approches fonctionnelles in vivo et in vitro
publicité
Année 2015-2016 - Demande d’allocation doctorale ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549 1. Informations administratives : Nom de l’encadrant responsable de la thèse : Rozenn DALBIES-TRAN Unité : UMR PRC 7247 - INRA Centre Val de Loire Equipe (si unité multi-équipes):Biologie INtéGrative de l’Ovaire (BINGO) Email de l’encadrant : [email protected] 2. Titre de la thèse : Rôle du gène BCAR4 pendant le développement embryonnaire : approches fonctionnelles in vivo et in vitro dans des espèces d’intérêt agronomique 3. Résumé : La qualité de l’ovocyte repose sur trois piliers: i) la maturité nucléaire, l’ovocyte devant atteindre le stade métaphase II ; ii) la maturité cytoplasmique, avec la distribution intracellulaire adéquate des organites; iii) et la maturité moléculaire, soit la constitution d’un stock optimal d’ARN et protéines. En effet, l’activité de transcription est minimale pendant la reprise de la méiose, la fécondation et les premières divisions de l’embryon : leur bon déroulement repose donc sur le recrutement de ces facteurs ovocytaires selon une chronologie précise, jusqu'à l’activation majeure du génome embryonnaire à un stade variable selon les espèces : 2 cellules chez la souris, 4/8 cellules chez l’homme, 8/16 cellules chez le lapin ou la vache. Certains facteurs ovocytaires s’avèrent indispensables spécifiquement pour le développement de l’embryon, définissant les gènes à effet maternel. Dans une banque d’ADNc ovocytaires bovins, nous avons retrouvé plusieurs gènes à effet maternel déjà connus chez la souris (Pennetier et al, 2005). De façon plus originale, nous avons découvert des gènes sans homologues murins, parmi lesquels BCAR4 (Breast Cancer Anti-estrogen Resistance 4) (Thélie et al, 2007). BCAR4 est conservé chez l'homme et plusieurs mammifères domestiques dont le lapin. Chez le bovin, la protéine est synthétisée dans l’ovocyte juste avant l’ovulation, devient abondante après la fécondation et persiste jusqu'au stade morula. Elle est localisée à l'intérieur ou à proximité des noyaux et aux jonctions intercellulaires. Son inhibition par microinjection d’ARN interférents dans l’ovocyte avant la fécondation in vitro diminue le taux de développement embryonnaire (Angulo, et al, 2013). Le gène BCAR4 a été identifié en parallèle comme un marqueur de certaines tumeurs du sein résistantes au traitement par le Tamoxifen (Meijer et al, 2006). Selon cette équipe, la protéine BCAR4 induit en l’absence d’estrogènes la prolifération de cellules qui en sont habituellement dépendantes, via l’activation des récepteurs ERBB2 et ERBB3 (Godinho et al, 2010 ; van Agthoven et al, 2015). Alternativement, BCAR4 agirait en tant qu’ARN non codant, avec des conséquences sur le contrôle épigénétique et la migration cellulaire responsable de métastases (Xing et al, 2014; Xing et al, 2015). Globalement, la phylogénie, le profil spatio-temporel d'expression, les données fonctionnelles in vitro et les propriétés pro-prolifératives dans les cellules tumorales indiquent que BCAR4 est un gène à effet maternel, impliqué dans les premières divisions de l’embryon chez les mammifères à activation embryonnaire tardive. Pour autant, le 6 contrôle de son expression, ses mécanismes d’action et son rôle in vivo restent inconnus, et feront l’objet de cette thèse. Les travaux seront menés selon trois axes indépendants. • Axe 1 : rôle du gène BCAR4 in vivo. Des lapines génétiquement modifiées (porteuses d'un gène BCAR4 inactivé) seront phénotypées sur plusieurs paramètres liés à la reproduction : activité ovarienne, ovulation, fécondation et développement précoce, gestation, taille de portée. Il est attendu une stérilité des femelles par arrêt prématuré du développement embryonnaire. • Axe 2 : mécanismes moléculaires d’action de BCAR4. Plusieurs directions seront explorées. 2.1. l’activation des voies de signalisation de ERBB2 et ERBB3 dans l’ovocyte et l’embryon. 2.2. l’identification de protéines partenaires de la protéine BCAR4, par des approches ciblée (co-localisation avec E-cadherine, β-caténine etc… aussi impliquées dans le développement précoce) et «sans a priori» (co-immunoprécipitation et identification par spectrométrie de masse). 2.3. le rôle de l’ARN non codant : co-précipitation avec l’ARN BCAR4 bovin, et identification des partenaires (immunodétection de SNIP1 et PNUTS comme dans les cellules tumorales humaines, ou identification de nouveaux partenaires par spectrométrie de masse). • Axe 3 : contrôle post-transcriptionnel de l’expression et de la localisation intracellulaire de BCAR4. La région 3’ non traduite des ARN contrôle la chronologie de leur traduction dans l’ovocyte puis l’embryon. Elle peut aussi diriger la localisation intracellulaire d’une protéine (Berkovits & Mayr, 2015). Nous analyserons la contribution respective de chacun des deux transcrits BCAR4 bovins, issus de l’utilisation alternative de deux signaux de polyadénylation dans la région 3’ non traduite. A l’heure actuelle, notre équipe est la seule à étudier ce gène dans le contexte de la reproduction. A travers la caractérisation du gène BCAR4, la thèse abordera des questions scientifiques naissantes voire inédites. Elle rejoint des préoccupations médicales, des mutations dans le gène BCAR4 pouvant être à l’origine d’infertilités féminines jusqu’alors inexpliquées. Références : • Angulo, et al, 2013. Hum Reprod. 28:430-41. • Berkovits & Mayr, 2015 Nature 522:363-7. • Godinho et al, 2010. Br J Cancer. 103:1284-91. • Meijer et al, 2006. Mol Cancer Res. 4:379-86. • Pennetier et al, 2005. Biol Reprod. 73:713-20. • • • • Thélie et al, 2007. BMC Dev Biol. 7:125. van Agthoven et al, 2015. PLoS 10:e0136845. Xing et al, 2014. Cell. 159:1110-25. Xing et al, 2015. RNA Biol12:681-9. One. 4. Résumé en anglais: Role of BCAR4 in embryo development: functional approaches in vivo and in vitro in agronomically important species Oocyte quality relies on three criteria: i) nuclear maturation to metaphase II; ii) cytoplasmic maturation with an adequate localisation of organelles; and iii) molecular maturity, through storage of an optimal pool of RNA and proteins. Indeed, transcription is minimal throughout meiosis resumption, fertilization and the first embryonic divisions. These stages rely mainly on recruitment of oocyte factors, up until the embryo activates its own genome in a major way. This occurs at a species-specific stage: 2-cell in mouse, 4/8-cell in human, 8/16-cell in rabbit or cow. Some oocyte factors are essential precisely for embryonic development: the corresponding genes are called maternal-effect genes. In a bovine oocyte cDNA library, we have identified several maternal-effect genes previously known in the mouse (Pennetier et al, 2005). More originally, we have discovered genes that do not have a murine homolog, including BCAR4 (Breast Cancer Anti-estrogen Resistance 4) (Thélie et al, 2007). BCAR4 is conserved in human several domestic mammals including rabbit. In bovine, the BCAR4 protein is synthesized in the oocyte just before ovulation; it becomes abundant after fertilization and persists up until the morula stage. Microinjecting specific interfering RNA into the oocyte before in vitro fertilization alters protein translation and results in a lower rate of embryos developing to the morula and blastocyst stages (Angulo, et al, 2013). 7 In parallel, BCAR4 has been identified as a marker of some Tamoxifen-resistant breast tumors (Meijer et al, 2006). According to this group, the BCAR4 protein is able to drive proliferation of estrogen-dependant cells even in the absence of estrogens, by activating the ERBB2 and ERBB3 receptors (Godinho et al, 2010 ; van Agthoven et al, 2015). Alternatively, BCAR4 might act as a long noncoding RNA, with consequences onto epigenetic control and cellular migration causing metastases (Xing et al, 2014; Xing et al, 2015). Overall, phylogeny, expression profile, in vitro functional data and pro-proliferative effect in tumor cells indicate that BCAR4 is a maternal-effect gene involved in the firts embryonic divisions in mammalian species with late embryonic genome activation. Nevertheless, its role in vivo, the control of its expression and intracellular localization, and the underlying molecular mechanisms remain unknown. These questions will be addressed in this PhD thesis through three independant workpackages. 1. role of BCAR4 in vivo. Genetically modified rabbit (carrying an inactivated BCAR4 gene) will be phenotyped on several reproductive parameters: ovarian activity, ovulation, fertilization and early embryo development, gestation, litter size... Females are expected to be sterile due to a premature arrest of embryo development. 2. molecular mechanisms underlying BCAR4 action in the oocyte/embryo. 2.1. investigating the ERBB2 and ERBB3 signalling pathway in the oocyte/embryo. 2.2. identifying BCAR4 protein partners using both targeted approaches (co-localization with E-cadherin, β-catenin or other candidate proteins involved in preimplantation development) and open approaches to uncover novel partners (co-immunoprecipitation and identification by mass spectrometry). 2.3. role of the long noncoding RNA : pull-down with BCAR4 RNA, and identifying partners (immunodetection of candidate SNIP1 and PNUTS, as in human tumor cells; alternatively, novel partners may be discovered by mass spectrometry). 3. post-transcriptionnal control of BCAR4 expression and intracellular localisation. The 3' untranslated region controls RNA stability and timing of translation in the oocyte and embryo. It can also direct the corresponding protein intracellular localization (Berkovits & Mayr, 2015). We will analyze the respective contribution in the oocyte/embryo of the two bovine BCAR4 transcripts, resulting from alternative polyadenylation signals. To the best of our knowledge, only our group studies the role of BCAR4 in reproduction. Through characterizing BCAR4, this PhD thesis deals with emerging or novel scientific questions. It also meets the medical field, as mutations in BCAR4 may be involved in a subset of so far unexplained cases of female infertility. References : • Angulo, et al, 2013. Hum Reprod. 28:430-41. • Berkovits & Mayr, 2015 Nature 522:363-7. • Godinho et al, 2010. Br J Cancer. 103:1284-91. • Meijer et al, 2006. Mol Cancer Res. 4:379-86. • Pennetier et al, 2005. Biol Reprod. 73:713-20. • • • • Thélie et al, 2007. BMC Dev Biol. 7:125. van Agthoven et al, 2015. PLoS 10:e0136845. Xing et al, 2014. Cell. 159:1110-25. Xing et al, 2015. RNA Biol12:681-9. One. 5. Thèses encadrées au cours des 4 dernières années (par l’encadrant et l’éventuel coencadrant) : Nom du doctorant : Leslie ANGULO Encadrant responsable de la thèse : Rozenn DALBIES-TRAN Dates : 2009-2012 Financement de la thèse : CIFRE Publications de l’étudiant en 1er auteur : 2 Devenir de l’étudiant: Malgré deux publications en premier auteur, Leslie Angulo n’a pas soutenu sa thèse. Elle possédait clairement des qualités didactiques et pour le travail de laboratoire. Elle avait commencé à travailler à son manuscrit, mais elle n’a pas pu/su surmonter des problèmes médicaux et personnels pour en reprendre la rédaction malgré les relances et encouragements pendant plus de deux ans. Dernièrement, elle envisageait une carrière dans l’enseignement secondaire ou comme attachée de recherche clinique. 8 6. Thèses en cours (par l’encadrant et l’éventuel co-encadrant) : Aucune 7. Cinq publications principales ou brevets de l’encadrant (et de l’éventuel coencadrant) au cours des 4 dernières années : • Angulo, L., Guyader-Joly, C., Auclair, S., Hennequet-Antier, C., Papillier, P., Boussaha, M., Fritz, S., Hugot, K., Moreews, F., Ponsart, C.,Humblot, P., & Dalbies-Tran, R. (in press) Reproduction, Fertility and Development. An integrated approach to bovine oocyte quality: from phenotype to genes. • Franciosi, F., Goudet, G., Tessaro, I., Papillier, P., Dalbies-Tran, R., Reigner, F., Deleuze, S., Douet, C., Miclea, I., Lodde, V., & Luciano, A.M. (in press) Reproduction, Fertility and Development. IVM affects chromosome segregation, spindle morphology and H4K16 acetylation in horse oocytes • D. Monniaux, R. Dalbies-Tran, S. Fabre, N. Gérard, P. Monget, F. Clément (2014) in La Reproduction Animale et Humaine, ed Quae, pp41. chapitre 2 : « Le développement folliculaire ovarien et l’ovulation » • Angulo, L., Perreau, C., Lakhdari, N., Uzbekov R., Papillier, P., Freret, S., Cadoret, V., Royere, D., Ponsart, C., Uzbekova, S. & Dalbies-Tran, R. (2013) Human Reprod. 28:430-441. Breast-cancer anti estrogen resistance 4 (BCAR4) encodes a novel maternal-effect protein in bovine and is expressed in the oocyte of human and other non-rodent mammals. • Thelie, A., Pascal, G., Angulo, L., Perreau, C., Papillier, P., & Dalbies-Tran, R. (2012) Molecular Reproduction and Development 79:380-391. An oocyte-preferential histone mRNA stem loop binding protein like is expressed in several mammalian species. 8. Principaux contrats de recherche obtenus par l’encadrant (et l’éventuel co-encadrant) au cours des 4 dernières années : • • • • programme PROLIFIC (2013-2017) ; financement Union Européene programme KOALA (2012-2014) ; financement INRA ; coordinateur programme REPROSEQ (2012-2014) ; financement privé Apis-gene programme ANR OVOGENAE2 (2008-2012) ; coordinateur demandes en cours d'évaluation: • projet Agence de Biomédecine (2016-2019) ; coordinateur • projet Région Centre (2017-2019) 9. Autres thèses en cours au sein de l’équipe : Nombre d’HDR 5 dans l’équipe Détail des étudiants en thèse dans l’équipe (Nom des encadrants et calendrier de ces thèses) Nom étudiant Dates : début et fin de thèse Anna GRANDCHAMP 2015-2018 Nom de l’encadrant (en gras) et éventuel co-encadrant (entre parenthèses) Financement de la thèse Philippe MONGET bourse MESR Priscila BERTEVOLLO 2015-2018 Svetlana UZBEKOVA Mouhamad OSEIKRIA 2014-2017 Svetlana UZBEKOVA (Sébastien ELIS) université brésilienne bourse du gvt syrien 10. Remarques éventuelles à signaler : 9
