Transcriptome et métabolisme de l'ovocyte bovin Thèse Sara-Myriam Scantland-Marchand Doctorat en Sciences Animales Philosophiae doctor (PhD) Québec, Canada © Sara-Myriam Scantland-Marchand, 2014 Résumé Durant la croissance, les ovocytes emmagasinent des quantités importantes d’ARNm maternel dans leur cytoplasme. Ces ARNm pourront plus tard être traduit en protéines afin de soutenir la maturation ovocytaire et le développement précoce et ce, jusqu’à l’activation du génome de l’embryon qui est une étape cruciale du développement. Trois catégories d’ARNm peuvent être distinguées durant cette période : les ARNm emmagasinés, les ARNm en voie de traduction (ARNm polyribosomaux) et les ARNm voués à la dégradation. De ces trois catégories, seuls les ARNm polyribosomaux ont un impact direct sur la physiologie cellulaire sous-jacente. Dans cet ouvrage, j’ai développé une méthode permettant d’isoler les ARN polyribosomaux afin de faciliter l’étude de la physiologie de l’ovocyte et de l’embryon précoce. Cette méthodologie a permis de découvrir plusieurs faits très intéressants portant sur le métabolisme énergétique et la synthèse protéique durant la maturation ovocytaire. Les cinq complexes mitochondriaux ainsi que la production énergétique sont fortement diminués durant la maturation ovocytaire. L’impact direct d’une telle inhibition se traduit par une réduction de la production d’ATP par la mitochondrie et l’initiation d’une quiescence dans l’ovocyte entraînant une diminution importante des capacités traductionnelles. Ces découvertes m’ont amenés à m’enquérir de la présence de mécanismes alternatifs dans l’ovocyte permettant de soutenir les besoins énergétiques durant la maturation. Le transfert de molécules telles que l’AMP et l’AMPc provenant des cellules du cumulus ainsi que la récupération des AMP libérés au moment de la dégradation de la queue poly(A) des ARNm maternels semblent être deux mécanismes d’importance permettant de soutenir les besoins énergétiques de l’ovocyte. Il semble donc que la maturation ovocytaire représente une période de préparation à la fécondation caractérisée par une maturation nucléaire, cytoplasmique et moléculaire mais également une période d’entrée en quiescence et de ralentissement métabolique afin de survivre aux nombreuses heures d’attentes précédent la fécondation et avant l’activation du génome embryonnaire. iii Abstract During growth, oocytes store large quantities of maternal mRNAs within their cytoplasm. These mRNAs can then be translated into proteins at different times to sustain oocyte maturation and early development, up until a crucial step in development: the embryonic genome activation. Three categories of mRNAs can be identified during this period: stored mRNAs, mRNAs in the process of being translated (polyribosomal mRNAs) and mRNAs fated for decay. Of these three categories, only polyribosomal mRNAs have an impact on the underlying cell physiology. Within this text, we have developed a method to isolate polyribosomal mRNAs to facilitate the study of oocyte and early embryo physiology. This methodology allowed us to investigate the energetic metabolism of mitochondria and protein synthesis during oocyte maturation. All five mitochondrial complexes as well as energy production are strongly incapacitated during oocyte maturation. The direct impact of such an incapacitation is a limitation of ATP production by mitochondria and the initiation of quiescence within the oocyte which results in an important diminution of translational potential. These discoveries caused us to start inquiring about the presence of alternative mechanisms which could sustain the energetic needs of the oocyte during maturation. The transfer of molecules such as AMP and AMPc from the cumulus and the salvage of AMPs freed during the degradation of the poly(A) tail of maternal mRNAs appear to be two important mechanisms which could sustain the energetic needs of the oocyte. Thus, it seems that oocyte maturation represents not only a period of preparation for fertilization through a nuclear, cytoplasmic and molecular maturation but also a period of entry into quiescence and metabolic slow down in order to survive the long wait before fertilization and subsequent embryonic genome activation. v Table des matières Résumé............................................................................................................................... iii Abstract ............................................................................................................................... v Table des matières ............................................................................................................ vii Table des illustrations ........................................................................................................ ix Table des tableaux ............................................................................................................. xi Liste des abréviations....................................................................................................... xiii Remerciements................................................................................................................ xvii Avant-propos ................................................................................................................... xxi 1. Chapitre 1. Introduction à la maturation ovocytaire et au développement précoce .... 1 1.1 L’OVOCYTE ............................................................................................................ 1 1.1.1 Origine et migration des cellules germinales primordiales ................................. 1 1.1.2 Folliculogenèse .................................................................................................... 5 1.1.3 Ovogenèse ........................................................................................................... 9 1.1.4 Fécondation ....................................................................................................... 17 1.2 L’EMBRYON ......................................................................................................... 18 1.2.1 Anatomie du développement précoce ............................................................... 18 1.2.2 Première semaine de développement ................................................................ 18 1.2.3 Poursuite du développement embryonnaire ...................................................... 20 1.2.4 Structuration des cellules embryonnaires .......................................................... 20 1.2.5 Destin cellulaire ................................................................................................. 21 1.3 LA TRANSCRIPTION DANS L’OVOCYTE ET L’EMBRYON PRÉCOCE ..... 22 1.3.1 Transcription ovocytaire .................................................................................... 22 1.3.2 Mécanismes d’emmagasinage des transcrits ..................................................... 23 1.3.3 Arrêt de la transcription ..................................................................................... 26 1.3.4 Régulation de la traduction des transcrits emmagasinés ................................... 29 1.3.5 La durée du silence transcriptionnel .................................................................. 31 1.4 RÉGULATION DE LA TRADUCTION DES ARNm MATERNEL ................... 35 1.4.1 Réadénylation des ARNm emmagasinés........................................................... 35 1.4.2 Les joueurs clés de la régulation de la traduction.............................................. 36 1.5 MÉTABOLISME ÉNERGÉTIQUE ....................................................................... 44 1.5.1 Les mitochondries ovocytaires .......................................................................... 44 1.5.2 Mitochondries et production énergétique .......................................................... 48 1.5.3 Mitochondries et fécondation ............................................................................ 49 1.5.4 Mitochondries et développement précoce ......................................................... 50 1.5.5. Substrats métaboliques ..................................................................................... 51 1.6 OBJECTIFS DE LA THÈSE .................................................................................. 54 1.7 RÉFÉRENCES ........................................................................................................ 57 2. Chapitre 2 : Isolation des ARNm polyribosomaux pour l’étude du développement embryonnaire précoce ....................................................................................................... 71 2.1 Résumé .................................................................................................................... 72 2.2 Abstract ................................................................................................................... 73 2.3 Background ............................................................................................................. 74 2.4 Results ..................................................................................................................... 76 2.5 Discussion ............................................................................................................... 79 vii 2.6 Conclusions ............................................................................................................. 82 2.7 Methods ................................................................................................................... 82 2.8 Authors' contributions ............................................................................................. 88 2.9 Acknowledgements ................................................................................................. 89 2.10 References ............................................................................................................. 89 3. Chapitre 3 : L’analyse des ARNm polyribosomaux révèle l’acquisition de la quiescence énergétique durant la maturation ovocytaire chez le bovin .......................... 102 3.1 Résumé .................................................................................................................. 103 3.2 Abstract .................................................................................................................. 104 3.3 Introduction ........................................................................................................... 105 3.4 Results ................................................................................................................... 107 3.5 Discussion .............................................................................................................. 109 3.6 The Quiet Oocyte................................................................................................... 114 3.7 Methods ................................................................................................................. 115 3.8 References ............................................................................................................. 120 4. Chapitre 4. Source alternative d’ATP durant la maturation ovocytaire bovine. ...... 135 4.1 Résumé .................................................................................................................. 136 4.2 Abstract .................................................................................................................. 137 4.3 Introduction ........................................................................................................... 138 4.4 Results ................................................................................................................... 139 4.5 Discussion .............................................................................................................. 142 4.6 Conclusion ............................................................................................................. 147 4.7 Methods ................................................................................................................. 147 4.8 Authors' contributions ........................................................................................... 150 4.9 References ............................................................................................................. 151 5. Chapitre 5. Conclusion............................................................................................. 163 5.2 Références ............................................................................................................. 167 viii Table des illustrations Figure 1-1 Migration des cellules germinales primordiales chez l’humain. ........................................................ 2 Figure 1-2 Représentation schématique des différents stades de croissance des follicules. .............................. 7 Figure 1-3 Représentation du cycle œstral à trois vagues chez la vache. .......................................................... 8 Figure 1-4 Représentation du mode d’action du MPF. ..................................................................................... 14 Figure 1-5 Ligne du temps de l’activité du MPF et du CSF. ............................................................................... 16 Figure 1-6 Progression des premiers stades embryonnaires précoces. ............................................................ 19 Figure 1-7 La liaison de la protéine EDEN-BP favorise le recrutement des déadénylases. ............................... 24 Figure 1-8 La voie de l’ARNm dans l’ovocyte. ................................................................................................... 30 Figure 1-9 Compétition entre la poly(A) ribonucléase PARN et la poly(A) polymérase GLD2. .......................... 36 Figure 1-10 Modèle du mécanisme de stimulation de la traduction par Paip1. .............................................. 38 Figure 1-11 Circularisation de l’ARN ................................................................................................................. 40 Figure 1-12 Contrôle de la traduction par l’intermédiaire de la protéine Maskin. .......................................... 41 Figure 1-13 Phénotypes mitochondriaux. ......................................................................................................... 47 Figure 2-1 Effect of cross-linking on recovery of RNA extracted from Drosophila SL2 cells. ............................. 93 Figure 2-2 Neutralization of formaldehyde in Drosophila SL2 cell extract. ....................................................... 94 Figure 2-3 Distribution of Drosophila SL2 polyribosomes in sucrose density gradient fractions ...................... 95 Figure 2-4 Confirmation that the high-sedimenting materials contain polyribosomes. ................................... 96 Figure 2-5 Reproducibility of the polyribosome mRNA extraction method. ..................................................... 97 Figure 2-6 Determination of total, poly(A) and polyribosomal RNA in oocytes at different stages .................. 98 Figure 2-7 Relative abundance of selected polyribosomal mRNA sequences and corresponding proteins. ..... 99 Figure 3-1 Polyribosomal profiles. .................................................................................................................. 124 Figure 3-2 Venn diagram of expressed and differentially expressed genes between GV or MII oocytes. ...... 125 Figure 3-3 Comparison analysis of cellular functions. ..................................................................................... 126 Figure 3-4 Comparison analysis of canonical pathways. ................................................................................ 127 Figure 3-5 RT-PCR validations. ........................................................................................................................ 128 Figure 3-6 ATP and ADP:ATP ratios during oocyte maturation. ..................................................................... 129 Figure 3-7 Reduction of EIF2 signaling during oocyte maturation. ................................................................. 130 Figure 3-8 Reduction of oxidative phosphorylation during oocyte maturation. ............................................. 131 Figure 4-1 Alternative ATP production mechanisms during oocyte maturation ............................................. 155 Figure 4-2 Impact of OXPHOS inhibitor (CCCP) ............................................................................................... 156 Figure 4-3 QPCR validation for 3 candidates in the adenosine salvage pathway .......................................... 157 Figure 4-4 Impact of AK and CK inhibitor ........................................................................................................ 158 Figure 4-5 Creatine kinase assay..................................................................................................................... 159 Figure 4-6 Impact of adding phosphocreatine (PCr) to the culture media ...................................................... 160 Figure 4-7 Impact of culture under different form .......................................................................................... 161 Figure 4-8 Impact of PARN inhibitor and AMP rescue .................................................................................... 162 ix Table des tableaux Tableau 1-1 Caractéristiques associées à la maturation de l’ovocyte au stade de vésicule germinale. .......... 11 Tableau 1-2 Activation du génome embryonnaire chez différentes espèces. .................................................. 34 Table 2-1 Proportion of detected microarray signals above threshold ........................................................... 100 Table 2-2 Description of RT-PCR or PCR primers for examined genes............................................................. 101 Table 3-1 Log-ratios and p-values associated with molecules related to mitochondrial function.................. 132 Table 3-2 Log-ratios and the p-value associated with different molecules in EIF2 signaling pathway ........... 133 Table 3-3 Primer sequences for QPCR ............................................................................................................ 134 xi Liste des abréviations % 4E-BP A ADN AGE AMP AMPc AP AR ARE ARN ARNm ARNr ATP Axe A-P Axe D-V BMP C CCCP CCNB1 CCR4-Pop2-Not Cdc CDK CPE CPEB CPSF CSF CTD Cx CYP26B1 DCP1A DDX6 DICE E EDEN eIF FRGY FSH G GLD2 GV GVBD HBP Pourcentage eIF4E-binding protein Adénine Acide désoxyribonucléique Activation du génome embryonnaire Adénosine monophosphate Adénosine monophosphate cyclique Phosphatase alkaline Acide rétinoïque AU-rich element Acide ribonucléique Acide ribonucléique messager Acide ribonucléique ribosomal Adénosine triphosphate Axe antéro-postérieur Axe dorso-ventral Bone morphogenetic protein Cytosine Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone Cycline B1 C-C chemokine receptor type 4 – popeye 2 – Not transcription complexe Cell-division cycle Cyclin dependant kinase Cytoplasmic polyadenylation element Cytoplasmic polyadenylation element binding Cleavage and polysadenylation specific factor Cytostatic factor Carbon-terminal domain Connexine Cytochrome p450 Decapping enzyme 1A DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box helicase 6 Differential control element Embryonnaire Embryo deadenylation element eukaryotic initiation factor Frog Y-box protein 2 Follicle-stimulating hormone Guanine Glucose dehydrogenase 2 Germinal vesicle Germinal vesicle breakdown Hexosamine biosynthesis pathway xiii HEX ICM Kb KL LH mg MI MII MIV mm Mos MPF MSY MZT ng PABP PAIBP Paip PARN PDE PFK pg PGC Phase G Phase M Phase S PI3K PKA PPP Pro RNAP Ror2 ROS RPB1 RRM S SCF Ser Thr Tyr U UTR Wnt YBX ZP μm xiv Hexanucléotide de polyadénylation (AAUAAA) Inner cell mass Kilobase Kit-ligand Luteinizing hormone miligramme Métaphase I Métaphase II Maturation in vitro Milimètre v-mos Moloney murine sarcoma viral oncogene Maturation promoting factor Mouse Y-box Maternal to zygotic transition Nanogramme Poly-A binding protein Poly-A interacting binding protein Poly-A interacting protein Poly-A ribonucléase Phosphodietérase Phosphofructokinase Picogramme Primordial germ cell Phase ‘gap’ Phase de mitose Phase de synthèse/duplication de l’ADN Phosphatidylinositol 3-kinase cAMP dependent protein kinase Pentose phosphate pathway Proline Ribonucleic acid polymerase Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2 Reactif oxygen species RNA polymerase II large subunit RNA-recognition motif Svedberg (unité de sédimentation) Stem-cell factor Sérine Thréonine Tyrosine Uracil Untranslated region Wingless-type Y box protein Zone pellucide Micromètre À mon amoureux, Éric, et à mon père, Raymond xv Remerciements Après toutes ces années aux études supérieures, je voudrais prendre le temps de remercier les personnes qui ont contribuées à mon succès. Je remercie d’abord mon directeur de recherche, Dr. Claude Robert, pour m’avoir permis de concilier ma passion pour l’enseignement avec tout le travail demandé par les études graduées. Je suis également particulièrement heureuse d’avoir réussi à te convaincre de l’intérêt de mes dernières hypothèses sur le métabolisme énergétique. Je remercie également mon co-directeur, Dr. Marc-André Sirard, pour son tact et son grand pouvoir tampon lors de ses interventions qui m’ont permis d’en arriver au point où je peux aujourd’hui, faire le dépôt de ma thèse. J’ai énormément apprécié ton support et tes conseils dans les moments cruciaux de mon doctorat. Je prends ici le temps de remercier un étudiant qui a joué un rôle particulier au cours de mon doctorat : Dr. Gaël Cagnone. Gaël a mis en pratique ses qualités de futur directeur de recherche pour me ‘diriger’ dans certains de mes travaux. Nos longues discussions, ses sempiternels questionnements et surtout sa considération pour mes idées auront joué un rôle particulièrement formateur dans l’acquisition de mes compétences professionnelles. Un énorme merci d’avoir fait parti -non officielle- de mon équipe de direction. Les professionnels de recherche des équipes du Dr. Robert et du Dr.Sirard ont été d’une aide précieuse au cours de mes études. Je remercie particulièrement Dominic Gagné qui a été une personne référence essentielle et qui, par ses connaissances, son expérience et sa disponibilité en ont fait un allié précieux; Dr. Isabelle Dufort qui a participé régulièrement à la résolution des problèmes rencontrés en laboratoire ainsi que l’exceptionnelle Dr. Julie Nieminen, simplement pour sa personnalité qui m’a permis d’apprécier encore davantage mon doctorat. Enfin, je dois ici ajouter mon conjoint, Éric, qui en plus d’être une personne extraordinaire dans ma vie de tous les jours, m’a apporté une aide professionnelle presque quotidienne par ses analyses bioinformatiques, les corrections d’anglais qui m’ont permis chaque fois de remettre des articles de meilleures qualités et surtout, ses nombreuses discussions sur mes projets de recherche. Ces quatre personnes ont joué un rôle majeur tout au long de mon doctorat mais également du point de vu personnel puisqu’ils sont aussi devenu des amis. Merci pour tout! xvii Un merci particulier à Isabelle Laflamme pour toute son aide lors des ponctions et la production des embryons 8 cellules mais surtout, pour toutes les heures de jasette qui rendaient la ponction beaucoup plus agréable. Merci également aux étudiants que j’ai côtoyés au cours de toutes ces années : Eve-Lyne Sylvestre, Florence Pagé-Larivière, Dany Plourde, Élise Mondou, Isabelle Gilbert, Audrey Bunel, Anne-Laure Nivet, Ernesto Orozco-Lucero, Annie Girard, Julietta Caballero, Carolina Macabelli, Maëlla Gohin, Nicolas Guillemin, Luis Baldoceda, Angus Macaulay et Habib Shojaei Saadi. Comme je l’ai mentionné au début des remerciements, l’enseignement a toujours eu une place importante dans ma vie et je voudrais remercier toutes les personnes qui m’ont offert des opportunités incroyables d’enseignement au cours de mes études. Premièrement, je voudrais remercier Robert Chartrand avec qui tout a commencé. L’assistance dans les laboratoires d’Anatomie et physiologie animales, la mise en place d’une nouvelle section d’histologie puis la chance inouïe que j’ai eu à te remplacer durant ton année sabbatique ont été des moments exceptionnels dans ma vie. Merci de m’avoir fait confiance et de m’avoir offert cette chance alors que je n’étais qu’une étudiante de premier cycle à l’époque. Milles merci également à Dr. Éric Philippe qui a cru en moi et m’a offert de nombreuses possibilités d’enseignement en histologie et surtout, bonheur! en embryologie. Ces expériences ont marquée ma vie. Que ce soit en médecine dentaire, en sciences biomédicales ou en biologie moléculaire, mon passage à la faculté de médecine m’aura permis d’élargir mon réseau et d’améliorer mes compétences en enseignement, tout cela, grâce à votre confiance. Un grand merci également à Dr. Janice Bailey et Dr. Michel Lefrançois qui m’ont offert ma première charge de cours complète dans une matière que j’adore, l’anatomie et physiologie animales. Avoir ma première cohorte d’étudiants et les voir évoluer durant toute la session a été très stimulant et surtout, de vivre cette passion durant la partie la plus difficile de mon doctorat m’a beaucoup aidé à passer au travers et à apprécier cette période. Je souhaite de tout cœur avoir l’occasion de poursuivre l’expérience dans les prochaines années. Même si cela peut sembler étrange, la plus belle chose que m’a apportée mon doctorat a été de redécouvrir mon père, Raymond, et de renouer avec lui. Au cours des dernières années, j’ai eu l’occasion de comprendre ce que ma mère m’a écrit dans sa lettre posthume «C’est xviii le talent qui va te permettre de rejoindre ton père ». Finalement, j’ai définitivement suivi tes traces puisque j’ai même pu avoir l’honneur de te remplacer en tant qu’enseignante en embryologie. J’ai adoré nos dîners en tête à tête et nos conversations passant du coq à l’âne qui aurait essoufflé toute autre personne présente! Merci pour tout le transfert de connaissance, merci pour tous les conseils tant en enseignement qu’en recherche, merci pour ta ‘supervision’ lors de mes milles projets de rénovation, merci pour ton support! Merci également à ma mère, Suzanne, pour tout l’amour qu’elle m’a donné au cours de mes 11 premières années de vie. Cet amour immense a réussi à me porter jusqu’aujourd’hui et pour les années futures. Merci à ma sœur, Catherine, qui sera toujours là pour moi comme je serai toujours là pour elle. Merci également à mes ‘familles adoptives’, Nathalie, Normand, Kassandra et Myriam ainsi que Lucie et Marie-Hélène qui m’ont supporté dans les moments les plus difficiles. Merci à ma belle-famille : Mamie Francine qui sera bientôt Grand-Maman pour la première fois et Maxime que j’ai appris à apprécier énormément (même ton terrible sarcasme). Je vous aime énormément. Pour terminer, je voudrais remercier ma petite famille. Même si je t’ai déjà remercié, je veux encore te dire merci Éric de faire partie de ma vie et pour toutes les autres raisons aussi nombreuses qu’évidentes. Merci à ‘Ti-Pou’, mon fils qui naîtra dans les prochains jours et que j’aime déjà de tout mon cœur. De te porter en moi durant les derniers mois a été l’élément le plus encourageant pour terminer mon doctorat ‘à temps’ pour pouvoir te consacrer tout mon temps. Et finalement, merci à Roxie et Vénus, mes deux amours canins qui réussissent toujours à ramener un sourire à mes lèvres même dans les temps difficiles. xix Avant-propos Chapitre 1 : Sara Scantland est l’unique auteure du chapitre 1. Certaines sections des souschapitres «Transcription dans l’ovocyte et l’embryon précoce» et «Régulation de la traduction des ARNm maternels» correspondent à une traduction générale de l’anglais de certaines sections rédigées par Sara Scantland dans le chapitre de livre publié sous la référence :Sara Scantland*, Angus Macaulay * and Claude Robert, RNA Processing During Early Embryogenesis: Managing Storage, Utilisation and Destruction in the book «RNA Processing» edited by Paula Grabowski, University of Pittsburgh, USA, ISBN 978-953307-557-0, InTech, August 8, 2011. * Les deux auteurs ont contribués de façon équivalente à ce manuscrit. Le chapitre 2 est un manuscrit publié. Le chapitre 3 et le chapitre 4 seront soumis sous la forme d’un seul article qui n’a pas encore été soumis pour publication. Chapitre 2 : Scantland S, Grenon JP, Desrochers MH, Sirard MA, Khandjian EW, Robert C. BMC Dev Biol. 2011 Feb 15;11:8. Method to isolate polyribosomal mRNA from scarce samples such as mammalian oocytes and early embryos Dans cet article, Sara Scantland a effectué la majorité des expériences incluant le développement de la méthode, l’évaluation de la robustesse de la méthode ainsi que toutes les expériences en contexte biologique. Elle a également rédigé le manuscrit. Jean-Philippe Grenon a testé les conditions préliminaires pour la préparation des ARNm exogènes et la préparation des ovocytes, il a validé la linéarité du gradient et a déterminé les conditions optimales d’hybridations des micropuces. Marie-Hélène Desrochers a effectué certains des immunobuvardage. Dr. Edward W. Khandjian a fourni une expertise en polyribosomes et a aidé à la rédaction du manuscrit. Dr. Claude Robert a conçu l’étude, a supervisé les étudiants gradués et a aidé à la rédaction du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final. Chapitre 3 : Sara Scantland, Gaël Cagnone, Éric Fournier, Carolina H. Macabelli, Dominic Gagné, Claude Robert. Polyribosomal mRNA analysis reveals quietness acquisition during bovine oocyte maturation. xxi Dans cet article, Sara Scantland a effectué toutes les expériences, excepté certains QPCR. Elle a également rédigé le manuscrit. Dr. Gaël Cagnone a participé à la conception de l’étude, a fourni une expertise en métabolisme cellulaire et a participé à la récolte des échantillons. Éric Fournier a réalisé toutes les analyses statistiques et a participé à la correction linguistique du manuscrit. Carolina H. Macabelli a réalisé la majorité des QPCR. Dominic Gagné a participé à la supervision technique des étudiants gradués. Dr. Claude Robert a participé à la conception du projet. Chapitre 4 : Sara Scantland, Éric Fournier, Dominic Gagné, Claude Robert. Alternative ATP source during bovine oocyte maturation. Dans cet article, Sara Scantland a effectué toutes les expériences et rédigé le manuscrit. Dominic Gagné a offert une supervision technique. Éric Fournier a aidé à la rédaction du manuscrit et à sa correction linguistique. Dr. Claude Robert a supervisé l’étudiante graduée. xxii 1. Chapitre 1. Introduction à la maturation ovocytaire et au développement précoce 1.1 L’OVOCYTE 1.1.1 Origine et migration des cellules germinales primordiales Les cellules germinales primordiales (PGC, primordial germ cell) proviennent de l’ectoderme embryonnaire. Cependant, elles migrent rapidement vers l’allantoïde et le sac vitellin, deux annexes extra-embryonnaires, et y demeurent durant une période spécifique à chaque espèce avant de migrer à nouveau vers les crêtes génitales en formation (Figure 11). La forte activité phosphatase alkaline (AP) des PGC a permis d’étudier leur migration chez plusieurs espèces. Cependant, si l’AP est un marqueur efficace des PGC, elle n’est pas essentielle à leur développement. Chez la souris, les PGC sont observées pour la première fois autour du jour embryonnaire E7.5 alors qu’elles forment une grappe d’une quarantaine de cellules situées à la base de l’allantoïde. Les PGC migrent à travers la ligne primitive pour envahir l’endoderme au niveau de l’intestin postérieur. Vers le jour E10.5, les PGC atteignent la crête génitale en formation [1]. Chez le bovin, les premières PGC potentielles ne sont observées qu’au jour E18 dans l’embryon au disque embryonnaire tridermique, dans la portion proximale du sac vitellin. Entre les jours E23 et E25, la majorité des PGC sont retrouvées au niveau de l’intestin postérieur où se développeront, à partir du jour 27, les futures crêtes génitales [2]. Chez l’humain, malgré la durée très semblable de la grossesse chez la femme et de la gestation chez la vache, le processus de migration des gamètes est légèrement décalé et allongé. Les PGC apparaissent près de l’allantoïde au jour E24 chez l’humain et colonisent les gonades au début de la 5ème semaine de développement [3]. Durant ces quelques jours (voire semaines) les PGC subissent de nombreuses mitoses, et ce dans toutes les espèces. Chez la souris, on compte environ 24 000 PGC dans les crêtes génitales suite à leur colonisation [4] alors qu’on en compte environ 1000 chez le bovin [2]. 1 Figure 1-1 Migration des cellules germinales primordiales chez l’humain. A) 2è semaine de développement, les cellules germinales primordiales ne sont pas différenciées, elles originent de l’épiblaste B) 3 à 6 semaines de développement, les CGP migrent à l’extérieur du corps de l’embryon pour se situer près de l’allantoïde C) Entre la 5e et la 12e semaines de développement, les CGP migrent vers les crêtes génitales. A et B) Reproduit avec la permission de Dr. Raymond Marchand, C) Image tirée de [5], reproduit avec permission. Le mode de déplacement des PGC est encore sous étude et plusieurs théories ont été proposées pour l’expliquer. La théorie la plus connue est celle de la migration active des 2 PGC par mouvement amiboïde, dirigée par des chimio-attractants et en interaction avec la matrice extracellulaire. Le principal chimio-attractant serait Kit ligand (KL), aussi connu sous le nom de Stem-cell factor (SCF). KL stimule la réorganisation du cytosquelette et la production de filopodes, permettant d’initier le mouvement amiboïde des PGC. Il agit également sur la voie de signalisation PI3K, favorisant l’activation de la machinerie migratoire des PGC [6]. Plusieurs membres de la famille des protéines Bone Morphogenetic proteins (BMP), sécrétés par les annexes extra-embryonnaires, seraient à l’origine de l’induction des PGC [7]. La voie de signalisation BMP serait essentielle à la survie et à la migration des cellules germinales primordiales jusqu’à leur colonisation des futures gonades. Ce serait entre autres la voie de signalisation BMP qui permettrait l’expression du chimio-attractant KL [8]. La voie de signalisation Wnt serait également essentielle à la migration des PGC. Le récepteur tyrosine kinase-like Ror2 serait une cible de cette voie de signalisation. Ror2 serait un facteur permissif dans la réponse des PGC aux chimio-attractants [9]. Plusieurs PGC ont été observées dans le système circulatoire de l’embryon, menant à l’idée que ce moyen de transport pouvait être utilisé pour mener les PGC à destination. Il semble que les espèces aviaires privilégient cette méthode de migration des PGC. Chez le poulet, les PGC sont initialement retrouvées dans une région antérieure à la tête puis entrent dans la circulation sanguine en concomitance avec la formation du système vasculaire embryonnaire. Plus tard, les PGC vont activement quitter les vaisseaux sanguins pour migrer le long du mésentère dorsal et coloniser les crêtes génitales [10]. Cependant, puisque le cheminement des PGC est très différent chez ces espèces, il peut être difficile de comparer les oiseaux aux mammifères. Pour l’instant, la théorie de l’utilisation du système sanguin comme mode de transport des PGC chez les mammifères n’a pas encore été prouvée. La théorie très controversée de l’équipe de Jonathan L. Tilly est basée sur ce possible transport des cellules germinales par le sang [11, 12]. Selon cette théorie, la transplantation de moelle osseuse d’un donneur sain permettrait de rétablir la production d’ovocytes chez les souris stérilisées suite à des traitements de chimiothérapie. Ainsi, les cellules souches présentes dans la moelle osseuse pourraient recoloniser l’ovaire grâce au transport sanguin périphérique et permettre la production de nouveaux ovocytes. 3 Cependant, la communauté scientifique demeure particulièrement sceptique face à ces résultats puisque plusieurs conclusions seraient inexactes ou incomplètes [13-15]. Une autre théorie expliquant la distribution spatiotemporelle des PGC dans le conceptus tente toutefois d’invalider la théorie de la migration active des PGC sans, non plus, appuyer la théorie du transport sanguin. Elle affirme que chez l’embryon bovin, la migration active des PGC est inutile dû au développement morphologique de l’embryon. Le déplacement des PGC de la région caudale du sac vitellin (jour embryonnaire E18) jusqu’au mésonéphros, site des futures gonades (E23) peut être expliqué par les plicatures de l’embryon. Ces plicatures permettent à l’embryon de passer de la forme de disque tridermique à un corps embryonnaire cylindrique. Durant ce processus de plicature, les PGC situées dans le sac vitellin se retrouvent incorporées dans l’embryon lorsqu’une portion du sac se transforme en intestin moyen et postérieur. Ainsi, lorsque les crêtes génitales apparaissent au jour E27, elles contiennent déjà des PGC présentes depuis le tout début. Aucune migration active ne serait nécessaire pour expliquer cette colonisation [2]. Après avoir colonisé les crêtes génitales, les PGC poursuivent leurs mitoses afin de créer le réservoir définitif d’ovogonies estimé à 2,7 millions chez la vache [16] et à sept millions chez la femme [17]. Cependant, ce nombre diminue fortement durant la gestation pour atteindre en moyenne 68 000 ovocytes chez la vache et environ un million chez la femme à la naissance. Contrairement aux gamètes mâles qui sont produites de façon continue par un processus inépuisable, le processus de formation des gamètes femelles est discontinu et non renouvelable. Chez la femme, les ovogonies vont initier le processus de méiose entre la 10ème et la 11ème semaine fœtale où on les retrouve majoritairement au stade leptotène. Par la suite, malgré le fait que tous les ovocytes ne sont pas synchronisés, on peut évaluer leur progression dans la prophase I de la méiose. On observe les premiers ovocytes aux stades zygotène et pachytène vers la semaine embryonnaire 10.5 et 11.5 respectivement et les premiers ovocytes au stade diplotène vers la 12ème semaine [18]. À ce stade, les ovocytes subiront le premier arrêt méiotique. Ce stade correspond également à l’apparition des cellules folliculaires autour de l’ovocyte et à la formation du follicule primordial. Alors que le follicule poursuivra son développement, la méiose demeurera en latence. Ainsi, peu importe leur stade folliculaire à la naissance, tous les ovocytes sont arrêtés au stade 4 diplotène de la prophase I de la méiose. Ils demeureront sous cette forme jusqu’à la puberté où, suite au pic de LH, les ovocytes sélectionnés pourront reprendre le processus méiotique. L’acide rétinoïque (AR) est une molécule clée dans l’initiation de la méiose [19-21]. Produite par le mésonéphros tant chez le mâle que chez la femelle, il est rapidement dégradé chez le mâle par l’enzyme spécifique CYP26B1, inhibant la reprise de la méiose et forçant plutôt l’entrée des PGC en phase G0/G1 du cycle mitotique. L’absence de CYP26B1 dans l’ovaire permet le maintien d’une forte dose d’AR qui induit l’entrée en méiose des ovocytes [21]. Selon de récentes études, il semble même que la production ovarienne d’acide rétinoïque serait suffisante pour initier la méiose, la production par le mésonéphros serait donc superflue [22]. 1.1.2 Folliculogenèse L’accumulation de cellules somatiques autour de l’ovocyte pour former un follicule est essentielle à sa survie. Chez les rongeurs, la folliculogenèse ne débute qu’après la naissance [23] alors que chez l’humain et le bovin [18, 24], elle est initiée durant la période embryonnaire. Les PGC qui existaient alors sous forme de grappes de plusieurs ovocytes, sous forme de syncytium où les connections intercellulaires permettaient des échanges d’organelles entre les ovocytes adjacents, se séparent et s’entourent individuellement de cellules folliculaires [25]. Chez le bovin, les premières cellules folliculaires, les cellules de granulosa, apparaissent vers le jour E74, donnant naissance au follicule primordial [24, 26]. Ces quelques 5 à 8 cellules de granulosa sont initialement aplaties et entourent un ovocyte ovoïde plutôt que sphérique d’un diamètre d’environ 30 μm pour former un follicule de moins de 40 μm. Les cellules de granulosa adjacentes peuvent communiquer entre elles par des jonctions communicantes (gap junction) [27]. L’apparition du follicule correspond au moment du premier arrêt méiotique et tous les ovocytes se retrouvent au stade diplotène de la prophase I de la méiose. Le mécanisme induisant la formation du follicule primordial est peu connu mais il est indépendant de la concentration en FSH, l’ovocyte ne possédant pas de récepteur à cette hormone [24]. Avec la croissance du follicule, on observe l’apparition de plusieurs couches de cellules de granulosa, de la zone pellucide, d’une membrane basale et de couches cellulaires supplémentaires vascularisées et innervées, les cellules de la thèque. Les follicules ont été catégorisés selon ces étapes de développement (Figure 1-2). 5 Follicule primaire Chez le bovin, le follicule primaire est observé pour la première fois dès le jour E91. L’ovocyte contenu dans le follicule primaire est sphérique et une couche simple de 8 à 20 cellules de granulosa cuboïdes l’entoure complètement. On observe pour la première fois l’apparition de quelques petites sections de zone pellucide entre l’ovocyte et les cellules de granulosa en division [27]. Alors que l’ovocyte croît peu, le diamètre du follicule peut doubler et mesure généralement entre 40 et 80 μm [28]. Follicule secondaire Le follicule secondaire, d’un diamètre de 80 à 130 μm, est caractérisé par une double couche partielle ou complète de cellules de granulosa cuboïdes. Il est observé pour la première fois chez le bovin vers le jour E120. De grandes régions de l’ovocyte peuvent être couvertes de zone pellucide. Les cellules de granulosa en contact avec l’ovocyte sont pourvues d’extensions qui entrent en contact avec l’ovocyte formant des jonctions communicantes favorisant les échanges [27]. Quelques capillaires sanguins sont observés autour des follicules secondaires et deviennent particulièrement apparent autour du jour E160 [24]. Follicule tertiaire Plusieurs couches de granulosa entourent maintenant l’ovocyte du follicule tertiaire qui peut atteindre un diamètre allant jusqu’à 250 μm [28]. On observe déjà l’apparition de quelques espaces lacunaires entre les cellules de granulosa. L’ovocyte est maintenant complètement entouré de la zone pellucide, traversée par les prolongements cellulaires des cellules de la corona radiata, la couche de cellules folliculaire directement en contact avec l’ovocyte [27]. Quelques petits follicules pré-antraux peuvent apparaître durant la période embryonnaire à partir du jour E150 [24]. Follicule antral À partir du stade antral, on parle de croissance folliculaire terminale. Les follicules deviennent dépendants des gonadotrophines pour poursuivre leur développement [29-32]. Les premières vagues de follicules antraux apparaissent donc à la puberté durant les premiers cycles hormonaux. Chez la vache, on observe pour la première fois des follicules antraux vers l’âge de 5 mois [33]. La formation de l’antre permet de faire la distinction 6 entre les cellules de granulosa murales, près de la paroi du follicule, et les cellules de cumulus qui entourent l’ovocyte [34]. Durant la croissance folliculaire terminale, une forte activité transcriptionnelle est observée dans l’ovocyte pour permettre l’accumulation finale des transcrits nécessaires au programme embryonnaire précoce. Cette activité transcriptionnelle sera tranquillement réduite pour être totalement inhibée lorsque l’ovocyte atteint sa taille finale. Chez la souris, cela se produit peu avant l’ovulation [35-37] alors que chez le bovin, l’arrêt transcriptionnel se produirait plus tôt dans des follicules aussi petits que de 1,5 à 6 mm [35, 38-41]. L’acquisition de la compétence au développement apparaît lorsque le follicule bovin atteint une taille de plus de 2 mm [42, 43]. À ce moment, l’ovocyte a atteint sa taille mature approchant 120 μm et a accumulé tous les transcrits nécessaires à la maturation, la fécondation et à la réalisation du programme embryonnaire précoce [37]. Figure 1-2 Représentation schématique des différents stades de croissance des follicules. Image tirée de [44]. Droit de reproduction libre. 7 &\FOH°VWUDO &KH]OHERYLQRQREVHUYHGHX[jWURLVYDJXHVIROOLFXODLUHVGXUDQWXQF\FOH°VWUDO>@YRLU )LJXUHSRXUUHSUpVHQWDWLRQG¶XQF\FOHjWURLVYDJXHV'XUDQWFKDTXHYDJXHIROOLFXODLUH XQHFRKRUWHGHIROOLFXOHVG¶HQYLURQPPHW SRVVpGDQW OHUpFHSWHXUjOD)6+pFKDSSHQW j O¶DWUpVLHHWVRQWUHFUXWpVSRXUHQWUHUGDQVXQHSKDVHGHFURLVVDQFHWHUPLQDOHGpSHQGDQWHGH FHWWH KRUPRQH JRQDGRWURSH &HSHQGDQW HQ SRXUVXLYDQW OHXU FURLVVDQFH OHV IROOLFXOHV VpFUqWHQW GH SOXV HQ SOXV G¶°VWUDGLRO HW G¶LQKLELQH GHX[ KRUPRQHV SURYRTXDQW XQH UpWURDFWLRQQpJDWLYHVXUODVpFUpWLRQGH)6+,OVHSURGXLWDORUVXQHpWDSHGHVpOHFWLRQTXL UpGXLWOHQRPEUHGHIROOLFXOHVTXLYRQWSRXUVXLYUHOHXUFURLVVDQFH&KH]OHVHVSqFHVPRQR RYXODQWHV WHOOHV TXH OD YDFKH HW OD IHPPH XQ VHXO IROOLFXOH OH IROOLFXOH GRPLQDQW VHUD VpOHFWLRQQp>@'LIIpUHQWHVWKpRULHVWHQWHQWG¶H[SOLTXHUODVpOHFWLRQGXIROOLFXOHGRPLQDQW 2QVXSSRVHTXHVHXOOHIROOLFXOHTXLWROqUHOHVSOXVEDVQLYHDX[GH)6+SHXWVXUYLYUHDORUV TXH OHV DXWUHV HQWUHQW HQ O¶DWUpVLH &HWWH WROpUDQFH DX IDLEOH QLYHDX GH )6+ SHXW rWUH H[SOLTXpH SDU O¶DFTXLVLWLRQ GH UpFHSWHXUV j OD /+ GDQV OHV FHOOXOHV GH JUDQXORVD HW SDU O¶DXJPHQWDWLRQ GX WDX[ GH FHWWH KRUPRQH VXLWH DX[ VpFUpWLRQV G¶°VWUDGLRO SDU OHV JURV IROOLFXOHV¬SDUWLUGHFHPRPHQWODVXUYLHGXIROOLFXOHGRPLQDQWVHUDLWDVVXUpHSDUOD/+ SOXW{WTXHSDUOD)6+DORUVTXHOHVIROOLFXOHVSOXVSHWLWVHWSRVVpGDQWVPRLQVGHUpFHSWHXU /+VHUDLHQWYRXpVjO¶DWUpVLH>@ )LJXUH5HSUpVHQWDWLRQGXF\FOH°VWUDOjWURLVYDJXHVFKH]ODYDFKH 8 On observe les taux relatifs des hormones du cycle cellulaire ainsi que la croissance et l’atrésie des follicules durant les vagues folliculaires. Reproduit avec la permission de Audrey Bunel. Cependant, tous les follicules dominants ne subissent pas l’ovulation. Seule la dernière vague du cycle mènera à l’expulsion d’un ovocyte puisque les premières vagues se produisent en présence de progestérone. Cette hormone, sécrétée par le corps jaune produit lors du cycle précédent, prévient la décharge finale de LH nécessaire à l’ovulation [45, 51]. 1.1.3 Ovogenèse Morphologie de la maturation ovocytaire La morphologie des ovocytes est amenée à changer durant la croissance et la maturation ovocytaire. Afin de mieux définir les changements qui se produisent et être à même de déterminer le niveau de développement des ovocytes par l’observation de leur phénotype, plusieurs phases ont été caractérisées [27, 39, 41]. Différents termes peuvent être utilisés pour chacune des phases mais les mêmes caractéristiques ont été observées par différents auteurs. De façon générale, on peut caractériser les ovocytes des phases GV0 à GV3 (ou GV4 selon les auteurs) selon leur niveau de développement et leur compétence à produire un embryon viable. La phase GV0 correspond à des ovocytes en pleine croissance encore très actifs au niveau de la transcription. On les retrouve dans les petits follicules antraux de moins de 0,7 mm jusqu’à 1,5 mm [39]. En pleine période d’accumulation de transcrits, la chromatine est retrouvée sous forme de filaments diffus, bien décondensée. Le noyau est retrouvé près du centre de l’ovocyte et son enveloppe est bien lisse. Les organelles sont dispersées dans le cytoplasme, de même que les granules corticaux. Les mitochondries présentes sont rondes et distribuées en grappes [27, 41]. Leur forme laisse supposer qu’elles sont encore actives. À la surface de l’ovocyte, on observe des microvillis dressés qui s’étendent dans la zone pellucide [27]. Ces ovocytes sont caractérisés par une très faible capacité, in vitro, à compléter la méiose et gagneraient à subir une phase de ‘pré’-maturation pour accélérer leur croissance et leur permettre d’acquérir la compétence au développement [52]. À partir de la phase GV1, on observe une condensation progressive de la chromatine accompagnée d’une réduction graduelle de la transcription. On retrouve les GV1 dans des 9 follicules antraux moyens, à partir de 1,5 mm. Le noyau se rapproche tranquillement de la zone pellucide et on observe une légère ondulation de la membrane nucléaire, signe de l’initiation de la maturation nucléaire. Les organelles se déplacent vers le cortex de l’ovocyte et le cytoplasme se rempli progressivement de vésicules laissant de moins en moins de matrice cytoplasmique. C’est à ce stade qu’on observe une subtile apparition de l’espace périvitellin provoquant la libération des microvillis de la zone pellucide [27, 41]. En GV2, la chromatine se condense davantage et forme des amas bien visible se rapprochant du nucléole. La transcription est de moins en moins active et on observe une ondulation marquée de la membrane nucléaire, particulièrement du côté faisant face à la zone pellucide puisque le noyau est maintenant situé en périphérie de l’ovocyte. Les mitochondries ont subies d’importantes modifications morphologiques [27, 41]. Alors qu’elles étaient bien rondes en GV0, la majorité prennent maintenant une forme encapuchonnée, caractéristique de leur état peu actif et demeureront sous cette forme jusqu’à l’activation du génome de l’embryon [53]. Plusieurs organelles ont également subies des modifications. Les réticulums endoplasmiques sont beaucoup moins extensifs et on remarque une réduction considérable de l’appareil de Golgi. Les granules corticaux sont maintenant situés dans le cortex de l’ovocyte et présentent différents degrés de dégénération [41]. C’est à partir de GV2 que les ovocytes, contenus dans des follicules mesurant de 1,8 à 3 mm, commencent à acquérir la compétence à compléter la méiose [39, 52]. En dessous de cette taille, les ovocytes sont incapables de reprendre la méiose. Cependant, les follicules de moins de 3 mm sont incapables de se développer au-delà du stade embryonnaire de 8 cellules in vitro [54]. À partir du stade de GV3, la chromatine bien condensée n’est plus du tout permissive à la transcription. Elle se concentre principalement autour du nucléole et peut même l’encapsuler complètement. Les organelles sont maintenant regroupées dans le cortex de l’ovocyte. Le cytoplasme est rempli de vésicules et on observe plusieurs signes de dégénérescences cellulaires telles que la détérioration des granules corticaux et des régions sans organelle. L’ovocyte a atteint sa taille mature (environ 120 μm) et à partir de ce moment, seul le follicule poursuivra sa croissance [41]. La majorité des follicules sont 10 synchronisés sous forme de GV3 avant d’entreprendre la maturation ovocytaire, initiée par le bris de la vésicule germinale (GVBD). Afin de démontrer la présence ou l’absence de transcription durant la maturation ovocytaire et plus tard durant le développement embryonnaire, plusieurs études ont réalisés des marquages à l’uridine triciée ou autrement marquée (5’bromo-UTP). Ces études ont permis de démontrer la forte diminution de la transcription dans les ovocytes aux stades de GV1 et GV2 et l’inhibition globale dans les GV3 [41, 55]. Tout au long du processus de croissance, on assiste également à l’inactivation du nucléole, site de transcription des ARN ribosomaux. Cette inactivation se produit en parallèle avec l’encapsulation du nucléole par les amas de chromatine et sa vacuolisation, c’est-à-dire, l’apparition d’une grosse vacuole en son centre [41]. Cet arrêt de la production d’ARN ribosomaux suggère que l’ovocyte et l’embryon précoce ont un potentiel limité pour le renouvellement des ribosomes et la traduction. Cette théorie est appuyée par la faible quantité d’ARN ribosomaux 28S et d’un rapport anormal entre le nombre d’ARN ribosomaux 18S et 28S durant les premiers stades de développement [56]. Tableau 1-1 Caractéristiques associées à la maturation de l’ovocyte au stade de vésicule germinale. Tiré et modifié avec permissions. [41]. GV0 GV1 GV2 GV3 Localisation du noyau Excentré En périphérie En périphérie En périphérie Ondulation de l'enveloppe nucléaire Presque absente Légère Profonde Profonde Distribution des organelles Éparpillés Homogènes dans le cortex de l'ovocyte Homogènes dans le cortex de l'ovocyte En amas dans le cortex de l'ovocyte Espace périvitellin Absent Présent Présent Présent Microvillis Érigées Courbés Courbés Courbés Phénotype mitochondrial Rondes À capuchon À capuchon À capuchon Petits amas dispersés dans le cytoplasme Profondément dans le cortex Profondément dans le cortex En périphérie Localisation des mitochondries 11 Reprise méiotique Alors que l’ovocyte a acquis une certaine maturité durant sa croissance, une maturation finale est nécessaire chez le follicule dominant destiné à ovuler à la fin de la vague folliculaire du cycle œstral. Cette maturation finale est caractérisée par la reprise de la méiose et est initiée, chez les mammifères, par l’augmentation de la pulsatilité de l’hormone lutéinisante (LH, luteinizing hormone). La reprise de la méiose provoque la dissolution de la membrane nucléaire ou bris de la vésicule germinale (GVBD), l’expulsion du premier globule polaire puis un second arrêt méiotique en métaphase II. Les mécanismes de reprise de la méiose se retrouvent régulièrement sous la loupe des chercheurs. Malgré les nombreuses recherches et l’avancement des connaissances, plusieurs mystères entourant ce processus ont encore à être élucidés. Tel que mentionné précédemment, la reprise de la méiose in vivo est provoquée par l’augmentation de la pulsatilité de la LH vers la fin du cycle œstral. Le pic de LH provoque de nombreuses modifications cellulaires, la plus importante consistant au bris de la communication entre les cellules. Plus précisément, le pic de LH provoque le bris des jonctions communicantes par la phosphorylation et l’inactivation de la connexine 43 (Cx43), la principale molécule associée à l’assemblage des jonctions communicantes entre les cellules de granulosa [57]. Ce bris de communication aura des effets importants sur l’ovocyte, principalement en raison de l’arrêt de l’apport en AMPc. L’AMPc joue un rôle fondamental durant la maturation ovocytaire mais son rôle est bien différent entre les cellules de granulosa et l’ovocyte. Contrairement à l’ovocyte, les cellules de cumulus et de granulosa possèdent des récepteurs à la LH. Elles répondent au pic de LH par une augmentation marquée de la production d’AMPc due à la stimulation de l’adénylate cyclase. Avant le bris des jonctions communicantes, l’AMPc produit par les cellules de cumulus et de granulosa est continuellement transféré vers l’ovocyte et permet de maintenir celui-ci en arrêt méiotique. Hors, suite au pic de LH, on observe une augmentation transitoire d’AMPc dans l’ovocyte, provoquée par la surproduction d’AMPc par les cellules de cumulus, suivi par une diminution drastique suite au bris des jonctions communicantes. 12 Cette baisse des niveaux d’AMPc constitue le principal signal pour la reprise de la méiose [58, 59]. Le mode d’action de l’AMPc est intimement associé à son rôle dans l’activation de la protéine kinase A (PKA) [60] (voir Figure 1-4). La PKA régule directement 2 enzymes : elle active la kinase Wee1B et inhibe la phosphatase Cdc25. Wee1B et Cdc25 contrôlent la phosphorylation de CDK1 (Cyclin-dependant kinases, CDK), composante régulatrice du complexe MPF (Maturation Promoting Factor). La phosphorylation de CDK1 par Wee1B inactive le complexe MPF et inhibe la reprise de la méiose. Au contraire, Cdc25 déphosphoryle CDK1, ce qui active le MPF et initie la reprise de la méiose. Ainsi, avant le pic de LH, les hauts niveaux d’AMPc dans l’ovocyte stimulent la PKA qui maintient l’activité de Wee1B. Wee1B phosphoryle CDK1 qui inactive le MPF. Au moment de la reprise de la méiose, une chute importante d’AMPc intra-ovocytaire provoque l’inactivation de PKA. Cdc25, inhibée jusque-là par la phosphorylation induite par PKA, est activée et déphosphoryle CDK1, provoquant l’activation du complexe MPF (revue dans [61]. Le rôle de PKA ne s’arrête pas là. Il semble que la PKA ait directement un rôle dans la diminution d’AMPc en phosphorylant et activant la phosphodiestérase PDE3A. Les phosphodiestérase dégradent les nucléotides cycliques permettant de diminuer les taux d’AMPc dans l’ovocyte. Cette forte diminution d’AMPc provoque une boucle de rétroaction qui inactive la PKA. En résumé, la diminution d’AMPc est provoquée passivement par le bris des jonctions communicantes et activement par les phosphodiestérases. 13 )LJXUH5HSUpVHQWDWLRQGXPRGHG¶DFWLRQGX03) /D SKRVSKRU\ODWLRQ GH OD &'. SFGF SDU OHV NLQDVHV :HH0\W PDLQWLHQW OH 03) LQDFWLI DORUV TXH VD GpSKRVSKRU\ODWLRQ SDU &GF SHUPHW GH O¶DFWLYHU /¶DFWLYLWp GHV NLQDVHV HW SKRVSKRU\ODVHV HVW HOOHPrPH UpJXOpH SDU OH QLYHDX G¶$03F TXL SHUPHWWHQW GH PDLQWHQLU RX G¶LQKLEHU O¶DFWLYLWp GH OD NLQDVH 3.$ ,PDJH WLUpH HWPRGLILpH GH >@ 5HSURGXLW HW PRGLILp DYHF SHUPLVVLRQV (QXQHpTXLSHGHUHFKHUFKHDGpPRQWUpSRXUODSUHPLqUHIRLVTX¶LOpWDLWSRVVLEOHGH UpDOLVHU XQH PDWXUDWLRQ RYRF\WDLUH LQ YLWUR HQ LVRODQW O¶RYRF\WH GH VRQ IROOLFXOH UHSURGXLVDQW DLQVL OD GpFKDUJH GH /+ >@ &H IDLW YLHQW DSSX\HU O¶LGpH TXH OH SLF GH /+ SURYRTXH OD UXSWXUH GHV MRQFWLRQV FRPPXQLFDQWHV HQWUH O¶RYRF\WH HW OHV FHOOXOHV GH FXPXOXVDFWLYDQWWRXWXQSURFHVVXVPHQDQWjODUHSULVHGHODPpLRVH 03)HWIDFWHXUF\WRVWDWLTXH (Q SOXV GH &'. 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Il est donc crucial de réactiver rapidement le MPF par une production de novo de CCNB1 et une réactivation de CDK1. La protéine Mos (c-mos, pp39mos), le composant catalytique du facteur cytostatique (CytoStatic Factor, CSF), semble être essentielle à la réactivation de CDK1 et joue donc un rôle crucial dans l’inhibition de la duplication de l’ADN [65, 66]. Cette protéine apparaît après le bris de la vésicule germinale, augmente graduellement jusqu’en MII où elle provoque un second arrêt méiotique puis diminue abruptement au moment de la fécondation [67]. C’est la vague calcique produite au moment de la fécondation qui provoque l’inactivation du CSF et permet l’extrusion du second globule polaire [68] (Figure 1-5). En l’absence de Mos, le second arrêt méiotique n’a pas lieu et l’ovocyte expulse son second globule polaire, provoquant parfois une activation parthénogénétique de l’œuf qui peut alors se diviser jusqu’à atteindre 4 cellules [69]. 15 Figure 1-5 Ligne du temps de l’activité du MPF et du CSF. Activation relative du MPF et du CSF exprimé en unité arbitraire. On observe l’activation du MPF au moment de la reprise de la méiose, son inactivation au moment de la méiose 1 et les vagues d’activation/inactivation pour chaque cycle cellulaire. On observe également l’activation du CSF suite à la reprise de la méiose et sa disparition complète suite à la fécondation. Traduit et adapté de [70]. Reproduit et modifié avec permissions. Compétence au développement et atrésie folliculaire Plusieurs études se sont penchées sur le lien de plus en plus évident entre compétence au développement et atrésie folliculaire. En effet, même si cela peut paraître étonnant, les ovocytes présentant des signes légers d’atrésie seraient les plus compétents à reprendre la méiose et à poursuivre le développement embryonnaire [39, 54, 71-73]. La réduction de la taille de l’appareil de Golgi, l’ondulation de l’enveloppe nucléaire, la dégénérescence des granules corticaux et la présence de régions sans organelle sont toutes des caractéristiques phénotypiques associées à l’atrésie qui sont également associées à la compétence ovocytaire. La configuration de plus en plus compactée de la chromatine, corrélée avec les précédentes caractéristiques, pourrait représenter un pas de plus vers l’atrésie. La proportion d’ovocytes qui entreprennent la GVBD augmente significativement dans les follicules présentant des signes de faible atrésie [39]. Il semble même qu’un haut degré 16 d’atrésie ne serait pas détrimentaire pour la compétence ovocytaire [72]. Il en serait de même pour la production embryonnaire qui est augmentée dans les classes de follicules présentant quelques signes d’atrésie (ovoplasme légèrement granuleux et cumulus en expansion). Il semble également que la morphologie ovocytaire soit corrélée à la morphologie folliculaire. Les ovocytes en GV0 et GV1 seraient davantage retrouvés dans des follicules non atrétiques alors que les ovocytes en GV2 et GV3 seraient observés dans des follicules légèrement atrétiques [54]. 1.1.4 Fécondation La fécondation est un processus complexe où la fusion de l’ovocyte et du spermatozoïde, deux cellules haploïdes hautement spécialisées, est à l’origine de la première cellule d’un futur être. Plusieurs étapes sont nécessaires au bon déroulement de ce processus mais seul un rapide survol sera réalisé dans cette thèse. La première étape consiste en la fusion du spermatozoïde à la zone pellucide de l’ovocyte. C’est une glycoprotéine située sur la zone pellucide qui assure la spécificité de l’espèce : seuls les spermatozoïdes d’un mâle de la même espèce que celle de l’ovocyte peuvent se lier à cette glycoprotéine. Chez le bovin, c’est la protéine ZP3 qui joue ce rôle de spécificité alors que d’autres protéines ZP peuvent être impliquées chez d’autres espèces. La liaison du spermatozoïde à l’ovocyte provoque la fusion des membranes externe et interne de l’acrosome et la formation de pores dans la membrane cellulaire du spermatozoïde. Le contenu de l’acrosome, contenant entre autres de la hyaluronidase et de l’acrosine, sera déversé et permettra de dissoudre la zone pellucide pour la fragiliser et faciliter le passage du spermatozoïde. Plusieurs spermatozoïdes peuvent initier la réaction acrosomique mais normalement, un seul peut pénétrer l’ovocyte. La réaction corticale permet de protéger l’ovocyte contre la polyspermie. L’entrée du spermatozoïde provoque une cascade de signalisation, initiée par un flux calcique qui provoque la fusion des granules corticaux à la membrane externe de l’ovocyte. Les granules corticaux libèrent alors leur contenu dans l’espace périvitellin et provoque une modification de la protéine ZP3, inhibant l’attachement du spermatozoïde à l’ovocyte. De plus, suite à la fécondation, la membrane plasmique de l’ovocyte se rétracte davantage, rendant plus difficile la pénétration de spermatozoïdes additionnels. 17 Tel que mentionné plus haut, le flux calcique provoque également l’inactivation du facteur cytostatique et la reprise de la méiose, caractérisée par l’expulsion du second globule polaire. Ainsi, le spermatozoïde, en plus d’apporter le bagage génétique nécessaire au rétablissement de la diploïdie, est responsable de l’activation de l’œuf. Son seul apport supplémentaire est un centriole, le deuxième centriole étant apporté par l’ovocyte. 1.2 L’EMBRYON 1.2.1 Anatomie du développement précoce La première cellule, le zygote, est totalement indifférenciée et totipotente. Par multiplication cellulaire et par différenciation, le zygote est à l’origine de la formation de tous les tissus et de tous les organes, incluant les annexes embryonnaires qui assurent la survie de l’embryon durant la gestation. 1.2.2 Première semaine de développement La fécondation est un processus qui dure environ 28 heures chez le bovin et se termine par une première division mitotique pour former un embryon de deux cellules. Par la suite, les deuxième (2 à 4 cellules) et troisième (4 à 8 cellules) clivages sont très rapides et caractérisés par l’absence ou la forte réduction des phases G1 et G2 du cycle cellulaire, normalement dédiées à la synthèse d’ARNm. L’embryon duplique donc rapidement son génome (phase S) avant d’entrer à nouveau en mitose (phase M), ce qui prend environ 8 à 9 heures chez le bovin. Le quatrième cycle cellulaire (8 à 16 cellules) est beaucoup plus lent, dure environ 40 heures et correspond à une phase critique du développement embryonnaire précoce: l’activation du génome de l’embryon, qui sera détaillée dans la section 1.3.5 ‘Durée du silence transcriptionnel’. C’est le premier cycle cellulaire où sont présentes les quatre phases du cycle cellulaire normal : G1, S, G2 et M [74]. Par la suite, l’embryon poursuit ses divisions pour former un amas compact de cellules appelé morula, contenant de 32 à 64 cellules. Chacune des cellules embryonnaires est appelée un blastomère. Les premières divisions cellulaires chez l’embryon se font sans aucune augmentation de volume puisque l’embryon est toujours prisonnier de la zone pellucide rigide. Chaque clivage produit donc deux blastomères dont le volume individuel correspond à la moitié du volume de la cellule mère. C’est seulement au stade de blastocyste, après l’apparition d’une 18 cavité appelée blastocoèle, qu’on observe la première augmentation du volume, associé à une fragilisation de la zone pellucide puis à l’éclosion du blastocyste (Voir Figure 1-6). Chez le bovin, l’embryon atteint le stade de blastocyste vers la fin de la première semaine de développement. Figure 1-6 Progression des premiers stades embryonnaires précoces. A) Ovocyte au stade de GV B) Embryon 2 cellules C) Embryon 4 cellules D) Embryon 6 cellules E) Embryon 8 cellules F) Morula G) Blastocyste H) Éclosion du blastocyste I) Blasctocyste éclos Figure produite par l’auteure Sara Scantland et Dr.Claude Robert. Chez l’humain, l’éclosion du blastocyste est rapidement suivie de l’attachement de l’embryon à la paroi utérine puis à son implantation directement à l’intérieur de la muqueuse utérine, une caractéristique propre aux humains, aux primates, aux rongeurs et aux lagomorphes (lapin, lièvre, pica) [75, 76]. Chez le bovin, l’embryon ne s’implantera jamais dans la muqueuse utérine mais s’attachera à la paroi par des projections des membranes fœtales jusqu’aux caroncules maternels. Le moment exact de l’attachement de l’embryon bovin demeure incertain. En 1927, Hammond affirmait que les membranes fœtales n’étaient toujours pas attachées à l’utérus maternel à la fin du premier mois de gestation [77]. En 1942, Winters soutenait plutôt que l’embryon s’attachait entre les jours 11 et 12 après fécondation alors que Kingman (1948) supposait qu’une union fragile des membranes embryonnaires à l’utérus était initiée entre les jours 15 et 19 post-fécondation [77, 78]. Une étude histologique de Melton (1951) soulignait qu’aucune membrane n’unissait l’embryon à la mère après 31 jours de gestation, qu’un attachement très fragile 19 pouvait être observé à 33 jours et que ce n’était qu’à partir de 35 jours que l’attachement entre les tissus chorioniques et les caroncules maternels étaient suffisamment profond pour permettre une union intime entre ces tissus [77]. Pour assurer la survie de l’embryon malgré la longue période avant son attachement, la reconnaissance maternelle de la gestation doit avoir lieu rapidement. Selon [79], l’attachement chez le bovin se produirait en 5 étapes : 1) l’éclosion, 2) le contact initial, 3) l’apposition, 4) l’adhésion et enfin 5) une invasion très limitée de l’endomètre. Chez le bovin, l’éclosion du blastocyste se produit aux environs des jours 9 à 10. Par la suite, l’embryon passe par une étape d’allongement où il prend une forme filamenteuse. Sa croissance est telle qu’il passe d’une forme ovoïde d’environ 2 mm au jour 13 à une longueur d’environ 6 cm au jour 16 puis de 20 cm au jour 19. Si le moment exact de l’attachement n’est pas encore connu, les chercheurs s’entendent que ce n’est qu’après cette date que le conceptus initie son attachement en s’apposant à la paroi endométriale et en développant des projections qui s’étendent jusque dans les glandes utérines [80-83]. 1.2.3 Poursuite du développement embryonnaire Le développement embryonnaire précoce englobe la première semaine de développement et se termine au moment où l’embryon, sous forme de blastocyste éclos, est prêt à s’attacher à la paroi utérine ou, in vitro, est prêt à être transféré dans l’utérus d’une mère porteuse. Chez l’humain, la phase embryonnaire correspond aux huit premières semaines de développement. Après ce temps, l’embryon est parfaitement formé et tous ses tissus et organes ont été modelés. Les semaines de développement subséquentes correspondent à la phase fœtale et seront caractérisées par une forte croissance et par la maturation des organes. La période embryonnaire et tout particulièrement les quatre premières semaines de développement correspondant à l’organogenèse représentent une période fort intéressante. Cependant, les objectifs de cette thèse se concentrent exclusivement sur le développement précoce et donc sur la première semaine de développement. Le développement embryonnaire subséquent ne sera donc pas abordé ici. 1.2.4 Structuration des cellules embryonnaires Lorsque l’embryon atteint le stade de morula, on assiste à un processus de compaction qui modifie les cellules embryonnaires et mène à une première différenciation. Les cellules 20 embryonnaires retrouvées au centre de l’embryon seront plus grosses que celles retrouvées en périphérie. On parle alors de macro-blastomères et de micro-blastomères. Suite à l’apparition du blastocœle au stade subséquent, les macro- et micro-blastomères se différencieront davantage pour former la masse cellulaire interne (Inner cell mass, ICM, également appelé bourgeon embryonnaire) et le trophoblaste, respectivement. La masse cellulaire interne permet la formation du corps de l’embryon ainsi que de quelques annexes embryonnaires (sacs amniotique et vitellin) alors que le trophoblaste ne formera que des annexes (chorion placentaire) [84]. 1.2.5 Destin cellulaire Dans plusieurs organismes, l’œuf possède déjà une certaine polarité établie durant l’ovogenèse, qui permet de déterminer les axes du corps de l’embryon. C’est le cas de la drosophile où l’établissement des axes antéro-postérieur (A-P) et dorso-ventral (D-V) est déterminé durant l’ovogenèse par la position de l’ovocyte par rapport aux cellules nourricières et selon la position de la vésicule germinale dans l’ovocyte. Les cellules nourricières, en syncytium avec l’ovocyte, ont un rôle majeur à jouer dans l’établissement du destin cellulaire en transférant des ARNm vers l’ovocyte. Ce transfert d’ARNm permettra d’établir un gradient d’ARNm et de protéines dans l’embryon dont la concentration spécifique permettra la détermination des segments corporels [85] (et revu dans [86]). Chez d’autres espèces, tel que le nématode C. elegans, la polarité de l’ovocyte n’est pas détectable avant la fécondation. Les axes embryonnaires seront déterminés au moment de la fécondation, le site d’entrée du spermatozoïde signalant le pôle postérieur de l’embryon. L’aster spermatique interagit avec le cortex ovocytaire voisin pour ségréger certaines protéines de polarité au pôle postérieur [87-89]. Chez le Xénope et l’ascidie, la polarité de l’embryon est déterminée avant et après la fécondation. Durant la maturation ovocytaire, un pôle animal et un pôle végétal apparaissent dans l’ovocyte, la position des chromosomes méiotique et le site d’extrusion des globules polaires définissant le pôle animal. Mais ce n’est seulement qu’au moment de la fécondation que seront déterminés les axes A-P et D-V grâce à l’entrée du 21 spermatozoïde. Celle-ci provoque une onde de contraction précisant l’axe D-V et introduisant le centrosome paternel, qui définit le côté postérieur [89]. Le cas des mammifères est beaucoup plus complexe car la détermination des axes embryonnaires s’exprime tardivement. Ce n’est qu’à partir du stade de blastocyste que l’on peut observer une réelle polarité et que le premier axe embryonnaire (dorso-ventral) peut être défini de façon claire. Tout comme les ovocytes de plusieurs autres espèces, les ovocytes de mammifères possèdent un pôle végétal et un pôle animal. Toutefois, celui-ci n’est pas aussi facilement visible à l’œil nu et n’est déterminé qu’au moment de l’expulsion des globules polaires, le site d’extrusion déterminant le pôle animal. Extrapolant sur les données obtenues chez les autres espèces, plusieurs auteurs ont tenté de découvrir une certaine polarité précoce associée au pôle animal-végétal et/ou au site de pénétration du spermatozoïde [90, 91]. Cependant, la communauté scientifique demeure mitigée face à ces résultats puisque plusieurs autres études les ont contredits [92-94]. Dans le même ordre d’idées, d’autres chercheurs ont affirmé que la destinée cellulaire est déjà établie suite au premier clivage. Les deux blastomères obtenus suite à cette division produiraient respectivement la masse cellulaire interne et le trophectoderme [95]. Encore une fois, ces résultats sont fortement controversés puisqu’il est possible d’éliminer l’une de ces deux cellules sans effet délétère sur le développement. En fait, jusqu’au stade de huit cellules, il est possible d’éliminer certaines cellules sans provoquer le moindre problème développemental, chaque cellule étant parfaitement totipotentes [96]. De même, des chimères formées de deux embryons huit cellules formeront des animaux normaux [97]. Ces observations contredisent l’idée que les axes embryonnaires pourraient être déterminés avant le stade de blastocyste. 1.3 LA TRANSCRIPTION DANS L’OVOCYTE ET L’EMBRYON PRÉCOCE 1.3.1 Transcription ovocytaire Une période de transcription active se produit durant la croissance de l’ovocyte et se termine lorsque l’ovocyte atteint sa taille mature. De fait, il semble que chez la souris 95% de l’ARNm soit accumulé durant la période où l’ovocyte passe de 65% de sa taille jusqu’à l’atteinte de sa taille mature [98]. Cette production importante de transcrits permettra d’accumuler et d’emmagasiner les ressources nécessaires à la maturation ovocytaire, à la 22 fécondation et aux premières étapes du développement précoce. Cette accumulation de transcrits modifie profondément les rapports ARNm/ARN totaux dans l’ovocyte par rapport aux cellules somatiques. Alors que les cellules somatiques sont normalement composées de 95% d’ARN ribosomaux (ARNr) et de quelques 5% d’ARNm, le pourcentage d’ARNm augmente drastiquement durant la croissance de l’ovocyte. Malgré ces quantités phénoménales de transcrits accumulés dans l’ovocyte, la difficulté d’obtenir de grandes quantités de matériel biologique est problématique lorsqu’on étudie l’ovocyte. Il reste donc difficile de mesurer la teneur en ARNm de ceux-ci avec les outils moléculaires disponibles actuellement. Cependant, plusieurs estimations ont été réalisées chez différentes espèces. Ainsi, on estime à 350 pg la quantité d’ARNm présents dans l’ovocyte bovin [56], 330 pg chez l’humain [99] et 650 pg chez le porc [100]. Chez certaines espèces, les quantités peuvent être remarquables. Par exemple, on retrouve jusqu’à 15 ng d’ARNm dans l’ovocyte de lapin et plus de 1 μg dans certains œufs d’oiseaux [100]. 1.3.2 Mécanismes d’emmagasinage des transcrits Dans les cellules somatiques, la transcription des ARNm est généralement suivie par leur traduction en protéine pour une utilisation rapide. Cependant, puisque l’ovocyte doit accumuler une multitude de transcrits qui ne seront utilisés que plus tard durant la maturation ovocytaire, la fécondation ou les premières étapes du développement embryonnaire, il est nécessaire de les emmagasiner de façon à les protéger à la fois de la traduction et de la dégradation. Déadénylation des transcrits La première étape essentielle à l’emmagasinage des transcrits est leur déadénylation. Ceci permet probablement de les protéger de la traduction précoce. Cette étape est parfois régulée par de courtes séquences riches en adénylate et en uridylate présentes dans la région non-traduite située en 3’. Ces séquences sont appelés ARE (éléments riches en AU de l’anglais AU-Rich Elements). La séquence EDEN (embryo deadenylation element) est l’ARE le plus connu dans l’ovocyte et l’embryon précoce chez l’humain et le Xénope [101, 102] mais aucun homologue n’a été trouvé chez le bovin. Lorsque la protéine de liaison 23 ('(1ELQGLQJSURWHLQ('(1%3YLHQWVHOLHUjO¶$5(HOOHIDYRULVHOHUHFUXWHPHQWGHV GpDGpQ\ODVHVWHOOHVTXH3$51RXOHFRPSOH[H&&53RS1RW>@)LJXUH )LJXUH/DOLDLVRQGHODSURWpLQH('(1%3IDYRULVHOHUHFUXWHPHQWGHVGpDGpQ\ODVHV ('(1 (PEU\RQLF GHDGHQ\ODWLRQ HOHPHQW ('(1%3 (PEU\RQLF GHDGHQ\ODWLRQ HOHPHQW ELQGLQJSURWHLQ('(1%3VWLPXOHO¶DFWLYLWpGHOD3$51HQ]\PHHQURXJH5HSURGXLWHWPRGLILp DYHFODSHUPLVVLRQGH'U/XF3DLOODUG <%R[%3 'DQV OHV FHOOXOHV VRPDWLTXHV OD GpDGpQ\ODWLRQ SURYRTXH JpQpUDOHPHQW XQH GpJUDGDWLRQ UDSLGHGHO¶$51PPDLVGDQVO¶RYRF\WHHWO¶HPEU\RQRO¶HPPDJDVLQDJHGHVWUDQVFULWVHVW HVVHQWLHOLOVHPEOHTXHFHVGHX[pWDSHVVRLHQWWHPSRUHOOHPHQWVpSDUpHV3RXU\DUULYHUOHV $51PGRLYHQWrWUHLPPpGLDWHPHQWVWDELOLVpVHWSURWpJpVDILQG¶HPSrFKHUOHXUGpJUDGDWLRQ SDUOHVQXFOpDVHV8QHPpWKRGHHIILFDFHGHSURWHFWLRQFRQVLVWHjHPPDJDVLQHUOHVWUDQVFULWV VRXV IRUPH GH SDUWLFXOHV GH ULERQXFOpRSURWpLQHV 6RXV FHWWH IRUPH OHV WUDQVFULWV SHXYHQW DWWHLQGUHXQHGHPLYLHDOODQWMXVTX¶jMRXUV>@/HVSURWpLQHV<ER[VHPEOHQWFRQIpUHU FHWWH IRUWH VWDELOLWp DX[ $51P HPPDJDVLQpV HQ SOXV G¶LQKLEHU OHXU WUDGXFWLRQ /HXU PpFDQLVPH G¶DFWLRQ Q¶HVW SDV HQFRUH ELHQ FRPSULV PDLV QH VHPEOH SDV VSpFLILTXH j XQH VpTXHQFH SDUWLFXOLqUH /HV SUHPLqUHV UHFKHUFKHV VXU OHV <ER[ GDQV O¶RYRF\WH RQW pWp PHQpHVFKH];HQRSXVRO¶RQDGpFRXYHUWODSURWpLQH<%;DQFLHQQHPHQW)5*<>@ SXLV FKH] OD VRXULV R O¶RUWKRORJXH <%; DQFLHQQHPHQW 06< D pWp FDUDFWpULVp &HV SURWpLQHVVRQWUHWURXYpHVHQTXDQWLWpSKpQRPpQDOHGDQVO¶RYRF\WHDOODQWMXVTX¶jFRQVWLWXHU GHVSURWpLQHVHPPDJDVLQpHV >@/HPpFDQLVPHSHUPHWWDQW DX[SURWpLQHV <ER[GH VWDELOLVHUOHV$51PHPPDJDVLQpVHVWWRXMRXUVVRXVLQYHVWLJDWLRQPDLVLOHVWFRQQXTXHOD SKRVSKRU\ODWLRQ GH <%; FKH] OD VRXULV SHUPHW G¶HQ PRGXOHU OD IRQFWLRQ >@ $LQVL GXUDQWODFURLVVDQFHGHO¶RYRF\WHODOLDLVRQGHODSURWpLQH<%;DX[WUDQVFULWVSHUPHWGH 24 protéger ceux-ci de la dégradation. Après la reprise de la méiose chez la souris, YBX2 est phosphorylée par la kinase CDK1 provoquant une dégradation massive des transcrits maternels. Chez cette espèce, 90% des ARNm maternels sont dégradés au stade de deux cellules, l’activation du génome de l’embryon étant initiée dès le stade zygotique [108]. Cette dégradation des transcrits maternels serait essentielle puisqu’en inhibant leur dégradation, on bloque la transition maternelle-zygotique chez la souris [107, 109]. Le mécanisme équivalent est probablement plus complexe chez les grands mammifères puisque l’activation du génome de l’embryon survient à des stades subséquents et nécessite un contrôle plus séquentiel de la dégradation des transcrits maternels. De plus, certains ARNm maternel subsistent suite à l’AGE. Par exemple, les transcrits MATER, ZAR1, BMP15 et GDF9, d’origine maternelle, sont encore faiblement retrouvés au stade de morula et ce, malgré l’absence de transcription de novo suite à l’AGE [110]. Ceci suggère que la dégradation des ARNm maternels est plus progressive chez les grands mammifères. Granules d’ARN Afin d’assurer une protection supplémentaire aux ARNm maternels contre la dégradation, il est fort probable que les ribonucléoprotéines soient accumulées dans des granules d’ARN. Il existe différents types de granules permettant la protection, l’emmagasinage et/ou la dégradation des transcrits. De nombreuses protéines de différentes fonctions cellulaires s’y accumulent et agissent pour stabiliser l’ARNm ou, au contraire, initier sa dégradation. On y retrouve des protéines de liaison à l’ARN tel que YBX2 et CPEB (Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding), toutes deux associées à la stabilisation des transcrits, ainsi que DDX6, une hélicase jouant à la fois un rôle dans la stabilisation de l’ARN et dans l’inhibition de la traduction [111]. En revanche, on y retrouve également des protéines telles que DCP1A, une enzyme du complexe de décoiffage qui initie la dégradation des ARNm. Les granules d’ARN les plus communes dans les cellules de mammifères sont les processing bodies (P-bodies). Ces granules sont souvent associées à la dégradation des transcrits et accumulent toutes les enzymes nécessaires à l’enlèvement de la coiffe. Un 25 second type de granules, les granules de stress, permettraient également l’accumulation de transcrits tout en les protégeant contre la dégradation afin de pouvoir les rendre rapidement disponible en situation de stress. Pour éviter la dégradation des transcrits, les enzymes du complexe de décoiffage DCP1A seraient absentes des granules de stress. Dans les ovocytes de Xenopus tropicalis, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans et de Danio renio, des granules ‘germinales’ ont été caractérisées et semblent agir au niveau de la stabilisation des ARNm [112-114]. Par contre, chez les mammifères, la dynamique de tels granules d’ARN est moins connue. Basé sur la localisation de différents marqueurs, la présence de P-bodies a été confirmée dans les ovocytes immatures. On assiste toutefois à une diminution marquée de leur taille en parallèle avec la croissance de l’ovocyte et leur trace est indétectable lorsque l’ovocyte atteint sa taille mature. Par contre, cette disparition des P-bodies serait compensée par l’apparition de granules d’ARN subcorticaux contenant plusieurs protéines de liaison à l’ARN (entre autres YBX2, CPEB et DDX6) ainsi que des ARNm en dormance [111]. La disparition des P-bodies se produit en concomitance avec une forte diminution de l’enzyme DCP1A qui ne réapparait, chez la souris, qu’au moment de la reprise de la méiose. Cette disparition de DCP1A dans un moment critique d’emmagasinage des transcrits puis sa réapparition dans un moment de forte dégradation des transcrits correspond bien à sa fonction de décoiffage des ARNm en voie de dégradation [111]. 1.3.3 Arrêt de la transcription Il a été mentionné à plusieurs reprises que l’ovocyte arrête complètement toute activité transcriptionnelle lorsqu’il atteint sa taille mature. À première vue, il semble logique d’affirmer que la compaction graduelle de la chromatine observée durant la maturation ovocytaire puisse être la principale cause de l’inhibition de la transcription (Voir la section Morphologie de la maturation ovocytaire). La compaction limite considérablement la capacité transcriptionnelle en réduisant l’accès des protéines impliquées à l’ADN. Cependant, il semblerait que le remodelage de la chromatine ne soit pas indispensable pour réprimer la transcription puisqu’il est possible expérimentalement d’inhiber la compaction sans affecter le silence transcriptionnel [55]. Cette découverte implique la nécessité de mécanismes alternatifs pour inhiber la transcription. Ainsi, en plus de la compaction de la 26 chromatine, il semble que la transcription soit inhibée par l’inactivation de l’ARN polymérase II (RNAPII) et par l’inhibition de certaines phases du cycle cellulaire normal. Inactivation de RNAPII C’est le complexe de l’ARN polymérase II (RNAPII) qui est responsable de la transcription des ARNm chez les mammifères. Tant chez la souris que chez le porc, où l’activité de RNAPII a été évaluée, les chercheurs semblent s’accorder à l’idée que la polymérase devient inactive durant la maturation ovocytaire et provoquerait l’arrêt de la transcription [115-117]. Cependant, aucun consensus n’a été établi à savoir si RNAPII est dégradée ou simplement inactivée. Selon Abe (2010), RNAPII serait retrouvée sur 42% des gènes inactifs mais ne serait pas en mesure de transcrire les gènes dû à sa forme hypophosphorylée. La plus grosse sous-unité de RNAPII, RPB1, contient un domaine carbo-terminal (CTD, Carbo-terminal domain) qui peut être phosphorylé réversiblement durant le processus de transcription. Le CTD contient 52 répétitions d’un heptapeptide, Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser [118, 119]. Lorsque le CTD n’est pas phosphorylé, RNAPII peut être activement recrutée au site d’initiation de la transcription mais son activité est inhibée. La transcription peut être initiée lorsque la cinquième Ser est phosphorylée, mais une double phosphorylation en Ser2 et en Ser5 est nécessaire pour les étapes de d’élongation et d’épissage de l’ARNm [120, 121]. Corroborant cette idée, RNAPII est retrouvée à la fois sous forme phosphorylée et déphosphorylée dans les ovocytes en croissance (et donc transcriptionnellement actifs) alors que seul la forme déphosphorylée de RNAPII se retrouve dans l’ovocyte mature [115, 117]. Une autre étude avance plutôt l’idée qu’en plus d’être déphosphorylée, la sous-unité RPB1 de RNAPII serait carrément dégradée durant la maturation [116]. Cette conclusion a cependant été remise en question par des recherches ultérieures. Chez le porc, la sous-unité déphosphorylée a été détectée durant la métaphase I mais demeure indétectable au moment de la métaphase II. Cela suppose que RPB1, la sous-unité de RNAPII, est au moins partiellement dégradée durant la maturation ovocytaire [117]. Chez le bovin, il semble que la sous-unité déphosphorylée soit détectée durant la maturation ovocytaire et durant la première division embryonnaire mais serait graduellement dégradée lors des deuxième et troisième divisions embryonnaires [119]. Toutes ses caractéristiques supportent l’idée que l’ovocyte et l’embryon précoce sont 27 incapables de transcrire leur génome, la polymérase responsable de la transcription des ARNm étant inactive. Inhibition du cycle cellulaire En plus de la condensation de la chromatine et de l’absence d’une ARN polymérase efficace, le silence transcriptionnel se poursuivrait suite à la fécondation puisque les premiers cycles cellulaires ne se prêtent pas aisément à la synthèse de novo d’ARN. Que ce soit chez la drosophile [122], le xénope [123], le poisson zèbre [124] ou le bovin [125], il semble que les premières divisions cellulaires se produisent très rapidement et sans passer par les phases G1 et G2 du cycle cellulaire. Ces phases sont normalement dédiées à la synthèse d’ARN puisque c’est à ce moment que la chromatine se trouve dans un état décondensé et accessible pour la polymérase et les autres protéines nécessaires à la transcription. Avant l’activation du génome embryonnaire, les cycles cellulaires consistent principalement en une phase S suivie d’une phase M. Ce n’est qu’au moment de l’activation du génome de l’embryon que les phases G1 et G2 font leur apparition, augmentant drastiquement la durée du cycle cellulaire. La raison de l’absence des phases «gaps» est peu connue mais semble associée avec la régulation particulière des ARNm et des protéines maternelles avant l’activation de la transcription embryonnaire. L’absence de phase G1 pourrait être expliquée par la forte activité de la protéine CDK2 durant les premiers cycles cellulaires. Un excès de cette protéine pourrait provoquer l’initiation d’une nouvelle phase S dès la fin de la phase M, lorsque la cyclin B1 est dégradée et l’activité MPF inhibée [126, 127]. L’absence de phase G2 pourrait quant à elle être expliquée, entre autres, par la régulation de cdc25 [128, 129]. Cette protéine est normalement nécessaire à la progression de la phase G2 vers la phase M. Cependant, une expression importante et rapide de cdc25 dès que la synthèse d’ADN est complétée (phase S, phase de synthèse / duplication de l’ADN) provoquerait une initiation prématurée de la phase M (mitose). Après l’activation de la transcription embryonnaire, un changement dans l’expression de cdc25 permettrait 28 l’apparition d’une première phase G2. Lorsque l’activité de cdc25 est inhibée, une phase G2 peut apparaître avant l’activation de la transcription [126]. 1.3.4 Régulation de la traduction des transcrits emmagasinés Durant la période de répression de la transcription, les ARNm maternels sont rigoureusement régulés. Ceci est nécessaire pour permettre l’expression génique, aux moments spécifiques, des protéines essentielles à chaque étape du développement. Cette régulation se traduit par des modifications post-traductionnelles qui permettent l’activation de protéines ainsi que par la synthèse de novo de protéines à partir des ARNm maternels emmagasinés durant la croissance de l’ovocyte (Figure 1-8). Un exemple classique de contrôle de l’expression génique utilisant à la fois la traduction de novo et les modifications post-traductionnelles est la régulation de la reprise de la méiose par l’action du facteur MPF. Comme je l’ai mentionné à la section Reprise méiotique, ce complexe est composé de deux sous-unités : la ‘cyclin-dependant kinase’ (CDK1) et l’unité régulatrice, la cycline B1 (CCNB1) [130]. Deux étapes sont nécessaires afin d’activer le complexe et initier la maturation méiotique par le bris de la vésicule germinale. La première étape correspond à la synthèse de ces deux molécules si elles ne sont pas déjà présentes dans le cytoplasme de l’ovocyte. La deuxième correspond à l’activation du complexe. Selon les espèces, une des deux protéines est généralement présente dans le cytoplasme alors que l’autre doit être traduite au moment opportun pour initier la reprise de la méiose [131, 132]. La présence des deux sous-unités du MPF est nécessaire mais non suffisante pour assurer la compétence méiotique. La régulation post-traductionnelle est péremptoire pour activer le MPF par l’intermédiaire de la déphosphorylation de la sousunité CDK1. Ce type de fine régulation du recrutement des ARNm emmagasinés et des protéines est ubiquitaire et indispensable à la poursuite du développement précoce. La série d’évènements complexes qui permettent d’orchestrer le recrutement des ARNm maternels n’est pas bien comprise et demeure sous continuelle investigation. Une fois emmagasinés, les ARNm peuvent être recrutés pour la traduction. Toutefois, une grande partie d’entre eux seront simplement expédiés vers la voie de la dégradation (Figure 1-8). Il n’est pas encore déterminé si ces mécanismes de recrutement sont généraux, spécifiques ou une combinaison des deux. Cependant, considérant que le développement nécessite une 29 progression étape par étape, les ARNm ne peuvent être traduits ou dégradés en une seule et unique vague de recrutement. Il est donc probable que leur gestion soit effectuée par un mécanisme spécifique mais encore inconnu. Figure 1-8 La voie de l’ARNm dans l’ovocyte. La transcription de l’ARNm a lieu dans le noyau où il est épissé puis exporté au cytoplasme. Une fois rendu au cytoplasme, l’ARNm est déadénylé puis lié à des protéines qui le protègeront de la dégradation ou de la traduction précoce. Au cours de la maturation ou du développement précoce, certains ARNm seront sélectionnés pour la traduction et des ribosomes viendront s’y lier pour former les ARN polyribosomaux. Droit de reproduction libre. Pour revenir à l’exemple du complexe MPF, les cyclines doivent être régulées de façon chronologique durant le programme embryonnaire. La dégradation des cyclines à la fin de chaque cycle cellulaire est indispensable pour permettre l’inactivation des kinases dépendantes des cyclines (CDK). Cette inactivation est nécessaire afin de compléter les étapes essentielles que sont le démantèlement des fuseaux mitotiques, la cytokinèse et la transition vers la phase G1 [133]. Évidemment, de nouvelles cyclines doivent être 30 synthétisées avant chaque nouvelle division cellulaire. Jusqu’à l’AGE, cette synthèse de novo doit se produire par un processus précis de recrutement et de traduction des ARN emmagasinés afin d’assurer la présence des cyclines nécessaires au bon moment du développement précoce. De la même façon, certains ARN messagers doivent être dégradés à des moments spécifiques du développement. Par exemple, certains ARNm impliqués dans des évènements spécifiques de la méiose doivent être dégradés rapidement suite à la fécondation sans quoi leur présence pourrait devenir délétère pour le développement subséquent. C’est le cas du proto-oncogène Mos, qui est nécessaire pour réaliser le second arrêt méiotique en attendant la fécondation. La présence de Mos suite à la fécondation provoque rapidement l’arrêt du développement embryonnaire [134]. L’élimination de la protéine Mos n’est toutefois pas suffisante : les ARNm de Mos emmagasinés doivent également être rapidement dégradés après la fécondation, ce transcrit étant potentiellement nuisible pour le développement subséquent. Ces exemples tendent à indiquer que la gestion des ARNm maternels est probablement le fait de nombreux mécanismes d’action et non d’un seul processus global. Il semble en effet que les besoins spatio-temporels de l’embryon en protéines spécifiques nécessitent une variété de mécanismes de production. Jusqu’à maintenant, quelques mécanismes de régulation ont été découverts et seraient impliqués dans la régulation d’au moins une fraction des ARNm emmagasinés. Une section complète de cette thèse (section 1.4) sera consacrée aux mécanismes connus de régulation de la traduction. 1.3.5 La durée du silence transcriptionnel La durée du silence transcriptionnel varie entre les espèces. Alors que cette période est très courte chez la souris, elle peut durer plusieurs jours chez de nombreuses autres espèces. Chez la souris, le génome embryonnaire est activé dès la fin du stade zygotique. Selon Schultz [108], une activation mineure du génome de la souris se produit aussi tôt que le stade G2 dans le zygote alors que l’activation majeure du développement se produit au stade de deux cellules. Ainsi, la contribution des ARNm maternels n’est requise que pour supporter le premier cycle cellulaire. Il y a donc une différence importante entre la souris et les grands mammifères tels que l’humain, le porc, le bovin et les ovins où l’activation du 31 génome embryonnaire se produit beaucoup plus tard, vers la fin du troisième ou du quatrième cycle cellulaire. Chez d’autres organismes, les ARNm emmagasinés peuvent supporter jusqu’à 16 cycles cellulaires, ce qui correspond à plus de 30 000 cellules [135]. Il y a donc une différence importante entre les mammifères et les non-mammifères tels que les poissons, les amphibiens, les insectes et les oiseaux. Chez le poisson-zèbre (Danio Rerio), l’activation de la transcription est initiée au cours du 10e cycle cellulaire (entre 512 et 1024 cellules). Les neuf premiers cycles étant contrôlés par une horloge interne qui permet des clivages parfaitement synchronisés aux 15 minutes [136]. Chez Xenopus, l’embryon entreprend 12 clivages rapides (4096 à 8192 cellules) synchronisés aux 35 minutes avant qu’une transcription ne soit détectable [137]. Chez la drosophile, la transcription s’amorce durant le 14ème cycle cellulaire (8192 à 16 384 cellules) [138]. Le poulet représente un modèle extrême où la transcription est décelée pour la première fois durant le 16ème cycle cellulaire alors que l’embryon est constitué de 30 000 à 50 000 cellules [135]. Enfin, C. elegans représente également un cas extravagant. Si la transcription débute normalement dès le stade de 4 cellules, le vers peut se développer jusqu’à la gastrulation (28 cellules) avant de voir son développement embryonnaire affecté par une absence de transcription. Par la suite, quelques aberrations sont détectées mais le vers poursuit tout de même son développement jusqu’à atteindre environ 100 cellules. Ceci est particulièrement impressionnant sachant que le vers adulte ne possède que 558 cellules [139]! La grande variabilité observée entre les espèces dans le nombre de cycle cellulaire et le nombre de cellules requises pour initier la transition maternelle embryonnaire est remarquable. Elle est également tributaire de la grande quantité de ressources accumulées durant l’ovogenèse. Le temps total (en heure) écoulé avant l’AGE est également un aspect impressionnant de ce phénomène. Bien que la souris atteigne l’AGE dès le stade zygotique (on parle alors de transition maternelle-zygotique, MZT), il demeure qu’une période de 23 heures s’écoule entre la fécondation et l’observation d’une première activité transcriptionnelle. En ajoutant le temps écoulé entre la reprise de la méiose et son second arrêt au stade de MII, soit environ 10 heures, la période totale de silence transcriptionnel est de plus de 30 heures. Chez les grands mammifères, la période totale durant laquelle les ARNm maternels doivent être emmagasinés peut être encore plus longue. Chez le bovin, les ovocytes atteignent leur 32 taille mature alors que les follicules qui les contiennent mesurent environ 3 mm. Plusieurs de ces ovocytes ont déjà une chromatine hautement condensée et transcriptionnellement silencieuse [39]. Ce follicule de 3 mm devra atteindre la taille préovulatoire, ce qui peut prendre de 4 à 8 jours selon le nombre de vagues folliculaires (2 ou 3) observées durant le cycle. De plus, il faut considérer le temps nécessaire pour atteindre les autres étapes fondamentales du développement, c’est-à-dire le temps entre le pic de LH provoquant l’ovulation (1 jour), le temps alloué à la fécondation et le temps nécessaire pour le zygote à atteindre l’AGE, quelques 3 à 4 jours plus tard. Considérant cette chronologie et étant donné le fait que certains ARNm sont emmagasinés dès les premières étapes du recrutement ovocytaire et ne sont traduits qu’au moment de l’AGE, certains ARNm maternels peuvent être emmagasinés pour une période de plus de deux semaines avant d’être utilisés. Le nombre de cycles cellulaires accomplis avant l’AGE et la durée du silence transcriptionnel ne sont pas corrélés. En effet, il est intéressant de remarquer que dû à leurs cycles cellulaires extrêmement rapides, les embryons de drosophile et de xénope peuvent atteindre plusieurs milliers de cellules avant l’AGE mais demeurer silencieux transcriptionnellement seulement 3 et 7 heures, respectivement [108, 137]. Par analogie, l’embryon de poulet atteint le 16ème (30 000 à 50 000 cellules) seulement 24 heures après la fécondation [135]. 33 Tableau 1-2 Activation du génome embryonnaire chez différentes espèces. Espèce Stade de développement Nombre de cycle cellulaire Souris 1 cellule 0 [108] 4-6 cellules 2-3 [140] Humain 4-8 cells 2-3 [141] Bovin 8-16 cells 3-4 [119] Lapin 8-16 cells 3-4 [142] Mouton 8-16 cells 3-4 [143] 512-1,024 cells 9-10 [136] Xénope 4,096-8,192 cells 12-13 [137] Drosophile 8,192-16,384 cells 13-14 [138] Poulet 30,000-50,000 cells 15-16 [135] Porc Poisson-zèbre 34 Réferences 1.4 RÉGULATION DE LA TRADUCTION DES ARNm MATERNEL 1.4.1 Réadénylation des ARNm emmagasinés La première étape du recrutement des ARNm emmagasinés pour la traduction est généralement l’allongement de la queue poly(A). La majorité des ARNm emmagasinés dans le cytoplasme ont une queue poly(A) courte, contenant souvent moins de 50 nucléotides, et l’allongement de la queue à plus de 200 nucléotides initie la traduction [144146]. Les mécanismes associés à l’allongement de la queue poly(A) sont bien connus chez le Xénope et la souris mais moins chez le bovin [145, 147-149]. Le processus pourrait toutefois être semblable chez le bovin [150]. Cette polyadénylation est régulée par deux éléments agissant en cis, présent dans la région 3’ non-traduite (3’UTR, Untranslated region) de l’ARNm. Le premier correspond à l’hexanucléotide de la polyadénylation (HEX), AAUAAA. Cette séquence est un pré-requis tant pour la polyadénylation nucléaire que pour la repolyadénylation cytoplasmique de tous les ARNm. Le deuxième est l’élément de polyadénylation cytoplasmique (CPE, cytoplasmic polyadenylation element) dont la séquence consensus est UUUUUAU [151]. La séquence HEX et la séquence CPE sont liés par les facteurs CPSF (cleavage and polyadenylation specific factor) et CPEB (CPEBinding protein) respectivement. Cependant, la présence de ces séquences spécifiques sur tous les transcrits est insuffisante pour expliquer l’utilisation graduelle des transcrits durant le programme embryonnaire. Pour revenir à l’exemple de la régulation des cyclines, si tous les transcrits portaient les mêmes séquences spécifiques, leur traduction serait synchronisée. Pour répondre à la contrainte de régulation temporelle des transcrits, plusieurs isoformes portant des séquences régulatrices différentes en 3’UTR devraient être retrouvés dans les ressources maternelles emmagasinées dans le cytoplasme [152, 153]. Une population hétérogène de transcrits pourrait donc être accumulée durant l’ovogenèse. Lorsque qu’un ARNm est recruté pour la traduction, les mécanismes associés aux séquences HEX et CPE sont initiés pour stimuler l’allongement de la queue poly(A). Ces mécanismes se produisent différemment selon les espèces. La majorité des études sur le sujet portent sur les ovocytes et les embryons précoces de xénopes puisque leur grande taille et leur disponibilité conviennent parfaitement à de telles études. Ainsi, chez les espèces non-mammaliennes, il semble que la polyadénylation soit induite par la poly(A) 35 polymérase GLD2, qui se lie aux protéines CPSF et CPEB. La réadénylation cytoplasmique semble se produire par la compétition entre les activités de déadénylation promue par la PARN et d’adénylation stimulée par la GLD2. La PARN ribonucléase et la polymérase GLD2 font toutes deux partie du complexe de polyadénylation cytoplasmique et la longueur de la queue poly(A) est contrôlée par la balance de ces deux enzymes aux activités antagonistes. La phosphorylation de la protéine CPEB lors du recrutement d’un transcrit pour la traduction joue également un rôle clé dans l’allongement de la queue poly(A) car cette modification provoque l’expulsion de PARN du complexe, laissant la possibilité à la polymérase GLD2 de prendre le dessus pour allonger la queue poly(A) (Figure 1-9) (revue dans [144, 154]). Figure 1-9 Compétition entre la poly(A) ribonucléase PARN et la poly(A) polymérase GLD2. Lorsque PARN est expulsée suite à la phosphorylation de CPEB, GLD2 stimule l’allongement de la queue poly(A). [154] Reproduit avec permission. 1.4.2 Les joueurs clés de la régulation de la traduction Rôle des protéines de liaison à la queue poly(A) La longueur de la queue poly(A) joue un rôle clé dans l’initiation de la traduction. Cette stimulation est facilitée par la liaison de protéines spécifiques, les Poly(A) binding proteins 36 (PABP), à la queue poly(A) et ce, tant chez la levure, le xénope, la souris et l’humain [155157]. Peu d’études ont été réalisées chez le bovin mais un mécanisme semblable serait utilisé [158]. Chaque PABP possède quatre motifs de reconnaissance de l’ARN (RNA recognition motifs, RRM) et un domaine carboxy-terminal. Ces sites représentent des sites d’ancrage pour de nombreuses protéines qui vont stimuler la traduction. Par exemple, l’association entre les PABP et la coiffe de l’ARNm permet la circularisation du transcrit. La protéine PABP se lie au facteur d’initiation de la traduction eukaryotic initiation factor 4G (eIF4G), qui s’associe lui-même au facteur eIF4E, qui lui est en contact direct avec la coiffe de l’ARNm. Ces interactions permettent de stabiliser le complexe d’initiation eIF4F et stimule la liaison de la sous-unité ribosomale 40S [155]. Afin de réguler la liaison des PABP à la queue poly(A) et ainsi réguler la traduction, deux protéines aux fonctions opposées, les poly(A) binding protein interacting protein (Paip1 et Paip2), vont se confronter. La première, Paip1, va stimuler la traduction à plusieurs niveaux. D’abord, Paip1 montre de nombreuses similarités avec la portion centrale de eIF4G qui, tout comme ce dernier, lui permet d’interagir avec eIF4A, une hélicase spécifique à l’ARN et dépendante de l’ATP. Ainsi, Paip1 stimule l’action de PABP puisque sa liaison à eIF4A en 5’UTR de l’ARNm cible provoque le déroulement des structures secondaires de l’ARN. Cette action facilite la liaison du ribosome et stimule l’initiation de la traduction. De la même façon, Paip1 pourrait interagir avec eIF3, qui agit comme un adaptateur entre le ribosome et la protéine eIF4G [157, 159]. Cette interaction entre Paip1 et eIF3 permet de rapprocher PABP et le ribosome, corroborant l’idée de la circularisation de l’ARN, ce qui stimule la traduction grâce à la proximité des deux extrémités de l’ARN (Figure 1-10). 37 Figure 1-10 Modèle du mécanisme de stimulation de la traduction par Paip1. Paip1 stabilise l’intéraction entre eIF4G et PABP par l’intermédiaire de eIF3 et stimule la circularisation de l’ARN. [159]. Reproduit avec permission. La protéine Paip2 joue quant à elle un rôle opposé en réprimant la traduction. Lorsque Paip2 est active, elle prévient complètement la multimérisation de PABP qui ne peut plus jouer son rôle organisationnel au niveau de la queue poly(A) [160]. Le mécanisme d’inhibition est expliqué par la compétition entre Paip2 et eIF4G pour la liaison à PABP. Tel qu’il a été mentionné plus haut, les motifs de liaison à l’ARN retrouvés sur PABP représentent des sites d’ancrage pour de nombreuses protéines. Cependant, les sites de liaison de Paip2 et eIF4G se chevauchent au niveau du second RRM, expliquant qu’une seule des deux molécules puisse s’y lier [160]. En empêchant l’action de PABP, Paip2 romprait la circularisation de l’ARNm. De plus, il a été démontré que Paip2 inhibe la formation du complexe d’initiation du ribosome 80S. Cependant, la principale action de Paip2 demeure sa compétition directe avec Paip1 pour la liaison à PABP. Alors que Paip1 se lie aux RRM 1 et 2 de PABP, Paip2 interagit avec les RRM 2 et 3. Ainsi, tout comme pour la compétition entre Paip2 et eIF4G, le chevauchement des deux protéines sur le second RRM provoque une liaison exclusive d’une seule des Paip sur PABP [155]. Paip1 et Paip2 jouent donc un rôle clé dans la régulation de la traduction par l’intermédiaire de leur action sur PABP. Leur mécanisme d’action est bien connu chez l’humain [157, 159, 38 160] mais serait également utilisé chez le bovin [158]. Cependant, la régulation de l’activité des Paip demeure peu connue. Puisque Paip1 et Paip2 sont toutes deux des phosphoprotéines, leur état de phosphorylation pourrait permettre de réguler leurs activités [155]. Rôle des protéines de liaison à eIF4E D’autres joueurs clés de la régulation de la traduction sont les eIF4e binding proteins (4EBP). Par leurs interactions directes avec eIF4E, les 4E-BP empêchent la liaison de eIF4G, paralysant la formation du complexe d’initiation. Ce complexe, nommé eIF4F, est composé du facteur eIF4E, de l’hélicase eIF4A et d’eIF4G. eIF4E est la protéine directement associée à la coiffe alors qu’eIF4G correspond à la protéine d’échaffaudage sur laquelle se lie de nombreuses protéines impliquées dans l’initiation de la traduction. La liaison des 4EBP sur eIF4E permet de séquestrer cette protéine de façon réversible puisqu’elle est régulée par la phosphorylation des 4E-BP [155]. Le modèle de la boucle fermée Tel qu’il a été mentionné plus haut, l’interaction physique entre des protéines liées à la queue poly(A) des ARNm (PABP, PAIBP, CPEB) et des protéines associées au complexe d’initiation de la traduction (eIF4G, eIF4A, eIF3), en 5’UTR, permet la circularisation de l’ARN en associant les deux extrémités (Voir Figure 1-11). Ce modèle de la traduction en boucle fermée est important pour favoriser l’initiation de la traduction mais aussi l’efficacité de la synthèse protéique. En effet, la circularisation de l’ARN favorise le recyclage des ribosomes sur le même ARNm de par la proximité physique des deux extrémités [155, 161]. Ces interactions permettent également de protéger la cellule contre la production potentiellement létale de protéines tronquées puisque seuls les ARNm intacts seront traduits. Les ARNm dont la queue poly(A) ou la coiffe ont été dégradés par des ribonucléases ne pourront plus se circulariser et leur traduction en sera inhibée. De plus, ce modèle en boucle fermée permet de limiter l’accès des exonucléases à l’ARN en protégeant ses extrémités [155]. 39 Figure 1-11 Circularisation de l’ARN A) Visualisation de la circularisation de l’ARN par microscopie à force atomique [162] Reproduit avec permission. B) Principales molécules impliquées dans la circularisation de l’ARN [163]. Reproduit avec permission (Pr.Dietz). Le modèle CPEB-Maskin chez le xénope Toutes ces recherches mènent à considérer les extrémités 5’ et 3’ des ARNm comme des régions clés pour la régulation de la traduction. De nombreux modèles tentent d’élucider les mécanismes responsables de la régulation temporelle des transcrits maternels. La majorité d’entre eux impliquent les protéines de liaison à eIF4E, les différentes voies de polyadénylation et les différents processus favorisant la formation du modèle de la boucle fermée. Un de ces modèles [151] implique la protéine Maskin, une 4E-BP. Maskin se lie à la fois à CPEB et à eIF4E (Voir Figure 1-12). Sa présence inhibe la liaison eIF4E-eIF4G ce qui empêche la formation du complexe d’initiation [164]. Il a été démontré que les interactions entre Maskin et eIF4E sont considérablement réduites durant la maturation ovocytaire, moment où de nombreux ARNm sont recrutés pour la traduction [164]. Le mécanisme sous-jacent de régulation de la traduction implique le relâchement de Maskin du complexe CPEB-Maskin-eIF4E suite à la phosphorylation de CPEB par la protéine kinase Aurora A. Cette phosphorylation augmente également l’affinité de CPEB pour CPSF, qui vient se lier à l’hexanucléotide HEX. Cette liaison favorise le recrutement de la poly(A) polymérase qui allonge la queue poly(A). Une fois la queue poly(A) allongée, les PABP peuvent venir se lier à celle-ci, stimulant la formation de la boucle fermée en s’associant au facteur eIF4G du complexe d’initiation. eIF4G est une protéine ‘échafaud’ qui permet le 40 recrutement de nombreuses protéines pour former le complexe d’initiation eIF4F. L’hélicase eIF4A vient se lier au complexe et favorise le déroulement de l’ARN et de ses structures secondaires pour faciliter la liaison de nouvelles molécules dont les ribosomes. EIF3 viendra également se lier au complexe d’initiation et favorisera le recrutement de la sous-unité ribosomale 40S pour initier la traduction. Une fois le complexe eIF4F complètement recruté, il initie son voyage le long de l’ARNm pour atteindre le codon d’initiation AUG où la sous-unité 60S se liera à lui et commencera la traduction. Le modèle CPEB-Maskin est probablement le modèle le plus connu de régulation de la traduction dans le contexte de la gestion des ARNm maternels. Cependant, la proportion d’ARNm régulée par l’intermédiaire de ce modèle demeure inconnue. De plus, l’application universelle de ce modèle est le sujet de nombreux débats puisqu’aucun homologue à la protéine Maskin n’a été identifié jusqu’à ce jour dans les espèces non-mammaliennes [165]. Cette divergence vient encore une fois souligner la grande variation des méthodes de régulation de la traduction et de gestion des ARNm durant le développement embryonnaire entre les espèces. Figure 1-12 Contrôle de la traduction par l’intermédiaire de la protéine Maskin. La phosphorylation de CPEB inhibe la liaison de Maskin à eIF4E, permettant l’assemblage du complexe d’initiation sur la coiffe de l’ARNm. [166] Reproduit avec permission. Un code combinatoire dans le 3’UTR Il semble évident que la régulation de la traduction passe par des liaisons de protéines à certaines régions (souvent situées en 3’UTR) de l’ARN. Cependant, afin de contrôler de 41 façon temporelle la synthèse protéique à partir des ARNm maternels qui sont emmagasinés, la présence d’un ‘code’ dans les régions non traduites de l’ARN est nécessaire. Plusieurs séquences ont déjà été identifiées pour leur rôle dans la polyadénylation des transcrits. En plus des séquences HEX et CPE connues pour leur rôle dans la polyadénylation des transcrits, la séquence EDEN joue quant à elle un rôle dans leur déadénylation chez le xénope. Cette séquence riche en purines A et en pyrimidines U est retrouvée dans la région 3’ non traduite de certains ARNm. Sa présence induit la déadénylation d’une sous-classe d’ARNm qui n’est déadénylée qu’après la fécondation. Une protéine de liaison, EDEN-BP, est responsable du recrutement des déadénylases telles que PARN ou le complexe CCR4Pop2-Not [103]. En plus de ces processus généraux de régulation, il a été proposé que la région non traduite en 3’ de l’ARNm puisse contenir un code combinatoire qui serait utilisé tel un langage moléculaire afin d’expliquer la régulation temporelle de la traduction. Ce code impliquerait les séquences CPE et HEX et permettrait d’expliquer comment un même ARNm peut être recruté pour la traduction à différents moments durant la maturation [153]. Ces observations ont été réalisées à partir d’une analyse comparative des régions 3’ non-traduite des ARNm. Le nombre et la position relative de ces deux éléments (HEX et CPE) permettent de déterminer l’état actif ou réprimé de l’ARNm. Un ARNm portant une seule séquence CPE qui ne chevauche pas une séquence HEX sera polyadénylé et sa traduction sera activée si la distance entre les deux séquences n’excède pas 121 nucléotides. La distance entre les séquences CPE et HEX modulerait la force de l’activation. Une activation maximale serait induite par des séquences rapprochées mais sans chevauchement alors qu’une plus grande distance entre les deux séquences n’induit qu’une faible polyadénylation [153]. Au contraire, un ARNm dont la région 3’ non traduite comprend au moins deux séquences CPE sera maintenu dans un état déadénylé. La distance entre les séquences CPE module l’efficacité de la répression. Une distance de 10 à 12 nucléotides maximise cette répression. Ces résultats portent à proposer que la protéine Maskin se lie à un hétérodimère de CPEB mais ne peut se lier efficacement à une seule molécule. La séquence HEX quant à elle serait impliquée dans la régulation temporelle de la polyadénylation. Une polyadénylation précoce durant la maturation ovocytaire est déclenchée par la protéine kinase Aurora A qui phosphoryle CPEB. Cette phosphorylation 42 augmente l’affinité de CPEB pour CPSF, qui vient se lier à la séquence HEX [153]. Par la suite, le mécanisme présenté plus haut commence : PARN est expulsée et la polyadénylation, déclenchée par GLD2, initie la traduction. Une polyadénylation plus tardive sera spécifique aux ARNm où une séquence CPE chevauche la séquence HEX, empêchant la liaison de CPSF dû à la présence de CPEB sur la séquence CPE. Dans cette situation, l’ARNm est silencieux. Ce silence sera maintenu jusqu’à la synthèse de Mos, un élément du facteur cytostatique, et la phosphorylation de CPEB. Ces conditions vont mener à la dégradation de la majorité des CPEB. Une fois dégradé, CPSF peut se lier à la séquence HEX et enclencher la polyadénylation [153]. Ce code combinatoire pourrait être applicable dans plusieurs cas tant chez le xénope, la souris que chez l’humain [153] mais ne peut répondre à tous les besoins de régulation temporelle des ARNm de l’ovocyte et de l’embryon. En plus de réguler la longueur de la queue poly(A), les séquences présentes en 3’UTR des transcrits peuvent également agir dans des étapes subséquentes du recrutement. Entre autres, ses séquences peuvent avoir un impact durant l’initiation de la traduction. Normalement, suite à l’allongement de la queue poly(A) qui permet l’association du complexe eIF4F, la sous-unité ribosomale 40S se lie à l’ARNm et commence à balayer la région 5’UTR à la recherche du codon d’initiation. Durant ce processus, la majorité des facteurs du complexe eIF4F sont relâchés, faisant place aux facteurs d’initiation eIF5 qui se lient à l’ARNm. La liaison des facteurs eIF5 favorise l’association de la sous-unité ribosomale 60S au moment de la reconnaissance du codon d’initiation [155]. Un exemple de séquence affectant l’initiation de la traduction est le ‘Differential control element’ (DICE) qui interfère avec le recrutement de la sous-unité 60S du ribosome, inhibant la formation du monosome chez l’humain. De cette façon, le complexe DICE permet de maintenir le silence traductionnel [167]. Sceller le destin des transcrits selon les séquences spécifiques retrouvées en 3’UTR est un modèle plutôt séduisant. Cependant, ce modèle est incomplet. Il convient davantage au programme embryonnaire de la souris, qui ne dure que le temps d’un cycle cellulaire, mais peut difficilement s’appliquer aux autres espèces dont les cycles embryonnaires doivent subir de nombreux cycles cellulaires. En effet, les séquences spécifiques retrouvées en 3’UTR devraient être particulièrement complexes pour répondre à tous les besoins de la cellule. Avec le développement récent du séquençage à 43 haut-débit, les transcrits embryonnaires ont pu être analysés mais une telle hétérogénéité dans les régions 3’non traduites n’a pas été démontré. Il semble donc que d’autres mécanismes sont nécessaires pour permettre une régulation temporelle des transcrits. De plus, si les régions 3’UTR se retrouvent souvent sous la loupe des chercheurs, les régions en 5’UTR sont rarement l’objet de telles recherches mais dissimulent probablement plusieurs séquences clés pour la régulation des transcrits. 1.5 MÉTABOLISME ÉNERGÉTIQUE L’ovocyte a besoin d’énergie afin de réguler la transcription, la traduction, le mouvement des organelles et tous les autres processus cellulaires mentionnés dans cette thèse. Le métabolisme est un terme qui englobe toutes les transformations et les dépenses énergétiques qui prennent place dans la cellule. Le métabolisme énergétique est basé sur la production d’ATP, la molécule clé de l’énergie. Plusieurs mécanismes permettent de produire l’ATP, les principaux utilisant le processus de phosphorylation oxydative réalisé par les mitochondries afin de produire l’ATP en quantité suffisante. Le présent texte se limitera principalement aux rôles de la mitochondrie durant la maturation ovocytaire, la fécondation et le développement précoce. Plus précisément, ses rôles dans la production d’ATP par le processus de phosphorylation oxydative et la régulation du calcium intracellulaire seront discutés. Enfin, un court résumé des sources énergétiques (oxygène, glucose et pyruvate) chez l’ovocyte et l’embryon sera également présenté. 1.5.1 Les mitochondries ovocytaires Les mitochondries sont des organelles essentielles à la survie de toute cellule eucaryote de par leurs rôles dans la production énergétique cellulaire. Ces organelles ont la particularité de posséder leur propre génome. Le génome mitochondrial correspond à un peu plus de 16 kb d’ADN à l’origine de 37 gènes. De ceux-ci, 13 codent pour des protéines associées à la phosphorylation oxydative; 22 forment des ARN de transfert unique à la mitochondrie et 2 sont à l’origine d’ARN ribosomaux (12S et 16S) [168]. La transmission intergénérationnelle des mitochondries est uniparentale et se produit de façon exclusivement maternelle. Même s’il a longtemps été considéré que les mitochondries 44 paternelles apportées par le spermatozoïde lors de la fécondation pouvaient participer au bassin mitochondriale de l’embryon, il semble qu’un consensus soit maintenant établi pour éliminer cette possibilité. Les mitochondries paternelles seraient rapidement détruites dès leur entrée dans l’ovocyte par un processus de protéolyse dans une voie dépendante de l’ubiquitine [169-171]. Chez la drosophile, il existe également un mécanisme permettant la destruction de l’ADN mitochondrial durant la spermatogenèse, éliminant la capacité du spermatozoïde à transmettre un génome mitochondrial à sa descendance [172]. Il semble cependant que dans de très rares occasions, les processus mis en place pour éliminer la transmission paternelle de l’ADN mitochondrial peuvent être déficients. Un cas humain de transfert d’ADN mitochondrial a déjà été rapportée [171]. Le nombre de mitochondries présentes dans l’ovocyte mature fait encore l’objet de débats. Un très petit bassin de mitochondries pouvant représenter moins de 10 organelles serait retrouvé dans les ovogonies et leur multiplication serait à l’origine de toutes les mitochondries présentes dans l’ovocyte mature et le futur embryon [173]. Lorsque l’évaluation du nombre de mitochondries se fait par microscopie à transmission électronique, des estimations de 300 000 à 400 000 mitochondries sont obtenues [173]. Ces estimations présupposent cependant que les mitochondries sont uniformément distribuées dans l’ovocyte. Toutefois, comme nous le verrons plus loin, tel ne semble pas être le cas. Lorsque le nombre de mitochondries est estimé à partir du nombre de copies du génome mitochondrial, obtenu à partir de méthodes PCR (polymerase chain reaction), d’énormes variations sont observées. L’équipe de Reynier (2001) observe des variations allant de 20 000 à 598 000 copies du génome par ovocyte et ce, même chez les ovocytes d’un seul et même individu. De fait, le nombre de copies du génome par mitochondrie est variable et pourrait aller de 1 à 15 selon les auteurs [174-176]. Tel que mentionné dans la section consacrée à la morphologie de la maturation ovocytaire, les mitochondries présentes dans l’ovocyte adoptent une forme particulière qui demeure inchangée durant les premières divisions embryonnaires. Les mitochondries retrouvées dans les ovocytes matures ont une forme variable, allant d'arrondie à légèrement triangulaire, avec un diamètre d’environ 0,5 μm et présentant souvent une forme encapuchonnée et une matrice interne dense mais contenant peu de cristaux (voir Figure 45 1-13). Les quelques cristaux présents traversent rarement la matrice interne et sont plutôt rétractés en périphérie [27, 41, 53, 177]. Cette forme laisse supposer que les mitochondries sont immatures et peu efficaces dans la production d’énergie. Par contre, les mitochondries demeurent les organelles les plus abondantes dans l’ovocyte et leur nombre pourrait contrebalancer leur faible capacité respiratoire [178]. Chez l’humain, cette forme serait maintenue jusqu’au stade de morula [178]. Chez le bovin, les mitochondries encapuchonnées sont retrouvées jusqu’à l’activation du génome embryonnaire au jour 4, stade 8 à 16 cellules [53]. À partir de ce stade, les mitochondries reprennent une forme plus conventionnelle caractérisée par un aspect allongé avec de plus en plus de cristaux traversant complètement la matrice interne. Cette forme serait plus mature et permettrait de produire activement de l’ATP par le mécanisme de phosphorylation oxydative [179]. 46 Figure 1-13 Phénotypes mitochondriaux. (A, B) Mitochondries à capuchon (hooded) retrouvées dans les ovocytes matures (C) Mitochondrie orthodoxe observée dans les cellules somatiques. [53]. Reproduit avec permission. Il a également été mentionné plus haut que les mitochondries migrent durant la maturation ovocytaire. Originalement retrouvées en grappes dispersées dans le cytoplasme de l’ovocyte au stade GV0, les mitochondries se déplacent vers le cortex durant la maturation [41]. Du moins chez la souris, les mitochondries se déplaceraient le long des microtubules et migreraient préférentiellement vers la région périnucléaire, le noyau lui-même s’étant déplacé en périphérie de l’ovocyte. On retrouve alors des sphères d’organelles entourant les chromosomes et plus tard, entourant les fuseaux métaphasiques. Ce remodelage spatial des 47 mitochondries pourrait permettre de subvenir localement aux besoins plus élevés en ATP requis afin de mener à bien les différentes étapes de la méiose et de la fécondation [180]. 1.5.2 Mitochondries et production énergétique La morphologie sous-développée des mitochondries dans l’ovocyte et l’embryon précoce a été traditionnellement interprétée dans un contexte de faible activité respiratoire. Considérant l’absence de vascularisation dans les follicules, l’ovocyte se développe dans un milieu près de l’anoxie et la faible concentration en oxygène pourrait limiter la respiration oxydative des mitochondries [178]. Si tel est le cas, la demande énergétique de l’ovocyte pourrait être minimale ou une source exogène d’ATP pourrait être utilisée pour combler ses besoins énergétiques. Par exemple, puisque les cellules de cumulus sont en contact direct avec l’ovocyte par l’intermédiaire des jonctions communicantes, il est possible que l’ATP soit importée à partir de ces cellules [178] ou, selon nos propres hypothèses, que des molécules (AMP, AMPc) provenant des cellules de cumulus soient importées puis agissent comme élément moteur de la production d’ATP dans l’ovocyte. Cependant, les projections reliant cellules de cumulus et ovocytes sont rompues durant les premières heures (3 à 12 heures) de maturation [181]. D’autres mécanismes alternatifs seraient donc nécessaires pour fournir de l’énergie à l’ovocyte puis à l’embryon suite aux bris de la communication. Plusieurs étapes de la maturation ovocytaire, de la fécondation et du développement précoce représentent des activités énergivores et nécessitent une quantité élevée d'ATP. Il est donc impossible de penser que le phénotype immature des mitochondries est associé à un arrêt complet de la production énergétique. Le nombre de mitochondries présentes dans l’ovocyte pourrait avoir un rôle considérable sur la compétence au développement. Des variations de la quantité d’ATP pouvant aller jusqu’à un ordre de magnitude peuvent être observées dans des cohortes de MII non fécondé. [178]. Les ovocytes contenant une faible quantité de mitochondries (entre 20 000 et 60 000 copies du génome mitochondrial) sont associées à une faible capacité métabolique et à un plus grand taux d’échec à la fécondation [182]. Cette découverte supporte l’idée que la faible capacité de maturation, de fécondation ou de développement pourrait parfois être provoquée par une insuffisance de production d’ATP. D’un autre côté, les ovocytes contenant un nombre très élevé de mitochondries ou dont les mitochondries seraient très actives sur le plan métabolique pourraient être 48 incapables de bien réguler la production de ROS (reactive oxygen species) et provoquer une toxicité irréversible durant le développement. Un arrêt prématuré du développement chez des souris mutantes a déjà été relié à la présence d’un niveau très élevé de phosphorylation oxydative et à une forte production d’ATP [183]. Cette forte activité mitochondriale pourrait stimuler la production de ROS jusqu’à un niveau où l’ovocyte ou l’embryon ne pourrait plus en réguler l’élimination. Une telle concentration de ROS pourrait provoquer une détérioration du cytoplasme, une perturbation mitochondriale et l’entrée en apoptose ou en sénescence [184]. Ainsi, le phénotype immature des mitochondries dans l’ovocyte et l’embryon précoce pourrait être essentiel au développement. En plus du nombre de mitochondries, il semble que la localisation spatio-temporelle de celles-ci ait également un impact sur la production énergétique [185]. Une étude de Dumollard et al. (2004) chez la souris démontre que la demande et la production d’ATP durant la maturation et la fécondation seraient étroitement liées. En migrant le long des microtubules afin de se relocaliser autour des fuseaux métaphasiques, les mitochondries pourraient répondre à un besoin localisé élevé d’ATP. Leur nouvelle localisation permettrait une génération et une consommation couplée d’ATP. Cet équilibre maintiendrait les niveaux intracellulaires d’ATP tout en évitant la production superflue de ROS. 1.5.3 Mitochondries et fécondation En plus de leur rôle dans la production d’ATP nécessaire à la survie de l’embryon, les mitochondries jouent un rôle essentiel dans la régulation du calcium intracellulaire. Cette fonction est cruciale, particulièrement au moment de la fécondation lorsque l’entrée du spermatozoïde provoque le relâchement du calcium emmagasiné dans le réticulum endoplasmique lisse. En effet, il est connu depuis longtemps que les mitochondries régulent la concentration du calcium intracellulaire par leur habileté à le séquestrer et à le relâcher en réponse à une variété de signaux (revue dans [178]). Lorsque le calcium emmagasiné dans le réticulum endoplasmique lisse est relâché, la mitochondrie récupère une partie de ce calcium et le relâche de façon lente et transitoire afin de contribuer à la fréquence des oscillations et à la recharge en calcium du réticulum. Si les fonctions mitochondriales sont 49 affectées, par exemple en découplant le gradient de proton avec du Carbonyl cyanide mchlorophenyl hydrazone (CCCP), les concentrations de calcium intracellulaire demeurent constamment élevées et provoquent rapidement la mort cellulaire [186, 187]. L’étude de Dumollard (2004) démontre également un lien entre la respiration mitochondriale et les niveaux de calcium intracellulaire. Il semblerait que la séquestration et le relâchement du calcium par la mitochondrie soit associé à leur activité métabolique. Ces auteurs semblent également affirmer que le nombre et la localisation des mitochondries affectent la compétence au développement de l’embryon. L’entrée du spermatozoïde stimulerait localement la respiration mitochondriale afin de répondre aux besoins urgents associés à la fécondation tels que l’exocytose des granules corticaux, l’extrusion de second globule polaire et l’homéostasie du calcium. Grâce à cette production localisée d’ATP pour subvenir aux besoins immédiats de la cellule, la majorité des ovocytes ne montrent pas d’augmentation significative d’ATP suite à la fécondation [187]. Un certain pourcentage d’ovocytes montre cependant une augmentation graduelle d’ATP et il serait intéressant d’évaluer si ces ovocytes sont tout aussi compétents au développement. Il serait possible en effet que les ovocytes qui ne réussissent pas à stabiliser leur production d’ATP au moment de la fécondation produisent davantage de ROS et nuisent au développement subséquent de l’embryon. 1.5.4 Mitochondries et développement précoce La fécondation et les premières étapes du développement embryonnaire se produisent dans l’oviducte, où la concentration en oxygène est limitée (entre 2 et 8% d’oxygène) [188]. Il semble cependant que la majorité de l’ATP produit durant les stades pré-implantatoire chez la souris provienne tout de même de la phosphorylation oxydative, principalement celle de substrats tels que le pyruvate, qui est nécessaire au développement précoce [187]. La consommation d’oxygène semble augmenter progressivement avec le développement, les blastocystes consommant environ 60 à 70% d’oxygène pour la phosphorylation oxydative alors que l’embryon en clivage n’en consommerait que 30% [189]. Puisqu’il n’y a pas de réplication mitochondriale durant les stades pré-implantatoires, il semble que le nombre de mitochondries par cellule diminue de moitié avec chaque division. L’augmentation de l’activité respiratoire pourrait alors compenser pour le nombre 50 décroissant de mitochondries. Cependant, une ségrégation disproportionnée des mitochondries peut provoquer des variations importantes entre les blastomères quant à leur capacité à produire de l’ATP. Les conséquences peuvent alors provoquer des effets allant de l’arrêt de la division cellulaire jusqu’au gonflement et à la lyse des blastomères [178, 179]. Lorsque l’embryon atteint le stade de blastocyste, des changements phénotypiques sont observés chez les mitochondries. Celles-ci prennent une forme beaucoup plus standard associée à une forte activité respiratoire. Cette augmentation dans la capacité respiratoire est également associée à une demande augmentée en ATP puisque le blastocyste doit former le blastocœle et éclore, deux processus énergivores. 1.5.5. Substrats métaboliques L’ovocyte et l’embryon utilisent différents substrats métaboliques afin de produire l’énergie nécessaire à leur survie. L’oxygène, le glucose, le pyruvate et le lactate représentent les principaux substrats. Un survol de leur utilisation sera présenté ici. L’oxygène L’utilisation de l’oxygène est directement reliée à sa disponibilité dans le milieu environnant ainsi que par le taux d’activité des mitochondries. In vivo, la concentration en oxygène dans l’ovaire est limitée due à l’absence de vascularisation dans les follicules [178]. Cependant, les niveaux d’oxygène disponible pourraient augmenter significativement durant la période pré-ovulatoire puisque l’accumulation de fluide dans l’antre folliculaire et l’augmentation du débit sanguin dans la région périfolliculaire augmente durant le développement du follicule de Graaf [178]. Les concentrations d’oxygène dans l’oviducte et l’utérus varient entre 1,5% et 9% d’oxygène selon les espèces (singe, lapin, hamster), soit des concentrations fortement inférieures à celle de l’atmosphère [190]. Durant la MIV chez le bovin, les concentrations en oxygène ne sont pas modifiées (concentration atmosphérique, 21%) alors qu’elles sont réduites à environ 5% durant le développement embryonnaire afin de mimer les concentrations d’oxygène réduites observées dans l’oviducte et l’utérus. 51 Comme nous l’avons vu dans les derniers paragraphes, l’activité mitochondriale est limitée durant la maturation ovocytaire et les premiers clivages dû à l’état immature et peu développé des mitochondries. Selon , environ 65% de la respiration basale est utilisée pour la respiration mitochondriale dans l’ovocyte immature bovin et seulement 63% de la respiration mitochondriale est couplée à la production d’ATP. Lorsque l’ovocyte atteint la maturité (MII), moins de 50% de la respiration mitochondriale se retrouve couplée à la production d’ATP, suggérant que la phosphorylation oxydative est fortement diminuée durant la maturation ovocytaire. Une étude semblable réalisée chez l’embryon de souris démontrait une plus forte baisse encore des capacités mitochondriales dans les premiers stades embryonnaires puisque seulement 30% de l’oxygène consommé serait utilisé par la phosphorylation oxydative [189]. Ce n’est qu’au cours du développement embryonnaire, suite à l’AGE chez le bovin, que les mitochondries se différencient et récupèrent leur entière fonctionnalité dans l’activité respiratoire. La consommation d’oxygène par l’ovocyte et l’embryon précoce suit cette transformation puisqu’elle demeure faible avant le stade de 8 cellules puis augmente rapidement pour atteindre les niveaux les plus élevés dans le blastocyste [191]. Chez la souris, où les mitochondries atteignent un stade de maturité autour du stade de blastocyste, ce n’est qu’à ce moment que la capacité respiratoire de l’embryon serait améliorée : 60 à 70% de la consommation d’oxygène serait liée à la respiration mitochondriale. Ainsi, malgré la faible concentration d’oxygène dans l’oviducte et l’utérus, l’embryon dont les mitochondries sont bien développées peut maximiser sa consommation d’oxygène. Le glucose Plusieurs études ont démontrés que l’ovocyte a une faible capacité de consommation de glucose dû à la faible présence de transporteurs ayant une forte affinité pour celui-ci [192, 193] ainsi qu'à la faible activité de la phosphofructokinase (PFK), une enzyme limitante de la glycolyse [194]. Hors, le glucose représente un métabolite essentiel pour le complexe ovocyte-cumulus et joue un rôle important au niveau de nombreuses voies métaboliques telles que la glycolyse, la voie des pentoses phosphates (PPP), la voie de la synthèse des hexosamines (HBP) et la voie des polyols. Il semble que les cellules de cumulus, qui consomment de grande quantité de glucose, métabolisent celui-ci et en fournissent les 52 intermédiaires à l’ovocyte (revue dans [195]). De fait, les cellules de cumulus consommeraient 23 fois plus de glucose mais 3 fois moins d’oxygène que l’ovocyte [196], une situation favorisant grandement la glycolyse. In vivo, la concentration en glucose du fluide folliculaire se rapproche des niveaux sanguins, autour de 2,3 mM chez le bovin [197] alors que durant la MIV, des concentrations supraphysiologiques sont utilisées (TCM-199, 5,6 mM de glucose) afin de contrer les risques d’épuisement du milieu, ce dernier demeurant statique durant environ 24 heures. Le glucose consommé par les cellules de cumulus peut être utilisé pour la production énergétique; pour la synthèse de novo de purine; pour la maturation nucléaire par l’intermédiaire du PPP; pour la formation de matrice extracellulaire; pour la stimulation de la signalisation cellulaire par l’intermédiaire du HBP ou enfin, pour la régulation de l’homéostasie cellulaire par l’intermédiaire de la voie des polyols (revue dans [195]). Durant le développement embryonnaire précoce, le métabolisme du glucose par l’embryon est également fortement limité. Il semble que la faible quantité de glucose consommé serait principalement utilisée par la voie des PPP durant les premiers stades embryonnaires puisque les enzymes de la glycolyse seraient absentes ou peu actives alors que celles de la voie des PPP seraient fortement présentes [198]. La première augmentation significative du métabolisme du glucose se produit suite à l’activation du génome embryonnaire [199], dû à la traduction des enzymes responsables de la glycolyse. À partir de ce moment, la fermentation lactique devient une voie importante de dégradation du glucose et postcompaction, la glycolyse génère jusqu’à 15% de l’ATP produit par l’embryon [200]. Le pyruvate et le lactate Le pyruvate représenterait la source majeure d’énergie dans l’ovocyte et l’embryon précoce [191]. Durant la maturation, le pyruvate est principalement apporté par les cellules de cumulus suite à la dégradation du glucose via la glycolyse alors que durant le développement embryonnaire, le pyruvate est principalement fournit par le milieu extérieur. En condition aérobie, le pyruvate entre dans le cycle de Kreb associé à la respiration 53 mitochondriale alors qu’en condition anaérobie, le pyruvate est plutôt converti en lactate par des réactions de fermentation. Ainsi, durant les premiers clivages, la majorité du pyruvate serait transformé en lactate alors qu’à partir des stades de 16 cellules chez le bovin, son utilisation par la phosphorylation oxydative augmente fortement et génère environ 80% de l’ATP [191]. La forte utilisation du pyruvate et du lactate pour subvenir aux besoins de l’ovocyte et de l’embryon est dû, en partie, à leur disponibilité dans le milieu environnant. Dans l’oviducte bovin, la concentration en lactate atteint 6 mM et diminue jusqu’à 1 mM dans l’utérus. Cette concentration en lactate dans l’oviducte est grandement supérieure à la concentration retrouvée dans le plasma (< 1 mM) et favorise son utilisation par l’ovocyte et l’embryon précoce. Quant au pyruvate, sa concentration dans l’oviducte et l’utérus est semblable à celle retrouvée dans le plasma, c'est-à-dire environ 0,1 mM [201]. Le transport du pyruvate dans l’ovocyte et dans l’embryon serait régulé par des transporteurs actifs et passifs qui sont fortement présents durant les premiers stades embryonnaires [202]. 1.6 OBJECTIFS DE LA THÈSE La maturation ovocytaire représente une fenêtre développementale très dynamique où l’ovocyte subit de nombreuses modifications phénotypiques, moléculaires et métaboliques. Elle représente également une période de silence transcriptionnel qui se prolongera par delà la fécondation et les premiers clivages, jusqu’à l’activation de génome embryonnaire. Afin de survivre à cette période où il lui devient impossible de transcrire son génome pour répondre aux stimuli et aux stress environnementaux, l’ovocyte accumule des quantités remarquables d’ARN durant sa croissance et les emmagasine de façon à les protéger de la dégradation et de la traduction précoce. Cette caractéristique permet à l’ovocyte et à l’embryon de survivre mais complique grandement l’étude transcriptomique de la maturation ovocytaire puisque la majorité des ARN présents ne représentent pas la physiologie sous-jacente de la cellule. Seule une petite proportion des ARNm seront traduits/actifs durant chaque stade de la maturation et du développement précoce. Ces ARN se distinguent des ARN emmagasinés par leur liaison à des ribosomes afin d’initier leur traduction et on les appelle les ARN polyribosomaux. Dans ce contexte, j’émets l’hypothèse que l’extraction des polyribosomes permettra de mettre en lumière les 54 différences entre les ovocytes immatures (GV) et les ovocytes matures (MII). Ces différences me permettront d’expliquer certains mécanismes de maturation ovocytaire. Afin de valider cette hypothèse, la première partie de mon projet (Chapitre 2) consistait à mettre au point une méthode permettant d’extraire spécifiquement les ARN polyribosomaux à partir d’un nombre limité d’ovocytes. Pour y arriver, il était important de rencontrer deux principaux objectifs. Le premier objectif était de pouvoir prouver la nature polyribosomale des transcrits et ce, malgré l’utilisation d’un nombre très limité d’ovocytes. Cet objectif a été atteint par l’ajout d’ARN exogène afin d’obtenir un profil UV de distribution des polyribosomes. Le deuxième objectif était de pouvoir identifier les transcrits, c’est-à-dire de pouvoir les différencier des ARN exogènes ajoutés durant le processus d’extraction. Ce second objectif a été atteint grâce à la fusion des ARN exogènes – par procédé chimique – avant de les ajouter aux échantillons d’ovocytes bovins. Cette nouvelle méthode a été utilisée (Chapitre 3) afin de comparer les transcrits polyribosomaux d’ovocytes immatures au stade de vésicules germinales à celui d'ovocytes matures au stade de métaphase II de la méiose. L’objectif de cette seconde partie du projet était de découvrir différentes fonctions cellulaires importantes durant cette période afin de mieux comprendre certains aspects de la physiologie de la maturation ovocytaire. Les résultats obtenus en comparant les transcrits polyribosomaux durant la maturation ovocytaire m’ont permis de mettre en lumière une forte diminution de la phosphorylation oxydative et de la synthèse protéique dans l’ovocyte. La réduction substantielle de la phosphorylation oxydative diminue la capacité de production énergétique de l’ovocyte. Parallèlement, la diminution de la synthèse protéique est un phénomène courant lorsqu’une cellule subit un stress énergétique puisque ce mécanisme cellulaire est l’un des plus demandant énergétiquement [203-205]. Combinées, ces deux informations m’ont amenés à poser l’hypothèse que l’ovocyte acquiert une certaine quiescence durant sa maturation. Cette quiescence permettrait à l’ovocyte de survivre à cette période critique énergétiquement. Il est bien connu que l’embryon quiescent a plus de chance de survivre et d’atteindre le stade de blastocyste [206]. Mes recherches tendent à prouver que cette quiescence est acquise avant même la fécondation, durant la maturation. 55 Enfin, puisque la production énergétique est fortement affectée par la réduction de la respiration cellulaire, et puisque l’ATP est une ressource nécessaire à la survie de l’ovocyte, je me suis penchée sur l’étude de mécanismes alternatifs de production d’énergie afin de combler les besoins de l’ovocyte durant cette période. J’ai émis l’hypothèse que l’ovocyte pouvait récupérer les grandes quantités d’AMP disponibles durant la maturation pour stimuler la production d’ATP grâce aux enzymes responsables de la voie de récupération des adénosines (adenosine salvage pathway). Mes résultats démontrent que deux enzymes permettant, l’une la transformation d’AMP en ADP (adénylate kinase) et l’autre, la transformation d’ADP en ATP (créatine kinase), conduisent à la production de novo d’ATP durant la maturation ovocytaire. L’AMP libéré suite à la dégradation de la queue poly(A) des ARNm ainsi que celui produit suite à la dégradation de l’AMPc par les phosphodiestérases semblent être rephosphorylés afin de produire l’ATP essentiel à la survie de l’ovocyte. La mise en place de cette voie de récupération durant la maturation ovocytaire permettrait à l’ovocyte de combler des besoins spatiotemporels spécifiques en ATP. 56 1.7 RÉFÉRENCES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Molyneaux KA, Stallock J, Schaible K, Wylie C: Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev Biol 2001, 240(2):488-498. Wrobel KH, Suss F: Identification and temporospatial distribution of bovine primordial germ cells prior to gonadal sexual differentiation. Anat Embryol (Berl) 1998, 197(6):451-467. Mollgard K, Jespersen A, Lutterodt MC, Yding Andersen C, Hoyer PE, Byskov AG: Human primordial germ cells migrate along nerve fibers and Schwann cells from the dorsal hind gut mesentery to the gonadal ridge. 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Khandjian, Claude Robert Cet article a été publié dans la revue «BMC Developmental Biology» sous la référence suivante : Scantland S, Grenon JP, Desrochers MH, Sirard MA, Khandjian EW, Robert C. Method to isolate polyribosomal mRNA from scarce samples such as mammalian oocytes and early embryos. BMC Dev Biol. 2011 Feb 15;11:8. 71 2.1 Résumé Introduction : Bien que les techniques d’amplification des acides nucléiques permettent d’obtenir le profil transcriptomique de très petites quantités de cellules, il demeure difficile de distinguer les ARN messagers actifs de ceux emmagasinés. L’emmagasinage des transcrits se produit durant certains stades spécifiques de la gamétogenèse et du développement embryonnaire précoce, période durant laquelle l’activité transcriptionnelle du génome est négligeable et les ARNm emmagasinés sont utilisés afin de soutenir la production de novo de protéines. Dans plusieurs cas, les ARNm emmagasinés peuvent être beaucoup plus abondant que les ARNm utilisés pour la traduction. Afin d’identifier les ARNm actifs dans les ovocytes bovins, nous avons développé une méthode d’isolation de très petites quantités d’ARN polyribosomaux. Résultats: La méthode proposée est basée sur l’utilisation d’un mélange du cytoplasme extrait des ovocytes avec une préparation de polyribosomes provenant d’une source non-homologue (Drosophila) qui est fractionné sur un gradient de sucrose afin de concentrer les polyribosomes. Ceci implique la fusion des polyribosomes non-homologues suivi de la neutralisation de l’agent de fusion. En utilisant cette méthode, nous avons démontré que les différents stades de maturation ovocytaire corrélaient avec des changements dans l’abondance des ARNm polyribosomaux. Cette corrélation n’était toutefois pas détectées observée en ce qui concerne l’abondance des ARN totaux ou des ARNm poly(A). Nous avons également démontré que l’abondance de transcrits sélectionnées correspondaient au niveau protéique. Conclusions: Nous exposons dans cet article la mise au point avec succès d’une méthode afin d’obtenir le profil en ARNm présents dans les fractions polyribosomales à partir d’aussi peu que 75 ovocytes. Le fractionnement des ARNm polyribosomaux fourni un nouvel outil afin d’étudier la gamétogenèse et le développement embryonnaire précoce avec une meilleure représentation de la physiologie sous-jascente de la cellule. 72 2.2 Abstract Background: Although the transcriptome of minute quantities of cells can be profiled using nucleic acid amplification techniques, it remains difficult to distinguish between active and stored messenger RNA. Transcript storage occurs at specific stages of gametogenesis and early embryogenesis, during which genome transcription activity is negligible and stored mRNA is used to sustain de novo protein synthesis. In many cases, stored mRNA can be several times more abundant than mRNA ready for translation. In order to identify active mRNA in bovine oocytes, we sought to develop a method of isolating very small amounts of polyribosome mRNA. Results: The proposed method is based on mixing the extracted oocyte cytoplasm with a preparation of polyribosomes obtained from a non-homologous source (Drosophila) and using density gradient fractionation to concentrate the polyribosomes. It involves cross-linking the nonhomologous polyribosomes and neutralizing the cross-linking agent. Using this method, we showed that certain stages of oocyte maturation coincide with changes in the abundance of polyribosomal mRNA but not total RNA or poly(A). We also showed that the abundance of selected sequences matched changes in the corresponding protein levels. Conclusions: We report here the successful use of a method to profile mRNA present in the polyribosomal fraction obtained from as little as 75 oocytes. Polyribosomal mRNA fractionation thus provides a new tool for studying gametogenesis and early development with better representation of the underlying physiological status. 73 2.3 Background Gametogenesis and embryonic development in mammals involve several major cellular events marked by an unusual mode of messenger RNA management. In nearly all animal species, mRNA molecules are stored in the developing oocyte until use during maturation or after fertilization [1-8]. These stored mRNAs direct protein synthesis during the period of transcriptional silence, which begins when the germinal stage oocyte reaches its full size [9-13] and lasts until embryonic genome activation [14-16]. In cattle, this size is approximately 120 μm within a follicular antrum 3-5 mm in diameter [10, 15, 17]. During the period covering the remaining follicular development (i.e. from 3 to 25 mm in antral diameter), the post-LH-surge oocyte maturation, fertilization and the onset of embryonic genome activation, very little genomic transcription occurs. It is generally believed that transcript storage begins in the early stages of oogenesis and may thus last for several weeks. It is also believed that the transcripts are stored in a particulate form and lack the poly(A) portion, although the latter detail remains the subject of debate. It has been reported that shortening the poly(A) tail to less than 50 nucleotides stabilizes the mRNA molecule and keeps it from being either degraded or translated [18]. So far, little is known about the molecular mechanisms underlying the steps that occur during this transcriptional silencing period. Early development is characterized by major fluctuations in the abundance of total and messenger RNA [2, 19], with specific waves of maternal RNA degradation [14, 20]. These observations have led to the belief that measurement of messenger abundance provides little useful information about cells that are storing RNA, since it does not distinguish between mRNA that is 1) stabilized and stored and thus not contributing to any cellular function; 2) recruited and on its way to degradation, not contributing to the translation process and 3) recruited and being translated in de novo protein synthesis. In order to avoid the contribution of the stored or decaying molecules to the mRNA abundance measurements, we seek to provide a mean to isolate the mRNA population bound to the translation apparatus. Messenger RNAs engaged in translation are found to be bound by ribosomes throughout the cytosol either freely or attached to the cytoskeleton while dormant or stored transcripts are accumulated in diverse forms of ribonucleoprotein complexes and particles [21]. It is also well known that actively 74 translated messengers are bound by multiple ribosomal units [22-25]. The composition of these different particles makes it possible to fractionate them by density gradient. Profiling of polyribosomal mRNA through standard sucrose gradient fractionation procedure requires considerable starting material (e.g. 200 μg of total RNA [26]). A recent publication reports the development of a method suitable for input material not fewer than five Xenopus laevis oocyte, eggs or early embryos [27]. Considering the Xenopus oocyte contains about 15,000 times more total RNA comparatively to the bovine counterpart (respectively 6 μg [28] and 340 pg [19], the method still requires too much input for work on mammalian early development. The relative scarcity of mammalian oocytes, egg and embryonic tissues is another impediment to increasing understanding of mammalian gametogenesis and early development, since the choice of methods suitable for handling such minute quantities of material is severely limited. Pre-amplifying the entire transcriptome offers the possibility of studying the fluctuations in transcript abundance in these tissues. Minute amounts of initial RNA can be amplified with success [29-31] and provide sufficient output for high throughput approaches such as microarrays [32, 33] or systematic deep sequencing (RNAseq) [34, 35]. To our knowledge, the isolation of polyribosomes from mammalian oocytes or early embryos has been reported only twice and resulted in limited success [36, 37]. The methodology used by De Leon and colleagues [36, 37] involves spiking a small sample with a large amount of genetically homologous material to confirm the polyribosomal nature of the RNA molecules being studied. However, the inability to distinguish between the spike and the sample prevented identification of oocyte/embryo mRNA molecules. In contrast, the approach used by Potireddy and colleagues [36, 37] allowed mRNA identification but could not confirm the polyribosomal nature of the isolated fraction nor exclude the presence of nonpolyribosomal contaminants. We therefore sought to combine the advantages of each method by devising means of confirming the polyribosomal nature of the extracted mRNAs while maintaining the possibility of identifying them and determining their relative abundance. 75 2.4 Results Preparation of the inert carrier In order to develop a polyribosomal isolation method that could be performed with very small quantities of sample material, we used an RNA carrier fraction. Spiking the bovine sample with polyribosomes from a non homologous organism (i.e. Drosophila) is helpful as long as there is a way to prevent interference with downstream transcript identification. Formaldehyde was used to cross-link RNA and proteins from the drosophila SL2 cell extracts in order to produce a range of materials that might function as carriers. To determine the optimal concentration of formaldehyde that would provide a useful carrier and minimize downstream interference, a dose-response experiment was done. At lower concentrations (i.e. 0.2% and 0.37%), cross-linking was slight, as indicated by the recovery of almost all of the initial RNA in sucrose density gradient fractions. At a concentration of 1% formaldehyde, approximately 10% of the RNA could be recovered while at the highest concentration tested (3.37%), less than 1% of the initial RNA input could be recovered (Figure 2-1A). The micro-electrophoretic profile confirmed the extremely low level of RNA recovered following the 3.37% formaldehyde treatment (Figure 2-1B-C). This latter treatment was used and an additional step was included to neutralize excess formaldehyde prior to adding the SL2 cell carrier polysome preparation to the experimental samples. Glycine, used routinely to titrate free formaldehyde and used in this study at the commonly used concentration of 0.1 M [38] was not entirely effective at neutralizing this cross-linking agent (Figure 2-2A). Since tris-hydroxymethylaminomethane molecule (THAM or Tris) has been suggested for this purpose [39], tests were conducted to determine the conditions under which it would efficiently inactivate residual formaldehyde in SL2 cell extract. The impact of pH was also tested since polyribosome extraction was done at a higher pH than in the Sutherland study. The impact of pH was found not significant (Figure 2-2B). At a concentration of 0.5 M, Tris was found comparable to 0.1 M glycine and thus could not be considered more efficient. At concentrations of 1 M and 1.5 M, Tris did neutralize the residual formaldehyde completely (Figures 2-2B and 2-2C). Figure 2-3 shows the effect of the RNA carrier preparation protocol on the distribution of polyribosomes in the sucrose density gradient fractions of the Drosophila SL2 cell extract. The crosslinking treatment did 76 not interfere with polyribosome profiling as both treated and control samples show very similar profiles (Figure 2-3). Validation of the polyribosomal nature of the isolated RNA Since polyribosomes are stabilized by Mg2+ ions, addition of EDTA causes their dissociation into ribosomal subunits and the release of messenger RNA. Cytoplasmic extracts were therefore fractionated in the presence or absence of EDTA. In order to observe this in the absence of the Drosophila polyribosome preparation, a suitable quantity of granulosa cells was processed. Standard RT-PCR of genes ACTB (for granulose cells) and CDK1 (for oocytes) was used as means of comparing RNA abundance in the collected fractions. For the two cell types, the presence of EDTA caused a shift in RNA abundance towards the fractions containing low sedimentation coefficient materials, thus confirming the polyribosomal nature of the higher sedimenting fractions (Figure 2-4). Interference of Drosophila polyribosome RNA with microarray hybridization signals Interference by the exogenous carrier RNA with the density-gradient fractionation of the oocyte RNA was minimal. We decided to determine if this was true for microarray hybridization signals. Samples prepared from purified bovine oocyte RNA and from purified Drosophila SL2 RNA were labelled with different fluorophores and hybridized on the same microarray. Table 2-1 summarizes the proportion of microarray features that generated positive fluorescent signals above the background threshold. In spite of its phylogenetic distance from cattle, Drosophila RNA generated one third of positive spots that bovine RNA did at 55°C. Increasing the hybridization temperature by 5°C resulted in a significant loss in Drosophila positive signals and at 65°C, no Drosophila signal above background was detected. However, at 65°C, almost half of the bovine signals were also lost. The intermediate temperature seemed to be an acceptable compromise since only 6% of the spots generated positive, but very weak signals from Drosophila samples, while the fluorescence values from the bovine samples were still clearly above background. By comparison to the least stringent condition (55°C), 77% (47/61) of the bovine signals were kept when microarrays were hybridized at 60°C (Table 2-1). 77 Reproducibility of the polyribosome RNA extraction method We tested the reproducibility of the entire method by comparing the results obtained from biological replicates. Three oocyte pools were thus fractionated and analyzed separately using the density gradient method and microarray hybridization. The mean correlation value was found to be 0.95 ± 0.01, which clearly indicates that the procedure is robust (Figure 2-5). Validation of the method under different physiological conditions The polyribosome fractionation protocol was tested with oocytes at different stages of maturation using microarray hybridization to measure the abundance of RNA sequences representing known key factors in the control of oocyte maturation. Quantitative RT-PCR was used since probes for some of the chosen factors were absent on our microarray. The selected sequences correspond to components of maturation promoting factor, namely cyclin B1 (CCNB1), cyclin-dependant kinase 1 (CDK1) and Moloney sarcoma oncogne (MOS), which is part of the cytostatic factor required at the MII stage. Total RNA (targeted using random primers during the RT reaction), poly(A) (targeted using an oligo-dT during RT) and polyribosomal sub-fractions were measured.The abundance of these RNA types varied significantly between the different tissue types (Figure 2-6), indicating clearly that the stage of maturation of the oocyte sample has an impact on the distribution of the RNA. Potential implications for protein levels Since mRNA associated with polyribosomes is presumed actively translated, levels of protein corresponding to the selected factors were measured. Microarray gene entries corresponding to polypeptide sequences for which commercial antibodies were available were selected. Standard housekeeping candidates ACTB and TUBA were used as internal standards. Due to the requirement of oocyte maturation for extensive reorganization of the cytoskeleton, these standard housekeeping candidates were found to be unstable and were therefore considered solely as a control of sample loading and not used for data normalization. The fluctuations in polyribosomal mRNA levels observed between maturation stages closely matched protein levels for all candidates, as shown in Figure 2-7. 78 2.5 Discussion The need to develop a procedure for isolating and studying polyribosomal mRNAs from mammalian gametes and early embryos arose from the peculiarity of these cells. The collection of mammalian oocytes and early stage embryos is challenging and resourceintensive. Therefore, samples rarely contain more than 100 oocytes/embryos. Their scarcity imposes a method suited to handling minute quantities of material. For instance, protein profiling and identification of differentially expressed candidates requires several hundreds to thousands of mammalian oocytes or early embryos [40, 41]. Similarly, these tissues do not provide a much better source of RNA considering for example that a single Xenopus oocyte contains about 6 μg of total RNA [28] comparatively to only 340 pg in the bovine [19]. Nonetheless, the wide array of amplification procedures now available has made it possible to focus on the transcriptome rather than the proteome. Study of the transcriptome generally assumes that mRNA levels are indicative of cellular status and reflect corresponding protein levels. However, this assumption does not apply to cells containing large amounts of stored mRNA, such as mammalian oocytes and early blastomeres. In these cases, mRNA bound to polyribosomes and therefore likely being translated is considered a better indicator of gene activity and developmental stage. The first important step for polyribosomal RNA extraction is thorough lysis of the cells. The greatest difficulty encountered when working with oocytes or prehatching embryos is the challenge of breaking down the zona pellucida. This porous glycoprotein coat is composed of a dense net of fibril bundles that evolves during oocyte maturation and fertilization [42]. The bovine zona pellucida is particularly resistant, with a thickness averaging 26.9 μm compared to 14.5 μm for ovine and 11.4 μm for murine oocytes [43]. Since the lysis buffer used in the polyribosome isolation procedure is relatively mild to disrupt the cytoplasmic membrane and liberate intact polyribosomes, an additional treatment was required to efficiently disrupt the sturdy zona pellucid to liberate the cellular contents. We found that freeze/thaw cycles, effective for mouse oocytes [37], are ineffective against the bovine zona pellucida and that digestion with pronase produced irreproducible results due to residual protease activity. The previously used acidic (pH 2.1 to 2.5) Tyrode buffer [36] was also tested, but changes in the granular appearance of the oocyte cytoplasm suggested disruption of the cytoskeleton, to which polyribosomes are believed to be bound [44]. Moreover, 79 removal of the zona pellucida by acidic treatment has been reported to lead to embryo death and increased frequency of abnormalities in surviving embryos [45], suggesting damage to the embryo development program in which polyribosomes are involved. The only acceptable option appeared to be mechanical breakage of the zona with zirconia-silica beads in the presence of passive lysis buffer (Data not shown). This approach seemed to work since the zona and its contents were completely dissolved within a few minutes. To our knowledge, extraction of polyribosomes from oocytes and early embryos has been reported only twice [36, 37]. In the first case, mouse liver polyribosomes acted as a carrier of polyribosomal mRNA extracted from [3H]- uridine-labelled mouse oocytes. This attractive method allows confirmation of the presence of oocyte polyribosomes, but does not allow any identification or even relative quantification of the associated mRNA, since it cannot be distinguished from that of the liver polyribosomes. The second study involved a method that allowed identification of the transcripts but could not confirm their polyribosomal nature nor exclude the presence of non-polyribosomal contaminants. We have developed a method in which a heterologous carrier is used and which allows identification of extracted mRNA and confirmation of its polysomal nature. This involved determining optimal conditions for cross-linking the exogeneous polyribosomes. UV crosslinking was incomplete and prolonging the exposure led to RNA fragmentation (Data not shown). Formaldehyde cross-linking, which binds more specifically via free amino groups [46] was found more effective than UV. Before adding the carrier preparation to the biological sample, it was necessary to neutralize the excess formaldehyde, which is normally done with glycine. A recent study of the efficiency of glycine suggests using stronger nucleophiles such as Tris or lowering the solution pH as quick and efficient means of quenching residual formaldehyde [39]. Tris was the preferred option, since it was not clear that lowering the pH would neutralize the formaldehyde without damaging the polyribosomes. Using the method described here, the polyribosomal nature of the isolated bovine RNA can be inferred from its position in the sucrose gradient. Further validation was obtained using EDTA to disrupt the polyribosomes by sequestering Mg2+. The shift observed in the abundance of the amplified CDK1 fragment towards lower density fractions following this disruption is indicative of the polyribosomal nature of the bovine mRNA in the higher density fractions. The strength of the approach used here was assessed 80 by quantifying the abundance of selected mRNA of genes known to be involved in oocyte maturation. Following the luteinizing hormone surge, the oocyte resumes meiosis and undergoes a sequence of events involving germinal vesicle breakdown (GVBD), first polar body extrusion and a second arrest at the metaphase of the second meiosis (MII) in preparation for fertilization. It is known that maturation promoting factor (MPF), a heterodimer composed of cyclin B1 (CCNB1) and cyclin-dependant kinase 1 (CDK1, formerly known as p34cdc2), must be activated for meiosis to resume. Once meiosis reaches the MII stage, the role of the CSF is to halt cell cycle until the ovule is fertilized (For reviews, see [47, 48]). We previously observed that in cattle, the GV-stage oocyte lacks the CCNB1 component but contains the CDK1 protein [49]. For activation of MPF, CCNB1 must be translated immediately after meiosis resumes but before germinal vesicle breakdown. Consistent with these observations, CCNB1 mRNA was found in the polyribosomal fraction at the GV stage, in addition to CDK1 mRNA. CSF is activated during a later stage of oocyte maturation prior to its involvement in arresting the cell cycle. However, it has been found that MOS is expressed readily during early stages of oocyte maturation, since it is involved in CCNB1 accumulation and displays an MPF stabilizing activity at the MII stage [50]. Following fertilization, both the MPF and CSF are rapidly degraded. Consistent with the activation of MPF, our results showed that levels of CDK1 mRNA and CCNB1 mRNA present on polyribosomes increased during the initial step of maturation while MOS, known to be involved throughout oocyte maturation, was equally present at all stages. This physiologically relevant profile was not observed when targeting total or poly(A)-bearing RNA. This is a strong confirmation that transcript abundance measured as total maternal mRNA pool need to be interpreted with care due to the contribution of the large contents of stored thus physiologically inert mRNAs. Finally, we also investigated the proportionality between specific polyribosomal mRNAs and their corresponding protein products. By definition, polyribosomal RNA encodes protein to be newly synthesized. In contrast, the protein content of a candidate results from both its synthesis and turnover rates. Nevertheless, of the three mRNA sequences studied in parallel by Western blot, all showed a shift in total protein that matched the shift in their polyribosomal status, confirming the added value of polyribosome-bound mRNA studies in terms of physiological information. 81 2.6 Conclusions The study of oocyte maturation and early development faces a major challenge regarding the physiological relevance of the abundance of total RNA or even poly(A) RNA. The presence of stored and hence inactive maternal RNA that marks developmental stages prior to embryonic genome activation can bias the subsequent interpretation of these measurements. We provide evidence that the study of polyribosomal mRNA offers a better option for studying the physiology underlying gametes and embryonic development especially when the cells are bearing large amounts of stored RNA. The procedure developed in the present study was shown to be robust and efficient for isolating polyribosomal mRNA from small amounts of cells. This polyribosomal mRNA can then be used for downstream transcriptomic studies. 2.7 Methods All chemicals were from Sigma-Aldrich (St-Louis, MO) unless specified otherwise. Oocyte recovery and selection Germinal vesicle (GV) oocytes were produced as described previously [51] from bovine ovaries collected at a commercial slaughterhouse and transported to the laboratory in a saline solution containing antimycotic agent. Cumulus oocyte complexes (COC) selected on the basis of having at least five layers of cumulus were washed three times in HEPESbuffered Tyrode’s medium supplemented with 0.3% bovine serum albumin, 0.2 mM pyruvic acid and 50 μg/ml gentamycin. Groups of approximately 50 COCs were placed in four-well Petri dishes containing 0.5 ml of maturation medium (composed of modified synthetic oviductal fluid medium with 0.8% bovine serum albumin, modified Eagle’s medium non essential amino acids, modified Eagle’s medium essential amino acids, 1 mM glutamine, 0.5 μg/ml follicle-stimulating hormone, 5 μg/ml luteinizing hormone and 1 μg/ml 17b-estradiol) under 0.5 ml of mineral oil. Germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II (MII) oocytes were obtained by incubating COCs at 38.5°C with 5% CO2 for 6 and 24 hours respectively. Maturation was stopped upon transfer to PBS-cycloheximide. Cumulus cells were removed by vortexing the tissue in PBS containing 100 μg/ml of cycloheximide to prevent translation and ribosome run off. The denuded oocytes were 82 washed at least three times with PBS cycloheximide to remove any remaining cumulus cells. Groups of 75 GV, GVBD or MII oocytes collected for polyribosomal extraction were separated from the PBScycloheximide by centrifugation at low speed. Carrier preparation Since a single bovine GV oocyte, even though enriched with stored RNA, may contain as little as 340 pg of total RNA [19] and polyribosomal mRNA represents only a small fraction of this total, conventional extraction methods for obtaining a UV-distribution profile on sucrose density gradient would require an unobtainable number of oocytes. We therefore devised an inert polyribosome support to serve as a marker and carrier in the sucrose gradient, allowing us to observe the distribution of single ribosomes and polyribosomes. RNA extracted from drosophila SL2 cells was used as a carrier because of its phylogenetic distance from cattle. SL2 cells were cultured at 28°C in complete Schneider’s Drosophila Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) containing 10% heatinactivated foetal calf serum (Hyclone, Logan, UT), 50 U/ml penicillin G and 50 μg/ml streptomycin sulphate (Invitrogen). To enhance translation and therefore increase the number of polyribosomes, these cells were starved for 3 hours in serum-free medium then stimulated for at least 150 min by adding 33% of fresh medium and 6.25% of heatinactivated foetal calf serum to the medium. Cells were harvested by centrifugation at 1,200 × g for 3 min at 4°C in the presence of 100 μg/ml cycloheximide and lysed in polyribosome lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.7, 150 mM KCl, 1.25 mM MgCl2, 1% IGEPAL, 0.5% deoxycholate, 200 μg/ml cycloheximide, 1000 U/ml Protector™ RNase inhibitor (Roche, Indianapolis, IN) supplemented with complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets (Roche, Indianapolis, IN) followed by triturating. The homogenate was then clarified by centrifugation at 12,000 × g for 20 min at 4°C and the absorbance of the supernatant was measured at 260 nm using a Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop, Wilmington, DE, USA). For each cross-linking test described below, clarified cytoplasmic extract was prepared from 8 × 106 cells. 83 Chemical cross-linking of Drosophila polyribosomes Formaldehyde was added to clarified cytoplasmic extract to give final concentrations of 0.2% to 3.37%. All crosslinking was done on ice for 45 min. Residual formaldehyde was neutralized by adding 0.1 M glycine [38]or Tris-HCl at concentrations of 0.15 M to 1.5 M with the pH adjusted to 8.7 or 10.9, followed by 20 min on ice. Each cross-linked and neutralized extract was then processed through the steps designed for isolation of polyribosomes from the gradient fractions. Cytoplasmic samples were mixed with guanidium isothiocyanate solution and the RNA fraction was ethanol precipitated overnight. The pellet was further purified by column chromatography (PicoPure, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Cross-linking efficiency was based on the yield of total RNA thus recovered. It was expected that with increased cross-linkage, more RNA would be covalently bound to and eluted with the protein fraction. The RNA-containing fraction eluted from the column was analyzed using a 2100 BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). To determine if the formaldehyde-treated material retained the potential to generate a normal polyribosomal fractionation profile, it was subjected to isokinetic sedimentation in sucrose density gradient as described below and the generated UV profile distribution was compared to one from an untreated sample. Oocyte sample preparation Since the polyribosome lysis buffer is unable to dissolve the bovine zona pellucida, oocytes were strongly vortexed with 1.0 mm zirconia-silica beads (BioSpec, Bartlesville, OK) in 50 μl of passive lysis buffer. The lysis product was transferred to a clean Eppendorf tube and the beads were discarded. Cell debris were removed by centrifuging at 12,000 × g for 20 min. The clarified solution was added to 100 μl of drosophila carrier. Each sample was loaded on a 4 ml linear sucrose gradient. Sucrose gradient preparation and centrifugation The linear sucrose gradient was generated using a SG-15 gradient maker (Hoefer, Holliston, MA, USA) following the manufacturer’s instructions with 10% and 60% solutions of sucrose in isotonic buffer made of 150 mM KCl, 1.25 mM MgCl2 and 50 mM 84 Tris adjusted to pH 8.7. The linear gradients were kept at 4°C until use. Cytoplasmic extracts were analyzed by sedimentation velocity in the sucrose gradients for 3 h at 34,000 rpm using a SW 60 Ti rotor (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). The gradients were processed using a BR-188 Density Gradient Fractionation System (Brandel, Gaithersburg, MD, USA). Fractions of 350 μl were collected with continuous monitoring of absorbance at 254 nm using an Isco UA-6 detector (Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA). The RNAcontaining fractions were collected directly in 428 μl of 5.25 M guanidinium thiocyanate (pH 5.5) and 3 μl (5 μg/μl) of linear polyacrylamide (Ambion, Austin, Texas, USA) were added to each as an RNA co-precipitant. Isopropanol was then added and the samples were left overnight at -20°C. The polyribosome-containing RNA precipitate thus obtained was then re-suspended in the extraction buffer provided with the RNA extraction PicoPure kit (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) and RNA content was assayed using the NanoDrop ND-1000 spectrophotometer. The polyribosomal nature of the isolated fractions was verified by adding 100 mM of EDTA to the lysis buffer and the sucrose gradient solutions to sequester Mg2+ and thereby disrupt any polyribosomes. Microarrays The hybridizations were performed on the custom-made BlueChip v1.3 cDNA microarray. This microarray contains 1153 expressed sequence tags collected from four subtracted libraries made from oocytes and early embryos [52]. For the determination of the optimal microarray hybridization temperature to avoid potential contamination from the carrier (Table 2-1) two technical replicates were performed for each tested temperature. To test the reproducibility of the polyribosomal isolation, six hybridization samples were prepared representing three biological replicates each performed in dye swap (two technical replicates). To test the method in a biological context (Figures 2-6 and 2-7), for each maturation stage, two biological replicates each containing 75 oocytes were used to generate hybridization samples. A total of 12 microarrays were hybridized including a technical replicate for each sample. RNA samples were amplified through two rounds of in vitro transcription using the RiboAmp kit (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Yields of antisense RNA were assayed on the NanoDrop ND-1000 spectrophotometer. For each microarray hybridization sample, 10 μg of antisense RNA was labelled using the ULS 85 aRNA labelling kit (Kreatech, Amsterdam, The Netherlands). To obtain more concentrated and cleaner output, Pico-Pure columns (Molecular Devices) were used for aRNA purification. The resulting labelled purified probes were heat-denatured at 90°C for 5 min and 50 μl of SlideHyb buffer #1 (Ambion) was immediately added. The slides were hybridized in the SlideBooster hybridization chamber (Advalytix, San Francisco, CA, USA) at the tested temperature for 18 h. Slides were washed twice in lowstringency buffer (2× standard saline citrate (SSC)/0.5% sodium dodecyl sulphate) for 15 min at 60°C. Washes were repeated with high-stringency buffer (0.5× SSC/ 0.5% sodium dodecyl sulphate) in the same conditions. Slides were then dipped three times in SSC 1× followed by three more dips in H2O, spun for 5 min at 1,200 × g at room temperature and scanned using a VersArray ChipReader (Virtek, Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada) supported by VersArray software (Bio-Rad). Signal intensity and local background were determined with Array-Pro Analyzer Ver4.5 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA). Pearson’s correlation coefficients were calculated based on net signal intensities of probes on the microarray that generated positive signals. The same approach was used to determine the optimal microarray hybridization temperature (Table 2-1). Positive signal threshold values were determined based on a net intensity cut-off value calculated from the background values + 2 standard deviations. For microarrays, data was pre-processed: 1) background was subtracted; 2) intra-array normalization was performed using Loess; 3) inter-array normalization was performed using Quantile. RT-PCR Total RNA was extracted using PicoPure columns (Molecular Devices). An on-column DNase 1 treatment was performed. The resulting RNA samples were reverse transcribed using the qScript Flex cDNA synthesis kit (Quanta, Biosciences, Gaithersburg, MD, USA). The reaction was primed using either an oligo dT (for poly (A) and polyribosomal RNA) or with random primers to target all mRNAs regardless of poly(A) length, in a total reaction volume of 20 μl. For PCR, primer sequences and details are listed in Table 2-2. For standard PCR (Figure 2-4), the distribution was repeated twice from biologically independent samples. The NovaTaq DNA Polymerase (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ, USA) was used and the amplification conditions were as follows: Hot start cycle, 10 min at 95°C; 30 PCR cycles (denaturing: 94°C for 30 sec; annealing: 60°C for 30 sec; extension: 72°C for 1 min) followed by a last 10 min extension at 72°C. The PCR products were loaded onto 1.5% 86 agarose gel for migration. For quantitative PCR, four biologically independent replicates were processed for all treatments and time points. A standard curve was generated using the template from a PCR product purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) and quantified with a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer. The standard curve consisted of five serial dilutions of the purified PCR products ranging from 0.1 pg to 0.01 fg. Quantification was achieved using the Light- Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) following the manufacturer’s recommendations. All reactions were conducted in a LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics). Primer annealing and fluorescence acquisition temperatures are listed in Table 2-2. Specificity of amplification was determined by sequencing the amplicon for each target and by the presence of a single peak on the melting curve. Data normalization could only be accounted by using samples containing the same amount of oocytes. Since quantifications were performed on different RNA populations (i.e. total RNA, poly(A) bearing and polyribosomal mRNA), data normalization could not be performed across these groups. Furthermore, usual housekeeping gene candidates could not be used for data normalization across oocyte maturation stages since their respective transcript abundance been reported to be fluctuating [53, 54]. As a consequence, absolute transcript measurements were considered where total variance includes both technical and biological variances. Western blot analysis Oocytes were frozen in groups of 25 in a minimal volume (1-3 μl) of PBS and stored at -80°C. Three pools of each maturation stage were re-suspended in 2× sodium dodecyl sulphate gel loading buffer (100 mM Tris-Cl, 4% w/v sodium dodecyl sulphate, 0,2% w/v bromophenol blue, 20% v/v glycerol, 10% b-mercaptoethanol) and heated to 95°C prior to loading. The samples were separated by SDS-PAGE (12% acrylamide). Proteins were transferred onto a nitrocellulose membrane (NitroBind Cast) using the wet transfer method and transferred proteins stained with Ponceau S red. The membranes were processed for immunoreactions with the primary antibody overnight at 4°C then with secondary antibody under the following conditions: STAT3 (no. 9132, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) diluted 1/1,000 - goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase diluted 1/200,000; DTX2 (no. 101938, Santa Cruz biotechnology, 87 Santa Cruz, CA) diluted 1/100,000 - anti-rabbit diluted 1/100,000; PTTG1 (no. 3305, Abcam) diluted 1/ 2,500 - anti-mouse diluted 1/40,000. Each candidate was immunoblotted in parallel with the usual housekeeping genes: b-actin (no. 4967, Cell Signaling Technology) diluted 1/10,000 - anti-rabbit diluted 1/200,000 or a-tubulin (Santa Cruz biotechnology 33999, diluted 1/ 250) - rabbit anti-goat IgG horseradish peroxidise (diluted 1/200,000)). Determination of the housekeeping gene products was done according to the molecular weight of the protein of interest to avoid overlapping signals. All secondary antibodies came from Invitrogen. Protein expression levels were quantified using GeneTools software (Syngene, Frederick, MD, USA). Statistical analysis and microarray data processing Significant differences were calculated using SAS software (SAS-Institute inc., Cary, NC). One-way ANOVA with Dunnett tests were conducted for all cross-linking tests by using standard extraction as control. Differences were considered statistically significant (*) at the 95% confidence level (P < 0.05) and highly significant (**) at the 99% confidence level (P < 0.01). For Figure 2-6, RNA abundance data were analyzed with one-way ANOVA using Tukey’s multiple comparison test. For Figure 2-7, protein and polyribosomal RNA levels were analysed with two-way ANOVA since interrelation between both are expected. Data with different letters are significantly different (P < 0.05). When ANOVA criteria were not met (normality and homogeneity of variance), data were transformed to logarithms. For microarrays, statistical testing was conducted using the statistical significance test from Limma using a Web-based tool, WebArray DB (http://www.webarraydb. org/webarray/index.html). Only candidates with statistically significantly different signal (p < 0.05) and with at least a twofold change were selected. 2.8 Authors' contributions SS carried out most of the experiments including the development of the carrier’s preparation, the method’s robustness assessment and all of its testing in biological contexts. She also drafted the manuscript. JPG carried out the preliminary conditions for carrier and oocyte preparation, assessed the linearity of the sucrose gradient, determined the optimal microarray hybridization conditions and initiated the method’s repeatability testing. MHD 88 performed some of the immunoblots. MAS supported the stipend of JPG and directed his academic program. EWK provided the expertise on polyribosomal and help to draft the manuscript. CR conceived the study, participated in its design and coordination, supervised the graduates and helped to draft the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. 2.9 Acknowledgements The authors thank Dr. Julie Nieminen (Université Laval, Canada) for critical review of the manuscript and language correction. This work received support from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant numbers 300712-04). SS received support in the form of a Graduate Scholarship from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. 2.10 References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Aoki F, Worrad DM, Schultz RM: Regulation of transcriptional activity during the first and second cell cycles in the preimplantation mouse embryo. Dev Biol 1997, 181(2):296-307. Bachvarova R, De Leon V, Johnson A, Kaplan G, Paynton BV: Changes in total RNA, polyadenylated RNA, and actin mRNA during meiotic maturation of mouse oocytes. Dev Biol 1985, 108(2):325-331. 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Reproduction 2010, 140(6):787-801. Figure 2-1 Effect of cross-linking on recovery of RNA extracted from Drosophila SL2 cells. A) Total RNA recoverable from cell extracts (the clarified supernatant) after cross-linking with various concentrations of formaldehyde; Micro-electrophoretic profile of the total RNA recovered from B) untreated cell extract; C) cell extract treated with 3.37% formaldehyde. 93 Figure 2-2 Neutralization of formaldehyde in Drosophila SL2 cell extract. Total RNA recovered from cell extracts (the clarified supernatant) treated with 3.37% formaldehyde, quenching the reaction using A) Glycine at pH 8.7; B) Tris at different concentrations and pH; C) Tris at a broad range of concentrations at pH 8.7 94 Figure 2-3 Distribution of Drosophila SL2 polyribosomes in sucrose density gradient fractions as detected by UV absorbance. A) Untreated cytoplasmic extract; B) Cytoplasmic extract treated with 3.37% formaldehyde and quenched with 1 M Tris. Ribosomal subunits (40S and 60S), monoribosomes (80S), polyribosomes and corresponding fraction numbers are indicated. Top of gradient corresponds to fraction 1. 95 )LJXUH&RQILUPDWLRQWKDWWKHKLJKVHGLPHQWLQJPDWHULDOVFRQWDLQSRO\ULERVRPHV &HOOV ZHUH O\VHG DQG IUDFWLRQDWHG LQ WKH SUHVHQFH RU DEVHQFH RI ('7$ 573&5 ZDV XVHG WR DPSOLI\WKH$&7%DQG&'.VHTXHQFHVIURP51$LVRODWHGUHVSHFWLYHO\$IURPJUDQXORVDFHOOV DQG%IURP*9VWDJHRRF\WHV7RSRIJUDGLHQWFRUUHVSRQGVWRIUDFWLRQ 96 Figure 2-5 Reproducibility of the polyribosome mRNA extraction method. Distribution of microarray signal intensities obtained from two independent biological replicates. The mean correlation value of all three replicates is indicated. 97 Figure 2-6 Determination of total, poly(A) and polyribosomal RNA in oocytes at different stages of physiological maturation. Quantitative RT-PCR was used to amplify the following sequences: A) CDK1; B) CCNB1; and C) MOS. GV = germinal vesicle; GVBD = germinal vesicle breakdown; MII = metaphase II. For each RNA population different superscript indicate statistically significant difference (p < 0.05). 98 Figure 2-7 Relative abundance of selected polyribosomal mRNA sequences and corresponding proteins. Immunoblots were prepared from oocytes at the GV, GVBD and MII stages. The three candidates were selected based on microarray data. A) Deltex 2 (DTX2); B) Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3); C) Pituitary tumour-transforming gene 1 (PTTG1). b-actin (ACTB) and atubulin (TUBA) were used as indicators of protein loading. For each component different superscript indicate statistically significant difference (p < 0.05). 99 Table 2-1 Proportion of detected microarray signals above threshold Species Bos taurus Drosophila melanogaster 100 Hybridization temperature (°C) 55°C 60°C 65°C 61% 47% 36% 20% 6% 0% Table 2-2 Description of RT-PCR or PCR primers for examined genes Gene name Gene symbol Cyclin B1 CCNB1 Cyclin Dependant kinase 1 Primer sequences 5'-3' Amplicon size (bp) Annealing/ melting temp. (°C) Accession number F: ACC TGG CAA AGA ATG TGG TC R: GCT GTG CTA GAG TGC TGA TCT TAG 108 60/80 NM_001045872 CDK1 F: GAT CCT GCC AAA CGA ATT TCT GGC R: TCT GCT CTT GAC ACA ACA CAG GGA 121 60/78 NM_174016 Oocyte maturation factor MOS MOS F: CAA AGC ATT GTG CAC TTG GAC CTC R: TGG GTG TAA CAG GCT CTC CTT TGA 190 60/89 XM_590874 Actin beta ACTB F: CGC CAT GGA TGA TGA TAT TG R: GGT CAT CTT CTC ACG GTT GG 363 60/N/A NM_173979 101 3. Chapitre 3 : L’analyse des ARNm polyribosomaux révèle l’acquisition de la quiescence énergétique durant la maturation ovocytaire chez le bovin Sara Scantland, Gaël Cagnone, Éric Fournier, Carolina H. Macabelli, Dominic Gagné, Claude Robert Cet article n’a pas encore été soumis pour publication. 102 3.1 Résumé Contexte : Chez le bovin, la maturation ovocytaire, la fécondation et le développement embryonnaire précoce sont caractérisés par un silence transcriptionnel. Toutes les étapes menant à la maturation et au développement précoce dépendent exclusivement de l'usage d'ARNm maternels accumulés pendant la croissance de l'ovocyte. Ces ARNm maternels sont présents sous différentes formes: alors que certains entreprendront le processus de traduction (ARNm actifs), la plupart seront stockés dans le cytoplasme pour un usage futur ou tout simplement pour être dégradé. Ainsi, les profils transcriptomiques représentant la physiologie cellullaire des ovocytes et des embryons précoces sont difficiles à obtenir vu les difficultés techniques impliquées dans la séparation des ARNm actifs et des ARNm stockés. Puisque les ARNm actifs doivent être associés avec des polyribosomes pour permettre la traduction, la seule façon connue de distinguer des ARNm actifs des ARNm inactifs est l'isolation des polyribosomes. Cette méthode a été utilisée pour comparer le transcriptome actif des ovocytes en arrêt méiotique et celui d'ovocytes en métaphase II. Résultats : Les ARNm polyribosomaux d’ovocytes au stade de vésicules germinales et au stade de métaphase II ont été isolés. Des ARNm exogènes "crosslinkés" ont été ajoutés aux échantillons pour agir comme porteur afin d'obtenir des profiles UV de distribution polysomale. Les ARNm isolés ont été amplifiés linéairement et hybridés à des biopuces à ADN. L'analyse des biopuces a révélé une dysfonction mitochondriale aïgue et une diminution de la phosphorylation oxydative durant la maturation. Ceci est corroboré par des mesures du ratio ADP:ATP qui mènent à l'hypothèse d'un ovocyte MII "quiescent". La synthèse protéique est aussi grandement affectée: bien que moins d'ARNm polyribosomaux sont extraits dans les ovocytes MII en comparaison aux vésicules germinales, plusieurs fonctions cellulaires associées à la synthèse des protéines et à la voie de signalisation d'EIF2 sont réduites. Conclusion : L'effondrement de la production énergétique, la réduction de la synthèse protéique et les ratios ADP:ATP supportant l'hypothèse d'un stade MII quiescent pourraient être expliqués par l'importance de diminuer le métabolisme pendant la maturation. Ce métabolisme diminué pourrait aider l'ovocyte à survivre jusqu'à la fécondation et l'activation du génome embryonnaire. Ceci suggère que l'hypothèse de l'embryon quiescent pourrait entrer en jeu avant même la fécondation, pendant la maturation ovocytaire. 103 3.2 Abstract Background: In the bovine, oocyte maturation, fertilization and early embryo development are characterized by transcriptional silence. All of the steps leading to maturation and early development rely exclusively on the use of maternal mRNAs accumulated during the growth of the oocyte. These maternal mRNAs are present in different forms: while some of them undergo the process of translation (active mRNAs), most are stored in the cytoplasm for future use or are simply destined to be decayed. Thus, transcriptome profiles representing the underlying cell physiology of oocytes and early embryos are arduous to obtain due to the technical difficulties involved in separating active and stored mRNAs. Since active mRNAs must be associated with polyribosomes to allow their translation, the only known way to distinguish active from inactive mRNAs is polyribosomal isolation. This method was used to compare the active transcriptome profile of germinal vesicle and metaphase II oocytes. Results: Polyribosomal mRNAs from germinal vesicle and metaphase II oocytes were isolated. Samples were spiked with exogeneous crosslinked mRNAs as a carrier to obtain UV polysomal distribution profiles. The isolated mRNAs were linearly amplified and hybridized to microarrays. Analysis of the microarray data revealed acute mitochondrial dysfunction and oxidative phosphorylation breakdown during maturation. This is corroborated by ADP:ATP ratio measures which lead to the hypothesis of the «quiet» MII oocytes. Protein synthesis is also greatly affected: while fewer polysomal mRNAs are extracted in MII oocytes compared to GV oocytes, many cellular functions associated with protein synthesis and the EIF2 signaling pathway are reduced. Conclusion: The breakdown in energy production, the reduction in protein synthesis and the ADP:ATP ratio supporting the hypothesis of a quiet MII stage could be explained by the importance of lowering the oocyte metabolism during maturation. This lowered metabolism could help the oocyte survive until fertilization and activation of the embryonic genome. This suggests that the quiet embryo hypothesis is applicable even before fertilization, during oocyte maturation. 104 3.3 Introduction Growing oocytes accumulate large amounts of maternal mRNAs in their cytoplasm. In bovines, this crucial accumulation allows the oocyte and the future embryo to survive for many days without transcription. De novo RNA synthesis is undetectable during meiotic resumption [1, 2] and this transcriptional silence is maintained until embryonic genome activation (EGA) which occurs during the fourth cell cycle [3, 4]. Thus, when including the time needed for follicles to grow from 3 mm to their preovulatory size, maternal mRNAs can be stored for more than 2 weeks before entering translation or degradation (reviewed in [5]). In mice, the transcriptional silence period is much shorter since active transcription is still detected until the GVBD stage [6, 7] and a minor genome activation is initiated at the end of the zygotic stage [8]. Despite this, the half-lives of mice maternal mRNAs are also quite long, up to 28 days [9]. Therefore, developmental steps in the mouse can rely on de novo transcription, translation and post-transcriptional modifications whereas from the beginning of oocyte maturation, bovine development relies exclusively on translation and post-transcriptional modifications until EGA (reviewed in [10]). This process requires previously synthesized mRNAs to be recruited for translation in a time-specific and well orchestrated program. This recruitment for translation passes through ribosomal association on mRNAs to form polyribosomal mRNAs [11, 12]. Oocyte maturation and early embryo development are mostly studied through strategies involving the analysis of the transcriptome [13-15]. This approach can be useful to acquire a general view of changes in mRNA levels but provides very little information on protein synthesis since most maternal mRNAs are not translated. In this way, these studies bias the analysis of oocyte physiology. Proteomic approaches have been used to study protein synthesis but the scarcity of oocytes makes it difficult to obtain a satisfying resolution to provide insight on maturation, especially for low abundance proteins [16-18]. To remedy the issues of low information obtained by total RNA study and low resolution obtained by proteomic approaches, we decided to focus on the study of polyribosomal mRNAs to get a clearer picture of the active transcriptome and get closer to the proteome. Our team recently proposed a method to isolate polyribosomal mRNAs starting with as little as 75 oocytes using a sucrose density gradient [19]. This method is combined with polyribosomal mRNA amplification in order to get enough material to hybridize the samples on microarrays. To 105 our knowledge, only one other study used polyribosomal analysis in oocytes [20]. In this study, they also isolated polyribosomal mRNAs through sucrose gradient fractionation, but concentrated their efforts on mechanisms of translational regulation during oocyte maturation in the mouse. Many findings support the hypothesis that protein synthesis is highly limited during oocyte maturation and early embryo development. First of all, it was previously reported that oocytes and early embryos present atypically low 28S ribosomal RNA content, pointing out a limited translational potential and low ribosomal turnover [21]. Moreover, many studies found that the number of synthesized protein is lowered during maturation [18] and that a general reduction in the rate of synthesis of proteins occurs [22]. From an energy point of view, many authors have described the immature structure of mitochondria during oocyte maturation and concluded that they suffer from low efficiency in energy production [23, 24]. In this situation of low mitochondrial efficiency, the secret to the survival of the oocyte seems based on tightly coupled supply and demand of ATP [25]. Many processes during oocyte maturation have high energy demands but specific spatial redistribution of mitochondria may help meet this local demand [25-27]. Here, we show that less mRNAs are associated with polyribosomes within MII than there are in GV oocytes, and that many canonical pathways involved in translation show lower activity during maturation. With our polyribosomal study, we demonstrate that mitochondrial functions are impaired and that the oxidative phosphorylation pathway is highly disturbed during maturation. We speculate that mitochondrial dysfunction lead to the acquisition of a quiet metabolism during maturation. This quiet metabolism occurs by lowering energy production with mitochondria impairment and by lowering energy consumption with translational dismiss. Protein synthesis is a very costly process demanding large quantities of ATP, [28, 29] and lowering translation could help ensure a lower metabolism. Thus, the acquisition of a quiet metabolism could be vital for oocyte competence and further embryo development. 106 3.4 Results Polyribosomal extraction Drosophila cross-linked mRNAs were mixed to bovine oocyte samples to obtain polyribosomal profiles (Figure 3-1). These profiles allow us to extract polyribosomal mRNAs, which contain mRNAs that are being actively transcribed as well as potential noncoding RNAs (ncRNAs) which are associated to active polysomes as cofactors, all while discarding stored mRNAs. Polyribosomal fractions corresponded to the 6th to 12th tubes that were collected from the gradient. Since usual housekeeping candidates fluctuate during the stages of oocyte maturation, they cannot be used for data normalization [30]. As it was demonstrated in the previously published method [19], most of the drosophila cross-linked mRNAs are discarded during RNA extraction and less than 0,5% of the remaining drosophila contaminants (not crosslinked) are still present after extraction [19]. As the drosophila mRNAs escort the bovine mRNAs throughout the whole experimental process and have stable concentrations in all samples regardless of the oocyte maturation stage, they represent the most appropriate candidates for data normalization. Within the thirteen drosophila transcripts present on the microarray slides, the one presenting the smallest variation coefficient in microarray data was used to normalize bovine candidates. The RpS3 (Ribosomal protein S3) transcript was selected for data normalization due to its variation coefficient of 0,06 and its great stability in relative expression measured by RT-PCR (Data not shown). Microarrays Out of over 37,000 probes, 4032 targeted gene transcripts were presents in GV and 2791 in MII. 3295 are exclusively present in GV oocytes and 2004 in MII oocytes. 730 gene transcripts were shared by the two groups. Statistical analysis comparison revealed that 1926 genes were differentially expressed (P < 0,05; fold change > 2), the great majority being downregulated in MII (1621 gene transcripts, 85%). Only 248 gene transcripts were upregulated in MII (Figure 3-2). 107 Functional analysis The Ingenuity software allows the analysis of thousands of transcripts simultaneously and the building of schematic representations of important pathways in oocyte maturation. By determining which polyribosomal mRNAs are enriched within each condition, the Ingenuity software allows us to understand which cellular functions and canonical pathways are most affected during maturation. Thus, we found that protein synthesis, RNA post-transcriptional modification, gene expression, post-translational modifications and protein folding are all lowered in MII oocytes compared to GV oocytes. Another important function underrepresented in MII oocyte is energy production, which seems absent. Cell cycle related functions are some of the only ones to be higher in MII oocytes, an unsurprising result given that oocyte maturation is characterized by cell cycle progression (Figure 3-3). Amongst canonical pathways, polyribosomal mRNAs associated with EIF2 signaling, oxidative phosphorylation and mitochondrial function are highly enriched in GV compared to MII oocytes (Figure 3-4). EIF2 signaling is related to protein synthesis while oxidative phosphorylation and mitochondrial function are associated with energy production. Table 3-1 presents the log-ratios and the enrichment p-values of molecules associated with mitochondrial function that are downregulated during maturation as well as a representation of oxidative phosphorylation pathways associated with the different mitochondrial complexes that are impaired during maturation. As mitochondria are the organelles responsible for cellular respiration, a downregulation of the oxidative phosphorylation pathway can be associated with mitochondrial dysfunction. Table 3-2 presents the logratios and the enrichment p-values associated with different molecules in EIF2 signaling. RT-PCR validation To allow confident interpretation of the results obtained through microarray hybridizations, we performed several QPCR validations. Seven differentially expressed candidates in the oxidative phosphorylation (all except EIF3M and RPL18) and mitochondrial function 108 (ATP5A1, ATP5C1, NDUFB2, NDUFA8) pathways as well as protein synthesis pathway (EIF3M and RPL18) were quantified in three biological replicates of each oocyte stages. All results demonstrated positive validation of differential expression, 45% (4/9) with a pvalue < 0,05, 45% (4/9) with a p-value < 0,01 (Figure 3-5) and one with a tendency value (p<0,10). These validations attest the microarray results and their interpretation. ATP level, ADP level and ADP:ATP ratio in the oocyte The ADP:ATP ratio is an interesting tool to evaluate cellular metabolism (proliferation, growth arrest, apoptosis or necrosis). In a general way, cells in growth arrest show slightly elevated ATP level with little or no change in ADP levels compared to control. Thus, cells in quiescence are accumulating low level of ATP without using it. The ADP:ATP ratio decreases. In contrast, cell in apoptosis show low ATP level and increased ADP level, revealing a high used of ATP without capacity to produce de novo ATP. The ADP:ATP ratio increases. When we compared matured oocytes (MII) to immature oocytes, our results demonstrate a slightly increased in ATP level with no change in ADP level; ADP:ATP ratio tend to lower but it is not significant (Figure 3-6). 3.5 Discussion Polyribosomal mRNA This study provides a general picture of polyribosomal transcripts during oocyte maturation. The method used to specifically isolate polyribosomal mRNAs allows for greater insight in active transcriptome analysis by discarding the noise inherent in stored mRNAs. Thus, we get closer to proteomics. Oocyte and embryo scarcity represents an important challenge in transcriptomic and proteomic studies. The method used here requires a significantly larger number of oocytes (groups of 75 oocytes) than the study total mRNA (where 5 to 10 oocytes are usually sufficient), but allows us to accumulate far more and especially much more accurate information. Since association of an mRNA with ribosomes correlates with active translation, the specific isolation of polyribosomal mRNA brings us one step closer to the proteome and gives us a better view of oocyte physiology. In 2011, the team of Marco 109 Conti used a similar method based on sucrose gradient fractionation to obtain information on translational control during oocyte maturation and fertilization in the mouse [20]. Their method doesn’t use exogenous RNA, and thus more than 500 oocytes and embryo had to be pooled for each replicates. While this herculean effort was greatly rewarded by the discovery of a novel mechanism that controls a late wave of translation in mouse oocytes, the sheer amount of oocytes and embryos needed to get this information is not within the reach of most teams, especially given that production costs of embryonic material rises continually. By using only 75 oocytes, the method presented herein is much more accessible and could reach much wider usage. Reduction in protein synthesis According to our microarray analysis, over 6,000 transcripts are associated to polyribosomes during bovine oocyte maturation. This result is very similar to the one obtained by [20], where around 7,600 polyribosomal transcripts were identified in mouse oocytes during maturation. According to our results, many evidences support an important translation reduction during maturation. We observed 32% less transcripts associated with polyribosomes in MII oocytes compared to GV oocytes (2791 transcripts in MII compared to 4082 transcripts in GV) (Figure 3-2). Furthermore, many new transcripts appear during maturation but are generally weakly translated. Thus, only 248 transcripts over 2791 are significantly overexpressed in MII compared to GV (Fold change >2.0 and p-value < 0,05) (Figure 3-2). On the contrary, almost half the transcripts present in GV are significantly overexpressed compared with MII oocytes, suggesting a high expression of GV transcripts. The low number of transcripts present on polyribosomes in MII and their weak expression suppose a wide-ranging reduction of translation during oocyte maturation. The reduction in protein synthesis inferred through the low number and low expression of polyribosomal transcripts in MII compared to GV is also substantiated by the changes observed in molecules enrichment in cellular functions and canonical pathways during maturation. Analysis by Ingenuity reveals a marked impoverishment in molecules associated with cellular functions related to translation such as protein synthesis, RNA post-transcriptional modification and in general gene expression. General post-translational modifications and protein folding also seem to be lowered during maturation. Amongst 110 canonical pathway, the EIF2 pathway is the most impoverished in molecules associated. mRNAs as important as PABP, PAIP1, many EIFs (eukaryotic initiation factors) and mRNAs associated with 40S and 60S ribosomal subunit are impoverished on polyribosomes in MII. All these molecules are highly important in translation initiation. Therefore, their downregulated expression certainly impairs translation (Table 3-2, Figure 3-7). The reduction in translation rate during oocyte maturation and early embryo development has already been observed by others [18, 21, 22]. The number of synthesized protein is lowered during maturation [18] and a general reduction in the rate of synthesis of each protein occurs [22]. These results are confirmed by our study. Furthermore, atypically low 28S ribosomal RNA content points out a limited translational potential and a restrained ribosomal turnover during oocyte maturation and early embryo development [21]. In the mouse early embryo, most of the ribosomes are not associated with the translating fractions; once again suggesting limited protein synthesis ability [31]. Thus, decrease in protein synthesis has been observed in many ways by others but ours results reveal for the first time that in mature oocytes: fewer mRNA are associated with polyribosomes, polyribosomal mRNA are weakly expressed compared to the ones in GV oocytes and fewer polyribosomal mRNA promote translation initiation and protein synthesis pathways. Of course, translation remains absolutely vital for oocyte maturation [32-35]. Among other things, protein synthesis is essential for GVBD, MI and MII progression and to maintain MII before fertilization. Spatio-temporally expression of protein allows the progression of oocyte maturation [35, 36]. Nevertheless, the oocyte decreases translation during oocyte maturation and this low translation rate seems to persist throughout early embryo development [21, 37]. Well-orchestrated translation mechanisms could probably ensure the synthesis of essential proteins while inhibiting the synthesis of non-essential ones [20, 38]. One of the really few functions that seem to be higher in MII oocytes than in GV oocytes is the function of cell cycle. This rise in cell cycle function is logical since progression from GV to MII oocytes is a progression in meiosis cell cycle. This specific rise of protein synthesis could support the idea that only a range of proteins favourable to survival are produced while the others are inhibited. 111 Mitochondrial dysfunction Another cell function affected during oocyte maturation is energy production. During maturation, the form of mitochondria changes to become more triangular with a hooded end. They present a dense matrix with relatively few cristae which are retracted at the periphery. This structure is indicative that mitochondria are immature and have a low efficiency in energy production [23, 24]. This is reflected in our results, as we found that most of the respiratory complexes subunits are less expressed during maturation, increasing mitochondrial dysfunction. Oxidative phosphorylation is also seriously affected, supporting the observed mitochondrial phenotype (Figure 3-8). Some could argue that oxidative phosphorylation could not be downregulated during maturation since ATP production is absolutely necessary for oocyte survival. Many authors have already discussed the importance of this unique phenotype in oocytes and its impact on metabolism [39-41]. All agree that immature mitochondria cannot be associated with a complete cessation of energy production which will inevitably provoke cell death. It seems that the low respiratory chain efficiency is counteracted by the high number of mitochondria in oocytes. At least in mice, despite the low ATP production of each individual mitochondrion, the large number of mitochondria allows the production of most of the ATP used by the oocyte [42]. Large-scale ATP quantity variations are observed in MII oocytes [39]. Oocytes containing few mitochondria (between 20 000 and 60 000 mitochondrial genome copies) are associated to low metabolic capacity and a higher rate of fertilization failure [40]. Thus, if the number of mitochondria in the oocyte is not sufficient to counterbalance their weak efficiency, essential processes in the cell will be prevented and oocyte competence will be compromised. Nevertheless, low efficiency of mitochondria could have an important role in oocyte competence. Oocytes containing a very high number of mitochondria or containing mitochondria highly competent for oxidative metabolism could be unable to regulate their production of reactive oxygen species (ROS), which could lead to an irreversible toxicity during maturation or later during development. A premature failure in embryo development in mutant mice has been linked to high levels of oxidative phosphorylation and ATP production [43]. A high concentration of ROS could provoke cytoplasm deterioration and induce apoptosis [41]. By lowering oxidative phosphorylation, mitochondrial dysfunction 112 causes a reduction in the production of ROS. Therefore, immature mitochondria in the oocyte and in the early embryo could be vital for developmental competence. In this way, our results support the hypothesis of many others: for the first time, oxidative phosphorylation downregulation during maturation is supported at what is nearly the proteomic level. Mitochondria could not be efficient if essential mRNAs were no longer translated. The secret for oocyte survival seems to rely on tightly coupled supply and demand of ATP [25]. Many processes during oocyte maturation have high energy requirements, but a specific spatial redistribution of mitochondria may help meet such local demands. Indeed, such a continual redistribution of mitochondria occurs during oocyte maturation, and proceeds in accordance with differential ATP requirements [25-27]. This balance between energy production and energy consumption keeps intracellular ATP levels stable while avoiding superfluous ROS production. Moreover, it has been demonstrated that localised mitochondrial activity could be stimulated by molecular mechanisms. For example, at fertilization, spermatozoid entry in the oocyte could stimulate local mitochondrial respiration in order to provide the surging ATP needs associated with fertilization (cortical granules exocytosis, polar body extrusion, calcium homeostasis) [25]. It is interesting that mitochondrial preparation in the oocyte seems to have an important impact in later development. Blastocysts produced from immature oocytes aspirated post-mortem appeared to carry mitochondrial dysfunctions that are not present in blastocysts produced from immature oocytes collected from FSH-stimulated follicles (obtained by transvaginal ovum pick-up). Moreover, while the transcriptomes of these two kinds of blastocysts are very similar, the blastocyst yields on day 7 are highly superior (55% vs 30%) with FSH-stimulated follicles. Thus, it seems that some mitochondrial preparation is necessary before oocyte maturation and that the absence of this preparation phase could impact on blastocyst quality later in development. Oocyte metabolism ADP:ATP ratio is a useful tool to evaluate cell status according to proliferation, growth arrest, apoptosis or necrosis in cell. Our results support the idea that the matured oocytes are more quiescent than GV oocytes. The slightly increased level of ATP in MII compared to GV without change in ADP level are signs of growth arrest. This means that the oocyte lower its metabolism, leading to lower ATP consumption and slightly ATP accumulation in 113 the cytoplasm. The slight decrease observed in ADP:ATP ratio is yet not significant. In this case, growth arrest could represent the entry in a static stage where the oocyte is awaiting fertilization. It could seem contradictory that ATP level increases in matured oocyte despite the shift to potentially less efficient ATP production due to mitochondrial dysfunction. Nevertheless, this situation has already been observed in cells suffering from less efficient ATP production. In response to hypoxia, cardiomyocyte cells tend to decrease ADP:ATP ratio despite a shift from oxidative phosphorylation to less efficient anaerobic respiration [44]. Just as we conclude that matured oocytes reduced their metabolism, the authors conclude that cells reduced ATP utilization by reducing contractility therefore, reducing their metabolism. They supposed that cells tend to conserve ATP as a temporary measure to maintain viability during transient hypoxic episodes. In the oocyte, ATP could be conserved to maintain viability until EGA since it is at this moment that mitochondria recover their usual form and should recover their full ability to produce ATP. 3.6 The Quiet Oocyte The quiet embryo hypothesis is well known. It posits that the embryo viability benefits more from a quiet metabolism than from an active metabolism [45]. It is based among others things on the observation that embryos with a lower amino acid turnover are more likely to survive compared to embryos that have a higher amino acid turnover, which fail to develop [46]. The major use of amino acid in embryo is protein synthesis. The less metabolically active embryos lower their amino acid turnover, thus lower their protein synthesis, and are more apt at surviving until the blastocyst stage and implantation [45, 47, 48]. Our results tend to show that the quiet hypothesis could be applied even earlier, during oocyte maturation. It is well known that the fully grown oocyte is transcriptionally silent but our results point out that the oocyte also undergoes a translational reduction. This reduction could be associated to limited ribosomal turnover and inhibition of translation initiation mechanisms. A minimal translation, concomitantly to a well orchestrated protein synthesis program, could allow the synthesis of specific essential proteins for oocyte 114 maturation and, later, for early development. Furthermore, lowering translation ensures that energy demand is reduced significantly since translation is a process which demands large amounts of energy. Indeed, protein synthesis is the costliest process according to energy ATP demand [28, 29]. It is well known that hypoxia induces rapid inhibition of mRNA translation to favour energy conservation in the face of reduced capacity for oxidative metabolism [49, 50]. This corresponds well to the situation observed in oocytes since mitochondria are highly dysfunctional and oxidative phosphorylation is greatly reduced. Therefore, the reduction in mRNA translation may be crucial to answer to the new situation of low energy production in the oocyte and favour the quietness of the oocyte. The low energy production caused by mitochondrial dysfunction could be necessary for oocyte survival. Lowering ATP production could be a good mechanism to ensure that the oocyte lowered its metabolism by reducing the highest energy consuming process like translation. Evidently, minimal energy needs are necessary for oocyte maturation. But lowering energy turnover (need/production) seems to allow the oocyte to enter in a quiet mode that could be essential for survival. Moreover, a high ATP production by oxidative phosphorylation is harmful to the oocyte since the ROS production induces a cellular stress response and prevents the oocyte from maintaining quietness. Indeed, the reduction in protein synthesis and in energy production could underline an entry in latency. 3.7 Methods All chemicals were purchased from Sigma, Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) unless otherwise indicated. Oocyte preparation Oocyte collection and maturation were performed as described previously [19]. Briefly, cumulus oocytes complexes (COC) having a minimum of five layers of cumulus were washed in HEPES-buffered Tyrode’s medium supplemented with bovine serum albumine, pyruvic acid and gentamycin. Oocytes at germinal vesicle (GV) stage were collected, pipetted up and down to remove cumulus cells then washed in PBS containing 100 μg/ml of cycloheximide (CHX) to stop translation and to prevent ribosomal run-off. To obtain metaphase II oocytes (MII), groups of 50 COC were placed in four-well petri dishes in 115 maturation medium under mineral oil and incubated during 24 hours at 38.5°C with 5% CO2. MII oocytes were denuded the same way as GV oocytes. Denuded oocytes (DOs) were produced by denuding COC at the GV stage and allow DO to mature for 24 hours in the same way as MII oocyte. Cocultured DOs (coDOs) were obtained by coculturing DOs with COC in a 1:1 ratio for 24 hours. Groups of 75 GV or MII oocytes were collected for polyribosomal fractionation. For ATP/ADP ratio assays, groups of 5 oocytes were obtained in the same way. Carrier preparation, crosslinking and neutralization Fractionation methods using UV-distribution profiles on sucrose density gradients require micrograms of RNA. Unfortunately, since each oocyte contains as little as 340 pg of total RNA [21], it is practically impossible to obtain enough oocytes to produce a visible polyribosome specific UV-distribution profile. To counter this problem, exogenous RNA from drosophila SL2 cells was used as a carrier. Drosophila cells were chosen due to their phylogenetic distance from cattle and their easy and rapid production. Drosophila RNAs were extracted as previously described [19]. Briefly, drosophila SL2 cells were cultured at 28°C, starved for 3 hours in serum-free medium then stimulated for 150 minutes by adding 33% fresh medium and 6,25% of heat-inactivated fœtal calf serum. Cells were harvested by centrifugation and lysed in polyribosome lysis buffer by triturating. The homogenate was clarified by centrifugation. Formaldehyde was added to the supernatant at a final concentration of 3,37% for 45 minutes on ice. Residual formaldehyde was neutralized by adding 1,5 M of Tris-HCL pH 8,7 for 20 minutes on ice then conserved at -80°C until processing. Polyribosomal sample preparation Oocytes used for polyribosomal fractionation were strongly vortexed with 1,0 mm zirconiasilica beads in 50 μl of polyribosome lysis buffer to break the bovine zona pellucida. After lysis, 50 μl of drosophila carrier sample was mixed to the dissolved oocytes and was then transferred in a new tube to discard the beads. Cell debris were removed by centrifuging at 12,000 x g for 20 minutes at 4°C. Each sample was loaded on a 4 ml linear 15%-45% sucrose gradient generated using a SG-15 gradient maker (Hoefer, Holliston, MA, USA). 116 Sucrose solutions were prepared in isotonic buffer made of 150 mM KCl, 1,25 mM MgCl2 and 50 mM Tris adjusted to a pH of 8,7. The linear gradients were kept at 4°C until use. Once the bovine-drosophila mixed RNA was drop off on the top of the sucrose gradient, it was ultracentrifugated for 3 hours at 34,000 rpm using a SW 60 Ti rotor (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). The gradients were processed using a BR-188 Density Gradient Fractionation System (Brandel, Gaithersburg, MD, USA). Fractions of 350 μl were collected with continuous monitoring of absorbance at 254 nm using an Isco UA-6 detector (Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA). Each fraction was collected directly in 12 tubes containing 428 μl of 5.25 M guanidinium thiocyanate (pH 5.5) and 2 μl (5 μg/μl) of linear polyacrylamide (Ambion, Austin, Texas, USA) that acts as an RNA co-precipitant. Fractions corresponding to polyribosomal RNA were defined according to the UVdistribution profile and pooled in 30 ml Corex tubes. To allow additional normalization, 1 μl of 1/10,000 ERCC spikes was added to the polyribosomal sample. NaOAC 3M ph 5,5 and 100% ethanol were added to allow RNA precipitation. Samples were left overnight at 20°C. RNA precipitates were then re-suspended in the extraction buffer provided in the PicoPure RNA extraction kit (Life Science) and extracted with this kit. This step allows the discarding of most of the drosophila mRNA since the cross linked RNAs are not retained on the column [19]. Microarrays Polyribosomal mRNA samples were amplified by in vitro transcription using RiboAmp HS plus RNA amplification kit (Life Science) to obtain antisense RNA. 825 ng of antisense RNA was labelled using ULS Fluorescent Labeling Kit (Kreatech) and hybridized on a microarray slide. The microarray slides were Agilent-manufactured EmbryoGENE slides [51] modified to include 208 probes corresponding to 13 drosophila genes with 2 different sequences repeated 8 times for each drosophila candidate. These probes were used for data normalisation. Slides were hybridized for 17 hours at 65°C then washed for 1 minute in gene expression wash buffer 1, 3 minute in gene expression buffer 2 then 10 seconds in 100% acetonitrile and 30 seconds in stabilization and drying solution (Agilent). Immediately after the washing step, the hybridized slides were scanned using PowerScanner (Tecan) and analysed with Array-pro 6.3 (MediaCybernetics). 117 Microarray normalization and analysis Intensities within each array were normalized using a method inspired by [52] using the drosophila probes as controls. First, a loess curve was fitted over the differences in intensity between the drosophila probes on each array and their inter-array means. These loess curves were then subtracted from the intensity distribution of each array. Intensities were further subjected to scale normalization using the normalizeBetweenArrays method from the Limma package [53] to yield the final normalized data. To determine which transcripts are present within each maturation stage, we calculated the average intensity of each probe across all arrays representing the same condition. Background signal was estimated in a similar way, using Agilent negative control probes. To increase the stringency, we labeled a transcript as "present" if its average intensity minus 2 standard deviations (SD) was above the average intensity of negative control probes plus 4 SD. Fold-changes were then calculated using the linear model provided by the lmFit and ebayes_fit methods of the Limma package. Genes were considered differentially expressed if they showed an absolute log ratio above one and had a p-value below 0.01. All raw data and analysis scripts for this analysis are available at http://embbioinfo.fsaa.ulaval.ca/bioinfo/html/Scantland2013/. Enrichment analysis Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) was used for data analysis. The software allows identifying functions and canonical pathways that are the most significant in the data set. The p-value is calculated with the right-tailed Fisher’s Exact Test. This test allows asking if the dataset is significantly enriched in molecules with a particular annotation. The significance value is a measure of the risk that the association between a dataset and a function or a canonical pathway is due to random chance. In canonical pathway analysis, moreover than the p-value, the software allows getting a ratio of the number of molecules from de dataset that map to the canonical pathway displayed. Visual representations are also obtained with this system. Each molecule is presented in a 118 color code. Green and red symbol represented genes respectively down- and up- regulated in MII compared to GV. Gray symbols represented genes with significant but not different expression between conditions and white symbols represented genes that are not present on the microarray. A fold-change cut-off of 2.0 and a P value < 0.05 were used to identify significantly differentially regulated transcripts in each dataset. Real Time-PCR To validate candidates identified during microarrays analysis, an aliquot of the amplified RNA sample was reverse transcribed using qScript Flex cDNA synthesis kit (Quanta). The use of random primers instead of oligo dT primers was necessary since the amplification produced antisens RNA. For real-time PCR, primer sequences were designed in order to obtain short amplicons (less than 120 nuceotides) near the poly(A) tail to account for the short products obtained after 2 rounds of mRNA amplification. The PCR products were purified with QIAquick PCR purification kit (Qiagen) and were sequenced to demonstrate specificity. A standard curve from 0,1 pg to 0,01 fg was produced to allow relative quantification. Light-Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche) was used to quantify the sample with Light Cycler 2.0. The acquisition temperature of each product was determined according to the single melting peak on the melting curve (Table 3-3). Data normalisation could not be performed across oocyte maturation stages using usual housekeeping genes since their relative abundance fluctuates between stages [30, 54]. Thus, the most stable remaining drosophila genes were used to normalize the candidates. ADP:ATP ratio The ATP and ADP content of GV and MII oocytes was measured using the commercial EnzylightTM ADP:ATP ratio assay kit (Bioassay systems, Hayward, CA) based on the luciferin-luciferase reaction. Briefly, groups of 5 oocytes were collected. All oocytes were snap-frozen by liquid nitrogen in a maximum of 10 μl of PBS. Just after thawing, around 10 zirconia-silica beads were added to the sample and vigorously vortexed to blow up the oocytes and allow the release of oocyte component. The 10 μl were then transferred in a 96-wells plate and 90 μl of ATP reagent was added to each sample. ATP levels were measured after 1 min (Relative luminescence unit, RLU A). To measure ADP levels, the 119 samples were read again after 10 min (RLU B) then 5 μl of ADP reagent was added. The samples were read again after 1 minutes (RLU C). ADP levels were calculated by RLU C – RLU B. ATP and ADP were measured using a luminometer (BMG Labtech, FLUOstar Omega, Cary, NC). A mixed seven-point standard curve (64 pmol ADP with 64 pmol ATP, 0 pmol ADP with 32 pmol ATP, 2 pmol ADP with 16 pmol ADP, 4 pmol ADP with 8 pmol ADP, 8 pmol ADP with 4 pmol ATP, 16 pmol ADP with 2 pmol ATP and 32 pmol ADP with 0 pmol ATP) was included in each assay. The quantitative ATP and ADP content were determined according to the linear regression of their respective standard curve. ADP:ATP ratios were determined according to the linear regression of the standard curve obtained with the different non-negative ratios. 3.8 References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 120 Fair T, Hyttel P, Greve T, Boland M: Nucleus structure and transcriptional activity in relation to oocyte diameter in cattle. Mol Reprod Dev 1996, 43(4):503-512. Hyttel P, Fair T, Callesen H, Greve T: Oocyte growth, capacitation and final maturation in cattle. Theriogenology 1997, 47(1):23-32. Kopecny V, Flechon JE, Camous S, Fulka J, Jr.: Nucleologenesis and the onset of transcription in the eight-cell bovine embryo: fine-structural autoradiographic study. Mol Reprod Dev 1989, 1(2):79-90. Memili E, First NL: Control of gene expression at the onset of bovine embryonic development. Biol Reprod 1999, 61(5):1198-1207. Scantland S, Macaulay A, Robert C: RNA Processing During Early Embryogenesis: Managing Storage, Utilisation and Destruction, RNA Processing. RNA processing 2011. 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Comparison analysis of cellular functions affected by oocyte maturation. Protein synthesis and energy production are greatly diminished while cell cycle functions are upregulated in MII. The xaxis displays the -log of p-value which is calculated by Fisher's exact test right-tailed. The significance threshold correspond to –log(p-value at 0,05). 126 Figure 3-4 Comparison analysis of canonical pathways. Comparison analysis of canonical pathways affected during oocyte maturation.EIF2 signaling, oxydative phosphorylation and mitochondrial function are greatly diminished in MII oocytes. The x-axis displays the -log of p-value which is calculated by Fisher's exact test right-tailed. The significance threshold correspond to –log(p-value at 0,05). 127 Figure 3-5 RT-PCR validations. Differentially expressed candidate genes associated with mitochondrial function (ATP5A1, ATP5C1, NDUFA8, NDUFB2), oxidative phosphorylation (The precedents + ATP5G1, ATP6V0D1, TCIRG1 ) and EIF2 signaling (EIF3M, RPL18). * is significant, ** is highly significant, T is tendency. EIF3M: eukaryotic translation initiation factor 3, subunit M; ATP5A1: ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1; ATP5C1: ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, gamma polypeptide 1; ATP5G1: ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit C1 (subunit 9); ATP6V0D1: ATPase, H+ transporting, lysosomal 38kDa, V0 subunit ; NDUFA8: NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 8; NDUFB2: NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 2; RPL18: Ribosomal protein L18 ; TCIRG1: T cell, immune regulator 1, ATPase, H+ transporting, lysosomal V0 protein A3 128 Figure 3-6 ATP and ADP:ATP ratios during oocyte maturation. Comparison of ATP and ADP:ATP ratio between GV oocyte and MII oocyte. 129 Figure 3-7 Reduction of EIF2 signaling during oocyte maturation. Different molecules associated with translation initiation down-regulated in MII oocytes compared to GV oocytes. Schematic representation of mRNA expression. Color intensity represents fold change intensity. Red color represents downregulated gene while green color represents upregulated gene. White color is for non differentially expressed gene. EIF2: eukaryotic translation initiation factor 2; EIF3: eukaryotic initiation factor3; EIF4A: eukaryotic initiation factor 4a; EIF4E: eukaryotic translation initiation factor 4E; EIF4G: eukaryotic translation initiation factor 4G ; EIF5: eukaryotic translation initiation factor 5; PABPC1: poly(A) binding protein, cytoplasmic 1 ; PAIP1: poly(A) binding protein interacting protein 1 ; 40S: eukaryotic small ribosomal subunit ; 60S: eukaryotic large ribosomal subunit; 80S: eukaryotic ribosome. 130 Figure 3-8 Reduction of oxidative phosphorylation during oocyte maturation. Schematic representation of reduction in translation of the 5 oxydative phosphorylation complexes during oocyte maturation. Color intensity represents fold change intensity. No gene are upregulated. 131 Table 3-1 Log-ratios and p-values associated with molecules related to mitochondrial function with schematic representation of the associated mitochondrial respiratory complexes. Complex 1 : NADH deshydrogenase Complex 3: Cytochrome bc1 complex Gene symbol Gene symbol Log-ratio p-value -1,037 -2,251 -4,128 -2,770 -1,370 -2,015 -3,760 -1,260 -1,381 0,018 0,032 0,008 0,011 0,009 0,011 0,022 0,006 0,003 CYC1 -1,042 0,020 UQCR11 -1,899 0,022 Complex 4: Cytochrome oxydase NDUFB8 -1,636 0,009 NDUFB9 -2,458 0,016 NDUFS2 -2,728 0,007 NDUFS3 -2,200 0,035 NDUFS5 -3,862 0,012 NDUFS7 -2,189 0,003 NDUFV2 -3,645 0,013 Complex 2 : Fumarate reductase COX5A -3,542 0,006 COX5B -3,124 0,010 COX6B1 -1,933 0,008 COX6C -1,525 0,020 COX7A1 -1,541 0,016 COX7A2 -2,544 0,022 COX7A2L -1,568 0,013 COX6A1 -3,343 0,015 SURF1 -2,713 0,005 Complex 5: ATP synthase NDUFA11 NDUFA5 NDUFA8 NDUFA9 NDUFAB1 NDUFB11 NDUFB2 NDUFB4 NDUFB5 Gene symbol SDHA SDHB SDHC 132 Log-ratio -1,939 p-value 0,006 -2,874 -1,619 0,005 0,012 Gene symbol COX4 Log-ratio Log-ratio -1,313 p-value p-value 0,004 Gene symbol Log-ratio p-value ATP5A1 ATP5B ATP5C1 ATP5G1 ATP6V0D1 TCIRG1 -1,670 -1,223 -2,195 -3,892 -3,860 -3,996 0,009 0,010 0,006 0,018 0,018 0,008 Table 3-2 Log-ratios and the p-value associated with different molecules in EIF2 signaling pathway Eukaryotic initiation factor Gene symbol Log-ratio EIF3B 1,514 EIF5 -1,647 EIF2S1 -1,193 EIF3C -3,874 EIF3D -1,156 EIF3F -3,236 EIF3I -2,006 EIF3J -1,233 EIF3K -1,854 EIF3M -4,37 EIF4E -1,477 p-value 6,39E-03 6,62E-03 3,97E-03 1,28E-02 3,33E-02 4,73E-03 8,65E-03 1,83E-02 2,40E-03 2,15E-02 1,44E-02 Poly(A) binding protein related Gene symbol Log-ratio p-value PABPC1 -1,347 9,31E-03 PAIP1 -1,216 6,80E-03 40S ribosomal subunit Gene symbol Log-ratio RPS5 -2,696 RPS6 -2,774 RPS7 -1,046 RPS8 -1,301 RPS11 -1,209 RPS13 -2,062 RPS15 -1,797 RPS24 -2,383 RPS15A -1,17 RPS27L -1,736 RPS3A -1,962 RPS4Y1 -3,808 p-value 7,06E-03 9,67E-03 4,76E-03 8,70E-03 1,65E-02 2,08E-03 6,03E-03 2,62E-02 4,89E-02 2,24E-02 3,06E-02 9,55E-03 60s ribosomal subunit Gene symbol Log-ratio RPL3 -1,774 RPL4 -1,974 RPL6 -1,768 RPL7 -2,584 RPL8 -1,489 RPL12 -2,608 RPL13 -2,851 RPL15 -2,76 RPL18 -3,023 RPL23 -1,185 RPL24 -2,286 RPL26 -2,896 RPL28 -1,837 RPL31 -1,188 RPL34 -2,977 RPL36 -1,721 RPL37 -1,988 RPL13A -1,074 RPL18A -1,153 RPL23A -2,491 RPL27A -1,351 RPL37A -1,109 RPL38 -2,952 RPL7L1 -3,365 RPLP1 -1,856 RPLP2 -1,559 p-value 1,15E-02 9,14E-03 4,48E-03 7,77E-03 4,60E-03 1,48E-02 9,76E-03 2,61E-02 1,75E-02 2,04E-02 1,74E-02 1,16E-02 1,58E-02 4,19E-03 1,24E-02 1,21E-03 1,57E-02 2,72E-02 2,88E-02 8,90E-03 1,79E-03 1,78E-03 9,11E-03 6,14E-03 9,33E-03 4,36E-03 133 Table 3-3 Primer sequences for QPCR Gene symbol ATP5A1 ATP5C1 NDUFA8 NDUFB2 ATP5G1 ATP6V0D1 TCIRG1 RPS3 Primer sequence 5' - 3' F: TCACGTTATCAGCCAACATCAGGC R: CAGCTTTGCATCTGACTCTTCTGAG F : TGACTCTGACATTCAATCGCACCC R : TTTCATTAGTCCAGAGCCGCAGCA F : GTTTGACGAGTGTGTGCTGGACAA R : GCCTTGCTCTTGAGTGATAGGGAT F : TGCTGTGCTGGGTCACTTTCCTTA R : TTGGCAAGAGCTGAGCCTCTGTTT F : TGGCAGCTTGATCATTGGCTATGC R : AAGGCGACCATCAAACAGAAGAGC F : CTCCCACACCAAGAATGGACCAAG R : AGTGACCACATGCTTCTCAGACAC F : AGCAGGAAACAAATTCTGAGGCGG R : AAACTGTATCGGAAGCACCATCCC F: TCGTCGATGGCCTGATGATCCATT R: TGAGGGCAACTCTTTCAGCTAGTC Amplicon Annealing/ Accession number size (bp) melting temp. (°C) 82 57/76 NM_174684.2 91 58/81 NM_001075136.1 125 58/84 NM_175826.3 109 59/82 NM_175828.2 120 58/83 NM_176649.2 102 58/85 NM_174505.2 96 57/83 NM_001075634.1 333 60/87 NM_057284.5 Gene names : ATP5A1, ATP synthase alpha subunit 1; ATP5C1, ATP synthase subunit C1 (subunit 9); NDUFA8, NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 8; NDUFB2, NADH dehydrogenase 1 beta subcomplex 2; ATP5G1, ATP synthase gamma polypeptide 1; ATP6V0D1, ATPaseV0 subunit d1; TCIRG1, T-cell, immune regulator 1; RPS3, Ribosomal protein S3 (Drosophila melanogaster) 134 4. Chapitre 4. Source alternative d’ATP durant la maturation ovocytaire bovine. Sara Scantland, Éric Fournier, Dominic Gagné, Claude Robert Cet article n’a pas encore été soumis pour publication. 135 4.1 Résumé Introduction : L’ovocyte a besoin de quantités importantes d’ATP afin de permettre la maturation, la fécondation et, plus tard, le développement précoce. Toutefois, la production énergétique dans l’ovocyte fait face à de nombreuses contraintes : les mitochondries y prennent une forme immature peu encline à la phosphorylation oxydative et la glycolyse y est quasi-absente, l’ovocyte devant en obtenir les substrats à partir des cellules de cumulus. Pour élucider la façon dont l’ovocyte comble ce déficit énergétique apparent durant cette période cruciale de son développement, nous nous sommes penchés sur la voie de récupération des adénosines afin de déterminer si celle-ci pourrait représenter un mécanisme alternatif de production d’énergie. Résultats : Plusieurs enzymes de la voie de récupération des adénosines (les adénylates kinases et les créatines kinases) sont présentes et actives durant la maturation ovocytaire. Lorsque l’on inhibe leur fonction, l’ovocyte présente un phénotype énergétique d’apoptose, ce qui supporte l’hypothèse que cette voie a un rôle important dans la production d’énergie. Afin de stimuler la voie de récupération des adénosines, des sources considérables d’AMP doivent être disponibles. Lorsque les ovocytes sont cultivés sous forme dénudée ou lorsque l’enzyme responsable de la dégradation de la queue poly(A) est inhibée, les quantités d’ATP disponible pour la maturation ovocytaire chutent drastiquement. Ces résultats soutiennent l’idée que les cellules de cumulus peuvent transférer des molécules menant à l’accumulation d’AMP et d’ATP dans l’ovocyte et que la dégradation de la queue poly(A) représente une source importante d’AMP. Lorsqu’un déficit énergétique est provoqué dans la cellule, l’ajout d’AMP au milieu de culture permet de ramener les niveaux d’ATP au dessus de la normale et d’obtenir un phénotype de sauvetage. Conclusion : L’adénylate kinase et la créatine kinase sont deux enzymes qui conduisent à la formation de novo d’ATP dans l’ovocyte. Pour y arriver, les cellules de cumulus transfèrent des molécules menant à l’accumulation d’AMP dans l’ovocyte. Les molécules d’AMP libérées suite à la dégradation de la queue poly(A) des ARNm durant la maturation jouent également un rôle important dans ce processus. 136 4.2 Abstract Background : Oocytes need large amounts of ATP to allow maturation, fertilization and, later on, early embryonic development. However, energy production within the oocyte faces many obstacles: mitochondria take on an immature form with limited oxidative phosphorylation potential, and glycolysis is almost absent, with oocytes having to obtain its sub-products from the cumulus. To figure out how the oocyte paliates this energetic deficit during this crucial stage of its development, we turned ourselves toward the adenosine salvage pathway to determine if it might represent an alternative mechanism for energy production. Results : Many enzymes from the adenosine salvage pathway (adenylate kinases and creatine kinases) are present and active during oocyte maturation. When they are inhibited, oocytes show an energetic phenotype of apoptosis. This supports the hypothesis that this pathway plays an important role in energy production. To stimulate the adenosine salvage pathway, considerable sources of AMP must be available. When oocytes are cultured under denuded form or when the enzyme responsible for degradation of the poly(A) tail is inhibited, available quantities of ATP fall drastically. These results support our hypothesis that cumulus cells can transfer molecules which can lead to the accumulation of AMP and ATP within the oocyte and that degradation of the poly(A) tail represents an important source of AMP. When an energetic deficit is induced within the cell, addition of AMP to the culture media allows the restoration of ATP levels above the normal and creates a rescue phenotype. Conclusion : Adenylate kinases and creatine kinases are both enzymes which lead to the de novo formation of ATP within the oocyte. To achieve this, cumulus cells must transfer molecules leading to the accumulation of AMP within the oocyte. AMP molecules released by the degradation of the poly(A) tail of mRNAs during maturation also play an important role in this process. 137 4.3 Introduction Mitochondria are essential organelles that act as the principal energy source of eukaryotic cells through oxidative phosphorylation (OXPHOS). However, just as the oocyte is in many ways a peculiar cell, it also is peculiar cell at the mitochondrial level. During maturation, oocytal mitochondria are transforming, passing from an orthodox form to a hooded one characterized by an increased electron density within its matrix and containing a reduced number of cristae which are retracted at the periphery of the mitochondria [1-4]. Since the cristae are the principal site of OXPHOS, energy production by the mitochondria is reduced in this immature form [2, 5, 6]. These hypotheses are also supported by the results obtained through polyribosomal mRNA analysis presented in Chapter 3 where polyribosomal mRNA analysis reveals mitochondrial dysfunction and a great reduction of OXPHOS. This immature mitochondrial phenotype persists at least up to the 8 to 16 cells stage embryo in the bovine [2] and up to the late morula stage in humans [5]. These observations intrigued many authors, who then sought to evaluate ATP production within mitochondria during oocyte maturation and early embryo development [2, 5-7]. However, their conclusions are often contradictory. According to [8], mitochondrial OXPHOS is responsible for up to 96% of ATP synthesis in the precompaction stages of embryo development, considering that all the oxygen uptake is use for OXPHOS. According to [9], around 63% of mitochondrial respiration was coupled to ATP synthesis in GV oocyte whereas this percentage drops to 43% during maturation. This percentage seems to continue to drop after fertilization since [6] evaluates at 30% the oxygen uptake consumed through OXPHOS-dependant processes in cleaved embryos. Generally, only two ATP synthesis pathways are taken into consideration when thinking about energy production within a cell: OXPHOS, directly associated with the respiratory chain of the inner mitochondrial membrane , and glycolysis, a cytoplasmic pathway that produces smaller but nevertheless important levels of ATP [8]. Yet, it is well known that both glycolysis and mitochondrial OXPHOS are impaired within oocytes and during early embryo development (for review, [10]). How then do oocytes and early embryos fulfill the high energetic needs associated with maturation and early development? 138 To answer this question, we investigate here a previously unexplored potential driver of ATP synthesis, the adenosine salvage pathway. This mechanism drives the phosphorylation of AMP to ADP and then to ATP. Two important AMP sources are available during oocyte maturation: the degradation of cAMP transferred by cumulus cells during the onset of maturation [11, 12] and mRNA deadenylation which occurs concomitantly with the reduction in protein synthesis [13, 14]. Two enzymes could play a key role in alternative ATP production. The first one, adenylate kinase (AK), catalyzes reaction (1): AMP + ATP ↔ 2 ADP (1) The second one, creatine kinase, take the products of reaction (1) and transform them into ATP concomitantly with the transformation of phosphocreatine (PCr) into creatine (Cr) (reaction 2): ADP + PCr ↔ ATP + Cr (2) We present here evidence that AKs and CKs should be considered as important enzymes in the process of ATP production during oocyte maturation and that the large quantities of AMP provided through cumulus cells transfer and mRNA deadenylation act as drivers of this same process (Figure 4-1). We postulate that while adenosine salvage uses one ATP in its first reaction, the two ATP molecules created by the second one lead to de novo ATP synthesis and an increased combined ADP:ATP pool which is essential to sustain the oocyte in its peak energetic needs. This AMP driven mechanism could be very active in oocytes and could supplement mitochondria ATP production. 4.4 Results Experiment 1. Impact of OXPHOS inhibitor on ATP production in metaphase II oocyte To determine the importance of mitochondrial ATP production during oocyte maturation, a mitochondrial inhibitor was added to COC (cumulus-oocyte complexes) and DO (denuded oocytes). Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) reduces the ability of ATP synthase to function optimally by uncoupling the proton gradient that is established in the electron transport chain. Thus, the link between the respiratory chain and the 139 phosphorylation system is cut and ATP production is impaired [15]. Following 24 hours of culture with CCCP, ATP production in COC and in DO is highly impaired (Figure 4-2 A, B respectively). The OXPHOS inhibitor also provokes a higher ADP:ATP ratios in COC and in DO, indicating that the oocyte is near apoptosis (Figure 4-2C, D). Experiment 2. Evaluation of the presence of adenylate kinase, creatine kinase and creatine transporter mRNA on polyribosomal fraction The presence of AK, CK and creatine transporter (SLC6A8) mRNAs on polyribosomal fraction during oocyte maturation was evaluated after polyribosomal extraction, amplification and hybridization on microarrays. To increase the stringency, we labeled a transcript as "present" in an array if its average intensity minus 2 standard deviations (SD) was above the average intensity of negative control probes plus 4 SD. The transcript was considered as present in the oocyte stage only when it met this threshold in at least 3 arrays out of 4. According to these criteria, 5 AKs (AK2, AK3L1, AK5, AK6 and AK7), the 3 CKs (CKB, CKMT1, CKMT2) and SLC6A8, the creatine transporter, are present during oocyte maturation (data not shown). Three QPCR validations (AK6, CKB and CKMT1) were performed to confirm these results (Figure 4-3). The presence of all evaluated candidates was validated in GV and MII oocytes. Experiment 3. Evaluation of adenylate kinase and creatine kinase activity during oocyte maturation Since mRNA translation is not proof of enzyme activity, we sought to demonstrate the activity of AK and CK during oocyte maturation by adding inhibitors of those enzymes in the culture media and measuring their impact on ATP production. Either sodium fluoride (NaF, an AK inhibitor) or iodoacetamide (IAN, a CK inhibitor), were added for 24 hours during oocyte maturation. The addition of these inhibitors reduced the levels of ATP available during oocyte maturation drastically, both in COC and DO culture (Figure 4-4 A, B). ADP:ATP ratio elevation similar to the one observed for OXPHOS inhibition is also observed with the adenosine salvage pathway inhibitors, once again implying that apoptotic processes have been engaged (Figure 4-4 C, D). Moreover, creatine kinase activity was confirmed by creatine kinase assay during oocyte maturation (Figure 4-5). The results 140 clearly show an increase in creatine kinase activity during maturation despite the translational decrease of the creatine kinase mRNAs evaluated by QPCR. Experiment 4. Phosphocreatine impact during oocyte maturation Since creatine kinase is present and active during oocyte maturation, we speculate that addition of phosphocreatine in the culture media could enhance ATP production in situation where the oocyte is lacking energy (DO). As expected, the addition of phosphocreatine significantly enhances ATP production (Figure 4-6). The ADP:ATP ratio is also improved and is lower than the control, DO. Experiment 5. Cumulus cells impact during oocyte maturation To have a significant impact on ATP production, the adenosine salvage pathway must have important sources of AMP. It is well known that cumulus cells transfer cAMP to the oocyte through gap junctions that are present at the end of cumulus cell projection. Thus, we measured the impact on ATP production of cultured oocytes in a denuded form. Without surprise, ATP levels are highly decreased in DO compared to oocytes cultivated under COC form (Figure 4-7 A). Interestingly, DO cocultured with COC (CoDO) improved their ATP productions even if the DOs did not make any contact with cumulus cells (s-coDO) (Figure 4-7 A). To determine if the important drop in ATP production observed in DO was due to the lack of AMP production from AMPc transfer by the cumulus cell, a rescue protocol was carried out 1 mM AMP was added to the culture media of DO. The impact of adding AMP to the culture media was so important that ATP production exceeded ATP production observed within COCs (Figure 4-7 C). The culture media already contains some AMP (0.000576 mM) but in concentration much lower than the concentration added. All the ADP:ATP ratio were in harmony with ATP level, that is when ATP production is higher, ADP:ATP ratio decrease (Figure 4-7 B, D). 141 Experiment 6. mRNA deadenylation impact during oocyte maturation Since mRNA deadenylation is important during oocyte maturation and given that mRNA degradation is constitutively present, the release of adenosines in the form of AMP should be important within the oocyte. To evaluate the impact of mRNA deadenylation on energy production during oocyte maturation, poly(A) ribonuclease (PARN), the enzyme responsible for mRNA deadenylation, was inhibited with 4 mM GTP. An important drop in available ATP in oocytes cultured under COC form after PARN inhibition was observed. To prove that this important drop was due to the decrease in the release of AMP, a rescue protocol was carried out. Twenty minutes after PARN inhibition with GTP, 1 mM AMP was added to the culture media. Once again, this AMP addition allows for the recovery of the initial ATP availability within COCs (Figure 4-8 A). ADP:ATP ratio get higher with PARN inhibition and the rescue allows a partial restore of energy ratio (Figure 4-8 C). However, when the same experiments were conducted with DO oocytes, the impact of PARN inhibition on ATP production was not observed (Figure 4-8 B) and no significant difference was observed in ADP:ATP ratios (Figure 4-8 D). 4.5 Discussion It is well known that maturing oocytes and early embryos have low capacities for glucose uptake [16, 17] and that they are missing an important enzyme involved in glucose catabolism (phosphofructokinase) [18]. Oocyte must therefore rely on cumulus cells to directly transfer glycolytic products such as pyruvate to the oocyte (for review, see [10]), losing the ATP generating reactions which would happen upstream of this process. Moreover, the well established immature phenotype of mitochondria acquired during oocyte maturation limits ATP production through the OXPHOS process. Nevertheless, this limited ATP production remains an important energy source for the oocyte [6-8]. One important hypothesis is that low OXPHOS capacity could be compensated by the enormous number of mitochondria present in the oocyte, which is estimated to be between 300 000 to 400 000 when measured by transmission electron microscopy [19]. To ensure OXPHOS elevated ATP production in some localisation where high energy is needed in the oocyte, the clustering pattern of mitochondria could be highly important [20]. The importance of 142 ATP production by mitochondria is also apparent in our results. The important reduction in ATP production observed after mitochondrial respiration inhibition (Figure 4-2 A, B) confirms that OXPHOS is still an important source of energy during oocyte maturation and this, despite immature mitochondrial phenotype. However, the levels of ATP measured after OXPHOS inhibition should not be used to estimate the percentage of ATP which is produced by OXPHOS. In situations where the cell cannot use OXPHOS, one of its first reactions will be to reduce its ATP usage to survive the initial stress [21, 22]. Nevertheless, prolonged exposure to the stress, here over 24 hours long, will provoke cell death and is associated to a major decrease in ATP levels [23]. This explains the higher ADP: ATP ratio observed when OXPHOS is inhibited: during apoptosis, ATP is consumed without a concomitant de novo production. Since ATP levels increase in matured oocytes despite mitochondrial dysfunctions (see results in chapter 3), we posit that alternative mechanisms are used by the oocyte to fulfill its ATP requirements without relying on OXPHOS or glycolysis. The adenosine salvage pathway is one such mechanism, as it could be used to transform the high levels of AMP and ADP available in the oocyte into ATP. The phosphorylation of AMP into ADP is known to be performed by adenylate kinases (AK) (reaction 1) while the phosphorylation of ADP into ATP is usually achieved by pyruvate kinases (purine metabolism, KEGG pathway, 2.7.4.3 and 2.7.1.40 respectively) [24]. However, pyruvate kinases are glycolytic enzymes that produce ATP by transforming phosphoenol-pyruvate into pyruvate, an activity mostly absent in the oocyte [25]. Fortunately, another enzyme which can produce ATP from ADP while concomitantly transforming phosphocreatine (PCr) into creatine (Cr) is creatine kinase (CK), an enzyme well known in muscle and brain to sustain high and local ATP demand. Its presence has been noted in embryos [26] (reaction 2). The first step in proving the impact of the adenosine salvage pathway on energy production during oocyte maturation was to show the presence and activity of its two key enzymes. The presence of AKs and CKs on polyribosomal mRNAs indicates that they are translated during oocyte maturation. A reduction in translation levels for two of the three QPCR candidates was observed in microarrays and confirmed in RT-QPCR validations (Figure 4-3). This reduction is unsurprising given the general reduction in protein synthesis 143 observed during oocyte maturation (see chapter 3). However, this reduction in translation did not correlate with a reduction in enzyme activity, indicating that the protein could be stored in the cytoplasm and activated later by protein folding or phosphorylation, according to the needs of the oocyte. The creatine kinase assays confirm these results, as we observed an important increase in creatine activity during maturation. Interestingly, our measurements of CK presence (microarrays and QPCR results) are analog to the results obtained in early embryos for CKB, CKM and CKMT1 by [26]. In both oocytes and early embryos, CKB is the most strongly expressed isoform while CKM is not detected. CKMT1 is highly present in GV oocytes but decreases drastically in MII oocyte (Figure 4.3 C) and is completely absent in zygote and 2 cell embryos. Thereafter, it is newly synthesized from 4 cell stage and onward [26]. CKB therefore seems to be the most important CK during oocyte maturation and early embryo development. AK inhibition using NaF results in an important decrease in the ATP levels available to the oocyte, proving that this enzyme is active during oocyte maturation and that it could have a role in energy production. Similarly, CK inhibition by IAN greatly limits ATP production (Figure 4-4). This result, in addition to the increase in CK activity during oocyte maturation and the increase in ATP level when phosphocreatine is added to the culture media of DO, supports the hypothesis of CK activity and involvement in energy production. CK activity during embryo development has also been studied by [26]. In this study, the authors showed that the biochemical activity of CKs was constant from the 2- to 8-cell stages before being significantly reduced at the blastocyst stage, when an high OXPHOS capacity has been reacquired by the embryo. Like us, they conclude that CKs could represent important enzymes in embryonic ATP production. Moreover, they discovered that CKs were associated with the mitotic spindle and could act as creatine shuttles that play a key role in the local delivery of ATP. There is no reason to believe that this could not also apply to oocyte maturation. Once the importance of AKs and CKs on ATP production levels is proven, it is interesting to determine the AMP sources that allows for the adenosine salvage pathway to function. It is well known that cAMP is highly transferred from the cumulus cells to the oocyte through the junctions that persist for the first hours of maturation, and that meiotic arrest relies on 144 this high level of cAMP [27-30]. Conversely, the degradation of cAMP has an important role in meiotic resumption. This degradation is performed by phosphodiesterases, which convert cAMP into plain AMP [11, 31, 32](for review, see [12]). During the 12 first hours of oocyte maturation, projections between the oocyte and its surrounding cumulus cells are broken and cAMP is no longer transferred to the oocyte, provoking a drastic drop in cAMP levels but an increase in AMP levels [27, 33]. Moreover, it seems that the cumulus cell could directly transfer ATP or other nucleotides. Inside cumulus cell projections, many mRNAs associated with purine, nucleotide and ATP binding are present and could facilitate their transport to the oocyte (MacAulay, 2013, under submission). To evaluate the importance of ATP production drived by molecules transferred from cumulus cells, we cultivated oocytes under denuded form (without cumulus cells). The results clearly show that the supply of ATP decreases when oocytes are cultured without cumulus cells. Moreover, coculture of denuded oocytes with cumulus-oocyte complexes seems to partially (associated coDO) or completely (separated coDO) restore the supplies of ATP (Figure 4-7). This result is highly interesting. First, it hints that molecules (cAMP or AMP) can be sent over to the oocyte without a direct transfer through cumulus projections. Secondly, we can see in Figure 4-7 (E, F) that when DO are allowed to make contact with COCs, they seem to "share" cumulus cells with the COCs during maturation. Making contact with cumulus cells is probably a costly process explaining why the energy available is not as high in coDOs with contacts as in separated coDO. Nevertheless, the DOs should have an interest in making these contacts, since they facilitate the transfer of many molecules [34, 35] by new cumulus to oocyte projections. According to these results, molecules transferred directly or indirectly from cumulus cells to oocytes seem to be a part of ATP production during oocyte maturation. To be sure that DOs decrease their ATP production due to the lack of transfer of cAMP and its degradation into AMP through phosphodiesterases, we added AMP to the culture media to perform a rescue protocol. This AMP addition completely restores the ability of DOs to produce ATP, confirming the importance of the adenosine salvage pathway for ATP production (Figure 4-7). All ADP:ATP ratios obtained during these experiments are in agreement with the available energy and associated cell metabolism. Low ADP: ATP ratio when ATP is highly available 145 and allows for a good metabolism (COC and coDOs), and high ADP:ATP ratio when the cell, in an energy deficit, is entering apoptosis (DO). The mechanism used by AMP to enter DOs is not perfectly understood. It is usually thought that cell membranes are impermeable to nucleotides. However, the high impact of adding AMP to the culture media induces us to think that some mechanism may allow the direct transport of AMP through the zona pellucida and oocyte membrane, as it is known to occur in some bacteria and cell types [36-38]. Moreover, the media commonly used for cell culture, medium 199 (Invitrogen, Carlsbad, USA) contains low level of AMP and ATP. This fact also supports the idea that these molecules can be uptake by cells, otherwise the addition of these compounds would be of no use. It is also well known that ectoenzymes present on the surface of the oocyte can cleave nucleotides into nucleosides [39-42]. Once in nucleoside form, they can be taken up and accumulated inside the cytoplasm, where they can be retransformed into their nucleotide form. Some enzymes also transform AMP into ZMP, a nucleotide that can be taken up by the oocyte and converted into IMP, which serves as a precursor of purine compounds such as AMP (Richard, F.J, personal communication). Finally, it is also possible that denuding oocytes leaves holes in the oocyte membrane where projections used to be, facilitating AMP entry. We also present the possibility that maternal mRNA deadenylation, which releases AMP in the cytoplasm, could be an important driver of ATP production using the adenosine salvage pathway. Indeed, mRNA polyadenylation is an important step of mRNA recruitment for translation and poly(A) tail length has a close relationship with the rate of translation [43]. In general, poly(A) mRNAs containing more than 200 nt are translated while mRNAs bearing less than 50 nt are dormants [44]. We ([45] [46]) and others [47-49]) have already determined that oocyte maturation is characterized by an important reduction in protein synthesis. In agreement to this reduction in protein synthesis, poly(A) tails are highly reduced during oocyte maturation in many species [14, 50, 51], releasing adenosine under AMP form. To evaluate this possibility, we inhibited mRNA deadenylation with GTP, a purine which affects PARN activity. The effect on COCs clearly shows that deadenylation inhibition highly decreases ATP supplies within the oocyte. The rescue obtained by adding AMP in the media confirms that AMP could be transformed into ATP in the oocyte. 146 However, no decrease in ATP production was observed in DO. This result could be due to the same ectoenzymes discussed above. When the oocyte membrane is exposed, as is the case in DOs, the enzymatic sites are exposed and could cleave GTP, limiting its action. In COCs, the cumulus cell layer could act as a barrier limiting the access of GTP to the oocyte ectoenzymes. GTP could then enter cumulus cells and be transferred to the oocyte through the projections. 4.6 Conclusion The findings of our study support the hypothesis that alternative mechanisms are used to drive de novo production of ATP from AMP sources during oocyte maturation. Two enzymes allowing adenosine salvage pathway, the adenylate kinase and the creatine kinase, are active during maturation and appear to have an important role in energy production. While the oocyte is lacking important enzyme allowing ATP production through glycolysis and is presenting immature mitochondria phenotype less prone to OXPHOS, its seem that it turn toward adenosine salvage pathway to fulfil its need in ATP. Many AMP molecules are freed from mRNA poly(A) tail during maturation and large amount of AMP is produced by phosphodiesterase after cAMP cumulus cell transfer. Our results show that these AMP sources could drive ATP production through the adenosine salvage pathway. In conclusion, we believe that adenylate kinase and creatine kinase can be added as potential drivers of ATP production from AMP during oocyte maturation. 4.7 Methods Unless otherwise indicated, all chemicals were purchased from Sigma, Chemical Co. (StLouis, MO). Oocyte preparation Oocyte collection and maturation were performed as described previously (see chapter 2 and 3). Briefly, COC having a minimum of five layers of cumulus were washed in HEPESbuffered Tyrode’s medium supplemented with bovine serum albumin (BSA), pyruvic acid and gentamycin. To obtain metaphase II oocytes (MII), groups of 20 COC were placed in four-well petri dishes in maturation medium under mineral oil and incubated during 24 hours at 38.5°C with 5% CO2. MII oocytes were denuded before freezing. Denuded oocytes 147 (DOs) were produced by denuding COC at the GV stage and allowing maturation for 24 hours in the same way as MII oocyte. Cocultured DOs (coDOs) were obtained by coculturing DOs with COC in a 1:1 ratio for 24 hours. In associated coDO (a-coDO), DO and COC were allowed to make close contact while in separated coDO (s-coDO), DOs were placed in small holes which were punctured in the dish to help keep them far from COCs. For ADP:ATP ratio assays, groups of 5 oocytes were snap frozen in liquid nitrogen then kept at -80°C. Polyribosomal sample preparation The polyribosomal mRNAs samples used in these experiments are the same as those used in Chapter 3 of the present thesis. Therefore, their preparation including ‘Carrier preparation, crosslinking and neutralization’ will not be described again. The same is true for microarray. Real Time-PCR The same samples of reverse transcribed RNA used for QPCR validation in chapter 3 were used here (see chapter 3 for details sample preparation). Primer sequences were designed with the same criteria, namely to obtain short amplicons near the poly(A) tail to account for the short products obtained after amplification. Relative quantification was allowed through a standard curve from 0,1 pg to 0,01 fg produced from purified PCR product. Light-Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche) was used to quantify the sample using Light Cycler 2.0. The acquisition temperature of each product was determined according to the single melting peak on the melting curve (Table 1). Since the relative abundance of usual housekeeping genes fluctuates between oocyte maturation stages, these could not be used for data normalization [52, 53]. Thus, exogenous RNA (drosophila polyribosomal mRNA) was used to normalize the candidates (for details, see Chapter 3). Pharmacology To uncouple mitochondria respiration, 100 nM carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) was added to the cultured media. This concentration was used according to previous experiments achieved in our lab to optimize the treatment effect (Baldoceda, 148 unpublished). Sodium fluoride (NaF, 25 mM) was used to inhibit adenylate kinases without important inhibition of creatine kinase activity [54, 55]. To inhibit creatine kinase activity, iodoacetamide (IAN) was used at a concentration of 2 mM [56]. In order to inhibit the polyA ribonuclease, PARN, 4 mM of GTP was added to the cultured media. According to the results obtained in [57], this concentration inhibits almost 90% of PARN activity. All rescues with AMP were conducted with a 1 mM concentration. When used to rescue PARN inhibition, AMP was added 20 minutes after PARN inhibition with GTP. ATP measure and ADP:ATP ratio The ATP content and the ADP:ATP ratio of GV and MII oocytes were measured using the commercial EnzylightTM ADP:ATP ratio assay kit (Bioassay systems, Hayward, CA) following the assay protocol. Briefly, 90 μl of ATP reagent was added to each oocyte sample (freezed in a maximum of 10 μl of PBS) previously homogenized by vortexing the sample with around 10 zirconia-silica beads. ATP levels were measured after 1 min (Relative luminescence unit, RLU A) in a luminometer (BMG Labtech, FLUOstar Omega, Cary, NC). To obtain ADP levels and further ADP:ATP ratio, the samples were read again after 10 min (RLU B-background) then 5 μl of ADP reagent was added. The samples were read again after 1 minutes (RLU C). A mixed seven-point standard curve (64 pmol ADP with 64 pmol ATP, 0 pmol ADP with 32 pmol ATP, 2 pmol ADP with 16 pmol ADP, 4 pmol ADP with 8 pmol ADP, 8 pmol ADP with 4 pmol ATP, 16 pmol ADP with 2 pmol ATP and 32 pmol ADP with 0 pmol ATP) was included in each assay. The quantitative ATP and ADP content were determined according to the linear regression of their respective standard curve. ADP:ATP ratios were calculated by (RLU C – RLU B) / RLU A then normalized according to the linear regression of the standard curve obtained with the different non-negative ratios. Creatine kinase assays The creatine kinase assays were realised using the EnzyChromTM Creatine Kinase Assay Kit (BioAssay Systems), which allows colorimetric determination of creatine kinase activity at 340 nm. This kit has a detection range from 5 U/L to 300 U/L. Pools of 25 oocytes were thawed, homogenized by vortexing with zirconia-silica beads then transferred 149 in one of the 96-wells before adding 100 μl of reconstituted reagent (composed of 10 µL Substrate Solution, 100 µL Assay Buffer and 1 µL Enzyme Mix). The plate is incubated for 20 minutes at room temperature before absorbance was read at OD340nm in the FluoStar Omega multi-mode microplate reader. Samples were read again after 40 minutes and CK activity was calculated using this equation: CK (U/L) = (OD40min – OD20min) / (ODCalibrator – ODH2O) x 150 Statistics Significant differences were calculated using the Graphpad prism IV software. One-way ANOVA with Tukey's Multiple Comparison Test were conducted for all the ATP and ADP:ATP ratios tests when 3 and more comparisons were present. When only two groups were compared, a T-test was applied to evaluate the difference between the two groups. Differences were considered statistically significant (*) at the 95% confidence level (P < 0.05), highly significant (**) at the 99% confidence level (P < 0.01) and very highly significant (***) at the 99,9% confidence level (P<0,001). 4.8 Authors' contributions SS carried out most of the experiments including samples preparation and pharmacology, microarray analysis, QPCR and ADP:ATP ratio measure. She also drafted the manuscript. EF carried out the data normalization, acted as advisor and helped with language revision.CR supervised and directed SS academic program. The authors read and approved the final manuscript. 150 4.9 References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Baca M, Zamboni L: The fine structure of human follicular oocytes. J Ultrastruct Res 1967, 19(3):354-381. Crocco M, Alberio RH, Lauria L, Mariano MI: Effect of serum on the mitochondrial active area on developmental days 1 to 4 in in vitro-produced bovine embryos. Zygote 2011, 19(4):297-306. 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Figure 4-1 Alternative ATP production mechanisms during oocyte maturation. cAMP is transferred from cumulus cell, transformed in AMP by phosphodiesterase and phosphorylated by adenylate kinase than creatine kinase to form ATP. mRNA deadenylation can also freed AMP that can enter the same process. 155 Figure 4-2 Impact of OXPHOS inhibitor (CCCP) on ATP production (A, B) and ADP:ATP ratio (C, D) during oocyte maturation. (A, C) Impact on COC (B, D) Impact on DO. * significant at p<0,05 ; ** highly significant at p<0,01. COC: cumulus oocyte complexe. DO: denuded oocyte. CCCP: Carbonyl cyanide mchlorophenyl hydrazone. 156 Figure 4-3 QPCR validation for 3 candidates in the adenosine salvage pathway * significant at p<0,05. AK6: adenylate kinase 6. CKB: creatine kinase brain. CKMT1: creatine kinase mitochondrial 1. 157 Figure 4-4 Impact of AK and CK inhibitor on ATP production (A, B) and ADP:ATP ratios (C, D). Impact on COC (A, C). Impact on DO (B, D). COC: cumulus oocyte complex. DO: denuded oocyte. NaF: Sodium fluoride. IAN: iodoacetamide. Different letters represent means that are significantly different. 158 Figure 4-5 Creatine kinase assay. *** highly significant at p<0,001. 159 Figure 4-6 Impact of adding phosphocreatine (PCr) to the culture media when oocytes are cultured under denuded form (DO) on ATP production (A) and ADP:ATP ratio (B). * significant at p<0,05. ** highly significant at p<0,01. 160 Figure 4-7 Impact of culture under different form on ATP production (A) and ADP:ATP ratio (B). Impact of AMP rescue on oocyte cultured under denuded form (DO) on ATP production (C) and ADP:ATP ratio (D). Picture of the two different coculture process. associate coculture before maturation (E), after maturation (F), separated coculture before maturation (G). The arrow in represents a little depression in the dish that helps to separate COC from DO. COC: Cumulus-oocyte complex, DO: Denuded oocyte, a-coDO: associated coculture where COC and DO are in close contact; scoDO: separated coculture where COC and DO are not allowed to make contacts. Different letters represent means that are significantly different. ** highly significant at p<0,01. 161 Figure 4-8 Impact of PARN inhibitor and AMP rescue on ATP production (A, B) and ADP:ATP ratio (C, D) in COC (A, D) and DO (B, D). Different letters represent means that are significantly different 162 5. Chapitre 5. Conclusion L’objectif de cette thèse était d’étudier les transcrits polyribosomaux impliqués dans la maturation ovocytaire afin d’identifier des mécanismes moléculaires importants durant cette période et ainsi mieux comprendre la physiologie sous-jascente. Le premier article était dédié à la mise au point d’une méthode permettant d’extraire spécifiquement les ARN polyribosomaux à partir d’un nombre limité d’ovocytes. Les outils moléculaires disponibles actuellement permettent d’extraire efficacement des quantités minimales d’ARNm, de les amplifier et de les marquer afin de les hybrider sur des biopuces à ARN. Ces méthodes permettent d’obtenir une vision globale du transcriptome cellulaire. Cependant, même si ces méthodes ont permis d’en apprendre beaucoup sur les ovocytes et les embryons précoces, il demeure que ce sont des cellules particulières dont le silence transcriptionnel force la présence d’une multitude de transcrits qui ne participent pas à la physiologie cellulaire. Ainsi, en utilisant les méthodes transcriptomiques habituelles sans se limiter à l’étude des ARN polyribosomaux, les résultats obtenus demeurent noyés dans un bassin de transcrits inactifs. La présence des transcrits emmagasinés peuvent limiter mais également biaiser la vision globale de la physiologie cellulaire. Une méthode de fractionnement cellulaire sur gradient de sucrose permet d’isoler les ARN polyribosomaux des ARNm emmagasinés [1-3]. Cependant, cette méthode est adaptée à l’étude des tissus et requiert des quantités non négligeables d’ARN. Dans la situation où la disponibilité du spécimen étudié est limitée, de nombreuses modifications doivent être apportées afin de l’adapter à de faibles quantités d’ARN. Quelques équipes de recherches [4-6] ont déjà tenté d’adapter cette méthode à l’ovocyte sans jamais réussir à combiner les deux objectifs de notre méthode; c’est-à-dire d’obtenir une preuve de la nature polyribosomale des échantillons grâce à l’obtention d’un profil de fractionnement tout en permettant d’étudier individuellement les transcrits afin d’en mesurer l’abondance. Le premier article a représenté la plus grande difficulté de la thèse ainsi que de nombreuses années d’efforts et d’embûches. Cependant, une fois mise au point, cette méthode est particulièrement novatrice. Les résultats obtenus (article 2 et 3) en utilisant cette méthode 163 ont permis d’obtenir une vision plus précise de la physiologie de la maturation ovocytaire et de déceler l’acquisition d’une certaine quiescence durant cette période. Le deuxième article se base sur la méthode mise au point dans le premier article afin de comparer les ARN polyribosomaux provenant d’ovocytes immatures du stade de vésicules germinales aux ARN polyribosomaux provenant d’ovocytes matures du stade de métaphase II. L’analyse des transcrits polyribosomaux durant cette période souligne une diminution importante de la synthèse protéique et de la phosphorylation oxydative durant la maturation ovocytaire. La diminution de la synthèse protéique est observée à la fois par une diminution importante du nombre de transcrits présents sur les polyribosomes ainsi que par une diminution de la traduction des gènes responsables de l’initiation de la traduction. La littérature soutient également de différentes façons ces observations [4, 7-9]. La diminution de la phosphorylation oxydative, accompagnée par une augmentation des dysfonctions mitochondriales et d’une réduction de la production énergétique, semble associée à une forte diminution de la traduction des protéines faisant partie de la chaîne respiratoire mitochondriale. De fait, les 5 complexes mitochondriaux subissent une réduction accrue de la synthèse de leurs protéines. Encore une fois, la littérature vient fortement appuyer nos résultats et plusieurs auteurs décrivent l’acquisition d’un phénotype mitochondrial immature (mitochondries «à capuchon») [10, 11] ainsi que la diminution de la respiration mitochondriale [12, 13]. Puisque la phosphorylation oxidative représente la principale voie de production d’énergie dans la cellule, je me suis intéressée aux quantités d’ATP disponibles dans l’ovocyte durant la maturation ovocytaire. De façon un peu surprenante, j’ai déterminé que les quantités d’ATP augmentent durant la maturation. Cette augmentation de l’énergie disponible malgré la diminution de la respiration mitochondriale, couplée avec la forte diminution de la traduction durant la maturation, m’a permis d’émettre une nouvelle hypothèse. Il est bien connu que l’embryon doit ralentir son métabolisme afin de survivre jusqu’à l’activation du génome embryonnaire (The Quiet embryo hypothesis, [14]). Nos résultats mènent à penser que l’acquisition de cette quiescence métabolique se produit encore plus tôt, durant la maturation ovocytaire. En diminuant fortement la traduction, mécanisme hautement demandant énergétiquement, l’ovocyte acquière une certaine quiescence tout en conservant un maximum d’énergie lui permettant de survivre jusqu’à la fécondation puis, par la suite, jusqu’à l’AGE. 164 La phosphorylation oxidative ainsi que la glycolyse sont généralement considérées comme les deux seuls mécanismes permettant la production d’énergie dans la cellule. Cependant, l’augmentation des quantités d’ATP disponibles durant la maturation ovocytaire et ce, malgré la diminution de la respiration mitochondriale et la quasi-absence de la glycolyse, mène à se questionner sur la présence de mécanismes alternatifs de production énergétique dans l’ovocyte. Sachant que des quantités importantes d’AMP sont disponibles durant cette période, je me suis penchée, dans le troisième article, sur le mécanisme de récupération des adénosines (adenosine salvage pathway) et je me suis demandé si ce mécanisme pouvait fournir des quantités importantes d’ATP à l’ovocyte. Deux enzymes sont nécessaires à cette voie : l’adénylate kinase qui permet la transformation de l’AMP en ADP et la créatine kinase qui permet la transformation de l’ADP en ATP. Après avoir déterminé la présence de ces enzymes sur les polyribosomes, j’ai évalué l’impact de leur inhibition sur les quantités d’ATP disponible dans l’ovocyte. Les résultats confirment que la voie de récupération des adénosines peut représenter un mécanisme important de production d’ATP durant la maturation ovocytaire. J’ai ensuite évalué l’importance de différentes sources d’AMP dans l’ovocyte. La source la plus importante est sans aucun doute la dégradation de l’AMPc transféré vers l’ovocyte par les cellules de cumulus. J’ai donc évalué l’impact de différentes cultures ovocytaires : la culture des ovocytes sous forme dénudée (DO), sous forme de complexe avec les cellules de cumulus (COC) ou la coculture DO et COC (coDO). Sans grand étonnement, j’ai observé une diminution drastique de l’ATP disponible dans les ovocytes dénudés en comparaison aux ovocytes cultivés sous forme de COC, soutenant l’importance des cellules de cumulus dans la production énergétique. Lorsque cultivés en concomitance avec des COC, les quantités d’ATP disponibles pour les DO augmentent et atteignent presque les quantités obtenues lorsque cultivés sous forme de COC. Ce résultat supporte l’idée que les cellules de cumulus peuvent transférer directement, ou indirectement, des molécules qui faciliteront la production énergétique dans l’ovocyte. J’ai également émis l’hypothèse que la dégradation de l’ARN ainsi que la déadénylation de la queue poly(A) pouvaient représenter des sources non-négligeables d’AMP. J’ai donc inhibé la dégradation de la queue poly(A) en utilisant un inhibiteur de la poly(A) 165 ribonucléase (PARN) et mesuré l’impact sur l’énergie disponible. Les résultats ont démontrés que cette source d’AMP pouvait être ajoutée à la liste des sources d’énergie potentielles durant la maturation ovocytaire. Dans cette thèse, l’identification de transcrits polyribomaux durant la maturation ovocytaire m’a permis de mieux comprendre certains aspects de la physiologie de la maturation ovocytaire. La diminution de la phosphorylation oxidative et la diminution de la synthèse protéique ont mis en lumière l’acquisition d’une certaine quiescence durant la maturation ovocytaire et cette découverte a mené à l’identification d’un nouveau mécanisme de production d’énergie impliquant la voie de récupération des adénosines. 166 5.2 Références 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Zong Q, Schummer M, Hood L, Morris DR: Messenger RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(19):10632-10636. Wang Y, Ringquist S, Cho AH, Rondeau G, Welsh J: High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res 2004, 32(10):e79. Koritzinsky M, Wouters BG: Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods Enzymol 2007, 435:247-273. De Leon V, Johnson A, Bachvarova R: Half-lives and relative amounts of stored and polysomal ribosomes and poly(A) + RNA in mouse oocytes. Dev Biol 1983, 98(2):400-408. 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