ANNIE BOULANGER FWET DE GREFFES DE MYOBLASTES CHEZ

ANNIE BOULANGER
R ~ L EDES ANTIGÈNES MiNEURS D'HISTOCOMPATIBIUTÉDANS LE
FWET DE GREFFES DE MYOBLASTES CHEZ LA SOURIS MDX
Mémoire
présenté
à la Faculté des études supérieures
de l'Université Laval
pour l'obtention
du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
Microbiologie-Immunologie
FACULTÉDE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
Mars 1998
O ANNIE BOULANGER, 1998
1+1
National Library
ofCanada
Bibliothèque nationale
du Canada
Acquisitions and
Bibliographie Services
Acquisitions et
seMces bibliographiques
395 Wellington Street
OttawaON K1AûN4
canada
395, nie WeiIington
Ottawa ON K IA ON4
canada
The author has granted a nonexclusive licence allowing the
National Libmy of Canada to
reproduce, loan, distriiute or sell
copies of this thesis in microfom,
paper or electronic formats.
L'auteur a accordé une licence non
exclusive permettant à la
Bibliothèque nationale du Canada de
reproduire, prêter, distn'buer ou
vendre des copies de cette thèse sous
la forme de microfiche/nlm, de
reproduction sur papier ou sur format
électronique.
The author retains ownership of the
copyright in this thesis. Neither the
thesis nor substantial extracts fkom it
may be printed or otherwise
reproduced without the author's
permission.
L'auteur conserve la propriété du
droit d'auteur qui protège cette thèse.
Ni la thèse ni des extraits substantiels
de celle-ci ne doivent être imprimés
ou autrement reproduits sans son
autorisation.
AVANT PROPOS
J'aimerais remercier le Docteur Jacques P. Tremblay pour m'avoir si bien
encadrée tout au long de mon projet de recherche. Sa grande disponibilité, sa
compréhension et sa confiance furent tout à fait appréciées. De par son
enthousiasme, il a su me communiquer une petite parcelle de l'énorme feu
sacré qui l'habite en ce qui concerne la recherche.
Un gigantesque merci à Isabelle Asselin. C'est elle qui m'a initiée aux
rudiments de la recherche. Elle m'a supportée techniquement et moralement à
travers ces deux années de maîtrise. Sa patience sans borne et sa coopération
ont contribué grandement à la réussite de m o n projet.
Merci à Benoit Guérette qui, en me parlant de ses travaux de recherche, m'a
donné le goût d'entreprendre ces études. Je le remercie d'avoir omis de me
parler des séminaires, clubs de lecture et biopsies sur les bébés souris sans quoi
je n'aurais sans doute pas eu le désir de faire cette maîtrise.
Je remercie Ikuo Kinoshita pour avoir supporté mes larmes de désolation alors
qu'il m'enseignait la culture cellulaire à partir des biopsies de bébés souris.
Merci à Jean-Thomas Vilquin pour ses conseils techniques et ses réflexions
judicieuses. Il était toujours là, tard le soir, pour discuter boulot ou tout
simplement pour me sauver la vie en réparant le cryostat.
Merci également à Dominique Mayrand pour ses conseils en biologie
moléculaire et à Florence Célestin pour ses encouragements dans les moments
difficiles tel l'écriture d'un article...
Merci à Brigitte Roy, Marlyne Goulet, Isabelle Deaudelain et François Tardif qui
sont toujours là pour résoudre les petits et gros problèmes.
Enfin, mille excuses à vous, les petites bêtes, qui nous servez de modèle
expérimental. En souhaitant que cela serve à quelque chose de concret et qu'un
jour on puisse voir un enfant dystrophique sinon guéri, du moins soulagé!
Page
&SM
.....................................................................................................................
i
..
AVANT-PROPOS.........................................................................................................
u
...
TABLE DES M A T I ~ E S..........................................................................................
LU
.
LISTE DES TABLEAUX..............., ........................................................... .................vu
...
W T E DES FIGURES................................................................... .......................... . .vui
LISTE DES FIGURES PRÉSENTÉES D A M L'ARTICLE ..................................
ix
LISTE DES ABBRÉVIATIONS...................
.
.......................................................... .x
*
IÈRE PARTIE ASPECTS FONDAMENTAUX, CLINIQUES ET
THERAPEUTIQUESD E LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE D E
DUCHENNE
CHAPITRE 1 LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE (DMD)
Historique de la maladie..................
............................................................... 1
Pathophysiologie.............................................................................................. .l
Caractérisation de la dystrophine...............................................................
2
1.3.1 Identification du gène en cause dans la DMD et identification
du produit du gène................................................................................ 2
1.3.2 Localisation de la dystrophine.......................................................... ..5
1.3.3 Structure de la dystrophine................................................-................5
1.3.4 Distribution de la dystrophine............................................................ 8
1.3.5 Fonctions de la dyçtrophine................................................................ 8
CHAPITRE 2 LA TRANSPLANTATION DE MYOBLASTES COMME
AVENUE ~ É R A P E U T I Q U E POUR TRAITER LA DMD
2.1
.................................................... 9
.
.
La transplantation de myoblastes..........
2.1.1 Myogénèse et régénération musdaire........
.....
2.2
........................
9
2.1.2
Latransplantationdemyoblastesdiezlasouris ...............
.
.
.....11
2.1.3
Le modèle animal de la DMD: la souris mdx ..............................
2.1.4
Les différents protocoles de transplantations effectués chez la
souris par l'équipe du Dr. Tremblay............................................... 14
2.1.5
La transplantation de myoblastes chez l'humain........................16
13
Problème majeur relié à la transplantation de myoblastes .................... 18
CHAPITRE 3 LA RECONNAISSANCE ALLOGÉNIQUE ET LE REJET D E
GREm
3.1
. . ........................................................................ 19
La reconnaissance allogeruque
3.2
Le complexe majeur d'hiçtocompatibilité(Ch4.H)....................................... 20
Organisation génétique du CMH......................
.
............................ 20
Rôle du C M . dans la présentation de l'antigène...........................21
Les lymphocytes T: Immunité versus tolérance............................24
Éducation thymique et tolérance naturelle......................................24
. . . ....................................................................................25
L'alloantigenicité
Le CMH et la reconnaissance allogénique......................................... 26
Reconnaissance de l'alloantigène par les lymphocytes T..............26
3.3
Répome humorale aux alloantigènes du CMH........................................
-30
3.4
Mécanisme de rejet suivant I'auotransplantation.
.
............................
-31
C W I T R E 4 LES ANTIGENES lMINEURS D'HISTOCOMPATISILITE (AGMH)
ET LES ANTIGENES NON-ChlH
Identifka tion et isolement des AgMH.......................................................... -32
L'antigène mâle H-Y........................................................................................
Différences principales entre CMH et AgMH...................................
33
...LM
Les AgMH sont reconnus uniquement par les lymphocytes T................ 34
Réponse allogénique aux AgMH: Restriction au C M H............................ 35
Assemblage des AgMH avec les molécules du CMH.................................35
Réponse allogénique aux AgMH: Amorçage in vivo ............................... 36
Immunodominance........................................................................................
36
Expression tissulaire des AgMH.....................................................................36
AgMH et leur implication dans les transplantations..
....
.......................-36
2EME PARTIE ROLE DES ANTIGENES MINEURS D'HISTOCOMPATIBILTTÉ
DANS LE REJET D E GREFFES DE MYOBLASTES CHEZ LA
SOURIS MDX
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
Abstract...............................................................................................................41
Introduction....................................................................................................
..42
Matenel and rnethods..................................................................................... 43
Results................................................................................................................ 46
Discussion.......................................................................................................... 48
Conclusion..........................,. ...............................................................*............-52
Figures................................................................................................................. 53
References........................................................................................................... 55
3EME PARTIE DISCUSSION GÉNÉRALE
.
2.
1
3.
4
5
.
Bilan des essais diniques effectués chez l'humain...................................... &4
Retour à I'expérimentation chez l'animal........................ .................
.......65
............................................................ 66
Importance des AgMH ................... .
.
Autres études se rapportant au rejet causé par les AgMH .......................... 67
Autres problèmes importants se rapportant à la transplantation de
myoblastes.................
.
6
...................................................................................
.
.
68
Perspectives d 'avenir......................................................................................... 69
LISTE DES OUVRAGES CITES................................................................................
C
71
LISTE DES TABLEAUX
Page
Table 1:
Myoblasts transplantation r e d i s , cellular and humoral
reaction of different groups of dogr& and syngeneic
g a f t..-..*...*.....*...*...*.........*..****.*....
.-...-.*.-*.-*-..* -.--......-.-...**.*-...
*-.*
**
*
LISTE DES FIGURES
Page
Figure 1:
Localisation du gène de la dystrophine sur le
chromosome X ...................................................................................
4
Figure 2:
Localisation de la dystrophine par immunohistochimie........... 6
Figure 3:
Modèle structural de la dystrophine et de ses
protemes associees.............................................................................. 7
8
. 8
Figure 4:
Principe de la transplantation de myoblastes..............
.
............
Figure 5:
Distribution des cellules satellites dans le muscle strié
squelettique............................................................................................ 12
Figure 6:
Molécule du CMH de classe I.............................................................. 2
Figure 7:
Molécule du CMH de classe II............................................................ 23
Figure 8:
Peptides allogéniques présentés par le CMH autologue................28
Figure 9:
Peptides allogéniques présenté par le CMH allogénique...............28
Figure 10:
Peptides autologues présentés par le CMH dogénique ................29
10
Figure 1:
Expression of dystrophin 4 weeks after syngeneic myoblast
transplantation
Expression of dystrophin 16 weeks after syngeneic myoblast
b)
transplantation
CI, d) A few muscle fibers expressing dytrophin, 16 weeks after
myoblast allotransplantation
No muscle fiber expressing dystrophin 16 weeks after
e)
myoblast allotransplantation
A few positive fibers expressing dystrophin following
O
transplantation of male myoblasts in female..................................... 59
a)
g)
h)
i)
CD4+ lymphocytes detected 3 to 4 weeks after myoblast
allotransplantation
MAC+ cells detected 3 to 4 weeks after myoblast
allotransplantation
CD8+ lymphocytes detected 3 to 4 weeks after myoblaçt
allotransplantation.. ............................................................................. .60
Figure 2:
Antibodies detected against donor myoblasts..................................61
Figure 3:
RT-PCR amplification of granzyme B, y-Interferon and
B-actin.................................................................................................... A 2
LISTE DES ABBRÉVU~TIONS
DMD:
Dystrophie musculaire de Duchenne
CMH: Complexe majeur d'histocompatibilité
AgMH: Antigènes mineurs d'histocompatibilité
Fetal calf serum
FCS:
HESS: Hank's balanced salt solution
INF-11: Gamma- interferon
PBS:
Phosphate-buffered saline
TA:
Tibialis antérieur
lERE PARTIE: ASPECTS FONDAMENTAUX, CLINIQUES ET
THÉRAPEUTIQUES DE LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE
DUCHENNE
CHAPITRE 1 LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE D E DUCHENNE
1.1 Historique
C'est en 1860 que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) a été décrite
pour la première fois par le physiologiste français, Guillaume Ducheme de
Boulogne. En 1879, elle fut définie par Duchenne et Gowers comme une
myopathie caractérisée par une dégénérescence musculaire progressive
accompagnée d'une pseudohypertrophie musculaire. Dans les années 1950, les
développements en génétique ont permis de découvrir que cette maladie était
liée au chromosome X (Stephem et Tyler, 1951; Walton et Natrass, 1954). Nous
avons dû attendre l'avènement de la biologie moléculaire durant les années
1980 pour pouvoir positionner le gène impliqué dans la DMD et identifier la
protéine en cause: la dystrophine.
1.2 Pathophysiologie
La DMD
est donc transmise de mère en fils et affecte environ une naissance
mâle sur 3500. C'est la plus fréquente des myopathies et également la plus
grave. La DMD est une maladie dégénérative des muscles squelettiques et
cardiaques. Elle se traduit par un affaiblissement musculaire progressif
affectant successivement les muscles proximaux et distaux. Le phénotype est
apparant dès l'âge de 2-3 ans. Malgré la précocité de l'apparition des
symptômes cliniques, l'acquisition de la marche est toujours possible. On
observe la perte de la fonction ambulatoire vers l'âge de 10-15 ans. Le coeur est
souvent atteint et la faiblesse musculaire peut engendrer des déformations
osseuses (lordose, scoliose). Un déficit intellectuel est quelque fois observé
mais les causes de ce retard mental demeurent inconnues. Le pronostic est
mauvais et la mort survient généralement dès le début de la trentaine par
déficit cardio-ventilatoire .
Parmi les autres observations caractérisant la DMD, la pseudohypertrophie
musculaire qui apparaît lorsque les fibres musculaires ne peuvent plus se
renouveller à un rythme suffisant pour compenser la dégénérescence. Le
muscle s'atrophie alors et les fibres sont remplacées graduellement par du tissu
conjonctif et adipeux.
Cette prolifération tissulaire entraîne une
pseudohypertrophie des muscles.
Par ailleurs on retrouve un t a u sérique anormalement élevé d'une enzyme, la
créatine-kinase (CK), imputable à la dégénérescence des fibres musculaires.
Au point de vue histologique on observe le développement de lésions
histopathologiques et ce, dès le début de la myogénèse. Lors de Ia période
néonatale on peut voir des modifications minimes, des fibres hypercontractées
qui augmentent progressivement ainsi qu'une augmentation de la CK sérique.
Quelques mois après la naissance, la fibrose endomysiale apparaît, suivie de la
nécrose. A partie de l'âge de 10 ans le tissu fibro-graisseux remplace le tissu
musculaire.
1.3 Caractérisation de la dystrophine
1.3.1 Identification du gène en cause dans la DMD et identification du produit
de ce gène
L'avènement de la biologie moléculaire a rendu possible les recherches en vue
d'identifier le gène responsable de la DMD. On savait déjà que le gène en cause
était situé sur le chromosome X. Dans les années 80, la découverte de rares
filles atteintes de DMD a aidé les chercheurs à positionner le gène. Leurs
chromosomes montraient des altérations nommées translocations, c'est-à-dire
qu'un bout du chromosome X était échangé avec la partie d'un autosome
(chromosomes non-sexuels). Le point de cassure du chromosome X étant
toujours situé dans la région p21, il fût suggéré que le gène devait se retrouver
à cet endroit.
Le processus d'inactivation d'un chromosome X appelé lyonisation peut
expliquer le fait que certaines filles soient atteintes de DMD (Lyon, 1961). En
effet, tôt lors de I'embryogénèse survient la lyonisation mais puisque les
cellules ne peuvent inactiver un autosome, le chromosome X porteur du
fragment d'autosome demeure actif, forçant la cellule à inactiver le
chromosome normal.
D'autres études ont par la suite confirmé que le gène impliqué dans la DMD
était bien situé dans la région Xp21 (Murray, 1982, Davies, 1983, Boyd, 1987).
La position du gène connue, il restait maintenant à l'identifier. C'est en 1985
que Kunkel et al. ont analysé l'ADN d'un garçon présentant de nombreux
symptômes: granulomatose chronique, rétinite pigmentaire, retard mental,
syndrôme de McLeod et dystrophie musculaire de Duchenne. En utilisant la
technique d'hybridation d e sondes d'ADN complémentaire provenant de la
région Xp21, on a pu identifier quatre fragments d'ADN absents chez le malade.
Ces sondes ont par la suite été utilisées afin d'identifier le gène en cause.
En 1986, le groupe de Monaco et ni ont, par clonage positiomel, réussi à
identifier précisément le gène responsable de la dystrophie musculaire de
Duchenne. On a par la suite tenté de décoder l'ADN du gène puis identifier la
protéine qui en découle, la dystrophine (Hoffman et Kunkel, 1987).
Le gène de la dystrophine est le plus grand gène connu avec ses 2,3 millions de
nucléotides, soit près de 1% de la longueur totale du chromosome X. Il
contient 73 exow aiwi qu'un grand nombre de nucléotides ne participant pas à
la synthèse de la protéine ( 0,596 du gène participe à la transcription d'un
ARNm de 14 Kb)(Figure 1).
Le gène de la dystrophine est retrouvé sur le
Figure 1:
ciuomosome X au niveau de la région p21. Il est constitué de
2x106 paires de bases et contient 73 exons qui sont transcrits en un
ARNm de 14 Kb.
1.3.2 Localisation de la dystrophine
De façon à localiser la dystrophine, Hoffman et al (1989) a utilisé des
polypeptides synthétisés à partir de deux larges régions dlADNc provenant du
gène de la DMD des souriç mdx (modèle animal de la DMD). Pour ce faire, ils
ont hybridé ces fragments avec un gène d'E. coli puis incorporé le tout à
l'intérieur des bactéries. Les protéines correspondantes obtenues ont été
utilisées pour immuniser des animaux.
Les anticorps produits ont servi, après purification et sélection pour leur
spécificité, à localiser la dystrophine par immunohistochimie (Hoffman et al,
1987-88). Ils ont ainsi pu déterminer sa présence au niveau d u sarcolemme,
dans les muscles striés squelettiques des sujets normaux. Par contre, ils ont
constaté l'absence de dystrophine dans les muscles des patients souffrant de
myopathie de Duchenne ainsi que chez la souris mdx. D'autres auteurs ont
également confirmé ces résultats (Monaco et al, 1986; Chelley et al, 1988)(Figure
2) -
1.3.3 Structure de la dystrophine
La dystophine est une énorme protéine de 427 kDa contenant 3600 acides
aminés. Elle est codée par un gène de 2,5 millions de bases et traduite par un
ARNm de 14 kb. Elle représente 0,002% des protéines totales du muscle
squelettique et 5% des protéines liées au sarcolemme.
C'est une protéine du cytosquelette et elle possède d e nombreuses homologies
de structure avec la spectrine et l'a-actinine.
La dystrophine est formée de 4 domaines distincts (Koenig et al, 1988): La
région N-terminale fixant l'actine est constituée de 200-240 résidus aminés, la
partie centrale contituée de 26 séquences en triple hélice, une troisième région
riche en résidus cystéine et située entre les résidus aminés 3080-3360 et une
extrémité C-terminale contenant 420 acides aminés Ce domaine est lié au
complexe glycoprotéique (dystophin-associated glycoprotein complex ou DAG)
qui sert d'attache à la face interne d u sarcolemme (Figure 3).
Figure 2:
Localisation de la dystrophine par
immunohistochimie sur des coupes musculaires
provenant d'une souris normale (A) et d'une souris
dystrophique mdx (B).
Figure 3:
Modèle structural de la dystrophine et de ses
prot6ines associées. La dystrophine forme un
complexe glycoprotéique avec six autres protéines
membranaires, de façon à Lier la membrane
musculaire au cytosquelette interne des fibres
musculaires (A).
L'absence de dystrophine et de certaines de ses
protéines associées déstabilise le complexe et entraîne
la vulnérabilité accrue des fibres musculaires
dystrophiques (B).
Tirée de Enrasti et coll. 1991 (A).
Tirée de Hoffman. E.P. La recherche 1993, vol. 24 (B).
Normale
Dystrophique
1.3.4 Distribution de la dystrophine
Chez l'adulte, on peut distinguer deux isoformes: une de type musculaire et
une de type nerveuse. Une troisième isoforme dite de type hépatique, de plus
petit poids moléculaire, est largement répandue dans tous les tissus. La
dystrophine est donc retrouvée dans tous les types de muscles: striés
squelettiques, lisses et cardiaques ainsi qu'au niveau du système nerveux.
1.3.5 Fonctions de la dystrophine
Le rôle de la dystrophine retrouvée au cerveau est mal compris. Son absence
chez les patients DMD pourrait toutefois expliquer le retard mental quelquefois
observé. Par contre, la dystrophine d e type musculaire semble d'une grande
importance. Mokri et Engel (1975) ont démontré que la membrane des fibres
musculaires des patients DMD était rompue à certains endroits. Différents
groupes de recherche (Hoffman et al, 1988; Arahata et al, 1988; Rowland et al,
1988) ont permis de localiser par immunofluorescence, la dystrophine sous la
membrane plasmatique. Par la suite, Watkins et al. (1988) ont observé par
microscopie électronique que la protéine faisait vraisemblablement partie d'un
réseau intramembranaire. En 1989, Campbell et al ont démontré que la
dystrophine appartenait à un complexe glycoprotéique associé à la membrane.
Son rôle principal serait donc d'ordre mécanique et permettrait de renforcir la
rigidité du sarcolemme en servant d e lien entre ce dernier, le cytosquelette
cellulaire et la matrice extracellulaire. Le déficit en dystrophine, n'empêchant
pas la fonction contractile d u muscle, serait mieux perçu comme un facteur
déclenchant du phénomène dystrophique que comme un responsable direct.
L'intégrité des fibres musculaires dépourvues de dystrophine est grandement
compromise. En effet, elles deviennent plus vulnérables aux différentes
conditions stressantes, ce qui peut entraîner des perturbations de la
perméabilité membranaire, desquelles découlent la nécrose suivie d'une
fibrose cellulaire progressive.
CHAPITRE 2 LA TRANSPIANTATION DE MYOBLASTES COMME
AVENUE THÉRAPEUTIQUE POUR TRAITER LA DMD
L'histoire naturelle de la myopathie de Duchenne débute donc par une
mutation génétique qui entraîne un déficit en dystrophine. Il s'ensuit un état
pathologique déficitaire musculaire progressif accompagné de différentes
manifestations histologiques de dégénérescence/régénération. Un mécanisme
de régénération inadapté produit une fibrose progressive. Conséquemment,
différentes approches thérapeutiques peuvent être envisagées soit en
remplaçant directement la dystrophine absente ou en corrigeant l'anomalie
génétique par thérapie génique ou encore par transplantation de myoblastes
normaux. Enfin, de façon plus modeste, en tentant de contre-balancer le déficit
en dystrophine minimisant ainsi le processus de nécrose cellulaire.
Dans le présent mémoire, nous discuterons uniquement de la transplantation
de myoblastes.
2.1 La transplantation de myoblastes
Il s'agit de remplacer la dystrophine absente ou altérée en greffant des cellules
précurseurs saines, les myoblastes, qui délivrent le gène normal codant pour la
dystrophine fonctionnelle. Cette thérapie cellulaire est basée sur les travaux
initiaux de Partridge et al (1989) qui a démontré le pouvoir régénérateur des
myoblastes. Ils sont en effet capables de se multiplier et de f u i o ~ e entre
r
eux
ou avec les fibres musculaires de l'hôte pour former des cellules musculaires
multinucléées hybrides. Ces dernières sont, par la suite, capables d'exprimer la
dystrophine (Figure4).
2.1.1 Myogénèse et régénération musculaire
Les muscles sont constitués d'un regroupement de fibres musculaires striées et
multinucléées, formées pendant le développement e m b r y o ~ a i r epar la fusion
de myoblastes mononucléés. Ces fibres striées sont des structures complexes,
hautement différenciées et non-mitotiques.
Figure 4:
Principe de la transplantation de myoblastes.
Cette technique permet de remplacer la dystrophine
absente en injectant des cellules saines dans le
muscle dystrophique. Les cellules myoblastiques sont
obtenues par culture cellulaire suite à la digestion
enzymatique des fibres musculaires. n est possible
d'obtenir 60 000 myoblastes par gramme de muscle.
Par la suite, l'injection de ces cellules au sein des
muscles permet d'obtenir des fibres musculaires
hybrides contenant des noyaux normaux et des
n o y a u dystrophiques.
Tirée de Médecine Sciences 1991; 7: 821-829.
Un faible pourcentage des myoblastes embryonnaires ne fusionnent pas lors du
développement embryonnaire et tombent en quiescence, formant ainsi des
cellules satellites en périphérie des fibres musculaires (Figure 5). Ces dernières
peuvent être activées lors du bris de la fibre musculaire. C'est alors qu'elles se
différencient de nouveau et redeviennent des myoblastes ayant la capacité de se
diviser et de fusionner pour réparer la fibre brisée. C'est donc dire que la fusion
myoblastique se produit lors de la myogénèse et égaiement pendant la
régénération musculaire. Lorsque le bris cellulaire survient, les cellules
satellites entrent dans une phase de prolifération intensive. O n ignore encore
la nature du stimulus qui déclenche la prolifération des cellules satellites. Il
semble toutefois que l'information s'exprime à distance c'est-à-dire au-delà du
site de bris cellulaire (Pariridge et Sloper, 1977; Watt el al, 1987). Ce processus
est à la base de la transplantation de myoblastes.
2.1.2 La transplantation de myoblastes chez la souris
Les premières transplantations de myoblastes chez la souris ont été effectuées
en 1988 par Peter Law et son équipe. Ils ont greffé des myoblastes dans le
soléaire des souris dystrophiques C57BL/6J @ Y / ~ Y ) Cette lignée de souris sert
uniquement de modèle phénotypique pour la DMD car la mutation qui la rend
dystrophique n'est siîuée ni sur le gène de la dystrophine ni même sur le
chromosome X. Quoi qu'il en soit, Law a constaté que 6 mois après I'injection
des cellules, le muscle greffé contenait plus de fibres à l'aspect normal que le
muscle témoin contralatéral. Les paramètres observés étaient I'augmentation
de la masse, le nombre de fibres ainsi que le potentiel de repos, c'est-à-dire la
différence de potentiel entre l'intérieur et l'extérieur des fibres musculaires.
Une augmentation significative de tous ces paramètres a permis d e conclure
qu'il existait un plus grand pourcentage de fibres saines dans le muscle greffé
par rapport au muscle témoin. Par ailleurs, ils ont pu observer une
augmentation de la force de contraction isométrique maximale et de la tension
tétanique. Selon Law, deux mécanismes pouvaient expliquer ce succès.
D'abord, les myoblastes normaux du donneur pouvaient fusionner pour
former des myotubes normaux ayant la capacité de remplacer les fibres
dys trophiques.
Figure 5:
Distribution des cellules satellites. Les cellules
satefites sont situées sous Ia membrane
sarcoplasmique des fibres musculaires (flèche). On
peut voir une cellule satellite en coupe longitudinale
(A) et transversale (B). Les lettres A, B et C font
correspondre les fibres musculaires en A et en B.
Ensuite, les myoblastes normaux pouvaient fusionner avec les myoblastes
déficients a . de former des fibres musculaires hybrides capables d'exprimer la
protéine absente chez la souris dystrophique. Le produit du gène s'avérait donc
être le facteur manquant puisque sa présence permettait de corriger le
phénotype de la dystrophie.
Par la suite, la découverte d'un modèle pour la DMD, la souris mdx, a permis à
Partridge et al (1989) de démontrer que suite à l'injection de myoblastes
normaux dans les muscles de ces souris, on pouvait observer l'apparition de
dystrophhe sous la membrane des fibres musculaires.
D'autres travaux ont permis d'établir que même en détruisant le potentiel de
cellules satellites de l'hôte par irradiation, il était possible d'obtenir, après
transplantation de myoblastes, une régénération quasi complète du muscle
chez la souris et chez le chien.
Par ailleurs, Morgan (1990) a obtenu 70% de fibres musculaires exprimant de la
dystrophine suite à la greffe de myoblastes normaux dans un muscle
dystrophique irradié. Ces expériences démontrent bien la capacité qu'ont les
myoblastes transplantés à régénérer le muscle hôte.
2.1.3 Le modèle animal de la DMD: la souris m d x
Le modèle murin d e la DMD possède une mutation ponctuelle qui remplace
un codon d'acide aminé par un codon stop (Sincinski, 1989). Ceci provoque la
terminaison prématurée d u polypeptide et se traduit par l'absence de
dystrophine dans les muscles de la souris mutante. 11 est important de
mentionner l'absence du phénotype caractérisant la pathologie chez les patients
atteints de DMD. En effet, la progression de la maladie décrite chez l'humain
ne se retrouve pas chez la souris. On observe chez cette dernière un
développement normal des muscles, suivie par une myonécrose vers les 20
jours. Par la suite, on remarque une amélioration du muscle du point de vue
histologique et la souris ne développe pas la nécrose suivie de fibrose
caractéristique à l'humain (Partridge, 1991). C'est pourquoi la souris mdx est
un excellent modèle biochimique et génétique de la DMD mais ne peut servir
comme modèle phénotypique.
2.1.4 Les différents protocoles de transplantations effectuées chez la souris par
l'équipe du Dr. Tremblay
Trans~lantationssvneeniaues
Les transplantations d e myoblastes histocompatibles pour tous les antigènes
d'histocompatibilité (génétiquement identiques à ceux d u receveur) ont
conduit à des résultats très intéressants i.e. au-delà d e 90% de fibres muscdaires
ayant la capacité d'exprimer la dystrophine, plusieurs semaines après la greffe
(Vilquin et al. , 1995).
Trans~lantationsalloincornva tibles
Les transplantations d e cellules histoincompatibles pour le complexe majeur
d'histocompatibilité se sont soldées par un rejet aigu et en aucun temps après la
greffe, les fibres n'exprimaient de la dystrophine. L'infiltration lymphocytaire
importante et la détection des ARNm de granzyme B et dlIFN-y sont des
évidences que cet échec pourrait être imputable aux réactions immunitaires en
réponse à la greffe (Guérette et al., 1995).
Transdantations sous immunosu~~ression
L'équipe du Dr. Tremblay a donc procédé à d'autres transplantations
histoincompatibles, cette fois-çi en prenant soin de contrôler la réponse
immunitaire du receveur à l'aide d'immunosuppresseurs tels la cyclosporine
A (CyA), le FK 506, la rapamycine, la cyclophosphamide et le RS 61443.
Parmi les agents irnmunosuppresseurs utilisés, le FK 506 a donné les meilleurs
résultats. Lors de transplantations histoincompatibles pour le CMH, l'équipe
du Dr. Tremblay a obtenu plus de 80% de fibres musculaires positives pour la
dystrophine et/ou P-galactosidase dans les muscles greffés (Kinoshita et al.,
1994).
Par ailleurs, la plupart des souris traitées au FK 506 n'ont pas développé
d'anticorps dirigés contre les myoblastes. Cet agent exerce donc un excellent
contrôle sur la réponse immunitaire humorale. Toutefois, le FK 506
n'empêche pas l'infiltration cellulaire (Kinoshita et al., 1994).
Le FK 506 a été isolé en 1984, à partir d'une souche de S t r e p t o m y c e s
tsukubaenses. Tout comme la cyclosporine, le FK 506 inhibe la production
d'interleukine-2 (IL-2)par les lymphocytes T. Ce dernier est cependant de 50100 fois plus efficace que la cydosporine (Kino, 1987).
L'efficacité de la rapamycine a également été testée par Vilquin et al. (1995), qui
ont démontré que cet agent empêche toujours la formation d'anticorps chez
l'hôte et favorise le contrôle du système immunitaire permettant ainsi
l'apparition de fibres positives pour la dystrophine dans les muscles greffés.
La cyclophosphamide (CPA) a également été étudiée (Vilquin et al.., 1995). Les
résultats se sont avérés plutôt médiocres avec peu ou pas de fibres positives
pour la P-galactosidase suite aux transplantations sous immunosuppression.
La CPA a bien réduit la réponse humorale et on explique ces piètres résultats
par l'action toxique de cette drogue qui provoquerait des dommages
irréversibles sur les myoblastes injectés.
La
cyclosporine
seule
ou
en
combinaison
(CyA+Azathioprine+methylprednisone)n'a pas donné les résultats escomptés.
En effet, son efficacité était beaucoup trop variable et on retrouvait des
anticorps dirigés contre les myoblastes greffés dans la moitié des cas (Vilquin et
al.,, 1994).
A
utilisée
Le RS 61443 s'est avéré complètement inefficace à empêcher la formation
d'anticorps (Vilquin et al., 19%).
2.1.5 La transplantation de myoblastes chez l'humain
Premières tentatives
Les équipes qui ont effectué des transplantations de myoblastes chez l'humain
sont au nombre de cinq: celle de P.K.Law ( Memphis, Tennessee, USA), celle
de R. Miller ( San Francisco, Californie, USA), celle de G. Karpati (Montréal,
Québec, Canada), et celle de J.P. Tremblay (Québec, Québec, Canada). Plus
récemment, Mendel et son équipe ont également tenté ce genre de
transplantations, mais aucun résultat n'a été publié jusqu'à présent. Nous
allons nous attarder plus particulièrement aux travaux effectués par notre
équipe. Par la même occasion, nous verrons brièvement les différents
protocoles expérimentaux utilisés par les autres équipes.
Chacun des protocoles comportent des différences majeures. La sélection du
donneur est un des paramètres importants. Les trois premiers groupes ont
choisi des individus apparentés aux receveurs tels que le père ou le frère. Le
greffon n'était donc pas parfaitement histocompatible. Ils ont évidemment dû
employer des immunosuppresseurs tels la cyclosporine A (CyA) et la
cyclophosphamide afin de prévenir le rejet. Malheureusement, ces composés
ont des effets secondaires importants surtout lorsqu'ils sont utilisés sur une
longue période. La CyA est néphrotoxique et à la longue, elle peut être la cause
de myopathies (Goy, 1989). Quant à la cyclophosphamide, elle peut entraîner
une pancytopénie, une neutropénie ou encore une cystite hémorragique.
Chez le docteur Tremblay, des donneurs histocompatibles ont été utiIisés de
manière à réduire les risques de rejet immunologique, sans toutefois employer
d'immunosuppresseur. Le dormeur était donc compatible avec le receveur
pour les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe 1 (HLAA, -B, -C) et de classe II (HLA-Dr). Cette restriction dans le choix des donneurs
est nécessaire puisque les myoblastes expriment fortement les HLA de classe 1
(Roy, 1990; Hohlfeld, 1990) et peuvent dam certaines circonstances exprimer les
HLA de classe II (Roy, 1991; Hohlfeld, 1990). Les femmes hétérozygotes ont pu
servir comme donneuses puisque 50% des clones de myoblastes cultivés
peuvent exprimer de la dystrophine, ce qui est amplement suffisant.
L'âge des receveurs constitue un autre paramètre expérimental important. Les
trois premières équipes ont pratiqué les transplantations chez des sujets
relativement jeunes, âgés entre 4 et 10 ans. En effet, la transplantation semble
être plus efficace chez de jeunes patients. L'equipe du Dr. Tremblay a préféré
effectuer les transplantations chez des adolescents déjà passablement atteints
plutôt que de risquer une perte de la fonction motrice suite à un éventuel rejet.
Il est déjà connu qu'une histocompatibilité parfaite entre donneur et receveur
n'écarte pas nécessairement la possibilité d'un rejet immunologique pouvant
être causé par la présence d'antigènes non-CMH, ce qui constitue d'ailleurs le
sujet principal de ce mémoire.
Le choix du muscle injecté diffère également d'une équipe à l'autre. Celle de
Dr. Law a opté pour l'extenseur propre du gros orteil et I'extenseur commun
des orteils, évitant ainsi les risques de perte de fonction importante. Les
premières injections du Dr. Karpati ont été faites dans le biceps bradual. Enfin,
les groupe du Dr. Miller et du Dr. Tremblay ont choisi de greffer au niveau du
jambier antérieur.
De plus, le nombre de myoblastes injectés variait d'une équipe à l'autre, entre 4
et 100 millions selon les protocoles. Nous avons débuté par une première
transplantation de 4 millions de myoblastes suivie de deux injections
consécutives de 10 et 50 millions de myoblastes. Nous seuls avons répété la
greffe plus d'une fois et dans plus d'un muscle.
Les résultats obtenus sont encourageants quoique insuffisants. En effet, neuf
patients DMD âgés entre 6-16 ans ont été transplantés. 11 a été observé que le
transfert de myoblastes permettait de réintroduire le gène sain et que certaines
fibres étaient capables d'exprimer de la dystrophine, quelques semaines après la
greffe. Cependant, I'expression de dystrophine a diminué en fonction du
temps. Il a également été vérifié que la force volontaire du muscle injecté a
augmenté de façon transitoire chez les patients plus âgés pour revenir au
même niveau que les muscles non-greffés (Huard et al., 1991; Tremblay et al.,
1991).
2.2 Problème majeur relié à la transplantation de myoblastes
Les résultats préliminaires de transplantation chez le modèle animal et chez
l'humain sont un pas important dans la quête d'un traitement pour la DMD.
Néanmoins, les différentes études chez l'humain ont démontré un succès
plutôt mitigé puisque la dystrophine, lorsqu'elle est exprimée suite à la greffe,
l'est uniquement sur une courte période. Les facteurs pouvant être mis en
cause sont nombreux: les conditions de culture des myoblastes du donneur et
la mort cellulaire au moment de la greffe, la migration limitée des cellules
greffées à partir du site d'injection et majoritairement, la haute surveillance du
système immunitaire du receveur face aux antigènes retrouvés sur les cellules
du donneur. Ce sont les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité
(CMH) qui sont d'abord responsables de la reconnaissance puis du rejet
immunitaire. Par ailleurs, même dans le cas d'une histocompatibilité parfaite
entre le donneur et le receveur, le problème du rejet persiste. Ce sont alors les
antigènes mineurs d'histocompatibilité (AgMH) retrouvés sur les cellules
greffées qui pourraient être mis en cause et qui feront l'objet du présent
mémoire. Les deux systèmes antigéniques (CMH) et (AgMH) seront traités
dans les chapîtres 3 et 4.
CHAPITRE 3 LA RECONNAISSANCE ALLOGENIQUE ET LE REJET DE
GREFFE
La transplantation d'organes ou de cellules fait couramment partie des
approches thérapeutiques dans les cas de dysfonctions d'organes et de maladies
dégénératives chroniques. Les récents développements en techniques
chirurgicales, les nouvelles formes d'immunosuppression en plus de l'avance
énorme concernant les connaissances en immunobiologie ont permis
d'améliorer grandement les succès de greffes. Quoi qu'il en soit, les échecs sont
encore possibles et le rejet chronique en demeure l'une des causes principales.
Il est donc important de bien connaître la biologie du système immunitaire,
l'un des principaux responsables du phénomène de rejet, et ainsi améliorer les
chances de survie du greffon.
3.1 La reconnaissance allogénique
Le phénomène de la reconnaissance allogénique a été remarqué pour la
première fois lors de transplantations de tissus incompatibles. Ainsi, le rejet de
greffes allogéniques a mené à l'identification du complexe majeur
d'histocompatibilité ( C m )et de ses produits, qui furent d'abord appelés
antigènes de transplantation».
Le CMH joue un rôle complexe dans la discrimination immunitaire entre les
molécules du «soi» et du mon-soi,) et promeut la détection et l'éradication des
agents infectieux. Par ailleurs, on sait depuis longtemps que les tissus
incompatibles a u niveau du CMH peuvent induire une forte réponse
immunitaire primaire in vitro comme il est possible de le voir dans les
réactions croisées de lymphocytes. Une des raisons principales pouvant
expliquer la vigueur de la réponse allogénique est le haut pourcentage de
lymphocytes T étant impliqués dans la reconnaissance des molécules du CMH
allogénique. On peut résumer ce phénomène par le fait que les alloantigènes
peuvent être présentés de plusieurs manières, recrutant ainsi un plus grand
nombre de cellules lors de la réponse allogénique.
3.2 Le complexe majeu d'histocompatibilité
La participation obligatoire du complexe majeur d'histocompatibilité lors de la
reconnaissance d'un antigène étranger par les lymphocytes T fait de ces
molécules le pivot central de la régulation de la réponse immunitaire et ce, à
différents niveaux, notamment dans la détermination d e I'immunogénicité
moléculaire, dans la sélection d u répertoire des lymphocytes T, dans
l'allogénicité ainsi que dans I'autoimmunité.
C'est lors de recherches sur le cancer que l'on a découvert le C H . Durant la
première partie du 20e siècle, les études sur la biologie du cancer ont permis
d'établir cinq lois concernant la transplantation. (1) les isogreffes sont bien
acceptées (2) les allogreffes sont rejetées (3) les tissus provenant de la souche
parentale et greffés chez un animal de la première génération (FI)sont acceptés
(4) les tissus provenant des parents et greffés aux animaux de la deuxième
génération (F2) sont acceptés en partie seulement (5) les tissus provenant de F2
ainsi que des générations subséquentes sont bien acceptés par FI (Snell, 1981).
Donc comme il était possible de propager des tumeurs uniquement chez des
souris génétiquement très apparentées (inbred), il fût proposé que la base de ce
phénomène était la reconnaissance immunologique, par le système
immunitaire, de molécules associées aux différents tissus. Ces molécules,
uniques pour une souche donnée d'un animal, peuvent diriger la
r e c o ~ a i s s a n c eet le rejet d'un tissu étranger provenant d e la transplantation
chez un receveur génétiquement différent.
3.2.1 Organisation génétique du CMH
Le CMH est un ensemble de plus de 40 gènes qui sont regroupés de façon très
rapprochée sur le chromosome 6 chez l'humain et 17 chez la souris. Le
complexe HLA (Human Leukocyte Antigens) occupe une région de 3500 kb
d'ADN chez l'humain et le complexe H-2 pour sa part, occupe 1500 kb d'ADN
chez la souris. HLA et H-2 codent pour trois classes de molécules (classe 1, II, III
) Nous verrons les 2 premières classes seulement. Les HLA de classe 1 et II
sont des gènes hautement polymorphes, ce qui agrandit considérablement le
répertoire immunologique de chaque individu, créant ainsi un haut degré
d'histoincompatibilité au niveau d'une population.
Les HLA de dasse 1 comprennent HLA-A, -8,-C en plus des non-classiques
découverts récemment; HLA-E, -F, -Gr -H et -J. Ils sont constitués d'une chaîne
a-polymorphique associée avec une chaîne p2-microglobuline nonpolymorphique. Ces antigènes sont présents sur la plupart des cellules
nucléées et sont particulièrement abondants sur les cellules lymphoïdes et sur
l'endothélium vasculaire. (Figure 6).
Les molécules HLA d e classe II comprennent 6 sous-régions: DN, DM, DO, DP,
DQ, DR. Elles sont formées de 2 chaînes a et p, liées ensemble d e façon
covalente. Les antigènes de classe II sont fortement exprimés par les cellules
présentatrices d'antigènes (CPA), les lymphocytes B, les cellules dendritiques
des capillaires et les macrophages, ainsi que par les lymphocytes T activés
(Figure 7).
L'expression des molécules du CMH sur les cellules endothéliales et sur les
macrophages est grandement influençée par les différents médiateurs
immunologiques. Plusieurs cytokines induisent les antigènes de classe 1 (IFNa,p, y ) , Iymphotoxines (TNF a et TNF B ). L'induction des antigènes de classe
II est plus réduite, étant réservée à I'IFNy.
3.2.2 Rôle du CMH dans la présentation de l'antigène
Les molécules de classe 1 et II situées à la surface des cellules peuvent lier les
antigènes. Habituellement, la présentation par le CMH de classe II est réservée
aux phagocytes professiomels que sont les monocytes/macrophages et les
cellules endothéliales. Ces derniers ont la capacité d'endocytoser les protéines
exogènes puis de présenter les produits de la protéolyse (petits peptides ) sur la
surface cellulaire, en association avec les molécules de dasse II du CMH. Les
lymphocytes T-auxiliaires reconnaissent le complexe CMH classe II/peptide via
leur récepteur et répondent de façon appropriée.
Figure 6:
Diagramme représentant la molécule du CMH de
classe 1. La niche peptidique est située entre les
domaines al et a2,alors que le domaine a3 sert
d'ancrage dans la membrane cytoplasmique. La PZmicroglobuline s'associe au complexe de façon noncovalente.
Tirée de Mohanakumar, T. 1994.
Peptide
Bindhg
C=lcIt
n
Membrane
Class 1 MHC
Figure 7:
Diagramme représentant la molécule du CMH de
classe II. La niche peptidique est formée par les
domaines al et pl alors que les domaines a2 et 82
servent d'ancrage dans la membrane cytoplasmique.
Tirée de Mohanakumar, T. 1994.
Peptide
Bindiag
UeR
r
Membrane
CIass II MHC
Les protéines endogènes synthétisées à même la cellule sont, quant à elles,
transferrées au réticulum endoplasmique où elles s'associent avec la molécule
de classe 1 et la f52-microglobuline. Ce complexe est ensuite <<processé»à travers
une série de compartiments intracellulaires jusqu'à la surface cellulaire où il
sera reconnu par les lymphocytes T-cytotoxiques. La présentation des protéines
endogènes n'est pas limitée aux CPA puisque toutes les cellules expriment les
CMH de classe I et ont la capacité de présenter l'antigène en association avec les
molécules de classe 1. Les CPA ne font toutefois pas la différence entre les
protéines d u «soi. et du «non-soi». Ils présenteront n'importe laquelle
protéine endogène synthétisée. La discrimination entre le «soi» et le «non-soi»
est plutôt l'affaire du lymphocyte T.
3.2.3 Les lymphocytes T: immunité versus tolérance
La réponse immunitaire cellulaire semble être exclusivement dominée par les
lymphocytes T. Ceux-ci possèdent un complexe moléculaire, le TcR, existant
sous deux farmes hétérodimériques, le classique TcR-aB et le plus récemment
décrit, le TcR-y6 qui demeure mal défini et fait toujours l'objet d'études. Le
TcR-ap permet de reconnaître les molécules de classe I et II du CMH en
association avec un peptide.
Les récepteurs des antigènes sont générés de façon continuelle par
réarrangements aléatoires de segments d'ADN codants pour les parties
variables des récepteurs. Ainsi, des récepteurs spécifiques pour les antigènes du
mon-soi. et également du «soi. sont obtenus. C'est donc dire que la
discrimination par le système immunitaire ne peut être acquise génétiquement
et doit être apprise. Les cellules T doivent apprendre la tolérance face à ses
propres protéines.
3.2.4
Éducation thymique et tolérance naturelle
C'est au niveau du thymus que les lymphocytes T-auxiliaires et T-cytotoxiques
subissent la maturation et la sélection au bout desquelles ils deviennent
immunocompétents et peuvent reconnaître un antigène en association avec le
CMH. La sélection, en ce qui concerne la spécificité du TcR, met en jeu deux
mécanismes. Le premier ayant lieu au moment d e l'expression du TcR
membranaire est la sélection positive et se fait parmi les cellules T qui
réagissent avec le «soi)>.Le «soi» est représente par les molécules de classe 1 et
II du CMH exprimées sur les cellules épithéliales, dendritiques et stromales du
thymus. Ainsi, cette sélection positive entraîne la prolifération et la
différenciation exclusive des clones auto-réactifs.
Le second mécanisme est la sélection négative permettant l'élimination des
cellules T ayant une trop forte affinité pour les molécules du CMH du «soi» ou
bien pour les molécules du CMH du <<soi.en association avec les antigènes du
.soi» (tolérance). Ce dernier cas pourrait mener au grave problème que posent
les maladies autoimmunes. C'est à cette étape que l'on doit générer le
répertoire antigénique des lymphocytes T.
Les antigènes d u CMH ont été identifiés comme les antigènes
d'histocompatibilité de par l'évidence de leur rôle dans le rejet de greffes
allogéniques Un paradoxe en immunologie qui donne lieu à de nombreuses
questions: le haut pourcentage de lymphocytes T (1 sur 10) ayant la capacité de
reconnaître les alloantigènes de classe I et II du CMH, et ce, indépendamment
de peptides étrangers. A première vue, ce fait semble contradictoire avec
l'hypothèse connue de la restriction au CMH disant que pour être activés, les
lymphocytes doivent reconnaître un antigène étranger dans le contexte d'un
même CMH. Des résultats expérimentaux suggèrent que le haut degré de
reconnaissance des molécules d u CMH allogénique pourrait signifier la
recomaissance d'un CMH étranger, perçu à la façon d'une molécule du «soi>)
altérée. En effet, il existe une similitude suffisante entre le C M . allogénique et
CMH du soi pour que la molécule allogénique soit reconnue comme «soi + X».
De plus il a été démontré qu'un clone de cellules T donné peut avoir deux
spécificités: antigène+CMH d u soi et CMH allogénique en absence d'un
antigène. C'est donc dire qu'au niveau d'une population, le pool cellulaire est
capable de répondre essentiellement à n'importe lequel CMH allogénique.
3.2.6 Le CMH et la reconnaissance allogénique
Le CMH joue un rôle complexe dans la discrimination des molécules du soi et
celles qui lui sont étrangères. Ainsi, il permet la détection et l'éradication des
différents agents infectieux. Des mécanismes immunitaires similaires
permettent la reconnaissance des alloantigènes. La compréhension de ces
mécanismes est basée sur deux propriétés du CMH. La première est sa capacité
de présenter un peptide donné sur la surface cellulaire pour faciliter la
discrimination du soi et d u non-soi. La deuxième est l'extrême diversité
génétique du CMH, diversité évidente chez chaque individu par l'expression
codominante des HLA de classe I et Il[.
3.2.7 Reconnaissance de l'alloantigène par les lymphocytes
Par des mécanismes variés, les protéines endogènes et exogènes sont
protéolytiquement clivées en fragments peptidiques, de composition qui
dépend de la séquence en acides aminés des protéines ainsi que des enzymes
protéolytiques disponibles. De ces pepides, seuls quelques-uns possèdent la
conformation nécessaire pour lier la molécule de CMH et seuls ces peptides
peuvent devenir disponibles pour la reconnaissance cellulaire par les
lymphocytes T. Il est estimé qu'approximativement 1%des peptides peuvent
s'insérer dans une molécule particulière du CMH de classe 1. Dans la
population, chaque individu exprime de 4 à 6 allèles différents du CMH,
chacun pouvant lier une sous-classe de peptides différents. C'est donc dire que
les molécules de classe 1 et II du CMH peuvent théoriquement présenter
environ 6% de tous les peptides provenant des protéines endogènes et
exogènes. Apparemment, cela semble offrir un échantillon protéinique
suffisant pour la discrimination immunologique des protéines du soi et du
non-soi. En général, seuls les peptides qui sont dérivés des protéines
autologues et qui sont liés au CMH autologue peuvent être reconnus
immunologiquement comme soi. Tout les autres peptides sont par définition
les "non-soi" et sont reconnus comme étrangers. Ceci inclut les peptides
dérivés des protéines autologues qui ne lient pas le CMH autologue aussi bien
que les peptides dérivés des protéines étrangères qui sont liés au CMH
autologue. Le mécanisme est d'autant plus complexe si l'on pense que les
cellules T s'engagent aussi bien avec les molécules du CMH autologues
qu'allogéniques. Donc les cellules présentatrices d'antigènes (CPA) peuvent
provenir de l'hôte et de la greffe.
Ces faits rendent la réponse immunitaire allogénique beaucoup plus complexe
que la réponse à un agent infectieux. En effet, à cause des multiples manières
dont un alloantigène peut être présenté, un plus grand nombre de lymphocytes
T est impliqué dans la réponse allogénique. En effet, alors qu'un antigène
nominal comme la toxine de Clostridium tetani implique 1/50 000 cellules T
pour un seul mécanisme de reconnaissance utilisé, la réponse à un
alloantigène engage environ 1/2000 cellules T. On peut ainsi expliquer la forte
intensité de la réponse immunitaire primaire lors d'un phénomène de rejet.
Il existe au moins trois façons pour les lymphocytes T de reconnaître les
alloantigènes: (1) les peptides allogéniques dans le contexte d'un CMH
autologue, (2) les peptides allogéniques dans le contexte d'un CMH allogénique,
(3) les peptides autologues dans le contexte d'un CMH allogénique.
(1)Peptides allogéniques /CMH autologue
Il existe des protéines d u CMH allogénique provenant du greffon qui
demeurent disponibles pour le système immunitaire du receveur. Ces
protéines peuvent être traitées par les CPA et les peptides obtenus sont
présentés via le CMH autologue de la même façon que les protéines exogènes
(Figure 8).
(2) Peptides allogéniques/ CMH allogénique
Il est clair que les cellules T du receveur peuvent reconnaître les peptides
présentés par les CPA du donneur dans le contexte d'un CMH allogénique.
Pour les molécules de classe 1 sur les CPA allogéniques, ces peptides sont
présumément dérivés des protéines endogènes comme les molécules
allogéniques du CMH elles-mêmes (Figure 9).
Figure 8:
Diagramme démontrant que des peptides provenant
des protéines ailogéniques peuvent être présentés aux
lymphocytes CD4+ du receveur en association avec
ses propres molécules du CMH de classe II.
Figure 9:
Diagramme démontrant que des peptides provenant
des protéines allogéniques endogènes se retrouvent
en association avec les molécules du CMH de classe 1
du donneur et sont présentés a u lymphocytes CD$+
du receveur.
Tirées de Mohanakumar, T. 1994.
l
ALLOGENEIC PEPTIDES / AUTOLOGOUS MHC
3
C
I
I
/
/
&
&
CEU
AiiûGENElC PEPTiDES / AUOGENEIC MHC
Figure 10:
Diagramme démontrant que des peptides provenant
des protéines du receveur sont disponibles pour lier
les molécules du CMH de classe II retrouvées au
niveau du greffon afin d'être présentés au
lymphocytes CD4+.
Tirée de Mohanakumar, T. 1994.
AUTOLOGOUS PEPTIDES / ALLOGENEIC MHC
R
RECIPIENT
CL>.+ T = E U
(3) Peptides autologues/ C m allogénique
Cette situation se présente lorsque les peptides provenant des protéines
autologues du receveur étant incapables de lier les molécules autologues du
CMH se lient aux molécules de dasse I et II situées sur les CPA au niveau du
greffon. Ainsi les peptides dérivés des protéines du receveur peuvent être
présentés dans une conformation légèrement différente par les molécules d u
CMH du donneur et être reconnus comme étrangers (figure 10).
3.3 Réponse humorale aux alloantigènes du CMH
Les anticorps anti-CMH se développent en réponse à un contact avec les
molécules du CMH étranger, soit par transfusion, grossesse, ou transplantation
de tissu. La réponse initiale au CMH étranger se traduit par la production
d'IgM. Etant donné que les molécules du CMH sont d'importantes
stimulatrices de lymphocytes T, la réponse humorale est rapidement
déclenchée. On assiste alors à une expansion clonale des lymphocytes B, ainsi
qu'au changement de classe des immunoglobulines (Ig) en IgG ou IgA.
Des alloanticorps sont retrouvés chez les receveurs après une transplantation
d'organe de façon très variable. La production d'anticorps chez chaque patient
peut se situer entre 10% et 80%. Par ailleurs, à la suite d'un rejet de greffe on
retrouve des alloanticorps sériques chez 10% des patients seulement. Les
raisons de cette grande variabilité sont incertaines mais pourraient être reliées
aux stratégies immunosuppressives utilisées pour les receveurs d'organes.
Les facteurs qui influencent la réponse humorale aux antigènes du CMH sont:
(1) lïmmunogénicité des molécules du CMH et de leurs épitopes, (2) la
prévalence du type de classe de CMH retrouvé sur le greffon, (3) la voie
d'immunisation, (4) lïmmunocompétence de l'hôte.
3.4 Mécanisme de rejet suivant l'allotransplantation
Le rejet immunologique d'une allogreffe est habituellement orchestré par les
lymphocytes T qui s'attaquent aux cellules endothéliales et parenchymales
portant les antigènes d'histocompatibilité étrangers, par cytotoxicité directe OU
bien par libération de cytokines.
La réponse cellulaire est initiée par les lymphocytes lorsque le récepteur TcR
reconnaît et se lie au complexe peptide/CMH. Cette interaction est nécessaire
quoiqu'insuffisante pour l'activation des cellules T et la prolifération clonale.
Une autre catégorie de récepteurs, les molécules d'adhésion, doivent également
être présentes afin de favoriser le contact CPA/lymphocyte en plus de fournir
les signaux complementaires à l'activation des cellules T.
Les mécanismes de rejet impliquent deux types cellulaires: les lymphocytes Tcytotoxiques dans la lyse cellulaire et les lymphocytes T-auxiliaires dans la
réaction inflammatoire dérivée de la libération de lymphokines. Dans la
plupart des cas, on retrouve les deux classes de CMH au niveau du greffon et
par le fait même, la double incompatibilité qui provoque l'activation
simultanée par les deux types cellulaires.
Les cytokines importantes sécrétées par les lymphocytes lors d'un rejet sont IL2, IFN-y et nuF-P. L-2 déclenche la prolifération cellulaire et est également
chimiotactique pour les cellules T. L' IFN-y incite les macrophages à devenir
plus cytotoxiques et augmente l'expression des antigènes du CMH sur plusieurs
types de cellules. Le TNF-B cause la lyse des cellules sans contact cellulaire.
Les perforines, incluant le granzyme B, sont des protéines exprimées
uniquement par les lymphocytes T-cytotoxiques activés. Ces protéines sont
retrouvées à l'intérieur de granules cytoplasmiques et sont libérées par
exocytose contre des cellules cibles spécifiques du greffon (Guérette, 1995).
Dans le présent projet de recherche, ce sont 1 ' W - y e t le granzyme B qui seront
détectés pour confirmer l'activation des cellules immunitaires infiltrantes suite
aux greffes.
CHAPITRE 4 LES ANTIGENES MINEURS D'HISTOCOMPATIBILTTÉ
ANTIGENES NON-CMH
ET LES
Les antigènes mineurs d'histocompatibilité sont connus depuis le début des
transplantations. Ils sont définis comme étant des alloantigènes retrouvés sur
la surface cellulaire. Leur appellation implique qu'ils induisent le rejet de
greffes pratiquées entre donneurs et receveurs génétiquement identiques pour
tous les loci des antigènes du CMH. Malgré leur appellation .mineur., ces
antigènes sont capables dans certains cas, de déclencher des réponses
immunitaires vigoureuses. La biologie et la génétique de ce système
antigénique ne sont pas encore très bien comprises et son existence demeure la
bamère principale à certains types de transplantations notamment la greffe de
moëlle osseuse. Ce dernier cas donne lieu à la maladie du greffon contre l'hôte
(GVHD), pathologie grave et souvent fatale. Les cas cliniques de rejet de greffes
et la GVHD rencontrée chez des patients donc le greffon est HLA-compatible
sont l'évidence même de I'existence des antigènes mineurs.
4.1 Identification et isolement des gènes codants pour les AgMH.
La méthode utilisée par Snell et al. (1976) pour isoler et identifier les gènes des
AgMH a été la production de souches de souris congéniques résistantes. Une
souche congénique est définie comme une souche identique à une autre
souche (inbred) exception faite d'un segment de chromosome introduit par le
croisement avec une autre souche non-apparentée. Dans ce cas, le segment de
chromosome étranger comporte des gènes codants pour des antigènes
d'histocompatibilité différents et on dit que la souche est congénique résistante
puisque que les greffes effectuées entre celle-çi et la souche ainbred), de départ
seront rejetées.
À l'aide de nombreux (<backcrossing»,
Bailey (1975) a réussi à établir 25 lignées
congéniques à l'aide des souches histocompatibles BalB/c et C57BL/6. Ces
lignées de souris sont très utiles pour l'étude des AgMH par transplantations
tissulaires ou par essais fonctionnels de lymphocytes T. Il est important de
comprendre que ces souches ne diffèrent pas par un seul locus mais plutôt par
un segment de chromosome qui peut contenir plus d'un gène codant pour
plusieurs AgMH (Bailey, 1982).
Les estimations théoriques basées sur les études de transplantation et de
&reeding» laissent croire qu'il existerait un très grand nombre d'antigènes
mineurs, probablement plusieurs centaines. On peut s'attendre à ce que d e w
individus non apparentés comportent de nombreuses disparités antigéniques.
L'identification des AgMH chez l'humain est difficile car s'il est relativement
rare de rencontrer dans la population des individus génétiquement identiques
au niveau des CMH, il est encore plus difficile de trouver des individus qui
diffèrent pour un seul locus dlAgMH. Donc, dans le cas où d e w individus
seraient compatibles pour le CMH tout en comportant des différences multiples
au niveau des loci d'AgMH, il est impossible d'étudier le rôle de chacun des
locus séparément.
4.2 L'antigène mâle H-Y
L'AgMH humain le mieux défini est l'antigène mâle H-Y. Il est facile à étudier
puisque seuls les mâles le possèdent. On l'a remarqué lors de transplantations
syngéniques de peau provenant de souris mâles et effectuées sur des femelles
(Simpson, 1983).
Comme pour les autres antigènes d'histocompatibilité, ce sont les lymphocytes
T qui sont impliqués dans le rejet cellulaire via les AgMH et il est possible de
cultiver ces cellules in vitro. Puisque les anticorps ne réagissent pas avec
l'antigène H-Y,ce sont les lymphocytes T auxiliaires et cytotoxiques qui sont
utilisés pour l'étude de cet antigène qui ne semble pas démontrer de
polymorphisme.
Le gène Hya codant pour l'antigène H-Y est situé sur le bras court du
chromosome Y de la souris et est intimement lié au gène Tdy impliqué dans la
formation des testicules (McLaren,1988). Chez l'humain, le gène codant pour le
facteur de détermination des testicules est situé sur le bras court du
chromosome Y alors que l'antigène H-Y est retrouvé sur le bras long (Simpson,
1987).
4.3 Différences principales entre CMH et AgMH
Les caractéristiques principales des antigènes mineurs qui les différencient des
antigènes du CMH sont l'intensité de la réaction de rejet, la capacité à induire la
formation d'anticorps et l'organisation génétique. Contrairement aux
antigènes du C H , les AgMH sont généralement moins immunogéniques et
ne favorisent pas la formation d'anticorps. De plus, les gènes codants pour les
AgMH sont situés partout dans le génome (Roopenian, 1992). En référence aux
antigènes du CMH, certains auteurs utilisent le terme non-CMH pour qualifier
les antigènes mineurs. En fait, cette dernière appellation pourrait avoir une
signification plus globale et inclure toute protéine allogénique.
4.4 Les AgMH sont reconnus uniquement par les lymphocytes T
Contrairement aux antigènes du CMH qui peuvent être reconnus par les
lymphocytes B et T, la réponse envers les AgMH semble être strictement
médiée par les cellules T (Loveland, 1986). En fait jusqu'à présent, aucun
laboratoire n'a réussi à produire d'anticorps dirigés contre les AgMH
(Loveland, 1986; Rammensee, 1983; Simpson, 1986) ni a détecter la production
d'anticorps ou à mesurer l'activité des lymphocytes B en réponse aux différents
antigènes mineurs. On pense que le problème est causé par des protocoles
d'immunisation inadéquats et qu'il serait difficile de produire des anticorps
contre les très courts peptides que sont les AgMH.
La réponse des lymphocytes T aux AgMH comportent trois aspects importants:
(1)la réaction est restreinte au CMH (2) l'amorçage in vivo est nécessaire (3) la
réponse semble se faire selon un patron d'immunodominance.
4.5 Réponse allogénique aux AgMH: Restriction au CMH
La restriction au C M . dans la réponse des lymphocytes envers les AgMH a été
démontrée en 1975 par Gordon. En effet dans le cas de l'antigène mâle relié au
chromosome Y (Ag-HY), les lymphocytes d'une souris mâle d'haplotype ~ 2 d
sont capables de reconnaître l'Ag-HY seulement s'il est présenté par les cellules
présentatrices d'antigènes (CPA) d'une souris mâle également d'haplotype
~ 2 d Ceci
.
implique que les AgMH sont en fait de courts peptides présentés en
association avec la molécules du CMH. Dam cet ordre d'idée, les antigènes
mineurs pourraient être définis comme étant des peptides-épitopes provenant
de protéines endogènes et présentés dans un contexte de CMH du soi. La
discrimination entre les protéines du soi et d u non-soi se fait via le TcR des
lymphocytes. De cette façon, les AgMH pourraient être impliqués dans le
développement du répertoire des lymphocytes T (Simpson, 1989).
4.6 Assemblage des AgMH avec la molécule de CMH
Donc, les AgMH sont présentés aux lymphocytes T en association avec une
molécule du CMH. La formation de ce complexe moléculaire est appelée
<<présentation d'antigène» et nécessite la dénaturation et l e clivage
protéolytique de la protéine. Il existe deux manières différentes de présenter les
peptides selon qu'ils proviennent de protéines exogènes ou endogènes. Les
AgMH font partie du second type protéinique et proviennent en fait des
protéines synthétisées au sein même de la CPA. Ces antigènes sont donc
«processés» au niveau du cytosol puis, les courts peptides obtenus de 16 acides
aminés ou moins sont transportés au réticulum endoplasmique où ils
s'associent à la chaîne lourde du CMH de classe 1. Cette association est
nécessaire pour le repliement adéquat de la chaîne lourde, l'association avec la
PZ-microglobuline et le transport du complexe vers la surface cellulaire en vue
de la présentation aux lymphocytes T cytotoxiques. Ces peptides ne peuvent
être obtenus par le traitement des protéines exogènes mais ils peuvent être
fournis en introduisant des peptides synthétiques dans le milieu de culture
(Townsend, 1989).
4.7 Réponse allogénique aux AgMH: amorqage in vivo
La détection in vitro de lymphocytes spécifiques pour un antigène mineur
donné requiert une phase d'amorçage in vivo puis une restimulation in vitro.
On explique ce fait par la basse fréquence des précurseurs de lymphocytes T
spécifiques aux AgMH ( Kaminçky, 1988).
4.8 Immunodominance
Les études sur les AgMH ont démontré qu'une panoplie de peptides est
retrouvée continuellement à la surface de toutes les cellules. Nous savons par
ailleurs que lors de transplantation cellulaire, l'animal est mis en contact avec
un grand nombre d'AgMH et que l'on génère des lymphocytes T cytotoxiques
spécifiques à un petit nombre seulement de ces antigènes (Wettstein, 1989). On
ne détecte pas de réponse pour la majorité des antigènes étrangers (Wettstein,
1986). On croit que le mécanisme d'immunodominance en cause implique,
lors de I'assemblage, la compétition des différents peptides pour une molécule
de CMH particulière (Roopenian, 1992; Komgold, 1990).
4.9 Expression tissulaire des AgMH
Si les A g W proviennent des protéines endogènes, on peut s'attendre à ce que
seules les cellules exprimant ces protéines présentent les molécules à Leur
surface. Il semble qu'effectivement plusieurs loci dlAgMH soient restreints à
un tissu particulier (Steinmuller, 1984). Par exemple, l'antigène H-40 est
exprimé uniquement par les lymphocytes B (Forman, 1984).
4.10 AgMH et leur implication dans la transplantation
Des transplantations de coeur et de peau entre souris congéniques résistantes
ont démontré que (1) une incompatibilité au niveau d'un seul locus d'AgMH
suffit pour causer le rejet, (2) le temps de rejet varie énormément d'un locus à
un autre, (3) l'immunogénicité de certains AgMH est additive, (4) les fernelies
rejettent plus rapidement les greffes que les mâles (Snell,1976; Graff, 1978; De
Tolla, 1977).
La nécessité de tenir compte de la présence des AgMH lors de transplantations
allogéniques a déjà été largement démontrée. Par ailleurs, il devient urgent de
travailler sur des protocoles qui soient applicables à l'humain et qui se
rapprochent le mieux possible des conditions cliniques retrouvées chez un
patient DMD. Heureusement il est possible de trouver un donneur compatible
pour les antigènes du CMH (HLA-A, -8,-C et HLA-DR). Par contre, il est
difficile voire impossible de déceler les AgMH et donc d'établir une
histocompatibilté parfaite. De là réside le problème de la transplantation de
myoblastes et de ce fait, l'importance de vérifier rôle des AgMH dans le rejet de
greffes.
Mon projet de recherche consistera donc à vérifier le rôle des antigènes
mineurs d'histocompatibilité dans le rejet de greffes de myoblastes chez la
souris mdx. Dans la 2ème partie, il sera question des objectifs poursuivis par ce
projet, de la méthodologie utilisée ainsi que des différents résultats obtenus
suivis de l'article "Role of non-MHC antigens in the rejection of transplanted
myoblasts".
ZIEMEPARTIE- RÔLEDES ANTIGÈNES MINEURS D~HISTOCOMPATIBILTTÉ
DANS LE REJET D E GREFFES D E MYOBLASTES CHEZ LA
SOURIS MDX
Le rôle du système immunitaire dans le rejet de greffes tissulaires n'est plus à
définir. Les principaux antigènes (CMH) impliqués dans le rejet allogénique
sont également bien décrit comme on l'a vu précédemment dans ce mémoire.
Par contre, le rôle des antigènes non-CMH incluant les antigènes mineurs
d'histocompatibilité (AgMH) est moins bien défini. Ces derniers sont connus
pour leur capacité à induire le rejet de tumeurs et de greffes de la peau lors de
transplantations parfaitement compatibles pour les antigènes du CMH. Jusqu'à
présent, l'implication des AgMH dans le rejet de myoblastes transplantés chez
la souris n'a été qu'indirectement étudiée (Wemig, 1995; Grounds, 1991). E n
effet, des études ont démontré que des transplantations de myoblastes entre des
souches de souris CMH-compatibles donnaient des résultats plutôt limités et
les auteurs ont pamellement attribué ces insuccès aux AgMH.
Mon projet consistera donc à vérifier le rôle des antigènes mineurs
d'histocompatibilité dans le rejet de myoblastes chez la souris. Il devient
indispensable de bien comprendre l'implication des AgMH puisque cesderniers ne peuvent être identifiés préalablement à la greffe, comme nous
l'avons vu au chapître 4. II est donc impératif de savoir s'ils provoquent des
réactions immunitaires chez le receveur. Si tel est le cas, de quels types sontelles? De quelle façon peut-on les prévenir afin de permettre le succès de la
greffe?
Nous avons donc effectué des transplantations syngéniques de myoblastes ainsi
que des transplantations allogéniques de myoblastes dont les donneurs étaient
incompatibles pour de nombreux antigènes non-CMH (incluant les antigènes
mineurs d'histocompatibilité) dans le Tibialis antérieur de souris mâles
Les souris hôtes n'étaient pas
dystrophiques C57BL/ 10J mdx/mdx.
irnmunosupprimées. Les greffes de myoblastes syngéniques ont mené à la
formation d'un haut pourcentage (90%)de fibres positives pour la dystrophine,
16 semaines après la transplantation. Il n'y a pas eu d'évidence de réaction
immunitaire cellulaire contre les myoblastes du donneur: i.e. pas d'infiltration
de lymphocytes CD4t ou CD8+ et pas d'expression d'ARNm pour le granzyme
B ou pour l'EN-y.
Les transplantations de myoblastes provenant de domeurs histoincompatibles
pour les antigènes non-CMH ont produit une augmentation transitoire de
fibres positives pour la dystrophine, 4 semaines après la greffe et ce, pour
quelques souches donneuses seulement. Pour ces souches, le nombre de fibres
dystrophine-positives était réduit, 16 semaines après la greffe. Il y a eu
évidence de réaction immunitaire cellulaire:
infiltration cellulaire de
lymphocytes CD4t et CD8+ accompagnée d'une augmentation de l'expression
d'ARNm pour granzyme B et IFN-y.
Les transplantations de myoblastes provenant de mâles C57BL/lOJ +/+
effectuées sur des femelles C57BL/ 10J mdx/mdx ont également mené à des
résultats médiocres avec quelques rares fibres positives pour la dystrophine
accompagnées de I'infitration de cellules immunitaires déjà observée. Dans ce
dernier cas, la réponse immunitaire a été attribuée aux antigènes mineurs
reliés au chromosome Y.
Finalement, des anticorps dirigés contre le sérum de veau fatal ont été détectés
à la suite des transplantations allogéniques et de façon inattendue, dans les
transplantations syngéniques. Ceci indique que le milieu de culture pourrait
être source d'antigènes et que les myoblastes auraient pu acquérir ces antigènes
lors de leur passage en culture. Chez la souris, la présence de ces anticorps ne
réduit aucunement le succès obtenu lors d'une première transplantation
syngénique.
ROLE OF NON-MHC ANTIGENS IN THE REJECTION
OF TRANSPLANTED MYOBLASTS
Amie Boulanger', Isabelle Asselin1, Raynald Roy2, Jacques P. Tremblay*
Centre de recherche en Neurobiologie
Hôpital de l'Enfant-Jésus
1401,18e Rue
Québec (Qc), Canada, G 4 124
Tel: (418) 649-5593
Fax: (418) 649-5910
e-mail: LabNeuroaVMl.ULAVAL.CA
Centre de recherche en Rhumatologie et Immunologie
Le Centre Hospitalier de l'Université Laval
2705 boul. Laurier
Ste-Foy (Qc), Canada,G1V 4G2
Tel: (418) 654-2772
Corres~ondingauthor:
L
Footnote:
Docteur Jacques P. Tremblay
Centre de recherche en Neurobiologie
Hôpital de l'Enfant-Jésus
1401,18e Rue
Québec (Qc), Canada, GU 124
This work was supported by grants from the Association
Française contre les myopathies (AFM)and the Muscular
Dystrophy Association of Canada (MDAC).
Keywords:
Muscular dystrophy, minor antigen, myoblast transplantation,
mouse, mdx
ABSTRACT
Myoblasts obtained from donors histoincompatible for several nonMHC antigens (i.e. induding minor histocompatibiüty antigens) and
from syngeneic donors were transplanted without any
immunosuppression into the muscles of male dystrophic C57BL/lOJ
mdx/mdx mice. Myoblasts from syngeneic mice resulted in the
formation of a high percentage of dystrophin positive fibers 16 weeks
after the transplantation. There was no evidence of a cellular immune
reaction against the donor myoblasts: i.e. no infiltration by CD4 or CD8
lymphocytes and no increased expression of granzyme B and yINF
mRNAs,
Transplantation of myoblasts obtained from donors histoincompatible
only for non-MHC antigens produced a transient increase of dystrophin
positive fibers at 4 weeks post-transplantation for some donor strains but
not for others. For donor strains which did produce an increase at 4
weeks, the number of dystrophin positive fibers was reduced 16 weeks
after the transplantation. There was evidence of a cellular immune
reaction: infiltration by CD4 and by CD8 lymphocytes, increased
expression of granzyme B and y-INF mRNAs.
Transplantation of myoblasts obtained from male C57BL/10J +/+ into
female C57BL/lOJ mdx/mdx also led to the presence of only a few
dystrophin positive fibers with the same signs of cellular immune
reaction. In this later case, the cellular immune response was attributed
to the H-Y minor antigens. Finally, antibodies against fetal calf senun
were detected following both syngeneic and non syngeneic
transplantations indicating that the culture medium may ako be a
source of antigens. In mice, the presence of these antibodies against
culture medium did not reduce the success of a first syngeneic
transplantation.
INTRODUCTION
Duchenne muscdar dystrophy (DMD) is a myopathy caused by
mutations in the dystrophin gene located on the short a m of the X
chromosome (1,2). This devastating disease affects about 1 in 3500 male
live birthç. The lack of dystrophin, which is thought to play a role in
maintainhg plasma membrane integrity and stability (3-5), resdts in
progressive weakness leading to death by the third decade.
Myoblast transplantation is a possible treatment to restore dystrophin
expression in the muscle of Duchenne patients and mdx mice (6,7).
Several in vivo and in vitro experirnents have shown that donor
myoblasts can fuse with one another and with host myoblasts to form
muscle fibers expressing dystrophin (8-11).
Our researdi group has transpianted MHC compatible myoblasts in DMD
patients without any immunosuppressive heatment. These
transplantations resulted in art increase of dystrophin positive fibers
only in a few patients (12,13,15). One of these patients who formed
dystrophin positive fibers in one muscle, showed significant increase of
strength which was, however, lost progressively with tirne. This lost of
strength was attributed at the time to the presence of antibodies against
dystrophin which would damage the dystrophin positive fibers formed
by the transplanted myoblasts.
Since then, our researdi group has also demonstrated successfu1
myoblast transplantation between syngeneic mice without the need for
irnmunosuppressive treatment (11). Abundant (90%) dystrop hin
positive fibers were observed in theçe host m d x rnice nine mon* after
the transplantation even though antibodies against dystrophin were
detected in the host as soon as one month after the transplantation.
This recent result clearly indicates that antibodies against dystrophin do
not damage the new or hybnd muscle fibers resulting from normal
myoblast transplantation. Thus, antibodies agauist dystrophin do not
appear to be responsible for the progressive loss of strength previously
gained by myoblast transplantation in the DMD patients. An alternative
explanation is that donor and host were perfectly compatible in mouse
syngeneic transplantations, not only for MHC but &O for au non-MHC
antigens, whereas most donors and recipients in the chical trials
(12,13,15), although compatible for MHC, differed for one or more nonMHC antigens. These non-MHC antigens include minor antigens
(MiHA) which are short peptide epitopes of endogenously synthesized
proteins presented by the MHC (16,17,19). Although there are no
humoral immune responses against these MiHA, they do trigger cellular
immune responses. The term non-MHC antigens is used in the present
article to group not only h&HA but also all other non-MHC antigens
which could trigger a humoral immune response. These non-MHC
antigens could have been responsible for the rejection of both donor
myoblasts and muscle fibers formed in part by the donor myoblasts, and
could thus have been responsible for the progressive lost of strength
previously gained following myoblast transplantation in one DMD
patient (13). Moreover, the fact that immune response seems to deshoy
not only donor and hybrid cells but also host cells (bystander damage)
could explain this lost of strength (14). This hypothesis led us to
investigate the role of non-MHC antigens in myoblast transplantation in
mice. 1s it possible that non-MHC antigens are responsible for myoblast
rejection as they are for skin transplantation? Our experiments
demonstrate that non-MHC antigens can indeed trigger the rejection of
trançplanted myoblasts. They also show that the male antigens alone
(i.e. rninor antigens associated with the Y chromosome) (lû-21)are
sufficient to trigger the rejection of male myoblasts transplanted into
female mice.
MATERIAL AND lMETHODS
Mouse myoblast culture
Mouse prirnary myoblast cultures were obtained from newborn skeletal
muscle biopsies (22). The mice were killed and the a m s and legs
skinned and the muscles were cut h t o small fragments which were
dissociated at 37O Cf initially with collagenase (600 N/ml; Sigma, St-
Louis, MO) for 1h and with trypsin (0.1% wt/vol; Gibco, Grand Island,
NY) for 30 min in HBSS solution (Gibco). The cell suspension was
grown in 199 medium (Gibco) suppiemented with 15%of fetal calf
senim (FCS)and a mixture of penicillin G (10 000 UI/ml) and
streptomycin (10 mg/ml). Ceus were harvested at confluence and frozen
in 199 medium containing 15% FCS and 10% DMSO,until grafting.
Animal used
Mouse myoblast cell cultures were obtained from 7 different groups of H2bhaplotype: C57BL/6J, C578L/lOJ, C3H.SW/Sn, Dl.LP/SN, 129/J,
BXSB/Mp J, DW / J. Myoblast transplantations were performed in
C578L/10J mdx/mdx which are also of the H-2b haplotype. Mice were
purchased kom Jackson hboratories (Bar Harbor, MA) and reproduced
in our animal fadities. This work was authorized by Laval University
Animal Care Cornmittee and conducted according to Canadian Council
rules on animal care.
Myoblast transplantations
Three weeks or less before transplantation, the left hind legs of the mdx
mice were cobalt-irradiated (20 Gy) in order to block host myoblast
proliferation. One day before transplantation, the left tibialis anterior
(TA) was exposed and injected with 5 j.d of notexin venom (5 pg/ml),
which has been shown to trigger muscle fiber degeneration without
damaging myoblasts. On the day of transplantation, the ce& were
thawed quickly in 199 medium containing 15% FCS, washed three times
in HBSS without FCS and then concentrated as pellets. Cell viability was
assessed using Trypan blue stauiing and was always higher than 95%.
The left TA muscles were exposed and injected in several sites with
approximately 5 x 106 cells suspended in 10 of HBSS.
Blood and muscle collection
Mice were deeply anesthetized with 0.1 ml of a solution containing
ketarnine (10 m g / d ) and xylasine (10 mg/ml). Blood was colleded by
cardiac puncture and mice were perfused with 0.9% NaCl solution
containing heparin (2 UI/ml,Organon Teknika, Toronto). Blood was
centrifuged and the serum fraction was kept at -20°C for cytofluorometric
analysis. Some grafted musdes were placed in a 30% sucrose solution for
24 h and then embedded in K T (Miles Inc. Elkart, In), frozen in liquid
nitrogen and serially sectioned at 8 p using a Zeiss cryostat. Other
muscles were placed directly in liquid nitrogen to prevent RNA
degradation. Tissues were stored at -80°Cuntil RNA extraction.
Immunohistochemical detection of dystrophin
Nonspecific binding sites were blocked by incubating the cryostat sections
with a mixture of horse (3.3%),rabbit (3.3%) and fetal calf (3.3%) sera in
PBS for 1 h. The sections were then incubated with anti-dystrophin
polyclonal antibody (R27,Genica Co., Worcester, MA) (1/1000, 1 h). The
second antibody was an anti-sheep peroxidase-conjugated (1/100,1 h,
Dako). The peroxidase activity was revealed with 3,3' diaminobenzidine
(1 mg/ml) and hydrogen peroxyde (0.03%)
CD4, CDS, MAC4 immunohistochemistry
Nonspecific binding sites on cryostat sections were first blocked with
horse s e m (10% in Tris buffered saline, 20 min). The sections were
then incubated for 1 h with the first antibody: a rat anti-CD4 antibody
(clone GK 1.5; ATCC, Rockville, MD), a rat anti-CD8 (anti-Lyt-2, clone
YTS 169, gift from Dr Waldmann, Oxford University, Oxford, U.K.)or a
rat anti-MAC4 antibody (clone M1/70, ATCC, Rockville, MD, USA).
Endogenous peroxidase activity was then blocked with 0.03% hydrogen
peroxide in methanol for 15 min. The sections were then incubated for
30 min with rabbit anti-rat antibody biotin-conjugated (diluted 1/150,
Dako, Copenhagen, Denmark) followed by 30 min incubation with
streptavidin-peroxidase (1/200, Dako). Peroxidase activity was revealed
with 33' diaminobenzidine (1 mg/ml) and hydrogen peroxide (0.03%).
Flow cytomehic analysis
Flow cytometric analysis was used to deted in the transplanted mouse
senun the presence of antibodies against donor myoblasts. Samples of
the myoblasts used for the transpIantations were further expanded in
culture. They were then irypsinized, washed by centrifugation and
resuspended in phosphate buffer solution at a final concentration of 107
ceIls/ml. A 40 jd sarnple of this myoblast suspension was then incubated
for 60 min at room temperature with 20 pl of the s e m of one of the
transplanted mice. The cells were washed in 4 ml of cold PBS and
incubated with 200 ~1 of a goat anti-mouse antibody conjugated with
fluorescein-isothiocyanate(FITC) (Coulter Co., Hialeah, Fl., USA).
Following three rinses in PBS, the percentage of labelled myoblasts was
determinated with a flow cytometer (FACSort, Becton Dickinson)
operating at 488 nm.
RT-PCR
The RNA extraction method and the amplification of granzyme B
mRNA were done exactly as recently described by our research group
(23). The amplification of y-INF mRNA and p-actin mRNA was
described by Guérette et al. (24).
RESULTS
Myoblasts obtained from newbom male and female C57BL/lOJ +/+ were
injected into the Tibialis anterior of nine male mice C57BL/lOJ
mdx/mdx. The graft success was then estimated by detecting the
presence of dystrophin-positive fibers at 4 and 16 weeks after the
transplantation. At 4 weeks, the number of dystrophin expressing fibers
was relatively high (50%) (Figure la) and reached 90% by the sixteenth
week (Figure lb, Table 1).
Myoblasts were also obtained Crom MHC-compatible newborn male and
fernale mice (H-2b) (C57BL/6Jf C3H.SW/Sn, DW /J, BXSB/MpJ, l29/J and
DW / J) and transplanted in male C57BL/ 10J mdx/mdx. These donors
were, however, incompatible with the host at many non-MHC loci.
Myoblasts were allotransplanted into 7 to 9 mdx mice for each type of
donor mouse. The success of grafting was estimated first at 4 weeks after
transplantation. At this time, a few muscle fibers expressed dystrophin
(Figures lc, d, Table 1)but, by sixteen weeks after transplantation, only
occasional dystrophin expressing fibers were found (Figure le, Table 1).
H-Y antieen
Myoblasts obtained from male C57E!L/lOJ +/+ mice were trançplanted
into female C57BL/10J mdx/mdx mice. When graft success was assessed
between 1 and 5 weeks after transplantation, few or no dystrophinpositive fibers were seen (Figure If, Table 1).
Detection of antibodies aeainst mafted mvoblasts.
Antibodies reacting with cultured donor myoblasts were detected in the
s e m of almost all mice (41/44) during the 4 weeks following the graft
(Figure 2, Table 1). A surprising observation was that these antibodies
were detected in the serum of the host, even following syngeneic
transplantations (Figures 2c, d), although at very low titres, 16 weeks
after transplantation (Table 1). The antibodies present in the semm of
hosts given syngeneic g r a h reacted only with donor myoblasts which
had been grown in culture with FCS and not when they had been grown
without FCS at any stage. In one experiment, C57BL/lOJ +/+ myoblasts
were grown without FCS and transplanted in three males C578L/lOJ
mdx/mdx. F o u weeks later, no antibodies reacting with the donor
myoblasts were detected in the serum of the recipient mice.
Immune cell infiltration
In all the muscles transplanted with myoblasts obtauied from strains
incompatible for non-MHC antigens, very conspicuous infiltrations of
CD4 or CD8 lymphocytes and MAC-1 expressing cells (macrophages,
neutrophils) were observed in tissue sections, 4 weeks after grafting
(Figures lg, h, i). In contrast, only a few lymphocytes were observed in
muscle sections of male m d x mice transplanted with syngeneic
myoblasts although many macrophages were observed at these injection
sites probably due to muscle damage.
Detection of R-actin,eranzvme B and lFNy mRNAs
RT-PCR amplifications of granzyme B and y-INF mRNAs were
performed on muscles obtained from mice transplanted with myoblasts
from C57BL/10J +/+, C3H.SW/Sn or BXSB/MpJ donors. The
amplifications were normalized between biopsies by co-amplifymg the
mRNA of p-actin. No significant increased expression of granzyme B
and y-INF mRNAs were observed at 1,2 and 3 weeks following
syngeneic transplantations (Le. C57BL/10J +/+ in C57BL/ 10J mdx/mdx).
However, significant increases of these mRNAs were detected 1 and 2
weeks after transplantation in muscles injected with C3H.SW/Sn or
BXSB/MpJ myoblasts as compared to the contralateral uninjected
muscles (Figures 3a, 3b). These results confirmed that the infiltrating
lymphocytes, present following non-MHC compatible myoblast
transplantations, were activated.
DISCUSSION
The term non-MHC antigens is used in this article to designate all
antigenç which are not major histocornpatibility antigens (MHC),
including the minor histocompatibility antigens (MiHA). These MiHA
were initially identified by their ability to induce tumor or skin graft
rejections following MHC compatible grafts (16,17). The present study
indicates that non-MHC antigens are also responsible for the rejection of
myoblasts transplanted in mdx mice. Indeed, excellent transplantation
results were obtauied with syngeneic myoblaçts, C578L/lOJ +/+ in male
C57BL/ 10Jmdx/mdx, as previously reported by our group (11). As in
that previous study, more than 90% of the muscle fibers expressed
dystrophin in the transplanted mdx muscle, 16 weeks after
transplantation. These dystrophin positive fibers resulted from fusion of
the normal (non dystrophie) myoblasts and thus indicated that these
cells were not rejected even without immunosuppression. The absence
of immune reaction was also indicated by the minimal infiltration of the
injected muscles by CD4 or CD8 lymphocytes and by MAC-1 positive
cells.
However, when MHC compatible myoblasts were obtained from mouse
strains other than C57BL/lOJ, differing for non-MHC antigens, the
success of transplantation was rather limited. Indeed only a few
dystrophin positive fibers were observed 4 weeks post transplantation.
Some other groups have obtained similar results with MHC compatible
muscle allografts in mice (14,261. However, Watt et al. (1991) have
observed proionged survival (up to 105 days) of dlogeneic precursor cells
within host muscles (27). This could depend on the host/donor strain
combinations used. In some cases, the scarce dysfxophin positive fibers
may have been due to a reversion rather than to the transplantation (25).
Although these donors had the same MHC haplotype as the host (i.e. H2b), they were expected to differ from the hosts at many non-MHC
antigen loci. Some differences were obsenred not only in the number of
surviving dystrophin-positive fibers but also in the degree of infiltration
by lymphocytes and macrophages between the mice which received
myoblasts from the various donor strains. This may have been due to a
more or less rapid rejection depending on the immunogenicity of the
various non-MHC antigens involved. The presence of macrophages and
of lymphocytes 4 and even 16 weeks after the transplantation, supports
the hypothesis of an immune reaction. This rejection phenomenon is,
however, slower than that observed in MHC incompatible myoblast
transplantation which leads to complete rejection in less than 2 weeks
(23)-
It was initidy surprishg to observe the presence of antibodies against
the donor myoblasts even foIlowing syngeneic transplantation since the
only antigen which was absent from the host was dystrophin.
Dystrophin would be expressed only in a low percentage of mature
myoblasts and so could not explain the reaction of the host serum with
all donor myoblasts. Moreover, dystrophin being an intracellular
protein, would not be accessible to the antibodies in non permeabilized
ce&. The absence of reaction of the host s e m with donor rnyoblasts,
following transplantation of myoblasts grown without FCS, indicated
that the antibodies were generated against FCS components attached to
the culture myoblasts. These components remained attached to the
myoblasts even after three rinses. Our interpretation of the results is
now that myoblasts grown in presence of FCS have some FCS
components on them at the time of transplantation which provoke a
humoral immune reaction in the host mice. As a result, serum obtained
from the grafted animals more than 4 weeks after the transplantation
contained antibodies which reacted with these components present on
the myoblasts grown in FCS and used for the flow cytometry test. AntiFCS antibodies may be partially responsible for the positive reaction with
donor myoblasts of sera obtained after transplantation of MHC
compatible myoblasts which differ at non-MHC loci. Some of these
antibodies may also be directed against minor antigens other than the
FCS components; although minor antigenç are comrnonly defined in
terms of cellular response this does not preclude the triggering of a
humoral response by allotypic immunogenic proteins, MiHA, present
on MHC-compatible but non-syngeneic donor myoblasts or on the
muscle fibers formed from these ce&. Finally it should be noted that
antibodies against FCS are not responsible for the rejection of the
transplanted myoblasts since such antibodies were present following
syngeneic transplantation and did not lead to the rejection.
The presence of a cellular immune reaction against myoblasts obtained
from donors incompatible for non-MHC antigens was clearly
demonstrated by the expression of granzyme B and W - y by the
lymphocytes infiltrathg the myoblast injected muscles. This cellular
immune reaction is probably due to the MiHA. It should be emphasized
that no sign of cellular immune reaction was observed fouowing fully
histocompatible transplantation. The presence of FCS which did trigger
a humoral response in these transplantations did not tngger a cellular
immune response. The rejection of myoblasts following MHC
compatible but MiIIA incompatible myoblasts will probably be
adequately controlled by FK506 immunosuppression since this treatment
was effective following MHC incompatible myoblast transplantation (10).
Indeed in the transplantations reported in that artide, donors and
recipients differed not only for MHC but also for many MiHAs. These
MiElAs codd have been presented to the host b u n e system by the
host MHC on hybnd myotubes (formed by fusion of donor myoblasts
with host myoblasts) and yet the immune response was adequately
controlled by FK506.
Responses to minor antigens in other transplantation systems are only
mediated by T cells. The minor antigens wodd be presented as short
peptides (8 to 12 amino acids) by MHC class 1 molecules. Myoblasts have
been shown to express MHC class I molecules (28) and are thus capable of
presenting directly these minor antigens. This w o d d explain why this
type of transplantation is still relatively rapidly rejected even when the
host and the donor differ only for minor antigens.
The failure of the transplantation of male C57BL/10J +/+ myoblasts in
female C57BL/ 10J mdx /mdx mice clearly demonstrated that differences
of only a few minor antigens, linked in this case to the Y chromosome,
are enough to trigger the rejection process. This observation explains
why myoblast transplantation evaluated with probes against the Yantigen had relatively little success (2930).
In contrast to the conventional approach of using cultured rnyoblasts,
the transplantation of whole and sliced musdes was reported by Fan et
al. (1996) to give longer survival (up to one year) (31). This could be
attributed to a reduced or delayed exposure of the muscle slices to the
immune response which could result in the developpment of tolerance.
CONCLUSION
Non-MHC antigens, including minor histocompatibility antigens,
present on myoblasts are recognized by the host immune system and are
responsible for the rejection of myoblast transplantation even when the
host and the donor are MHC compatible. This observation probably
accounts for the limited success that our research group has obtained
when MHC compatible myoblasts were transplanted to Dudienne
muscular dystrophy patients without immunosuppression (13). It will
therefore be necessary to immunosuppress DMD patients even when
they are transplanted with MHC compatible myoblasts.
This research is supported by gants from AFM, MDA and MDAC.
We wish to thank Dr. Terry A. Partridge for revising this manuscript.
FIGURE LEGENDS
Figure la:
Figure lb:
Figures lc,d:
Figure le:
Figure If:
Figures lg,h,i
Four weeks after syngeneic myoblast transplantation
(C57BL/lOJ +/+) in C57BL/10J mdx/mdx mice, a high
percentage of the fibers expressed dystrophin revealed by
immunoperoxidase.
Sixteen weeks after syngeneic (C5ïBL/lOJ +/+) myoblast
transplantation, almost 90% of the musde fibers expressed
dystrophin as shown by immunoperoxidase.
Four weeks after transplantation of myoblasts from mice
incompatible for non-MHC antigens C57BL/6J (c) and from
l29/J (d) in mice C57BL/ 10J rndx/rndx mice, there were
only a few muscle fibers expressing dystrophin (arrows).
Sixteen weeks after the transplantation of 129/J rnyoblasts
in C57BL/10J mdx/mdx mice there were no muscle fibers
expressing dystrophin.
Myoblasts obtained from male (C57BL/ 10J +/+) were
hansplanted into female (C57BL/lOJ rndx/mdx.) Only a few
positive fibers were present 1 to 5 weeks after such
transplantation.
The presence of infiltrathg cells was detected by
immunoperoxidase in muscle sections 3 to 4 weeks after
myoblast allotransplantation, CD4+lymphocytes (g), MAC-1
positive cells, i.e. macrophages and neutrophils (h) and
CD8+ lymphocytes (i) were observed.
(scale bar: a to f: 4 0 0 ~ g; and h: 2 0 0 ~i:; 100p.m)
Figure 2:
Antibodies against the donor myoblasts (Le. 129/Jin a and b,
C578L/lOJ in c and d), were detected in the senun of the
host mice by 80w cytometry. In a and c, preimmune serum
and in b and d serum obtained 4 weeks after the
transplantation. Positive reaction, i.e. increase of the
intensity of l a b e h g was observed in the sera obtained 4
weeks after the transplantation in both cases.
Figure 3
RT-PCR amplification of mRNA's of granzyme B
y-INF
@) and $-actin (c). Significant increases of mRNA were
detected 1 and 2 weeks after transplantation in the musdes
injected with C3H.SW/Sn or BXSB/MpJ compared with the
contralateral uninjected muscles.
(a),
REFERENCES
Kunkel, L.M., Monaco, A.P., Middlesworth, W., Odis, H.D. and Latt, S.A.
Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male
patient with an X chromosome deletion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985;
82: 4778-4782.
Ray, P.N., BelfaU, B., Duff,C. et al. Cloning of the breakpoint of an X:21
translocation associated with Duchenne muscular dystrophy. Nature
1985; 318: 672-675.
McArdle, A., Edwards, R.H.T. and Jackson, M.J. Effects of contractile
activity on muscle damage in the dystrophin-deficient mdx mouse.
Clinical Science 1991; 80: 367-371.
Menke, A. and Jockusch, H. Decreased osmotic stability of dystrophinless muscle celk from the mdx mouse. Nature 1991; 349: 69-71.
Sacco, P., Jones, D.A., Dick, J.R.T. and Urbova, G. Contractile properties
and susceptibility to exercise-induced damage of normal and mdx mouse
tibialis anterior muscle. C h . Sci. 1992; 82: 227-236.
Partridge, T.A. Myoblast transfer: A possible therapy for inherited
myopathies? Muscle and Nerve 1991; 14: 197-212.
Morgan, J.E. and Partridge, T.A. Ce11 transplantation and gene therapy in
muscular dystrophy. Bio. Assays 1992; 14: 641-645.
Partridge, T.A., Morgan, J.E., Coulton, G.R., Hoffman, E.P.and Kunkel,
L.M. Conversion of mdx myofibres from dystrophin-negative to positive by injection of normal myoblasts. Nature 1989; 337: 176-179.
Huard, J., Verreault, S., Roy, R., Tremblay, M. and Tremblay, J.P. High
efficiency of muscle regeneration after human myoblast clone
transplantation in SCID mice. J. Clin. Invest. 1994; 93: 586-599.
Kinoshita, I., Vilquin, J.T., Guérette, B., Asselin, I., Roy, R. and Tremblay,
J.P. Very efficient myoblast dotransplantation in mice under FK506
immunosuppression. Muscle and Nerve 1994; 17: 1407-1415.
Vilquin, J.T., Wagner, E., Kinoshita, I., Roy, R. and Tremblay, J.P.
Successful histocompatible myoblast transplantation in dystrophindeficient mdx mouse despite the production of antibodies against
dystrophin. J. Cell Biol. 1995; 131: 975-988.
Huard, J., Bouchard, J.P., Roy, R. et al. 1992. Human myoblast
transplantation: Preliminary results of 4 cases. Muscle and Nerve 1992;
15: 550-560.
Tremblay, J.P., Malouin, F., Roy, R., Huard, J., Bouchard, J.P., Satoh, A.
and Richards, C.L. Results of a triple b h d d i n i c a l study of myoblaçt
transplantations without immunosuppressive treatment in young boys
with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplantation 1993; 2: 99112.
Wemig A., Irintchev A. Bystander damage of host muscle caused by
implantation of MHC-compatible myogenic celis. J. Neurol. Sci. 1995;
130: 190-196.
Amato, A.A., King, W., Signore, L., Prior, T.W.,
Mendell, J.R., Kissel, J.T.,
Sahenk, Z., Besson, S., McAndrew, P.E., Rice, R., Nagaraja, H., Stephens,
R., Lantry, L., Morris, G.E. and Burghes, A.H.M. Myoblast transfer in the
treatrnent of Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 1995; 333:
832-838.
Lindahl, K.F. Minor hktocompatibility antigens. TIG 1991, 7:219-224.
Roopenian, D.C.,Davis, A.P., Christianson, G.J. and Mobraaten, L.E. The
functional basis of minor histocompatibility loci. The Journal of
Unmunology 1993; 151: 4595-4605.
18.
Eichwald, E.J. and Silrnser, C.R. Transplant Bull. 1955; 2: 148-149.
Goulmy, E., Termijtelen, A., Bradley, B.A., Van Rood, J.J. Alloimmunity
to human H-Y. Lancet 1976; 2: 1206
Goulmy, E., Termijelen, A., Bradley, B.A., Van Rood, J.J. Y-antigen
killing by T cells of women is restricted by HLA. Nature 1977; 266: 544545.
Wang, W., Meadows, L.R., Den Haan, H.M., Sherman, N.E.,Chen, Y.,
Blockland, E. et al. Human H-Y: a male specific histocompatibility
antigen derived f ~ o mthe SMCV protein. Science 1995; 269: 1588-1590.
Cossu, G., Zani, B., Coletta, M., Bouchè, M., Pacifia, M. and Molinarol,
M. Ln vitro differentiation of satellite cells isolated from normal and
dystrophie mammalian muscles, a cornparison with embryonic
myogenic cellç. Cell Differentiation 1980; 9: 357-368.
Guérette, B., Roy, R., Tremblay et al. hcreased granzyme B mRNA after
allouicompatible myoblast transplantation. Transplantation 1995; 60:
1011-1016.
Guérette, B., Tremblay, G., Vilquin, J.T.
et al. hcreased interferon-y
mRNA expression following alloincompatible myoblast transplantation
is inhibiteci by FK506. Muscle and Nerve 1995; (in press).
Hoffman, E.P., Morgan, J.E.,Watkins, S.C.and Partridge, T.A. Somatic
reversion/suppression of the mouse mdx phenotype in vivo. J. Neurol.
Sci. 1990; 99: 9-25.
Grounds M., Partridge T.A., Sloper J.C. The contribution of exogenous
cells to regenerating skeletal muscle: an isoenzyme shidy of muscle
allografts i
n mice. J. Pathology 1980; 132: 325-341.
Watt, D.J., Morgan, J.E., Partridge, T.A. Allografts of muscle precursor
cells persist in the non-tolerized host. Neuromuscular disorders 1991; 1:
345-355.
28.
Roy, R., Dansereau, G., Tremblay, JS.Belles-Ides,
,
M., Labrecque, C. and
Bouchard, J.P. Major histocompatibility complex (MHC) antigens
expression on human myoblasts. Transplantation Proceedings 1991; 23:
799-801.
29.
Grounds, M.D., Lai, MC., Fan, Y-, Codling, J.C. and Beilharz, M.W.
Transplantation in the mouse model - the use of a Y-chromosomespecific DNA clone to identify donor cells in situ. Transplantation 1991;
52: 1101-1105.
30.
Fan, Y., Maley, M., Belharz, M. and Grounds, M. Rapid death of injected
myoblasts in myoblast tramfer therapy. Muscle and nerve (in press).
31.
Fan, Y., Beilharz, M., Grounds, LM.A potential alternative strategy for
myoblast transfer therapy: The use of sliced muscle grafts. Ce11
Transplantation 1996; 5: 421-429.
Fluorescence intensity
MYOBLAST TRANSPLANTATlON RESULTS, CELLULAR AND HUMORAL REACTION OF DIFFERENT üROUt>S Ub
ALLOGRAFT AND SYNGENEIC GRAET
Group
Legend:
Donor suain
MAC
C57BU10J
1
weak
male transpl
3
5
we ak
cells per fiel
R cl0
+ 10-50
++ 50-100
+++ >IO0
nos
R
++
+
+
+
+
++
+
++
/
number
of
miir
1. Bilan des essais diniques effectués chez l'humain
À ce jour, cinq projets cliniques majeurs concernant la transplantation
myoblastes ont été menés en Amérique du Nord et en Italie afin de traiter
garçons atteints de dystrophie musculaire de Duchenne. La décision
procéder aux essais cliniques a été prise par les cliniciens lors d e la réunion sur
la thérapie de transfert de myoblastes organisée par l'Association Américaine
pour la Dystrophie musculaire qui a eu lieu à New York en 1989. La plupart
des chercheurs présents à cette réunion se sont farouchement opposés à cette
décision argumentant que les essais chez l'humain étaient prématurés et que
trop peu d'études chez l'animal avaient été faites.
Néanmoins, la gravité des symptômes de la DMD d'une part et l'ignorance
quant à l'immunogénicité des cellules myoblastiques d'autre part ont incité
certaines équipes à tenter des transplantations chez l'humain. Cette situation a
provoqué de grandes controverses mais les premières conclusions suite à ces
expériences sont: I'échec à remplacer efficacement la dystrophine dans les
muscles atteints et qu'aucune augmentation de la force musculaire n'a été
démontrée. Malgré ces insuccès, aucun dommage sérieux n'a été remarqué
chez les garçons dystrophiques suite aux greffes. Toutefois, il est important de
spécifier que des études chez la souris ont démontré des dommages
«bystander» au muscle hôte (Wernig, 1995) c'est-à-dire que la réponse
immunitaire envers le greffon peut simultanément endommager les tissus
environnants. Par ailleurs, le problème avec les essais cliniques c'est le peu
d'informations disponibles concernant le destin des myoblastes injectés. Il est
possible de prélever une biopsie musculaire au site d'injection certes, mais
seule une petite portion du muscle greffé peut ainsi être évaluée. Il est
éthiquement et tediniquement impossible de mieux suivre l'évolution de la
greffe dans les muscles dystrophiques déjà sévèrement compromis.
2. Retour à l'expérimentation chez l'animal
Le destin des myoblastes injectés peut heureusement être étudié chez les
modèles animaux. Il existe deux modèles importants pour la DMD: le chien et
la souris. La plupart des expérimentations sont effectuées sur cette dernière et
démontrent un certain succès. Par ailleurs, ces transplantations sont souvent
effectuées dans des conditions très différentes de celles entourant les greffes
chez l'humain. En effet, l'étude de plus de trente articles s u ce sujet a révélé
que la majorité des transplantations a été faite sur des animaux hôtes «traités»
(Grounds, 1996). Dans treize de ces études, les myoblastes ont été injectés dans
des souris nude ou SCID dont le système immunitaire n'est pas fonctionnel
pour le rejet des cellules étrangères. Dans neuf des études, les muscles hôtes
ont été pré-irradiés permettant ainsi aux myoblastes importés de mieux
participer à la régénération. L'irradiation au site de la greffe semble favoriser
grandement la prolifération cellulaire et même le déplacement des myoblastes
injectés. Onze des articles concernaient l'injection de lignées cellulaires telle
C2C12 au lieu des myoblastes. Malheureusement ces cellules, en fusionnant
avec les fibres musculaires hôtes, ont démontré qu'elles pouvaient former des
tumeurs in vivo. Ces expérimentations faites dans des conditions «optimales»
sont intéressantes mais peu applicables à la situation clinique. De plus, le
succès de ces études n'expliquent pas l'inçuccès des essais thérapeutiques. Il
devient nécessaire d'étudier les transplantations de myoblastes dans des
conditions qui se rapprochent le plus de celles rencontrées lors des greffes chez
l'humain. C'est ce que nous avons tenté en étudiant le l'implication des
antigènes mineurs d'histocompatibilité lors de transplantations de myoblastes
entre individus histocompatibles. En effet, le système immunitaire demeure
une barrière difficilement surmontable et les AgMH ont une grande part de
responsabilité dans le rejet immunitaire.
3. Importance des AgMH
Les antigènes mineurs d'histocompatibilité ont d'abord été identifiés par leur
capacité à induire des rejets de tumeurs et de transplantations de tissu. La
présente étude démontre que les AgMH peuvent également être responsables
d u rejet des myoblastes lors de transplantations chez la souris mdx.
Antérieurement, le groupe du Dr. Tremblay a démontré qu'il est possible
d'obtenir un très bon succès de greffe lors de transphntations syngéniques. Par
ailleurs, lorsque des transplantations sont effectuées entre donneur et receveur
différents au niveau d'un ou de plusieurs antigènes d'histocompatibilité, on
obsewe seulement quelques fibres exprimant de la dystrophine, 4 semaines
après la greffe. Ces fibres positives ont habituellement disparu vers la seizième
semaine suivant la greffe- La présence de rares fibres à ce moment peut être
due à des mutations inverses plutôt qu'aux transplantations elles-mêmes.
Parmi ces même groupes de souris transplantées, on a pu observer par
immunohistochimie une infiltration cellulaire importante composée de
cellules immunitaires (lymphocytes CD4+, CD8+, macrophages, neutrophiles).
Selon les combinaisons de transplantations, les différences au niveau de la
quantité de fibres positives pour la dystrophine et du degré de l'infiltration
cellulaire peuvent s'expliquer par un rejet plus ou moins rapide variant selon
l'irnmunogénicité des antigènes impliqués. Quoi qu'il en soit, la présence de
cellules immunitaires à 4 et à 16 semaines suivant les greffes sont l'évidence
d'un rejet et on peut conclure à un rejet chronique contrairement à la réponse
envers les antigènes du CMH qui est beaucoup plus rapide et qui s'apparente
plutôt au rejet aigu. Par ailleurs, l'activation des cellules d'infiltration a été
confirmée par la détection des ARNm de l'interféron gamma (EN-y) et de la
granzyme B. Ces protéines ne sont exprimées que par les cellules activées.
Suite aux transplantations allogéniques nous avons détecté des anticorps
dirigés contre les myoblastes greffés. Étonnamment, les transplantations
syngéniques semblent également avoir induit la formation d'anticorps. C'est
d'autant plus surprenant que les antigènes mineurs sont caractéris& par leur
incapacité à favoriser la formation d'anticorps. Certains auteurs d o ~ e n un
t
sens plus large au terme AgMH en les définissant comme des peptides
provenant de la protéolyse de n'importe quelle protéine, en autant qu'ils
soient capables de lier une molécule de CMH et de provoquer le rejet du tissu
transplanté. On peut ainsi désigner la dystrophine comme un AgMH. Lors des
transplantations syngéniques, seule cette protéine absente chez l'hôte aurait pu
induire la formation d'anticorps. Toutefois, cette hypothèse ne peut être
retenue car la dystrophine, n'étant exprimée que par un faible pourcentage de
myoblastes matures, ne peut être impliquée dans la réaction du sérum de l'hôte
avec les myoblastes du donneur utilisés pour le test de cytofluorimétrie. De
plus, la dystrophine étant une protéine inhacellulaire, elle demeure nondisponible pour les anticorps lors du contact avec des cellules nonperméabilisées. L'absence de réaction entre les sera des receveurs et les
myoblastes des donneurs cultivées en absence de semm de veau fœtal (FCS)
nous permet de croire que les anticorps pourraient être dirigés contre des
composés retrouvés dans le milieu de culture. Ces composés se retrouveraient
à la surface des cellules cultivées en présence de FCS et provoqueraient la
formation d'anticorps au moment de la greffe. Nous avons confirmé cette
interprétation par ELJSA. En effet, les sera provenant de souris transplantées 4
semaines plus tôt ont fourni des réactions positives avec le FCS contrairement
aux sera des souris naïves qui se sont avérées toutes négatives pour la présence
d'anticorps anti-FCS. I1 est possible que ces anticorps soient à l'origine de la
positivité des réactions croisées entre les sera post-greffes et les myoblastes
cultivés en présence de FCS utilisés pour les tests de cytofluorimétrie. Par
ailleurs, la plupart des transplantations allogéniques ont donné des réactions
positives pour la présence d'anticorps contre les cellules greffées. Certains de
ces anticorps pourraient être dirigés contre des antigènes mineurs autres que la
dystrophine. En effet, même si ces antigènes sont habituellement définis en
terme de médiation cellulaire, il reste possible que certains puissent induire
une réaction humorale. Une autre hypothèse qui reste cependant à vérifier est
que les myoblastes, lors de leur passage en culture et au contact avec le FCS,
pourraient se mettre à exprimer des antigènes absents dans d'autres conditions.
Finalement, il est important de souligner que ces anticorps anti-FCS ne
semblent pas perturber le succès des greffes puisque leur présence dans les
greffes syngéniques n'a pas causé de rejet.
La réaction immunitaire cellulaire dirigée contre les myoblastes obtenus à
partir de donneurs incompatibles pour un OU pour plusieurs antigènes
mineurs a été clairement démontrée par l'expression des ARNm de I'IFN-y et
de la granzyme B par les cellules immunitaires d'infiltration. Cette réaction est
probablement dirigée contre des AgMH. 11 est à remarquer que les
transplantations syngéniques sont exemptes de ce type de réaction.
L'utilisation d'agents immunosuppresseurs devient donc nécessaire lors de
transplantations de myoblastes et ce, même lorsque le receveur est
histocompatible avec le donneur. Les AgMH sont présentés aux lymphocytes
en association avec les molécules du CMH de classe 1. Il a déjà été démontré
que les myoblastes expriment ces molécules (Roy et al., 1995). Ceci pourraient
expliquer pourquoi les myoblastes sont rejetés relativement rapidement lors
des transplantations entre donneurs et receveurs compatibles uniquement
pour le CMH.
Le rejet des transplantations de myoblastes possédant l e chromosome Y
effectuées chez des femelles démontrent que la différence au niveau de
quelques antigènes mineurs (ceux reliés au chromosome Y) est suffisante pour
mener au rejet immunologique.
4. Autres études se rapportant au rejet causé par les AgMH
D'autres équipes ont également entreprit des études de transplantation de
cellules musculaires s'apparentant à mon projet. Il est difficile de comparer les
résdtah car les expériences ont été menées de diverses façons. De plus, ces
équipes n'avait pas établit d'avance l'étude du rôle des AgMH dans le rejet de
greffe. C'est suite aux mauvais résultats obtenus qu'ils ont imputé la
responsabilité du rejet immunologique aux AgMH.
Le groupe de Fan ( Muscle and nerve, sous presse) ont obtenu d'excellents
résultats (survie du greffon: 1 ans et plus) lors de transplantations syngéniques
en greffant des muscles entiers provenant de souris mâles et greffés dans des
femelles. Mentionnons que le but des transplantations dans des femelles était
de suivre I'évolution de la greffe en se sentant d'une sonde spécifique au
chromosome Y. Ceci contraste avec les pauvres résultats qu'ils ont obtenus lors
de transplantations de myoblastes isolés. L'inaccessibilité du muscle entier au
système immunitaire, du moins pour la réponse immunitaire immédiate,
pourrait expliquer ces résultats.
Des expériences similaires avaient été effectuées par Grounds en 1980. Les
résultats obtenus contrastent avec ceux du groupe précédent puisqu'aucune
greffe n'a sunrécu plus de 7 jours. Toutefois, puisqu'ils ne se sont pas
préoccupés du sexe des receveurs, les antigènes mineurs reliés au chromosome
Y (H-Y) ont pu être impliqués dans le rejet. Le degré d'immunogénicité et la
quantité des antigènes présents pourraient donc expliquer ces divergences.
Enfin, le groupe de Watt a obtenu des résultats fort surprenants. En effet, dans
les allotransplantations de précurseurs myoblastiques, ils ont observé que 86%
des transplantations avaient un temps de s u ~ allant
e
jusqu'à 100 jours selon
les combinaisons de souches utilisées qui sont d'ailleurs différentes des nôtres.
Encore une fois, on peut expliquer ces divergences par le degré
d'immunogénicité des antigènes en présence (Watt, 1991).
6. Perspectives d'avenir
Comme le démontre la présente étude, le système immunitaire demeure un
obstacle majeur pour la réussite des transplantations de myoblastes, même
lorsque le donneur et le receveur sont histocompatibles. L'utilisation d'agents
immunosuppresseurs (FK 506, CyA) demeure nécessaire. Malheureusement,
ces composés entraînent des effets secondaires indésirables. Ils n'agissent pas
de façon spécifique, ils requièrent une administration à long terme et
augmentent les risques d'infection. La forme idéale d'immunosuppression
thérapeutique devrait être administrée sur une courte période et rendre
l'individu tolérant aux antigènes désirés à long terme sans toutefois empêcher
la réponse à un agent infectieux. L'équipe du Dr. Tremblay travaille
présentement sur l'utilisation des anticorps monoclonaux (mAb) comme
agents immunosuppresseurs. Il existe de nombreuses études concernant
l'emploi de mAb lors de transplantations chez différents modèles animaux
(Cobbold et al., 1986; Madsen et al., 1987; Lenschow et al., 1995). La plupart des
mAb utilisés ont été choisis selon leur interaction avec les récepteurs de
membrane impliqués dans la CO-stimulation et l'adhésion des cellules
immunitaires tels: CD3, CD4, CDS, ICAM-1, UA-1, B7-1 et 87-2. Le bloquage de
ces récepteurs sur les CFA ou sur les lymphocytes T par les mAb adéquats peut
mener soit au rejet immunitaire, soit à l'immunosuppression ou encore à la
tolérance à long terme (Waldmann et al., 1989; Pearson et al., 1990; Bushel et al.,
1995). Cette dernière situation est celle qui serait idéale et que l'on cherche à
obtenir. Il reste à déterminer si cette forme d'immunosuppression serait
efficace dans le cas d'incompatibilité au niveau des AgMH.
Cette voie de recherche semble très prometteuse pour contrer le système de
surveillance immunitaire et nous permet d'espérer pouvoir un jour effectuer
des transplantations de myoblastes dans les musdes des patients dystrophiques
et ainsi remplacer la protéine absente.
Arahata K, Ishiura S, Ishiguro T, Tsukahara T, Suhara Y, Eguchi CH,
Ishihara, Nonaka 1, Ozawa E, Sugita H. Immunostaining of
skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibody
against Duchenne muscle dystrophy peptide. Nature 1988; 333:
861-63.
Bailey DW. Genetic histocompatibility in mice. Immunogenetics 1975; 2:
249-56.
Bailey DW. How pure are inbred strains of mice? Immun01 Today 1982; 3:
310.
Bjorkman PJ, Parham P. Structure, function and diversity of dass-1 major
histocompatibility complex molecules. A m . Rev. Biochem
1990;59: 253-88.
Blau HM, Webster C, Chiu CP, Guttrnan S, Chandler F. Differenciation
properties of pure populations of human dystrophie muscle
cells. Exp Cell Res 1983;144:495503.
Boris LK, Temin HM. Recent advances in retrovirus vector technology.
Curr. Opin. genet. Dev. 1993;3: 102-9.
Boyd Y, Munro E, Ray P. et al. Molecular heterogenecity of handocations
associated with muscular dystrophy. Clinical Genetics 1987; 31:
265-272-
Campbell KP, Kahl SD. Association of dystrophin and an integral
membrane glycoprotein. Nature 1989;338:259-62.
Chelley J, Kaplan JC, Marie P,Gautron S, Kahn A. Transcription of the
dystrophin gene in human muscle and non-muscle tissue.
Nature 1988;3335358 -860.
Clemens P,Caskey T. Gene therapy prospects for Duchenne Muçcular
Dystrophy. Eur. Neurol1994; 34: 181-5.
Davies KE,Pearson PL, Harper PS. et al. Linkage analysis of two cloned DNA
sequences flanking the Duchenne muscular dystrophy locus on
the short arrn of the human X-chromosome. Nuclei Acids
Research 1983;11:2303-2312.
Desnuelle C. Les enseignements de la dystrophine. Le Presse médicale
1994; 19:896-900.
Dudienne GB. Recherches sur la paralysie musculaire
pseudohypertrophique ou paralysie myosdérosée. Ar& Gen
Med 1868;11,179,305,421,552.
Dunckley MG, Love DR, Davies KE, Walsh FS, Morris GE, Didcson G.
Retroviral-mediated transfer of a dystrophin mînigene into
mdx m o u e myoblasts in vitro. FEBS Lett. 1992;296: 128-134.
England SB, Nicholson LV, Johnson MA et al. Very mild muscular dystrophy
assoaated with the deletion of 46% of dystrophin. Nature 1990;
343: 180-2.
Falk K, Rotzsdike O, Deres K et al. Identification of naturally processed
viral nonapeptides allows their quantification in infected cells
and suggests an allele-specific T celi epitope forecast. J Exp
Med 1991;174:425-34.
Gordon RD, Simpson E, Samelson LE. In vitro celi mediated immune
response to the male specific antigen in mouse. J Exp Med 1975;
142:1108-20.
Gorer PA, Lyman S, Snell GD. Studies on the genetic and antigenic basis of
tumor transplantation. Linkage betweeen a histocompatibility
gene and b e d in mice. Proc. R. Soc. Lond (Biol.) 1948;135:
499-505.
Goulmy E, Termijtelen A, Bradley BA, Van Rood JJ. Alloimmunity to hurnan
H-Y. Lancet 1976;2: 1206.
Goulmy E, Termijtelen A, Bradley BA, Van Rood JJ. Y-antigen killing by Tcells of women is resticted by HLA. Nature 1977; 266: 544-5.
Goy JJ,Stauffer JC, Deruaz JE'et al. Myopathy as possible side-effect of
cyclosporin. Lancet 1989; 1: 1446-7.
Hohlfeld R, Engel AG. Induction of HLA-DR expression on human myoblasts
with interferon-gamma. Am J Pathol. 1990; 136: 503-8.
Huard J, Labrecque C, Dansereau G, et al. Dystrophin expression in myotubes
formed by the fusion of normal and dystrophic myoblasts. Muscle
and nerve 1991; 14: 178-82.
Horowitz M. Adenoviridae and their replication. In virology. Edited by
Fields BN, Knipe DM. New York: Raven press; 1990: 1679-1740.
Law PK,Goodwin TG, Wang MG. Normal myoblast injections provide genetic
treatment for murine dystrophy. Muscle and nerve 1988; 11:52533.
Grounds M. Commentary on the present state of knowledge for myoblast
transfer therapy . CeU transpkmtation 1996; 3: 431-3.
Guérette Br Roy R, Tremblay M, Asselin 1, Kinoshita 1, Puymirat J, Tremblay J.
Increased granzyme B mRNA after ailoincompatible myoblast
transplantation. Transplantation 1995; 60: 1011-6.
Guérette Br Vilquin JT, Guigras M, Wood K, Tremblay J. Prevention of
immune reaction triggered by first-generation adenoviral
vectors by monoclonal antibodies and CTLA4Ig. Human gene
therapy 1996; 7: 1455-63.
Hoffman EP, Brown RH, Kunkel LM. Dystrophin: The protein product of ;
the Dudieme muscular dystrophy locus. Cell 1987; 51: 91: 928.
Hoffman EP, Fishbeck KH, Rosenberg P, Pollina C, Kunkel LM. Cell and
fiber-type distribution of dystrophin. Neuron 1988; 1:411-20.
Hoffman EP. Human molecular genetics and the elucidation of the primary
biochemical defect in Duchenne muscular dystrophy. Ce11
Motil. Cytoskel 1989; 14:163-8.
Johnson LL. At how many histocompatibility loci do congenic mouse
strains differ. Probability estimates and some implications. J
Hered 1987 2: 27.
Kaminsky E, Sharrock C, Hows J. Frequency analysis of CTL precursor:
Possible relevance to HU-matched unrelated donor bone
marrows transplantation. Bone Marrow Transplantation 1988; 3:
149-65.
h
o T.
FK 506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces.
J Antibiot. 1987; 40: 1249-55.
Kinoshita 1, Vilquin JT,Guérette B, Asselin 1, Roy R, Tremblay JP. Very
efficient myoblast allotransplantation in mice under FK506
immunosuppression. Muscle and nerve 1994; 17: 1407-15.
Monaco AP, Kunkel LM. The complete sequence of dystrophin
predicts a rod shape cytoskeletal protein. Ce11 1988; 53: 219-26.
Komgold R, Wettstein PJ. Immunodominance i
n the GVHD T cell response
to minor histocompatibility antigens. J of Imrnunol. 1990; 145:
4079-88.
Kuby J. Immunobiology. W.H. Freeman and Company 1992;230-39.
Kunkel LM, Monaco AP, Middlesworth W, Ochs HD, Lah SA. Speafic doning
of DMD fragments absent from the DNA of a male patient with a
X-chromosome deletion . Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985;82:
4778-82.
Labrecque C, Bouchard JP,Malouin F, Roy R, Huard J, Tremblay JP.
Approches thérapeutiques de la myopathie de Duchenne par
transplantation de myoblastes. Méd S u 1991;7:821-9.
Law PK,Goodwin TG, Li HJ. Histoincompatible myoblast injection irnproves
muscle structure and function of dystrophie mice. Tramp1 Proc.
1988;20: 1114-19.
Loveland B, Simpson E. The non-MHC transplantation antigens: Neither
weak nor minor. Immun01 Today 1986;7: 223.
Lyon MF. Gene action in the X-diromosorne of the mouse (Mus.musculus L.)
Nature 1961;190:372-4.
Mohanakumar T. The role of MHC and non-MHC antigens in alIograft
immunity . Medical Intelligence Unit 1994;l-104.
Monaco AP, Neve RL, Coletti-Freener, Bertlson CJ, Kumit DM, Kunkel LM.
Isolation of candidate cDNAs for portion of the Duchenne
muscular dystrophy gene. Nature 1986;323: 646-50.
Morgenstern JI?, Land H,. Advance mamrnalian gene transfer : High titre
retroviral vectors with multiple dmg selection markers and a
complementary helper free packaging cell lines. Nucleic Acids
Res. 1990;19: 3587-96.
Morgan JE. Normal muscle precursor implants restitute normal histology to
degenerating muscles of the mdx mouse. J Neurol Sci. 1990;98:
126.
Mulligan RC. The basic saence of gene therapy. Science 1993;260: 926932.
Murray JM,
Davies KE,Harper PS.et al. Linkage relationship of a cloned DNA
sequence on the short a m of the X-chromosome to Duchenne
muscular dysfxophy. Nature 1982;300:69-71.
Pagel CN, Morgan JJ5Myoblast Transfer and gene therapy in muscular
dystrophies. Micros. Res. and Tech. 1995;30:469-79.
Partridge TA, Morgan JE,Coulton GR, Hoffman EP, Kunkel LM.
Conversion of mdx myofibres from dystrophic-negative to
positive by injection of normal myoblasts. Nature 1989;
337:176-9.
-
Partridge TA, Sloper JC. A host conhibution to the regeneration of muscle
grafts. J Neurol Sci 1977;33: 425-35.
Partridge TA. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for
inherited myopathies? Muscle and nerve 1991;14: 197-212.
Perreault C, Decary G, Brochu S et al. Minor histocompatibility antigens.
Blood 1990;76(7): 1269.
Rammensee HG, Falk K, Rôtzschke O. MHC molecules as peptide
receptors. Curent Opinion in Immunology 1993; 5: 35-44.
Rammensee HG, Falk K, Rotzschke O. Peptides naturally presented by
MHC class 1molecuIes. Ann. Rev. Immunol. 1993; 11: 213-244.
Rammensee HG, Klein J. Polymorphism of minor histocompatibility genes
in wild rnice. Immunogenetics 1983; 17: 637.
Roopenian DC. What are minor histocompatibility loci? A new look at a old
question. Immun01 Today 1986; 7: 223.
Roy R, Tremblay J, Huard J, Richards C, Malouin F, Bouchard JP. Antibody
formation after myoblast hansplantation in Duchenne
dystrophie patients, donor HLA-compatible.
Scornik JC, Brunson ME, Howard RJ et al. AUoimmunization, memory and
the interpretation of cross-matdi results for rend
transplantation. Transplantation 1992;54: 389-94.
Sincinski P, Geng Y, Ryder-Cook AS et al . The molecular basis of muscular
dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science 1989; 244:
1578-80.
Simpson E, Chandler P, Goulmy E et al. Çeparation of the genetic loci for
the H-Y antigen and the testis determination on the human Ychromosome. Nature 1987; 326: 876-8.
Simpson E, Tomonan K, Lovering E. Minor transplantation antigens: Their
role in shaping the T cell repertoire. Immun01 Lett 1989; 21: 39.
Simpson E. T and B lymphocytes: Two repertoires or one? Immun01 Lett
1986;12: 185.
Snell GD, Dausset J, Nathenson S. Histocornpatibility. San Diego, CA,
Academic 1976.
Snell GD. Methods for the study of histocompatibility genes. J Genetics
1948; 49: 87-108.
Snell GD. Studies in histocompatibility. Science 1981; 213: 172-8.
Soulillou J.P. Les greffes d'organes. La recherche 1986; 177: 586-99.
Stephew FE, Tyler FH. Studies in disorders of muscle. The inheritance of
diildhood progressive muscular dystrophy in 33 kindreds.
Am J of Hum Gen 1951; 111-125.
Stredni B, Schwartz RH. Alloreactivity of an antigen specific T-tell clone.
Nature 1980; 287 855-7.
Townsend A, Elliot T, Cenindolo V et al. Assembly of MHC class 1
molecules analyzed in vitro. Cell 1990; 62: 285-95.
Townsend A, Ohlen Cf Bastin J, Ljunggren HG, Foster L, Karre K.
Association of class 1major histocompatibility heavy and light
chains induced by viral peptides. Nature 1989; 340: 443.
Tremblay JP,Bouchard JI?, Malouin F et al. Myoblast transplantation between
monozygotic twin girl carriers of Duchenne muscular dystrophy.
Neuromuscular Disord 1993; 3: 583-92.
Tremblay JF,
Malouin F, Roy R et al. Results of a triple blind clinical study of
myoblast transplantations wi thout immunosuppressive
treabnent in young boys with Duchenne muscular dystrophy.
Cell Transplantation 1993; 2: 99-112.
Vilquin JT,Asselin 1, Guérette B et al. Myoblast allotransplantation in mice:
the degree of success varies depending on the efficacy of vanous
irnrnunosuppressive treatments. Transpl. Proceed. 1994; 6: 337273.
Viquin JT, Kinoshita 1, Roy R, Trembiay JP. Cydophosphamide
immunosuppression does not permit successful myoblast
allotransplantation in moue. Neuro. disord. 1995; 5: 511-517.
Vilquin JT,Asselin 1, Guérette 8,et al. Successful myoblast allotransplantation
in mdx mice uskg rapamycin. Transplantation 1995; 59: 422-426.
Vilquin JT,Wagner E, Kinoshita I f Roy R, Trernblay JP. Successful
histocompatible myoblast transplantation in dystrophin-deficient
mdx m o u e despite the production of antibodies against
dystrophin. J Cell Bi01 1995; 131: 975-88.
Von Boehmer H, Haas W. H-2 restricted cytolytic and non-cytolytic T cell
clones: isolation, specificity and functional analysis. Immun01
Rev 1981; 54: 27-56.
Waldmann H, Cobbold S. The use of monoclonal antibodies to adueve
immunological tolerence. TiPS 1993; 14: 143-48.
Wallny HJ, Rammensee HG- Identification of classical minor
histocompatibility antigens as cell derived peptide. Nature
1990; 343: 275-81Nattrass FJ.On the classification, natural history and treatment
Walton JN,
of the myopathies. Brain 1954; 77: 169-231.
Watkins DC,Hoffman EP, Slayter HS, Kunkel LM. Immunoelectron
rnicroscopic localization of dystrophin in myofibres. Nature 1988;
333: 863-6.
Watt DJ, Morgan JE, Clifford MA, Partridge TA. The movement of muscle
precursor cells between adjacent regeneration muscles in the
mouse. Anat Embryol 1987; 175: 527-36.
Wernig A, Irintchev A. Bystander damage of host muscie caused by
implantation of MHC-compatible myogenic cells. J Neurol Sci.
1995; 130: 190-6.
Wettstein PJ, Bailey DW. Immunodominance in the immune respowe to
multiple histocompatibility antigens. Immunogenetics 1982;
16: 47-58.
Wettstein PJ. Immunodominance in T cell responce to multiple non-H2
histocompatibility antigens II: Observation of hierarchy among
dominant antigens. Immunogenetics 1986; 24: 24.
Wettstein PJ. Minor histocornpatibility loci. Litwin S. ed. Human
immunogenetics. New York: Dekker 1989; 339-57.
Yewdell JVV, Bennidc JR. The b i n q logic of antigen processing and
presentation to T ce&. Cell 1990;62:2036.
Zubrzycka-Gaam EE, Bulman DE, Karpati G, et al. The Duchenne
muscular dystrophy gene product is localized in sarcolemma
of human skeletal muscle. Nature 1988; 333: 466-9.
IMAGE EVALUATION
TEST TARGET (QA-3)
APPLIED
IMAGE. lnc
1653 East Main Street
-.- Rochester.
NY 14609 USA
--
---,
Phone: 71648.2-0300
Fax: 716/28&5989