A – Enjeux socio-économiques et scientifiques

Proposition de sujet de thèse
Responsables : J. Jahier
Unité d’accueil : UMR APBV INRA-Agrocampus Rennes
BP 35327, 35653 Le Rheu
Types de bourse demandées : Bourse cofinancée INRA-Région
Allocation de recherches ministérielles
Mots clés : Aegilops tauschii, blés synthétiques, chromosome, méiose
A – Enjeux socio-économiques et scientifiques
Environ 70% des espèces végétales ont connu au moins un événement de polyploïdisation au
cours de leur évolution. Cette duplication des génomes a joué un rôle majeur dans la
spéciation et la biodiversité des espèces contemporaines (Otto & Whitton, 2000, Adams &
Wendel 2005). De nombreuses espèces cultivées sont soit autopolyploïdes portant plusieurs
exemplaires d’un même génome (ex : luzerne, pomme de terre), soit allopolyploïdes
présentant des génomes de plusieurs espèces apparentées au niveau diploïde (ex : blé, coton,
colza, tabac).
Il est maintenant clairement démontré que la polyploidie ne consiste pas en une simple
addition des génomes Les génomes des polyploïdes présentent par rapport aux génomes des
espèces diploïdes de nombreuses modifications structurales (pertes de séquence…) et
fonctionnelles (reprogrammation de l’expression des gènes, activation d’éléments
transposables…) qui peuvent être la conséquence 1- des interactions entre les génomes 2- des
modifications structurales ou 3- d’évènements épigénétiques (remodelage de la chromatine,
condensation, méthylation…).. (Chen & Ni 2006, Levy & Feldman 2004, Osborn et al 2003)
Une approche intégrée est indispensable si l’on veut préciser les évènements mis en jeu dans
la stabilisation et/ou l’évolution des polyploïdes. La communauté française s’est fédérée sur le
thème de l’allopolyploïdie dans le cadre d’un projet ANR Biodiversité (2006-2009). Les
espèces concernées sont la spartine, le tabac, le blé et le colza. Ce sont des allopolyploïdes
ayant une histoire évolutive différente.
Les blés allopolyploïdes (blé dur 4X et blé tendre 6X) constituent un modèle pertinent pour
aborder les mécanismes en jeu lors de la spéciation d’une espèce allopolyploïde. Il est en effet
possible (1) de disposer des formes diploïdes, tétraploïdes, hexaploïdes contemporaines, (2)
d’extraire la forme tétraploïde telle qu’elle a évolué dans le blé tendre actuel et (3) de créer
différentes formes synthétiques ; il est donc possible d’appréhender les effets de l’évolution.
Deux équipes du GAP sont impliquées dans le programme ANR : URGV-Evry (B. Chalhoub)
et UMR APBV- Rennes (J. Jahier) et ont des travaux complémentaires.
Impact de l’évolution sur la recombinaison méiotique chez une espèce
allopolyploïde, le blé tendre.

Le projet présenté ici s’inscrit dans la complémentarité de l’approche intégrée citée ci-dessus.
Il concerne l’appariement des chromosomes homologues lors de la méiose chez les blés
synthétiques.
B - Problème de recherche
Actuellement les blés cultivés sont essentiellement le blé dur ou blé à macaroni qui est
tétraploïde (4x, 2n=28, AABB) et le blé tendre qui est hexaploïde (6x, 2n=42, AABBDD) et
destiné en priorité à la panification. Le blé diploïde ou engrain ou petit épeautre (2x, 2n=14,
AA) n’est cultivé que sur de très petites surfaces comme par exemple dans les Alpes du Sud.
La constitution génomique de ces trois espèces montrent qu’elles appartiennent à une série
polyploïde et constituent un exemple classique d’évolution par amphiploïdie (hybridation
interspécifique suivi de doublement des chromosomes). Le corollaire de ceci est que l’ordre
d’apparition des blés est le suivant : 2x puis 4x puis 6x. Les premiers blés tétraploïdes, résultat
de l’hybridation entre T. urartu (2n=14, AA) et une deuxième espèce diploïde, proche
d’Aegilops speltoides (2n=14, SS), sont apparus il y a au moins 500 000 ans. Les premiers
blés hexaploïdes ont été créés lors de la domestication, il y a environ 10 000 ans suite à
l’hybridation entre le blé tétraploïde T. dicoccum (2n = 28, AABB) et Ae. tauschii (2x,
2n=14, DD).
Les trois espèces diploïdes à l’origine des blés polyploïdes ont une méiose régulière (7
bivalents). L’hybridation au laboratoire entre T. urartu (AA) et Ae. speltoides (SS) (ou une
espèce proche de la section Sitopsis) permet après doublement du stock chromosomique de
l’hybride F1, de reproduire l’ancêtre du blé dur actuel (T. dicoccoides). Cet amphiploïde n’a
pas une méiose régulière car des appariements homéologues de type A-S ont été observés
contrairement aux blés tétraploïdes sauvages ou cultivés qui ont un comportement de diploïde
strict à la méiose : l’appariement se fait uniquement entre chromosomes homologues. On
admet que la principale raison est l’acquisition par mutation d’un système génétique
inhibiteur d’appariement homéologue. Le gène majeur de ce système, appelé Ph1 a été
récemment cloné par (Griffiths et al. 2006). Cependant, l’effet de l’évolution sur le nombre de
crossing over entre chromosomes homologues en présence de Ph1 n’a jusqu’à présent pas été
abordé alors qu’il conditionne le brassage génétique et la stabilité des nouvelles espèces
polyploïdes formées. Pour ce faire, nous avons produit un ensemble de blés synthétiques. Le
matériel est constitué de 8 blés synthétiques issus de l’hybridation entre :
- 2 blés 4X a) blé dur cv. Joyau
b) Tétra Courtot : la composante tétraploïde (AABB) extraite du blé tendre cv.
Courtot.
- 4 accessions d’Ae. tauschii
La stabilité méiotique de blés synthétiques au cours des générations S0 (issues du doublement
spontané d’hybrides blé 4X ×Ae. tauschii ABD, 2n = 21), S1 et S2, est appréhendée
par l’analyse
- des appariements chromosomiques
- la fréquence de plantes aneuploïdes
Bien que les composantes 4X (blé dur et blé 4X extrait du blé tendre 6X) et 2x aient une
méiose parfaitement régulière, nous avons montré que :
 le niveau d’appariement chromosomique homologue chez les blés synthétiques est
significativement inférieur à celui des blés témoins 6X,

 on a un effet significatif sur le niveau d’appariement du fond génétique du :
- parent 2X : les blés synthétiques dont les parents 2X sont les accessions d’Ae.
tauschii n°25 et n°109 montrent les comportements les plus extrêmes.
- parent 4X : la composante 4X extraite du blé tendre conférant une stabilité plus
grande que le blé dur 4X actuel.
Ce dernier résultat pourrait indiquer que l’évolution a mis en place sur les génome A et B un
contrôle génétique de l’appariement dans les blés 6X distinct de celui présent chez les blés 4X
actuels. Cette observation est à rapprocher des travaux de Ross-Ibarra (2004) qui souligne que
la domestication a abouti à des génotypes ayant un niveau de recombinaison homologue plus
élevé que chez les génotypes non domestiqués. Son étude basée sur le nombre de chiasma par
cellule ou par chromosome pourrait signifier que la domestication augmente le niveau
d’appariement homologue. En effet, le nombre de chiasma est en fait la combinaison
‘fréquence d’appariement × nombre de chiasma par appariement’. Il est raisonnable de penser
que les conclusions de Ross-Ibarra s’applique au blé : il y a une variabilité dans l’appariement
homologue chez les blés synthétiques et la domestication a sélectionné des gènes favorables à
un haut niveau d’appariement homologue.
Ces gènes pourraient agir à différents stades de la méiose. En effet, différentes étapes sont
distinguées dans l’appariement des chromosomes en prophase:
- rapprochement et alignement présynaptique des chromosomes homologues au
leptotène,
- l’appariement des homologues grâce au complexe synaptonémal au zygotène-
pachytène
- la formation de chiasmas suite aux crossing-over (pachytène-diacinése).
En métaphase I, suite à la condensation des chromosomes, les associations chiasmatiques
chromosomiques sont facilement observables et dénombrables.
Chez le blé : à ce jour, on a une bonne connaissance du système génétique impliqué dans
l’appariement homéologue (gènes promoteurs d’une part et gènes inhibiteurs d’appariement
homéologue). Par contre les gènes impliqués dans l’appariement homologue n’ont été que très
peu étudiés étudiés. A ce jour, seul le gène TaASY1 essentiel à la formation du complexe
synaptonémal a été isolé, séquencé et caractérisé par une équipe australienne (Boden et al
2007). Par ailleurs cette dernière a isolé 1350 transcrits impliqués dans les premiers stades de
la méiose (Crismani et al 2006). Les premiers résultats montrent que plusieurs d’entre eux
apparaissent orthologues de gènes connus pour être impliqués dans la méiose chez d’autres
organismes (levure, Arabidopsis thaliana (Spo, Mre, Msh….). Leur rôle dans le contrôle
génétique lors de la formation des chiasmas chez les polyploïdes reste à élucider.
C - Questions de recherches posées
Il est donc possible d’aborder pour la première fois chez une espèce polyploïde l’effet de
l’évolution sur les mécanismes régulant le nombre de crossing over entre chromosomes
homologues, en cherchant à déterminer :
*Quel est le contrôle génétique impliqué dans l’appariement homologue chez les blés
synthétiques ?
*Quelles sont les conséquences d’un déficit d’appariement homologue sur la fréquence de
plantes aneuploïdes ?
D - Hypothèses de travail

Des déterminants génétiques sont impliqués dans le niveau d’appariement homologue chez les
blés synthétiques
Depuis sa création il y a environ 10 000 ans, l’évolution de son génome par différents
mécanismes, la sélection naturelle et la domestication (y compris sélection) ont contribué au
développement de génotypes ayant une méiose très régulière (21 bivalents anneaux presque
systématiquement).
E - Programme de recherche
A- Travaux concernant la première question de recherche Q1 : Quel est le
contrôle génétique impliqué dans l’appariement homologue chez les blés
synthétiques ?
A partir (1) des deux Ae. tauschii 109 et 25 (2) de Courtot 4x issu du blé tendre 6x Courtot et
d’une variété de blé dur 4x, Joyau, nous avons créé les quatre synthétiques suivants qui
présentent des comportements méiotiques distincts:
SYN 109 = Tétra Courtot / Ae. tauschii 109
SYN 25 = Tétra Courtot / Ae. tauschii 25
JOY 109 = blé dur cv. Joyau / Ae. tauschii 109
JOY 25 = blé dur cv. Joyau / Ae. tauschii 25
 L’asynapsis des chromosomes en méiose affecte-t-elle de la même façon les trois génomes
A, B et D ?
La technique d’hybridation in situ GISH permet de visualiser par trois couleurs différentes les
trois génomes A, B et D du blé.
Elle sera mise en œuvre sur des CMP (cellules-mères du pollen) des deux synthétiques SYN
109 et JOY 25 parents de la population utilisée pour localiser dans le génome les facteurs
génétiques impliqués dans l’appariement homologue chez les synthétiques.
 Quels sont les déterminants génétiques impliqués dans l’appariement homologue chez les
synthétiques ?
Génération F1 : afin d’évaluer les différents effets génétiques (effets du parent 4X, du parent
2X, interaction 2X/4X), l’appariement de la F1 SYN 109 × JOY 25 sera comparé à celui des
hybrides suivants :
* Le synthétique SYN 25 sera produit en 2008. Voir partie  ci-dessous
Génération F2 : L’étude repose sur la population F2 entre SYN 109 (HHP*) et JOY 25
(LHP*) qui sera disponible pour le début de la thèse. Pour la créer, il sera impératif de :
- croiser des plantes euploïdes des deux parents pour produire la F1. Ces plantes
seront donc contrôlées sur un plan cytogénétique (2n, méiose, GISH),
- vérifier de la même façon les plantes F1 à l’origine de la F2.
* HHP = High Homologous Pairing
SYN 109 × JOY 109  effet 4X6X
SYN 25* × JOY 25
JOY 25 × JOY 109  effet 2X6X
SYN 25* × SYN 109

LHP = Low Homologous Pairing
Plus de 100 plantes de la population F2 seront cultivées. Au stade jeune plante, des
prélèvements de feuille seront faits pour extraire l’ADN nécessaire à la cartographie.
Au stade de la méiose, le comportement méiotique en métaphase I de chaque plante sera
établi. Nous rechercherons à minimiser et contrôler les effets environnementaux sur
l’appariement (dispositif expérimental avec répétition des génotypes parentaux, prélèvements
d’anthères le même jour..)
La carte génétique du croisement sera réalisée en utilisant :
- des marqueurs DArT (Diversity Arrays Technology, proposés par la société
Triticarte en Australie)
- et des marqueurs microsatellites. Le nombre utilisé dépendra de la densité de la
carte obtenue par les DArT. De toute façon, on en utilisera au moins deux par bras
chromosomique afin d’identifier les groupes de liaison.
La confrontation des données de cartographie et des données phénotypiques d’appariement
aboutira à la détection de gènes/QTL impliqués dans l’appariement homologue.*
L’effet sur la recombinaison des QTL détectés pourra être mis en évidence en génotypant puis
en analysant les évènements de recombinaison au niveau d’un groupe d’homéologie chez les
quatre populations F2 (étudiées en F1) : SYN 109 × JOY 109, SYN 25 × JOY 25, JOY 25 ×
JOY 109, SYN 25 × SYN 109
* (A plus long terme, la population pourra être utilisée pour localiser sur le génome du blé des
gènes homologues de ceux impliqués dans l’appariement homologue chez d’autres espèces. Si
certains étaient dans les zones chromosomiques (QTL) identifiées ci-dessous, ils pourraient être
des candidats pour expliquer le caractère)
 Quelle est la variabilité du niveau d’appariement homologue en fonction du parent
tétraploïde ?
Nous avons signalé plus haut que les synthétiques SYN dont le parent blé est Tétra Courtot
ont un comportement méiotique proche de ceux des blés tendres contemporains contrairement
aux synthétiques créés à partir de la variété de blé dur cv. Joyau.
Afin de savoir si les blés synthétiques dont le parent blé 4X est la composante tétraploïde
(AABB) d’un blé tendre ont un niveau d’appariement homologue en méiose plus élevé que
les synthétiques créés à partir de tout blé 4X (sauvage ou cultivé), nous allons créer en 2008
de nouveaux blés synthétiques. Les deux accessions d’Ae. tauschii 25 et 109 seront croisés
avec
a) des composantes tétraploïdes extraites de blés tendres d’origine très différente :
- Tétra Isengrain (produit par le labo)
- Tétra Canthacht
- Tétra Chinese Spring
- Tétra Courtot (croisement avec Ae. tauschii 25 seulement, celui avec 109 déjà obtenu)
b) des deux blés botaniques
- T. dicoccoides : l’ancêtre des blés tétraploïdes issu de l’hybridation entre T. urartu
(2n=14, AA) et Ae. speltoides donneur du génome B
- T. dicoccum : issu de T. dicoccoides, il est le parent tétraploïde à l’origine des blés
hexaploïdes (T. dicoccum × Ae. tauschii)