Nom : Habert

Stage proposé par Brigitte, LEFEVRE
DR2, INSERM
Nom et adresse du Laboratoire ou de l’Unité :
Institut Cochin INSERM U1016
Site internet : http://www.cochin.inserm.fr/
Directeur de l’Unité : Pierre Olivier COURAUD
Laboratoire : Génomique, Epigénétique et Physiopathologie de la Reproduction
Responsable : Daniel Vaiman
Intitulé de l ‘équipe d’accueil : Interaction Gamétique et Fécondation
Responsable : Jean-Philippe Wolf
Responsable de l’équipe : Jean-Philippe Wolf
Résumé du thème de recherche de l’équipe Nous cherchons à comprendre les mécanismes
moléculaires qui président à la reconnaissance, l’adhésion et la fusion des membranes au cours de la
fécondation. Nous travaillons notamment sur le rôle de trois familles de protéines : les Intégrines, les
tétraspanines et les protéines ancrées à un GPI (GPI-APs). Nous avons décrit un phénomène
d’échange de fragments membranaires similaire à la Trogocytose entre les deux gamètes juste avant
leur fusion. Nous cherchons actuellement à démontrer son caractère fonctionnel. En collaboration
avec une équipe de physiciens de l’ENS Paris, nous avons mis au point un dispositif permettant la
mesure des nanoforces développées lors de l’adhésion entre un spermatozoïde et un ovocyte. En
utilisant des gamètes mutés pour des protéines d’intérêt ou des anticorps dirigés contre celles-ci, nous
allons tenter d’identifier les protéines impliquées précisément dans l’étape de l’adhésion.
Titre du projet de stage : Lien entre Gas1 et GFRalpha1 ovocytaires dans le contrôle de la fusion
membranaire lors de la fécondation
Prénom, NOM, téléphone et adresse e-mail du Responsable du stage:
Brigitte LEFEVRE, brigitte.l[email protected] Tel : [phone]
Projet de stage : Les protéines membranaires ancrées à un glycosyl-phosphatidylinositol (GPI-APs)
qui sont impliquées dans l’organisation et l’induction de voies de signalisation le sont aussi dans la
fusion gamétique. En effet, l’invalidation conditionnelle au niveau de l’ovocyte du gène Pig-a, (codant
pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse du GPI), entraîne la disparition de toutes les GPI-APs
à la surface de l’ovocyte et la perte de la capacité fusiogène de la membrane ovocytaire. Après une
analyse bibliographique, nous avons sélectionné six de ces protéines dont nous avons vérifié la
présence dans les ovocytes de souris en immunofluorescence et en Western blot. Bien que toutes
présentes sur la membrane, deux seulement se sont avérées impliquées dans le processus de
fécondations, Gas1 et GFRalpha1 (GDNF family receptor alpha-1). En effet, la pré-incubation des
ovocytes ovulés et dépellucidés en présence de l’un ou l’autre de leurs anticorps réduit
significativement l’index de fécondation c’est à dire le nombre de tête de spermatozoïdes par ovocyte.
Il s’avère que ces deux protéines sont apparentées avec une divergence très tôt dans l’évolution des
métazoaires. Toutes deux forment un complexe avec un récepteur transmembranaire tyrosine kinase
(RET) dans d’autres modèles cellulaires. L’objectif de cette étude est donc d’établir 1) le lien éventuel
entre Gas1 et GFRalpha1 dans l’ovocyte de souris et dans le contrôle de la fécondation et 2) par
quelle(s) voies de signalisation elles le font.
.
Techniques mises en œuvre par le stagiaire :

Super ovulation des souris, préparation des gamètes mâles et femelles de souris, microinjection des
ARN interférents au stade VG, maturation in vitro des ovocytes, vérification de l’inhibition par RT-PCR,
Western blot et Immunofluorescence observée en microscopie confocale. Fécondation in vitro
et immunocytochimie
Publications du Responsable de stage au cours des 5 dernières années :
- Barraud-Lange V, Chalas Boissonnas C, Serres C, Auer J, Schmitt A, Lefevre B, Wolf JP, Ziyyat A.
Membrane transfer from oocyte to sperm occurs in two CD9-independent ways that do not supply the
fertilizing ability of Cd9-deleted oocytes. Reproduction. 2012 (in press)
-Lefèvre B, Wolf J-P, Ziyyat A. Sperm-egg interaction: Is there a link between tetraspanin(s) and GPI-
anchored protein(s)? BioEssays 2010, 32:143-152.
- Arnault E, Doussau M, Pesty A, Lefèvre B, Courtot A-M. Lamin A/C, caspase-6 and chromatin
configuration during meiosis resumption in the mouse oocyte. Reprod. Sci. 2010, 17:102-115.
- Pesty A, Doussau M, Lahaye J-B, Lefèvre B. Whole body or isolated ovary 60Co irradiation: effects
on in vivo and in vitro folliculogenesis and oocyte maturation. Reprod. Toxicol 2010, 20:93-98.
- Barraud-Lange V, Ziyyat A, Chalas C, Pont J-C, Auer J, Serre C, Lefèvre B, Wolf J-P. Les molécules
impliquées dans l'interaction des membranes gamétiques au cours de la fécondation: apport du
modèle murin. Reprod. Hum. Hormon. 2009, 22 :47-58.- Arnault E, Tosca L, Courtot A-M, Doussau M,
Pesty A, Finaz C, Allemand I, Lefèvre B. Caspase-2L, caspase-3, and caspase-9 during in vitro
maturation and fragmentation of the mouse oocyte. Dev Dyn 2008 237:3892-3903.
-Lefèvre B. The nucleolus of the maternal gamete is essential for life. Bioessays 2008, 30:613-617.
- Pesty A, Broca O, Poirot C, Lefèvre B. The role of PLCß1 in the control of oocyte meiosis during
folliculogenesis. Reprod Sci 2008 15:661-672.
- Arnault E, Doussau M, Pesty A, Gouget B, Van der Meeren A, Fouchet P, Lefèvre B. Natural uranium
disturbs mouse folliculogenesis in vivo and oocyte meiosis in vitro. Toxicology 2008 247:80-87.
- Miyara F, Pesty A, Migne C, Djediat C, Huang XB, Dumont-Hassan M, Debey P, Lefèvre B.
Spontaneous calcium oscillations and nuclear PLC-ß1 in human GV oocytes. Mol Reprod Dev 2008
75: 392-402.
Autres informations:
Etudiants actuellement en thèse ou en M2 dans l’équipe d’accueil. Pour chaque étudiant indiquez
le nom du responsable de thèse, l’année du début de la thèse et l’Ecole Doctorale de rattachement
Actuellement en M2 :
Mikael Agopiantz Master Biologie Cellulaire Physiologie Pathologie Spécialité : Reproduction et
Développement (Paris 5-7-11) Responsable : Brigitte Lefèvre
Jonathan Cohen Master Biologie Cellulaire Physiologie Pathologie Spécialité : Reproduction et
Développement (Paris 5-7-11) Responsable : Ahmed Ziyyat
Achraf Benamar Master Biologie Cellulaire Physiologie Pathologie Spécialité : Reproduction et
Développement (Paris 5-7-11) Responsable : Jean-Philippe Wolf
Magalie Vatin: thèse dirigée par Ahmed ZIYYAT, thèse 2009- Décembre 2012.
Ecole doctorale : GC2ID Paris 5
Cette proposition de stage s’adresse-t-elle spécifiquement à un étudiant scientifique, médecin
ou vétérinaire ou bien est-il ouvert à tous les profils ? Tous les profils
Ce sujet peut-il donner lieu à une thèse ? Oui