+ k - La Fed

Stage de Pré-Rentrée 2013
UE 1 – Enzymologie
Diaporama réalisé par les tuteurs de La Féd’
1
I - L’association PL
En biochimie, un ligand est une molécule capable de se fixer sur une protéine
avec une certaine affinité.
Complexe
(PL)
Protéine
(P)
Ligand (L)
L peut être : un ion, une petite molécule, une protéine plus petite, etc…
L’interaction est en général réversible.
Elle fait intervenir des liaisons faibles non covalentes.
Elle peut être michaëlienne ou allostérique.
Par soucis de simplification, nous ne traiterons aujourd’hui que la michaëlienne.
I - L’association PL
Nous allons modéliser cette interaction
P+L
k1
PL
k-1
Exprimons :
• La vitesse d’apparition du complexe PL :
• La vitesse de disparition du complexe PL :
v1 = k1 x [P] x [L]
v-1 = k-1 x [PL]
A l’équilibre, il se forme autant de complexes PL qu’il en disparait
Alors on peut écrire :
D’où l’égalité :
v1 = v-1
k1 x [P]eq x [L]eq = k-1 x [PL]eq
I - L’association PL
Définition de la constante de dissociation KD
On définit KD, la constante de dissociation.
Il s’agit d’une concentration (unité mol.L-1)
KD est un rapport de constantes de vitesse :
Nous avions écrit :
KD =
k1 x [P]eq x [L]eq = k-1 x [PL]eq
Nous en déduisons :
KD =
[P]eq x [L]eq
[PL]eq
k-1
k1
I - L’association PL
Définition de la saturation Y
On définit Y, la fraction de saturation de la protéine.
Il s’agit d’une valeur entre 0 et 1, sans dimension.
Y=
[PL]
[P] + [PL]
NB : La somme ([P] + [PL]) peut être notée P0
Cherchons un moyen de déterminer Y en fonction de Leq et de Kd
I - L’association PL
On sait que :
[P]eq = KD x [PL]eq x [L]eq-1
Alors, à l’équilibre :
Y=
[PL]eq
KD x [PL]eq x [L]eq-1 + [PL]eq
Après factorisation :
Y=
[PL]eq
[PL]eq (1 + KD x [L]eq-1)
On multiplie par [L]eq / [L]eq :
Y=
[L]eq
[L]eq + KD
I - L’association PL
Mettons-nous dans la situation où Y = 0,5 (protéine à moitié saturée).
0,5 =
[L]0,5
[L]0,5 + KD
0,5 Kd = 0,5 [L]0,5
Kd = [L]0,5
Conclusion : KD est la concentration en ligand pour laquelle la
protéine est à moitié saturée.
Corollaire : Si Kd ↗, l’affinité ↘ et inversement
I - L’association PL
Y=
[L]eq
Il s’agit d’une fonction Y = f([L]eq)
[L]eq + KD
de type y = x/(a+x) → HYPERBOLE
Y
1
0,5
KD
[L]eq
I - L’association PL
Linéarisation de
On inverse :
Y=
1
Y
1
Y
Équation de la forme :
=
[L]eq
[L]eq + KD
[L]eq + KD
= KD
[L]eq
1
[L]eq
+1
y=ax+b
I - L’association PL
1/Y
1
-1/KD
1/[L]
Expérimentalement : on relève un nuage de points.
La détermination de KD (pente de la droite) peut se faire par extrapolation
mathématique.
En effet, la droite extrapolée coupe l’axe des abscisses au point (1/[L]) = (- 1/KD)
I - L’association PL
Exercices
Répétons ensemble les deux formules que vous devez connaître par cœur :
- Expression de KD.
- Expression de Y (en fonction de [L] et KD).
Une immunoglobuline interagit avec un antigène.
La constante de dissociation (KD) de cette interaction est de 10-12 mol.L-1
- Par quels types de liaisons pourraient se faire cette interaction ?
- Quelle est la signification biochimique de KD ?
- Que vous inspire une telle valeur ?
I - L’association PL
Exercices
Deux peptides (A et B) interagissent avec un ion Ca2+.
- Quels résidus pourraient probablement être engagés dans la liaison avec Ca2+ ?
On relève pour chacun 1/Y en fonction de 1/[L].
1/Y
Peptide B
Peptide A
1
-106
.
1/[L] (L.mol-1)
- Rappeler l’expression mathématique des deux droites ci-dessus.
- A vue d’œil, quel est le peptide le plus affin pour le calcium ?
- Déterminer le KD du peptide A.
II – Relation enzyme-substrat
Les enzymes sont des catalyseurs de nature protéique (le plus souvent). Elles
permettent d’accélérer considérablement les réactions chimiques du vivants, et ce
dans les deux sens si la thermodynamique le permet.
L’enzyme prend en charge un substrat et accélère sa transformation en diminuant
l’énergie d’activation (ΔGa) de la réaction.
G
Substrats
ΔGa
ΔG = ΔH - TΔS
Loi d’Arrhénius: k = A.exp(-ΔGa/RT)
Exprime la constante de vitesse k en
fonction de ΔGa et T.
Produits
Déroulement
de la réaction
II – Relation enzyme-substrat
Modélisation de la relation enzyme-substrat
E+S
ES
EP
E+P
Simplification de Michaelis-Menten
E+S
k1
ES
k2
E+P
k-1
Arguments :
• Les constantes de vitesse de l’étape ES ↔ EP sont très grandes (très rapide)
• Le flux métabolique suppose l’irréversibilité de la transformation.
II – Relation enzyme-substrat
E+S
k1
ES
k2
E+P
k-1
A l’équilibre, il se forme autant de complexe ES qu’il en disparait :
v1 = v2 + v-1
k1 x [E] x [S] = k2 x [ES] + k-1 x [ES]
k1 x [E] x [S] = [ES] x (k2 + k-1)
[E] x [S]
[ES]
=
k2 + k-1
k1
= KM
KM = constante
de Michaelis
Unité : mol.L-1
II – Relation enzyme-substrat
E+S
k1
k2
ES
E+P
k-1
k2 est la constante de vitesse de l’étape cinétiquement limitante.
On peut donc écrire :
v = k2 .[ES]
[ES] peut au maximum atteindre [E0]
Dans ces conditions, v = Vm :
(Enzyme totale, saturée)
v
VM = k2 .[E0]
et donc
VM
=
[ES]
[E0]
= Y
II – Relation enzyme-substrat
v
VM
Or [E] = KM x [ES] x [S]-1
=
v
VM
On multiplie par [S]/[S] :
[ES]
[E] + [ES]
=
[ES]
[ES] (1 + KM x [S]-1)
v
VM
=
[S]
[S] + KM
v rend compte de [S] et de :
Conclusion :
v =
VM x [S]
La vitesse maximum
KM + [S]
L’affinité pour le substrat
II – Relation enzyme-substrat
v =
VM x [S]
Graphe direct = Hyperbole
KM + [S]
1) Produit en croix
On inverse
v.KM + v.[S] = VM.[S]
1
v
=
1/v
KM
VM
x
1
[S]
1
+
2) On divise par [S]
VM
Lineweaver-Burk
v = (- KM) x
v
v
[S]
Eadie-Hofstee
VM
Pente = - KM
Pente = KM / VM
1/VM
1/[S]
+ VM
v/[S]
II – Relation enzyme-substrat
Exercices
Par quel mécanisme une enzyme accélère-t-elle la vitesse d’une réaction ?
Rappeler la simplification de Michaelis-Menten.
QCM : La vitesse d’une réaction enzymatique est égale à v = (1/4).VM
lorsque la concentration en substrat est de 3.10-5 M.
A.
B.
C.
D.
E.
KM = 10-5 M
KM = (3/4).10-5 M
KM = 9.10-5 M
KM correspond à la concentration en substrat pour laquelle v = VM / 2
KM correspond à la concentration en substrat pour laquelle [E] = [ES]
III – Inhibitions enzymatiques
1) Inhibition irréversible
- Agents dénaturants classiques des protéines : chaleur, pH, détergents…
- Composés chimiques :
Intoxication courante des agriculteurs aux organosphosphorés
→ Inhibition de l’acétylcholinestérase
O
O P
O
F
O
H
O
Diisopropyl-fluorophosphate
O
Enzyme
à sérine
O
P
+ HF
O
Enzyme
à sérine
III – Inhibitions enzymatiques
Inhibition compétitive
2) Inhibition réversible
ES
S
E
EI
I
ESI n’existe pas.
KM ↗
III – Inhibitions enzymatiques
2) Inhibition réversible
Inhibition non compétitive
S
I
EI
ESI
E
VM ↘
ES
S
I
III – Inhibitions enzymatiques
2) Inhibition réversible
Inhibition incompétitive
I
E
ESI
ES
KM ↘
VM ↘
S
EI n’existe pas.
III – Inhibitions enzymatiques
On définit Ki :
Ki est analogue à KD mais il concerne l’interaction enzyme-inhibiteur.
Inhibition compétitive : KM ↗
Inhibition non compétitive : VM ↘
Inhibition incompétitive : KM ↘
VM ↘
v=
v=
v=
VM x [S]
K’M + [S]
V’M x [S]
KM + [S]
V’M x [S]
K’M + [S]
avec K’M = KM x (1+[I]/Ki)
avec V’M = VM / (1+[I]/Ki)
avec K’M = KM / (1+[I]/Ki)
avec V’M = VM / (1+[I]/Ki)
III – Inhibitions enzymatiques
Eadie-Hofstee
v
Inhibition
incompétitive
Inhibition compétitive
VM
Pente = - KM
v/[S]
VM =
KM ↗
v
VM
Pente = - KM
v
v/[S]
Inhibition non compétitive
VM
Pente = - KM
v/[S]
VM ↘
KM =
KM ↘
VM ↘
III – Inhibitions enzymatiques
Exercices
A propos de l’AUGMENTIN ®
L’amoxicilline est un antibiotique de la famille des β-lactamine
(pénicilline). Il possède un cycle β-lactame caractéristique de la famille.
NH2
NH
N
O
HO
S
O
OH
Amoxicilline
O
Question 1 : Vous souvenez-vous quelle est la cible des pénicillines ?
III – Inhibitions enzymatiques
Exercices
Les bactéries peuvent développer une résistance à l’antibiotique à cause
de l’expression d’enzymes, les β-lactamases.
Les β-lactamases dégradent le cycle β-lactame.
Dans ce cas, on utilise l’acide clavulanique, inhibiteur des β-lactamases.
NH2
O
NH
+
N
O
HO
S
CH2OH
O
OH
O
OH
Amoxicilline
N
O
O
Acide clavulanique
Question 2 : A votre avis, de quel type d’inhibiteur réversible s’agit-il ?
III – Inhibitions enzymatiques
Exercices
1)
Question 3 : A quelle modification du graphe de
Eadie-Hofstee vous attendez-vous lorsqu’une
β-lactamase est mise en présence d’acide
clavulanique ?
v
VM
Pente = - KM
Graphe 1 / Graphe 2 / Graphe 3 ?
v/[S]
2)
3)
v
v
VM
VM
Pente = - KM
Pente = - KM
v/[S]
v/[S]