Licence
publicité
UNIVERSITE KASDI MERBAH - OUARGLA FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES Projet de Fin d’Etudes En vue de l’obtention du diplôme de Licence Domaine : Sciences de la nature et de la vie Filière : Biologie Spécialité : Microbiologie fondamentale et appliquée Thème Lisetria monocytogenes: Effet combiné de la nisine et de conditionnement des aliments Présenté par : DJEDIAI RANIA. ZIGHEM AICHA. Encadreur : Mme SIBOUKEUR AMINA. U.K.M Ouargla. Examinatrice: Melle SOUID WAFA. U.K.M Ouargla. Année universitaire : 2013/2014. Dédicace : Je dédie ce modeste travail à : A mon très cher père, je lui dédie avec fierté ce mémoire qui reflète le fruit de l’éducation et de l’attention qu’il m’a tant réservé, je suis très reconnaissante et j’aurai tant aimé partager la joie de ma réussite avec lui. À la plus merveilleuse des mamans, qui ma supportée et sacrifier et m’a aidée dans les pires moments, car tu as toujours cru en moi, je suis que je suis maintenant ; merci maman. A mes frères: Doussem, Nizar et Mohammed. A mes sœurs: Djoumana et Farah. A mes collègues ainsi que ma binôme Aicha. A mes copines avec lesquelles j'ai partagé mes moments: hanane, hana, heyeme, ikram. DJEDIAI RANIA Dédicace Je dédie ce mémoire : A mon chère mari qui m’offre tous ses efforts pour m’aide et m’encourager de continuer mes études. A ma chère maman qui n’a jamais cessé de ménager ses sacrifices et privations comme mère soucieuse de l’avenir de ses enfants. A mon cher papa qui a su se montrer son encourageant. A mes frère Zakaria,Youcef , Sabri et Adem . A mes sœurs Bahria et ses enfants Brahim et Shaima , Djamaa et ses enfants Tadj et Siradj , Fatima, Radia. A Daouia,Taher ,mes belles sœurs Zineb , Nawel, Hana, Sara ,Hasna et Khadidja Jamais de simples mots ne me permettront de vous exprimer mes remerciements. A mes grandes familles ZIGHEM et DARI , grands et petits. A mes chères cousines lesquelles j’ai partagé mes bons souvenirs : Fatiha et Fouzia A ma binôme Rania ainsi que tous mes collègues Avant tout nous remercions '' DIEU '' tout puissant de nous avoir guidées tout au long de nos années d'études et de nos avoir donné le courage pour réaliser ce travail. Nous tiens à exprimer nos remerciements les plus distingués: A notre encadreur : SIBOUKEUR AMINA pour ça bien vaillance, ses conseils, son aides moral et scientifique, sa patience et sa disponibilité pendant toute la période de travail A notre examinatrice: SOUID WAFA d'avoir accepté d'examiner se modeste travail. A tous ceux qui ont contribués de près ou de lion à la réalisation de se mémoire. Sommaire Introduction 1 Partie I: Généralité sur Listeria monocytogenes 1.1.1. Historique 2 1.1.2. Taxonomie 2 1.3. Habitat 3 1.4. Caractères de Listeria monocytogenes 3 1.4.1. Caractères morphologiques 3 1.4.2. Caractères biochimiques 4 1.4.3. Caractères culturaux 4 1.5. Facteur de croissance 4 1.5.1. Température de croissance 4 1.5.2. pH de croissance 4 1.5.3. Activité d'eau et croissance 5 1.5.4. Tolérance aux sels 5 1.6. Pouvoir pathogène 6 1.6.1. Listériose 6 1.6.1.1. Listériose animale 6 1.6.1.2. Listériose humaine 6 1.7. Contamination des produits alimentaires par L.m 6 1.7.1. Sources de contamination des aliments 7 1.7.2. Recherche et dénombrement de L.m dans les denrées alimentaires 8 1.8. Méthodes de préservation des produits alimentaires contre L.m 9 1.8.1. Acide lactique 9 1.8.2. Acide acétique 9 1.8.3. Acide phenylacétique 9 1.8.4. Hautes pressions et irradiation 10 1.8.5. Thermo-résistance 11 1.8.6. Substances antimicrobiennes "bactériocines 11 1.8.6.1. Généralités sur les bactériocines 12 Partie II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments 2.1Conditionnement 14 2.2. Emballage 14 2.3. Conservation des aliments 14 2.3.1. Techniques de conservation par la chaleur 14 2.3.2. Techniques de conservation par froid 15 2.4. Méthodes de conditionnement 15 2.4.1. Mise sous vide 15 2.4.2. Conditionnement sous atmosphère modifiée 15 2.4.3. Emballage actif 15 2.4.3.1. Emballages actifs et les agents antimicrobiens 16 2.5. Nisine 16 2.5.1. Bactéries lactiques productrices de la nisine 16 2.5.2. Généralité sur les bactéries productrices de la nisine 16 2.5.2.1. Biosynthèse de la nisine 17 2.5.2.2. Structures de la nisine 18 2.5.2.3. Spectre d'activité 19 2.5.2.4. Extraction et purification de la nisine 19 2.5.2.5. Purification de la nisine 19 2.6. Effet de la nisine dans les produits alimentaires conditionnés 19 2.7. Mécanisme d’action de la nisine 23 Conclusion 25 Références bibliographiques 26 Liste d'abréviations: aw Activity Water(Activité d'eau) BL Bactéries Lactiques CAM Conditionnement sous Atmosphère Modifiée CMI Concentration Minimal Inhibitrice Da Dalton D Dose µm Micromètre G Gramme HPLC Chromatographie Liquide à Haute Performance kGy Kilo Gray Ml Millilitre Mg Milligramme MPa Méga Pascal L.m Listeria monocytogenes L Litre TC° Température en degré Celsius UHT Ultra Haut Température UI Unité Internationale Liste des tableaux: Tableau Page Tableau I : Croissance de Listeria monocytogenes sur milieu Trypticase (LAPRENT, 1997). 5 Tableau II : Identification de L.m (FEDERIGHI, 2005). 9 Tableau III: Classification des bactériocines des bactéries lactiques (HENG et TAGG, 2006). 12 Tableau IV : Variation de la sensibilité de quelques souches de Listeria à la nisine (HUGENHOLTZ et VEER, 1991 in RICHARD, 1996). 20 Liste des figures Figure Page Figure 1 : Vois de contamination des matières premières alimentaires par Listeria monocytogenes (FEDERIGHI, 2005). 7 Figure 2: Schéma de biosynthèse, de sa régulation et d’immunité de la souche Productrice pour la nisine (MAKHLOUFI et al, 2011) 18 Figure 3 : Structure de la nisine (MAKHLOUFI et al, 2011) 19 Figure 4: Inibition de L.innocua par la nisine dans la viande de porc hachée concervée à 6C° sur le milieu Palcam (RICHARD,1996). 21 Figure 5:Inhibition de L. monocytogenes en phase de latence, par addition à t = 0 des bactériocines seules ou en association nisinecurvaticine ou nisine-pédiocine (SEBTI et al. ,2002) Figure 6: Formation des pores membranaires par le complexe nisinelipide II selon CHATTERJEE et al, (2005). 22 23 Introduction Introduction Listeria monocytogenes est une bactérie ubiquitaire qui peut être trouvée dans le sol, les réseaux hydriques, sur les végétaux ainsi que dans l’environnement industriel des ateliers de production et de transformation des aliments (Dumas, 2007). Elle est l'espèce la plus pathogène du genre Listeria, est à l'origine de la listériose une infection grave chez l'homme et les animaux, d’origine alimentaire affectant essentiellement les personnes immunodéprimées, les personnes âgées et les femmes enceintes (VIDEAU, 1997). Toujours on a recherché des méthodes pour conserver les aliments, entre le moment où les denrées sont capturées, ou récoltées et celui de la consommation. Depuis des siècles, l'homme fait appelle aux plusieurs méthodes physiques et chimiques qui ont été appliqués sur les aliments au fur y a mesure. ces procédés font des dégâts à la santé humaine. Une nouvelle alternative a été étudiée pour éviter la contamination microbienne de produits alimentaires par des agents antimicrobiens. c'est l'utilisation des agents antimicrobiens (bactériocines) qui peuvent être incorporés dans la masse lors de la formulation du produit, ou appliqués en surface sur le produit fini (KIM et al., 2002). Les emballages actifs antimicrobiens, qui consistent à incorporer ces substances dans l’emballage, constituent une option innovante. En effet, ils offrent une plus grande efficacité dans la protection de l’aliment car ils permettent une meilleure stabilité de l’agent antimicrobien, et assurent le contrôle de son relargage vers l’aliment dans le temps. La question qui se pose. Quelles sont ces molécules antimicrobiennes généralement utilisées dans ces emballages et quel est l'effet de ces molécules durant la durée de conditionnement de l'aliment. Le présent travail a l'objectif de l’étude des caractères généraux de Listeria monocytogenes, et son action sur les produits alimentaires et l'effet de ces substances antimicrobiens incorporées dans le bio-emballage sur cette souche pathogène. 1 Partie I GENERALITES SUR Listeria monocytogenes PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes 1.2.Historique La découverte de Listeria monocytogenes est liée à des cas de listérioses humaines et animales étudiés au début de xxe siècle (RYSER et MARTH, 1999). En 1918. Dumont et Cotoni isolèrent une bactérie du liquide cephalorachidien d’un soldat atteint de méningite. Cette bactérie fut conservée et identifiée en 1940 comme étant L.monocytogenes. En 1926. Murray, Web et Swann isolèrent un petit bacille à Gram positif du sang de lapins atteints d’une mononucléose sangaine et fournirent une description détaillé du germe qu’ils nommèrent Bacterium monocytogenes. En outre, le germe a été isolé chez le porc en 1924, chez une espèce de gerbille africaine en 1927 sous le nom de Listerella hepatolytica et chez le mouton en 1929. En 1929. Nyfeldt isola une bactérie qu’il nomma Bacterium monocytogenes hominis du sang de trois malades présentant une mononucléose. Bacterium monocytogenes et Listérella hepatolytica semblant être le même organisme, le nom de Listorella hepatolytica fut proposé et conservé jusqu’en 1939. Puis le nom de Listorella serévélant déjà utilisé pour désigner un champignon le nom de Listeria monocytogenes fut adopté en 1940, en hommage à Lord Lister, chirurgien analais promoteur de l’asepsie, et en référence à la mononucléose observée chez les malades. (FEDERIGHI, 2005). Le rôle des aliments dans la transmisson de L.m à l’homme a été suspecté des la fin des années quarante, mais sans pouvoir etre clairement démontré. En 1981 au Canada, une épidémie de listériose à provoqué 17 décès parmi 41 personnes malades. Ces personnes avaient consommé une salade de chou cru contaminée par L.m .par sa fréquence et par les méthodes de typage des souches mis en oeuvere cet épisode à permis la première démonstration de la transmission du germe par les aliments. Depuis cette date, de nombreuses épidémies de listériose d’origine alimentaire ont été décrites dans différents pays de monde. En France, en 2004, la proportion de cas de listériose humaine due à une origine alimentaire estimée à 99% (FEDERIGHI, 2005). 1.3.Taxonomie Selon la classification officielle .les Listeria appartiennent à la branche des clostrdium voisin des genres Brochothrix, Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus et Bacillus .appartienne a la famille de listeriaceae, classe des bacilli et l'ordre des bacillale. Aussi elles appartiennent au groupe 19 concernant les bacilles réguliers, non sporulées, Gram positive (GUIRAUD et ROSE, 2004). Actuellement le genre Lisertia comporte six espèces réparties en deux groupes de parenté génétique, non pathogènes pour l'homme : L.monocytogenes L. innocua, L. ivanovii (subspecies ,ivanovii et subspecies, londoniensis) L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi (SEELIGER et JONES, 1986). L.monocytogenes qui fait de notre étude bibliographique. 2 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes La Listeria monocytogenes est une anthropo-zoonose (CZUPRYNSKI et al, 2003). Les infections qu'elle provoque peuvent se manifester sous diverses formes telles que la listériose, la septicémie, l'abcès, l'encéphalite, la méningite, ou les fausses couches. Par ailleurs, moins de 300 cas sont recensés chaque année (essentiellement des immuno-déprimés, enfants et femmes enceintes). La listériose se propage par la consommation d'aliments contaminés. (MENG et al., 1997) 1.3. Habitat L.m possède les caractères d’une bactérie tellurique. Cette bactérie non sporulée est capable de résister dans ou à la surface de nombreux supports: sol, plants, eaux, denrées alimentaires appareillages locaux. Elle peut profiter des matières organiques en décomposition, se comportant alors en germe saprophyte ou peut constituer des biofilms sur des surfaces. Cette capacité de survie et d’implantation multiplie les modalités de contamination des denrées alimentaires d’exposition des animaux et de l’homme: Chez des espèces animales dont 10 à 30% d’ovins, caprins,…qui sont parfois des porteurs sains de L.m. Chez l’homme, avec 3 à 5% des individus qui peuvent hébeiger L.m sans avoir des manifestations chimique. L.m est aussi capable de survivre et de multiplier dans des conditions propres aux animaux et à l'homme. En particulier cette bactérie peut survivre dans le tube digestif des animaux et de l’homme créant ainsi des porteurs a symptomatiques. Elle peut aussi envahir un hôte, se comportant alors en parasite intracellulaire (GUIRAUD et ROSE, 2004). 1.4. Caractères de Listeria monocytogenes 1.4.1. Caractères morphologiques Les espèces de L.m se présentent sous la forme de petits bacilles droits (quelques cellules peuvent être incurvées), de 0,4 à 0,5 µm de diamètre sur 0,5 à 2,5 µm de longueur, aux extrémités arrondies, se présentant de manière isolée ou groupés en V ou en L ou en palissades ou, parfois, en courtes chaînes. Dans les vieilles cultures, il est possible d'observer des formes mesurant de 6 à 20 µm de longueur , il est possible d'observer des formes coccoïdes (0,4 à 0,5 µ m de diamètre sur 0,4 à 0,6 µ m de longueur).Ce sont des bactéries à Gram positif (les cellules prélevées dans de vieilles cultures retiennent mal la coloration de Gram), non acido-résistantes, non capsulées, non sporulées, aéro-anaérobies facultatives mais cultivant mieux en aérobiose et mobiles lorsqu'elles sont cultivées à 20 - 28 °C. Le G+C% des L.m est de 37à39%.La ciliature est de type péritriche avec un nombre de flagelles compris entre 1 et 5 et la mobilité est caractéristique car la bactérie semble tourner sur elle-même (FEDERIGHI, 2005). 3 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes 1.4.2. Caractères biochimiques La caractérisation biochimique de L.m fait appel aux méthodes classiques d’identification bactérienne: catalase+, oxydase-, ß-hémolyse sur gélose au sang, Dxylose-, D-mannitol-, L-rhamnose+, Citrate-, _-méthyl-D-mannoside+. Cette bactérie est privée de nitrate réductase, elle fermente le glucose sans production de gaz, le catabolisme du glucose emprunte la voie d’Embden-Meyrhof. En anaérobiose, le produit terminal est l’acide lactique, elle hydrolyse l’esculine, elle ne produit pas d’indole, ni de H2S. Elle est uréase négatif et non protéolytique (gélatine) phosphatase alcaline+. L’arabinose, le lactose, le mélézitose, le saccharose et la dextrine sont tardivement fermentés ou négatifs. La xylose, raffinose, inositol, dulcitol, mannitol, adonitol ne sont pas fermentés. Listeria monocytogenes donne des résultats positifs en présence de rouge de méthyle et au test Vges proskauer (JONES, 1986). 1.4.3. Caractères culturaux L.m est aérobie microaérophile et anaérobie facultative. Elle est mésophile mais avec un comportement souvent psychrotrophe (DJENANE et al., 2006). Elle n'est pas exigeante et sa culture obtenue sur les milieux classiques telle que; la gélose nutritive au sang ou un bouillon nutritif. (KERDOUS et LAMROUS, 2006) Les colonies de Listeria monocytogenes sur gélose nutritive et après 24 heures d'incubation se développent sous formes légèrement lisse et convexe, à bords réguliers translucides et leur diamètres varie de 0.5à1.5 µm, éclairées par une lumière oblique, les colonies ont une légère coloration bleu vert. Sur une gélose au sang, on observe une zone d'hémolyse complète autour des colonies. Sur un bouillon nutritif, on obtient un trouble modéré homogène. L'addition aux milieux précités de substances telles que le sang, le sérum, le glucose (0.5%) permet d'obtenir une culture plus riche. 1.5. Facteur de croissance 1.5.1. Température de croissance La température optimale de croissance est comprise entre 30 et 37°C. La bactérie peut même se développer à des températures comprises entre -2°C et +45°C (AUGUSTIN, 1999). Par ailleurs, une forte hétérogénéité des taux de croissance a été décrite Plus généralement, le comportement à de températures inférieures à 0°C, celui-ci est extrêmement faible (AUGUSTIN, 1999). 1.5.2. pH de croissance Selon (BERGY, 1986) Listeria monocytogenes peut se développer dans une gamme de pH variant de (5.6à9.6).son pH optimal est aux alentours de 7 avec une 4 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes tendance plutôt alcaline. Des études ou néanmoins prouvé L.m commence à se développé à des pH inferieurs à 5, mais la tolérance à ces pH est plus faible qu'aux pH basique. La croissance à des pH bas est directement liée à la température. Tableau (I). (LOU et YOUSSEF, 1997). Listeria monocytogenes se conserve mieux à température de réfrigération qu'à 31°C )11 jours avec un pH de 3,6-3,7 à 8°C( )2 jours avec un pH de 3,6-3,7 à 37°C( L'inactivation de Listeria monocytogenes varie également avec l'agent acidifiant : la forme non dissociée des acides faibles est plus bactéricide. (ANONYME-1, 2005). Tableau (I) : Croissance de Listeria monocytogenes sur milieu Trypcase (LAPRENT, 1997) T° C d'incubation PH minimal de croissance 30 4.39-4.63 20 4.39-4.62 10 4.62-5.05 7 4.62-5.05 4 5.23-5.45 1.5.3. Activité en eau (aw) et croissance L'aw optimum de Listeria monocytogenes est de 0,97 mais cette bactérie peut se développer jusqu'à 0,943. Listeria monocytogenes survit 132 jours à 4°C à un aw= 0,83 sur trypticase, soja.Une aw faible (environ 0,90) augmente la résistance de Listeria monocytogenes à la chaleur. Cette espèce peut survivre sur des emballages pendant 14 jours de - 0,8°C à 6,6°C (ANONYME-1, 2005). 1.5.4. Tolérance aux sels Listeria monocytogenes est capable de se développer en présence de 10% NaCl. Elles peuvent se développer jusqu'à 12% de NaCl. Elle survit 150 jours dans du NaCl pur. Le temps de survie de cette espèce dans 25% de NaCl augmente quand la température baisse (24 jours à 22°C, 132 jours à 4°C) (JOHNSON, 1988). 5 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes 1.6. Pouvoir pathogène 1.6.1. Listériose L.m Souvent décrites comme des bactéries opportunistes infectant de nombreuses espèces animales et l’homme. Elle peut se comporter en commensal .Elle doit son nom à la propriété qu’il possède de provoquer chez certains animaux et dans certaines conditions une monoucléose (VIDEAU, 1987). 1.6.1.1. Listériose animale La listériose à été signalée chez une cinquantaine d’espèces animales. Elle revêt trois aspects principaux: Septicémie, Encéphalite, Avortements. 1.6.1.2. Listériose humaine Chez l’homme les cas de listériose semblent être de plus en plus nombreux. La contamination n’est généralement pas d’origine directement animale la listériose revêt des formes diverses: méningites s’associant parfois à un syndrome encéphalitique, septicopyohemies (surtout chez le nouveau-né) formes localisées plus rarement rencontrées (otites, conjonctivites). Chez la femme, la listériose peut être à l’origine d’avortements à répétitions. La contamination du fœtus par voie transplacentaire ou celle du nouveau né lors de l’accouchement est possible. Les listeria se comporter comme des germes virulents infectant les personnes âgées et les sujets en bonne santé. (VIDEAU, 1987). Listeria monocytogenes a été clairement identifiée comme étant une des bactéries responsables d’infection d’origine alimentaire. Cependant l’incidence des infections alimentaires dues à Listeria est faible comparée à celle des infections dues aux Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter. (VIDEAU, 1987) 1.7. Contamination des produits alimentaires par L.m L’altération microbienne des denrées alimentaires est synonyme d’un développement microbien croissant responsable de mise hors consommation du produit à cause des changements sensoriels (couleur, odeur et texture). Listeria monocytogenes cause des altérations des produits alimentaires dans le domaine de l’agroalimentaire, il faut savoir que la contamination des produits est souvent très aléatoire. (VIDEAU, 1987). Listeria est un germe opportuniste, ce qui explique que la contamination d’un produit puisse intervenir à tous les stades de sa fabrication, de son conditionnement, au “stockage”, à la commercialisation et même dans l’assiette du consommateur. Par leur origine et leur composition, certains aliments sont plus susceptibles que d'autres de contenir des Listeria monocytogenes, cette bactérie comme l'immense majorité des 6 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes bactéries dans la nature, ne sont pas en suspension dans des liquides, mais adhérente à des supports où elle forme des biofilms (PERNI et al., 2005 ; CHAE et al., 2006). Cette structure où cohabite généralement plusieurs genres bactériens, modifient la physiologie bactérienne, favorisent les échanges de matériel génétique, améliore la survie des bactéries face aux stress (applications technologiques diverses), et augmente les possibilités de contamination des aliments (RYSER et MARTH, 1999). 1.7.1. Source de contamination des aliments Le portage intestinal asymptomatique de L.m est relativement fréquent aussi bien chez l'homme que chez les animaux d'élevages. L.monocytogenes est capable de survivre très longuetemps dans les fèces d'animaux (entre 6 mois et plus de 5 ans) (RYSER,.et MARTH,1999). Les matières fécales animales ou humaines constituent donc une source de contamination de l'environnement naturel (sol et eau) (FEDEGHI.M, 2005) fig.1 Eau Sol Fèces Air, poussiers Fourrage Ensilages Animaux Produits végétaux viandes Lait Produits de mer Homme Figure 1 : Vois de contamination des matières premières alimentaires par Listeria monocytogenes (FEDERIGHI, 2005). 7 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes L.m a été fréquemment isolée de sols, de végétaux cultivés (fourrages, légumes) ou on décomposition, d'ensilage d'effluent urbain ou d'élevages et des eaux. Sa capacité de survie peut aller jusqu'à plusieurs années dans les sols ; elle varie en fonction physico- chimique et l'humidité de sols (RYSER et MARTH, 1999). 1.7.2. Recherche et dénombrement de L.m dans les denrées alimentaires Les L.m sont généralement en faible nombre dans les denrées alimentaires donc il est nécessaire d'utiliser des techniques d'enrichissement sélectifs suivi par un isolement sur des milieux sélectifs. La recherche et le dénombrement de L.m dans les aliments sont basé sur des normes; Lait et produits laitiers: ISO.10560.FIL-143A Toutes denrées ISO-11290-1, NF-08-028-1; NF -V- 08-028.1; NF-V-08-055; AFNOR DNA-14/2-02/95 Gene-Trak Systems DNA GTS 609; AFNOR SDP-07/4-09/98 probelia L.m; AFNOR BIO-12/4-02/95 Accuprobe détection de L.m; AFNOR SDP-07/4-09/98 RAPID' L.m ; AFNOR BIO12/3-03/96 Vidas L.m. Dénombrement de L.m en toutes denrées: ISO-11290-2;NF-V-08-028.2 Enrichissement et isolement (milieux sélectifs): Selon la méthode de référence NF en ISO 11290-1 qui comprend plusieurs étapes: 1. A partir d'une prise d'essai de25g enrichissement primaire de la suspension mère en milieu sélectif liquide de (bouillon Fraser- demi) pendant 24h à30C°. 2. Puis en faire le premier isolement sur milieux sélectifs solides : gélose Oxford PALCAM suivi par une incubation 24 - 48h à 30 - 37C°. 3. Enrichissement secondaire sur milieu sélectif liquide ce milieu contient 2 fois d'agent sélectif que le bouillon primaire, après on va l'incubé 4. La 2éme isolement sur milieux solide sélectif. Identification : Le tableau II Présente les caractères culturaux en bouillons d'enrichissement et sur gélose sélective qui permettent de suspecter la présence de Listeria dans l'échantillon analysée et les critères d'identification de L.m .une confirmation de genre et de l'espèce ensuite entreprise. Après examen des milieux solides sélectifs d'isolement, 5 colonies typiques ou suspectes chaque boite de milieu sont repiqués sur gélose non sélective. Des tests d'identification sont ensuite effectués: recherche de catalase, coloration de Gram, mis en évidence de la mobilité à 25-30C° soit par examen microscopique des bactéries à l'état frais, soit en milieu-mobilité, mise en évidence de l'hémolyse sur gélose au sang (FEDERIGHI, 2005). 8 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes Tableau II : Identification de L.m (FEDERIGHI, 2005). Etapes Enrichissement Isolement sur: Oxford PALCAM Identification Caractères utilisés pour identification de L.m -Noircissement des bouillons (hydrolyse de l'esculine) - colonies grises, luisantes entourées d'un halo noir (hydrolyse de l'esculine), incrustées dans la gélose (dépression central): - colonies verdâtres luisante entourées d'un halo noir (hydrolyse de l'esculine) , incrustées dans la gélose (dépression central): Caractéristiques l L.m: - hémolyse β sur gélose au sang (zone claire, étroite d'hémolyse autour des colonies ou d'une piqure) - test de Camp + On peut complétés l'identification de L.m à l'aide d'une galerie d'identification API Listeria (FEDERIGHI, 2005). 1.8. Méthodes de préservation des produits alimentaires contre Listeria monocytogenes 1.8.1. L’acide lactique Produit caractéristique de la fermentation du lactose par les bactéries lactiques exerce son activité antimicrobienne par une chute du pH de l’environnement mais aussi par sa forme indissociée qui peut diffuser au travers des membranes et réduire le pH intracellulaire (HOLZAPFEL et al., 1995). 1.8.2. L’acide acétique Est le produit caractéristique de la fermentation de l’acide lactique par certaines bactéries hétérofermentaires .Il peut aussi avoir une origine protéolytique. Il se caractérise par une constante de dissociation plus importante, ce qui le rend plus inhibiteur que l’acide lactique (HOLZAPFEL et al., 1995). 1.8.3. L’acide phenylacétique Est un composé excrété par certaines bactéries lactiques. Sous l’action de l’acide phenylacétique (1 mg/ml), les cellules de L. monocytogenes s’agrègent et sécrètent des exopolysaccharides, puis elles s’affaissent et sont lysées. En milieu liquide, cet acide possède une activité bactéricide sur L. monocytogenes (7 mg/ml) mais seulement bactériostatique pour la même concentration dans du lait UHT et de la 9 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes pâte de fromage. Les différentes matrices alimentaires peuvent être à l’origine de la diminution de l’effet inhibiteur, (MILLEt et al., 2005) ont fabriqué des fromages de type saint nectaire avec du lait cru préalablement inoculé avec L. monocytogenes. Une inhibition de Listeria monocytogenes a été mise en évidence dans les pâtes des fromages pour des pH inférieurs à 5,2 associés à des valeurs de lactates de 14 mg/g (MARIANI et al., 2007). 1.8.4. Hautes pressions et irradiation À l'effet des hautes pressions, il apparaît que L. monocytogenes n'est pas un germe très résistant comparativement à d'autres germes pathogènes. Il faut néanmoins appliquer 375 Méga Pascal (MPa) pendant 15 minutes pour réduire la population de 5 unités Log à 10-20°C. Des observations similaires ont été faites par différents auteurs, dont SIMPSON et GILMOUR, (1997) qui ont observé que L. monocytogenes peut survivre dans des dérivés de viande traités à Ultra Haute Température et à de 375 MPa/30 minutes à une température ambiante par rapport à ce qui a été observé dans une solution phosphatée (CHEFTEL et CULIOLI, 1997). Généralement, la résistance à l'irradiation de L. monocytogenes est faible et une dose de kGy (Kilo Gray) est suffisante pour détruire les cellules de L. monocytogenes aux2 inoculum habituellement rencontrés dans les aliments (OSTERHOLM et POTTER, 1997). La dose de réduction décimale (D10) se situe, suivant la température et la nature de l'aliment irradié entre 0,25 et 0,77 kGy, avec une moyenne aux environs de 0,56 kGy (MONK et KIM al., 2006). 1.8.5. Thermo-résistance L.monocytogenes n'est pas considérée comme un germe thermorésistant et est rapidement détruit à des températures de pasteurisation (BRÉAND et al., 1998). Toutefois l'effet de divers prétraitements thermiques peut beaucoup influencer sa thermo tolérance. Pour des bactéries cultivées initialement à 4°C, un préchauffage à 47,5°C pendant 3 heures (PAGAN et al., 1997). Pourrait lui acquérir une résistance ultérieure à une température de65C°. Ces résultats qui confirment ceux de LINTON et al., (1990) montrent que la faculté de préadaptation des L. monocytogenes aux traitements thermiques est réelle. Il serait donc probable que cette faculté contribue à la survie de L.m dans certains aliments subissant, au cours du processus de fabrication, un préchauffage avant pasteurisation (PAGAN et al., 1997). 1.8.6. Substances antimicrobiennes "bactériocines" Des études récentes ont révélé que les consommateurs considèrent plus sûres et sains les produits élaborés à partir des ingrédients naturels, en rejetant ceux qui enregistrent dans leurs étiquettes des additifs synthétiques. Cette situation justifie 10 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes l’intérêt pour l’identification des nouvelles substances antimicrobiennes capables d’être utilisées comme des ingrédients alimentaires. Les bactéries lactiques ont été utilisées depuis plusieurs siècles pour la conservation des denrées alimentaires. Les risques de Listérioses seront minimes, si la multiplication n’aurait pas lieu durant la préparation, l’entreposage et éventuellement au cours de la distribution des aliments. Les bactéries lactiques constituent la meilleure alternative de préservation naturelle grâce à leur capacité de synthétiser des métabolites antimicrobiens (LOZANO et al., 2006). La description et la caractérisation d’un grand nombre de métabolites antimicrobiens (bactériocines) durant ces dernières années et leur spectre d’activité étendu contre la flore d’altération et pathogène fait de ses substances d’excellents candidats pour répondre à l’attente légitime des consommateurs qui exigent des produits plus naturels, plus sûrs et moins altérables. L’intérêt croissant concernant les bactériocines est dû à une série de faits l’approbation que certaines bactériocines sont considérées des substances saines et la reconnaissance que la majorité des maladies fréquentes sont associées aux toxi-infections microbiennes provoquées lors de l’ingestion des aliments infectés. (LOZANO et al., 2006). 1.8.6.1. Généralités sur les bactériocines Déférentes définitions de bactériocines ont été données au cours du temps, et la définition la plus largement acceptée est celle de KLAENHAMMER, (1988) cet auteur à été définit les bactériocines comme des protéines ou complexe des protéines synthétisée par voie ribosomique et douées d'une activité bactéricide ou bactériostatique contre les espèces proches de la souche productrice (TAGG et al., 1976). Elles représentent une large classe de substances antagonistes qui varient selon le poids moléculaire de leur mode d'action. Elles agissent à très faible concentrations de l'ordre de nanomol/L (PARADA et al., 2007). La découverte des bactériocines remonte à 1925 quand GRATIA appela "colicines" des substances antibactériennes sécrétées par E.coli active contre E.coli V (TAGG et al., 1976). La première classification fut élaborée par KLAENHAMMER, (1988). Elle séparait les bactériocines en 2 groupes selon l'entendue de leur spectre d'activité d'inhibition des non-lantibiotiques de faible poids moléculaire et de haut poids moléculaire Les lantibiotiques. Suite au développement des méthodes biochimiques et génétiques se basant sur la structure et le mode d'action des bactériocines ,des nouvelles données ; les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont actuellement réparties en 03 classe tableau III. (HANG et TAGG, 2006). 11 PARTIE I: Généralités sur Listeria monocytogenes Tableau III: Classification des bactériocines des bactéries lactiques (HENG et TAGG, 2006). Classes Classe Ӏ- lantibiotique Sous classes Contiennent de lanthionine et de βméthyl- Lanthionines Ӏa- molécules linéaires Ӏb- bactériocines globulaires Class ӀӀ- peptides non modifié ӀӀa bactériocines apparentées à la Pédiocines ӀӀb peptides de types diver ӀӀc bactériocines composées de plusieurs Peptides Classe ӀӀӀ- protéines de poids moléculaire élevé ӀӀӀa bactériocines bactériolytiques ӀӀӀb peptides non lytiques ӀӀӀ 12 Partie II UTILISATION DE LA NISINE DANS LE CONDITIONEMENT DES ALIMENTS PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments Entre conditionnement et emballage ; ces deux termes sont parfois utilisés indifféremment. Ils ne désignent cependant pas exactement la même opération. Il peut donc être utile de rappeler les définitions données notamment par" le règlement européen n° 854/2004": 2.1. Conditionnement L’action de placer une denrée alimentaire dans une enveloppe ou dans un contenant en contact direct avec la denrée concernée; cette enveloppe ou ce contenant (ANONYME-2, 2002). 2.2. Emballage L’action de placer une ou plusieurs denrées alimentaires conditionnées dans un deuxième contenant; le contenant lui-même. (ANONYME-2, 2002). L’emballage ou le conditionnement constitue une étape importante de la transformation qui facilite la manutention lors du transport, du stockage et au niveau de la distribution. Il assure une protection adéquate du produit contre les contaminations extérieures et contre l’humidité de l’air. Il doit être approprié aux produits à emballer (ANONYME-3, 2000). Les opérations de conditionnement correspondent au nettoyage des emballages, au dosage au remplissage, à la fermeture, à l'étiquetage et au stockage du produit. Elles se raisonnent en fonction d'un couple produit emballage et constituent les dernières étapes des procédés de transformation (ANONYME-3, 2000). Leur déroulement doit se passer dans des conditions d'hygiène minimales. Les produits alimentaires sont sensibles aux attaques microbiennes. Ils ont besoin de subir un traitement pour assurer leur conservation. Ce traitement détruit les micro-organismes contenus dans le produit, afin d'en prolonger la conservation durant plusieurs jours voire plusieurs mois. Il a lieu généralement avant le conditionnement. Les opérations de conditionnement qui suivent, doivent se dérouler dans des conditions d'hygiène strictes (ANONYME-3, 2000). 2.3. Conservation des aliments Depuis des siècles l'homme a recherché des méthodes pour conserver sa nourriture, Parmi ces procédés utilisés pour la conservation des aliments on trouve : 2.3.1. Techniques de conservation par la chaleur Le traitement des aliments par la chaleur (ou traitement thermique) est aujourd’hui la plus importante technique de conservation de longue durée. Il a pour objectif de détruire ou d’inhiber totalement ou partiellement les enzymes et les microorganismes, dont la présence ou la prolifération pourrait altérer la denrée considérée ou la rendre impropre à l’alimentation humaine (BOUMENDJEL ,2005). 14 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments 2.3.2. Techniques de conservation par froid Le traitement par le froid permet de ralentir, voire arrêter, la prolifération et l'action de micro-organismes, et de conserver l'aliment pendant une période plus ou moins longue (ANONYME-4, 1993). 2.4. Méthodes de conditionnement 2.4.1. Mise sous vide Appliquée depuis le début du XXème siècle pour la conservation des aliments en l'état, cette technique est devenue un procédé de cuisson et de conservation qui diffère de l'appertisation par la nature du conditionnement et la mise sous vide des aliments avant cuisson : Appertisation : boîte métallique sertie hermétiquement ; Cuisson sous-vide d'airpoche en plastique alimentaire thermorésistant, scellée hermétiquement après mise sous vide des aliments. (BOUMENDJEL ,2005). Après cuisson dans l'emballage et pasteurisation, les germes principaux sont détruits et la conservation au froid (entre 0°C. et + 4°C.) peut varier d'une semaine à un mois. La plus grande vigilance doit être observée car ce procédé, mal appliqué, ne détruit pas tous les germes et certains, parmi les plus dangereux, résistent bien à la chaleur et prolifèrent rapidement en absence d'air, La manière la plus astucieuse de conserver mieux et plus longtemps se base sur une simple constatation: une fois mis sous vide, autrement dit dans un espace sans air, les aliments se détériorent nettement plus lentement (BOUMENDJEL ,2005). 2.4.2. Conditionnement sous atmosphère modifiée Le conditionnement sous atmosphère modifiée CAM est une technologie d'emballage employée couramment en vue de conserver les produits alimentaires frais. Cette technologie est utilisée pour les viandes et les pates fraiches, les légumes, le pain, les fruits, et les fruits de mer (BOUMENDJEL ,2005). Dans un système de conditionnement sous atmosphère modifié, les gaz qui composent l'intérieur de l'emballage sont remplacés par un gaz unique ou un mélange gazeux. Dans le but d'accroitre la durée de conservation du produits. Le ratio d'oxygène, nitrogène, de dioxyde ou de monoxyde de carbone est modifié en fonction du produit alimentaire visé. La conservation on prolongée des produits et la réduction au niveau des pertes dues à la dégradation des aliments procurent des avantages économiques considérables à l'industrie de l'alimentation. La CAM a pour le but de remplacer l'air par des gaz, principalement l'azote et le dioxyde de carbone agit sur le produit et sur les germes (BOUMENDJEL ,2005). 15 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments 2.4.3. Emballage actif Est destinés à prolonger la durée de conservation et/ou à maintenir ou améliorer les conditions des aliments emballés. Ils sont conçus de façon à incorporer délibérément des constituants qui libèrent ou absorbent des substances dans les denrées alimentaires emballées ou dans l’environnement des denrées alimentaires (ANONYME -3 ,2000). 2.4.3.1. Emballages actifs et les agents antimicrobiens Afin de prévenir la contamination microbienne de produits alimentaires, des agents antimicrobiens peuvent être incorporés dans la masse lors de la formulation du produit ou appliqués en surface sur le produit fini (KIM et al., 2002). Ces deux types d’opérations ont une efficacité limitée car elles résultent en une perte rapide de l’activité antimicrobienne. Les emballages actifs antimicrobiens, qui consistent à incorporer l’agent antimicrobien dans l’emballage, constituent une option innovante. En effet, ils offrent une plus grande efficacité dans la protection de l’aliment car ils permettent une meilleure stabilité de l’agent antimicrobien, et assurent le contrôle de son relargage vers l’aliment dans le temps Les molécules antimicrobiennes généralement utilisées peuvent être des acides organiques, des enzymes, des agents chélateurs (PADGETT et al., 1998). Des huiles essentielles ou encore des bactériocines (JACQUET et al., 1998). La nisine est la seule bactériocine de bactéries lactiques, utilisée comme bio-ingrédient dans les aliments depuis 1988.Elle est reconnue par son efficacité vis-à-vis les listeria monocytogenes. L'efficacité de la nisine est dépendante de la qualité des aliments et est meilleure dans le cas où la charge des contaminants n'est pas élevée. La nisine a été utilisée pour la première fois dans un fromage de type Emmental pour empêcher le gonflement par Clostridium butyricum, et contre la contamination par Clostridium. botulinum des fromages pasteurisés à pâte fondue. Dans la viande l'utilisation de la nisine est limité en raison de la quantité importante de nisine requise pour avoir un effet notable sur la durée de vie du produit La faible solubilité, la distribution non homogène et le manque de stabilité des bactériocines à la surface des viandes ainsi que l'action des protéases des ferments utilisés ou de la viande peuvent affecter l'efficacité des bactériocines. 2.5. Nisine C'est un métabolite primaire. Elle a été découverte dans les années 1920. Elle est produite par lactococcus lactis spp lactis. En 1988, elle a été reconnue par la Food and Drug Administration et est utilisée en tant qu'agent de conservation(E234) dans l'industrie alimentaire (SEBTI et al., 2002). La nisine appartient à la classe Ӏ des bactériocines ou les lanthionines (KLAENHAMMER, 1993). 2.5.1. Bactéries lactiques productrices des bactériocines: La production des bactériocines est une propriété très courante chez les bactéries lactiques (BL), ces bactéries décrites pour la première fois par ORLA JENSEN au début du XXe siècle (FEDERIGHI, 2005). 16 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments En spécifique ; les films d’emballages antimicrobiens, concept innovant en emballage alimentaire, ont été introduits pour répondre à la demande des consommateurs pour une plus grande sécurité microbiologique (GUIGA, CHOLLET, GALLAND, PEYROL & SEBTI). 2.5.2. Généralité sur la bactérie productrice de la nisine: On peut définit ces microorganismes comme étant des bactéries à gram positive, asporulées généralement immobiles se présentant sous forme bacilles ou coques et capables de fermenter les sucres en acide lactique. Sont généralement mésophiles quelques genre sont thermotolérantes, ou psychrotolérantes elles se développent à pH 4-4.5, et certain sont actives à pH 9.6ou3.2 (DELLAGIO et al., 1994). La classification actuelle des bactéries lactiques fait apparaître 12 genres sont: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella. (MCLAUCHLIN et al., 2004). Les Lactococcus; font partie du groupe des bacteries lactiques, Cinq espèces composent ce genre ; garwiae, lactis, piscium, plantarum et rafinolactis. Celle qui nous intéresse particulièrement, de par son production de la nisine est l'espèce lactis.cet espèce est constituée de 2 sous espèces Lactococcus lactis subsp cemoris et Lactococcus lactis subsp lactis. Lactococcus lactis subsp lactis C'est une bactérie Gram positive, se trouve sous forme de coque à 0.5 μm diamètre aéro-anaérobie facultative elle disposée en chaine longue sa métabolisme est homofermentaire, sa température de croissance minimale est inferieur 10° C, optimal est environ 30°C à PH 9.6, et elle ne tolère pas plus de 6.6% de Nacl (DELLAGLIO, 1994). 2.5.2.1. Biosynthèse de la nisine Les gènes impliqué dans la biosynthèse sont organisées en clusters dans le locus est symbolisé par "lan" (ASADUZZMAN et SONOMOT, 2009).Le système génétique impliqués dans la production de la nisine est retrouvé sur les éléments tanspostable présent sur le chromosome trois classes de transponsons qui sont responsables la production de la nisine bien définit chez L.lactis.ssp .Le systéme génétique codant pour la nisine est la plus étudie, symbolisé par "nis" .Le peptide précurseur est inactif donc entre dans la protection des souches productrices par les gènes nisI et nisFEG (nisB, nisC) ces gènes codant la cyclase et la déshydratase; qui impliques les modification post traductionnel des peptides précurseur. Les gènes responsable de fixation du zinc, qui impliquée dans la formation des ponts thiol est (nisC). Il ya aussi des enzymes impliquées dans ces modifications. Les peptides précurseurs sont transportés dans le milieu extracellulaire via un transporteur (nisT) puis hydrolysée par une protéase (nisP) qui utilise l'énergie pour cette activité, La biosynthèse de la nisine influencée par déférentes facteurs tels que la température de milieu, pH, salinité (Fig.2) (MAKHLOUFI et al., 2011). 17 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments Figure 2: Schéma de biosynthèse, de sa régulation et d’immunité de la souche Productrice pour la nisine (MAKHLOUFI et al., 2011). 2.5.2.2. Structures de la nisine C'est un polypeptide de 3488Da de poids moléculaire. Thermostable, composé de 34 acide am inés. (Fig.3). 18 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments Figure 3 : structure de la nisine (MAKHLOUFI et al., 2011). Les molécules de la nisine peuvent s'assembler en dimères ou en oligomères de 7000 à14000 Da (KLAENHAMMER, 1993).Elle possède une structure linéaire chargée positivement (TWOMEY et al., 2002). La nisine A et Z ont la même spécificité de l'activité antimicrobienne, mais sont diffères par un acide aminé en position 27 (MC AULIFFE et al., 2001). 2.5.2.3. Spectre d'activité Parmi toutes les bactériocines, la nisine possède un spectre d’activité très large. Elle possède une action inhibitrice sur les bactéries à GRAM positif. (MEGHROUS et al., 1999). 2.5.2.4. Extraction et purification de la nisine L'extraction de la nisine se fait après une centrifugation d'une culture de la souche productrice dans un bouillon M17, le surnageant est récupère et purifiée par la suite (SIBOUKEUR et al., 2011). 2.5.2.5. Purification de la nisine L'activité de la bactériocine n'était pas adsorbée sur une résine de type échangeur cationique. Sur résine hydrophobe, cette activité était perdue. Il a toutefois été possible d'adsorber cette activité par chromatographie sur échangeur anionique. Cela a d'abord été réalisé à pression normale et ensuite à haute pression (par HPLC) cette méthode a été réalisée par LACHANCE et al., (2000). 2.6. Effet de la nisine dans les produits alimentaires conditionnés Quand la nisine est incorporée dans un emballage alimentaire, l’efficacité de la nisine comme agent antimicrobien dépend de plusieurs paramètres : pH, température, teneur en sel et en matière grasse de l’aliment (JUNG et al., 1992 ; DEAN et al., 1996). Ces paramètres conditionnent à la fois la solubilité de la nisine, sa bioactivité, sa stabilité, sa désorption et sa diffusion dans la matrice alimentaire. 19 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments Selon les références consultées, seulement quelques études ont abordé la diffusion de la nisine dans des matrices alimentaires (SEBTI et al., 2004 ; RIPOCHE et al., 2006), mais aucune ne s’est intéressée au phénomène de désorption de celle-ci sur des films d’emballage. Parmi ces travaux consultés utilisant la nisine pour la conservation des aliments on cite les travaux de : RICHARD, (1996) a constaté une différence considérable dans les estimations de la concentration minimal inhibitrice (CMI) selon la souche et surtout, selon le milieu de culture utilisé pour la déterminer. Selon cet auteur, si l'on prend en compte une production maximale de nisine de 2 000 UI/ml dans un milieu approprié et des conditions optimales de culture d'une souche de lactocoques productrice de nisine, la CMI pour la souche de Listeria la plus résistante ne peut être atteinte dans un aliment que par addition de la nisine purifiée ou d'une culture très concentrée de la souche productrice (TableauIV). Dans Une publication plus récente montre que la CMI de nisine vis-à-vis de L monocytogenes est considérablement plus faibles que dans le tableau précédent, soit de 8 à80 UI/ml. Ces divergences peuvent être attribuées aux conditions de détermination de la CMI, en particulier, au milieu de culture utilisé (HUGENHOLTZ et VEER, 1991 in RICHARD, 1996). Tableau IV : Variation de la sensibilité de quelques souches de Listeria à la nisine (HUGENHOLTZ et VEER, 1991 in RICHARD, 1996). GUIGA, CHOLLET, GALLAND, PEYROL, PANTIEZ et SEBTI s’intéressent à l’étude de l’étape de désorption de la nisine à partir d’un film de polyéthylène/polyamide/polyéthylène activé par une solution filmogène d’hydroxypropylméthylcellulose contenant de la nisine, tout en s’attachant à vérifier que cette activation ne modifie pas les propriétés initiales du film. Premièrement Ils ont préparés le film puis donner les caractéristiques de ce dernier,et finalement étudier la désorption de la nisine. Comme conclusion ce travail a permis de démontrer que les films activés par enduction d’une solution de HPMC/nisine présentent une activité antimicrobienne significative contre Micrococcus luteus. L’activation de ces films n’affecte ni leur résistance mécanique, ni leur sensibilité à l’eau, ni leur transparence. L’étude et la modélisation de la 20 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments désorption de la nisine a également permis de démontrer que le relargage de cette bactériocine à partir des films activés dépendait à la fois de la force ionique de la solution de désorption et de la température d’entreposage mais pas du pH. Cependant, pour mieux approcher les conditions d’applications alimentaires, le pouvoir inhibiteur des films devra être vérifié sur des souches pathogènes comme Listeria monocytogenes et validé sur des aliments liquides réels, ainsi que dans les vraies conditions de stockage de l’industrie agro-alimentaire. RICHARD, (1996) montre, comme exemple de cette démarche, l'activité de la nisine vis-à-vis d'une souche de Listeria ajoutée à de la viande fraîche hachée et conservée à basse température. Les concentrations indiquées sont celles de la phase interstitielle, c'est-à-dire de la solution de bactériocine en contact avec la surface de la viande avant hachage. On observe, par rapport au témoin sans nisine, une perte de viabilité des bactéries cibles qui se poursuit pendant 2 jours, suivie d'une croissance des cellules survivantes à la même vitesse que les bactéries dans la viande témoin. On notera que 1 000 nisine, soit deux fois la CMI de cette UI/ml de souche déterminée au laboratoire n'entraîne qu'une diminution modeste de la souche cible. Il faudrait plus de 5 000 UI/ml pour obtenir 3 unités de log de réduction de cette bactérie, soit une destruction de 99,9 % de la population initiale(Fig.4) (RICHARD, 1996). Figure 4:Inibition de L.innocua par la nisine dans la viande de porc hachée conservée à 6C° sur le milieu Palcam (RICHARD,1996). Dans les références consultées on remarque que l'utilisation de la nisine pour la conservation des aliments est généralement combinée avec d'autres substances. SEBTI et al. (2002) ont recherché l'effet combiné éventuel de la nisine et de deux bactériocines (la pédiocine et la curvaticine).L’effet des deux bactériocines sur les phases de latence de L. monocytogenes est présenté dans la figure 5. 21 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments Figure 5:Inhibition de L. monocytogenes en phase de latence, par addition à t = 0 des bactériocines seules ou en association nisine-curvaticine ou nisine-pédiocine (SEBTI et al. ,2002) Aux concentrations testées, les temps de latence après addition de bactériocines sont augmentés d’un facteur 4, 5 et 10 respectivement pour la pédiocine, la nisine, et pour la curvaticine. L’association des bactériocines permet quant à elle d’améliorer les temps d’inhibition d’un facteur 6 et 13 pour respectivement la nisine-pédiocine et la nisine curvaticine. La curvaticine apparaît être la plus efficace en terme d’amélioration des temps d’inhibition, avec un retard de l’ordre de 2 jours de la croissance bactérienne, lorsque la curvaticine est associée à la nisine. Selon cet auteur, en accord avec plusieurs études bibliographiques, l’association de bactériocines a toujours montré un effet de synergie qui améliore l’activité anti-bactérienne des bactériocines sur L. monocytogenes (HANLIN et al., 1993, KATLA et al., 2001). Pour la conservation des aliments notamment les viandes, d’autres travaux ont cité l’action de d’autre bactériocines. On cite le travail de : DJENANE et al., (2005) .ce chercheur et ces collaborateurs ont inoculé des steaks avec deux souches de bactéries lactiques (Lactobacillus sakei CTC 372 (bacteriocinogenique: Sakacine T) et Lactobacillus CTC 711 (non caracterisee). Les steaks ont été ensuite conditionnés sous atmosphère modifié. Les deux souches lactiques ont provoqué une inhibition de 67,3% sur L. monocytogenes cultivée dans un milieu 22 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments de culture à 25ºC. Probablement, les souches lactiques ont atteint une phase logarithmique maximum à cette température et, par conséquent, une production suffisante de bactériocine qui pourrait être la cause principale de l’inhibition de Listeria monocytogenes. Néanmoins, même à 3 et 8ºC l’inhibition de L. monocytogenes a été signifiante. Ce qui explique l'avantage que peuvent avoir ces deux souches dans la préservation des viandes réfrigérées, notamment en conditions d’entreposage à des températures abusives (BREDHOLT et al., 2001). 2.7. Mécanisme d’action de la nisine La perméabilisation de la membrane cytoplasmique par formation de pores conduit à la mort de la bactérie cible après dissipation d’ions intracellulaires. L’exemple de mécanisme d’action le mieux connu est celui de la nisine et de différents lantibiotiques de type A I (subtiline et épidermine) et de type A II (lacticine 481, nukacine -1) .Un premier contact est initié entre la nisine et la membrane cytoplasmique de la bactérie cible via des interactions électrostatiques (RUHR et SAHL, 1985). Chargée positivement, la région C terminale de la nisine interagit avec la membrane cytoplasmique de la bactérie cible fortement anionique. Les boucles formant la lanthionine et la 3’-méthyllanthionine situées au niveau de la région N-terminale interagissent avec le disaccharide-pyrophosphate du lipide II précurseur de la biosynthèse de la paroi bactérienne (fig.6) (ASADUZZAMAN et al., 2006). Figure 6: Formation des pores membranaires par le complexe nisine-lipide II selon CHATTERJEE et al., (2005). D'autre part l’inactivation d’une enzyme nécessaire à la biosynthèse de la paroi bactérienne. L.m est composée d’une paroi, en contact direct avec le milieu extérieur, formée 23 PARTIE II: Utilisation de la nisine dans le conditionnement des aliments de peptidoglycanes, d’un espace périplasmique et d’une membrane cytoplasmique. Le peptidoglycane est composé d’une partie glucidique formé d'un polymère d’unités disaccharidique d'acide N-acétylmuramique (MurNAc) lié en β à un résidu de Nacétylglucosamine (GlcNAc). Les polysaccharides sont liés entre eux au niveau du MurNac par des liaisons pentapeptidiques dont la séquence varie en fonction des bactéries (PRESCOTT et al., 2003). Chez L. m la séquence peptidique de ces chaînons est : L-Ala, D-Glu, L-Lys, D-Ala, D-Ala. Contrairement aux bactéries à Gram positif, le peptidoglycane chez les bactéries à Gram négatif est plus fin et enchâssé entre deux membranes plasmiques : la membrane externe composée de phospholipides, de nombreuses protéines intrinsèques, notamment les protéines de transport appelées porines, ainsi qu’un composé non protéique appelé lipopolysaccharide . Les bactéries à Gram négatif telles que Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Salmonella typhimurium et Serratia marcescens sont résistantes aux lantibiotiques et en particulier à la nisine Cette résistance a été attribuée à la membrane externe riche en lipopolysaccharide qui empêche les bactériocines d’accéder pentapeptide du lipide II présent dans la membrane cytoplasmique (CHATTERJEE et al., 2005) . 24 Conclusion Conclusion Un bioemballage est un emballage prolongeant la durée de vie des produits, ou donnant l'alarme en cas d'altération des denrées. C'est l'un des meilleures procédées de conservation des aliments. Il est utilisé pour assurer la sécurité et la qualité de ces denrées contre les germes pathogènes tels que L.m. Les substances antimicrobiennes naturelles incorporées dans cet emballage sont nombreux, parmi ces derniers, le lysozyme ou l’acide lactique ou des bactériocines notamment la nisine. Cette substance est utilisée depuis des années comme conservateur alimentaire dans plusieurs pays. Plus récemment autre bactériocines (la pédiocine) a également été commercialisée comme conservateur alimentaire, qui contrôle la contamination microbienne d’un aliment, améliore son stockage, élimine les pathogènes indésirables et retarde la prolifération de Listeria monocytogenes. L'étude portant sur la nisine est toujours en cours afin de mieux comprendre son structure et son mode d’action pour élargir leurs applications. 24 Références bibliographiques ANONYME-1.( 2005). Manuel terrestre de l’OIE, 1249-1261 ANONYME-2. (2002).Système d'alerte rapide pour les denrées alimentaires et Rapport sur l'alimentation. ANONNYME- 3. (2000) .Bulletin du réseau TPA:4-43. ANONYME-4. (1993). L'emballage PSE au service de la chaine de froid:5-15 ASADUZZAMAN. S.M., et SONOMOTO.K. (2009). Lantibiotics: diverse activities and unique mode of action. Journal of biosciences and bioengineering vol.p.475-487. AUGUSTIN J.C. (1999). Modélisation de la dynamique de croissance des populations de Listeria monocytogenes dans les aliments. Thèse de Doctorat, France BREDHOLT S., NESBAKKEN T., HOLCK, A, ( 2001). Industrial application of an antilisterial of Lactobacillus sakei as a protective culture and its effect on the sensory acceptability of cooked sliced, vacuum- packaged meats. Int. J. Food Microbiol.vol. 66p. 191-196. BRÉAND S., FARDEL G., FLANDROIS J.P., ROSSO L., TOMASSONE R. (1998). Model of the influence of time and mild temperature on Listeria monocytogenes nonlinear survival curves. Int. J. Food Microbiol. vol.40.p. 185-195 BOUMENDJEL ,(2005).Conservation des denrées alimentaires. Centre Universitaire d'El-Tarf. CHATTERJEE. P.K. (2006), Intracellular Gene Expression Profile of Listeria monocytogenes, Infection and Immunity.vol.74. p.1323-1338. CHEFTEL J.C., CULIOLI J. (1997). Effects of High pressure on meat: A review. Meat Sci.vol.46.p. 211-236. CHAE M.S., SCHRAFT H., HANSEN L.T., MACKERETH R. (2006). Effects of physicochemical surface charachteristics of Listeria monocytogenes strains on attachement to glass. Food Microbiol.vol.23.p. 250-259 CZUPRYNSKI CJ. (2003), infection, immunologie.vol.72p 489-97. DANIEL GRENIER, PH. D, (2004). Des bactériocines pour remplacer les antibiotiques. FACULTÉ DE MÉDECINE VÉTÉRINAIRE, UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL.Canada. DELLAGLIO F., DE ROISSART H., TORRIANI S., CURK M. C., JANSSENS D, (1994). Caractéristiques générales des bactéries lactiques. Dans Bactéries lactiques vol 1. LORICA Uriage.p.25- 116. DJENANE D., MARTÍNEZ L., BLANCO D., YANGÜELA J,. BELTRÁN J.A., RONCALÉS P. (2005). Effect of lactic bacteria on extention of shelf life and growth 25 Références bibliographiques of Listeria monocytogenes in beef steak stored in CO2 rich atmosphere. J. Microbiol.vol.36.p 405-412. DJENANE.D. (2005). Les perspectives naturelles pour la préservation de la viande. Campus Rev. vol.16.p.26-61. DJENANE D., MARTÍNEZ L., SÁNCHEZ A., MONTAÑÉS L., BLANCO D., YANGÜELA J, . BELTRÁN J.A., RONCALÉS P. (2006). Effect of lactic acid bacteria on beef steak microbial flora stored under modified atmosphere and on Listeria monocytogenes in broth cultures. Food Sci. Technol. Int.45-50. DJENANE D., MEDDAHI A., RONCALES P. (2006). Les systèmes antioxydants et antimicrobiens pour la conservation de la viande. Sci. Alim.vol. 26.p. 37-73. FARBER J.M., PETERKIN P.I. (1991). Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. J Microbiol. Rev.vol. 55.p. 476-511. FEDERIGHI.M. ( 2005), Bacteriologies alimentaire 2emeed.p.96-126. HENG N. C et TAGG J. R. (2006). what’s in a name? Class distinction for bacteriocins. Nature Reviews Microbiol.vol.4.p. 1-2. HOLZAPFEL, W. H., GEISEN, R., and SCHILLINGER, U. (1995). Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and foodgrade enzymes. International Journal of Food Microbiology.vol. 24.p. 343-362. JOHNSON J.L., DOYLE M.P., CASSENS R.G., SCHOENI J.L. (1988). Fate of Listeria monocytogenes in tissues of experimentally infected cattle and in hard salami. Appl. Environ. Microbiol.vol.54.p.497-501. JOSEPH- PIERRE GUIRAUD.JEAN-PHILIPPE ROSE, (2004) pratique des normes en microbiologie alimentaire.vol.2.p.181-198. KAHINA. MAYA. MAKHLOUFI. (2011) Caractérisation d’une bactériocine produite par une bactérie lactique Leuconostoc pseudomesenteroides isolée du boza. Thèse de doctorat. Ecole doctorale iViv. france. KLAENHAMMER T .R. Biochimie.vol.70.p. 337-349. (1988). Bacteriocins of lactic acid bacteria. KLAENHAMMER. T. R( 1993).. (1993). Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Reviews.vol.12.p. 39-86. LARPENT S. P. (1997). Microbiologie alimentaire. Techniques de laboratoire. Ed. Tech et Doc, Lavoisier, Paris. LINTON R.H., PIERSON M.D., BISHOP J.R. (1990). Increase in heat resistance of Listeria monocytogenes Scott A by sublethal heatshock. J. Food Prot.vol.53.p. 924927. 26 Références bibliographiques MARIANI.C. (2007) effet inhibiteur vis à vis de Listeria monocytogenes. Thèse de doctorat. Ecole doctorale : Agriculture, Alimentation, Biologie, Environnement et Santé.France. Martin Lachance. (2000). purification et cara~térisation d'une bactériocine produite par lactococcus lactis ssp. lactis mjc15.Mémoire. France. McLauchlin J, Hall SM, Velani SK, Gilbert RJ.(2004). Human listeriosis and pate: a possible association. Britanic Medical Journal.vol 303.p.773-775 MEGHROUS J., GOULHEN F., LACROIX C. (1999). Production of a nisin Z/pediocin mixture by pH-controlled mixed-strain batch cultures in supplemented whey permeates. J. Appl. Microbiol.vol.86.p. 399-406. NISSEN-MEYER J., HOLO H., HAVARSTEIN L. S., SLETTEN K. AND NES I. F. (1992). A Novel LactococcalBacteriocin Whose Activity Depends on the Complementary Action of Two Peptides. J. bacteriol., 174, vol.17. p5686 - 5692. NIETO-LOZANO J.C., REGUERA-USEROS J.I., PELÁEZ-MARTÍNEZ M.C., TORRE A.H. (2006). Effect of a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici against Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens on Spanish raw meat. Meat Sci.vol.72.p. 57-61. NOLAN D.A., CHAMBLIN, D.C., TROLLER J.A. (1992). Minimal water activity levels for growth and survival of Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Int. J. Food Microbiol.vol. 16.p. 323-335. OSTERHOLM M.T., POTTER M.E. (1997). Irradiation pasteurisation of solid foods: taking food safety to the next level. Emerg. Infect. Dis.vol.3.p.575-577. PERSCOTT, L., HARLEY, J., and Klein, D. (2003) Le métabolisme: la libération et la conservation de l'énergie. In: Boeck, d., and Larcier (Eds). Microbiologie. Bruxelles, Belgium. P.172-203. PERNI S., JORDAN S.J., ANDREW P.W., SHAMA G. (2005). Biofilm development by Listeria innocua in turbulent flow regimes. Food Control PAGAN R., CONDON S., SALA F.J. (1997). Effects of several factors on the heatshock-induced thermotolerance of Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol.vol.63.p.3225-3232. RUHER, and SAHL, H. G. (1985) Mode of action of the peptide antibiotic nisin and influence on the membrane potential of whole cells and on cytoplasmic and artificial membrane vesicles. Antimicrob Agents Chemother.vol.27.p. 841-845. RYSER et MARTH, (1999). Listeria, listeriosis and food safety. 2eme Ed, New-York NY: Marcel Dekker. 27 Références bibliographiques SAHL, H. G, et Bierbaum, G. (1998) Lantibiotics: biosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from gram-positive bacteria. Annu Rev Microbiol.vol.52.p.41-79. SEELIGER H.P.R., JONES D. (1986). Genus Listeria Pirie 1940, 383AL. In : Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe and J.H. Holt, Williams & Wilkins, Baltimore.vol.2.p.1235-1245. SEBTI I. (2002). Bio-emballage actif incorporant la nisine, diffusion de cette bactériocine en gel d’agarose. Thèse de doctorat . l’université bordeaux i. France. SIBOUKEUR.A. (2011). Etude de l’activité antibactérienne des bactériocines (type nisine) produites par Lactococcuslactissubsplactis, isolée à partir du lait camelin. Mémoire de magister.Université Kasdi Merbeh.Ouargla. TAGG JR., DAJANI AS., WANNAMAKER LW. (1976). Bacteriocins of Grampositive bacteria. Microbiol Rev.vol.40.p. 722-756. Twomey, D., Ross, R. P., Ryan, M., Meaney, B., and Hill, C. (2002) Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications. Antonie Van Leeuwenhoek.vol.82.p.165-185. VIDEAU, (1987). Prévention et contrôle des listérioses Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1987.vol.6 (3).p.809-813. WAFA G, E CHOLLETS GALLAND, E PEYRLl, A. C. PANTIEZ & I. SEBTI. Films plastiques antimicrobiens : caractérisation et modélisation de la désorption de la nisine. IUT A – Université Claude Bernard Lyon 1.France. 28 RESUME Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène responsable de la listériose; C’est un micro organisme très fréquent rencontré dans notre environnement et aussi dans nos aliments. C’est pour cela que l’industrie agroalimentaire utilise plusieurs méthodes de conditionnement afin de conserver les produits alimentaires de l'altération par des micro- organismes pathogènes notamment L.m. Parmi ces méthodes de conservation on trouve le conditionnement par bio-emballage ou bien l’emballage actif. Dans ce procédé, on utilise un emballage associé à des molécules antimicrobiennes excrétées par des bactéries lactiques. Parmi ces substances antimicrobiennes on trouve, les acides organiques et les bactériocines notamment la nisine produite par une bactérie lactique appartenant à l'espèce Lactococcus lactis .Cette bactériocine est utilisée pour constituer la biopréservation (bioprotection) des aliments contre L.m. MOTS CLES: Listeria monocytogenes , conditionnement , bio-emballage, bactériocines, Lactococcus lactis, nisine. Abstract Listeria monocytogenes is a pathogenic bacterium responsible for listeriosis; this is a very common microorganism found in our environment and also in our foods. This is why the food industry uses several methods of packaging to keep food from spoilage by micro-organisms including L.m. Among these conservation methods found conditioning bio-packaging or active packaging. In this method, a package associated with antimicrobial molecules excreted by lactic acid bacteria is used. Among these there are antimicrobial substances, organic acids and (bacteriocins) such as (nisin) produced by a lactic acid bacteria belonging to the species Lactococcus lactis. This bacteriocine is used to form the biopreservation (bioprotection) of foods against L.m. KEYWORDS: Listeria monocytogenes, packaging, bio-packaging, bacteriocins, Lactococcus lactis, nisin. ممخص من أهم األنواع البكترية المجهرية المسببة لألمراض والمسؤولةListeria monocytogenes تعتبر المستوحدات اللستيرية . و التي تتواجد بشكل واسع في المحيط و خاصة في األغذيةListériose عن داء المستريات ولهذا يستخدم في الصناعات الغذائية العديد من أساليب التعبئة و التغميف لمحفاظ عمى المواد الغذائية من التمف الناتج عن و.bioemballege اوالتغميف الحيويbioemballage actif .هذه الكائنات الدقيقة ومن بين هذه الطرق المستعممة ; التغميف الحيوي النشط المرتبط بإضافة جزيئات مضادة لمميكروبات و المفرزة عن طريق البكتريا الالكتيكية والتي من بينها االحماض العضوية و Lactococcus ( و المنتجة من طرف البكتريا الالكتيكيةNisine ( ) نوع نيزينbactériocines) المضادات الميكروبية .Listeria monocytogenes والذي يستعمل في الحماية البيولوجية لالغذية و خاصة ضدlactis ssp Lactococcus ، المضاد الميكروبي، التغميف الحيوي النشط، التعبئة، Listeria monocytogenes: الكممات المفتاحية .النيزين،lactis
