Physiologie bactérienne: Nutrition et Croissance
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Faculté de Médecine d’Alger Enseignement de Microbiologie Première Post-Graduation Année Universitaire 2012-2013 Pr. A. BENSLIMANI Physiologie bactérienne: Nutrition et Croissance DEFINITIONS : La physiologie bactérienne consiste à étudier la nutrition, le métabolisme et la croissance des bactéries en fonction des variations (naturelles ou contrôlées) du milieu dans lequel elles vivent. Nutrition bactérienne : c’est l'analyse des besoins élémentaires , énergétiques et spécifiques nécessaires au fonctionnement et à la croissance de la bactérie , ainsi que des facteurs physicochimiques susceptibles de les influencer . Métabolisme biochimique bactérien : C’est l’ensemble des transformations chimiques ( anabolisme ou biosynthèse et catabolisme ou dégradation) qui assurent l’élaboration des constituants bactériens et leur fonctionnement . Croissance bactérienne : Dans un environnement optimal, la cellule bactérienne, grâce à son système enzymatique très développé ,va donner naissance en peu de temps (20 minutes pour la majorité des bactéries de l'environnement) , à deux bactéries filles qui lui sont identiques : On parle de croissance bactérienne .Elle se manifeste par une augmentation numérique des cellules bactériennes et non pas une augmentation de taille comme chez les organismes supérieurs ( homme, animal, plante). En définitive, une bactérie se forme, se développe, vit et se reproduit puis dépérit et meurt. CHAP I – NUTRITION ET CROISSANCE BACTERIENNE : A- NUTRITION : Pour survivre et se multiplier , les bactéries ont besoin d’ une quantité plus ou moins importante de substances minérales et organiques dites substances alimentaires ou nutriments. La dégradation de ces aliments , que l’on met à leur disposition dans les milieux de culture , va leur fournir les éléments simples (Carbone , Azote , Minéraux) , et l’énergie , qu’elles vont réutiliser pour synthétiser leurs propres constituants structuraux et enzymatiques . Les bactéries ont toutes un certain nombre de besoins communs tels : l’eau , une source d’énergie , une source de Carbone , une source d’Azote et des éléments minéraux . D’ailleurs , en examinant la composition chimique de la cellule bactérienne , on peut deviner ses besoins nutritifs : La bactérie est faite en majorité d’eau : 75 à 80 % de son poids total La matière sèche est faite de protéines (55%) , rRNA (16,7%), tRNA (3%), mRNA( 0,8%), DNA (3,1%), lipides (9,1%), Lipopolysaccharides (3,4%), Peptidoglycanes (2,5%), vitamines (2,9%) et ions inorganiques (1,0%). En résumé, la matière bactérienne sèche comporte : 95 % : C , O, N , H , P, S 5 % : K , Mg , Ca , Fe , Mn , Co , Cu , Zn 1 Donc, la bactérie aura besoin de 3 types d’éléments nutritifs : 1.Besoins élémentaires et énergétiques : 1-a- Les besoins élémentaires : - L’eau : Besoin majeur, il entre dans la composition de tous les milieux de culture. - Le Carbone : C’est un des éléments les plus abondants de la bactérie : il doit être fourni en quantité suffisante .Le plus simple des composés carbonés est le CO2 ou anhydride carbonique. On distingue les bactéries en 2 catégories : celles capables de se développer en milieu inorganique contenant le CO2 comme seule source de Carbone : Bactéries AUTOTROPHES (Stricte/ CO2 obligatoire, Facultatif /CO2 ou composé organique) ex. bactéries photosynthétiques et la plupart des bactéries chimiolithotrophes) - celles qui exigent des composés organiques comme source de carbone : bactéries HETEROTROPHES. Ainsi, ces bactéries sont capables de dégrader une panoplie de substances hydrocarbonées : Alcool, acide acétique, acide lactique (molécules simples), polysaccharides (complexes). Le CO2 peut cependant jouer un rôle majeur chez ces bactéries, en intervenant dans la synthèse de certains métabolites essentiels, à travers des réactions de carboxylation . ex.Brucella abortus . L’Azote : Les substances azotés entrent dans la composition des protéines bactériennes. L’azote peut être fixé par la bactérie : sous forme d’azote moléculaire, c’est à dire la forme la plus simple. ex. les Rhizobium – Azotobacter et certains Clostridiums. Sous forme de composés inorganiques : Ex. Nitrites par les Nitrobacter Ammoniac sous forme de sels d’ammonium par les Nitrosomonas Sous forme de composés organiques R-NH2 dont les groupements aminés représentent la source d’azote. - Le Phosphore et le Soufre : Ils occupent une place de choix. ● Phosphore : Il entre dans la composition des acides nucléiques, de nombreux coenzymes et de l’ATP. Il est incorporé dans la bactérie sous forme de Phosphate inorganique. Il permet la récupération, l’accumulation et la distribution de l’énergie dans la cellule. ● Soufre : Il entre dans la composition des acides aminés, des Protéines (groupement thiol). Il est incorporé dans la cellule sous forme de sulfate, de composés soufrés organiques, rarement sous forme de soufre réduit. - L’O2 et l’H2 : sont apportés par l’eau et par l’air atmosphérique. Les éléments cités doivent être apportés en quantités suffisantes. 2 - En plus faible quantité sont apportés les éléments minéraux. ● Certains interviennent dans l’équilibre physico-chimique de la cellule : Na ,K , Mg et Cl. ● D’autres constituent les enzymes ou les coenzymes : Fer des Cytochromes. - A l’état de traces, souvent apportés par l’eau : Ce sont les les oligo-éléments car ils sont indispensables en quantité infime : Ce sont Ca , Mg , Co , Cu , Mn…. A noter que de nombreux ions métalliques peuvent être toxiques pour certaines cellules (ex : les sels de cuivre) alors que d’autres ions sont indispensables à des concentrations précises , soit pour la synthèse d’un métabolite (ex : 0.14 mg de Fe/l pour la synthèse de la toxine diphtérique) , soit pour la synthèse de pigment (ex : Fer+Magnésium pour la production de Prodigiosine chez Serratia marcescens). 1-b-.Besoins énergétiques Ils couvrent les dépenses engagées dans les processus de biosynthèses. Les bactéries peuvent utiliser comme source d'énergie : - soit l'énergie lumineuse (bactéries phototrophes),qui transforment les photons lumineux en liaison ADP~Pi - soit l'énergie fournie par les processus d'oxydo-réduction (bactéries chimiotrophes). Bactéries Phototrophes Bactéries Chimiotrophes Elles utilisent un substrat oxydable minéral ou organique , comme source d’électrons. Elles puisent leur énergie au niveau de réaction REDOX , couplant une réaction d’oxydation d’un substrat SH2 à une réaction de réduction .L’énergie est fabriquée au cours de ces réactions REDOX par Phosphorylation. On distingue 2 types de Phosphorylation : hγ SH2 ADP + Pi NAD + NADH + H - Phosphorylation au niveau du substrat : A AH2 ATP S ADP + Pi ATP E SH2 SH2 S - Phosphorylation oxydative : SH2 minéral SH2 organique B. photolithotrophe B.photoorganotrophe SH2 S + - 2H + 2e chaîne de transport A AH2 ATP ATP SH2 SH2 minéral SH2 organique B. chimiolithotrophe B. chimioorganotrophe 3 Les bactéries phototrophes font appel à des composés minéraux ou organiques comme sources d'électrons. Si le substrat oxydable est minéral, la bactérie est dite photolithotrophe : elle est capable de se développer dans un milieu purement minéral comme le font les végétaux :exemple les bactéries sulfureuses pourpres ou vertes. Si le substrat oxydable est organique, la bactérie est dite photoorganotrophe : exemple les bactéries pourpres non sulfureuses. Les bactéries chimiotrophes ,qui puisent leur énergie à partir de réactions redox ,utilisent des composés minéraux ou organiques comme "donneurs d’hydrogène ou d’électrons" ou "accepteurs d'électrons". Si le donneur d’électron est un corps minéral, la bactérie est dite chimiolithotrophe, exemple bactérie oxydant l’hydrogène . Si le composé est organique , la bactérie est dite chimioorganotrophe. La grande majorité des bactéries font partie de cette dernière catégorie: bactéries pathogènes d’intérêt médical, de contamination alimentaire, d'usage industriel pour la synthèse d'antibiotique de vitamines... 2. Des besoins spécifiques: Ce sont des métabolites essentiels que la bactérie n’est pas en mesure de synthétiser par défaut enzymatique et qu’il faut donc lui fournir pour permettre son développement. On les appelle Facteurs de croissance. Les bactéries sont donc classées en 2 catégories : - Les Prototrophes qui ne nécessitent pas de facteur de croissance (ex. E.coli) - Les Auxotrophes qui les exigent (ex. Haemophilus influenzae) . Ex. Haemophilus influenzae exige 2 facteurs de croissance : facteur V ou NAD et facteur X ou hémine. Ces 2 facteurs sont présents dans la gélose au sang cuit , libérés par chauffage du sang . Seul le facteur X est présent dans la gélose au sang frais car le facteur V est strictement intra-GR et n’est en général pas libéré dans le milieu. On cultive en strie , Staphylococcus aureus , qui libère dans le milieu du NAD synthétisé en excès et Haemophilus influenzae pousse en satellitisme autour de la strie : C’est le phénomène de SYNTROPHIE. Les facteurs de croissance peuvent appartenir à 3 classes : - Les Acides aminés (pour la synthèse des Protéines) - Les bases puriques et pyrimidiques (pour la synthèse des acides nucléiques) Les vitamines (comme Coenzymes ou Précurseurs de Coenzyme) Les besoins quantitatifs sont de l'ordre de 10 microgrammes pour la 1ère et la 2ème classe et de l'ordre de 1 microgramme pour la 3ème classe. Les facteurs de croissance présentent des caractères communs: - ils sont actifs à concentration infime - ils sont étroitement spécifiques c’est à dire qu’un simple changement de position d’un groupement dans la molécule lui enlève toute son activité . 3- Les facteurs physiques : Ils interviennent de façon primordiale dans l’obtention d’une culture optimale .En effet , les nutriments doivent être apportés à la bactérie dans les conditions d’environnement qui lui conviennent , sinon , ils peuvent l’inhiber. a- Température : Selon le comportement de la bactérie vis à vis de la température , on distingue : les bactéries mésophiles :dont la température optimale de croissance se situe entre 20°C et 40°C .On admet généralement 30°C pour les mésophiles saprophytes , 37°C pour les 4 - mésophiles pathogènes . La majorité des microorganismes de l’homme et de l’animal sont des mésophiles : Bactéries pathogènes , bactéries des cavités naturelles ou du revêtement cutanéo-muqueux humain …. Les bactéries thermophiles : la température optimale est de 45°C à 65°C , généralement 55°C. Ce sont les bactéries des sources thermales .ex. Bacillus et Clostridium. Les bactéries psychrophiles : dont la température optimale se situe autour de 0°C. Dans cette catégorie , on peut situer les B.Psychrotrophes qui cultivent abondamment aux températures de réfrigération mais qui se multiplient encore plus à 10°C ou 20°C.Ces bactéries contaminent souvent les produits laitiers , de même que les produits biologiques (sang ou dérivés sanguins) conservés à basse température .ex .Pseudomonas , Acinetobacter, Aeromonas. Les bactéries cryophiles : qui préfèrent des températures inférieures à 0°C :Ce sont les bactéries des océans et des glaciers. b- Le pH : Les bactéries préfèrent un pH neutre ou légèrement alcalin (7 –7.5) mais les limites sont très larges : E.coli cultive entre pH 4.4 et pH8 Lactobacilles exigent plutôt un pH bas , voisin de 6 ( L.acidophilus) Vibrion se multiplie au pH optimal de 9 Pour éviter les brusques variations de pH dues aux modifications chimiques qui résultent de la dégradation du substrat , on utilise des solutions tampons. Les tampons phosphates (K2HPO4 et KH2PO4) sont les plus utilisés parce qu’ils permettent de garder le pH dans une large zone autour de 7 , parcequ’ils ne sont pas toxiques et qu’ils représentent une source de phosphore. c- L’Oxygène : Selon le type respiratoire, on distingue : les B .aérobies strictes : ne peuvent vivre qu’en présence d’oxygène de l’air et tolèrent des PO2 élevées. ex. BK , B.pyocyanique , culture uniquement en surface. Les B. anaérobies strictes : ne supportent pas l’O2 qui leur est toxique ex. Bacteroides fragilis . Culture uniquement au fond du tube. Les B.aéro-anaérobies facultatives :se développent aussi bien en présence qu’en absence d’oxygène . Leur richesse enzymatique leur permet d’utiliser l’O2 s’il est présent et d’utiliser la voie fermentaire quand l’oxygène est absent. ex. Entérobactéries Les B. microaérophiles : ne se reproduisent qu’en présence d’une faible tension d’oxygène . ex. Campylobacter Les B. anaérobies aero-tolérants : bien que tolérant l’oxygène , ils ne peuvent pas l’utiliser et tirent leur énergie exclusivement de la fermentation. ex. Lactobacilles d- Pression osmotique : Grâce à une paroi spécifique des procaryotes ( Muréine) qui leur confère une rigidité et une résistance aux chocs , les bactéries tolèrent des variations de concentrations ioniques . Certaines bactéries tolèrent des concentrations salines importantes ex. Enterococcus (6.5% Nacl) Staphylococcus aureus ( 7.5%Nacl) 5 Connaissant l’ensemble des besoins nutritifs de la bactérie , nous pouvons introduire la notion de culture bactérienne . La culture bactérienne a donné un essor considérable à l’étude des bactéries puisque nous sommes passé , grâce aux milieux de culture , du simple examen microscopique à l’isolement , et de là , à l’identification des bactéries . Pour cela , des milieux de culture ont été mis au point . 1- Définition : Le milieu de culture doit apporter à la bactérie un mélange équilibré de tous les nutriments nécessaires , à des concentrations qui permettent une croissance optimale, c’est à dire : - ni trop faible , sinon le milieu s’appauvrit vite et la bactérie cultive mal ; - ni trop forte sinon le milieu devient vite toxique . La composition du milieu de culture varie à l’infini. Elle est choisie en fonction du but à atteindre et des besoins requis par la bactérie . Le milieu peut être solidifié par addition d’Agar : C’est une substance extraite d’algues marines et qui possède la propriété de fixer une grande quantité d’eau d’où gélification . 2- Classification :On distingue différents critères de classification : 2-1- la composition chimique : permet de distinguer les milieux en 3 groupes : - Naturels ou Complexes : à base d’extraits de matière organique , afin d’apporter tous les nutriments nécessaires y compris les facteurs de croissance . On y rajoute le Glucose comme source de carbone et d’énergie . ex :Bouillon nutritif On distingue comme extraits de matière organique : Extraits de viande par macération , infusion ou décoction de tissus animaux : solution riche en sels minéraux , vitamines , protéines et glucose Extraits de levure par hydrolyse enzymatique de cellules de levure : mélange d’acides aminés , peptides , vitamines et hydrates de carbone Peptones obtenus par action d’enzymes protéolytiques sur des matières organiques telles Soja , viande ….en fonction de l’enzyme : Peptones pepsiques , Peptones trypsiques , Peptones pancréatiques - Semi-synthétiques : milieu synthétique auquel on rajoute de l’extrait de levure comme source de facteurs de croissance . - Synthétiques : qui possède une composition chimique bien définie .ex. Citrate de Simmons 2-2- La consistance : distingue les milieux en 3 groupes , en fonction de la concentration en Agar du milieu : milieu liquide (ex. bouillon de Clark –Lubs) milieu solide ou gélosé (ex. gélose Chapman) milieu semi-liquide ou faiblement gélosé (ex. milieu Mannitol-mobilité). 2-3- L’utilisation : On distingue : les milieux usuels ou de base (ex. gélose nutritive , bouillon nutritif) les milieux enrichis (ex. gélose au sang) les milieux sélectifs ou électifs (ex. gélose Hektoen) les milieux d’identification (ex. milieu TSI) les milieux de conservation les milieux de transport (milieu T.G.V.) 6 B- CROISSANCE BACTERIENNE : 1- Définition : C’est l’accroissement ordonnée de tous les composants d’un organisme . Si, chez les organismes supérieurs , elle aboutit à une augmentation de taille , chez les organismes unicellulaires (bactéries , levures) , elle aboutit à une augmentation du nombre d’individus . Il y a donc multiplication, toutes les 30mn environ, d’une bactérie, donnant naissance par division , à 2 nouvelles bactéries identiques . On définit le Temps de génération comme le temps requis pour un dédoublement du nombre de bactéries . ex. E.coli :TG= 20mn M.tuberculosis : TG= 20 h On définit aussi le Taux de croissance comme le nombre de divisions par unité de temps (ex. 3 pour E.coli). Au cours de la croissance, le milieu s’appauvrit en éléments nutritifs disponibles et s’enrichit en produits du catabolisme, souvent toxiques. Des modifications y surviennent, touchant le pH, le potentiel Redox, la pression osmotique … 2- Techniques de mesure de la croissance bactérienne : a- Dénombrement direct des bactéries : les bactéries sont considérées comme des Particules que l’on dénombre à l’état frais ou après coloration. a-1- Numération totale : on utilise pour cela : l’examen au microscope à l’aide d’une cellule hématimétrique : on compte toutes les bactéries vivantes ou mortes. La mesure automatisée avec un compteur de particules, des bactéries en suspension dans une solution d’électrolyte : on compte aussi bien les bactéries que les particules inertes de même taille . La méthode d’épifluorescence : Les bactéries sont colorées par un flurochrome : l’Acridine orange est actuellement le plus communément utilisé et colore en rouge fluorescent les bactéries en voie de croissance ou les cellules mortes porteuses d’un ADN dégénéré . Par contre , l’Acridine orange colore en vert fluorescent les bactéries inactives contenant un ADN bicaténaire. Cette coloration permet donc le comptage de toutes les cellules bactériennes ( bactéries totales ) sans distinction entre les vivantes et les mortes. a-2- Numération des cellules viables : Les bactéries cultivables forment des colonies sur un milieu de culture approprié : on utilise la culture en boîtes de Pétri ou Plate Count. dilutions susp. brute 1 volume fixe étalement ou incorporation 18h à 37°C n= nombre de colonies comptées dans le volume analysé (UFC ou unité formant colonie) Inconvénient : Plusieurs cellules agglomérées peuvent ne donner qu’une seule colonie. De nombreuses cellules isolées ne forment pas nécessairement de colonie. On peut utiliser la technique de filtration sur membrane , qui concentre les bactéries présentes en faible quantité dans un échantillon liquide ( ex. Colimétrie des eaux). 7 b- Mesure de la biomasse : b-1- détermination du poids sec : Microorganismes récoltées par centrifugation ou par filtration sur membrane lavage soigneux à l’aide d’un tampon approprié culot desséché à 100 °C-110°C Poids sec ( gr. de matière sèche par litre) Inconvénient : toute la masse cellulaire est mesurée . De plus , c’est une technique longue et délicate. b-2- Mesure de la Densité optique (DO) : On évalue la DO du milieu de croissance en fonction du temps , à une longueur d’onde donnée . En utilisant la Loi de BEER-LAMBERT qui définit les relations existant entre les intensités d'un faisceau lumineux avant et après la traversée d'une culture bactérienne , on peut évaluer la croissance bactérienne en déterminant la Densité Optique de la culture bactérienne. La mesure de la D.O. se fait à une longueur d'onde allant de 450 à 550nm et les cultures bactériennes sont diluées de façon à obtenir des D.O. inférieures à 0,4 ( les DO évoluent linéairement à la concentration cellulaire). b-3- Technique de la Cytométrie en flux : Elle consiste à mesurer un ou plusieurs paramètres spécifiques d’une cellule isolée , entraînée par un flux liquide . Cette technique est couramment appliquée en hématologie . Elle est encore en cours d’évaluation en microbiologie. c- Spectrométrie de masse : c’est une technique physique d’analyse permettant de détecter et d’identifier des molécules par mesure de leur masse et de caractériser leur structure chimique. Technique extrêmement sensible , elle est souvent couplée à un système de chromatographie en phase gazeuse .Cette association d’une méthode séparative et d’une méthode d’identification permet d’étudier des mélanges complexes à l’état de traces. Le principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). La spécrtométrie de masse est utilisée dans pratiquement tous les domaines scientifiques : physique , médecine, biologie, chimie organique…et même dans le domaîne de l’art. Le spéctromètre de masse comprends 5 parties principales : - le système d’introduction pour faire pénétrer l’échantillon dans l’appareil - la source d’ions dans laquelle les molécules sont ionisées après bombardement électronique , les méthodes d’ionisation étant multiples et dépendantes de la nature de l’échantillon et du type d’analyse - l’analyseur qui réalise le tri des ions fragments en fonction du rapport masse/charge par l’application d’un champ magnétique et/ou électrique - un détecteur qui collecte les ions fragments et amplifie le signal associé aux ions - un ensemble informatique de traitement des données qui permet de transformer les informations reçues par le détecteur en spectre de masse. En microbiologie, l’application du principe de la spectrométrie de masse se fait par la technique MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Resorption Ionisation Time of Flight). Elle permet alors l’identification des microorganismes grâce à l’analyse de leurs protéines ribosomiales et membranaires. Il existe actuellement plusieurs systèmes sur le marché et les laboratoires s’équipent de plus en plus avec ce type d’automate. La spectrométrie de masse est peu couteuse en consommable mais son coût à l’investissement et en matière de maintenance est élevé. C’est une technique simple, rapide, fiable , permettant l’identification d’un nombre croissant de taxons parmi les plus couramment isolés au laboratoire de bactériologie. Cette technique est en développement pour une identification directe des germes dans les produits pathologiques, pour la mise en évidence des facteurs de virulence ou de résistance aux antibiotiques et enfin pour les études épidémiologiques par comparaison de spectres. 8 3- Cinétique de la croissance bactérienne : L'étude de la croissance bactérienne dans le temps ou cinétique de la croissance peut être représenté sur un graphique en portant: - en ordonnée, les valeurs des log de la D.O du milieu de culture; - en abscisse, le temps. L'utilisation des log de base 2 facilite cette représentation: La courbe de croissance obtenue montre alors 6 phases: voir figure Phase A: Phase de latence :C'est la phase d'adaptation des bactéries à leur milieu de culture. On ne note pas de multiplication bactérienne pendant cette phase. Elle correspond à la mise en route des systèmes enzymatiques de la bactérie. Phase B : Phase d'accélération pendant laquelle le temps de génération se raccourcit pour atteindre la valeur caractéristique de l’espèce bactérienne étudiée. Phase C: Phase de croissance exponentielle : Le taux de croissance atteint la valeur maximale .Il y a dédoublement de la population à des intervalles de temps réguliers (dédoublement de la population toutes les 20 minutes pour E.coli). Phase D: Phase de ralentissement :Le taux de croissance baisse progressivement, le temps de génération s'allonge. Phase E: Phase stationnaire: La masse bactérienne est maximale . Les nouvelles générations équilibrent les vieilles bactéries qui se lysent. Phase F: Phase de déclin: La masse bactérienne décroît du fait de la lyse accélérée des bactéries. Ceci est lié à un épuisement des nutriments, à une réduction de l'oxygène , à une accumulation des déchets. Le temps de génération est de plus en plus long ,créant un déséquilibre entre les nouvelles générations de bactéries (de plus en plus rares) et les vieilles bactéries qui meurent en plus grand nombre. 0,3 log de la DO 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 A B C D E F temps Courbe de croissance bactérienne (milieu de culture non renouvelé) 4- Les modifications de la courbe de croissance : a- Croissance continue : La courbe de croissance est celle obtenue pour une culture bactérienne en milieu non renouvelé. On peut avec des artifices ,obtenir une culture bactérienne maintenue pendant très longtemps en phase de 9 croissance exponentielle :C'est ce qu'on appelle une croissance continue ,obtenue par un apport régulier de milieu nutritif neuf et extraction d'une quantité équivalente de vieux milieu. Ces procédés sont couramment utilisés dans l'industrie pour obtenir des corps bactériens de même âge (préparation de vaccins bactériens), ou des métabolites bactériens (vitamines ) ,des toxines bactériennes (préparation d'anatoxines) en grande quantité. b- La diauxie : En milieu synthétique , lorsque l’on fournit à la bactérie 2 substrats carbonés (aliments limitants ) , on peut assurer 2 modes de croissance : - une courbe de croissance normale , comme si un seul substrat limitant a été donné. - Une courbe diphasique , caractérisée par une première croissance exponentielle , suivie d’un plateau puis d’une deuxième phase exponentielle succédant à une phase de latence intermédiaire plus ou moins prononcée. Cause : au cours de la croissance , l’un des substrats est utilisé en premier jusqu’à épuisement avant que le deuxième substrat ne soit assimilé à son tour. II- METABOLISME BIOCHIMIQUE BACTERIEN: 1- Il est défini comme l'ensemble des transformations chimiques (réactions anaboliques et cataboliques ), qui assurent l'élaboration des constituants bactériens et leur fonctionnement. Grâce à un équipement enzymatique très complet, toutes les réactions chimiques du métabolisme bactérien sont catalysées par des enzymes spécifiques. L'étude du métabolisme bactérien permet de définir des caractères d'identification biochimique qui représentent des critères essentiels dans la classification (ou Taxonomie) bactérienne. ALIMENTS Réactions cataboliques MOLECULES SIMPLES METABOLITES INTERMEDIAIRES Réactions COMPOSANTS CELLULAIRES ATP DECHETS anaboliques MOBILITE TRANSPORTS (perméases) Les réactions cataboliques permettent à la bactérie de convertir les aliments mis à sa disposition ( Protéines , Lipides , Polysaccharides) en molécules organiques simples ou en métabolites intermédiaires , avec production d’énergie sous forme de liaison phosphate ADP ˜ Pi . Les liaisons anaboliques sont les voies de biosynthèse que la bactérie emprunte à partir de ces molécules simples pour synthétiser des macromolécules intervenant dans la structure et le fonctionnement bactérien. L’énergie utilisée dans ces biosynthèses provient du catabolisme. 10 2- Métabolisme énergétique : 2-1- Introduction : La bactérie produit de l’énergie au cours du catabolisme par le biais de réactions dites EXERGONIQUES . Pour éviter toute perte sous forme de chaleur , ces réactions exergoniques (productrices d’énergie) sont couplées à des réactions dites ENDERGONIQUES (absorbent l’énergie). L’énergie est ainsi emmagasinée dans des liaisons chimiques telles la liaison phosphate de l’ATP , ou encore , immédiatement consommée dans une réaction qui en nécessite. Chez les bactéries d’intérêt médical , qui sont chimioorganotrophes , les réactions exergoniques sont des réactions d’oxydation d’un composé organique . A partir d’un substrat SH2 , la réaction d’oxydation ou DESHYDROGENATION fait perdre 2électrons et 2 protons au substrat qui est oxydé. Ne pouvant rester libres , ces derniers sont éjectés puis captés par un accepteur d’électrons A qui est ainsi réduit en AH2 . Ces 2 réactions d’oxydation et de réduction sont exergoniques .L’énergie libérée est emmagasinée en ATP. SH2 S + Energie 2H+ + 2é ADP + Pi A ATP AH2 + Energie La réaction REDOX Le métabolisme énergétique d’une bactérie chimioorganotrophe est constitué d’une suite de réactions REDOX avec libération d’énergie, partant d’un substrat organique. Le composé organique peut être : - un hydrate de carbone (surtout le glucose) source la plus importante d’énergie - un acide aminé - un acide gras - un alcane - une base purique ou pyrimidique Les réactions redox productrices d’énergie sont intégrées dans 2 types de processus énergétiques : La Fermentation et la Respiration . - La fermentation a été définie par Pasteur comme la « vie sans air » En fait , c’est une oxydation biologique au cours de laquelle l’accepteur final d’H2 et d’é est un composé organique. Ce composé peut être présent dans le milieu ou provenir de la dégradation d’un substrat oxydable . Les voies fermentaires se déroulent au sein du cytoplasme bactérien. L’énergie est produite par Phosphorylation au niveau du substrat. Le bilan énergétique est réduit. SH2 S’ + 2H + 2é ADP + Pi S - ATP S’H2 La Respiration est l’ensemble des voies métaboliques au cours desquelles l’oxygène moléculaire ou des composés oxygénés inorganiques ou ioniques jouent le rôle d’accepteur d’électrons et d’H2 dans les réactions redox. Ces voies sont liées à la membrane cytoplasmique de la bactérie. L’énergie est produite par phosphorylation dite oxydative et libérée par paliers via une chaîne de transfert d’électrons ; Le bilan énergétique est élevé. 11 2-2- Les voies du métabolisme intermédiaire : Pour oxyder un substrat énergétique donné, il existe un ensemble de réactions cataboliques communes à de nombreuses bactéries : Ce sont les voies générales du métabolisme énergétique ou métabolisme intermédiaire. Ainsi, l’oxydation du glucose, considéré comme substrat énergétique oxydable le plus typique, emprunte les voies du métabolisme intermédiaire .On distingue 3 principales voies enzymatiques, à localisation cytoplasmique, qui oxydent le glucose en acide pyruvique, véritable plaque tournante du métabolisme et situé au carrefour du métabolisme intermédiaire : - La voie d’embden-Meyerhof –Parnas (EMP) ou voie des Hexoses-Diphosphates , voie comparable à celle de la glycolyse des êtres supérieurs .C’est la voie majeure de dégradation du glucose. Elle comporte 4 importantes réactions : (1) Phosphorylation du glucose et du fructose-6-phosphate par l’intermédiaire de l’ATP ; (2) Clivage du fructose 1-6 diphosphate en trioses par une aldolase spécifique ; (3) Réarrangements structuraux ; (4) oxydo-réduction et assimilation du phosphate inorganique. Cette voie aboutit à la production de 2 moles d’ATP par mole de glucose. - La voie des Hexoses-Monophosphates ou voie des Pentoses-Phosphates ou Shunt oxydatif ou cycle de Dickens-Horecker .Elle produit 1 mole d’ATP par mole de glucose. - La voie du 2-céto-3-déoxy-gluconate ou voie d’Entner-Doudoroff est assez propre aux microorganismes . Elle ne produit pas d’ATP. Au cours de ces voies du métabolisme intermédiaire du Glucose , apparaissent des molécules de NADH2 que les microorganismes peuvent , selon les cas , réoxyder . En aérobiose , l’accepteur final est l’oxygène moléculaire par le biais de la chaîne respiratoire . En anaérobiose , les accepteurs sont des composés organiques autres que l’oxygène moléculaire . (voir schémas correspondants) 2-3- La respiration : Le pyruvate est principalement oxydé en Acetyl-Coenzyme A , ces 2 composés étant au carrefour du métabolisme intermédiaire . Le pyruvate est le point d’aboutissement obligé de toutes les voies de dégradation du Glucose et des voies d’oxydation de nombreux acides aminés. Il est transformé en Acetyl~CoA par décarboxylation oxydative. 2-3-1- Le cycle de Krebs : L’Acetyl~CoA réagit avec l’acide oxaloacétique pour former de l’acide citrique .Suit une succession de réactions d’oxydation et de décarboxylation, avec réductions de NAD en NADH2 couplées aux réactions d’oxydation qui permettent de régénérer du NAD+ . Du point de vue énergétique, chaque tour de cycle de Krebs génère 4 réactions de déshydrogénation .Pour un Acetyl~CoA incorporé au cycle, 3 NADH2 et 1 FADH2 sont générés et 1 ATP est produit directement au niveau du cycle .Les molécules de NADH2 et de FADH2 vont alimenter en électrons les coenzymes de la chaîne respiratoire. Au cours de leur passage dans la chaîne, chaque NADH2 produit 3 ATP et chaque FADH2, 2 ATP. Ainsi, chaque tour de cycle produit 12 ATP. 2-3-2- La chaîne respiratoire : C’est la chaîne cytochromique de transfert des électrons , à laquelle sont associés des phosphorylations oxydatives . Ses composants sont disposés de façon séquentielle en fonction de leur potentiel redox. Le mouvement des électrons ou des protons le long de la chaîne s’effectue graduellement à partir des constituants les plus électronégatifs pour aller vers le constituant le plus électropositif (O2). Ces composants sont des enzymes associés à des groupements prosthétiques et qui agissent comme transporteurs d’électrons. AH2 (substrat) NAD+ FPH2 Flavoproteine A NADH FP Q 2Fe3+ 1/2O2 semi quinone QH2 2Fe2+ H2O +H2O2 12 H+ H+ H+ FP peut être FMN ou FAD * NAD : Nicotinamide Adénine Dinucléotide ou Coenzyme I ; Coenzyme fonctionnant comme transporteur d’hydrogène dans de nombreuses réactions redox. La molécule d’H est portée sur le résidu Nicotinamide. Forme oxydée :NAD+ Forme réduite : NADH + H+ (N.B. NADP= Coenzyme II) * FP : Ce sont des protéines de haut poids moléculaire contenant des flavines comme groupement prosthétique . Appartiennent aux FP la Flavine mononucléotide (FMN) et Flavine Adénine dinucléotide (FAD). Ces flavoprotéines ont pour fonction d’accepter l’H2 qui provient du NADH. * Ubiquinone ou Coenzyme Q : transporteur d’hydrogène , non lié à une protéine. * Cytochromes : Systèmes redox qui transfèrent des électrons et ne sont pas capables de transporter de l’hydrogène. Ils acceptent les électrons provenant des quinones. Parallèlement, un nombre équivalent de H+ est mis en solution. Ce sont des protéines dont le groupement prosthétique est une protoporphirine portant un atome de fer central qui participe au transport électronique. Cette protoporphirine s’appelle Hème quand le fer est à l’état Fe++ (ferreux) et Hémine lorsque le fer est à l’état Fe+++ (oxydé ou ferrique). De nombreux cytochromes ont été décrits chez les bactéries : a , a3 , b, c , o. Le cytochrome terminal qui joue le rôle d’accepteur final d’électron est appelé Cytochrome Oxydase. Au cours de la respiration , il y a dégagement important d’énergie puisqu’il y a oxydation du substrat jusqu’au stade H20+C02 .De ce fait , l’oxydation d’un substrat ne peut être couplé directement à la réduction de l’accepteur final , au risque de brûler la bactérie .L’énergie est libérée par palier au cours d’une succession de réactions redox allant de la réduction du NAD puis d’une flavoprotéine et d’une ubiquinone avec transfert d’électrons et de H2 jusqu’à l’accepteur final , les électrons étant transférés seuls par les cytochromes . La respiration se fait donc en 2 étapes : 1- Le cycle tricarboxylique de Krebs , avec libération de CO2 par oxydation couplée à la réduction de 3 NAD+ et de 1 FAD+ par tour de cycle . 2- La chaîne respiratoire avec coenzymes de déshydrogénases , Quinones et Cytochromes . CH3CO-COOH NADH + H+ CO2 CH3CO~SCoA oxaloacétate + Cycle de KREBS Citrate NAD FADH + H FAD + +é Selon l’accepteur final d’électrons et d’H2 , on peut distinguer : (voir les schémas correspondants) Dans la respiration aérobie, l’accepteur final est l’O2 NADH +H 13 Dans la respiration anaérobie, l’accepteur final est un composé inorganique ou ionique (NO3fumarate) 2-4- Fermentation du Glucose : La première étape comporte les différents voies du métabolisme intermédiaire qui aboutissent au Pyruvate .Ce sont les réactions de réduction du Pyruvate qui différentient les bactéries fermentaires car elles conduisent à des produits finals divers, soit uniques, soit plus souvent mélangés. On distingue, selon la nature des produits finals de fermentation : * la fermentation Acides complexes : C'est le type de fermentation le plus répandu chez les bactéries. Elle peut se présenter sous 3 formes possibles: - fermentation Acide Mixte : caractéristique des Enterobactéries VP(-). Pyruvate Formate Lactate AcetylCoA CO2+H2 Acetyl Phosphate Acetate Phosphoenol-pyruvate Acetaldehyde Ethanol Oxalo-Acetate Succinate L'accumulation d'Acides dans le milieu de culture aboutit à un PH final bas. - fermentation butanédiolique : Les Enterobacteries VP+ , Listeria monocytogenes,la plupart des Vibrio et Aeromonas possèdent ,à côté du mode de fermentation Acides Mixtes, une voie fermentaire particulière, dite Butanédiolique ou Butylène glycolique. Cette voie aboutit à la libération d'un produit neutre: Le 2,3 Butylène Glycol. Elle se déclenche lorsque le pH du milieu s’abaisse au dessous de 6. 2 molécules de Pyruvate CO2 Acetolactate acetolactate-decarboxylase Acetyl-methyl-carbinol ou Acetoïne butanédiol-deshydrogénase 2,3 Butanédiol * Fermentation lactique : L’acide lactique est le produit final unique ou dominant .On distingue 3 modèles: - Fermentation Homolactique : retrouvée chez les Streptocoques, 14 C'est une fermentation sans production de gaz et s'accompagnant d'une diminution importante du PH du milieu. - Fermentation Hétérolactique: retrouvée chez les Lactobacilles et les Leuconostoc. Comprend une production importante de CO2 et un PH bas. - Fermentation Aceto-lactique: retrouvée chez des bactéries du genre Bifidobacterium , s'accompagne de la production d'un mélange d'acide lactique et acétique. * Fermentation Alcoolique: C'est une fermentation retrouvée chez les champignons et les cellules végétales. * Fermentation Butyrique :qui aboutit à l'Acétate , le Butyrate, H2 et CO2 et qui est retrouvée chez les Clostridies dits Saccharolytiques 2-5- Tests d’exploration du métabolisme énergétique : 2-5-1- Epreuve de HUGH et LEIFSON : Milieu d’Etude de la Voie d’Attaque des Glucides (M.E.V.A.G) : Géloses molles , faiblement peptonée , additionnées de glucose à 1%, coulées en culot , fondues au moment de l’emploi .L’ensemencement se fait par piqûre centrale de 2 tubes de milieu , à partir d’une suspension riche du germe à étudier. Un tube est laissé ouvert « O » , l’autre est fermé par une couche de vaseline « F ». Résultat : tube « O » Jaune Jaune Rouge-violet tube « F » Jaune Rouge Rouge Fermentaire Oxydatif Inactif 2-5-2- Test dit de l’Oxydase : Cyt aa3 + Cytc ont la propriété d’oxyder le diméthyl ou le tétramethylparaphénylène diamine en une demi-quinone rouge violacée. Cyt c+++ + Cyt aa3+++ + réactif réduit Cyt c++ + Cyt aa3++ + réactif oxydé (rouge) Attention : - ne pas utiliser d’anse bactériologique métallique pour faire le test - ne pas faire le test à partir d’une pente de TSI ou KIA - ne pas faire le test à partir d’une gélose avec indicateur coloré. 2-5-3- Recherche de la catalase : on met en présence une colonie microbienne et une goutte d’eau oxygéné sur une lame. L’apparition de bulles d’air signe la présence d’une catalase. Attention : ne pas prélever la culture à partir d’une gélose au sang. 15 2-5-4- Test de GRIESS-ILOSWAY : Bouillon Nitrate à 1%o KNO3 ensemencé à partir de la souche à étudier Réactifs de révélation : Acide Sulfanilique et alpha-naphtylamine Poudre de Zinc Bouillon KNO3 + bactérie 24 h à 37°C + NR1 + NR2 Virage au Rouge Pas de virage Nitrate réductase + Ajouter une parcelle de Poudre de zinc Chauffer légèrement Virage au rouge pas de virage Nitrate réductase - Nitrate réductase + 2-5-5-Test au rouge de méthyle (RM) et réaction de Voges-Proskauer (VP) : L’étude des dérivés de l’Acide pyruvique permet de déterminer la ou les voies fermentaires utilisées par la bactérie. Les tests RM et VP permettent la différenciation entre les fermentations acide-mixte et butylène glycolique. Ces 2 réactions peuvent être effectuées sur le même milieu (Bouillon Clark et Lubs) et le plus souvent se vérifient mutuellement : une souche RM+ est habituellement VP- et vice versa. TEST au RM : consiste à révéler l’acidification finale du milieu après fermentation du glucose. La zone de virage du RM étant plus basse que celle des indicateurs habituellement utilisés (5-5,8), cet indicateur révèle une acidité importante, due à la production d’acides forts (Acide formique) ou à dissociation moyenne (Acide propionique, lactique…). REACTION DE VOGES-PROSKAUER : C’est une réaction plus spécifique et d’un plus grand intérêt que la précédente. Elle révèle la production d’Acetylméthylcarbinol (ou Acétoïne) , intermédiaire au cours de la fermentation 2-3 butylène-glycolique . Bouillon Clark et Lubs + Bactérie VP1 : KOH 4N VP2 : solution alcoolique d’alpha-naphtol 24 h à 37°C Répartir le bouillon dans 2 tubes à vis Ajouter 1 goutte de RM Couleur rouge RM+ couleur jaune RM- 3 gouttes VP1 et 3 gouttes VP2 Agiter et laisser en position inclinée pendant 20mn 16 Virage au rouge en surface du bouillon pas de virage VP + VP2-5-6- Utilisation du Citrate comme seule source de carbone : La bactérie est dite « citrate-positive » si elle utilise le Citrate comme seule source de carbone, avec l’intervention d’une Citrate-perméase. L’utilisation du Citrate par la bactérie se manifeste par une alcalinisation du milieu. En effet, les enzymes qui utilisent le citrate comme substrat, le font sous la forme d’acide citrique : Citrate +3H20 Acide citrique + 30HDe ce fait, l’incorporation d’un citrate par la bactérie, équivaut à la libération de 3 0H-. De ce fait, chaque fois que la bactérie oxyde complètement le citrate (comme cela se passe à travers le cycle tricarboxylique de Krebs), il y a libération de radicaux Hydroxyles OH- , qui vont alcaliniser le milieu. On utilise le Milieu au Citrate de SIMMONS, coloré en vert foncé (bleu de Bromothymol). Le milieu est inoculé à partir d’une culture sur gélose, sur une moitié de la pente, l’autre moitié servant de témoin négatif. La bactérie est dite « Citrate+ » si la zone inoculée vire du vert au bleu (alcalinisation) La bactérie est dite « Citrate - » si la zone inoculée ne vire pas. Le milieu au citrate de Christensen , contrairement au milieu synthétique de Simmons, contient de faibles quantités de glucose et d’extraits de levure .Il sert à différencier Shigella (toujours CITRATE NEGATIVE) de E.coli biovar Alcalescens-Dispar ( 72% de souches CITRATE + ). 3- Métabolisme Glucidique : On distingue 3 types de milieux pour explorer ce métabolisme ; - Milieux glucidiques liquides simples : Eau peptonée + Sucre + indicateur de pH - Milieux glucidiques gélosés simples : gélose + sucre + indicateur de pH un exemple en est : le milieu Mannitol-mobilité-nitrate - Milieux gélosés glucidiques complexes : TSI (Tri-Sugar-Iron ) et KIA (Kligler-Iron-agar) Ce sont des géloses inclinées avec pente +culot : 1%o Glucose et 10%o Lactose et Saccharose L’indicateur est le Rouge de Phénol Lecture : Bactérie Oxydative Culot rouge Pente rouge Bactérie Fermentaire Lactose – et saccharose - l’attaque des peptones alcalinise la pente Culot jaune pente rouge Bactérie Fermentaire Lactose + et/ou Saccharose + Culot jaune pente jaune l’attaque des peptones alcalinise la pente mais l’acidification par attaque des sucres prend le dessus. 17 - Etude de la voie d’attaque d’un sucre sur MEVAG +sucre (à 1%) - Etude des enzymes intervenant dans l’attaque d’un sucre : on détecte essentiellement la Bêta galactosidase, enzyme qui dégrade le lactose en glucose et galactose. Cette enzyme a 2 caractéristiques : 1) elle est intra-cellulaire 2) elle est inductible Il faut donc une perméase pour faire passer quelques molécules de lactose en intra-cellulaire et induire la synthèse de l’enzyme. Bactéries + disque d’un Galactoside artificiel : pente lactosée Ortho NitroPhénylGalactopyranoside de TSI ou KIA suspension en eau distillée on incube jusqu’à 24 h à 37°C Lecture à 15 mn – 30mn – 24 h Test + : production d’OrthoNitroPhénol de couleur jaune 4- Métabolisme Protidique : Il est étudié au laboratoire par la détection des enzymes du métabolisme protidique, en mettant en contact la bactérie avec le substrat correspondant. Protéine Enzymes de digestion ou Protéinases exemple Gélatinase Polypeptides Peptidases Acide Aminé Acide aminé soufré (Cysteine, Tryptophane Methionine) Tryptophanase TDA désulfydrase Indole H2S Ornithine Arginine Lysine Acide indole pyruvique L’H2S (Hydrogène Sulfuré), libéré par réduction d’un substrat soufré ( Thiosulfate de sodium), est précipité sous forme de sulfure de fer en présence de Citrate ferrique (ou de Sulfate ferrique) incorporé dans le milieu TSI (et KIA). Chez les bactéries H2S+, le sulfure de fer apparaît sous forme de précipité noire au sein du TSI (ou KIA). 18 Milieu à l’urée Urée + Tryptophane Uréase ou urée amidohydrolase NH3 (virage du milieu au rose-fushia) Tryptophanase Tryptophane désaminase R° d’Ehrlich-Kovacs Test de détection de la TDA ( addition du réactif d’Ehrlich-Kovacs (addition de perchlorure de fer) ou paradiméthylaminobenzaldehyde PDAB) TDA + indole + TDA - indole Virage au marron anneau rouge pas de virage anneau clair Catabolisme de l’Ornithine , Arginine et Lysine : Ornithine – Arginine - Lysine Ornithine Décarboxylases ODC,ADC,LDC Cycle de l’Urée Ornithine Urée Putrescine Arginine Agmatine Lysine Cadavérine Au laboratoire , on met en évidence les décarboxylases sur milieu de MOELLER-FALKOW : (sucre=Glucose , Indicateur=Pourpre de Bromocrésol) Vaseline stérile Milieu + Ornithine Milieu+Arginine Milieu+Lysine Témoin milieu 1er temps : Acidification de tous les tubes par attaque du glucose 2ème temps : Décarboxylation et libération de catabolites alcalins d’où virage au bleu violacé- le tube témoin reste jaune Interprétation : tube jaune : négatif tube violet : positif 19 Il existe une autre voie dégradant l’Arginine par le biais d’une Arginine Dihydrolase. Arginine Citrulline NH3 Ornithine NH3 + CO2 5- Métabolisme lipidique : Les lipides ne sont assimilables qu’une fois leur molécule clivée par hydrolyse , sous l’effet d’enzymes appelées généralement lipases. Il s’agit en réalité de 3 groupes d’enzymes : - Les estérases, qui hydrolysent les TWEENS , esters de sorbitol et d’acides gras à longues chaînes (le plus utilisé est le TWEEN 80) - Les lipases qui hydrolysent les Triglycérides , et en pratique le Tributyrate de glycérol ou tributyrine. - Les phospholipases ou lécithinases dont le substrat spécifique est la lécithine (extraite du jaune d’œuf). 5-1- Recherche des estérases sur milieu au TWEEN : Technique de SIERRA strie de la souche à tester Tween +Chlorure de calcium (Cacl2) +gélose en surfusion incuber 48 h à 37°C Présence d’une estérase libération d’acides gras sels calciques insolubles Lecture : recherche d’un halo opaque autour de la strie (opalescence + iridescence) 5-2- Recherche des lipases sur milieu à la Tributyrine : On utilise le Tributyrate de glycérol , ou Tributyrine , qui donne un aspect trouble à la gélose. La présence d’une lipase se traduit par une clarification de la gélose autour du spot de culture. 5-3- Recherche de la Lecithinase sur boîte à l’oeuf : Test de Laboratoire : on utilise communément la Lécithine du jaune d’œuf , incorporé à 10 % dans la gélose (émulsion dans de l’eau physiologique) . Lecture : Halo opaque blanc-jaunâtre autour du spot de culture Lécithinase + 20 Applications : Tests d’exploration Estérases Lipases Lécithinases Germes à tester Serratia sp. Certains Proteus, Pseudomonas, Flavobacterium Vibrionaceae (sauf Plesiomonas shigelloides Bacillus Test de différenciation intéressant pour les genres Branhamella et Yersinia Identification des genres Pseudomonas, Bacillus et Clostridium CHAP. II APPLICATIONS DE LA PHYSIOLOGIE BACTERIENNE : Les domaines d'application intéressent: 1-Le diagnostic bactériologique: La physiologie bactérienne intervient de façon primordiale dans le déroulement du diagnostic bactériologique. En effet, l'examen microscopique n'est qu'exceptionnellement suffisant pour identifier une espèce bactérienne et il ne représente habituellement qu'une étape d'orientation. Le plus souvent , il est nécessaire d'ensemencer le produit pathologique sur des milieux de culture contenant des nutriments indispensables à la croissance. 1-1- Les notions de physiologie bactérienne interviennent alors dans le choix du (ou des) type(s) de milieux de culture pour les bactéries que l'on désire isoler ou identifier. On peut distinguer : a) Des milieux d'isolement: Ce sont des milieux solides simples ou complexes, sur lesquels de nombreuses espèces bactériennes peuvent se développer selon une technique d’ensemencement qui permet d'obtenir des colonies séparées facilement identifiables. b) Des milieux d'identification: Solides ou liquides, ils servent à mettre en évidence un ou plusieurs caractères métaboliques d'une souche bactérienne préalablement isolée et purifiée.(L'étude du métabolisme bactérien ne peut se faire que sur une souche bactérienne pure). c) Des milieux sélectifs : Solides ,ils permettent l'isolement d'une espèce bactérienne tout en inhibant les autres espèces éventuellement présentes dans un prélèvement. Ex: Milieu de Chapman pour les Staphylocoques Milieu Hektoen pour les Salmonelles et les Shigelles d) Des milieux d'enrichissement: Liquides, ils contiennent des inhibiteurs spécifiques de certaines espèces bactériennes donc favorisent la multiplication d'espèces données. Ex: le bouillon Sélénite pour les Salmonella. 1-1- Il existe actuellement sur le marché de l’automate de laboratoire, plusieurs systèmes permettant l’identication précise des bactéries .Parmi eux, on citera le MALDI-TOF , dont le principe est celui de la spectrométrie de masse. Les laboratoires s’équipent de plus en plus en ce type d’automate malgré le coût non négligeable en matière de maintenance. 2- L'Antibiothérapie: Les modifications de la courbe de croissance permettent de mesurer l'activité anti-bactérienne d'un nouvel antibiotique sur une bactérie donnée. 21 3- L’efficacité de la stérilisation: L'étude de la courbe de croissance permet de vérifier la vitesse de destruction des bactéries par la chaleur , les UV, ou d'autres agents physiques ou chimiques. 4- L'industrie: - Dosage microbiologique des vitamines et autres substances qui sont des facteurs de croissance pour les bactéries, - Obtention de grandes quantités d'antibiotiques, d'enzymes et de vitamines grâce à la croissance en milieu de culture renouvelé, - Obtention de grandes quantités de bactéries destinées à l'alimentation en particulier animale (génie génétique). 5-Les systèmes pour hémoculture : Certains fournisseurs ont proposé des flacons d’hémoculture avec dispositif intégré permettant de détecter les premiers signes de culture par le biais des gaz dégagés par le métabolisme biochimique bactérien (Hémoculture SIGNAL -OXOID) ; les flacons d’hémoculture sont incubés sous agitation continue dans une étuve transparente, de manière à détecter les flacons positifs (avec dispositif de détection positif) .Aucune automatisation n’est nécessaire. Il existe cependant sur le marché de l’équipement biomédical, une grande variété d’automates pour hémocultures. Les plus anciens, maintenant dépassés, détectaient les premiers signes de culture en utilisant l’incorporation de C14 avec un risque élevé pour le manipulateur. Actuellement, des automates de plus en plus performants assurent la détection précoce d’hémocultures positives en se basant sur le principe de détection d’un produit du métabolisme biochimique, par des techniques sans risque, telles la technique colorimétrique pratiquée par l’automate BACT/ALERT microbial Detection System. 6- Notion de Quorum Sensing: Le QS est un système de communication inter-bactérienne reposant sur la diffusion de petites molécules au travers des parois bactériennes, ce qui représente pour les bactéries, le langage leur permettant de coordonner leur comportement vis-à-vis d’un environnement. Ainsi, lorsque la densité bactérienne augmente, la quantité de ces molécules augmente jusqu’à atteindre un seuil déclenchant l’activation ou la répression de certains gènes chez l’ensemble des bactéries. Chez P.aeruginosa par exemple, coexistent 2 principaux systèmes de QS, appelés lasR-lasI et rhsR-rhsI. Les 2 molécules diffusibles principales appartiennent à la famille des acylhomosérines lactones (AHL), C12-HSL et C4-HSL, elles sont synthétisées par leur enzyme respective et vont se fixer ensuite sur leur récepteur protéique respectif. La liaison de l’HSL à son récepteur protéique forme un activateur transcriptionnel permettant ainsi l’activation de nombreux gènes chez Pseudomonas aeruginosa, parmi lesquels figurent ceux impliqués dans la virulence. En inhibant le Qorum sensing, on peut ainsi inactiver les gènes de virulence chez des bactéries hautement pathogène ; ceci a été prouvé dans le modèle animal chez P.aeruginosa, ce qui ouvre la voie aux traitements autres qu’antibiotiques. 7- Les Biofilms : Les bactéries sont organisées en communautés et communiquent entre elles par QS. Dans leur biotope naturel, elles sont attachées à des surfaces, plus souvent que libres en suspension dans un milieu liquide. Les bactéries attachées à des surfaces sont engluées dans une matrice de polymères organiques : l’ensemble constitue un Biofilm. C’est aussi sous cette forme que les bactéries colonisent le biotope hospitalier, particulièrement le matériel d’exploration ou de soin : Endoscopie, cathéters, sondes respiratoires ou urinaires. Il existe différents biofilms dans le corps humain : c’est le cas de la plaque dentaire et de la végétation valvulaire en cas d’endocardite infectieuse. 22 Dans le biofilm, les bactéries sont à l’abri des agents antimicrobiens car elles se trouvent au repos ou dans un état de latence, ce qui empêche l’antibiotique d’agir sur elles. Elles représentent ainsi une forme de persistence du germe contre laquelle on ne peut pas agir et qui constitue un obstacle majeur dans la prévention et la lutte contre les infections nosocomiales. Conclusion et en quelques mots…. La maîtrise des techniques d’étude de la nutrition, des différentes voies métaboliques et de la croissance bactérienne permet une large application en matière de d’isolement , d’identification et d’étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques .Elle permet également de mieux comprendre le principe et le fonctionnement des automates chargés de l’identification rapide et fiable des microorganismes impliqués dans les infections . Elle ne peut se faire sans la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu par les bactéries , aussi bien au niveau intracellulaire qu’à l’échelle d’une population bactérienne. 23 Source :Microbial Physiology. Albert G.Moat, John W. Foster and Michael P.Spector 2002 Fig 1 : Voie d’Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) ou voie de la glycolyse –Les chiffres de 1 à 22 désignent les différentes enzymes impliquées dans les réactions chimiques : 1.Phosphorylase 2.Phosphoglucomutase 3. Hexokinase 4. Phosphoglucoisomérase 5.Phosphofructokinase 6.Fructose bisphosphate aldolase 7. Triose phosphate isomerase 8. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 9. Phosphoglycerokinase 10. Phosphoglyceromutase 11. Enolase 12. Pyruvate kinase 13.Lactate dehydrogenase 14. Pyruvate carboxylase 15. PEP carboxykinase 16. Fructose-1,6-biphosphatase 17.Glucose-6-phosphatase 18. ATP-glucose pyrophosphorylase 19. Glycogène synthetase 20. Glycerophosphate dehydrogenase 21.Phosphatase 22. Glycerol kinase 24 Source :Microbial Physiology. Albert G.Moat, John W. Foster and Michael P.Spector 2002 Fig 2 : Les voies divergeant à partir du 6-Phosphogluconate. (Les gènes de structure des enzymes chez E.coli sont indiqués par 3 lettres). Dans la voie commune, l’enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase oxyde glucose-6-phosphate en 6-phosphogluconolactone .Le lactone est dehydraté en 6-phosphogluconate via une lactonase . Dans la voie des pentoses, 6-phosphogluconate est oxydé en ribulose-5-phosphate et C02 par une 6-phosphogluconate dehydrogenase. Une phosphoribose –isomerase maintient un équilibre entre ribulose-5-phosphate et ribose-5-phosphate. Dans la voie d’Entner-Doudoroff, 6-phosphogluconate est dehydraté par une 6-phosphogluconate dehydratase pour donner 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate (KDPG). L’enzyme KDPG aldolase clive KDPG pour former du Pyruvate et du Glyceraldehyde-3-phosphate. L’action d’une pyruvate-carboxylase aboutit à de l’ethanol et C02. Glyceraldehyde-3-phosphate est métabolisé par le biais de la portion « triose-phosphate » de la voie d’Embden-MeyerhoffParnas en Ethanol et C02. Le rendement net de la voie d’Entner-Doudoroff est de 2 Ethanol +2 C02 25 Source :Microbial Physiology. Albert G.Moat, John W. Foster and Michael P.Spector 2002 Fig 3 : Voie de la Phosphoketolase ou voie des hexose-monophosphate. G-6-P : glucose-6-phosphate ; 6-P-G :6-phosphogluconate ; G-3-P :glyceraldehyde-3-phosphate 26 Source :Microbial Physiology. Albert G.Moat, John W. Foster and Michael P.Spector 2002 Fig 4 : Le cycle de Krebs. OAA : Oxaloacetate ; DPT : Diphosphothiamine ; FP :Flavoproteine Les chiffres de 1 à 8 indiquent le nome d’enzymes impliquées dans le cycle de Krebs : (1) Citrate synthethase. (2) Aconitase. (3) et (4) Isocitrate dehydrogenase. (5) Alpha-ketoglutarate dehydrogenase. (6) Succinate dehydrogenase. (7) Fumarase. (8) Malate dehydrogenase. La conversion du pyruvate en CO2 et Acetyl-CoA au sommet de la figure , incrimine un groupe d’enzymes connu comme le « Pyruvate dehydrogenase complex ». 27 Source :Microbial Physiology. Albert G.Moat, John W. Foster and Michael P.Spector 2002 28 Source :Microbial Physiology. Albert G.Moat, John W. Foster and Michael P.Spector 2002 Fig6 : La Phosphorylation oxydative : L’énergie composant la force proton-motrice est utilisée pour générer de l’ATP lorsque les protons, à l’extérieur de la bactérie, traversent la « Protontranslocating ATPase » associée à la membrane cytoplasmique. On estime que le passage de 3 protons à travers l’ATPase est nécessaire pour générer 1 ATP. Source :Microbial Physiology. Albert G.Moat, John W. Foster and Michael P.Spector 2002 29 Fig 7 : Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). La fonction du NAD dans les réactions d’oxydo-réduction. Les atomes d’hydrogène d’un donneur , sont transférés vers la partie « Nicotinamide » d’un NAD. (b) Les atomes d’H2 sont ensuite transférés vers un receveur tel les pigments de cytochrome. Bibliographie 1- Moat AG , Foster JW and Spector MP. Microbial Physiology Liss, Inc. Fourth edition 2002 Wiley- 2- Leclerc H. , Gaillard J.L., Simonet M. Microbiologie générale :La Bactérie et le monde bactérien Edition DOIN 1995 3- Marchal N., Bourdon J.L. , Richard CL . Les Milieux de culture pour l’isolement et l’identification biochimique des bactéries , Édition DOIN 1991 4- Olds R.J. Atlas en couleurs de Microbiologie Édition MALOINE 1979 5- Consultez les liens disponibles dans le site du Réseau AARN (Algérian Antimicrobial Resistance Network) que vous trouverez à l’adresse Internet : WWW.sante.dz/aarn 6-R.Leberre et al Quorum sensing : une mouvelle cible thérapeutique pour Pseudomonas aeruginosa Med Mal Inf.36 (2006) 349-357 30
