/ . Embryol. exp. Morph., Vol. 14, Part 3, pp. 255-263, December 1965 Printed in Great Britain Obtention experimentale de cyclopes parfaits par microchirurgie chez Fembryon de Poulet Etude histologique par JEAN SCHOWING1 Institut d'Embryologie experimentale du C.N.R.S. (Directeur: Professeur Etienne Wolff) AVEC DEUX PLANCHES LA cyclopie parfaite peut etre definie comme une anomalie de developpement caracterisee par la presence d'un seul oeil situe au milieu de la face, dans la position normalement occupee par le nez. Differents moyens ont ete mis en oeuvre pour reproduire experimentalement la cyclopie. Stockard (1908) obtient des embryons cyclopes en elevant des oeufs de Teleosteens dans une solution d'alcool ethylique. Leplat (1919) note que le chlorure de Lithium agissant sur des oeufs d'Amphibiens entraine la production de cyclopes dans 80 pour 100 des cas. Ces travaux, ainsi que ceux d'autres auteurs, introduisent la notion de sensibilite teratogenique. Les ebauches sont sensibles aux agents teratogenes a un certain moment, et pas dans les autres periodes de leur developpement. Un agent teratogene specifique est done susceptible d'entrainer l'apparition de monstres cyclopes si on le fait agir a un stade bien determine du developpement embryonnaire. D'autres auteurs font appel a la microchirurgie. Adelmann (1930, 1937) et Mangold (1931) excisent la partie prechordale du toit de l'archenteron chez le Triton et realisent ainsi des cyclopes. D'apres Adelmann, la cyclopie doit etre considered comme un etat primaire de la tete, car l'oeil anormal est toujours accompagne d'un nombre relativement constant d'anomalies du developpement. La partie olfactive est typiquement unique et situee au-dessus de l'oeil. La partie externe du nez peut manquer. Lorsqu'elle est presente, elle a souvent l'aspect d'une trompe. II n'y a qu'un seul choane. Le cerveau peut egalement presenter des deviations anormales, par exemple l'absence de prosencephale. Si celui-ci existe, il ne se divise pas en hemispheres cerebraux, mais forme un simple sac creux qui ne porte aucune indication de ventricules lateraux. Le diencephale peut 1 Adresse de Vauteur: Institut d'Embryologie experimentale du C.N.R.S., College de France, 49 bis, Avenue de la Belle Gabrielle, Nogent-sur-Marne (Seine), France. 256 J. SCHOWING etre malforme. Le mesencephale Test beaucoup moins. Quant a la partie posterieure du cerveau, elle est generalement normale. Les nerfs olfactifs et optiques peuvent etre simples, rudimentaires, ou absents. Les elements mesodermiques de la tete sont malformes de facon caracteristique. Les muscles extrinseques de l'oeil, en particulier, montrent une nette tendance a se fusionner dans le plan median et selon un processus de ventralisation, comme l'a -defini Backstrom chez Xenopus (1954, 1962). Entre l'aspect normal et la cyclopie existent tous les degres de synophtalmie, caracterises par une separation graduelle des yeux. Par ailleurs, l'oeil unique du cyclope peut montrer des degres variables de reduction, allant de la microphtalmie al'anophtalmie. Ces differentes categories de monstruosites ont ete realisees par Et. Wolff, qui obtient pour la premiere fois en 1936 des Cyclopes parfaits chez l'embryon de Poulet. II les realise de maniere constante par des irradiations aux rayons X localisees a la zone transversale comprenant l'ebauche du prosencephale. II faut pour cela que l'irradiation soit faite tres tot, et qu'elle porte sur l'extremite anterieure du prolongement cephalique ou de la gouttiere nerveuse. Dans ce cas, Et.Wolff obtient des cyclopes possedant un ceil median et rudimentaire. Le bourgeon frontal est atrophie, il manque done le bee superieur. Les hemispheres cerebraux sont atrophies aussi, d'ou la forme tronquee de la region frontale du crane. La cyclopie resulte done dans ce cas de la lesion simultanee de l'ebauche telencephalique et de l'ebauche du bourgeon frontal. La cyclopie parfaite ne peut toutefois pas etre obtenue par ce procede au stade ou les vesicules optiques commencent a apparaitre morphologiquement. Reprenant les observations d'Et. Wolff, nous avons tente d'obtenir les memes phenomenes par microchirurgie. Nous avons ainsi montre (Schowing, 1964) que l'excision de differents territoires encephaliques, allant du prosencephale a l'encephale entier, entraine l'apparition de monstres synophtalmes a deux yeux soudes et reunis dans la meme orbite. Pratiquee a un stade jeune, cette intervention permet d'obtenir des cyclopes a un seul ceil parfaitement median. Dans •certaines experiences, le bourgeon frontal a ete preserve. II n'empeche pas le rapprochement des deux ebauches oculaires, mais dans ce type d'experiences, nous n'avons observe aucun cas de cyclopie. Une experience pratiquee a un stade avance nous ayant donne un cyclope parfait, nous nous sommes demande dans quelle mesure il etait possible de reproduce cette malformation a partir d'embryons de plus de 10 somites. Quel est le stade ultime auquel on peut obtenir le cyclope parfait ? MATERIEL ET TECHNIQUES Nous operons sur des oeufs de race Leghorn blanche, apres 35 a 45 hr. d'incubation. Les embryons ont alors de 10 a 20 somites. La technique utilisee derive etroitement de celle qui nous a permis d'etudier Pinfluence de l'excision de ter- 257 Cyclopes chez Vembryon de Poulet ritoires encephaliques sur la differentiation du crane (Schowing, 1961). Elle consiste en microscalpels fabriques a partir d'aiguilles d'entomologiste en acier inoxydable qui sont polies sur pierre d'Arkansas. Les excisions portent principalement sur le prosencephale et le mesencephale, les vesicules optiques sont epargnees (Planche 1, Fig. A). Apres l'operation, nous remettons les oeufs en incubation jusqu'au T jour, puis nous extrayons les embryons et les fixons dans une solution de formol a 10 pour 100. Les embryons destines a l'histologie sont fixes au fixateur de Bouin et coupes a lix d'epaisseur. Les coupes sont mordancees pendant 24 heures dans une solution d'acetate d'alumine a 2 pour 100, puis colorees a l'alizarine sulfonee et au bleu alcian en solution aqueuse a 1 pour 100. La combinaison des deux colorants fait apparaitre le tissu nerveux en violet. RESULTATS Nous avons opere 28 embryons dont 27 ont survecu. Parmi ceux-ci, 14 embryons sont synophtalmes, 2 sont monophtalmes, c'est-a-dire qu'ils ont un seul ceil bien developpe, l'autre ayant avorte. 2 sont microphtalmes, 9 sont des Cyclopes parfaits. Ces derniers sont caracterises par la presence d'un ceil median de grande taille, qui resulte de la fusion des deux ebauches oculaires pour former un ceil de structure normale. Cet ceil possede une fente colobomique bien developpee, medioventrale, et qui apparait comme une plage claire sur l'ensemble pigmente. Elle existe dans tous les cas de cyclopie que nous avons observes. Les enveloppes externes sont legerement epaissies dans leur partie mediane, cet epaississement atteste seul l'origine double de cet ceil (Planche 1, Fig. B). TABLEAU Stade 10 S 11 S 12s 13s 14s 15s 16s 18s 19s 20 s Totaux Embryons operes 8 2 1 4 2 3 3 1 2 1 27 Monophtalmes 2 Microphtalmes 2 Synophtalmes 2 2 3 2 2 2 2 2 1 14 Cyclopes 2 1 1 1 3 1 9 En aucun cas, nous nous n'avons pu epargner le bourgeon frontal qui est tres petit a ce stade et pratiquement inseparable de l'encephale anterieur. Les Cyclopes n'ont done pas de bee superieur, ils ressemblent en cela a ceux obtenus par Et. Wolff. Le tableau indique le nombre d'embryons operes pour chaque stade, ainsi que les malformations obtenues. 258 J. SCHOWING Nous constatons que les Cyclopes sont largement representes. Le stade le plus avance auquel nous avons pu obtenir un cyclope parfait est le stade 18 somites. II fixe actuellement la limite de realisation experimentale de la cyclopie. II ne parait toutefois pas inconcevable de pouvoir obtenir cette malformation au-dela de ce stade. Le petit nombre de cas que nous avons etudies entre 19 et 20 somites ne nous permet pas d'afifirmer qu'il n'est plus possible a ce stade d'operer un embryon avec succes. MORPHOLOGIE INTERNE, HISTOLOGIE Nous avons etudie histologiquement un embryon opere au stade 16 somites, et dont l'aspect est celui du cyclope parfait. Une premiere coupe faite a travers l'ceil et dans sa partie anterieure montre le cristallin median, bien constitue et un peu plus grand qu'un cristallin normal. La retine et le tapetum sont reguliers sur toute leur surface. Us presentent un epaississement mediodorsal qui correspond vraisemblablement a la ligne de soudure des deux ebauches primitives. La fente colobomique s'etend ventralement jusqu'au niveau approximatif du plan equatorial de 1' ceil, le cristallin etant considere comme l'un des poles. Elle se caracterise par le developpement du peigne dans lequel le tapetum et la retine apparaissent en parfaite continuite (Planche 1, Fig. C). La fente colobomique se termine par une sorte de hile dans lequel se groupent des fibres nerveuses emanant des deux cotes de la retine. Les fibres se rassemblent en un nerf optique unique (Planche 1, Figs. D et E) qui s'inflechit vers l'arriere des son emergence de l'oeil et prend la forme d'un cordon subcylindrique (Planche 2, Figs. F et G) perce en son centre d'un canal de tres faible lumiere dont l'origine se trouve dans une invagination du tapetum, a l'endroit ou les fibres nerveuses s'organisent en nerf (Planche 1, Fig. E). La continuite a ce niveau entre le tapetum et la paroi du pedoncule optique rappelle par sa structure celle qui existe entre le tapetum et la paroi diencephalique chez les cyclopes prives seulement du prosencephale (Rogers, 1964). Par ailleurs, le nerf optique est court. II se termine par un renflement aux parois epaissies et peu differenciees, occupe en son centre par une cavite qui est l'elargissement du canal median. Cette cavite peut correspondre a une ebauche ventriculaire (Planche 2, Fig. H). L'ensemble de ces observations permet de penser que l'extremite du nerf optique est d'origine diencephalique. Un fragment de diencephale a pu etre epargne au cours de l'operation. Aucune fibre nerveuse ne prolonge l'extremite du nerf optique. L'oeil ne possede aucune relation avec ce qui reste du systeme nerveux cephalique. Les ganglions de Gasser apparaissent posterieurement par rapport a l'extremite du nerf optique, et en position ventro-laterale par rapport a l'oeil. Leur aspect est normal. Les branches ophtalmiques du nerf trijumeau convergent dans la musculature extrinseque de l'oeil qui s'est condensee ventralement pour former un ensemble dans lequel il n'est pas possible de reconnaitre chaque territoire musculaire en particulier. La figure I represente une coupe a un niveau anterieur J. Embryol. exp. Morph. Vol. 14, Part 3 PLANCHE1 FIG. A. Schema montrant le type d'intervention. Excision du prosencephale (en hachures), du prosencephale et du mesencephale (en pointille). Embryon de 15 somites. FIG. B. Aspect d'un embryon prive de prosencephale et de mesencephale. Embryon de 7 jours, opere au stade 15 somites. Cyclope parfait a un seul ceil median. Noter la presence de la fente colobomique, plus claire et ventrale. x 9. FIG. C. Coupe a travers I'oeil unique d'un embryon de 7 jours, opere au stade 16 somites f.c, fente colobomique; p., peigne. x 33,5. FIG. D. Coupe a travers I'oeil unique, au niveau de l'emergence du nerf optique. Embryon de 7 jours opere au stade 16 somites, x 22,5. FIG. E. Coupe de l'emergence du nerf optique. x 135. r., retine; t., tapetum; f.o., fibres optiques. JEAN SCH0W1NG (Facing page 258) / . Embryo], exp. Morph. Vol. 14, Pan 3 PLANCHE 2 FIG. F. Coupe a travers l'oeil unique et le nerf optique. Embryon de 7 jours opere au stade 16 somites, x 17,5. n.o., nerf optique. FIG. G. Coupe du nerf optique. x 105. Remarquer la lumiere centrale du nerf. FIG. H. Coupe dans l'extremite du nerf optique montrant Tepaississement de sa paroi, ainsi que la cavite qui la creuse. x 105. FIG. I. Coupe au niveau anterieur des ganglions de Gasser (g.G.). Embryon de 7 jours opere au stade 16 somites. Les branches ophtalmiques (b.o.) convergent vers la musculature de 1'ceil (m.)- x22,5. FJG. J. Coupe au niveau posterieur des ganglions de Gasser (g.G.). Remarquer le rhombencephale massif (Rh.). x 22,5. JEAN SCHOWING (Facing page 259) Cyclopes chez Vembryon de Poulet 259 des ganglions de Gasser. La partie mediane de la tete montre un debut de differentiation cartilagineuse dont le centre est occupe par la chorde. II n'y a aucune trace d'encephale. La partie posterieure de celui-ci reapparait un peu plus en arriere et au niveau moyen des ganglions de Gasser, sous la forme d'un eperon conique correspondant a la partie posterieure du mesencephale, et qui s'elargit rapidement pour former le rhombencephale vers lequel confluent les ganglions de Gasser. Le rhombencephale est massif et ne presente aucune trace de ventriculisation (Planche 2, Fig. J). Le ventricule reapparait sensiblement au niveau des ganglions auditifs, a partir desquels l'histologie de l'embryon cyclope est identique a celle de l'embryon normal. ce. n.o FIG. 1. Reconstitution schematique du systeme nerveux d'un embryon de 7 jours opere au stade 16 somites. oe., oeil unique; n.o., nerf optique; d., extremite du nerf optique; g.G., ganglion de Gasser; Rh., rhombencephale. D'apres l'ensemble de ces observations, nous avons reconstitue schematiquement le systeme nerveux du cyclope (Fig. 1). Le systeme nerveux est tres aberrant et scinde en deux parties totalement separees. La premiere comprend le nerf optique et son extremite, dont l'origine est vraisemblablement diencephalique, la seconde est essentiellement composee des ganglions de Gasser et de leurs branches ophtalmiques qui convergent en arriere de l'oeil dans la masse musculaire. Les ganglions de Gasser sont relies par leur partie posterieure au rhombencephale qui marque la reapparition du tronc encephalique posterieur, a partir duquel toutes les structures histologiques reprennent leur aspect normal. CONCLUSIONS Ces experiences et les resultats qu'elles apportent demontrent qu'il est possible de produire des Cyclopes parfaits par un traumatisme affectant principalement le tissu nerveux. II est possible de realiser des Cyclopes non seulement dans les jeunes stades, compris plus particulierement entre 6 et 8 somites, ainsi que nous Tavons deja montre (Schowing, 1964), mais aussi a des stades plus avances 260 J. SCHOWING pouvant aller jusqu'a 18 somites, ou le cyclope parfait peut encore etre obtenu par excision des territoires encephaliques anterieurs et de l'ectoderme qui les recouvre. Aucun substrat prechordal n'est enleve au cours de l'operation. Au stade le plus avance ou nous avons pu obtenir un cyclope parfait, c'est-a-dire 18 somites, les vesicules optiques sont deja bien differenciees. C'est done leur rapprochement en l'absence du prosencephale et du mesencephale qui est a l'origine de l'ceil unique du cyclope. Si la cyclopie peut etre considered comme un etat primaire, ainsi que l'a demontre Adelmann, elle peut aussi etre le resultat d'une action secondaire, qui est ici la suppression de l'encephale anterieur. La cyclopie resulte done d'une deficience neurale. Malgre l'absence de l'encephale anterieur, nous constatons la presence d'un rudiment de nerf optique. Dans quelles conditions peut-il se former et sous l'influence de quels facteurs ? Selon Gruenwald (1945), le pedoncule optique est determine tres tot. II n'est pas possible de le supprimer radicalement au cours d'une excision des parties medianes, il en subsiste toujours un fragment plus ou moins grand selon les cas. D'autre part, l'absence de nerf optique est en rapport direct avec l'absence de fente colobomique. Dans ce cas, les fibres nerveuses ne croissent pas dans le pedoncule optique qui degenere rapidement. Si, au contraire, la fente colobomique existe, les fibres nerveuses se developpent dans le pedoncule optique qui se differencie. Cette evolution se poursuit pendant environ 7 jours, puis elle cesse et regresse dans les jours suivants. Les cyclopes que nous avons obtenus presentent tous une fente colobomique bien developpee. Us ont ete observes au T jour de leur incubation, c'est-a-dire au stade qui correspond selon Gruenwald au maximum de differentiation du pedoncule optique. Les resultats que nous avons obtenus s'accordent avec les hypotheses de Gruenwald, du moins en partie, puisque nous relevons dans tous les cas l'existence de la fente colobomique. Nous pouvons seulement constater qu'il existe un pedoncule optique forme de nombreuses fibres nerveuses. Ceci explique sa structure histologique et etaye notre hypothese concernant l'origine diencephalique de l'extremite de ce pedoncule qui, dans nos experiences, a pu etre epargne partiellement au cours de l'operation. La position ventrale du nerf optique, ainsi que l'accumulation des muscles extrinseques de l'oeil confirment egalement les hypotheses exprimees en 1954 et 1962 par Backstrom. L'oeil unique qui resulte de cette operation provient done de la fusion des deux ebauches oculaires primitives, ainsi que de la fusion des fragments de pedoncule optique, voire de diencephale, qui ont pu subsister lors de l'intervention. Stockard (1913) et Werber (1915) avaient emis l'idee que la masse de l'oeil obtenu par fusion des deux ebauches devait egaler celle des deux yeux separes. Cette hypothese est refutee par Pasquini (1927) et Detwiler (1929) qui font intervenir les phenomenes de regulation et observent des yeux cyclopeens d'Axolotl a peine plus grands que les yeux normaux. L'oeil de l'embryon que nous avons etudie ici montre que la Cyclopes chez Vembryon de Poulet 261 regulation est en effet tres importante, au point que sa taille ne depasse que tres legerement la normale. Les Cyclopes parfaits obtenus par irradiations (Wolff, 1936) ou par microchirurgie (Gruenwald, 1945; Schowing, 1964; Rogers, 1964) sont tous caracterises par Fabsence de bee superieur. Ceci laisse en suspens la question de la participation du bourgeon frontal dans le processus aboutissant a la cyclopie. Le developpement de l'intermaxillaire n'empeche pas le rapprochement des yeux dans la meme orbite. S'oppose-t-il a une fusion complete des deux ebauches ? Le probleme n'est pas definitivement resolu. Nous confirmons done le role preponderant joue par le prosencephale dans la separation normale des yeux, et nous pouvons conclure qu'il est possible, grace a la microchirurgie, d'obtenir des Cyclopes parfaits en operant les embryons a des stades ou les vesicules optiques sont deja individualists. RESUME 1. L'encephale anterieur et moyen est excise par microchirurgie chez l'embryon de Poulet de 10 a 20 somites, dans le but d'obtenir des Cyclopes parfaits. 2. Sur 27 embryons operes, 9 sont des cyclopes parfaits caracterises par la presence d'un ceil unique median et de grande taille. Le bee superieur manque dans tous les cas (Fig. A). Le stade le plus avance auquel il a ete possible d'obtenir un cyclope parfait est le stade 18 somites. 3. L'etude histologique montre que Pceil est parfaitement constitue. II existe un nerf optique court et medioventral, termine par un renflement de structure diencephalique. Aucune fibre nerveuse ne le prolonge en direction de l'encephale posterieur (Fig. D a H). 4. Les ganglions de Gasser sont normaux. Les branches ophtalmiques des nerfs trijumeaux convergent dans la musculature extrinseque de l'ceil, laquelle s'est condensee ventralement (Fig. I). 5. L'encephale posterieur apparait au niveau moyen des ganglions de Gasser comme un eperon conique qui s'elargit rapidement pour former un rhombencephale massif (Fig. J). Le ventricule correspondant ne reapparait qu'au niveau des ganglions auditifs a partir desquels toutes les structures histologiques reprennent leur aspect normal. 6. Ces experiences montrent que la cyclopie resulte d'une deficience neurale. Le prosencephale joue un role important dans la separation normale des yeux, et il est encore possible d'obtenir des cyclopes parfaits en l'excisant a un stade ou yeux sont deja individualises. SUMMARY The experimental production of perfect cyclopia by micro-surgery in the fowl embryo: a histological study 1. The fore- and midbrain were removed by microsurgical means from chick embryos of from 10 to 20 somites old, in order to obtain perfect cyclopia. 18 262 J. SCHOWING 2. Among twenty-seven operated embryos, nine showed perfect cyclopia, characterised by a single, median, and over-sized eye. The upper beak was always lacking. The oldest stage at operation at which it has been possible to obtain perfect cyclopia is 18 somites-stage. 3. Histological study shows that the eye is perfectly formed. There is a short medioventral optic nerve, ended by a diencephalic-like bulge. No nerve fibres extend it in the direction of the hindbrain. 4. The Gasserian ganglia are normal. The ophthalmic branches of the trigeminal nerves converge in the extrinsic eye muscles which are ventrally condensed. 5. The hindbrain appears at the level of the middle of the Gasserian ganglia as a conical stalk which enlarges rapidly to form a massive rhombencephalon. The corresponding ventricle only appears at the level of the auditory ganglia, behind which all histological structures become normal. 6. These experiments show that cyclopia results from a neural deficiency. The prosencephalon plays an important role in the normal separation of the eyes, and it is still possible to obtain perfect cyclopia by removing it at a stage at which both eyes are already individualised. TRAVAUX CITES H. B. (1930). Experimental studies on the development of the eye. III. The effect of the substrate ('Unterlagerung') on the heterotopic development of median and lateral strips of the anterior end of the neural plate of Amblystoma. J. Exp. Zool. 57, 223-81. ADELMANN, H. B. (1937). 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