File - L2 Bichat 2012-2013

1/14
Ronéo N°2
UE1 Biochimie – Biologie moléculaire
Pr De Thé
Le 01/10/2012, de 8h30 à 10h30
Ronéotypeuse : Karine Saillant
Ronéolectrice : Pauline Sevrain
UE1 Biochimie - Biologie Moléculaire Cours N°3
Régulation de l’expression des gènes, l’exemple des récepteurs
nucléaires
Partie 1

2/14
Ronéo N°2
Sommaire
Introduction : les récepteurs nucléaires
I. Détermination des éléments de réponse aux hormones
A. Notion de gènes cibles
B. L’importance des promoteurs
C. Le couple hormone/élément de réponse
II. La purification
A. Les récepteurs
B. Les gènes
C. La séquence primaire de l’ADN copie
III. La connaissance des récepteurs
A. La structure de base des récepteurs
B. Recherche d’autres récepteurs
C. Etablissement d’un profil général
IV. Le lien structure-fonction
A. Evolution : comment en est-on arrivé là ?
B. Exemple : les œstrogènes
C. Etude expérimentale
V. Conséquences pratiques
A. Haploinsuffisance
B. Maladies génétiques
C. Comment trouver une nouvelle hormone

3/14
Ronéo N°2
Introduction : les récepteurs nucléaires
Jusqu’aux années 1970, on suivait le Paradigme de l’opéron (j’ai fait la
recherche : c’est opéron lactose, pour ceux que ça intéresse) qui vient de l’étude des
procaryotes. La régulation de la formation des ARNm est alors un élément clef réglé par
l’abondance des sucres.
L’intérêt de la régulation de la transcription chez les eucaryotes supérieurs est une
des pistes importantes car elle mène à l’étude des récepteurs nucléaires. Ce sont des
protéines qui se lient à l’ADN et recrutent l’ADN polymérase, en réponse à la fixation
d’hormones se comportant comme des interrupteurs moléculaires. Ces hormones
régulent la transcription.
C’est un système très utilisé car il est facile à reproduire expérimentalement. (On a
une cellule avec à l’intérieur un gène ; en réponse à une hormone, on obtient la production
d’ARNm). Un produit chimique déclenche la transcription ; on procède alors à
l’identification de tous les éléments du système.
Ce système est surtout utilisé avec les œstrogènes et les glucocorticoïdes car ils étaient
mieux connus et engendrent de fortes vagues de transcription : cela permet une meilleure
caractérisation des éléments.
Aujourd’hui, la biologie repose de plus en plus sur les modèles animaux. Au début,
on utilisait principalement la souris, mais on se rend compte qu’on peut en utiliser d’autres
car ils sont plus simples : insectes, vers, poissons (surtout le poisson-zèbre). On peut
également utiliser plusieurs modèles animaux pour une même protéine.
Chez les embryons de mouche, on a trouvé une hormone stéroïde, la leptisone, qui
déclenche des vagues successives de transcription. On a défini des gènes de la 1e vague,
de la 2e et de la 3e. Ce sont les gènes cibles primaires, secondaires et tertiaires.
I. Détermination des éléments de réponse aux hormones
A. Notion de gènes cibles
Une théorie expliquait que, parmi les gènes cibles primaires, il y avait beaucoup de
régulateurs de la transcription qui allaient réguler les gènes cibles secondaires, et ainsi de
suite.
Pour le prouver, on réalise une expérience très simple avec un inhibiteur : on vérifie la
nécessité ou la non-nécessité d’une synthèse protéique intermédiaire. Pour un gène
primaire, la synthèse protéique n’est pas nécessaire car on part d’un groupe de protéine
préformé qu’on active avec l’hormone. Mais le gène secondaire en nécessite une car les
ARNm de la première vague doivent être traduits pour activer la seconde.
On utilise CHX (peu importe le nom), qui bloque l’élongation dans les ribosomes et
stoppe ainsi la synthèse protéique. Expérimentalement, on observe seulement la première
vague (avec les gènes cibles primaires) et ensuite tout s’arrête.
On a étudié le mécanisme d’action des hormones et on a cherché des gènes cibles
primaires. Pour les œstrogènes, on s’intéresse à des gènes reproductifs : le gène de
l’albumine qui sert à remplir l’œuf chez le poulet. Lors de la ponte, il y a une forte
synthèse d’œstrogènes et donc d’albumine. Environ 10% des ARNm codent pour

4/14
Ronéo N°2
l’albumine. Les glucocorticoïdes sont surtout exprimés dans le foie. Le gène primaire est
celui qui code pour une enzyme (la TAT mais peu importe) massivement induite au niveau
de la transcription en réponse aux glucocorticoïdes.
Grâce à des techniques dont le fondement était l’expression différentielle en réponse à
l’hormone (des éléments peu ou pas présents avant le signal hormonal deviennent
massivement exprimés après celui-ci), on a pu caractériser et cloner des ARNm.
B. L’importance des promoteurs
Aux débuts des études sur le clonage, on cherche les promoteurs (endroit où
commence la transcription du gène). On trouve, en amont de cette séquence de
promoteurs, des éléments conservés (boîte TATA), là où s’assemble le complexe
protéique (ARN polymérase).
A partir d’expériences menées chez des insectes, il a été mis en évidence qu’à
proximité de ces promoteurs, il y a des sites de liaison pour une protéine qui serait le
récepteur nucléaire ou l’activateur transcriptionnel. Expérimentalement, grâce au
développement de la biologie moléculaire et du génie génétique, on a créé des plasmides
(morceaux d’ADN circulaires présents chez les procaryotes). Ils sont faits de 3 morceaux :
 Un gène dont l’expression est facile à mesurer. A l’époque on utilisait des enzymes.
Aujourd’hui, on utilise un gène codant une protéine auto-fluorescente verte (GFP),
provenant de la méduse. Cette protéine renverra une lumière verte lorsqu’elle sera
éclairée avec une certaine lumière. Donc le gène à mesurer donne de la lumière.
 On colle les promoteurs en amont du gène.
 Le dernier morceau contient une origine de réplication pour que le plasmide puisse
se propager dans les bactéries.
On place le plasmide (donc le
gène étranger) sur des cellules en
culture qu’on sépare ensuite en deux
groupes. Un seul groupe est traité
avec l’hormone. On compare avec
des graphiques recueillant la
production de lumière pour les deux
populations de cellules. On voit alors
que dans le morceau de promoteur
isolé, quelque chose confère la
sensibilité à une hormone et pas aux
autres.
On réalise alors une cartographie délétion : on cherche une région commune
associée à la sensibilité à l’hormone. On fait des découpages d’une quinzaine de
nucléotides pour réduire à une région minimale nécessaire.
On peut se poser par la suite la question de savoir si, réciproquement, cette région est
suffisante. C’est le même principe. On prend le promoteur d’un virus (promoteur très

5/14
Ronéo N°2
puissant) et on introduit l’élément de réponse : on voit l’apparition d’une sensibilité à
l’hormone avec production de lumière.
On a donc pu définir des éléments nécessaires et suffisants pour qu’un gène réponde à
un produit chimique.
C. Le couple hormone/élément de réponse
Cela nous a amené à faire des comparaisons avec plusieurs gènes et plusieurs
hormones. On s’est aperçu de plusieurs choses :
 Pour une hormone donnée, l’élément de réponse est toujours le même.
 Quand on part d’une autre hormone, l’élément de réponse est différent : il existe donc
une spécificité du couple hormone/élément de réponse.
 De façon surprenante :
 Le complexe protéique se fixant à l’ADN est un palindrome : ses séquences sont
auto-complémentaires. On a en effet un plan de symétrie (AGGTCA/TGACCT).
c’est extrêmement important pour son mécanisme fondamental dans la régulation
de l’expression génétique : dans la grande majorité des cas, le complexe fixé à
l’ADN sera un dimère, au minimum. Avec un motif simple, on peut ainsi créer des
combinaisons et avoir une grande diversité avec formation d’homo ou
d’hétérodimères.
De plus, pour un motif simple, l’affinité de liaison n’est pas suffisante pour être
stable. La dimérisation permet une plus grande spécificité (le génome est très
vaste, donc la spécificité de liaison est très importante pour un tout petit nombre
de gènes). On aura des interactions protéines/protéines en plus des interactions
ADN/protéines et donc une plus grande stabilité du complexe.
 Dans le cas des glucocorticoïdes, on s’est aperçu que non seulement on a aussi
un palindrome, mais en plus, il ressemble fortement à celui des œstrogènes
(AGAACA/TGTTCT). Ces protéines se composent donc d’éléments
d’architecture/structure conservés (AG--CA/TG--CT) et d’éléments de spécificité
(--GT--/--AC-- contre --AA--/--TT--).
Question possible à l’examen : Que nous apprend la structure des éléments de réponse ?
II. La purification
A. Les récepteurs
Il a fallu les repérer et les purifier. On a pris des œstrogènes, par exemple, qu’on a
rendus radioactifs. Ces récepteurs sont peu abondants (comme toute protéine régulatrice
ou de structure). Le facteur clef pour la purification des récepteurs est la liaison non-
spécifique de leur ligand avec d’autres protéines qui sont plus abondantes. Quand elles
sont trop abondantes, on ne peut plus détecter clairement la liaison avec les récepteurs à