4 matériels et méthodes - Université de Sherbrooke

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Université de Sherbrooke
Caractérisation de variants du récepteur des cystéinyl leucotriènes de type 1, CysLT1-
G300S et CysLT1-I206S
Par
Louiza Yaddaden
Programme d’immunologie
Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé
en vue de l’obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.)
en immunologie
Sherbrooke, Québec, Canada
Juillet 2015
Membres du jury d’évaluation
Dr. Jana Stankova, Immunologie
Dr. Marek Rola-Pleszczynski, Immunologie
Dr. Denis Gris, Immunologie
Dr. Jean-Luc Parent, Pharmacologie
© Louiza Yaddaden, 2015

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1RÉSUMÉ
Caractérisation de variants du récepteur des cystéinyl leucotriènes de type 1, CysLT1-
G300S et CysLT1-I206S
Par
Louiza Yaddaden
Programme d’Immunologie
Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention
du diplôme de maître ès sciences (M.Sc.) en Immunologie, Faculté de médecine et des
sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4
Les cystéinyl-leucotriènes (cysLTs) sont des médiateurs lipidiques pro-inflammatoires
impliqués dans l'asthme, liant trois récepteurs couplés aux protéines G: CysLT1, CysLT2 et
GPR99. Des polymorphismes de deux de ces récepteurs, CysLT1-G300S et CysLT2-M201V,
ont été fortement associés à l’atopie, une prédisposition aux allergies, alors que le
polymorphisme CysLT1-I206S n’y est pas significativement associé. Il a été montré
précédemment que le variant CysLT2-M201V avait une signalisation diminuée. L'objectif du
projet était d'étudier la signalisation cellulaire des variants CysLT1-G300S et CysLT1-I206S,
ainsi que l’interaction du variant CysLT1-G300S avec le récepteur CysLT2-M201V.
La lignée cellulaire HEK-293 a été transfectée avec les ADNs plasmidiques codant pour
des récepteurs de type sauvage et mutants. L’expression de surface des récepteurs a été
vérifiée par cytométrie en flux. La production d’inositol phosphates (IPs) et la transactivation
des promoteurs de l’IL-8 et de l’IL-13 ont été mesurées par essai IP-1 et essai luciférase,
respectivement, en réponse au LTD4 et LTC4. Ensuite, la phosphorylation de principaux
effecteurs de signalisation (Erk1/2, p65, p38 et c-Jun) suite à l’activation des récepteurs par
le LTD4, a été évaluée par immunobuvardage Western. Enfin, l’interaction entre les
récepteurs a été étudiée par des expériences de BRET (Bioluminescence Resonance Energy
Transfer) et BiFC (Bimolecular Fluorescent Complementation), en plus d’expériences de
type fonctionnel en co-expression.
L’expression de surface des récepteurs mutants et de type sauvage est équivalente. Le
variant CysLT1-G300S induit une plus forte production d’IPs et une plus grande
transactivation des promoteurs de l’IL-8 et de l'IL-13 que le récepteur de type sauvage. De
plus, la phosphorylation de Erk1/2 est également augmentée par l’activation de ce variant.
Par contre, le récepteur CysLT1-I206S ne montre pas de différence significative dans sa
transduction de signal. La co-expression des récepteurs CysLT1-G300S et CysLT2-M201V
n’affecte pas leur expression de surface, mais résulte en une faible transactivation du
promoteur de l’IL-8 et une production réduite d’IPs en réponse au LTD4. Enfin, les récepteurs
ont la capacité d’interagir et de dimériser entre eux.
En conclusion, ces résultats suggèrent que le variant CysLT1-G300S induit une plus forte
réponse que le récepteur de type sauvage. Cependant, bien qu’il puisse dimériser et interagir
avec le variant CysLT2-M201V, ce dernier domine la réponse combinée lorsqu’il est co-
exprimé avec le variant CysLT1-G300S.
Mots clés : Cystéinyl-leucotriène, variant, atopie, CysLT1, signalisation, CysLT2,
interaction.

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2TABLE DES MATIERES
1 Résumé ............................................................................................................................... ii
2 Table des matières ........................................................................................................... iii
3 Liste des figures ................................................................................................................. iv
4 Liste des tableaux ............................................................................................................... v
5 Liste des abréviations ....................................................................................................... vi
1 Introduction ........................................................................................................................ 8
1. Les médiateurs lipidiques .................................................................................................... 8
2. Les cystéinyl-leucotriènes .................................................................................................. 11
2.1. Synthèse et métabolisme ............................................................................................. 11
2.2. Implication en physiopathologie ................................................................................. 13
2.2.1. Asthme, rhinite allergique et atopie ..................................................................................... 13
2.2.2. Autres pathologies ................................................................................................................ 14
3. Les Récepteurs des cystéinyl-leucotriènes: CysLT1 et CysLT2 ...................................... 15
3.1. Structure ...................................................................................................................... 16
3.2. Expression et régulation .............................................................................................. 18
3.3. Agonistes et antagonistes ............................................................................................ 20
4. Signalisation cellulaire des récepteurs CysLT1 et CysLT2 ............................................. 23
4.1. Induction de cytokines................................................................................................. 23
4.2. Activation de récepteurs .............................................................................................. 24
4.3. Voies de signalisation impliquées ............................................................................... 25
4.4. Internalisation et désensibilisation .............................................................................. 28
4.5. Dimérisation des récepteurs ........................................................................................ 30
5. Polymorphismes des récepteurs et atopie ........................................................................ 31
5.1. Polymorphismes du récepteur CysLT1 ........................................................................ 32
5.2. Polymorphismes du récepteur CysLT2 ........................................................................ 34
2 Hypothèse et objectifs ...................................................................................................... 37
3 Matériels et Méthodes ..................................................................................................... 65
4 Article ................................................................................................................................ 40
5 Résultats ............................................................................................................................ 42
6 Discussion ......................................................................................................................... 81
7 Conclusion ........................................................................................................................ 94
8 Remerciements ................................................................................................................. 96
9 Liste des références .......................................................................................................... 97

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3LISTE DES FIGURES
Figure 1. Cascade de l'acide arachidonique. ......................................................................... 10
Figure 2. Synthèse des cystéinyl-leucotriènes. .................................................................... 12
Figure 3. Structure schématique des récepteurs CysLT1 et CysLT2. .................................... 17
Figure 4. Schéma simplifié des principales voies de signalisation des récepteurs CysLT1 et
CysLT2. ......................................................................................................................... 27
Figure 5. Polymorphismes du récepteur CysLT1. ................................................................. 34
Figure 6. Polymorphismes du récepteur CysLT2. ................................................................. 36
Figure 7. Schématisation de l’hypothèse de recherche. ........................................................ 39
Figure 8. Expression de surface de récepteurs chez des cellules HEK-293. ........................ 71
Figure 9. Dimérisation des récepteurs CysLT1 et CysLT2 étudiée par BiFC ....................... 75
Figure 10. Dimérisation des récepteurs CysLT1 et CysLT2 étudiée par BRET .................... 76
Figure 11. Production d’inositol phosphates. ....................................................................... 78
Figure 12. Transactivation du promoteur de l’IL-8. ............................................................. 80
Figure 13. Prédiction des sites de phosphorylation du récepteur CysLT1 et ses variants. .... 83
Figure 14. Sites de liaison de facteurs de transcription sur le promoteur de l’IL-13. ........... 86
Article
Fig. 1. Cell surface expression of CysLT1 receptors on HEK293 cells. .............................. 48
Fig. 2. Inositol phosphate production in CysLT1-transfected cells. ..................................... 49
Fig. 3. MAPKinases and NF-κB pathway effector phosphorylation in response to LTD4. .. 52
Fig. 4. IL-8 promoter activity in CysLT1-transfected HEK293 cells. ................................. 53
Fig. 5. IL-13 promoter transactivation in CysLT1-transfected HEK293 cells. .................... 54
Fig. 6. Binding of LTD4 to the CysLT1-WT receptor and its variants in transiently transfected
HEK293 cells. ............................................................................................................... 55