Sujet_ET1_2013-corrigé

BIO241 Examen terminal 1ère session (17 mai 2013)
Documents et calculatrices non autorisés
XX pages
Notation sur 100
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PARTIE A
Protéines/Bioénérgétique/Enzymologie/Métabolisme
Question 1 6 pts
On dispose d’un mélange de 3 protéines, A, B et C, dont les caractéristiques sont données dans le
tableau ci-dessous. La protéine A est formée de 2 chaînes polypeptidiques (A-I et A-II) liées par des
ponts disulfure.
Protéine
MM (g.mol-1)
pHi
Protéine A
A-I
A-II
80.000
60.000
20.000
7
5
9
Protéine B 40.000 6,8
Protéine C 40.000 4,1
a- Le mélange protéique est analysé sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en présence de SDS. Les
échantillons sont traités en présence en en absence de 2-mercaptoéthanol (2-ME)?
- Rappeler le principe de cette technique, le rôle du SDS et du mercaptoéthanol.
Le SDS est un agent dénaturant (détergent anionique) qui dénature les protéines et les charge toutes
négativement. Les protéines sont séparées par cette technique selon leur PM. Le mercaptoéthanol
est un agent réducteur qui coupe les ponts disulfure.
- Quel sera le profil électrophorétique du mélange protéique? Reproduire sur votre copie la figure ci-
dessous. Indiquer clairement l’échelle des PM utilisés, le sens de migration et la migration des
échantillons protéiques déposés, en respectant la légende.
Sur 2 points : 1 pt pour placer correctement l’échelle PM et sens de migration (haut PM en haut de
la figure et flèche vers le bas pour le sens de migration), 1 pt si profils corrects (bandes à 80 kDa et 40
kDa pour le puits 2 et bandes à 60, 40 et 20 kDa pour le puits 3)

b- Etablir un protocole de fractionnement chromatographique permettant de séparer les protéines
A, B et C . Justifier le protocole choisi.
Deux étapes : 1) gel filtration pour séparer A des protéines B & C (pcpe de séparation basé sur le PM),
puis récupérer la fraction correspondant au mélange B+C et les séparer par chromato échange ion
(pcpe de séparation basé sur la charge de la prot).
Question 2 6 pts
On dispose d’une série d’enzymes (E1 à E5) spécifiques du même substrat (S) et caractérisées par les
paramètres suivants :
Enzyme Km (M) Kcat (s
-1
)
E1 3.10
-3
3.10
3
E2 2.10
-3
4.10
3
E3 6.10
-5
6.10
2
E4 7.10
-3
7.10
2
E5 2.10
-2
2.10
4
Laquelle de ces enzymes, utilisée à concentration égale, doit-on choisir pour obtenir l’activité la plus
élevée en présence du substrat (S) à la concentration de : Justifier votre réponse
Cas a) : [S] = 10-6M

Cas b) : [S] = 10-1M
cas a: la [S] étant très inférieure à tous les Km de la série d’enzymes, on se trouve dans des
conditions où V0 est proportionnelle à (VM/Km), soit à conc [E] égale, à kcat/Km (rapport
déterminant l’efficacité catalytique). On choisit donc l’enzyme ayant la plus haute efficacité
catalytique, soit E3
Valeurs de kcat/Km (M-1. s-1):
E1 : 106 ; E2 : 2.106 ; E3 : 107, E4 : 105 ; E5 : 106
Cas b: la [S] étant saturante pour toutes les enzymes (car très supérieures aux valeurs individuelles
de Km), on se trouve dans des conditions où V0 est égale à Vm, soit à conc [E] égale, à kcat (valeur
qui définit l’éfficacité cinétique en conc saturante de S). On choisit don l’enzyme ayant la pus haute
efficacité cinétique, soit E5.
Question 3 12 pts
Le tableau ci-dessous caractérise la purification d’une enzyme E à partir de son tissu d’origine. Trois
étapes sont utilisées (précipitation au sulfate d’ammonium suivies de deux étapes
chromatographiques)
a- A partir des valeurs données pour l’extrait brut dans le tableau, indiquer les unités (il s’agit
d’unités usuelles, vues en cours et TD) utilisées par l’expérimentateur pour déterminer l’AE, AS et AT
de ses échantillons. 3 pts
Etape Vol
(ml)
Protéines
(mg/ml)
Activité enzymatique
(AE)
Unité : nkat/ml Ez
Activité spécifique
(AS)
Unité :nkat/mg prot
Activité totale
(AT)
Unité :nkat.
1-Extrait brut 100 500 200 0,4 20000
2- Précipitation au
sulfate
d’ammonium
50 8 16 2 800
3-Chromato 1 5 5 100 20 500
4-Chromato 2 5 2 80 40 400
b- donner la formule générale permettant de calculer le rendement de chaque étape de purification
Rdt = (AT étape n+1/ AT étape n) x 100 ou (AT étape n/AT extrait brut)x100
c- donner la formule générale permettant de calculer l’enrichissement en enzyme à chaque étape de
purification

c’est le facteur de purification : Fp
Fp = AS étape n+1/ AS étape n ou AS étape n+1/AS extrait brut
d- Quelle étape du protocole de purification est responsable de la plus grosse perte en enzyme ?
Justifier votre réponse par le calcul.
Il faut calculer la perte après chaque étape en utilisant la formule Rdt = (AT étape n+1/ AT étape n) x
100
Réponse : Etape 2 (précipitation sulfate ammo) : car le rendement à cette étape est très faible. On ne
récupère que 4 % des protéines E
Rdt à cette étape= (800/20000)x100= 4%
e- Quelle étape du protocole de purification a contribué le plus efficacement à la pureté de la
préparation enzymatique ? Justifier votre réponse par le calcul.
Il faut calculer le facteur de purification après chaque étape en utilisant la formule Fp = AS étape
n+1/ AS étape n
Réponse : Etape 3 (chromato 1) : car Fp entre étapes 2 et 3 est de 10, c’est le plus élevé.
f- quelle technique complémentaire utiliseriez-vous pour juger de la qualité du protocole de
purification et de la pureté de l’enzyme ?
technique SDS-PAGE
Question 4 6 pts
a-L’oxydation complète du glucose en CO2 et H2O est une source majeure d’énergie pour les
organismes aérobies. Cette réaction est principalement favorisée par sa large valeur négative de
variation d’enthalpie.
C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6 H2O
∆H° = -2938 kJ.mol-1 ∆S = +200 J.mol-1
A partir des données ci-dessus, calculer la valeur de la variation d’énergie libre standard de cette
réaction à 37°C.
∆G° = ∆H° - T∆S° = -2938000 – 310x 200 = - 3000 kJ/mol
b-Dans la réaction globale du métabolisme aérobie du glucose, 32 moles d’ATP sont formées à partir
d’ADP, pour chaque mole de glucose oxydée. Calculer la valeur ∆G°’ de cette réaction globale quand
l’oxydation du glucose est couplée à la formation d’ATP
(donnée : ∆G°’ d’hydrolyse de l’ATP à 37°C est -30 kJ.mol-1)

∆G°’= -3000 + (32x30)= -3000 + 960= -2040 kJ/mol
c-Quelle est l’efficacité du processus en terme de % de la variation d’énergie libre capturée sous
forme d’ATP ?
(960/3000 )x100= 32 %
Question 5 9 pts
a. Certaines réactions de la glycolyse sont considérées comme les étapes clé de régulation de cette
voie métabolique.
a1-Indiquer lesquelles. Ecrire les réactions (noms des réactants et noms des enzymes)
Réaction 1 : Glucose + ATP → Glucose-6-P + ADP (Hexokinase ou glucokinase)
Réaction 3 : Fructose-6P + ATP → Fructose-1,6-bisP + ADP (phosphofructokinase)
Réaction 10 : Phosphoenolpyruvate + ADP → Pyruvate + ATP (Pyruvate kinase)
a2-D’un point de vue thermodynamique, quel est l’intérêt de cibler ces réactions pour
réguler cette voie métabolique ?
ce sont les seules étapes avec un ∆G°’très négatif qui fonctionnent donc loin de l’équilibre et qui sont
considérées comme irréversibles
b- La réaction 5 de la glycolyse est appelée « réaction d’interconversion des trioses-phosphates ».
Cette réaction est catalysée par la Triose-phosphate isomérase (TIM), une enzyme dont on dit qu’elle
approche la perfection cinétique.
b1- Ecrire en détail cette réaction (avec les formules semi-développées des réactants).
DHAP ↔ GAP CH2OP-CO-CH2OH ↔ COH-CHOH-CH2OP
b2- quel est l’intérêt principal de cette réaction ?
Quand le fru1,6-BP est scindé en deux trioses phosphate à l’étape 4, seul le GAP continue dans la
glycolyse. Cette étape a pour but de convertir DHAP en GAP, ainsi les 6C du glucose peuvent
continuer dans la glycolyse
b3- Que signifie le terme « perfection cinétique » pour une enzyme ?
Ce sont des enzymes extrêmement efficaces caractérisées par des valeurs de kcat/Km de l’ordre de
108 à 109 M-1.s-1. Leur efficacité n’est limitée que par la vitesse de diffusion des molécules de E et S
c. Chez l’homme, en condition anaérobie, le pyruvate subit une transformation.
c1. Donner le nom de cette transformation. Ecrire en détail la (ou les) réaction(s) ayant lieu
(noms des réactants et enzyme).
fermentation lactique Pyruvate + NADH,H+  Lactate + NAD+ (LDH)
c2. Dans quel(s) type(s) cellulaire(s) ou tissu(s) cette réaction a-t-elle lieu ?
le GR et le muscle squelettique privé d’O2
c3. Quel est l’intérêt principal de cette réaction ?