File - L2 Bichat 2012-2013

UE1 Biochimie – Biologie moléculaire
Pr De Thé
Le 01/10/2012, de 8h30 à 10h30
Ronéotypeuse : Karine Saillant
Ronéolectrice : Pauline Sevrain
UE1 Biochimie - Biologie Moléculaire Cours N°3
Régulation de l’expression des gènes, l’exemple des récepteurs
nucléaires
Partie 1
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Sommaire
Introduction : les récepteurs nucléaires
I.
Détermination des éléments de réponse aux hormones
A. Notion de gènes cibles
B. L’importance des promoteurs
C. Le couple hormone/élément de réponse
II.
La purification
A. Les récepteurs
B. Les gènes
C. La séquence primaire de l’ADN copie
III.
La connaissance des récepteurs
A. La structure de base des récepteurs
B. Recherche d’autres récepteurs
C. Etablissement d’un profil général
IV.
Le lien structure-fonction
A. Evolution : comment en est-on arrivé là ?
B. Exemple : les œstrogènes
C. Etude expérimentale
V.
Conséquences pratiques
A. Haploinsuffisance
B. Maladies génétiques
C. Comment trouver une nouvelle hormone
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Introduction : les récepteurs nucléaires
Jusqu’aux années 1970, on suivait le Paradigme de l’opéron (j’ai fait la
recherche : c’est opéron lactose, pour ceux que ça intéresse) qui vient de l’étude des
procaryotes. La régulation de la formation des ARNm est alors un élément clef réglé par
l’abondance des sucres.
L’intérêt de la régulation de la transcription chez les eucaryotes supérieurs est une
des pistes importantes car elle mène à l’étude des récepteurs nucléaires. Ce sont des
protéines qui se lient à l’ADN et recrutent l’ADN polymérase, en réponse à la fixation
d’hormones se comportant comme des interrupteurs moléculaires. Ces hormones
régulent la transcription.
C’est un système très utilisé car il est facile à reproduire expérimentalement. (On a
une cellule avec à l’intérieur un gène ; en réponse à une hormone, on obtient la production
d’ARNm). Un produit chimique déclenche la transcription ; on procède alors à
l’identification de tous les éléments du système.
Ce système est surtout utilisé avec les œstrogènes et les glucocorticoïdes car ils étaient
mieux connus et engendrent de fortes vagues de transcription : cela permet une meilleure
caractérisation des éléments.
Aujourd’hui, la biologie repose de plus en plus sur les modèles animaux. Au début,
on utilisait principalement la souris, mais on se rend compte qu’on peut en utiliser d’autres
car ils sont plus simples : insectes, vers, poissons (surtout le poisson-zèbre). On peut
également utiliser plusieurs modèles animaux pour une même protéine.
Chez les embryons de mouche, on a trouvé une hormone stéroïde, la leptisone, qui
déclenche des vagues successives de transcription. On a défini des gènes de la 1 e vague,
de la 2e et de la 3e. Ce sont les gènes cibles primaires, secondaires et tertiaires.
I.
Détermination des éléments de réponse aux hormones
A. Notion de gènes cibles
Une théorie expliquait que, parmi les gènes cibles primaires, il y avait beaucoup de
régulateurs de la transcription qui allaient réguler les gènes cibles secondaires, et ainsi de
suite.
Pour le prouver, on réalise une expérience très simple avec un inhibiteur : on vérifie la
nécessité ou la non-nécessité d’une synthèse protéique intermédiaire. Pour un gène
primaire, la synthèse protéique n’est pas nécessaire car on part d’un groupe de protéine
préformé qu’on active avec l’hormone. Mais le gène secondaire en nécessite une car les
ARNm de la première vague doivent être traduits pour activer la seconde.
On utilise CHX (peu importe le nom), qui bloque l’élongation dans les ribosomes et
stoppe ainsi la synthèse protéique. Expérimentalement, on observe seulement la première
vague (avec les gènes cibles primaires) et ensuite tout s’arrête.
On a étudié le mécanisme d’action des hormones et on a cherché des gènes cibles
primaires. Pour les œstrogènes, on s’intéresse à des gènes reproductifs : le gène de
l’albumine qui sert à remplir l’œuf chez le poulet. Lors de la ponte, il y a une forte
synthèse d’œstrogènes et donc d’albumine. Environ 10% des ARNm codent pour
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l’albumine. Les glucocorticoïdes sont surtout exprimés dans le foie. Le gène primaire est
celui qui code pour une enzyme (la TAT mais peu importe) massivement induite au niveau
de la transcription en réponse aux glucocorticoïdes.
Grâce à des techniques dont le fondement était l’expression différentielle en réponse à
l’hormone (des éléments peu ou pas présents avant le signal hormonal deviennent
massivement exprimés après celui-ci), on a pu caractériser et cloner des ARNm.
B. L’importance des promoteurs
Aux débuts des études sur le clonage, on cherche les promoteurs (endroit où
commence la transcription du gène). On trouve, en amont de cette séquence de
promoteurs, des éléments conservés (boîte TATA), là où s’assemble le complexe
protéique (ARN polymérase).
A partir d’expériences menées chez des insectes, il a été mis en évidence qu’à
proximité de ces promoteurs, il y a des sites de liaison pour une protéine qui serait le
récepteur nucléaire ou l’activateur transcriptionnel. Expérimentalement, grâce au
développement de la biologie moléculaire et du génie génétique, on a créé des plasmides
(morceaux d’ADN circulaires présents chez les procaryotes). Ils sont faits de 3 morceaux :
 Un gène dont l’expression est facile à mesurer. A l’époque on utilisait des enzymes.
Aujourd’hui, on utilise un gène codant une protéine auto-fluorescente verte (GFP),
provenant de la méduse. Cette protéine renverra une lumière verte lorsqu’elle sera
éclairée avec une certaine lumière. Donc le gène à mesurer donne de la lumière.
 On colle les promoteurs en amont du gène.
 Le dernier morceau contient une origine de réplication pour que le plasmide puisse
se propager dans les bactéries.
On place le plasmide (donc le
gène étranger) sur des cellules en
culture qu’on sépare ensuite en deux
groupes. Un seul groupe est traité
avec l’hormone. On compare avec
des
graphiques
recueillant
la
production de lumière pour les deux
populations de cellules. On voit alors
que dans le morceau de promoteur
isolé, quelque chose confère la
sensibilité à une hormone et pas aux
autres.
On réalise alors une cartographie délétion : on cherche une région commune
associée à la sensibilité à l’hormone. On fait des découpages d’une quinzaine de
nucléotides pour réduire à une région minimale nécessaire.
On peut se poser par la suite la question de savoir si, réciproquement, cette région est
suffisante. C’est le même principe. On prend le promoteur d’un virus (promoteur très
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puissant) et on introduit l’élément de réponse : on voit l’apparition d’une sensibilité à
l’hormone avec production de lumière.
On a donc pu définir des éléments nécessaires et suffisants pour qu’un gène réponde à
un produit chimique.
C. Le couple hormone/élément de réponse
Cela nous a amené à faire des comparaisons avec plusieurs gènes et plusieurs
hormones. On s’est aperçu de plusieurs choses :
 Pour une hormone donnée, l’élément de réponse est toujours le même.
 Quand on part d’une autre hormone, l’élément de réponse est différent : il existe donc
une spécificité du couple hormone/élément de réponse.
 De façon surprenante :
 Le complexe protéique se fixant à l’ADN est un palindrome : ses séquences sont
auto-complémentaires. On a en effet un plan de symétrie (AGGTCA/TGACCT).
c’est extrêmement important pour son mécanisme fondamental dans la régulation
de l’expression génétique : dans la grande majorité des cas, le complexe fixé à
l’ADN sera un dimère, au minimum. Avec un motif simple, on peut ainsi créer des
combinaisons et avoir une grande diversité avec formation d’homo ou
d’hétérodimères.
De plus, pour un motif simple, l’affinité de liaison n’est pas suffisante pour être
stable. La dimérisation permet une plus grande spécificité (le génome est très
vaste, donc la spécificité de liaison est très importante pour un tout petit nombre
de gènes). On aura des interactions protéines/protéines en plus des interactions
ADN/protéines et donc une plus grande stabilité du complexe.
 Dans le cas des glucocorticoïdes, on s’est aperçu que non seulement on a aussi
un palindrome, mais en plus, il ressemble fortement à celui des œstrogènes
(AGAACA/TGTTCT). Ces protéines se composent donc d’éléments
d’architecture/structure conservés (AG--CA/TG--CT) et d’éléments de spécificité
(--GT--/--AC-- contre --AA--/--TT--).
Question possible à l’examen : Que nous apprend la structure des éléments de réponse ?
II.
La purification
A. Les récepteurs
Il a fallu les repérer et les purifier. On a pris des œstrogènes, par exemple, qu’on a
rendus radioactifs. Ces récepteurs sont peu abondants (comme toute protéine régulatrice
ou de structure). Le facteur clef pour la purification des récepteurs est la liaison nonspécifique de leur ligand avec d’autres protéines qui sont plus abondantes. Quand elles
sont trop abondantes, on ne peut plus détecter clairement la liaison avec les récepteurs à
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caractériser. C’est ce problème qui explique que l’on ait réussi avec certains récepteurs et
pas d’autres.
Une fois la protéine purifiée, on cherche des moyens de la reconnaître autrement : on
utilise des anticorps monoclonaux. Ceux-ci sont extrêmement puissants ; ils peuvent
reconnaître la protéine très spécifiquement, y compris lorsqu’elle est dénaturée.
B. Les gènes
A présent, on s’intéresse aux gènes. On part d’ARNm (d’au moins 30 000 espèces
différentes : certaines abondantes et d’autres rares). Les protéines régulatrices sont
toujours très rares : on en trouve à peu près une pour un million.
Grâce à des enzymes de virus, les rétrotranscriptases, on transforme cet ARNm en
ADN copie (cDNA) : on passe d’un simple brin à un double brin. On obtient alors une
copie parfaite (avec quelques petits biais tout de même car il y a plus d’abondance sur des
petits ARNm que sur des grand. Sur des grands, on ne va pas jusqu’au bout, ils sont donc
moins bien représentés) qu’on cherche à amplifier et purifier.
On met donc ces ADN copies dans des bactériophages (virus d’environ 50 000 paires
de bases mangeant les bactéries), dans une région située au centre avec peu de gènes. Il
y a une copie d’ADN par virus.
On met un promoteur qui fait (avec de la chance) une synthèse de l’ADN humain
implanté. En effet, l’ARNm ne peut être lu que dans un sens mais l’ADN est double brin : il
peut se mettre dans un sens ou dans l’autre. S’il est dans le bons sens, il y aura synthèse.
On constitue ainsi une bibliothèque : des millions de bactériophages avec chacun un ADN
copie, mais il y a un seul bactériophage par million qui nous intéresse car il a l’ARNm qui
nous intéresse.
On étale des bactéries dans de la gélatine et on y ajoute les virus. Ils les tuent et on se
retrouve avec des trous. On ajoute le promoteur qui contient l’ADN copie et qui va
fabriquer un ARNm : pour un trou sur deux, on a fabrication d’une protéine humaine. Il y a
2 possibilités mais une seule fonctionne en pratique :
 Le problème du criblage (problème classique en biologie) : on a une dizaine de
millions de virus avec environ 10 qui nous intéressent. Pour les récupérer, on transfère
donc la culture sur un « papier buvard » qui absorbe les bactéries et les virus. Il ne
reste que les protéines humaines qu’on va chercher avec nos anticorps monoclonaux.
Sur des millions de petits trous, environ un réagit avec l’Ac.
 On aurait aussi pu mettre l’hormone radioactive et attendre qu’elle se fixe ; mais en
pratique cela ne marche pas. Effectivement, pour cette fixation, on a besoin d’une
bonne structure tertiaire. La poche qui reçoit l’hormone provient de la juxtaposition de
plusieurs hélices différentes, situées loin l’une de l’autre dans la structure primaire :
c’est une fixation composite imposant d’avoir l’intégralité de l’ADN copie et que le
repliement se fasse bien.
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C. La séquence primaire de l’ADN copie
On va ensuite séquencer : on détermine la séquence primaire de l’ADN copie. Mais
ces ADN copies sont des petits morceaux de la séquence entière ; on doit récupérer le
messager complet. On utilise alors une technique très simple : on refait une bibliothèque
des bactériophages, mais on part cette fois de l’ADN copie marqué. On se sert de cet
ADN copie partiel comme d’une sonde en le rendant radioactif. On récupère en pratique
tous les ADN copies qui vont l’hybrider spécifiquement. On obtient l’intégralité de l’ADN
copie, on fait sa séquence et on détermine la séquence complète de l’ARNm. Enfin, on en
déduit la séquence de la protéine.
III.
La connaissance des récepteurs
A. La structure de base des récepteurs
Cela a permis de découvrir les récepteurs aux glucocorticoïdes et aux œstrogènes à
peu près en même temps. Pour comprendre leur mode d’action, on compare les protéines.
On peut définir 2 régions d’homologie : un premier bloc avec 70% d’identité et un
second avec 30%.
 Le premier témoigne d’une conservation très importante : les domaines de structure en
question sont donc fondamentaux (ils permettent la liaison à l’ADN).
Ces domaines sont pleins de cystéines en formation doigts de zinc. Ces formations
sont des verrous qui bloquent la marge de manœuvre (on ne veut pas que la protéine
bouge car elle doit reconnaître une autre structure).
Dans les récepteurs nucléaires, il y a 2 doigts de zinc : un pour la reconnaissance du
demi-site (demi-palindrome) et un pour la dimérisation des deux récepteurs. Ce sont 2
interfaces sur lesquelles il n’y a aucun degré de liberté : elles sont fixes.
 La deuxième région assure la liaison à l’hormone, est dotée d’un deuxième domaine
de dimérisation (dimérisation ADN indépendante) et assure aussi le recrutement
de l’ARN polymérase.
On a des sandwichs d’hélices α, formant des cavités à l’intérieur desquelles se fixent
les hormones. Il existe des variations de formes sur ces hélices α : elles vont être
sculptées pour reconnaitre un très grand nombre de types d’hormones. En effet, il y a
environ 70 récepteurs nucléaires, qui vont reconnaître un grand nombre d’hormones.
Les plus étudiées (œstrogènes et glucocorticoïdes) ne sont pas les plus importantes ni
les plus anciennes.
Question possible à l’examen : la structure, les différents domaines et régions d’un
récepteur nucléaire.
B. Recherche d’autres récepteurs
On revient au premier bloc. Il y a beaucoup de cystéines sur ce domaine qui a été
sculpté progressivement par l’évolution pour pouvoir reconnaître des séquences
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réceptives à l’ADN. Cela a permis de caractériser beaucoup d’autres récepteurs
nucléaires (environ 70). Cette caractérisation se fait par hybridation peu stringente.
Définition de la stringence (Wikipédia)
La Stringence est un terme utilisé pour décrire les conditions d'appariement de l'ARN ou de l'ADN.
En variant les conditions (principalement la concentration en sel, le pH et la température) pour un ARN ou
ADN simple brin, on a :
- Hybridation avec une cible parfaitement complémentaire (stringence élevée) - formation
d'homoduplex
- Hybridation avec une cible qui n'est pas parfaitement complémentaire (faible stringence) - formation
d'hétéroduplex
Une augmentation de la température ou une diminution de la concentration saline tend à augmenter la
sélectivité de l'hybridation et donc augmenter la stringence.
On a vu qu’on pouvait identifier l’ADN copie en utilisant un morceau d’ADN comme
sonde.
Mais on peut utiliser une autre technique : l’hybridation à basse stringence. En faisant
une hybridation à haute stringence, on ne récupère que des bactériophages qui ont le
même gène. Or, on cherche à trouver des familles de gènes. Si on fait une hybridation à
basse stringence (on diminue un peu la température), on obtient des appariements avec
des gènes de la même famille.
On prend donc le morceau d’ADN copie correspondant au domaine de liaison à l’ADN
et on le rend radioactif.
On a ainsi pu caractériser à partir de ces gènes, d’autres récepteurs nucléaires de
même structure, associés à des hormones inconnues. On les a donc baptisés
« récepteurs orphelins ». On verra plus loin comment caractériser les hormones
associées à ces récepteurs.
C. Etablissement d’un profil général
On a donc une structure générale : 2 doigts de Zinc, 3 hélices α, et 3 fonctions :
liaison à l’hormone, transactivation (par l’AF) et dimérisation. À l’origine, le récepteur
possède une région de dimérisation consécutive portée par le domaine en gris, et deux
sites de reconnaissance à l’ADN (en bas). Ceux-ci se comportent
comme une tête chercheuse, qui va aller chercher les sites de liaison
à la chromatine, définis par 2 choses :
 Reconnaissance des demi-sites : AGGTCA
 Bon espace-temps : c’est le 2ème doigt de Zinc, présent à
l’intérieur du domaine C (nom historique du domaine de liaison à
l’ADN) qui s’en charge.
La reconnaissance du petit nombre de gènes cibles primaires se
fait grâce à une parfaite concordance de forme entre l’ADN et la
protéine, et les différentes parties de la protéine entre elles. Cela crée un complexe
particulièrement stable, qui va être capable de reconnaître un tout petit bout d’une région
du génome.
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Quand on a eu la bonne reconnaissance, l’hormone, qui est fixée dans sa poche,
peut induire l’expression (l’exposition) d’un domaine appelé AF2 (Activating Function 2)
qui va recruter l’ARN polymérase. On a donc un interrupteur moléculaire qui permet de
coupler la fixation de l’hormone avec l’activation de la transcription.
IV.
Le lien structure-fonction
A. Evolution : comment en est-on arrivé là ?
Ce modèle général fait appel à la notion de « protéines constituées de domaines
indépendants ». Ici, on voit bien qu’on a 2 domaines indépendants : un bloc est chargé
de la reconnaissance de l’ADN ; un autre de la reconnaissance de l’hormone et de
l’activation de la transcription.
On a un mécanisme général dans l’évolution : la nature a commencé par créer des
domaines individuels, et par le jeu des translocations, ces domaines ont fusionné les uns
avec les autres. Dans certaines protéines, on peut reconnaître jusqu’à 5-6 domaines
individuels qui ont été collés les uns aux autres par le hasard de l’évolution. On a un
domaine très bien plié, très bien structuré, qui va remplir une fonction ; ensuite un bout de
peptide qui assure la liaison avec un autre domaine, lui aussi bien replié.
D’un point de vue évolutif, on pense que les récepteurs nucléaires sont nés d’un accident,
impliquant un facteur de transcription (protéine capable de se fixer à une séquence
spécifique de l’ADN) et une enzyme capable de se lier et de métaboliser des
xénobiotiques (éléments externes). En effet, beaucoup des hormones à récepteur
nucléaire dérivent du milieu, et en particulier de vitamines. On a utilisé des molécules
d’information de l’extérieur comme l’iode (qui a donné les hormones thyroïdiennes), la
vitamine A (acide rétinoïque), la vitamine D (vitamine D3)…
Ce sont donc des produits qui viennent de l’extérieur de la cellule, ils sont reconnus
et métabolisés par ce domaine à fonction enzymatique. Un jour, on a eu fusion entre ces 2
domaines et la possibilité (géniale) de moduler l’expression génétique en fonction
d’une information extérieure. Cela permet d’ajuster l’expression des ARNm en fonction
de ce qui se passe à l’extérieur. En pratique, on a créé un « senseur », capable de sentir
le milieu et de répondre par l’expression génétique. Ce système s’est développé car très
utile, et il est utilisé pour répondre à des informations provenant du milieu et de la cellule
elle-même.
Beaucoup de ces récepteurs sont très importants dans le métabolisme, en
particulier dans le métabolisme des graisses. Tout le métabolisme des lipides est contrôlé
par ce genre de signature. C’est très important en médecine, en particulier pour les
dyslipidémies et les problèmes d’obésité pathologique.
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On a donc deux domaines à l’origine indépendants qui vont se retrouver collés l’un
à l’autre et apprendre à travailler ensemble, en particulier pour assurer le couplage entre
la liaison à l’hormone et la fixation à l’ADN.
B. Exemple (que le prof aime bien poser à l’examen) +++ : les œstrogènes
À l’origine, le récepteur aux œstrogènes est cytoplasmique, car présent à l’état
d’hétérodimère avec une protéine chaperonne (vaguelettes grises sur le schéma).
Celle-ci empêche l’interaction protéine-protéine. Ici, elle bloque le domaine de dimérisation
constitutif. Le complexe est donc dans le cytoplasme. Lorsque l’œstrogène se fixe, on
décroche la chaperonne, l’homodimérisation est donc possible.
La protéine va donc migrer dans le noyau car la séquence NLS d’adressage nucléaire
n’est plus dissimulée par la protéine chaperonne.
Il y a deux domaines de liaison à l’ADN. On va alors avoir un processus de « scanning » :
le complexe cherche dans la chromatine où « se poser », à savoir un endroit où il peut
avoir ses 3 interactions à la fois (ADN, hormone, ARN polymérase), seul moyen d’avoir un
homodimère stable.
Une fois que le récepteur a fixé l’ADN et l’hormone, il change de conformation : il
extériorise une petite hélice α, appelée AF2, qui va reconnaître l’ARN polymérase. Cette
hélice est la même pour tous les récepteurs nucléaires : elle a une importance
fonctionnelle.
C. Etude expérimentale
Quelles sont les preuves que ce modèle est vrai ?
Il faut des informations structurales, c’est-à-dire qu’il faut faire un cristal. Quand on
fait un cristal, on sait exactement « qui touche quoi » (quel l’acide aminé touche quel
nucléotide), et on va pouvoir avoir une idée très précise de ce qui se passe.
Dans ce système, on a la possibilité de faire énormément de génétique : on a les ADN
copies, les éléments de réponse. On a donc des tests fonctionnels. On peut faire des
mutants en très grand nombre sur l’ADN copie, et on peut aborder des questions
biologiques et biochimiques par des expériences très fines de génétique. On peut, par
exemple, muter chaque acide aminé et voir ce qui se passe, pour en déterminer la
fonction.
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En premier, on fait un cristal de cette région. Cela permet de définir les points de
contact au niveau du domaine de dimérisation et surtout au niveau du domaine de liaison
à l’ADN. Dans le domaine C, on a deux doigts de Zinc. Le premier est impliqué dans la
reconnaissance de l’ADN, le 2ème assure l’homodimérisation. La séquence primaire de la
structure en doigt de Zinc est en général CXXC-XX-CXXC : les 4 C (cystéines) sont
reliées à l’atome de Zinc. Les deux acides aminés du milieu sont « Gly-Ser » pour le
récepteur aux glucocorticoïdes, et « Glu-Gly » pour le récepteur aux œstrogènes.
Dans l’architecture globale, conservée, du domaine C et de l’élément de réponse,
ces éléments assurent la spécificité. Pour prouver ceci, on peut muter soit l’élément de
réponse, soit le récepteur de l’ADN copie.
Pour l’élément de réponse, on peut faire : GT  AA. Au lieu d’un élément de réponse
aux œstrogènes, on aura un élément de réponse aux glucocorticoïdes.
On peut faire la même chose dans l’autre sens : on prend un récepteur de l’ADN copie des
glucocorticoïdes, et on mute les 2 positions. On fait : « Gly-Ser  Glu-Gly ».
Si la spécificité vient uniquement de ces deux résidus (les deux acides aminés), cela
signifie qu’on est capable d’induire une réponse aux œstrogènes sur un récepteur aux
glucocorticoïdes muté, et inversement. Attention, on induit la réponse avec des
glucocorticoïdes car le site de fixation de l’hormone n’a pas été modifié.
Il s’agit d’une des démonstrations les plus élégantes du caractère modulaire des
protéines, et du fait que les protéines soient une suite de domaines assurant chacun une
fonction, et qui vont fonctionner de manière coordonnée.
V.
Conséquences pratiques
A. Haploinsuffisance
Le domaine AF2 est conservé dans tous les récepteurs nucléaires. Cela conduit à la
notion importante de compétition.
Par exemple, on prend un gène cible des œstrogènes. On met beaucoup
d’œstrogènes sur la cellule qu’on « active à mort », et on arrive à 100 tours. De même, on
met des glucocorticoïdes dans la même cellule, et là aussi on induit le gène 100 fois. On
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prend ensuite la même cellule, et cette fois on met à la fois des œstrogènes et des
glucocorticoïdes. Cette fois-ci, on induit chaque gène 50 fois seulement.
Cela vient du fait que les protéines assurant la liaison à l’ARN polymérase sont en
quantité limitante : les récepteurs doivent se les partager. On ne peut donc pas activer à
fond les 2 systèmes à la fois. Si on met les 2 hormones on aura 50-50. C’est ce qu’on
appelle, en génétique, l’haploinsuffisance.
B. Maladies génétiques
Un petit nombre de maladies génétique touchent des gènes pour lesquels la protéine
est en quantité limitante. On a donc vraiment besoin de 2 gènes pour avoir l’entière
réponse biologique. Si on a un seul des 2 gènes, on a une maladie liée au fait que la
quantité de protéine a été diminuée de 50%, ce qui est insuffisant pour la cellule. Dans ce
cas, la transmission est dominante (mécanisme principal des maladies génétiques
dominantes). Les maladies génétiques les plus fréquentes sont les maladies par perte de
fonction, à transmission récessive.
Exemple : la maladie de Rubinstein qui touche une protéine faisant la liaison entre
AF2 et l’ARN polymérase. Comme cette protéine est limitante, en ayant perdu un allèle, la
cellule ne peut pas transcrire suffisamment. Donc l’organisme va avoir un développement
normal, mais va avoir toutes sortes de problèmes après la naissance, car la transcription
n’arrive pas à être suffisamment régulée : il manque 50% des protéines qui vont assurer la
liaison entre l’ARN polymérase et les récepteurs nucléaires.
C. Comment trouver une nouvelle hormone (récepteur orphelin)
On est un « jeune chercheur californien », qui a trouvé étant jeune un récepteur
nucléaire orphelin. On se met donc en tête de trouver l’hormone correspondant à ce
récepteur (pour être riche !). Comment faire ?
On peut assimiler ce problème à un problème mathématique à deux inconnues et
une seule équation : on connait le récepteur nucléaire (donc la structure du site de liaison
à l’hormone et du site de liaison à l’ADN, au niveau du récepteur), mais on ne connait ni
l’hormone, ni le site de liaison à l’ADN (sur l’ADN). Que faire ? On simplifie le problème.
On crée un récepteur chimérique, c’est-à-dire qu’on remplace le site de liaison à
l’ADN du récepteur orphelin par un site de liaison connu (par exemple celui du récepteur
aux œstrogènes). On connait donc l’élément de réponse, et le site de liaison à l’ADN.
Donc la seule inconnue est l’hormone. On refait ensuite comme vu précédemment : on
met le promoteur et la protéine verte de méduse. On exprime le récepteur chimérique
dans la même cellule, et on a un système génétique tel que lorsqu’on a la bonne hormone,
la cellule devient verte.
On fait ensuite un criblage. C’est-à-dire qu’on fait du « jus » de cerveau, de foie, de
testicules, etc. On met ensuite ces « jus » sur les cellules, et on observe du vert par
endroits. Lorsqu’on a du vert, on demande à des chimistes de séparer les « jus » en des
centaines de pics différents. On met chaque pic sur les cellules (c’est-à-dire que pour
chaque pic, on remet les constituants en question sur la cellule). A un moment donné, on
a une préparation pure qui va rendre verte la cellule, signifiant qu’on a trouvé l’hormone.
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On va ainsi devenir très riche et pouvoir reconstruire une physiologie inconnue, dans le
domaine du développement, du métabolisme ou de la réponse au stress.
C’est ce qui s’est produit avec ces récepteurs nucléaires : on a découvert de
nombreux systèmes hormonaux insoupçonnés, et ces connaissances ont eu des
applications médicales. On a pu, par ce biais, découvrir de nouveaux médicaments, qui
sont des analogues de ces hormones, agissant sur ces systèmes dont la découverte a été
assurée en partant de problématiques de biologie moléculaire.
Désolée pour le plan un peu moyen, mais le prof n’en a pas donné dans son cours alors
j’ai essayé de faire au mieux.
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