29/10/2014 Crévits Léna L2 Génétique médicale Dr Martin

GENETIQUE MEDICALE - Principe des études moléculaires
en Génétique Médicale,
Méthodes d’analyse des microlésions du Génome
29/10/2014
Crévits Léna L2
Génétique médicale
Dr Martin Krahn
14 pages
Principe des études moléculaires en Génétique Médicale - Méthodes d’analyse des microlésions du
Génome
A. Rappels et généralités
Introduction
L’intérêt médical des études moléculaires en génétique médicale est la mise en évidence
d'anomalies génétiques causales, à l'origine de maladies génétiques monofactorielles, et à
effet modificateur (qui correspondent à des « prédispositions génétiques ») , à l'origine de
maladies diverses: cancer, maladies cardio-vasculaires, maladies métaboliques...
L'analyse simultanée de tous les gènes d'un individu est impossible en routine à ce jour: il
faut donc choisir les techniques à utiliser en fonction de l'anomalie génétique recherchée.
Toutefois l'apparition de nouvelles technologies tend à rendre cela possible.
Démarche diagnostique dans les maladies génétiques
La consultation diagnostique se compose d'un interrogatoire et d'un examen clinique
durant lesquels doivent être déterminés l'histoire de la maladie ainsi que l'arbre
généalogique et le mode de transmission de cette maladie. Un examen clinique ciblé
ainsi qu'un examen clinique général doivent également être réalisés.
Des examens complémentaires peuvent également être menés: analyses biologiques selon
le contexte, imagerie, examens ciblés selon orientation...
Le but étant d'arriver à un diagnostic clinique.
Des analyses génétiques ( en cytogénétique et génétique moléculaire ) permettront d'arriver
à un diagnostic génétique.
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Plan
A. Rappels et généralités
B. Techniques courantes d’analyse de microlésions du génome
I. Notion de diagnostic direct et indirect
II. PCR
III. Séquençage direct
IV. Microarrays
V. Techniques d'étude de l'expression des gènes
C. La nouvelle ère de la génétique moléculaire
I. Principe et enjeux du Séquençage à Haut Débit

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Méthodes d’analyse des microlésions du Génome
Matériel d'étude : types d'échantillons
cDNA: séquence d'ADN complémentaire à un ARN messager, obtenue par transcription
inverse (technique de RT-PCR) à l'aide d'une enzyme, la « reverse transcriptase » ou
« transcriptase inverse » .
Le génome est en principe identique pour toutes les cellules d'un individu.
Le transcriptome et le protéome sont ubiquitaires ou spécifiques d'un tissus, d'un type
cellulaire, d'un état...
En ce qui concerne le génome et le transcriptome, le prélèvement de « base » en
génétique est le prélèvement sanguin périphérique. Celui-ci doit toujours être fait avec le
consentement de l'individu. D'autres prélèvements peuvent également être réalisés:
prélèvement de tissus embryonnaires/foetaux pour un diagnostic prénatal, prélèvement
d'autres tissus pour des analyses complémentaires dans certaines pathologies.
Grâce au prélèvement sanguin périphérique: obtention de chromosomes, ADN,
ARNmessager, cDNA.
B. Techniques courantes d'analyse de microlésions du génome
I.Notion de diagnostic direct et indirect
Diagnostic moléculaire des maladies génétiques
L'objectif est d'établir un diagnostic précis par l'identification de l'anomalie génétique.
L'intérêt est d'obtenir un diagnostic certain, de pouvoir fournir une prise en charge adaptée
ainsi que des conseils génétiques.
Pour un patient atteint, les analyses en génétique moléculaire par un diagnostic direct
permet l'identification de mutations dans le gène impliqué.
Pour un patient atteint, les analyses en génétique moléculaire par un diagnostic indirect
permet d'établir la congrégation familiale phénotype/ marqueur.
Le diagnostic direct consiste en la recherche de l'anomalie génétique primaire.
Celui-ci permet l'identification de mutations constitutionnelles délétères. Cette approche est
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utilisée de préférence et permet un diagnostic de certitude mais pose certains problèmes
dont les principaux sont que celle-ci est parfois lourde sur le plan technique (difficulté à
étudier les gènes de grande taille), parfois non concluante, et il faut également savoir
différencier les polymorphismes des mutations constitutionnelles délétères. De plus, dans le
cas du diagnostic prénatal, la contrainte de temps ajoute une difficulté supplémentaire.
Génétique moléculaire
L'objectif en génétique moléculaire est l'identification d'anomalies à l'échelle du gène.
Les mutations à l’échelle du gène peuvent être: la substitution d' un nucléotide
(principalement), l'insertion ou délétion de un à quelques nucléotides, l'insertion ou délétion
de quelques dizaines ou centaines de nucléotides.
Rappel: L'information génétique est contenue dans les exons qui sont les «séquences
codantes»
Comme la majorité des mutations pathogènes est localisée en séquence codante, l'analyse
se porte préférentiellement sur les exons (un exon comporte environ 150 pb ( 100 à 200 pb)
et les séquences codantes représentent 2 à 3 % de l'ADN).
Toutefois, le fait de se focaliser sur les exons induit le risque de ne pas détecter une
mutation qui se trouverai sur un intron (la taille des introns est variable, cela va jusqu'à des
milliers de pb). En outre, il est difficile de savoir si une mutation est délétère ou non en
région non codante avec les techniques actuelles. Quelques introns sont tout de même
étudiés en raison du phénomène d'épissage.
II.PCR
Lorsqu'on cherche à identifier une anomalie génétique, les études aux niveaux
moléculaires posent un problème: les faibles quantités de matériel. Les solutions à ce
problème peuvent être soit de travailler sur de plus grandes quantités de prélèvement, soit
l'amplification de la région d'intérêt.
La PCR ou polymerase chain reaction est une technique permettant d'amplifier en grande
quantité une région d'intérêt. Celle-ci est basée sur l'utilisation de courts fragments d'ADN
synthétiques (les amorces) complémentaires à la séquence d'intérêt (appariement) et d'une
enzyme ADN polymerase (Taq) qui permet d'amplifier/copier de manière fidèle un ADN
cible à partir de régions doubles brins (zones d'appariements ADN cible-amorces).
Ces amorces ou « primers » sont composées d'une vingtaine de nucléotides seulement pour
garantir leur fixation sur la région voulue. La précisons de l'endroit amplifié est donc
déterminée par les amorces.
Cette technique développée depuis les années 70 est à la base de l'analyse, de la détection
de pathogènes. Des PCR spécifiques sont utilisées en microbiologie pour étudier certains
virus ou bactéries.
La technique étant très sensible, il est important d'éviter les contaminations.
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A) L'étape de dénaturation (séparation des deux brins d'ADN) s'effectue à température
élevée.
B) Pour permettre l'hybridation des amorces, la température est diminuée.
C) L'élongation par la Taq polymérase s'effectue à température un peu plus haute, idéale
pour cette enzyme. Taq polymérase est donc thermosensible.
Les thermocycleurs permettent ces grandes variations de température.
Cette technique se compose d'une répétition d'environ 30 cycles: il y a donc une
amplification exponentielle de la région d'intérêt. La séquence étant doublée à chaque
cycle, si l'on effectue a cycles on obtient 2ª copies.
L'analyse de la région d'intérêt amplifiée comprend l'analyse de la séquence principalement
(recherche de mutations dans la région d'intérêt ) et l'analyse de la taille qui a des
applications diverses (analyse de microsatellites...). L'analyse de la taille sera vue en ED.
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III. Séquençage direct
Le séquençage direct est basé sur la méthode de Sanger qui utilise des ddNTP,
analogues structuraux des dNTP mais incapables de réaliser une liaison phosphodiester.
Cette méthode consiste en l'incorporation au hasard de ddNTP marqués (au fluorochrome
rouge, bleu, vert ou jaune) qui stoppent à chaque fois l'élongation.
Cette méthode est similaire à la PCR car elle utilise les mêmes constituants lors de la
réaction (matrice, amorce, ADN polymérase, dNTP...). (La matrice est la région que l'on
veut amplifier).
Etapes du séquençage direct:
Il y a tout d'abord une réaction d'élongation avec incorporation de ddNTP fixés à des
fluorochromes qui entraînent l'arrêt de celle-ci. Il y a donc production de fragments
amplifiés de toutes les tailles, se terminant tous par un ddNTP. Ces fragments sont ensuite
séparés par électrophorèse capillaire (dans le capillaire les fragments migrent plus ou
moins rapidement en fonction de leur taille, les petits migrant plus rapidement), et la lecture
de ceux-ci par un système laser permet l'obtention de pics de fluorescence (établissement
d'une information couleur qui correspond à la séquence). Enfin le traitement informatique
de ces résultats permet la reconstitution de la séquence.
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