ue 2v424 microbiologie compte-rendu de tp

L’UE Microbiologie est principalement composée de 5 travaux pratiques, au cours
desquels plusieurs expériences ont été menées, afin d’acquérir les bases de la manipulation de
microorganismes :
des bactéries : Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis,
un eucaryote unicellulaire : Saccharomyces cerevisiae,
des archées : Haloferax volcanii, Sulfolobus solfataricus,
un virus : bactériophage Lambda.
Ces travaux pratiques permettent d’acquérir une première approche des principales
expériences suivantes :
préparer un milieu de culture solide et stérile,
titrer une souche bactérienne ou virale,
travailler dans un cadre stérile,
effectuer des prélèvements, coupes, colorations, fixations et observations au
microscope optique de microorganismes de nature différente,
identifier les conditions de croissance (milieu de culture, environnement) de
différents microorganismes et calculer leur taux de croissance respectif,
réaliser un antibiogramme,
caractériser la diversité bactérienne selon plusieurs échantillons,
analyser un mélange de bactéries et savoir les différencier,
réaliser une PCR, une électrophorèse et identifier des organismes selon leur
code génétique.
Les pages qui suivent relateront ces expériences une par une.
UE
2V424 MICROBIOLOGIE
COMPTE-RENDU DE TP
Binôme 4
Florence Burger

2
TP 1
EXPERIENCE N°1
But : déterminer la présence de colonies d’Escherichia coli selon l’utilisation ou non d’agents
destructeurs de bactéries : antibiotique (ampicilline), alcool et savon.
Principe : préparer un milieu de culture gélosé LB-agar avec ou sans ampicilline et effectuer
des empreintes de doigts avec ou sans alcool et savon, puis faire incuber.
Résultat :
Figure 1 : Colonies d’Escherichia coli sur milieu LB : Témoin (à gauche) / Sans ampicilline +
ou – savon ou alcool (au milieu) / Avec ampicilline + ou – savon ou alcool (à droite)
La boîte témoin (figure 1 à gauche) nous prouve qu’il y a bien présence de bactéries sur nos
doigts, d’où la croissance de colonies bactériennes après incubation sur milieu riche gélosé
LB-agar sans aucun traitement antibactérien. L’ampicilline est un antibiotique inhibant la
synthèse de la paroi des bactéries Gram- et provoquant ainsi la lyse de la cellule.
Sur la boîte ne contenant pas d’ampicilline (figure 1 au milieu), le test des empreintes de
doigts a été effectué avant et après lavage à l’alcool d’une part, au savon d’autre part. On
observe la présence de colonies bactériennes avant lavage, comme sur notre boîte témoin,
mais on note bien l’absence de toute colonie bactérienne après lavage, que ce soit avec
l’alcool ou avec le savon. On peut donc supposer que l’alcool et le savon contiennent des
agents destructeurs de bactéries.
Néanmoins, nous noterons le fait que certains binômes ayant effectué la même expérience ont
tout de même obtenu la croissance de colonies bactériennes après lavage. On peut donc en
déduire que l’efficacité de l’alcool et du savon sur la destruction des bactéries dépend de
certains paramètres quantitatifs et qualitatifs : temps de lavage, qualité du lavage, quantité et
concentration de produit utilisé...
Sur la boîte contenant de l’ampicilline (figure 1 à droite), le protocole est le même que pour
la boîte sans ampicilline. On constate l’absence de toute colonie bactérienne, que ce soit avant
ou après lavage. Ceci confirme l’efficacité de l’ampicilline (du moins à la dose administrée
dans cette expérience) et que les bactéries qui étaient présentes sur nos doigts sont de type
Gram-. En observant nos boîtes, on sait que l’on peut distinguer des colonies bactériennes
selon au moins deux critères : la couleur et la taille.

3
EXPERIENCE N°2
But : déterminer la concentration cellulaire (UFC/mL) d’une culture bactérienne
d’Escherichia coli.
Principe : étaler la suspension bactérienne sur milieu gélosé LB-agar, après avoir effectué des
dilutions en série, puis faire incuber.
Résultats :
Figure 2 : Colonies d'Escherichia coli selon différentes dilutions
On part de l’hypothèse que chaque bactérie a fait une colonie et on s’intéresse aux dilutions
pour lesquelles le nombre de colonies est quantifiable, à savoir les dilutions de 10
-6
à 10
-9
. En
effet, moins la dilution est grande, plus il y a de bactéries et donc de plages de croissance de
colonies, qui deviennent indénombrables. Chaque point noir sur les boîtes correspond à une
colonie bactérienne (figure 2). On note ainsi la présence de 3 colonies à dilution 10
-8
, 27 à
dilution 10
-7
et 157 à dilution 10
-6
.
Les résultats obtenus ne sont pas parfaits, étant donné qu’on devrait obtenir un nombre de
colonies grandissant par facteur 10. Par exemple, en partant de 3 à dilution 10
-8
, on devrait
théoriquement obtenir un nombre de colonies avoisinant 30 à dilution 10
-7
, ce qui est presque
le cas puisqu’on a obtenu 27. Mais 27 x 10 = 270. Or, pour la dilution à 10
-6
, on a dénombré
157 colonies. Cette marge d’erreur peut être due à une erreur de manipulation (dosage) lors
des dilutions effectuées.
10
-
5
10
-
4
10
-9
10
-8
10
-7
10
-6

4
Binôme Dilution UFC
(par mL)
10
-
4
10
-
5
10
-
6
10
-
7
10
-
8
10
-
9
1 Indéfini Indéfini 88 34 57 0 1 x 10
9
2 Indéfini Indéfini 107 14 4 0 1,4 x 10
9
3 Indéfini Indéfini 143 15 0 0 1,5 x 10
9
4 Indéfini Indéfini 157 27 3 0 3 x 10
9
5 Indéfini 300 78 6 2 0 7,8 x 10
8
6 Indéfini 131 59 12 1 0 1,2 x 10
9
7 Indéfini Indéfini 144 34 12 2 1,2 x 10
9
Figure 3 : Tableau représentant le nombre de colonies bactériennes formées en fonction de
la dilution effectuée, ainsi que l’UFC qui en découle
On souhaite ensuite calculer l’UFC (unité formant colonie), c’est-à-dire la concentration
bactérienne obtenue (figure 3).
Explication calcul UFC : on dénombre 3 colonies dans la boîte à dilution 10
-8
, donc pour
obtenir une concentration bactérienne sans dilution, on multiplie par l’inverse du facteur de
dilution : 3 x 10
8
. Comme on a mis 100 µl de suspension bactérienne et qu’on souhaite
connaître la concentration de bactéries dans 1 mL, alors on multiplie la concentration trouvée
par 10 : 3 x 10
8
x 10 = 3 x 10
9
.
Au regard de ces résultats, il semblerait qu’il y ait au moins 3 milliards de bactéries dans 1
mL de suspension !
EXPERIENCE N°3
But : comparer les caractéristiques physiques de trois microorganismes : une bactérie :
Escherichia coli, une archée : Haloferax volcanii et un eucaryote unicellulaire (levure) :
Saccharomyces cerevisiae.
Principe : préparer une lame contenant le microorganisme à l’état frais sans coloration ou
après frottis et coloration, puis observer au microscope optique.
Résultats :
Figure 4 : Observation au microscope optique (x40) de Saccharomyces cerevisiae (à
gauche) et Haloferax volcanii (à droite), état frais sans coloration

5
Figure 5 : Observation au microscope optique (x40) d’Escherichia coli à l'état frais sans
coloration (à gauche), puis après frottis et coloration au Cristal violet (à droite)
Organisme Forme Taille
(en µm) Mobilité
Escherichia coli Bacille 0,5 à 3 Oui (flagelle)
Haloferax volcanii Disque aplati 2 à 3 Non
Saccharomyces cerevisiae Ovoïde 6 à 12 Non
Figure 6 : Tableau représentant les différences phénotypiques des trois organismes étudiés
On remarque que ces trois microorganismes (figures 4 et 5) n’ont pas la même forme ni la
même taille et certains sont mobiles, d’autres non. La taille est difficilement quantifiable,
aussi le tableau (figure 6) fait-il référence à des valeurs recherchées.
TP 2
But : comparer les temps et taux de croissance de deux microorganismes (Escherichia coli et
Saccharomyces cerevisiae) en fonction de différentes conditions de croissance.
Principe : ensemencer des fioles de Klett avec les microorganismes étudiés (différents
milieux et différentes conditions), les faire incuber, puis mesurer la densité optique
(DO) à l’aide d’un colorimètre.
Résultats :
Figure 7 : Condition 1 : Courbe de croissance d’Escherichia coli en fonction du temps et de la
DO / Milieu LB versus milieu M63