).
Par ailleurs, pour un temps de contact C11/cellules de 2 heures, nous notons une
activité dite proliférative (augmentation d’activité) aux plus fortes concentrations testées
(5.10-4 M à 1,156.10-5M).
Après 24 heures de contact, cet effet disparaît aux plus fortes concentrations et reste
encore notable aux concentrations 1,25.10-4M à 3,125.10-5M.
Pour les deux produits (furanone et composé 11), les concentrations maximales
testées sans effet cytotoxique sont inférieures aux valeurs de CMI et CMB déterminées
antérieurement. Ces valeurs constituent donc les concentrations limites à prendre en
compte pour les tests d’inhibition d’adhésion sur la lignée cellulaire MRC-5 (ATCCCCL-171 : lot 3929229) ; soit, une concentration finale en furanone de 5.10-5 M et en
composé 11 de 5.10-4 M pour 2 heures de contact avec les cellules.
VI-6-Test d’inhibition d’adhésion
Les tests d’inhibition d’adhésion ont été réalisés selon quatre protocoles, afin de mieux
évaluer la cible potentielle.
VI-6-1-Méthode
La lignée cellulaire MRC-5 (ATCC-CCL-171 : lot 3929229) est stockée dans l’azote
liquide. Après amplification en milieu DMEM, une suspension cellulaire ajustée à 2.105
cellules/mL est préparée en milieu DMEM supplémenté par 10% de SVF.
193
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
500 µL de cette suspension sont déposés dans chaque puits d’une plaque stérile de 24
puits à fond plat (Nunc®). Les plaques sont incubées à 37°C sous 5% de CO2 pendant 24h
jusqu’à la phase exponentielle.
Parallèlement, la souche bactérienne Pseudomonas aeruginosa PAO 1 est repiquée sur
milieu TSA-G. Les bactéries sont utilisées en phase de croissance logarithmique (24 heures
d’incubation à 37°C). Un contrôle microscopique de la pureté de la souche est effectué après
coloration de Gram.
Une suspension bactérienne est ajustée à 108 UFC/mL en bouillon TSA-B. Les
bactéries sont alors mises en présence de 30 µL d’Adénine tritiée (concentration = 1
millicurie/mL). L’incorporation d’adénine tritiée s’effectue pendant une incubation de 18
heures à 37°C sous aérobiose.
Après 3 lavages au PBS (3600 rpm pendant 10 min), les bactéries marquées sont
remises en suspension et ajustées à 108 UFC/mL en milieu DMEM sans SVF.
VI-6-1-1-Lecture
Après 18 heures d’incubation des plaques, le lysat de chaque puits est prélevé et placé
dans des flacons à scintillation, en présence de 2 mL de liquide de scintillation (Ready safe,
Beckman Coulter). Les tubes à scintillation sont placés pendant 1 heure à 4°C.
La lecture est immédiate au compteur béta et les résultats sont exprimés en
désintégration par minute transformé en coups par minute (CPM).
VI-6-1-2-Interprétation
Le pourcentage d’inhibition d’adhésion est calculé selon la formule suivante:
% d’adhésion / au témoin = [(CPM essai - CPM témoin) / CPM témoin] x 100
CPM du témoin: CPM sans traitement des cellules
CPM de l’essai: CPM avec traitement des cellules
A partir d’une valeur inférieure ou égale à - 30%: le produit est considéré comme
ayant un effet inhibiteur d’adhésion de la bactérie considérée à la lignée cellulaire testée.
194
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
VI-6-2-Test d’inhibition d’adhésion: Protocole 1
Ce protocole implique un contact direct du tapis cellulaire avec la suspension de PAO
1 radiomarquée et différentes concentrations de produits testés, suivi d’une incubation de 2h à
37°C sous 5% CO2.
Le tapis cellulaire est lavé avec 500µL de PBS.
500µl de la suspension de PAO 1 radiomarquée (108 UFC/mL en DMEM sans SVF) sont
déposés dans les puits.
Sont alors ajoutés : 500µl de chaque produit à tester (concentration finale dans le puits de
furanone: 5.10-5 M et composé 11: 5.10-4 M) ou de milieu de culture (témoin).
Après 2 heures d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, 2 lavages sont réalisés au PBS
(lavage sous un volume de 500µL).
Après addition de 500µL de solution de lyse (SDS 0,1% + NaOH 0,5M), la
microplaque est incubée 18 heures à 37°C.
Les résultats (Tableau 5) sont exprimés en pourcentage d'adhésion en présence de
furanone ou de composé 11 par rapport au témoin, sur la base de la moyenne des CPM ±
écart-type (n= 2).
Temps contact:
24h
Moyenne
Ecart type
Pourcentage
CPM totaux
furanone
5.10-5 M
12359
655,0
981,99
11646
2,5.10-5 M
1116
54,3
-2,30
11646
Composé 11
5.10-4 M
13060,75
1003,7
1043,42
11646
2,5.10-4 M
10959
755,2
859,42
11646
Témoin
1142,25
113,7
11646
Tableau 5. Protocole 1-Pourcentages d'adhésion de la souche de PAO 1 radiomarquée (108 UFC/mL en DMEM
sans SVF) en présence de furanone et de composé 11 après 24 h heures d’incubation à 37°C sous 5% de CO2 ,
après 2h de contact avec le tapis de cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot: 3929229) (moyenne +/- écatr-type,
n= 2)
Dans ces conditions d’essai, c'est-à-dire après addition sur les cellules de la suspension
de PAO1 et des produits à tester en même temps, aucune inhibition d’adhésion n’est observée.
Des valeurs très supérieures au témoin sont notées, indiquant même une augmentation du
nombre de bactéries adhérées.
195
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
VI-6-3-Test d’inhibition d’adhésion: Protocole 2 – contact
préliminaire cellules/produit
Ce protocole implique un pré-traitement du tapis cellulaire avec différentes
concentrations de produits à tester pendant 24h à 37°C sous 5% CO2. La suspension de PAO
1 radiomarquée et ajoutée sans élimination des produits testés (incubation de 2h à 37°C sous
5% CO2).
Le tapis cellulaire est lavé avec 500µL de PBS.
500µL de solution de chaque produit à tester (concentration finale de furanone: 5.10 -5
M et composé 11: 5.10-4 M) ou de milieu de culture (témoin) par puits.
Après 24 heures d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, 500µL de suspension de PAO 1
radiomarquée (108 UFC/mL en DMEM sans SVF) sont ajoutés sans lavage.
Après 2 heures d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, 2 lavages sont réalisés au PBS
(lavage sous un volume de 500µL).
Après addition de 500µL de la solution de lyse (SDS 0,1% + NaOH 0,5M), la
microplaque est incubée 18 heures à 37°C.
Les résultats (Tableau 6) sont exprimés en pourcentages d'adhésion de la furanone et
du composé 11 par rapport au témoin, sur la base de la moyenne des CPM ± écart-type (n= 2).
Temps contact:
24h
Moyenne
Ecart type
Pourcentage
CPM totaux
Composé 11
furanone
5.10-5 M
1269
91,6
11,10
3556
2,5.10-5 M
1116
54,3
-2,30
3556
5.10-4 M
5574,25
561,4
388,01
3556
2,5.10-4 M
5270,25
404,5
361,39
3556
Témoin
1142,25
113,7
3556
Tableau 6. Protocole 2- Pourcentages d'adhésion de la souche PAO 1 radiomarquée (108 UFC/mL en DMEM
sans SVF) en présence de furanone ou de composé 11 après 24 h d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, de
contact sur les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot: 3929229) (moyenne +/- écart-type, n= 2)
-
Le pré-traitement des cellules par la furanone n’entraîne pas d’inhibition de l’adhésion
de PAO1 (adhésion > à -30%). L’augmentation du nombre de bactéries adhérées
observé dans le cas du protocole 1 n’est pas trouvée.
-
Pour le composé 11, le pré-traitement des cellules se traduit toujours par une
augmentation significative de l’adhésion de PAO1 (adhésion > à +30%) qui est
cependant inférieure à celle notée lors de l’application du protocole 1.
-
196
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
VI-6-4-Test d’inhibition d’adhésion: Protocole 3 – contact
préliminaire cellules/produit – élimination produit
Ce protocole implique un pré-traitement du tapis cellulaire avec différentes
concentrations de produits à tester pendant 24h à 37°C sous 5% de CO2. La suspension de
PAO 1 radiomarquée et ajoutée après élimination des produits testés (incubation de 2h à 37°C
sous 5% de CO2).
Le tapis cellulaire est lavé avec 500µL de PBS.
500µL de solution de chaque produit à tester (concentration finale de furanone: 5.10 -5
M et composé 11: 5.10-4 M) ou de milieu de culture (témoin) sont ajoutés.
Après 24 heures d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, 2 lavages sont réalisés au PBS
(lavage sous un volume de 500µL).
500µL de suspension de PAO 1 radiomarquée (108 UFC/mL en DMEM sans SVF)
sont déposés dans les puits.
Après 2 heures d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, 2 lavages sont réalisés au PBS
(lavage sous un volume de 500µL).
Après addition de 500µL de solution de lyse (SDS 0,1% + NaOH 0,5M), la
microplaque est incubée 18 heures à 37°C.
Les résultats (Tableau 7) sont exprimés en pourcentages d'adhésion par la Furanone et
par le composé 11 et par rapport au témoin, sur la base de la moyenne des CPM ± écart-type
(n= 2).
Temps contact:
24h
Moyenne
Ecart type
Pourcentage
CPM totaux
furanone
5.10-5 M
10485,25
904,3
6,50
11228
2,5.10-5 M
10388,125
496,1
5,51
11228
Composé 11
5.10-4 M
11775,125
1022,2
19,60
11228
2,5.10-4 M
12340
530,1
25,33
11228
Témoin
9845,75
893,4
11228
Tableau 7. Protocole 3- Pourcentages d'adhésion de la souche PAO 1 radiomarquée (108 UFC/mL en DMEM
sans SVF)mise en contact de furanone et du composé 11 après 24 h d’incubation à 37°C sous 5% de CO2 en
présence des cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot: 3929229), (moyenne +/- écart-type, n= 2)
Le pré-traitement des cellules par la furanone avec lavage intermédiaire n’entraîne pas
d’inhibition de l’adhésion de PAO1 (adhésion > à -30%). Les valeurs observées sont proches
de celles relevées avec des cellules non lavées.
197
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Pour le composé 11, le pré-traitement des cellules avec lavage intermédiaire n’entraîne
pas de modification de l’adhésion.
Dans les conditions décrites (lavage intermédiaire entre contact produit / bactérie), les
valeurs observées sont proches de celles relevées avec des cellules non traitées pour les deux
produits testés.
VI-6-5-Test d’inhibition d’adhésion: Protocole 4 – contact
préliminaire bactéries/produit
Ce protocole implique un pré-traitement de la suspension de PAO 1 radiomarquée
avec différentes concentrations de produits à tester pendant 24h à 37°C sous 5% de CO2.
Après élimination des produits, la suspension est mise en contact avec le tapis cellulaire
(incubation de 2h à 37°C sous 5% de CO2).
500µL de solution de chaque produit à tester (concentration finale dans le puits de
furanone: 5.10-5 M et composé 11: 5.10-4 M) ou de milieu de culture (témoin) sont déposés
sur une plaque à 24 puits sans cellules.
500µL de suspension de PAO 1 radiomarquée (108 UFC/mL en DMEM sans SVF)
sont déposés dans les puits de la microplaque 24 puits.
Après 24 heures d’incubation à 37°C sous aérobiose, le mélange (bactéries + produit)
est lavé avec PBS à 3600 rpm/min pendant 10min à température ambiante pour éliminer le
produit et conserver le culot de bactéries marquées traitées.
Le culot de PAO 1 radiomarquée (108 UFC/ml) est repris dans les puits avec 1mL de DMEM
sans SVF.
Un lavage est réalisé au PBS (lavage sous un volume de 500µL).
500µL de suspension de PAO 1 radiomarquée (108 UFC/mL en DMEM sans SVF)
ainsi
pré-traitée sont déposés dans les puits sur tapis cellulaire.
Après 2 heures d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, 2 lavages sont réalisés au PBS
(lavage sous un volume de 500µL).
Après addition de 500µL de solution de lyse (SDS 0,1% + NaOH 0,5M), la
microplaque est incubée 18 heures à 37°C.
Les résultats des pourcentages d’adhésion sont présentés dans le tableau 8 (n= 2).
198
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Temps contact :
24h
Moyenne
Ecart type
Pourcentage
CPM totaux
furanone
5.10-5 M
2834,25
285,4
-67,02
4109
Composé 11
Témoin
5.10-4 M
5290,75
8594,75
210,5
437,2
0,01
6275
9412
Tableau 8. Protocole 4- Pourcentages d'adhésion de la souche PAO 1 radiomarquée (108 UFC/mL en DMEM
sans SVF) en présence de furanone et du composé 11 après 24 h d’incubation à 37°C sous aérobiose, contact
après lavage sur les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot: 3929229). (moyenne +/- écart-type, n= 2)
Le pré-traitement de PAO1 par la furanone pendant 24h entraîne une inhibition
significative de l’adhésion aux cellules MRC-5. Ceci semble confirmer une activité directe de
la furanone sur PAO1 qui limite ainsi l’adhésion au tapis cellulaire.
Le prétraitement de PAO1 par le composé 11 pendant 24h ne modifie pas le
pourcentage de l’adhésion par rapport au témoin.
VI-7-Conclusion
Les résultats observés indiquent que la furanone et le composé 11 n’ont pas d’effet
cytotoxique direct sur les cellules MRC-5 aux concentrations testées. Cependant, des effets
activateurs de la prolifération ou du moins de l’activité métabolique (respiration) des cellules,
caractérisée par une augmentation de l’activité des déshydrogénases mitochondriales, ont été
observés aux plus fortes concentrations, notamment pour le temps court d’incubation de 2h.
Cet effet disparaît ou est nettement réduit à 24h et ce pour les deux produits testés.
Les essais d’adhésion aux cellules MRC-5 indiquent des quantités globales de
bactéries marquées supérieures dans le cas du protocole 1 (addition concomitantes des
bactéries et des produit testés) pour la furanone et le composé 11, et du protocole 2 (prétraitement des cellules: temps de contact avec le produit testé : 24h, puis avec les bactéries :
2h) pour le composé 11.
Le simple lavage intermédiaire entre l’addition de produit testé et la mise en contact
avec les bactéries (protocole 3) se traduit par une adhésion proche de celle du témoin pour les
deux produits testés.
Seul le protocole 4 (pré-traitement des bactéries) permet l’observation d’un effet
inhibiteur d’adhésion significatif et ce uniquement pour la furanone.
199
Chapitre VI- Cytotoxicité et inhibition d’adhésion aux cellules eucaryotes
Les variations observées doivent être analysées en prenant en compte différents points:
-
l’effet prolifératif potentiel des deux molécules testées à fortes concentrations pouvant
conduire à une activation cellulaire (2h de contact) ou un nombre de cellules supérieur
au témoin (24h de contact), et donc une augmentation du pourcentage d’adhésion de la
bactérie PAO1 sur les cellules MRC-5.
-
l’action antimicrobienne intrinsèque de la furanone qui peut jouer un rôle dans l’effet
observé, lors de l’application du protocole 4, par altération des structures notamment
pariétales (contact bactérie/produits testés de 24h) et/ou par effet bactéricide.
-
l’évaluation de la seule étape d’adhésion initiale avec le tapis cellulaire lors de ces
essais in vitro (après une incubation de 2h) du fait de la mort cellulaire lors de contact
prolongé avec les bactéries expliquant l’absence ou le faible effet des produits testés.
Ainsi, l’effet de la furanone sur la phase d’adhésion, lors d’un pré-traitement des bactéries
durant 24h est cohérent avec nos résultats antérieurs (Chapitre V) sur l’activité
antibactérienne de la furanone et son effet anti-biofilm.
L’absence d’effet du composé 11 quel que soit le protocole est également pertinent si l’on
considère que ce produit testé ne semble pas avoir d’effet sur la phase d’adhésion (2h) mais
plutôt sur la phase de multiplication des bactérie adhérée, que nous ne pouvons reproduire in
vitro sur cellules eucaryot
200
Chapitre VII- Discussion
Chapitre VII
Discussion
201
Chapitre VII- Discussion
202
Sommaire des tableaux et figures de la discussion
Sommaire des tableaux et figures de la discussion
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Figure 1. Potentiels électrostatiques moléculaires (isolignes rouges: potentiels négatifs;
isolignes vertes: potentiels positifs)
♦ Tableau 1. Charges atomiques déterminées par la méthode PM6 (MOPAC 2007)
203
Sommaire des tableaux et figures de la discussion
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Chapitre VII- Discussion
P. aeruginosa est un bacille à Gram négatif ubiquitaire, retrouvé dans différents
environnements: sol, milieux hydriques, écosystèmes végétaux, animaux. Parallèlement, cette
bactérie est typiquement considérée comme un opportuniste du fait de ses remarquables
capacités d’adaptation à son environnement. Il est alors l’agent d’infections nosocomiales,
plus particulièrement dans les services de réanimation et chez les patients immunodéprimés.
La problématique biofilm est typique chez une bactérie opportuniste ubiquitaire comme
P. aeruginosa. En effet, c’est la colonisation progressive de l’environnement (réseau d’eau,
robinetterie,…), des dispositifs médicaux implantables ou non sous forme biofilm qui va
conduire à la colonisation chez l’homme, puis à l’apparition d’un statut infectieux spécifique.
Ce statut infectieux lié à l’expression des gènes de virulence de P. aeruginosa est également
étroitement lié au développement de cette bactérie sous forme biofilm au niveau des
muqueuses, comme nous avons pu le voir dans le chapitre I. Par ailleurs, une des
caractéristiques des biofilms, notamment à P. aeruginosa, va être une perte de sensibilité aux
traitements accessibles à ce jour, dont les antibiotiques classiquement considérés comme antipyocyaniques.
L’ensemble de ces éléments souligne l’intérêt de développer des études à la fois sur la
compréhension des mécanismes de formation du biofilm et sur de nouvelles approches
thérapeutiques avec la définition de nouvelles cibles potentiellement spécifiques (Costerton et
al. 1999). Nos travaux s’inscrivent dans ce cadre, avec une première partie concernant la
modification, voire l’amélioration du modèle de formation de biofilm en flux continu mis au
point antérieurement au Laboratoire et une seconde partie, plus importante, dédiée à la
conception, la synthèse et l’évaluation d’analogues potentiels de la C4-HSL avec comme
objectif la sélection de molécules « anti-biofilm » et donc comme crible de sélection l’impact
sur la cinétique de formation du biofilm.
Lors des travaux antérieurs réalisés au Laboratoire dans le cadre d’un groupe de
travail (SFM – Antiseptiques et désinfectants) sur la mise au point d’un modèle en flux
continu de formation de biofilm, l’approche choisie avait été non spécifique. Elle a conduit à
la proposition de conditions d’essai standard (composition du milieu, inoculum, nature du
support, longueur de la boucle, débits d’alimentation et d’agitation, température
d’incubation), permettant l’obtention de biofilms stables et reproductibles de différentes
espèces bactériennes. Soit des bactéries aérobies stricts (Bacillus subtilis, P. aeruginosa) soit
des bactéries anaérobies facultatifs (Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Streptococcus
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Chapitre VII- Discussion
mutans) (Alasri, 1992). Le milieu de culture utilisé comporte du lactose (0,025 g/L), des sels,
des acides aminés essentiels et de l’extrait de levure.
Le modèle en flux continu, mis au point initialement au Laboratoire, présente la
caractéristique de fonctionner en condition d’anaérobiose ménagée, avec un apport de milieu
et sans agitatives, avec une surface d’échange limités avec l’air, une fiole de garde et une
circulation du milieu au sein de la boucle sans apport d’air.
Nos premiers travaux ont porté sur la modification de la composition d’un Bouillon
Biofilm (BB) avec la prise en compte de différents facteurs:
-
la non-utilisation du lactose par P. aeruginosa et son remplacement par du glucose,
-
un apport en nutriments faible, afin de favoriser une croissance en mode biofilm, sur la
base d’une réponse de type stress et d’un conditionnement de la surface favorisant la
phase d’adhésion initiale, notamment par chimiotactisme,
-
un apport essentiellement minéral avec maintien du rapport C/N par rapport au BB
initial.
P. aeruginosa présente un métabolisme exclusivement respiratoire (aérobie et
anaérobie). Sa capacité à utiliser les sucres comme source de carbone n’inclut pas le lactose.
La présence d’une nitrate réductase lui permet cependant de fonctionner en anaérobiose, par
réduction des nitrates jusqu’au stade de diazote (N2) moléculaire. Ainsi, la composition
initiale du bouillon biofilm peut apparaître non optimale pour l’étude spécifique des biofilms
à P. aeruginosa. Parallèlement, la présence de composés mal caractérisés (extrait de levure)
conduit à un risque de variation dans la composition du milieu non négligeable, et un risque
d’interférence avec certaines méthodes de dosage, notamment des exopolysaccharides (EPS).
De ce fait, la première partie de notre travail a consisté en la mise au point théorique d’un
nouveau bouillon Biofilm et son évaluation sur le modèle en flux continu. La modification de
la nature et des concentrations en substrats entraîne des variations importantes, que ce soit au
niveau du conditionnement des surfaces que de la synthèse des polysaccharides. Samrakandi
(1996) a ainsi étudié les différentes cinétiques de formation de biofilm pour des milieux
différents, en suivant le nombre d’UFC/cm2, les taux de polysacharides totaux et
d’exopolysaccharides en fonction du temps, pour une souche de P. aeruginosa muqueux. Les
milieux testés, en-dehors du bouillon Biofilm, étaient un milieu comportant du glycérol (5
g/L) et de l’acide citrique (3 g/L) (Marty et al. 1992), un milieu associant glycérol et
glutamate ou glycérol/glutamate/désoxycholate et un milieu enrichi à 20 g/L de glycérol avec
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Chapitre VII- Discussion
diminution de l’apport azoté (0,05 g/L). Pour tous ces milieux, la croissance du biofilm
apparaît plus lente que sur bouillon Biofilm. Par contre, des variations importantes de
production de polysaccharides sont notées, avec les taux les plus élevés correspondant au
milieu enrichi à 20 g/L de glycérol. Ce phénomène n’apparaît que pour la souche mucoïde et
pourrait être lié au rapport C/N élevé, favorable selon Sutherland (1985) à la production de
polysaccharides et à une modification de l’activation des gènes impliqués dans la synthèse
d’alginate (variation de l’apport azoté). Selon les microorganismes, une dissociation entre la
croissance des bactéries adhérées et les taux de protéines et polysaccharides détectés,
phénomène lié à une production importante de matériel extra-cellulaire peut également être
observée (Lawrence et al. 1991; Okabe et al. 1994).
Notre choix s’est donc porté vers un remplacement de l’extrait de levure, du mélange
d’acides aminés et du lactose par un apport azoté minéral et du glucose, tout en conservant le
ratio C/N (Chapitre III, Tableaux 1 et 2), sur la base:
-
des travaux antérieurs ayant permis de démontrer une obtention de biofilm structuré
sur souches mucoïdes et non mucoïdes de P. aeruginosa en bouillon Biofilm,
-
d’importance de la phase de colonisation et d’augmentation de la biomasse (comptage)
au niveau pulmonaire pour la mise en place du processus infectieux au décours de la
mucoviscidose.
Dans ces nouvelles conditions expérimentales, nous observons une cinétique de
formation de biofilm similaire entre le bouillon Biofilm et le bouillon Biofilm modifié en ce
qui concerne la colonisation de la surface par des cellules cultivables (Chapitre III, Figure 3).
La première phase, observée lors de l’établissement des cinétiques de formation de
biofilm en flux continu (Capdeville & Nguyen 1990; Alasri 1992), correspond à une phase de
latence dépendant essentiellement des interactions physico-chimiques entre la surface de la
bactérie et celle du support, ainsi qu’à la mobilité de la bactérie qui semble correspondre à
l’adhésion initiale.
Durant cette phase, nous observons une décroissance de la biomasse en suspension
liée à une dilution et élimination des bactéries en suspension via l’alimentation continue, et
bien sûr à un rapprochement et adhésion de certaines bactéries au support. Cette phase courte
(premières heures) correspond à l’adhésion initiale avec consommation de substrat et activité
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Chapitre VII- Discussion
déshydrogénasique non détectables. Cependant, des différences en nombre de bactéries
adhérées peuvent être notées en fonction des microorganismes testés. Les travaux antérieurs
de Samrakandi (1994) ont ainsi démontré que S. aureus (ATCC 6538P et CIP 53154) est
détecté dès la première heure avec une densité supérieure à 4 log/cm2. S. mutans (CIP
103220T) et E. coli (CIP 5412)7 colonisent également rapidement la surface, mais à des taux
inférieurs à S. aureus. B. subtilis (ATCC 6633) et un isolat de P. aeruginosa mucoïde
présentent au contraire des cinétiques d’adhésion initiale faibles et les dénombrements des
bactéries adhérées n’est possible que respectivement après
3 heures et au-delà de 4
heures. Par opposition, le révertant non muqueux de P. aeruginosa colonise la surface avec un
taux de 2,4 log/cm2 après 2 heures. Ces observations semblent être corrélées au caractère
hydrophobe des bactéries. En effet, les mesures réalisées par coefficient de partage dans
l’hexadécane (Rosenberg et al. 1980) et par mesure de l’angle de contact indiquent que S.
aureus (CIP 53154) présente une hydrophobicité supérieure à celle exprimée par E. coli (CIP
54127). P. aeruginosa et B. subtilis (ATCC 6633) se montrent très hydrophiles ce qui limite
leur rejet initial de la phase aqueuse vers une surface moins hydrophile. Par ailleurs, en ce qui
concerne P. aeruginosa mucoïde et son révertant non muqueux, les différences de
comportement dès la phase d’adhésion peuvent être liés à la perte de mobilité des souches
mucoïdes. En effet, ceci est corroboré par nos observations lors des essais de mise au point
d’un modèle de criblage en microplaque. En effet, l’isolat clinique 7844 mucoïde ne permet
d’obtenir que de très faibles taux d’adhésion, caractérisés par des valeurs de DO très faibles
après coloration par le cristal violet. Par opposition, le révertant non muqueux présente des
valeurs supérieures et détectables (Chapitre IV, Tableaux 1).
Afin de poursuivre l’amélioration du modèle en flux continu et en prévision d’études
nécessitant du matériel biotique et abiotique en grandes quantités, la surface à coloniser a été
augmentée par allongement de la boucle expérimentale. Aucune différence notable en terme
d’UFC/cm2 n’a été observée, après augmentation de la surface testé (300 mm au lieu de 190
mm), quel que soit le temps d’incubation ou la localisation sur la boucle, démontrant
l’absence d’influence de la quantité d’inoculum dans ces conditions (Chapitre III, Figure 2).
Notre objectif s’inscrit ici dans une approche originale d’étude phénotypique et
génomique aux différents stades de formation du biofilm. En effet, l’étude des modifications
bactériennes aux phases précoces pose le problème de la quantité de matériel à étudier.
L’étude des biofilms et de leur structuration en mode cinétique se heurte aux quantités de
matériel biotique ou abiotique récupérées aux différentes phases de formation du biofilm,
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Chapitre VII- Discussion
notamment aux phases d’adhésion et multiplication initiale (formation des microcolonies).
Les approches réalisées à ce jour sont souvent indirectes, sur bactéries planctoniques et
secondairement immobilisées, sur bactéries en agar (Tresse et al. 1998) ou bien font appel à
l’utilisation de mutants (Fox et al. 2008; Toutain-Kidd et al. 2008). Les travaux présentés ne
constituent bien sûr qu’une première approche et doivent être complétés par une analyse plus
précise de la constitution du biofilm dans les nouvelles conditions décrites, notamment par
observation en microscopie confocale.
La deuxième partie de nos travaux concerne la sélection de molécules « antibiofilm », en considérant que la croissance des bactéries sous forme biofilm puisse conduire
au développement de nouvelles cibles thérapeutiques. L’objectif de ce travail associant les
compétences de deux laboratoires en synthèse chimique, notamment par étude des analogies
structurales, et en microbiologie, plus particulièrement en ce qui concerne la capacité
bactérienne à former des biofilms, a porté sur la conception et l’évaluation de molécules
présentant une analogie structurale avec la C4-HSL de P. aeruginosa en tant qu’inhibiteurs
potentiels de la formation de biofilm.
Notre choix d’une cible quorum sensing (QS) est basé sur l’implication reconnue de ce
système dans la formation de biofilm, mais surtout dans l’étiologie des infections à P.
aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose.
De nombreux travaux ont porté sur de nouvelles approches préventives ou
thérapeutiques en liaison avec l’acquisition de nouvelles connaissances sur les facteurs de
virulence de P. aeruginosa et leur régulation.
L’approche vaccinale a notamment été envisagée pour les facteurs de virulence en
liaison avec la surface de la bactérie. Ainsi, des vaccins dirigés contre le flagelle ou les pili
ont été mis au point (Landsperger et al. 1994, Hertle et al. 2001). Cependant, ces travaux
n’ont pas conduit à la mise sur le marché de vaccins, soit du fait d’échec pour la mise en place
d’essais de phase III (Doring et al. 1995, 1997), soit du fait de la variabilité antigénique des
souches (Hahn et al. 1997; Cachia et al. 2004).
De la même manière, de nombreux vaccins basés sur l’antigène O ont été mis au point
et évalués, mais sans succès à ce jour (Lang et al. 2004a, Hatano et al. 1998; Pier 2003).
Différents travaux sont en cours sur des vaccins atténués ou associant d’autres cibles (Lang et
al. 2004b; DiGiandomenico et al. 2004). La vaccination basée sur l’exotoxine A a été
également décrite (El-Zaim et al. 1998; Shiau et al. 2000). Des approches similaires ont
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Chapitre VII- Discussion
envisagées avec l’alginate (Theilacker et al. 2003; Pier et al. 1994). L’immunisation par des
épitopes synthétiques de l’élastase permet de diminuer la sévérité de l’infection chez le rat
(Sokol et al. 2000). Des inhibiteurs de protéase ont été également été testés chez le rat et se
sont révélés efficaces (Woods et al. 2005). Le système de sécrétion de type III a également été
considéré comme une cible de choix pour de nouvelles approches thérapeutiques. Ainsi, la
protéine PerV qui joue un rôle dans l’assemblage et la translocation d’un pore dans la
membrane cellulaire eucaryote a été ciblée (Goure et al. 2004) et une immunothérapie antiPerV s’est révélée efficace sur des modèles animaux (Neely et al. 2005). D’autres approches
thérapeutiques ont été envisagées par l’utilisation d’antioxydants (par exemple la glutathione)
ou l’inhibition de synthèse de la pyocyanine (Griese et al. 2004; Lau et al. 2004a).
Malgré certains essais in vitro jugés prometteurs et caractérisés par une inhibition
partielle de l’adhésion de souches de P. aeruginosa, que ce soit en présence d’oses ou de
lectines solubles ou par voie immunologique, aucun développement pharmaceutique n’est
clairement énoncé à ce jour et n’a pu conduire à la mise sur le marché d’un candidatmédicament.
Cette analyse de la littérature explique le choix de notre cible. En effet, la
virulence multifactorielle exprimée par P. aeruginosa, peut expliquer l’absence d’efficacité in
vivo des approches décrites. Notre objectif a donc été de sélectionner une cible plus en amont
et moins spécifique, impliquée globalement dans le processus infectieux à P. aeruginosa chez
les patients atteints de mucoviscidose. Parmi ceux-ci, les systèmes senseurs, le système de
sécrétion de type III et le QS pouvaient être considérées comme des cibles potentielles de
choix.
Différents travaux ont été réalisés afin de définir des stratégies préventives,
notamment par « coating » des surfaces susceptibles d’être colonisées. Différentes molécules
d’origine naturelle, dont d’origine microbiologique, peuvent ainsi interférer avec la séquence
de formation de biofilm, que ce soit des molécules signal ou des biosurfactants (Neu, 1996;
Federle & Bassler, 2003; Rasmussen & Givskov, 2006, McLean et al. 2004). Un concept est
ainsi apparu concernant la maîtrise des biofilms par compétition inter-bactéries, notamment
entre bactéries commensales et pathogènes (An et al. 2006; Rao et al. 2005; Burmolle et al.
2006). Ainsi, Valle et al. (2006) ont pu mettre en évidence le rôle potentiel anti-adhésion de
polymères de la capsule provenant de souches d’E. coli uropathogène ou exprimant des
capsules de type II.
210
Chapitre VII- Discussion
Chez P. aeruginosa, la synthèse et la sécrétion de nombreux facteurs de virulence sont
sous le contrôle du QS qui constitue ainsi un élément clé dans la génèse des infections à P.
aeruginosa, notamment au niveau des poumons de patients mucoviscidosiques (Erickson et
al. 2002; Rumbaugh et al. 2000). Dans la hiérarchie reconnue du QS, l’expression du gène
rhlR est sous le contrôle du système Las (Latifi et al. 1996) et les deux systèmes associés
interviennent dans l’expression de plus de 200 gènes (Schuster et al. 2003; Wagner et al.
2003). Paradoxalement, le système de sécrétion de type III (T3S), considéré comme un
élément majeur de la virulence de
P. aeruginosa est régulé négativement par le complexe
RhlR-C4-HSL (Bleves et al. 2005), du moins dans des conditions de déplétion en Ca++. Les
auteurs émettent l’hypothèse que les fonctions de virulence associées au régulon T3S
interviennent dans les phases précoces de l’infection (colonisation et dissémination), et donc
antérieurement à la mise en jeu d’une régulation liée à la densité bactérienne (QS)
correspondant plutôt à la phase d’infection chronique. Cependant, un phénomène inverse a été
observé chez E. coli entéropathogène et entérohémorragique (Sircili et al. 2004; Sperandio et
al. 2003) et la sensibilité aux conditions d’essai (présence de Ca++) doit amener à considérer
ces résultats avec précaution. Par ailleurs, le rôle de T3S est sous la dépendance du contact
entre bactérie et cellule eucaryote, phénomène qui pourrait réellement se révéler secondaire au
stade macrocolonies ou biofilm mature, si l’on considère que la majorité des cellules
bactériennes ne sont pas au contact des cellules eucaryotes à ce stade. Ainsi, une diminution
progressive de l’expression du gène exoS caractéristique d’une perte progressive de la
fonctionnalité du système de sécrétion de type III a été observée par Pierre et al. (2008) au
cours d’une infection expérimentale chez la souris, avec une forte mortalité entre le deuxième
et le troisième jour de l’infection. Parallèlement, les auteurs notent une augmentation
progressive de l’expression des gènes algD et lasI corrélée à l’apparition d’un phénotype
mucoïde avec production d’alginate, caractéristiques de l’installation d’une infection
chronique. Ces données correspondent aux observations cliniques avec 75 à 90% des souches
de P. aeruginosa isolées de pneumopathies aiguës présentant un système de sécrétion de type
III fonctionnel (Hauser et al. 2002; Roy-Burman et al. 2001) contre seulement 12 à 41% pour
les souches isolées de patients mucoviscidosiques (Jaine et al. 2004; Dacheux et al. 2002).
En 1997, Everett et al. ont démontré une partie des relations existant entre les
systèmes las et rhl. Las contrôle rhl aux niveaux transcriptionnel et post-translationnel.
Parallèlement, l’expression de lasR et rhlR est dépendante de la croissance, l’activation des
gènes prenant effet dans la deuxième moitié de la phase exponentielle de croissance,
conduisant à la production d’un maximum de facteurs de virulence en phase de croissance
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Chapitre VII- Discussion
exponentielle tardive et en phase stationnaire. Il faut souligner que ces observations ont été
faites sur bactéries en mode planctonique et que la « promiscuité » bactérie-bactérie au sein
des biofilms modifie certainement ces données.
En-dehors de nombreux facteurs de virulence, le système rhl régule l’opéron rhlAB,
nécessaire à la production des rhamnolipides qui jouent un rôle clé dans la structuration finale
des communautés bactériennes du biofilm, au même titre que l’alginate. La synthèse de
l’alginate est connue pour être activée par une osmolarité élevée, la déshydratation, la
limitation nutritive et la disponibilité en oxygène (Deretic et al. 1994; Terry et al. 1991; Bayer
et al. 1990).
Parallèlement, il faut prendre en compte les données de la littérature concernant le rôle
du QS in vivo, dans la mucoviscidose. Les observations les plus importantes concernent
l’importance du système rhl dans les crachats de patients mucoviscidosiques. En effet, Singh
et al. (2002) ont noté que les deux homosérines lactones C4-HSL et 3O-C12-HSL étaient
présentes dans un ratio 3/1.
Classiquement, les modèles de formation de biofilm in vitro en conditions aérobies ont
conduit à la mise en évidence du rôle majeur de la 3O-C12-HSL (Davies et al. 1998) et de la
présence de flagelle et de pili de type IV (O’Toole & Kolter, 1998). Environ 39% des isolats
de crachats de patients chroniquement infectés sont déficients sur le plan de la mobilité liée au
flagelle et aux pili (Mahenthiralingam et al. 1994). Ces notions remettent donc en cause la
pertinence des modèles d’étude actuels in vitro, bien adaptés à l’étude des biofilms sur
cathéters, tractus urinaire ou flux sanguin, pour l’étude des biofilms à P. aeruginosa observés
dans le cas de la mucoviscidose.
D’après ces données, et en considérant in vivo le rôle central du QS et du système rhl à
la fois sur le plan de la colonisation progressive des poumons avec formation de
microcolonies et sur le plan de la pathogénicité avec régulation de la production des différents
facteurs de virulence reconnus chez P. aeruginosa, notre choix s’est donc porté plus
particulièrement sur le système rhl.
A ce stade, notre objectif s’est trouvé confronté à différents problèmes:
-
le choix des modifications chimiques de la structure de base de la C4-HSL par rapport
aux études antérieures du même type,
-
le choix et la validation du critère à la base du criblage des molécules synthétisées,
-
la quantification de l’effet observé pour une comparaison entre les molécules testées.
212
Chapitre VII- Discussion
En ce qui concerne le critère retenu pour le criblage, différentes approches étaient
proposées dans la littérature. En effet, par rapport à la cible envisagée, l’approche pouvait se
situer au niveau de l’expression du QS, du système rhl (phénotypique ou génomique), ou de
l’effet attendu sur le QS, à savoir une modification de la formation du biofilm.
La capacité de souches bactériennes, génétiquement modifiées ou non, à répondre
phénotypiquement à la présence d’inhibiteurs du QS a ainsi été décrite. Ces techniques
portent
notamment
sur l’utilisation
de
Agrobacterium tumefaciens
A136
et
de
Chromobacterium violaceum CV026 comme biosenseurs (Fuqua et al. 1996; McLean et al.
1997). Ainsi, McLean et al. (2004) ont mis à profit la capacité de deux senseurs bactériens
dérivés d’Agrobacterium tumefaciens et de Chromobacterium violaceum capables de produire
des pigments sous le contrôle d’une C6-HSL, mais également d’autres HSL. Ainsi, l’addition
d’inhibiteurs potentiels du QS (ici des produits de différentes souches bactériennes ou de
plantes) se traduit par une modification de la production de pigment au cours de la croissance.
Ce test permet de définir en parallèle si l’activité observée est spécifiquement une inhibition
du QS ou un mécanisme antibactérien classique (inhibition de croissance). Un test basé sur la
bioluminescence liée à la production du signal luxS (AI-2) a également été proposé (Surette et
al. 1999) et utilisé dans différents essais (Kadurugamuwa et al. 2003). Enfin, des systèmes
rapporteurs gfp ont été largement appliqués à l’étude de la production d’HSL in situ par
observation en microscopie confocale (Christensen et al. 1999; Hentzer et al. 2002). Ces
différentes méthodes posent le problème de la quantification de l’effet observé. Celle-ci a été
proposée par voie chimique avec une quantification des molécules signal après extraction
(Moré et al. 1996), par la caractérisation des différentes molécules produites (Charlton et al.
2000; Marketon et al. 2002), par voie enzymatique ou par mesure de la production du pigment
(Blosser & Gray, 2000). En conclusion de leurs travaux, McLean et al. (2004) soulignent que
la méthode proposée n’est qu’une étape préliminaire de criblage qui doit amener à des essais
complémentaires afin de contrôler le véritable impact sur la formation de biofilm.
Différents modèles de criblage de mécanismes impliqués dans la formation de biofilm
(rôle du QS) ou de molécules anti-biofilm (inhibiteurs du QS) ont été proposés dans la
littérature. Parmi ceux – ci nous trouvons des méthodes basées sur l’utilisation de mutants.
Ainsi, différentes études sont basées sur le comportement des mutants dans différentes
conditions de culture (Yoon et al. 2002; Fox et al. 2008) ou en présence de différents
composés (Spring et al. 2004; Smith et al. 2003; Filloux & Vallet, 2003), en terme de capacité
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Chapitre VII- Discussion
d’adhésion et/ou de formation de biofilm. Cependant, ces méthodes peuvent présenter
certaines limites liées à:
- la difficulté d’obtenir des mutants isogéniques, dont la mutation soit réellement
limitée au gène ciblè,
- la complexité des systèmes de régulation, rendant difficile l’interprétation de résultats
avec un mutant rhlR, par rapport à un mutant lasR ou un double mutant lasRrhlR. Ainsi, dans
l’étude de Yoon et al. (2002) le mutant rhlR présente une faible capacité à former des biofilms
en condition anaérobie au même titre que les mutants lasR et lasRrhlR. Cependant, ce
phénomène est lié à une augmentation de la production de NO toxique et seule la
neutralisation de ce composé a permis aux auteurs de conclure sur l’implication préférentielle
de rhlR dans la formation de biofilm anaérobie à P. aeruginosa.
- des réponses du type « tout ou rien ». En effet, ces méthodes permettent de déterminer
l’implication ou non de certains gènes (ou plutôt de certaines mutations) pour un modèle
d’évaluation précis, du type adhésion aux surfaces (Vallet et al. 2001; Filloux & Vallet,
2003). Cependant, des effets de niveau intermédiaire peuvent être observés, rendant
l’interprétation des résultats difficile. Par ailleurs, une étude cinétique du phénomène est
souvent impossible.
Notre objectif premier étant la sélection de molécules capables de modifier la capacité
de formation de biofilm par P. aeruginosa, notre choix s’est donc porté sur ce critère
phénotypique. De plus, la possibilité de caractérisation et de quantification d’un impact
aux différentes phases décrites dans la littérature nous est apparue comme un critère
important de sélection de la méthode de criblage. En effet, des mutants lasI sont capables
de former des biofilms sous certaines conditions (Purevdorj et al. 2002), démontrant la
difficulté de conclure sur une évaluation ponctuelle.
L’approche choisie présente l’avantage de nous permettre d’optimiser les conditions
de criblage par rapport aux données in vivo.
Différents travaux ont décrit l’aspect morphologique des biofilms à P. aeruginosa
dans le lumen des bronches de patients atteints de mucoviscidose, caractérisés par la présence
de microcolonies sphériques (Costerton et al. 1981). L’utilisation de modèles in vitro type
chambre en flux continu en condition aérobie, a permis d’étudier plus en détail les
mécanismes biochimiques et génétiques mis en jeu et plus particulièrement le rôle du QS.
Cependant, in vivo, les conditions environnementales sont très différentes. Les biofilms à P.
214
Chapitre VII- Discussion
aeruginosa sont associés à un mucus épais et relativement stagnant (Tarran et al. 2001),
conduisant à des conditions d’anaérobiose favorables à la production d’alginate (Worlitzsch et
al. 2002). Différents travaux semblent démontrer une concentration des éléments du mucus
multipliée par un facteur 3 à 4 chez les patients mucoviscidosiques par rapport aux sujets non
atteints (Tarran et al. 2001; Trout et al. 1998; Deneuville et al. 1997). D’autres travaux
récents font état d’une faible tension en oxygène au sein du mucus de patients atteints de
mucoviscidose (< 2%) (Alvarez-Ortega & Harwood, 2007; Matsui et al. 2006) voire une
absence d’oxygène (Yoon et al. 2002). Les travaux récents de Matsui et al. (2006), sur la base
d’un modèle in vitro, révèlent qu’un mucus concentré conduit à des conditions d’hypoxie
avec formation caractéristique de macrocolonies. Ceci correspond à une diminution de la
motilité cellulaire et de la diffusion des petites molécules, conduisant localement à de fortes
concentrations bactériennes et d’autoinducteurs, et une résistance accrue aux défenses de
l’hôte. P. aeruginosa, sous forme planctonique ou biofilm, est capable de mettre en place une
respiration aérobie ou anaérobie. Ce dernier processus met en jeu des nitrates (NO3-), des
nitrites (NO2-) ou de l’oxyde nitreux (N2O) en tant qu’accepteur d’électrons (Hassett et al.
2002). Différents auteurs ont démontré la présence de NO3- en quantité suffisante dans le
liquide de surface des bronches (Worlitzsch et al. 2002) et dans les crachats (Hassett, 1996;
Jones et al. 2000) de mucoviscidosiques pour permettre une croissance des bactéries
planctoniques. La voie énergétique la plus performante en anaérobiose correspond à la
réduction du NO3-, qui peut se faire selon deux voies. La première correspond à une
incorporation de l’azote dans des macromolécules sous la forme de NH3 (sous aérobiose ou
anaérobiose), la seconde ou dénitrification (sous anaérobiose seulement) implique la réduction
séquentielle de NO3- en azote gazeux. P. aeruginosa est également capable d’utiliser
l’arginine en conditions anaérobies, même si cela conduit à une croissance réduite (Van der
Wauven et al. 1984).
Sur cette base, une croissance anaérobie du mode biofilm au niveau des poumons de
patients infectés chroniques a été envisagée et est soutenue par les travaux de différentes
équipes. Beckmann et al. (2005) ont ainsi détecté la présence de narG, codant pour la chaîne
α de la nitrate réductase anaérobie, dans le sérum de patients mucoviscidosiques. Son et al.
(2007) ont également démontré l’expression de nombreux gènes impliqués dans la respiration
anaérobie de P. aeruginosa par analyse microarray de crachats provenants de patients atteints
de mucoviscidose.
215
Chapitre VII- Discussion
Ainsi, récemment, des modèles in vitro basés sur une croissance des biofilms au sein
de mucus ont été proposés et ont confirmé l’importance du caractère anaérobie (lié à la
concentration du mucus) et la structuration en macrocolonies (Matsui et al. 2006).
Parallèlement, en conditions d’anaérobiose, Yoon et al. (2002) ont démontré que
P. aeruginosa forme des biofilms plus denses et plus robustes qu’en aérobiose, remettant en
cause de nombreux travaux antérieurs réalisés sur biofilms aérobies.
Différents modèles en microplaque ont été mis au point et utilisés pour l’étude de la
capacité à former des biofilms par des souches bactériennes dont principalement P.
aeruginosa. La plupart de ces essais consistent en une évaluation de la capacité d’adhésion
aux surfaces inertes. L’équipe d’A. Filloux utilise fréquemment un test d’adhésion en
microplaques 24 ou 96 puits en milieu synthétique considéré riche par rapport au BBM
proposé ici (M63 : MgSO4, 7H2O (0,25 g/L), FeSO4, 7H2O (0,0005 g/L), KH2PO4 (13,6 g/L),
(NH4)2SO4 (2 g/L), supplémenté en apport carboné (0,2 à 0,5% de glucose et/ou acides
aminés); BBM: MgSO4, 2H2O (0,2 g/L), FeSO4, 7H2O (0,0005 g/L), Na2HPO4 anhydre (1,25
g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), (NH4)2SO4 (0,1 g/L), glucose (0,05 g/L) et inoculum élevé (108 UFC)
(Vallet et al. 2001) puis coloration au cristal violet. Les auteurs indiquent que « l’anneau » de
bactéries colorées est quantifié par lecture de la DO à 600nm, après traitement à l’éthanol.
Cependant, la plupart des travaux présentés concernent l’évaluation de mutants au niveau de
différentes structures impliqués dans l’adhésion: pili de type IV (de Bentzmann et al. 2006),
pseudopili de type II (Durand et al. 2003), gènes cup (Vallet et al. 2001), pour lesquels la
méthode décrite se révèle discriminante. Les mêmes remarques peuvent être faites concernant
les méthodes décrites par différents auteurs : culture en milieu Vogel–Bonner (VB) (Vogel &
Bonner, 2001) et inoculum élevé sur lamelle de polypropylène (Hogardt et al. 2004).
Cette remarque est supportée par les travaux de Vasseur et al. (2005) concernant la
détection de souches dites « Biofilm déficientes », issues de la souche PAK et présentant des
mutations au niveau du cluster pel. Les gènes correspondant codent pour des protéines
similaires à celles impliquées dans la biogènése de polysaccharides. Les essais d’adhésion
sont réalisés en microplaques 24 puits, en milieu riche et inoculum élevé selon la
méthodologie classiquement utilisée par l’équipe Vallet et al. (2001), puis coloration au
cristal violet. Lors de la même étude, des essais ont été réalisés en milieu minimum M63
supplémenté en glucose, acides aminés et MgCl2, dans des tubes contenant des lamelles semiimmergées. Dans ces conditions, l’évaluation des bactéries adhérées, après lavages des
lamelles, a été réalisée par microscopie après 6h, 24h et 48h d’incubation à 30°C, sans
216
Chapitre VII- Discussion
agitation. La mise en jeu de ces deux techniques a permis de définir que les mutations pel
avaient peu d’influence sur la phase d’attachement initiale (sauf sur une souche non-piliée),
évaluée par la méthode en microplaque, mais par contre influaient le phénotype biofilm
mature obtenu sur lamelles.
Différents travaux font ainsi appel à des milieux jugés minimum, mais qui sont
toujours caractérisés par des apports élevés en source carbonée (0,1 à 0,5%), correspondant
aux apports des milieux de croissance classiques de type trypcase soja (0,25% de D-glucose)
ou agar glucosé à la peptone de caséine et à l’extrait de levure (PCA) (0,1% de glucose).
D’autres méthodes ont ainsi été proposées sur différents supports, avec
appauvrissement du milieu (milieu LB 0,1 X), mais toujours un inoculum élevé (environ 106
UFC) (Vallet et al. 2004). Une autre alternative a été mise au point par Moskowitz et al.
(2004) pour l’évaluation de l’activité d’agents antimicrobiens sur biofilms. La croissance est
réalisée en milieu CAMHB (Cation-Adjusted Mueller-Hinton Broth) avec un inoculum
d’environ 107 UFC par puits de microplaque. Le dépôt d’un couvercle présentant 96 picots
permet la formation d’un biofilm à la surface de ceux-ci. Le transfert du couvercle vers une
seconde microplaque contenant les antimicrobiens à tester permet d’évaluer l’activité « antibiofilm » après mise en culture secondaire. Dans ce dernier modèle, la comparaison des
milieux (avec ou sans arginine) et des conditions d’essai (mode statique ou sous agitation)
indiquent que ce modèle induit à la formation de biofilms aérobies.
Cependant, les différentes observations réalisées sur la croissance de P. aeruginosa en
conditions anaérobies (Yoon et al. 2002, Worlitzsch et al. 2002) au sein des poumons de
patients mucoviscidosiques remettent également largement en cause l’utilisation de tels
modèles in vitro pour l’étude de la formation de biofilm et notamment l’impact d’inhibiteurs
potentiels.
Nos essais préliminaires en microplaque, sur la base des méthodes décrites dans la
littérature, nous a conduit à reconsidérer totalement les conditions expérimentales, dans leur
intégralité notamment par l’absence de mise en évidence d’effet de la furanone quel que soit
l’inoculum initial et le temps d’incubation. Ces résultats corroborent le fait que ces modèles
sont plutôt favorables à l’étude de la phase d’adhésion dépendante des flagelles et pili et/ou
d’une formation de biofilm mais surtout de la 3O-C12-HSL. Des essais complémentaires, non
présentés dans ce manuscrit, ont été également réalisés avec l’azithromycine, molécule
connue pour son efficacité anti-biofilm à P. aeruginosa in vivo chez les patients colonisés ou
217
Chapitre VII- Discussion
infectés (Glansdorp et al. 2008). De la même manière, aucun effet n’a pu être observé, même
pour concentrations très élevées (128 mg/L).
Différentes techniques d’évaluation de la biomasse adhérée ont été proposées. Hormis
des techniques d’observation directe de type Microscopie Electronique à Balayage ou
Microcopie Confocale, les méthodes classiques reposent sur la mesure d’une activité
cellulaire ou un dénombrement des cellules (indirect par coloration ou direct par
dénombrement des UFC).
Etant donné l’hétérogénéité décrite au sein des biofilms sur le plan spatial et temporel,
les mesures d’activités métaboliques, comme la mesure de l’activité du transport des électrons
(activité déshydrogénase), ne paraissent pas répondre à nos objectifs.
Les méthodes par coloration présentent l’avantage de pouvoir être réalisées
directement sur support. La quantification peut alors être réalisée par comptage réel en
microscopie ou par mesure d’une densité optique.
Enfin d’autres méthodes nécessitent une étape préliminaire de décrochement des
cellules du support avec un comptage cellulaire basé sur la cultivabilité des cellules, la
viabilité ou la simple présence.
Différents travaux ont porté sur les techniques de récupération de la biomasse adhérée.
La pectinase à 0,3 U durant 30 mn ne permet de récupérer qu’une fraction de la biomasse
adhérée puisqu’un simple raclage secondaire de la surface conduit à la récupération d’un
nombre élevé de cellules cultivables (Alasri, 1992). Cette faible activité détachante pourrait
être liée, comme le soulignent Whittaker et al. (1984), à une pénétration limitée de l’enzyme à
l’intérieur du biofilm et l’augmentation de la concentration enzymatique se traduit par
l’apparition d’une activité létale.
De la même manière, la sonication peut provoquer des endommagements cellulaires
mis en évidence par des problèmes de revivification sur milieux non sélectifs ou sélectifs. De
ce fait, nous avons retenu la technique du raclage suivi d’une agitation en milieu de
récupération afin de désagréger les amas bactériens. Cette méthode a été validée lors d’essais
antérieurs et permet la récupération des bactéries adhérées sur surface lisse, quel que soit l’âge
du biofilm (Alasri et al. 1992; Samrakandi et al. 1994; Pineau et al. 1997; Campanac et al.
2002).
En ce qui concerne l’évaluation de la biomasse, nous nous sommes intéressés en
premier lieu aux méthodes colorimétriques qui peuvent être appliquées directement sur
microplaque et présentant donc de nombreux avantages pour un criblage. L’utilisation de ces
218
Chapitre VII- Discussion
méthodes se traduit par l’obtention de valeurs de DO peu faibles et reproductibles (selon les
souches et les temps d’analyse) (Chapitre IV, Figure 7). De ce fait, nous avons sélectionné la
méthode de dénombrement des UFC lors de tous nos essais sur modèle Tygon en flux
continu. Celle-ci nous permet d’obtenir des valeurs reproductibles entre essais indépendants
et, du fait des étapes antérieures de lavages, nous permet d’évaluer la seule population
adhérée à la surface inférieure du puits des microplaques.
Ainsi, même si le modèle utilisé ne met pas directement en jeu le processus de
dénitrification comme processus énergétique anaérobie, les conditions d’essai et la méthode
de détection de la biomasse adhérée ont été sélectionnées afin de favoriser l’évaluation de la
cinétique de formation de biofilm en conditions d’aérobiose limitée. Parallèlement à une non
agitation du milieu et un renouvellement régulier de celui-ci, une évaluation du biofilm au
niveau de la zone d’anaérobiose et non plus à l’interface air-eau a été mise en place et validée.
En effet, dans les nombreuses études de criblage en microplaques décrites précédemment, la
visualisation des bactéries adhérées par coloration au cristal violet correspond en réalité à une
visualisation de l’anneau de bactéries adhérées à l’interface air-eau. Nous avons pu constater
que ce phénomène est largement prédominant lors de ces essais, et l’enlèvement de ce biofilm
typiquement aérobie ne permet pas une évaluation fiable de la biomasse adhérée aux surfaces
immergées des puits par simple mesure de la DO après coloration au violet cristal. Nos
résultats démontrent que les différentes conditions d’essai décrites dans la littérature en milieu
riche et inoculum élevé conduisent typiquement à une évaluation de la capacité d’adhésion
des bactéries planctoniques, voire à une évaluation de la capacité à former un biofilm aérobie,
au contact de l’air.
L’utilisation de telles conditions (milieu Luria-Bertani, inoculum à
8
environ 10 UFC) dans l’étude de Yoon et al. (2002) permet d’observer, en conditions
aérobies en microplaques, un biofilm caractéristique, avec formation de microcolonies.
L’addition de NO3- au milieu de culture, toujours en condition d’aérobiose, conduit à une
légère augmentation de la biomasse adhérée. Par contre, les essais réalisés sous anaérobiose
révèlent un biofilm significativement plus dense, avec un ratio mainteniu à 1,8 entre cellules
viables et mortes. Sur cette base, nous avons conservé la composition du BB modifié (BBM),
soit un milieu réellement minimum, (sans apport de NO3-), avec un inoculum initial faible,
une élimination séquentielle des bactéries planctoniques, renouvellement du milieu, et en
conditions statiques. Ce modèle nous a permis d’obtenir une colonisation progressive des
surfaces immergées, croissance sous forme de microcolonies jusqu’à atteindre en 48 heures
des épaisseurs > 40µm, avec un ratio cellules viables/cellules mortes très favorable (Chapitre
IV, Figure 11). Les observations réalisées en microscopie confocale indiquent alors une
219
Chapitre VII- Discussion
structuration du biofilm en rapport avec les observations faites par Yoon et al. (2002) pour les
biofilms anaérobies, notamment en ce qui concerne l’épaisseur. En conditions aérobies, en
présence ou non de NO3-, Yoon et al. (2002) notent des épaisseurs relativement faibles,
d’environ 20 à 25 µm.
Les différentes étapes de mise au point du modèle correspondent au final à un
protocole intermédiaire entre les différents modèles statiques, aérobies, en microplaque, en
flux continu et aérobiose limitée comme ceux décrits par Ghigo et al. (1997) pour E. coli et le
modèle dynamique sur tube Tygon mis au point antérieurement au laboratoire (Alasri, 1992;
Campanac, 2002; …).
Ces différentes observations nous ont conduit à proposer un modèle de formation
de biofilm en microplaque basé sur une optimisation et différenciation de la phase
d’adhésion initiale, avec élimination séquentielle des bactéries planctoniques afin de
favoriser la multiplication des bactéries initialement adhérées. Ainsi, le renouvellement
de milieu est effectué toutes les 2 heures durant les 6 premières heures (adhésion initiale
et initiation de la multiplication), puis, à 20 heures, 24 heures et 48 heures (croissance
des microcolonies et structuration). Les observations en microscopie confocale
confirment la différenciation séquentielle des différentes phases de formation du biofilm.
Le modèle mis au point a ainsi pu être appliqué à l’évaluation de l’impact de la
furanone. Dans les conditions décrites, nous observons un effet anti-biofilm significatif audelà de la phase d’adhésion, comme le montrent les photographies en microscopie confocale
comparables entre le témoin et la furanone au temps 2 heures (Chapitre IV, Figure 10). Audelà, toutes les phases sont modifiées en présence de furanone et ce dès la multiplication des
bactéries adhérées. L’observation par double marquage (SYTO 9® et Iodure de propidium)
indique une altération, voire une mortalité des cellules qui pourrait correspondre à
l’association d’un effet inhibiteur de la C4-HSL à l’activité antibactérienne notée avec la
furanone, molécule halogénée.
L’analyse de l’impact de l’ajout de furanone en séquentiel (aux différentes phases de
formation du biofilm) soutient ces premières observations. (Chapitre IV, Figure 13).
Enfin, l’antagonisme C4-HSL / furanone est confirmée dans la dernière phase de nos
travaux de validation du modèle développé. (Chapitre IV, Figure 15).
220
Chapitre VII- Discussion
Les conditions de culture, et notamment la nature du milieu, jouent également un
rôle clé dans l’expression des facteurs du QS. En milieu M9 caséinate, la transcription des
gènes du QS est fortement induite durant la phase de croissance ; de même, en conditions
microaérophiles, supposées plus proches des conditions environnementales rencontrées dans
les poumons de patients mucoviscidosiques (Alvarez-Ortega & Harwood, 2007) et en
présence de mucine (Duan & Surette, 2007). Par contre, en milieu M9 CAA ou en milieu
tamponné complexe, l’expression des gènes du QS est faible ou n’apparaît qu’après la fin de
croissance (Schuster et al. 2003; Whiteley et al. 1999). LasI apparaît comme un des gènes
dont l’expression est la moins modifiée par les conditions de culture en liaison certainement
avec un mécanisme de contrôle homéostatique (Rampioni et al. 2006). Ainsi, le niveau de
production de 3OC12-HSL n’est plus considéré comme le facteur limitant (Schuster et al.
2003; Whiteley et al. 1999; Diggle et al. 2002). Ce phénomène observé en conditions de
sélection sous stress (Van Delden et al. 1998) et pour certains mutants lasR (Sandoz et al.
2007) implique une régulation positive de rhl avec production élevée de C4-HSL et donc
compensation par le système rhl.
La surexpression de la protéine de réponse aux conditions stringentes RelA active
prématurément le QS chez P. aeruginosa, notamment l’expression de lasR, rhlR et lasB et la
production des acyl-HSL (Van Delden et al. 2001).
Les découvertes récentes concernant le fonctionnement anaérobie de P. aeruginosa
dans les poumons de patients mucoviscidosiques sont très importantes sur le plan
thérapeutique. En effet, des molécules anti-pyocyaniques de base, comme la tobramycine, se
révèlent peu ou pas efficaces sous anaérobiose. Parallèlement, la machinerie enzymatique
mise en jeu sous anaérobiose est absente chez l’homme et pourrait ainsi constituer une
approche thérapeutique originale et pertinente. Ainsi, des anticorps anti-OprF se sont révélés
protecteurs chez la souris (Price et al. 2001).
Cette implication spécifique du système rhlR/C4-HSL dans le cas de biofilm à
P. aeruginosa anaérobie et notamment dans les poumons de patients infectés, explique le
fait que dans les conditions classiques décrites dans la littérature que nous avons testées,
la furanone ne présente aucun effet sur la formation du biofilm. Par contre, les
conditions de criblage en microplaque que nous avons développées nous permettent:
221
Chapitre VII- Discussion
-
d’obtenir une formation de microcolonies caractérisées par une épaisseur
importante (jusqu’à 100µm) et une viabilité élevée des bactéries constitutives,
-
de caractériser l’activité anti-biofilm de la furanone avec un impact significatif
au niveau des différentes phases de formation du biofilm postérieures à la phase
d’adhésion,
-
de valider l’impact de la furanone en tant qu’inhibiteur de la C4-HSL,
-
de valider la forte implication du système rhlR/C4-HSL dans notre modèle,
nous rapprochant ainsi des conditions optimales d’étude de molécules anti-biofilm dans
la prévention ou le traitement des colonisation ou infection pulmonaires par P.
aeruginosa chez les patients mucoviscidosiques.
La phase finale de notre travail concerne l’évaluation de l’impact de différents
analogues structurels de la C4-HSL sur leur impact sur la formation de biofilm à
P. aeruginosa PAO1, selon le modèle validé.
L’environnement particulier rencontré dans les poumons de patients atteints favorise la
conversion d’une forme de P. aeruginosa mobile et planctonique en une forme mucoïde,
sessile, conduisant à l’obtention d’agrégats de grandes dimensions (Worlitzsch et al. 2002).
Sous cette forme, l’éradication de P. aeruginosa par les méthodes thérapeutiques
conventionnelles et/ou les défenses de l’organisme est impossible (Costerton et al. 1999;
Hassett et al. 2002). Les mécanismes de résistance ou de perte de sensibilité des biofilms liés
à la matrice exopolysaccharidique, au taux de croissance diminué et aux différentes
modifications phénotypiques induites par la croissance en mode biofilm, sont largement
documentés à ce jour. Plus récemment, un mécanisme actif de dispersion des cellules
bactériennes a été mis en cause, caractérisé par une diversité génétique au sein de la
communauté bactérienne et ainsi une augmentation des « chances » de survie du
microorganisme (Boles et al. 2004; Hentzer et al. 2004; Koh et al. 2007). Cette dispersion de
cellules très mobiles présentes en surface des macrocolonies est associée à une mort cellulaire
au centre de celles-ci. Ce phénomène met en jeu la conversion d’un prophage vers une forme
lytique, en liaison avec l’accumulation de d’espèces réactives oxygénées ou nitrées (Barraud
et al. 2006; Webb et al. 2003) et dépend donc de la souche testée. Ainsi, Kirov et al. (2007)
ont récemment démontré l’importance de ce phénomène dans la diversité des variants
obtenus, ce qui pourrait expliquer en partie la persistance de P. aeruginosa dans les poumons
de patients atteints de mucoviscidose.
222
Chapitre VII- Discussion
Les travaux récents de Sandoz et al. (2007) soutiennent l’idée de nouvelles approches
thérapeutiques par modification de la communication inter-bactérienne. En effet, ces auteurs
ont démontré in vitro l’émergence de mutants lasR qui ne produisent plus les facteurs de
régulation du QS, mais « utilisent » la production communautaire. Ces mutants ont également
été observés in vivo (Cabrol et al. 2003). L’étude de Platt et al. (2008) a également permis de
démontrer qu’une forte proportion des gènes régulés positivement en présence de NO3- et de
NO2- sont ceux codant pour le bactériophage Pf1. Cette étude est la première répertoriant la
machinerie moléculaire impliquée dans la respiration anaérobie NO3- et de NO2-, constituant
de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques de l’infection à P. aeruginosa chez les patients
mucoviscidosiques.
Sur la base des connaissances phénotypiques et génomiques acquises dans le domaine
des biofilms à P. aeruginosa, différentes approches thérapeutiques non antibiotiques ont été
envisagées. Celles-ci ont essentiellement pour cibles les facteurs impliqués dans l’adhésion
bactérienne et/ou les facteurs de virulence. Il s’agit d’approches par antagonisme (couples
ligand/récepteur) ou par réponse immunitaire (vaccination, Ac,…) (Iglewski, 1994).
Cependant, aucune de ces approches n’a conduit à ce jour à un développement
pharmaceutique, notamment du fait d’une activité trop ciblée et donc limitante. Le choix
d’une cible plus en amont, impliquée dans la régulation de l’expression de l’ensemble de ces
facteurs, paraît donc tout à fait pertinent (Suga & Smith, 2003; Le Berre et al. 2006).
La compréhension des interactions entre HSL, les protéines du QS et l’ADN est très
importante si de bons candidats à l’inhibition des QS veulent être développés. L’hypothèse
actuelle
est
que
les
antagonistes
empêchent
la
dimérisation
des espèces
liant
l’ADN nécessaires pour l’activation de la transcription (Zhang et al. 2002; Zhu et al. 2001).
Différents travaux portent sur la synthèse d’analogues de la 3-oxo-C12-HSL en tant
qu’antagonistes potentiels du QS (Smith et al. 2002). Ce choix est initialement basé sur
l’importance de cette molécule dans le schéma d’activation mis en jeu, sur les taux supérieurs
de cet AI1 détectés dans la plupart des études sur biofilms à P. aeruginosa, et enfin sur
l’impact majeur de cette molécule dans la structuration du biofilm également soulignée par
différents auteurs.
223
Chapitre VII- Discussion
Ainsi, des modifications de la 3-oxo-C12-HSL ont porté sur la chaîne latérale (Kline et
al. 1999; Passador et al. 1996) ou au contraire sur le groupe HSL (Smith et al. 2003). Des
changements mineurs dans la structure d’un agoniste en C12, ont permis l’obtention de 3
antagonistes potentiels (Suga & Smith, 2003).
La plupart de ces travaux utilise des souches avec système rapporteur sous le contrôle
du QS et donc définissent la notion d’antagonisme sur le plan génomique. Par ailleurs, cette
approche peut concerner différents promoteurs, selon la classification de Whiteley et al.
(1999). Les promoteurs de classe I, incluant le promoteur lasI, sont induits uniquement après
atteinte d’un certain quorum et répondent spécifiquement à AI1 (Smith et al. 2003). Le
promoteur lasB, appartenant à la classe IV, requiert AI1 et AI2 et répond faiblement à AI1
seul (Hentzer et al. 2002). Ainsi, cette approche peut être jugée insuffisante si l’on considère
les résultats de Smith et al. (2003). En effet, ces auteurs ont démontré qu’un antagoniste de
la 3-oxo-C12-HSL n’était pas automatiquement antagoniste de la C4-HSL, remettant en cause
l’implication majeure de l’AI1 et le système de régulation.
Ces données sont à corréler avec celles concernant le type de biofilms observé in vivo
et la démonstration d’une activation possible de la cascade rhl en l’absence de la cascade las
sous certaines conditions de stress (Van Delden et al. 1998). Ainsi, Smith et al. (2003)
indiquent la nécessité de trouver des antagonistes potentiels sur les 2 cibles pour association
thérapeutique.
Par ailleurs, les tissus et cellules de mammifères ont développé des mécanismes de la
protection vis-à-vis des agents infectieux, notamment par production de différentes molécules
type lactoferrine (Farnaud & Evans, 2003), lysozyme ou défensines (Boman, 2003; Ganz,
2003; Hancock & Scott, 2000). Des essais réalisés sur culture primaire d’épithélium
respiratoire humain et sur différentes lignées cellulaires indiquent une inactivation de la 3oxo-C12-HSL qui pourant intervenir dans les défenses de l’hôte (Chun et al. 2004). Cette
inactivation est spécifique, sans effet sur la C4-HSL.
Ces observations ainsi que les données récentes concernant la formation et la
structuration du biofilm à P. aeruginosa dans les poumons de patients atteints de
mucoviscidose, remettent en cause une approche principalement centrée sur la 3-oxoC12-HSL notamment en ce qui concerne l’implication forte de la C4-HSL.
Plus récemment, différents travaux ont démontré l’intérêt d’antagonistes naturels. Il
s’agit de furanones halogénées produites par une algue marine (Manefield et al. 2001).
Hentzer et al. (2003) considère que les composés tels que la furanone « semblent respecter
224
Chapitre VII- Discussion
leur rôle d’antagonistes de HSL et permettent de développer des substances» qui
interfèreraient avec la communication bactérienne, rendraient les bactéries moins virulentes et
plus sensibles aux traitements par des biocides. Cependant, les molécules naturelles isolées
semblent présenter une activité limitée, notamment en ce qui concerne l’interaction LasR 3oxo-C12-HSL. Ainsi, Hentzer et al. (2002) ont synthétisé un analogue privé de la chaîne
alkyle et qui présente une activité antagoniste supérieure à celle des furanones naturelles.
L’activité inhibitrice concerne des gènes rapporteurs contrôlés par le QS et des facteurs de
virulence pour des mutants du QS, mais n’est pas observée chez une souche sauvage
exprimant des taux normaux d’AI. De la même manière, ce composé n’inhibe pas la
formation de biofilm, mais affecte son architecture. D’autres antagonistes synthétiques ont été
évalués par Olsen et al. (2002) toujours par une approche génomique. Enfin, de nouvelles
approches peuvent être considérées, comme les N-acyl cyclopentylamides (Ishida et al. 2007).
A ce jour il faut considérer que le développement de molécules dérivées de la furanone
est limité par deux aspects:
-
d’une part, la toxicité potentielle liée à la présence d’halogènes (Wu et al. 2004),
-
d’autre part, une activité in vivo limitée. Les travaux de Wu et al. (2004) montrent en
effet que, dans le cas d’infection mortelle à P. aeruginosa, un traitement à la furanone
permet seulement de prolonger significativement le temps de survie de souris.
L’ensemble de ces données bibliographiques valide nos choix concernant:
-
la cible potentielle (C4-HSL),
-
le contrôle d’absence d’activité antibactérienne (sur bactéries planctoniques) et
cytotoxique intrinsèque,
-
un modèle de criblage basé sur la cinétique de formation du biofilm par une
souche non mutante, avec distinction et visualisation des différentes phases.
En ce qui concerne les résultats obtenus, la première caractéristique importante
concerne l’absence d’activité antibactérienne de nos composés sur bactéries planctoniques
(Chapitre V, Tableau 3). Ces données sont à corréler à l’absence de groupements halogénés
au niveau des analogues synthétisés. En effet, de nombreux travaux réalisés sur la furanone ou
225
Chapitre VII- Discussion
d’autre molécules halogénées indiquent une activité antibactérienne intrinsèque et ont
nécessité l’utilisation de doses de l’ordre de 10-5M à 10-6M afin d’éviter cet effet lors d’essais
in vitro et in vivo (Hentzer et al. 2003; Wu et al. 2004).
Le criblage réalisé sur les molécules hydrosolubles, analogues de la C4-HSL, indique
un effet anti-biofilm pour le seul composé 11. Les dénombrements des UFC adhérés ainsi que
les observations par microscopie confocale confirment que ce composé, au même titre que la
furanone, ne modifie pas l’étape d’adhésion, avec un taux de recouvrement de la surface du
puits similaire à celui observé pour le témoin. Le composé 11 modifie spécifiquement la
phase de colonisation et de formation des colonies. Ainsi, lors de l’addition séquentielle de ce
composé au cours de la formation du biofilm, l’effet anti-biofilm du composé 11 n’est observé
que lors d’addition aux temps 2 heures, 4 heures et 6 heures. Au-delà, l’effet devient non
significatif démontrant l’absence d’impact de cette molécule sur les phases finales de
structuration du biofilm. Par ailleurs, les observations par double marquage (SYTO 9® et
Iodure de propidium) confirment l’absence d’activité létale vis-à-vis des bactéries, aux
concentrations testées (Chapitre V, Figure 2).
Différents facteurs sont connus pour influer la formation de biofilms. Selon la revue de
Stanley & Lazazzera (2004), les étapes initiales concernant l’attachement aux surfaces et la
formation des microcolonies sont régulés par des systèmes spécifiques à chaque bactérie et à
l’habitat considéré. Les étapes finales de maturation concernant l’architecture du biofilm sont
par quand à elles sous le contrôle de mécanismes généraux et reflètent la physiologie d’un
phénotype biofilm sous l’aspect communauté cellulaire. Différents systèmes de régulation du
QS ont été mis en évidence, dont certains sont directement liés à des phénomènes de stress ou
de carences nutritionnelles (RpoS, RpoN,…). Ces systèmes activés, notamment en phase
stationnaire ou en fonction de l’environnement nutritionnel, régulent positivement
l’expression des deux systèmes impliquant des HSL.
En ce qui concerne la phase d’adhésion initiale, l’implication de systèmes senseurs
de la surface et des conditions environnementales a été largement démontrée pour E. coli avec
des travaux sur le système de signalisation Cpx (Otto & Silhavy, 2002; Dorel et al. 1999) et
sur le système EnvZ/OmpR (Prigent-Combaret et al. 2001). Ce dernier système est activé
selon l’osmolarité du milieu (Pratt & Silhavy, 1995) et représente donc un système clé
permettant à E. coli de « répondre » aux surfaces dans des conditions de nutrition limitées. En
226
Chapitre VII- Discussion
effet, les protéines, polysaccharides et autres molécules ou ions vont préférentiellement
s’accumuler au niveau des surfaces à coloniser, constituant une zone plus favorable à
l’activité métabolique bactérienne que le milieu environnant (Lux et al. 1999). Cette zone de
concentrations en nutriments présente également une osmolarité supérieure à celle du milieu
environnant lorsque celui-ci est pauvre. La réponse du système EnvZ/OmpR à ce gradient
d’osmolarité conduit alors à favoriser l’adhésion via la biosynthèse de curli (Vidal et al. 1998;
Prigent-Combaret et al. 2000, 2001) et la synthèse de la matrice extra-cellulaire (Chirwa &
Herrington, 2003). Ce système est présent chez de nombreuses espèces (Dziejman &
Mekalanos, 1994). A l’inverse une trop forte osmolarité du milieu inhibe la formation du
biofilm (O’Toole & Kolter, 1998a; Loo et al. 2000; Prigent-Combaret, 2001) conduisant les
bactéries à rester sous forme planctonique dans l’attente de conditions environnementales plus
favorables. Dans nos conditions d’essai, cette phase d’adhésion paraît relativement optimale si
l’on considère le faible impact de la variation de taille de l’inoculum initial et l’obtention d’un
biofilm structuré pour un inoculum sélectionné très faible (102 UFC). A ce stade le QS paraît
non impliqué, ce qui est confirmé par la similarité des observations en microscopie confocale,
à la phase d’adhésion, entre le témoin et le composé 11. Ces résultats sont également
confirmés par les essais réalisés in vitro sur lignée cellulaire d’origine pulmonaire. En effet,
quel que soit le protocole utilisé, le composé 11 ne présente aucun effet inhibiteur d’adhésion
aux cellules MRC5, le test correspondant à un contact bactéries/cellules de 2 heures, temps
similaire à celui validé pour l’obtention de la phase d’adhésion dans le modèle de formation
de biofilm sur microplaque. La furanone ne présente un effet que dans le cas du protocole 4,
correspondant à une pré-incubation des bactéries avec ce composé. Ceci confirme la
possibilité d’une activité directe de la furanone sur P. aeruginosa, notamment au niveau de la
structure pariétale.
A partir de cette phase d’adhésion, la croissance du clone adhéré et la mise en place
d’interactions cellulaires stables sont nécessaires à la formation de microcolonies
(Reisner et al. 2003). La croissance est directement liée à l’accessibilité aux nutriments,
concentrés dans nos conditions, au voisinage de la surface.
Chez P. aeruginosa, l’implication des pili de type IV dans la formation des
microcolonies a été démontrée par O’Toole et al. (2000) et Heydorn et al. (2002). Les pili de
type IV seraient responsables de 90% de la capacité d’adhérence aux cellules pneumocytaires
humaines A549 et seraient également responsables de 90% de la virulence sur cellules de
souris (Farinha et al. 1994). Au niveau des glycosphingolipides, le récepteur serait plus
227
Chapitre VII- Discussion
précisément le motif disaccharidique GalNAc(β1-4) (Sheth et al. 1994). La synthèse des pili
IV est sous le contrôle d’un facteur de régulation global du métabolisme carboné, Crc,
indiquant la nécessité de préserver une source carbonée préférentielle de P. aeruginosa dans
le milieu. Le rôle du facteur de régulation sigma a également été démontré en réponse à
différents stress environnementaux. Chez P. aeruginosa, les systèmes senseurs RetS et LadS
permettent à la bactérie sous l’influence de modifications environnementales, de réguler
l’expression des facteurs de pathogénicité dont la synthèse d’exopolysaccharides et seraient
donc impliqués dans le statut infectieux, aigü ou chronique (Ventre et al. 2006).
L’implication du flagelle, des pili de type IV et de l’alginate dans l’adhésion et la
formation de biofilm des souches non mucoïdes et mucoïdes est reconnue. Cependant, l’étude
du génome de P. aeruginosa a permis de caractériser de nombreux autres déterminants
moléculaires impliqués.
La lectine PA-IL, bien que soluble, est très impliquée dans l’adhésion de P.
aeruginosa. Rebiere-Huet et al. (2004) ont ainsi démontré que cette capacité d’adhésion
pouvait être fortement réduite en présence de l’acide sialique du N-acétylglucosamine et du
N-acétylgalactosamine et de façon moindre en présence de glucosamine, de galactosamine, de
fucose, de mannose ou de galactose. PA-IIL, reconnaissant le L-fucose et d’autres
monosaccharides jouerait un rôle dans la phase de reconnaissance bactérie-cellule eucaryote
ou bactérie-bactérie.
Lors de nos essais, la furanone et le composé 11 semblent avoir un impact sur cette
phase. Cependant, les effets observés sont différents. L’addition de la furanone semble
stopper le processus au stade de l’adhésion intiale avec un impact sur la viabilité cellulaire.
L’addition du composé 11 se traduit par une croissance des bactéries adhérées limitée,
conduisant à la formation de rares colonies de petites tailles, mais constituées de cellules
viables. La structure du composé 11, sans atome de brome, induit donc un réel antagonisme
avec le système du QS.
L’étude très intéressante de Ren et al. (2004) démontre le rôle antagoniste potentiel de
la furanone sur E. coli par une approche en microarray. 166 gènes présentent une expression
modifiée par AI-2 et 90 par la furanone. Parmi ceux-ci 79% des gènes réprimés par la
furanone sont induits par AI-2, indiquant un antagonisme furanone / AI-2 et l’ensemble des
gènes associés (régulon). La plupart de ces gènes sont impliqués dans le chimiotactisme, la
motilité et la synthèse des flagelles. Cependant, chez E. coli, ces systèmes sont
particulièrement mis en jeu dans la formation de biofilm à l’interface air-liquide et l’effet de
la furanone a pu être observé dans ces conditions.
228
Chapitre VII- Discussion
Dans nos conditions d’essai, la démonstration d’un antagonisme avec la C4-HSL
pourrait remettre en cause l’implication et l’importance de cette molécule dans la
séquence d’activation du QS, notamment si l’on considère les données récentes
concernant les conditions particulières de formation de biofilm au sein des poumons
atteints de mucoviscidose (anaérobiose, taux de C4-HSL supérieur au taux de 3-oxoC12-HSL) (Yoon et al. 2002; Favre-Bonté et al. 2002).
Différents systèmes de régulation, dont les systèmes de répression cataboliques
interviennent au niveau de la maturation du biofilm chez différentes espèces bactériennes
(Jackson et al. 2002). Chez P. aeruginosa, l’épaisseur du biofilm est inversement relié au
facteur de transcription RpoS (Whiteley et al. 2001; Heydorn et al. 2002), correspondant à
l’entrée en phase stationnaire (Venturi, 2003). L’activation de RpoS correspond à différents
stress dont la limitation en nutriments. Sous des conditions de sevrage importantes, un retour
vers la phase planctonique peut même être observé, phénomène observé sous le contrôle du
QS chez Vibrio cholerae (Zhu & Mekalanos, 2003). Notre choix s’est donc porté vers un
milieu dit minimum, mais avec renouvellement de celui-ci afin d’éviter les phénomènes de
limitation en nutriments au voisinage de la surface, de répression catabolique et de retour vers
la phase planctonique.
Enfin, la production de surfactant de type rhamnolipide chez P. aeruginosa
conditionne l’architecture en « champignons » caractérisées par la présence de canaux aqueux
(Davey et al. 2003). Le gène impliqué dans la production de ce rhamnolipide est régulé par
lasI-lasR via rhlI-rhlR (Pearson et al. 1997) et pourrait correspondre à un mécanisme
d’acquisition optimale des nutriments.
Davies et al. (1998) ont démontré l’implication du QS dans la structuration finale du
biofilm et dans la résistance au SDS. Les travaux de Hentzer et al. (2003), démontrent que le
traitement par un dérivé synthétique de la furanone (C-30) conduit à une sensibilité au SDS,
ainsi qu’à la tobramycine, aminoglycoside classiquement utilisé dans le traitement de la
mucoviscidose (Høiby et al. 2000). Dans le cas du biofilm témoin, seules les bactéries à la
surface du biofilm sont tuées par le traitement à la tobramycine. Même si les auteurs notent
une croissance sous forme planctonique similaire entre le témoin et les bactéries traitées par la
furanone (10-5 ou 10-6 M), une sensibilité supérieure à la tobramycine des bactéries
planctoniques est également observée, supportant l’idée d’un effet direct de la furanone ou de
ses dérivés sur les bactéries. L’analyse par microarray des gènes réprimés lors du contact avec
229
Chapitre VII- Discussion
C-30, révèle que 30% d’entre eux correspondent à ceux classiquement impliqués dans
l’expression de facteurs de virulence sous le contrôle du QS. Ils incluent lasB (élastase), lasA
(LasA protéase), l’opéron rhlAB (production de rhamnolipide), l’opéron phzA-G (biosynthèse
de la phénazine), l’opéron hcnABC (production d’acide cyanhydrique) et chiC (activité
chitinase). D’autres gènes sont activés, notamment ceux impliqués dans des phénomènes
d’efflux (mexEF et mexR), des ABC et MFS transporteurs. Cependant, il faut souligner le
problème classique et récurrent de ces approches qui concernent le fait que les essais sont
réalisés sur bactéries planctoniques et non directement sur biofilms.
La furanone et de nombreux dérivés halogénés ont largement été impliqués dans la
modification d’expression de gènes considérés comme associés à la structuration du biofilm.
Nos essais confirment un impact majeur de la furanone à cette phase, conduisant même à une
destructuration complète du biofilm lorsque la furanone est ajoutée sur biofilm formé. Par
opposition, le composé 11 n’a qu’un impact très faible et non significatif sur biofilm formé.
Ces résultats nécessitent des études complémentaires afin de confirmer le lien avec l’absence
d’atomes de brome et l’absence d’activité antibactérienne intrinséque. Cependant, une autre
possibilité doit être envisagée au la vue des résultats d’évaluation de l’antagonisme avec la
C4-HSL. En effet, la furanone pourrait avoir une meilleure constante d’affinité avec la
cible protéique que le composé 11, et pourrait conduire, comme cela a été décrit pour
LuxR (Manefield et al. 1999) à un déplacement de la C4-HSL. L’absence d’effet du
composé 11 au-delà de 6 heures serait alors lié à son incapacité à déplacer la C4-HSL et
à dissocier le dimère fonctionnel.
Au stade précoce, la bactérie est sous forme invasive, non mucoïde. Alors que la
maladie progresse, des modifications phénotypiques vont apparaître avec surproduction
d’alginate, perte des chaînes latérales O du LPS, perte des pili et flagelles et activité
protéolytique réduite. Classiquement, l’apparition du caractère mucoïde est considérée comme
associée à la gravité de l’infection (Deretic et al. 1995; Firoved & Deretic, 2003). Ces
souches, bien que moins invasives, seraient caractéristiques de la maturation du biofilm,
parfaitement adaptées aux conditions environnementales spécifiques du poumon de patient
atteint de MCV et plus difficiles à éliminer que ce soit par les moyens naturels de défense de
l’hôte que par les différents traitements envisagés. Plus récemment, un nouveau morphotype,
appelé SVC pour Small Colony Variant, a été décrit. Il est caractérisé par des clones
produisant des petites colonies, à croissance lente, une hyperpiliation, un mécanisme
230
Chapitre VII- Discussion
d’autoaggrégation, une capacité accrue à former des biofilms et une résistance aux
antibiotiques (Haussler et al. 2003).
Les essais in vivo utilisant des analogues du QS tels que la furanone sont
essentiellement basés sur une approche thérapeutique (post-inoculation et/ou post-infection) et
conduisent classiquement à la mise en évidence d’un effet positif, mais temporaire et non
curatif au final. Ainsi, Hentzer et al. (2003) notent une amélioration de la clairance
bactérienne sur un modèle d’infection de souris par PAO1 lorsque le composé nommé par les
auteurs C-30 est administré dès l’infection et durant les 3 jours suivants. Par ailleurs, Wu et al
(2004) ont relevé in vivo sur souris un effet toxique non négligeable des analogues halogénés
de la furanone, ainsi qu’une non efficacité lorsque des inoculi élevés sont utilisés (décès des
souris traitées et non traitées 3 jours après inoculation à 107 UFC/souris).
Ainsi, l’intérêt d’antagonistes du QS nécessite une réflexion quant aux conditions
d’essai in vivo et aux applications futures. Des effets préventifs doivent être plutôt
envisagés. Une action curative nécessite soit la démonstration d’une dissociation des
dimères, soit une affinité très forte des antagonistes pour la cible potentielle et une
posologie permettant un apport constant de l’antagoniste afin de contre-balancer la
synthèse de novo.
Cette étude correspond aux premiers résultats d’un antagoniste de la formation de
biofilm, sans effet antibactérien sur les cellules planctoniques.
Dans le cadre d’une étude des relations structure-activité nous avons conçus,
synthétisés et testés des composés, analogues de la C4-HSL. Ils sont caractérisés par la
modification du cycle lactone qui est l’élément commun aux auto-inducteurs produit chez
Pseudomonas aeruginosa.
Le cycle lactone a été remplacé par différents cycles ou
hétérocycles comportant un ou deux hétéroatomes (N, O ou S) afin de moduler
l’encombrement stérique, et en raison de la capacité de certains atomes (N) à former des
liaisons hydrogène. La furanone considérée comme un analogue de la C4-HSL et dont l’effet
anti-biofilm a été démontré a donc constitué notre référence positive.
Parmi les composés synthétisés, seul le dérivé 11 présente une activité inhibitrice. Des
calculs réalisés à l’aide du logiciel MOPAC 2007 (Steward 2007a) utilisant la méthode PM6
(Steward 2007b) permettent de mettre en évidence de fortes charges négatives, favorables à
l’interaction, sur les atomes d’azote des cycles thiazole (composé 3), thiazoline (composé 4),
231
Chapitre VII- Discussion
benzothiazole (composé 5), isoazole (composé 6), pyridine (composés 9, 10) et pyrimidine
(composé 11) (Tableau 1). Ces atomes situés dans l’environnement immédiat du groupement
amide peuvent être considérés soit comme des nucléophiles soit comme des accepteurs de
liaisons hydrogène. Dans le composé 11 la présence d’un deuxième atome d’azote conduit à
un environnement électronique différent des autres molécules. Les cartes de potentiels
électrostatiques moléculaires (Figure 1) présentent des zones de charges négatives (isolignes
rouges) qui révèlent la présence d’atomes accepteurs de liaisons hydrogène. Un atome de
soufre dans la même position porte des charges beaucoup plus élevées. Ceci est peut être à
l’origine du comportement inhibiteur de cette molécule.
D’autre part, d’un point de vue structural, on constate que le cycle pyrimidine est plan tout
comme la furanone, contrairement au cycle lactone.
Composé 11
Composé 3
Figure 1. Potentiels électrostatiques moléculaires (isolignes rouge : potentiels négatifs ;
isolignes vertes : potentiels positifs)
232
Chapitre VII- Discussion
O
X
Z
N
H
Y
Composé
O
N
X
Y
Z
________________________________________________________________________________
2
3
4
5
6
8
9
10
11
12
-0.5253
-0.5038
-0.4848
-0.4904
-0.5014
-0.5411
-0.5228
-0.5140
-0.4981
-0.5713
-0.5344
-0.5041
-0.4864
-0.4998
-0.4932
-0.5120
-0.5167
-0.5333
-0.4937
-0.4441
(C) -0.2893
(N) -0.4090
(N) -0.3919
(N) -0.4186
(N) -0.2271
(C) -0.1380
(N) -0.4218
(C) -0.3995
(N) -0.4551
(C) -0.2390
(CO) -0.3810
(S) -0.1383
(S) +0.0307
(S) -0.0234
(C) -0.4662
(C) -0.1193
(C) -0.3978
(C) -0.4024
(N) -0.4586
(C) -0.2392
(S) -0.167
(O) -0.0993
(O) -0.4676
(N) -0.3526
(N) -0.1344
(O) -0.4433
Lactone -0.5234
- 0.5537
(C)-0.3657
(CO) -0.4111
________________________________________________________________________________
Tableau 1. Charges atomiques déterminées par la méthode PM6 (MOPAC 2007)
Celui-ci n'a aucun atome d'halogène et est certainement moins toxique (Martinelli et
al. 2004), que la furanone. Puisque la formation des colonies protégées par le biofilm est une
cause de l'efficacité réduite des traitements antibiotiques, la nature chronique des infections de
P.aeruginosa peut être allégée par une telle prévention du développement de biofilm.
Les furanones naturelles sont considérées comme interférant avec différents processus
régulés par les HSL, sans effet sur la capacité de synthèse protéique (Givskov et al. 1996;
Manefield et al. 2000). L’hypothèse retenue est un antagonisme par compétition pour le site
de liaison du récepteur protéique. Ainsi, Manefield et al. (1999) ont démontré que les
furanones halogénées étaient capables de déplacer une HSL de son récepteur protéique LuxR
et ce mécanisme est également supporté par les travaux de Hentzer et al. (2002).
Classiquement, le système las est considéré comme régulant l’expression de différents
facteurs de virulence, comme des enzymes extracellulaires (élastases, protéases) des
métabolites secondaires (pyocyanine, pyoverdine,…) des toxines (exotoxine A) et lasI. Le
système rhl concerne plutôt la synthèse de rhamnolipide et rhlI. Cependant, il est également
233
Chapitre VII- Discussion
impliqué dans la modulation de l’expression des facteurs de virulence contrôlés par le système
las (Glessner et al. 1999; Pearson et al. 1995). Par ailleurs, les systèmes de régulation sont
relativement complexes, impliquant Vfr dans le cas de lasR (Albus et al. 1997) et RpoS dans
le cas du système rhl (Whiteley et al. 2000). Lors de leurs travaux de 2002, Hentzer et al.
avaient émis l’hypothèse d’une interférence de la furanone avec un des circuits de régulation
impliqués à un niveau supérieur. Nous avons démontré ici l’antagonisme potentiel de la
furanone et du composé 11, notre choix étant basé sur l’analogie structurelle de ces
molécules avec la C4-HSL. Cependant, des essais complémentaires sont nécessaires pour
évaluer réellement la (ou les) cible(s) potentielles de ces inhibiteurs de formation de
biofilm, en considérant notamment leur impact différent sur la cinétique de formation
de biofilm à P. aeruginosa.
Les perspectives envisagées se situent à différents niveaux:
-
évaluer le modèle de criblage en microplaque en conditions d’anaérobiose et/ou en
présence de NO3-,
-
synthétiser de nouveaux composés, notamment dérivés du composé 11 afin d’obtenir
une activité anti-biofilm optimale dans nos conditions de criblage,
-
à partir de la sélection d’un ou de nouveaux composés, nous nous proposons de
poursuivre nos travaux par:
o une évaluation plus précise des mécanismes mis en jeu, notamment par
l’utilisation de différents mutants isogéniques type rhlR, lasR, lasRrhlR (ou de
gènes rapporteurs fluorescents) et/ou la variation des conditions d’essai
(aérobiose/anaérobiose, ajout de NO3-),
o une confirmation de l’intérêt potentiel in vivo, lors des interactions
bactérie/hôte, notamment par l’utilisation du modèle Caenorhabditis elegans
(Felix & Sternberg, 1997; Legouis et al. 2000; Tan & Ausubel, 2000;
Labrousse et al. 2000) ou de modèles murins (Cash et al. 1979; Hentzer et al.
2003; Pierre et al. 2008).
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Annexe
Annexe
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Annexe
300
Annexe
Attenuation of Pseudomonas aeruginosa biofilm by a N-butanoylHomoserine Lactone analog.
Pouneh Khalilzadeh, Barbora Lajoie, Salomé El Hage, Geneviève Baziard,
Mathieu Berge, and Christine Roques *
Université de Toulouse ; UPS ; LU49 – Adhésion bactérienne et formation de biofilms1, 35 chemin des
Maraichers 31062, Toulouse Cedex 09, France.
*
Corresponding author. Mailing address: LU49 - Laboratoire de Bactériologie, Virologie et Microbiologie
Industrielle, Université Paul Sabatier Toulouse 3, Faculté des Sciences Pharmaceutiques, 31062, Toulouse
Cedex 09, France. Phone: 33-5-62256860. Fax: 33-5-61259572.
E-mail: [email protected].
301
Annexe
Abstract
The discovery of quorum sensing (QS) communication systems regulating bacterial virulence has afforded a
novel opportunity for controlling infectious bacteria by interfering with QS. Pseudomonas aeruginosa is an
example of an opportunistic human pathogen, for which N-Acyl HomoSerine Lactone (AHLs) related
compounds have been described as potent inhibitors of biofilm formation and virulence factors, given their
similarity to the natural QS autoinducers (AHLs). Our purpose was to design potent analogs of N-butanoyl-LHomoSerine Lactone (C4-HSL) and to screen them for biological activity.
Eleven original compounds characterized by the modification of the lactone moiety were screened for their
ability to impair biofilm formation. Among them, compound 11 was able to modify the growth kinetics and to
restrict the number of adherent cells when added from the early stages of biofilm formation i.e. adhesion and
microcolony formation, in a dose-dependent manner. To demonstrate antagonism with C4-HSL, we showed that
the inhibition of biofilm formation by compound 11 was impaired when C4-HSL was added. Structure-activity
relationships are discussed with respect to the results obtained.
Key words: Pseudomonas aeruginosa, Quorum sensing (QS), N-Acyl HomoSerine Lactones (AHLs), 4-bromo5-(bromomethylene)-2-(5H)-furanone
302
Annexe
Introduction
Pseudomonas aeruginosa is an increasingly prevalent opportunistic human pathogen and the most common
gram-negative bacterium found in nosocomial infections and life-threatening infections of immunocompromised patients (Van Delden and Iglewski 1998) and patients with cystic fibrosis (Hall-Stoodley et al.
2004). The production of many virulence factors is controlled by the quorum-sensing (QS) mechanism related to
cell density (Pearson et al. 2000, Williams et al. 2000). Moreover, there is growing evidence that QS influences
more complex behavioral processes such as the ability to form surface-associated, structured and cooperative
consortia referred to as biofilms (Davies et al. 1998). The QS system is important for fully differentiated biofilms
(Davies et al. 1998) and is also involved during the early stages of biofilm development that are characterized by
attachment and microcolony formation (Kim et al. 2008, de Kievit et al. 2001). Biofilm plays an important role
in bacterial pathogenesis and is a common cause of persistent infections (Costerton et al. 1999, De Kievit and
Iglewski 2000, Høiby et al. 2001, Middleton et al. 2002). In this form, P. aeruginosa becomes impossible to
eradicate with existing therapies and is refractory to host defenses (Hayes et al. 2008, Wood and Smyth 2006).
P. aeruginosa employs two dependent quorum-sensing systems, termed las and rhl, which
together regulate an extensive set of cell population density and grow phase dependent
virulence factors (Fuqua and Greenberg 2002, Juhas et al. 2005, Parsek and Greenberg 2000).
The activation of QS genes occurs in a hierarchical fashion involving two autoinducers (AIs):
N-(3-oxo-dodecanoyl)-L-HomoSerine Lactone (C12-HSL) and N-butanoyl-L-HomoSerine
Lactone (C4-HSL) which are able to complexe with the proteins lasR and rhlR respectively.
The conception of compounds able to shut down las and rhl expression is of great interest as
then all the other genes in the QS cascade would be shut down as well, including those
involved in biofilm formation. Attractive strategies for interfering with QS, and thus impair
bacterial pathogenesis, are either to degrade AHL-signalling molecules (Dong et al. 2005,
Huang et al. 2006, Park et al. 2005, Sio et al. 2006) or to use quorum-sensing antagonists
(Givskov and Rasmussen 2006, Olsen et al. 2002, Reverchon et al. 2002). Therefore, we were
interested in designing AHL analogs as efficient inhibitors of biofilm formation. The
extraction and quantification of the two P. aeruginosa cell-to-cell signals (C12-HSL and C4-
303
Annexe
HSL) from lung tissues of CF patients infected by P. aeruginosa showed that the ratio of C4HSL to 3-oxo-C12-HSL exceeded 100 in all tissue samples, in opposition to in vitro
evaluation (Favre-Bonté et al. 2002). Therefore we developed the synthesis of C4-HSL
analogues characterized by modification of the lactone moiety (Table 1). We chose to
randomize this region because it is the common structural element of the AIs produced by all
Gram negative organisms (Robson et al. 1997) with the aim of studying the relationship
between the structure of AHL analogs and their activity. The lactone ring was replaced by
various carbocycles or heterocycles of 5 or 6 members to modulate steric hindrance. In
particular, nitrogen heterocycles were chosen because nitrogen atoms could act as H-bond
acceptors more easily than sulfur atoms. In fact, a hydrogen bond acceptor adjacent to the
amine would be required for both binding and activation of transcription factors (Smith et al.
2003). Usually the rapid screening for LasR agonists or antagonists is carried out by
measuring the expression of gfp (encoding green fluorescent protein) under the control of a
promotor induced by LasR-AI1. Unfortunately, some molecules inhibiting gfp expression
showed no effect on the inhibition of biofilm formation using a biofilm assay (Smith et al.
2003). Therefore to screen synthesized molecules we used a biofilm assay developed in an
attempt to observe and favor the adherent phase and sticked bacteria growth rather than the
planktonic one, and to detect significant modifications in biofilm formation. Brominated
furanone was used as a test positive control given its specific antagonistic activity (Givskov et
al. 2004, Høiby et al. 2004).
Materials and Methods
Bacterial strains. P. aeruginosa PAO1 was obtained from the Institute Pasteur Collection (Paris, France). The
strain was frozen and kept at -80°C. Before each experiment, two subcultures were prepared on trypcase soy
agar (Biomérieux, Craponne, France) and incubated under aerobic conditions at 37°C for 24 hours. Bacterial
suspensions were freshly prepared in sterile distilled water before each experiment.
304
Annexe
Media. The bacterial numerations were done on trypcase soy agar. The basic medium for biofilm formation
(BBM), modified from Campanac et al. (2002), contained: MgSO4.2H2O (0.2 g/L), FeSO4.7H2O (0.0005 g/L),
anhydrous Na2HPO4 (1.25 g/L), KH2PO4 (0.5 g/L), (NH4)2SO4 (0.1 g/L), and glucose (0.05 g/L) (Sigma-Aldrich,
Saint-Quentin Fallavier, France). This medium has been tested and shown to promote biofilm formation but not
growth of planktonic cells even with an inoculum higher than that used in biofilm assays (102 – 105 UFC/mL).
Chemistry. C4-HSL and compounds 2-11 were prepared by the acylation of the appropriate amine with butyric
acid in dichloromethane (DCM) in the presence of N, N’-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or with butyryl
chloride in pyridine (Sigma-Aldrich) (Scheme 1). After the usual work up, the crude products were purified by
silica-gel chromatography (DCM-cyclohexane) or by recrystallization from ethanol and obtained in yields
ranging from 20 to 70%.
4-bromo-5-(bromomethylene)-2-(5H)-furanone (referred to as furanone) was synthesized as previously reported
(Manny et al. 1997) by cyclization of 3, 5-dibromolevulinic acid with conc. H2SO4.
All compounds were characterized by 1H NMR and IR spectra, and the NMR data for previously described
compounds were in agreement with the literature.
The compounds tested were dissolved at 1mM in sterile distilled water.
Impact on biofilm formation. Bacterial biofilms were developed at 37°C in 24-well microtiter plates containing
BBM (2 mL) in the presence or absence of AHL analogs. After initial inoculation with a 102 cell suspension of
PAO1, the medium was renewed at 2h, 4h, 6h, 20h and 24h. Preliminary experiments were performed using
crystal violet. Given the final concentration of adherent bacteria for the control after 48h incubation (about 108
CFU/well), this method did not lead to a significant and reproducible determination of OD values.
Therefore a method based on the numeration of cultivable bacteria was used as previously described (Campanac
et al. 2002). At each control time, 1 mL of the batch was taken for planktonic cell counting. The wells were
rinsed twice with 1 mL sterile distilled water and then the bottoms of wells were scraped with a sterile spatula
into 1 mL sterile distilled water for the estimation of adherent cells. After dispersion and dilution of the
suspension, the number of CFU was obtained after inclusion of the suspension on agar plates and incubating at
37°C for 24h. Percentages of the inhibition of biofilm formation and planktonic cells were calculated versus the
control [[(CFU control – CFU assay) / CFU control] x 100].
305
Annexe
The screening of an inhibitor’s effect on biofilm formation was carried out on all the products by adding them, at
a final concentration of 0.5 mM from T = 0h and evaluating the biofilm formation in their presence or absence
for 48 hours. This step led us to select one compound that was active against biofilm formation.
The effect of the selected compound on the biofilm formation (CFU numerations of adherent cells) after 20h,
24h and 48h was then evaluated over a concentration range from 5 µM to 5 mM.
A third experiment was performed by adding the selected product at different stages of biofilm formation. Series
were carried out with the addition of the product at each medium renewal time i.e. at 0h, 2h, 4h, 6h, 20h and 24h,
with CFU numerations of adherent and planktonic cells (detached from biofilm) performed at 20h, 24h and 48h
(cf lines 1 to 5 of Table 2).
To evaluate the antagonism by C4-HSL, a fourth experiment was carried out by adding together C4 –HSL (0.5
mM) and compound 11 (0.5 mM) from T = 0h, or compound 11 at T = 0h and C4-HSL from T = 6h. CFU counts
were made after 48h and the percentage inhibition of biofilm formation was calculated using the C4-HSL added
from T = 0h as the control.
Microscopic study of biofilm. Confocal images were obtained after 48 hours of incubation with the selected
product. Staining was initially performed using SYTO 9® (Invitrogen® SARL, France). Images were acquired
with an SP2 confocal laser scanning system equipped with an upright microscope (Leica®, Germany) and a 40 x
(HCX APO, N.A. 0.8) water immersion objective. An argon laser was used for the excitation at 488nm and the
emitted fluorescence of the SYTO 9® was recorded between 500 and 540 nm. The images were computed by
projection of 150 plane-confocal images acquired in the z-direction with a 0.4 µm increment between two focal
planes (Leica confocal software, LCS). To evaluate cell viability, propidium iodide (Invitrogen® SARL, France)
was also used. The emitted fluorescence of the propidium iodide was recorded at 543 nm.
Evaluation of the antibacterial effect on planktonic cells. The potent antibacterial activity of the compounds
on planktonic cells was verified by a dilution micromethod in trypcase soy broth (Biomérieux) given that there
was no growth of planktonic cells in BBM. Briefly, 100 µl of trypcase soy broth was placed in each well of 96well microtiter plates and 100 µl of test solution was added to the first column. Two-fold dilutions were carried
out from one column to the next, until all the columns of the microplates were filled except columns 11 and 12,
which were used as controls of the medium sterility (without test solution) and growth (without test solution,
with bacteria) respectively. The microtiter plates were inoculated using a multipoint inoculator (Denley; Mast
306
Annexe
Diagnostics, Bootle, UK) to obtain a final concentration of 102, 103, 104 and 105 cells/mL, and incubated for 24
hours at 37°C. After a check on the growth in each well of column 12, the effect of the tested product on
planktonic growth was evaluated by considering visible growth (no inhibitory effect on planktonic cells) or no
visible growth (inhibitory effect on planktonic cells). Assays were performed in duplicate.
Computational study. Starting geometries were initially created with the Vega ZZ software
(http://www.ddl.unimi.it) (Pedretti et al. 2002) on a PC workstation. Each structure was then energy-optimized
at the PM6 (Parametrized Model revision) level (Stewart 2007) with the precise keyword, using the MOPAC
2009 software (Stewart 2009). The molecular electrostatic potentials were generated in the medium plane of the
compounds with the Hyperchem v 7.5 software (Hypercube, Inc., Gainesville, FL 32608, USA). For the
visualization of LasR from P.aeruginosa (PDB code 2uv0) and the manual docking of ligands in the active site,
Accelrys software was used. Residues within a distance of 5 Å from the ligand were selected for docking
calculations. Synthetic and natural ligands were drawn with Chem Draw and geometry optimizations were
carried out by MM2 (Molecular Mechanics) and PM6. The resulting conformers were then docked and the whole
complex was optimized using PM6.
Results
Impact of AHL analogs on biofilm formation. Among the eleven derivatives tested, compound 11 (C11) was
the only one that showed a significant effect on adherent cells after 48h of contact at 0.5 mM (the medium and
C4-HSL analogs being renewed at 2h, 4h, 6h, 20h and 24h) in comparison with furanone (0.05 mM) (Table 1).
The other compounds did not shown any antagonist or agonist effect on biofilm formation.
Figure 1 shows the variations in biofilm impairment according to the C11 concentration. A significant dose
effect was noted. At 5 µM there is no or little effect. At 50 µM an inhibition of biofilm formation of about 90%
(1 log) is only observed at 20h and 24h. A biofilm reduction higher than 6 log (considered as 100% inhibition of
biofilm formation) is observed at 500µM and 5 mM even after 48h of incubation.
To further explore the impact of compound 11 on biofilm formation, counts of adherent and planktonic cells
were done at 20h, 24h and 48h of culture with the times of addition of the products (0.5 mM) beginning at 0h,
2h, 4h, 6h, 20h, and 24h. Table 3 gives the percentages of inhibition of biofilm formation and planktonic cells
detection versus the control for each condition and at each incubation time. Addition of compound 11 at T = 0h,
2h, 4h led to a significant reduction (above 6 log) of both adherent and planktonic cells (Table 3). We observed a
307
Annexe
progressive loss of activity of compound 11, when added from T = 6h, with the number of adherent cells
increasing with time: 93%, 47% and 0% inhibition after 20h, 24h and 48h respectively. This loss of activity was
confirmed by the positive numeration of cells when compound 11 was added from T = 20h or 24h, indicating
poor activity on maturing biofilm. These results underline an inhibitory effect of C11 on biofilm growth, which
is specific for adherent cells if considering the non-antibacterial effect observed on planktonic cells at the tested
concentration.
During an assay performed with addition of compound 11 at each time of medium renewal from T = 0h, SCLM
observations revealed that there was no modification of early adhesion steps (4h : Figure 2a, 2a’). Further
incubation with C11 led to a poor growth of adherent cells (Figure 2b, 2b’) and no structured biofilm but a few
low density aggregates (Figure 2c, 2c‘ and 2d, 2d‘). A control by staining with SYTO 9® and propidium iodide
indicated low cell damage contrary to what we observed with furanone (data non shown).
We carried out a final experiment to investigate the antagonism between compound 11 and C4-HSL (Figure 3).
Under the described conditions and after 48h of biofilm formation, the inhibitory effect on adherent cells of
compound 11 was reduced (60.33% ± 1.89%) when the two compounds were added together. When compound
11 was added at T = 0h but addition of C4-HSL was delayed until 6h, the activity of compound 11 was better
preserved with a percentage of inhibition of biofilm formation of 73.45% ± 3.70%.
Discussion
New synthetic approaches are required for the generation of AHL analogs and the systematic evaluation of their
interference with biofilm formation (Blackwell et al. 2005, Givskov et al. 2004, Olsen et al. 2002, Reverchon et
al. 2002). These molecules, antagonists of autoinducers, could be considered as potential therapeutics (Ruimy
and Andremont 2004, McLean et al. 2004). The two natural autoinducers described for P. aeruginosa are
considered to play a role in its pathogenesis, so we developed the synthesis of eleven analogues of one of them,
the C4-HSL, with the objective of selecting “anti-biofilm” molecules and evaluating them using a model based
on the description of P. aeruginosa biofilm in CF patients by Yoon et al. (2002).
As indicated in Table 1, furanone is considered to be a C4-HSL analog and because of its known impact on the
effects of AHLs (Givskov and Rasmussen 2006, Høiby et al. 2001, Juhas et al. 2005) we used it as a control. As
expected, furanone inhibited P. aeruginosa PAO1 biofilm formation. Under the same conditions, the compound
11 also inhibited biofilm formation at a high level (above 6 log reduction in comparison to the control) from a
308
Annexe
concentration of 0.5 mM. The effect on biofilm formation appears only when C11 was added during the initial
stages (0-6h) corresponding to adhesion and the first divisions of adherent cells. When the compound was added
later, the effect was much reduced even if detectable.
The C4-HSL is naturally produced during the log phase of growth, which may explain the impact of compound 11
when it was added from the beginning and during the early stages of biofilm formation (adhesion and microcolony
formation) (Figure 3). Our last results confirmed that compound 11 prevented biofilm formation by antagonism with
C4-HSL but did not act on the biofilm during its maturation. It inhibited the growth of adherent cells even though it
showed no significant inhibitory effect on planktonic cells.
The 11 original compounds tested were characterized by modification of the lactone moiety and, among these
synthesized analogs, compound 11 had an obvious effect on the growth of the bacteria in sessile mode. An
examination of the atomic charges on the heteroatoms enabled us to differentiate the various compounds (Table 4).
The atomic charges carried by the nitrogen atoms of the rings of thiazole (compound 3), thiazoline (compound 4),
pyridine (compounds 9, 10) and pyrimidine (compound 11) were highly negative and could favor interactions.
These atoms adjacent to the amino group are potential H-bond acceptors. The presence of a second nitrogen atom in
compound 11 near the amino group, leads to an electronic environment different from the others. Molecular
Electronic Potentials (MEPs) show negative zones (red isolines) that could reflect the presence of hydrogen bond
acceptors (Figure 4). A sulfur atom in the same position (compounds 3, 4, 5) carries a higher atomic charge. On the
other hand, the flatness of the pyrimidine ring was noted, in contrast to the lactone ring.
To examine structure-activity relationships of synthesized compounds, we did a molecular modeling study. Firstly,
molecular modeling results enabled the preferable geometry of compound 11 to be identified. This ligand has an
original spatial structure in comparison with the other tested compounds and natural AIs. By comparing the heat of
formation for the models, we observed that a molecule with cis-amide (∆H = - 60,03kJ) is more stable than transamide configuration (∆H = - 41,3kJ), probably due to the strong repulsion effect between the negative charged
nitrogen atoms of pyrimidine and the atoms of the amide.
Molecular docking is usually used to explain correlations between ligand structures and biological activities that
depend on the conformation of the receptor-ligand complex. The LasR and RhlR proteins belong to the LuxR
family of acylhomoserine lactone dependent transcriptional regulators. Recently, the structure of LasR- 3-oxoC12 has been described
309
Annexe
(Bottomley et al. 2007), but until now RhlR has not been purified or structurally analyzed. Thus we used
structural data of the LasR binding site for our studies of the binding of C4-HSL (Figure 5a) and compound 11
(Figure 5b) in the active site. This transcription factor shares sequence homology with the LuxR family of
regulators (Soulère et al. 2008, Ruimy et al. 2004) like RhlR, so we can suppose that our ligand could form the
similar hydrogen bond network with the active site of RhlR.
For C4-HSL (Figure 5a) we could observe the putative hydrogen bonds: i) between the lactone carbonyl and
Trp-60-NH (1.95 Å), ii) between the oxo group and Tyr-56-OH (1.82 Å), iii) between the amide NH and Asp73-COO (1.90 Å). The distances between the others aminoacid residues of active site (i.e.Thr-75 and Arg-61),
involved in the hydrogen bonds with natural autoinducer 3-oxo-C12-HSL, were measured : i) between the
lactone carbonyl and water molecule H2O-134 (indirect H bond with Arg-61) (2.81 Å), ii) between the amide
NH and Thr-75-OH (2.93 Å).
If we consider that compound 11 binds in the same manner in the active site (Figure 5b, Figure 6), we could
observe the position of aromatic pyrimidyl ring in neighborhood with aromatic aminoacids Trp-60, Trp-88 Tyr56 and Tyr-93. The pyrimidyl ring can stacks with aromatic ring of Trp-88, the distance between the two rings is
about 4 Å. Therefore, we can suppose the possible stabilizing π-π interactions of aromatics rings. Polar groups of
compound 11 could form H-bonds : i) between the nitrogen atom of pyrimidyl ring and Tyr-56-OH (2.32 Å), ii)
between the amide NH and Thr-75-OH (2.42 Å), iii) between the oxo group and Ser-129-OH (2.47 Å). Finally,
Thr-115-OH could be involved in two putative hydrogen bonds with compound 11 either by the amide NH (2.46
Å) or by the oxo group (1.85 Å).
Therefore, the rearrangement of the active site when is occupied by compound 11 could result in an unstable
protein and consequently to the prevention of the protein folding indispensable for QS activity.
In conclusion, this study describes an original C4-HSL analog that inhibits biofilm formation. It is structurally
different from furanone, has no halogen atoms and is certainly less toxic (Martinelli et al. 2004) to the host
organism. Because the formation of colonies protected by biofilm is one cause of the reduced efficacy of
antibiotic treatments, the chronic nature of P. aeruginosa infections may be alleviated by such prevention of
biofilm development. Further experiments are in progress to synthesize other molecules derived from compound
11, and also to investigate adhesion to eukaryotic cells and biofilm formation in vivo.
310
Annexe
Acknowledgments
We thank Mr Alain Jauneau and Mrs. Cecile Pouzet for their experimental work with the scanning
confocal laser microscope, and Mr Laurent Amielet, Mrs Christelle Récoché and Mr Alain Signoles for
their technical support. We are grateful to the French Embassy in Iran for its financial support.
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Yoon, S.S., Hennigan, R.F., Hilliard, G.M., Ochsner, U.A., Parvatiyar, K., Kamani, M.C., Allen, H.L., De
Kievit, T.R., Gardner, P.R., Schwab, U., Rowe, J.J., Iglewski, B.H., McDermott, T.R., Mason, R.P., Wozniak,
D.J., Hancock, R.E., Parsek, M.R., Noah, T.L., Boucher, R.C., and Hassett, D.J. 2002 Pseudomonas aeruginosa
anaerobic respiration in biofilms: relationships to cystic fibrosis pathogenesis. Dev. Cell. 3(4): 593-603.
314
Annexe
Scheme 1
R-NH2 + CH3-(CH2)2-COOH
DCC
DCM
CH3 -(CH2)2-CO-NH-R
R-NH2 + CH3-(CH2)2-COCl
pyridine
315
Annexe
Table 1
N°
R
Formula
MW
Biofilm Inhibition
Br
H
C5H2O2Br2
Br
furanone
1
254
O
O
+
CH3 - (CH2)2 – CO – NH – R
2
S
-
C8H13NO2S
187
C7H12N2OS
172
-
C7H10N2OS
170
-
C11H12N2OS
220
C8H12N2O2
168
C10H13NO
163
C10H13NO2
179
C9H12N2O
164
C9H12N2O
164
C8H11N3O
165
C8H16N2O2
172
O
N
3
S
N
4
S
N
5
S
-
CH3
6
N
O
7
8
OH
9
N
N
10
-
-
-
-
-
N
11
N
12
N
O
+
-
% inhibition of biofilm formation : + : > 99.99% ; - : ≈ 0%
316
Annexe
Table 2
Time point of medium renewal and/or addition of compound tested
T (h)
0
2
4
6
20
24
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ : addition of tested compound
blank : only medium renewal
317
Annexe
1
2
3
4
5
Table 3
Time addition (h)
6
20h
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Numeration time / Cumulative time
% BI / % PCI
0
2
4
6
20
24
100% / 100%
100% / 100%
100% / 100%
93.0% (± 0.66) / 74.0%(± 4.18)
NA / NA
NA / NA
24h
% BI
/ % PCI
100% / 100%
100% / 100%
100% / 100%
47.0% (± 5.14) / 90.0% (± 1.44)
46.0% (± 4.07) / 6.7% (± 7.91)
NA / NA
48h
% BI / % PCI
100% / 100%
100% / 100%
100% / 100%
0% (± 0.7) / 12.0% (± 7.74)
6.3% (± 10.81) / 7.4% (± 7.65)
6.3% (± 10.90) / 7.3% (± 9.10)
BI :Biofilm Inhibition / PCI : Planktonic Cell Inhibition (removed from biofilm)
100% mean reduction > 6 log
NA : not applicable
318
Annexe
Table 4
O
X
Z
N
H
Compound
X
Y
Y
Z
---------------------------------------------------------------------------2
-
-
(S) -0.167
3
(N) -0.4090
(S) -0.1383
-
4
(N) -0.3919
(S) +0.0307
-
5
(N) -0.4186
(S) -0.0234
-
6
9
10
11
(N) -0.2271
(N) -0.4218
(N) -0.4551
(O) -0.0993
-
-
-
(N) -0.3526
(N) -0.4586
-
319
Annexe
Inhibition of biofilm formation (%)
Figure 1
100
80
5µM
50µM
60
500µM
5mM
40
20
0
20h
24h
48h
Time (h)
320
Annexe
Figure 2
Control
Compound 11
4h
20 µm
a)
20 µm
a’)
6h
20 µm
20 µm
b)
b’)
24h
20 µm
20 µm
c)
c’)
48h
75 µm
d)
75 µm
d’)
321
Annexe
Figure 3
100
Inhibition of adherent cells (%)
90
80
70
60
50
48h
40
30
20
10
0
C11 (0h)
C11(0h)+C4(6h)
C4(0h)+C11(0h)
Addition of tested compounds
Figure 4
322
Annexe
Compound 11
Compound 3
323
Annexe
Figure 5
Tyr-93
Trp-88
CH2
a)
Trp-88
b)
H2 C
Tyr-93
CH2
CH 2
O
Asp-73
N
H
H
Phe-101
H2C
-
1.90 A
O
1.95 A
N H
Trp-60
H
C
H2
C
H2
H
N
C
O
N H
3.11 A
H
CH2
HN
H2C
Tyr-56
Ser-129
H
Trp-60
O
H
3.90 A
O-
H
C
CH3
N
H
Arg-61
C
H2
H
H2
C
C
H2
CH 3
H
C
H
Thr-75
O
2.32 A
1.85 A H
H
O
H
N
O
NH 2
CH 2
HN
H2C
O
H
C
CH3
Thr-115
1.84 A
H
C
O
2.46 A
C
O
Thr-115
C
O
N
4.12 A
C
H2
2.42 A
H
3.90 A
Asp-73
H2C
4.11 A
Thr-75
1.82 A O
H
2.97 A
N
H
N
C
H
H
O
NH2
O
2.93 A
O
Phe-101
CH3
C
O
H
H2
C
N
O
O
Arg-61
O
H
2.81 A
C
H2
C
Ser-129
Tyr-56
324
Annexe
Figure 6
TRP115
SER129
325
Annexe
Scheme 1. Synthesis of AHL analogs 2 - 11
Table 1. Synthesized AHL analogs (formula and MW); biofilm inhibition at a concentration of. 0.5 mM for the
analogs and at 0.05 mM for furanone.
Table 2. Protocol for the addition of tested compound.
Table 3. Percentage inhibition of biofilm formation and planktonic cell inhibition [(CFU control – CFU assay) /
CFU control] x 100] (mean ± standard deviation; n = 3) by compound 11 (0.5 mM) addition at different
incubation times – numerations at 20h, 24h and 48h:
Table 4. Atomic charges on hetero-atoms
Figure 1. Percentage inhibition of adherent cells [(CFU control – CFU assay) / CFU control] x 100] (mean ±
standard deviation; n = 3) by compound 11 depending on the concentration (5 µM, 50 µM, 500 µM, 5 mM) at
different incubation times (numerations at 20h, 24h and 48h).
Figure 2. Images of effects of compound 11 on P. aeruginosa biofilm formation by scanning confocal laser
microscopy at 4h, 6h, 24h and 48h of incubation vs control (addition from T= 0h)) (400X) (SYTO 9®).
Figure 3. Percentage inhibition of adherent cells [(CFU control – CFU assay) / CFU control] x 100] (mean ±
standard deviation; n = 3) by compound 11 (0.5 mM) + C4-HSL (0.5 mM) with addition at different incubation
times; numerations at 48h.
Figure 4. Maps of molecular electrostatic potentials (red isolines: negative potentials,
green lines: positive potentials).
Figure 5 : Schematic overview of the active site displaying the possible hydrogen bond network between
aminoacid residues and C4-HSL (a) and C11 (b).
326
Annexe
LasR side chains could make many H bonds to the ligand. Dotted lines show the distances between the ligands
and aminoacid residues of binding site able to form the hydrogen bonds.
Figure 6 : Modeling of compound 11 interactions with LasR binding site. (in sticks : grey, carbon; white,
hydrogen; blue, nitrogen; red, oxygen).
327
Titre et résumé en anglais
Titre et résumé en anglais
Attenuation of Pseudomonas aeruginosa biofilm by N-AcylHomoserine Lactone analogs
The discovery of quorum sensing (QS) systems regulating bacterial virulence has
afforded a novel opportunity for controlling infectious bacteria by interfering with QS.
Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic human pathogen, for which furanone related
compounds have been described as potent inhibitors of biofilm formation and virulence
factors, given their similarity with natural QS autoinducers, N-Acyl HomoSerine Lactones
(AHLs). Our purpose was to design analogs of C4-HSL and to screen them for biological
activity. Eleven non-halogenated original compounds were screened for their ability to impair
biofilm formation. Among them, C11 was able to modify the growth kinetics and to restrict
the number of adherent cells during the early stages of biofilm formation. We also showed
antagonism between C11 and C4-HSL.
328
Auteur : Pouneh KHALILZADEH
Formation de Biofilm à Pseudomonas aeruginosa:
évaluation d’inhibiteurs potentiels du Quorum Sensing
Directrices de Thèse : Mme Christine ROQUES, Mme Geneviève BAZIARD
Faculté des sciences Pharmaceutiques, L’Université Paul Sabatier
(Toulouse III)
Le 22 septembre 2009
Résumé en français :
La découverte du Quorum-Sensing (QS), système de communication inter-bactéries,
régulant l’expression de nombreux gènes de virulence a offert l’opportunité de contrôler
l’infection bactérienne. Pseudomonas aeruginosa est une bactérie opportuniste fréquemment
impliquée dans la formation de biofilms résistants aux antibactériens. Des dérivés de la
furanone ont été décrits comme de puissants inhibiteurs de formation de biofilm du fait de
leur similitude avec les auto-inducteurs naturels du QS, les N-Acyl HomoSérineLactones.
Notre objectif a été de concevoir des analogues de la C4–HSL et d’étudier leur activité
biologique. Parmi eux, le composé C11 a été capable de modifier la cinétique de formation du
biofilm et de réduire le nombre de cellules adhérées durant les premières étapes de formation
du biofilm. L’antagonisme entre C11 et la C4-HSL a également été étudié.
Mots clés : Quorum-Sensing, Pseudomonas aeruginosa, N-Acyl HomoSérineLactone
Discipline : Microbiologie
Unité de recherche : LU 49, UFR des sciences Pharmaceutiques