Introduction - Institut des Métaux en Biologie de Grenoble

Biocatalyse
M2 BOBI 2008-2009
Plan du cours
zIntroduction à la biocatalyse
zCatalyse acide/base (protéines à Zinc)
zRéactivité de O2 en (bio)catalyse
zFixation de O2 (protéines à Fer et Cuivre)
zActivité « oxygénase » des protéines à Fer
zActivité « oxydase » et « oxygénase » des
protéines à Fer et Cuivre
Introduction à la Biocatalyse
II.
I.
Introduction
Pré-organisation des enzymes
III. III. Métaux et biocatalyse
I. Introduction
Energie
Etat de transition
z + faible, +
réaction facile
z Quand < énergie
Energie
d’activation
thermique à une
température
donnée, réaction
spontanée
ΔrG°
Coordonnée de réaction
Un catalyseur va …
zÊtre non consommé
zRendre possible une réaction:
{Oxydation du méthane en méthanol par la
Méthane Monooxygénase
zAccélèrer une réaction:
{Hydrolyse d’amides: k = 0.01 s-1 sans enzyme,
1000000 s-1 avec Carboxypeptidase
Comment ?
Energie
Etat de transition
Etat de transition
Energie
d’activation
ΔrG°
Coordonnée de réaction
Rouge: Réaction catalysée
zDiminue l’énergie
d’activation
zRevient à
stabiliser l’état de
transition
Catalyse par des enzymes
z Pré-organisation du site actif: plus
complémentaire avec l’état de transition qu’avec
le substrat initial
‡
Energie
Etat de transition
Site actif
Coordonnée de réaction
Pour une catalyse efficace
Forte affinité
Substrat
Très complémentaire
Etat de transition
Faible affinité
Produit
Æ Structure tridimensionnelle des enzymes
II. Préorganisation des enzymes
(protéines)
z Amino-acides connectés par des liens amides
z Résidus R vont jouer un rôle primordial dans:
{Solubilité, interactions entre biomolécules (Balance
hydrophile / lipophile)
{Stabilité de la structure, fixation du substrat
(Liaisons H ou hydrophobe, ponts S-S)
{Catalyse acide / base
{Coordination de métaux
Structure des protéines
z Primaire: séquence d’acides aminés
z Secondaire: repliement de régions de protéines
• Hélices α:
Ala, Glu, Leu, Met, Pro, Gly,
Tyr, Ser
Structure des protéines
z Secondaire: repliement de régions de protéines
• Feuillets β:
Val, Leu, Ile, Trp, Tyr, Thr, Phe
Structure des protéines
z Structure tertiaire: forme de la protéine entière
z Structure quaternaire: Résulte de l’interaction entre
plusieurs sous-unités. Responsable de l’allostérie
de l’hémoglobine par ex.
Ex de structure quaternaire
Assemblage permettant l’allostérie
Site actif
z Là où la réaction catalytique a lieu
z Domaine très restreint de la protéine
Site actif: réaction catalytique
Enveloppe protéique: Stabilité,
régulation, allostérie, fixation de
cofacteurs, interaction avec
d’autres biomolécules
III. Métaux et biocatalyse
zAcidité de Lewis: Facilitent les réactions
acide-base
zMultiples degrés rédox accessibles:
Facilitent les réactions rédox
zActivation par coordination: Facilitent le
transfert d’atomes ou de groupements
Métaux omniprésents car la plupart des grandes
réactions biochimiques peuvent être facilitées !!!
Concentration en métaux au niveau
cellulaire
z Nb atome / Cellule
z Concentration
(E. Coli)
LogC
Log
-1
8
Milieu de culture
-2
6
-3
4
-4
2
0
Cellule
-5
Mg K Fe Zn Ca V,Cr,Mn,Co,
Ni,Cu,As,Se,
Mo
-6
Mg,K Ca
Fe,Zn Cu,V,Cr,Mn,
Co,Ni,Cu,As,
Se,Mo
Rôles biochimiques des métaux:
z Structure (protéines, ADN, os): Ca, Zn, Mg
z Transfert d’information, maintien de pression
osmotique: Na, K, Ca
z Catalyse acide-base: Zn, Mg
z Transfert d’électrons: Fe, Cu, Mn, Mo, W, V, Co,
Ni
z Transport d’O2 (Fe, Cu) et fixation de N2 (Fe,
Mo, V)
Rôles biochimiques des métaux:
z Structure (protéines, ADN, os): Ca, Zn, Mg
z Transfert d’information, maintien de pression
osmotique: Na, K, Ca
z Catalyse acide-base: Zn, Mg
z Transfert d’électrons: Fe, Cu, Mn, Mo, W, V, Co,
Ni
z Transport d’O2 (Fe, Cu) et fixation de N2 (Fe,
Mo, V)
La nature a sélectionné des métaux:
zAbondants
{Sinon coût énergétique
Abondance dans la croûte terrestre:
z Si: 2.8x105
z Fe: 5x104
z Ca: 3.6x104
z Na: 2.8x104
z K: 2.6x104
z Mg: 2.1x104
z Mn: 950
z V: 135
z Cr: 100
z Ni: 75
z Zn: 70
z Cu: 55
z Co: 25
LogC
Cellule
-1
-2
-3
-4
-5
-6
Rem: Soulignés = métaux rédox actifs en bio
Mg,K Ca
Fe,Zn Cu,V,Cr,Mn,
Co,Ni,Cu,As,
Se,Mo
La nature a sélectionné des métaux
zAbondants
{Sinon coût énergétique
zPlutôt labiles (Cr rare en bio)
{Réactions facilitées au niveau des sites actifs
de métalloprotéines
zDont les complexes sont stables
thermodynamiquement
{Stabilité des biomolécules
Métaux les plus « universels » en
biocatalyse: Fer et Cuivre
Fonction
Transport d’O2
Oxygénation
Oxydase
Transfert d’électrons
Antioxydant
Réduction de nitrites
Fer
Hémoglobine
Cytochrome P450
Catéchol dioxygénase
Hème peroxydase
Peroxydase
Cytochrome
Peroxydase
Cytc nitrite réductase
Cuivre
Hémocyanine
Tyrosinase
Amine oxydase
Galactose oxydase
protéine « blue copper »
Superoxyde dismutase
Cu nitrite réductase
Protéines à Fe et Cu ayant même fonction: Théorie de l’évolution
Æ Adaptation du vivant à la présence d’oxygène: Fe2+ s’oxyde en Fe3+ qui
précipite et devient indisponible pour le vivant. Cu+ toxique s’oxyde en Cu2+
qui va être utilisé à la place du fer.
Propriétés générales des métaux
a- Acidité de Lewis
zComportement des ions métalliques dans
l’eau:
{H2O: base de Lewis Æ Formation de complexes
aquo M(H2O)nz+
{Effet du métal (acide de Lewis): Acidité des
molécules d’eau coordinées augmente
Ex: pKa Fe(H2O)63+ / Fe(H2O)5(OH)2+ = 2 !!
{Acidité augmente qd z augmente et r diminue
b- Propriétés rédox
En violet:
Degrés d’oxydation
courants en biologie
Effet de ligand sur le potentiel d’oxydation
z Chargé négativement: Stabilise haut degré
d’oxydation
z σ-donneur: Stabilise haut degré d’oxydation
z π-accepteur: Stabilise bas degré d’oxydation
z Effet stérique !
Effet des ligands sur le potentiel
d’oxydation
zE° (Fe(H2O)63+ / Fe(H2O)62+) = 0.77 V
zE° (Fe(CN)63- / Fe(CN)64-) = 0.36 V
zExplication:
CN- est un meilleur ligand que H2O pour Fe3+
Degré +III du complexe favorisé
Plus grand domaine de prédominance
FeII
FeIII
FeII
FeIII
E
H2O
E
CN-
Potentiels de métalloenzymes à Fe ou Cu
catalysant des réactions rédox
Æ En fonction du ligand tous les potentiels sont accessibles !!!
c- Sites actifs de métalloenzymes
z Le squelette protéique défini une sphère de
coordination autour du métal
z Normalement un métal bien défini se fixe
z Effet de la seconde sphère de coordination
souvent non négligeable
Première sphère: coordination
directe (en rose)
Deuxième sphère: acides
aminés dans les feuillets b
adjacents
Quel ligand pour quel métal ? Æ Théorie
HSAB
Hard
Cation
Ligand
Soft
Liaison: dur-dur Æ Caractère ionique
mou-mou Æ Caractère covalent
d. Classes de ligands biologiques
zAmino-acides
zADN (phosphates)
zSucres (hydroxyles)
zCofacteurs, groupements prosthétiques
(porphyrines …)
zAgrégats (ferritine)
d. Classes de ligands biologiques
zAmino-acides
zADN (phosphates)
zSucres (hydroxyles)
zCofacteurs, groupements prosthétiques
(porphyrines …)
zAgrégats (ferritine)
d.1 Amino-acides
zCoordination par les chaines latérales
Dur
pKa
O
H2N CHC OH H2N
CH2
C O
OH
3.6
O
CHC OH
CH2
CH2
C O
OH
O
O
O
O
H2N CHC OH H2N CHC OH H2N CHC OH H2N CHC OH H2N
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
SH
N
CH2
8.4
NH
CH2
4.3
NH2
OH
6.0
10.2
Hard
Soft
Cation
10.8
Ligand
O
CHC OH
CH2
CH2
S
CH3
Mou
d.1 Amino-acides
z Cas particulier des oligopeptides: Complexation
par les N- d’amides déprotonés ou les
carbonyles d’amides.
{Mode de coordination observé uniquement lorsque la
biomolécule est flexible
{Rarement observé lorsque la protéine présente une
structure tertiaire ou quaternaire
d.2 Groupements prosthétiques
Définition: groupe ou ligand fixant le métal et qui
peut être enlevé (intact) de la protéine
z Le plus couramment rencontré: Hème
z Structure dérivée du tétrapyrrole
z Métaux: essentiellement Fe (hémoglobine) et Mg
(chlorophylle)
NH
N
N
HN
Cys
S
S Cys
OOC
NH
N
N
HN
HO
COO
Protoporphyrine IX
Hémoglobine
NH
N
N
HN
OOC
NH
N
N
HN
COO
O
COO
OOC
Hème a
Hème c
(lié de manière covalente
≠ prosthétique)
Cytochrome Oxydase
Cytochrome c
Porphyrines
Ion
Rayon ionique (pm)
Adéquation en tant que centre
métallique dans les tétrapyrrole
Réactivité des protéines à fer héminique
(les plus courantes)
Réactivité dictée par:
z L’environnement
protéique (ionisation)
z Le type d’hème
z Le métal, son degré
rédox, son spin
Fixation de la porphyrine à la protéine
NH
N
OOC
N
Ferrochelatase
+
HN
Fe2+,
COO
Protoporphyrine IX
-2
N
N
Fe
H+
N
N
His de l’hémoglobine
COO
OOC
Hème
Nécessite que la porphyrine soit métallée
d.3 Autres modes de coordination (moins
intéressants en catalyse)
z Coordination avec des sucres:
z ADN:
z Cœur minéral