Stage proposé par Brigitte, LEFEVRE DR2, INSERM Nom et adresse du Laboratoire ou de l’Unité : Institut Cochin INSERM U1016 Site internet : http://www.cochin.inserm.fr/ Directeur de l’Unité : Pierre Olivier COURAUD Laboratoire : Génomique, Epigénétique et Physiopathologie de la Reproduction Responsable : Daniel Vaiman Intitulé de l ‘équipe d’accueil : Interaction Gamétique et Fécondation Responsable : Jean-Philippe Wolf Responsable de l’équipe : Jean-Philippe Wolf Résumé du thème de recherche de l’équipe Nous cherchons à comprendre les mécanismes moléculaires qui président à la reconnaissance, l’adhésion et la fusion des membranes au cours de la fécondation. Nous travaillons notamment sur le rôle de trois familles de protéines : les Intégrines, les tétraspanines et les protéines ancrées à un GPI (GPI-APs). Nous avons décrit un phénomène d’échange de fragments membranaires similaire à la Trogocytose entre les deux gamètes juste avant leur fusion. Nous cherchons actuellement à démontrer son caractère fonctionnel. En collaboration avec une équipe de physiciens de l’ENS Paris, nous avons mis au point un dispositif permettant la mesure des nanoforces développées lors de l’adhésion entre un spermatozoïde et un ovocyte. En utilisant des gamètes mutés pour des protéines d’intérêt ou des anticorps dirigés contre celles-ci, nous allons tenter d’identifier les protéines impliquées précisément dans l’étape de l’adhésion. Titre du projet de stage : Lien entre Gas1 et GFRalpha1 ovocytaires dans le contrôle de la fusion membranaire lors de la fécondation Prénom, NOM, téléphone et adresse e-mail du Responsable du stage: Brigitte LEFEVRE, [email protected] Tel : 01 44 41 23 20 Projet de stage : Les protéines membranaires ancrées à un glycosyl-phosphatidylinositol (GPI-APs) qui sont impliquées dans l’organisation et l’induction de voies de signalisation le sont aussi dans la fusion gamétique. En effet, l’invalidation conditionnelle au niveau de l’ovocyte du gène Pig-a, (codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse du GPI), entraîne la disparition de toutes les GPI-APs à la surface de l’ovocyte et la perte de la capacité fusiogène de la membrane ovocytaire. Après une analyse bibliographique, nous avons sélectionné six de ces protéines dont nous avons vérifié la présence dans les ovocytes de souris en immunofluorescence et en Western blot. Bien que toutes présentes sur la membrane, deux seulement se sont avérées impliquées dans le processus de fécondations, Gas1 et GFRalpha1 (GDNF family receptor alpha-1). En effet, la pré-incubation des ovocytes ovulés et dépellucidés en présence de l’un ou l’autre de leurs anticorps réduit significativement l’index de fécondation c’est à dire le nombre de tête de spermatozoïdes par ovocyte. Il s’avère que ces deux protéines sont apparentées avec une divergence très tôt dans l’évolution des métazoaires. Toutes deux forment un complexe avec un récepteur transmembranaire tyrosine kinase (RET) dans d’autres modèles cellulaires. L’objectif de cette étude est donc d’établir 1) le lien éventuel entre Gas1 et GFRalpha1 dans l’ovocyte de souris et dans le contrôle de la fécondation et 2) par quelle(s) voies de signalisation elles le font. . Techniques mises en œuvre par le stagiaire : Super ovulation des souris, préparation des gamètes mâles et femelles de souris, microinjection des ARN interférents au stade VG, maturation in vitro des ovocytes, vérification de l’inhibition par RT-PCR, Western blot et Immunofluorescence observée en microscopie confocale. Fécondation in vitro et immunocytochimie Publications du Responsable de stage au cours des 5 dernières années : - Barraud-Lange V, Chalas Boissonnas C, Serres C, Auer J, Schmitt A, Lefevre B, Wolf JP, Ziyyat A. Membrane transfer from oocyte to sperm occurs in two CD9-independent ways that do not supply the fertilizing ability of Cd9-deleted oocytes. Reproduction. 2012 (in press) -Lefèvre B, Wolf J-P, Ziyyat A. Sperm-egg interaction: Is there a link between tetraspanin(s) and GPIanchored protein(s)? BioEssays 2010, 32:143-152. - Arnault E, Doussau M, Pesty A, Lefèvre B, Courtot A-M. Lamin A/C, caspase-6 and chromatin configuration during meiosis resumption in the mouse oocyte. Reprod. Sci. 2010, 17:102-115. - Pesty A, Doussau M, Lahaye J-B, Lefèvre B. Whole body or isolated ovary 60Co irradiation: effects on in vivo and in vitro folliculogenesis and oocyte maturation. Reprod. Toxicol 2010, 20:93-98. - Barraud-Lange V, Ziyyat A, Chalas C, Pont J-C, Auer J, Serre C, Lefèvre B, Wolf J-P. Les molécules impliquées dans l'interaction des membranes gamétiques au cours de la fécondation: apport du modèle murin. Reprod. Hum. Hormon. 2009, 22 :47-58.- Arnault E, Tosca L, Courtot A-M, Doussau M, Pesty A, Finaz C, Allemand I, Lefèvre B. Caspase-2L, caspase-3, and caspase-9 during in vitro maturation and fragmentation of the mouse oocyte. Dev Dyn 2008 237:3892-3903. -Lefèvre B. The nucleolus of the maternal gamete is essential for life. Bioessays 2008, 30:613-617. - Pesty A, Broca O, Poirot C, Lefèvre B. The role of PLCß1 in the control of oocyte meiosis during folliculogenesis. Reprod Sci 2008 15:661-672. - Arnault E, Doussau M, Pesty A, Gouget B, Van der Meeren A, Fouchet P, Lefèvre B. Natural uranium disturbs mouse folliculogenesis in vivo and oocyte meiosis in vitro. Toxicology 2008 247:80-87. - Miyara F, Pesty A, Migne C, Djediat C, Huang XB, Dumont-Hassan M, Debey P, Lefèvre B. Spontaneous calcium oscillations and nuclear PLC-ß1 in human GV oocytes. Mol Reprod Dev 2008 75: 392-402. Autres informations: Etudiants actuellement en thèse ou en M2 dans l’équipe d’accueil. Pour chaque étudiant indiquez le nom du responsable de thèse, l’année du début de la thèse et l’Ecole Doctorale de rattachement Actuellement en M2 : Mikael Agopiantz Master Biologie Cellulaire Physiologie Pathologie Spécialité : Reproduction et Développement (Paris 5-7-11) Responsable : Brigitte Lefèvre Jonathan Cohen Master Biologie Cellulaire Physiologie Pathologie Spécialité : Reproduction et Développement (Paris 5-7-11) Responsable : Ahmed Ziyyat Achraf Benamar Master Biologie Cellulaire Physiologie Pathologie Spécialité : Reproduction et Développement (Paris 5-7-11) Responsable : Jean-Philippe Wolf Magalie Vatin: thèse dirigée par Ahmed ZIYYAT, thèse 2009- Décembre 2012. Ecole doctorale : GC2ID Paris 5 Cette proposition de stage s’adresse-t-elle spécifiquement à un étudiant scientifique, médecin ou vétérinaire ou bien est-il ouvert à tous les profils ? Tous les profils Ce sujet peut-il donner lieu à une thèse ? Oui