A – Enjeux socio-économiques et scientifiques
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Proposition de sujet de thèse Impact de l’évolution sur la recombinaison méiotique chez une espèce allopolyploïde, le blé tendre. Responsables : J. Jahier Unité d’accueil : UMR APBV INRA-Agrocampus Rennes BP 35327, 35653 Le Rheu Types de bourse demandées : Bourse cofinancée INRA-Région Allocation de recherches ministérielles Mots clés : Aegilops tauschii, blés synthétiques, chromosome, méiose A – Enjeux socio-économiques et scientifiques Environ 70% des espèces végétales ont connu au moins un événement de polyploïdisation au cours de leur évolution. Cette duplication des génomes a joué un rôle majeur dans la spéciation et la biodiversité des espèces contemporaines (Otto & Whitton, 2000, Adams & Wendel 2005). De nombreuses espèces cultivées sont soit autopolyploïdes portant plusieurs exemplaires d’un même génome (ex : luzerne, pomme de terre), soit allopolyploïdes présentant des génomes de plusieurs espèces apparentées au niveau diploïde (ex : blé, coton, colza, tabac). Il est maintenant clairement démontré que la polyploidie ne consiste pas en une simple addition des génomes Les génomes des polyploïdes présentent par rapport aux génomes des espèces diploïdes de nombreuses modifications structurales (pertes de séquence…) et fonctionnelles (reprogrammation de l’expression des gènes, activation d’éléments transposables…) qui peuvent être la conséquence 1- des interactions entre les génomes 2- des modifications structurales ou 3- d’évènements épigénétiques (remodelage de la chromatine, condensation, méthylation…).. (Chen & Ni 2006, Levy & Feldman 2004, Osborn et al 2003) Une approche intégrée est indispensable si l’on veut préciser les évènements mis en jeu dans la stabilisation et/ou l’évolution des polyploïdes. La communauté française s’est fédérée sur le thème de l’allopolyploïdie dans le cadre d’un projet ANR Biodiversité (2006-2009). Les espèces concernées sont la spartine, le tabac, le blé et le colza. Ce sont des allopolyploïdes ayant une histoire évolutive différente. Les blés allopolyploïdes (blé dur 4X et blé tendre 6X) constituent un modèle pertinent pour aborder les mécanismes en jeu lors de la spéciation d’une espèce allopolyploïde. Il est en effet possible (1) de disposer des formes diploïdes, tétraploïdes, hexaploïdes contemporaines, (2) d’extraire la forme tétraploïde telle qu’elle a évolué dans le blé tendre actuel et (3) de créer différentes formes synthétiques ; il est donc possible d’appréhender les effets de l’évolution. Deux équipes du GAP sont impliquées dans le programme ANR : URGV-Evry (B. Chalhoub) et UMR APBV- Rennes (J. Jahier) et ont des travaux complémentaires. Le projet présenté ici s’inscrit dans la complémentarité de l’approche intégrée citée ci-dessus. Il concerne l’appariement des chromosomes homologues lors de la méiose chez les blés synthétiques. B - Problème de recherche Actuellement les blés cultivés sont essentiellement le blé dur ou blé à macaroni qui est tétraploïde (4x, 2n=28, AABB) et le blé tendre qui est hexaploïde (6x, 2n=42, AABBDD) et destiné en priorité à la panification. Le blé diploïde ou engrain ou petit épeautre (2x, 2n=14, AA) n’est cultivé que sur de très petites surfaces comme par exemple dans les Alpes du Sud. La constitution génomique de ces trois espèces montrent qu’elles appartiennent à une série polyploïde et constituent un exemple classique d’évolution par amphiploïdie (hybridation interspécifique suivi de doublement des chromosomes). Le corollaire de ceci est que l’ordre d’apparition des blés est le suivant : 2x puis 4x puis 6x. Les premiers blés tétraploïdes, résultat de l’hybridation entre T. urartu (2n=14, AA) et une deuxième espèce diploïde, proche d’Aegilops speltoides (2n=14, SS), sont apparus il y a au moins 500 000 ans. Les premiers blés hexaploïdes ont été créés lors de la domestication, il y a environ 10 000 ans suite à l’hybridation entre le blé tétraploïde T. dicoccum (2n = 28, AABB) et Ae. tauschii (2x, 2n=14, DD). Les trois espèces diploïdes à l’origine des blés polyploïdes ont une méiose régulière (7 bivalents). L’hybridation au laboratoire entre T. urartu (AA) et Ae. speltoides (SS) (ou une espèce proche de la section Sitopsis) permet après doublement du stock chromosomique de l’hybride F1, de reproduire l’ancêtre du blé dur actuel (T. dicoccoides). Cet amphiploïde n’a pas une méiose régulière car des appariements homéologues de type A-S ont été observés contrairement aux blés tétraploïdes sauvages ou cultivés qui ont un comportement de diploïde strict à la méiose : l’appariement se fait uniquement entre chromosomes homologues. On admet que la principale raison est l’acquisition par mutation d’un système génétique inhibiteur d’appariement homéologue. Le gène majeur de ce système, appelé Ph1 a été récemment cloné par (Griffiths et al. 2006). Cependant, l’effet de l’évolution sur le nombre de crossing over entre chromosomes homologues en présence de Ph1 n’a jusqu’à présent pas été abordé alors qu’il conditionne le brassage génétique et la stabilité des nouvelles espèces polyploïdes formées. Pour ce faire, nous avons produit un ensemble de blés synthétiques. Le matériel est constitué de 8 blés synthétiques issus de l’hybridation entre : - 2 blés 4X a) blé dur cv. Joyau b) Tétra Courtot : la composante tétraploïde (AABB) extraite du blé tendre cv. Courtot. - 4 accessions d’Ae. tauschii La stabilité méiotique de blés synthétiques au cours des générations S0 (issues du doublement spontané d’hybrides blé 4X ×Ae. tauschii ABD, 2n = 21), S1 et S2, est appréhendée par l’analyse - des appariements chromosomiques - la fréquence de plantes aneuploïdes Bien que les composantes 4X (blé dur et blé 4X extrait du blé tendre 6X) et 2x aient une méiose parfaitement régulière, nous avons montré que : le niveau d’appariement chromosomique homologue chez les blés synthétiques est significativement inférieur à celui des blés témoins 6X, on a un effet significatif sur le niveau d’appariement du fond génétique du : - parent 2X : les blés synthétiques dont les parents 2X sont les accessions d’Ae. tauschii n°25 et n°109 montrent les comportements les plus extrêmes. - parent 4X : la composante 4X extraite du blé tendre conférant une stabilité plus grande que le blé dur 4X actuel. Ce dernier résultat pourrait indiquer que l’évolution a mis en place sur les génome A et B un contrôle génétique de l’appariement dans les blés 6X distinct de celui présent chez les blés 4X actuels. Cette observation est à rapprocher des travaux de Ross-Ibarra (2004) qui souligne que la domestication a abouti à des génotypes ayant un niveau de recombinaison homologue plus élevé que chez les génotypes non domestiqués. Son étude basée sur le nombre de chiasma par cellule ou par chromosome pourrait signifier que la domestication augmente le niveau d’appariement homologue. En effet, le nombre de chiasma est en fait la combinaison ‘fréquence d’appariement × nombre de chiasma par appariement’. Il est raisonnable de penser que les conclusions de Ross-Ibarra s’applique au blé : il y a une variabilité dans l’appariement homologue chez les blés synthétiques et la domestication a sélectionné des gènes favorables à un haut niveau d’appariement homologue. Ces gènes pourraient agir à différents stades de la méiose. En effet, différentes étapes sont distinguées dans l’appariement des chromosomes en prophase: - rapprochement et alignement présynaptique des chromosomes homologues au leptotène, - l’appariement des homologues grâce au complexe synaptonémal au zygotènepachytène - la formation de chiasmas suite aux crossing-over (pachytène-diacinése). En métaphase I, suite à la condensation des chromosomes, les associations chiasmatiques chromosomiques sont facilement observables et dénombrables. Chez le blé : à ce jour, on a une bonne connaissance du système génétique impliqué dans l’appariement homéologue (gènes promoteurs d’une part et gènes inhibiteurs d’appariement homéologue). Par contre les gènes impliqués dans l’appariement homologue n’ont été que très peu étudiés étudiés. A ce jour, seul le gène TaASY1 essentiel à la formation du complexe synaptonémal a été isolé, séquencé et caractérisé par une équipe australienne (Boden et al 2007). Par ailleurs cette dernière a isolé 1350 transcrits impliqués dans les premiers stades de la méiose (Crismani et al 2006). Les premiers résultats montrent que plusieurs d’entre eux apparaissent orthologues de gènes connus pour être impliqués dans la méiose chez d’autres organismes (levure, Arabidopsis thaliana (Spo, Mre, Msh….). Leur rôle dans le contrôle génétique lors de la formation des chiasmas chez les polyploïdes reste à élucider. C - Questions de recherches posées Il est donc possible d’aborder pour la première fois chez une espèce polyploïde l’effet de l’évolution sur les mécanismes régulant le nombre de crossing over entre chromosomes homologues, en cherchant à déterminer : *Quel est le contrôle génétique impliqué dans l’appariement homologue chez les blés synthétiques ? *Quelles sont les conséquences d’un déficit d’appariement homologue sur la fréquence de plantes aneuploïdes ? D - Hypothèses de travail Des déterminants génétiques sont impliqués dans le niveau d’appariement homologue chez les blés synthétiques Depuis sa création il y a environ 10 000 ans, l’évolution de son génome par différents mécanismes, la sélection naturelle et la domestication (y compris sélection) ont contribué au développement de génotypes ayant une méiose très régulière (21 bivalents anneaux presque systématiquement). E - Programme de recherche A- Travaux concernant la première question de recherche Q1 : Quel est le contrôle génétique impliqué dans l’appariement homologue chez les blés synthétiques ? A partir (1) des deux Ae. tauschii 109 et 25 (2) de Courtot 4x issu du blé tendre 6x Courtot et d’une variété de blé dur 4x, Joyau, nous avons créé les quatre synthétiques suivants qui présentent des comportements méiotiques distincts: SYN 109 = Tétra Courtot / Ae. tauschii 109 SYN 25 = Tétra Courtot / Ae. tauschii 25 JOY 109 = blé dur cv. Joyau / Ae. tauschii 109 JOY 25 = blé dur cv. Joyau / Ae. tauschii 25 L’asynapsis des chromosomes en méiose affecte-t-elle de la même façon les trois génomes A, B et D ? La technique d’hybridation in situ GISH permet de visualiser par trois couleurs différentes les trois génomes A, B et D du blé. Elle sera mise en œuvre sur des CMP (cellules-mères du pollen) des deux synthétiques SYN 109 et JOY 25 parents de la population utilisée pour localiser dans le génome les facteurs génétiques impliqués dans l’appariement homologue chez les synthétiques. Quels sont les déterminants génétiques impliqués dans l’appariement homologue chez les synthétiques ? Génération F1 : afin d’évaluer les différents effets génétiques (effets du parent 4X, du parent 2X, interaction 2X/4X), l’appariement de la F1 SYN 109 × JOY 25 sera comparé à celui des hybrides suivants : SYN 109 × JOY 109 SYN 25* × JOY 25 effet 4X6X JOY 25 × JOY 109 SYN 25* × SYN 109 effet 2X6X * Le synthétique SYN 25 sera produit en 2008. Voir partie ci-dessous Génération F2 : L’étude repose sur la population F2 entre SYN 109 (HHP*) et JOY 25 (LHP*) qui sera disponible pour le début de la thèse. Pour la créer, il sera impératif de : - croiser des plantes euploïdes des deux parents pour produire la F1. Ces plantes seront donc contrôlées sur un plan cytogénétique (2n, méiose, GISH), - vérifier de la même façon les plantes F1 à l’origine de la F2. * HHP = High Homologous Pairing LHP = Low Homologous Pairing Plus de 100 plantes de la population F2 seront cultivées. Au stade jeune plante, des prélèvements de feuille seront faits pour extraire l’ADN nécessaire à la cartographie. Au stade de la méiose, le comportement méiotique en métaphase I de chaque plante sera établi. Nous rechercherons à minimiser et contrôler les effets environnementaux sur l’appariement (dispositif expérimental avec répétition des génotypes parentaux, prélèvements d’anthères le même jour..) La carte génétique du croisement sera réalisée en utilisant : - des marqueurs DArT (Diversity Arrays Technology, proposés par la société Triticarte en Australie) - et des marqueurs microsatellites. Le nombre utilisé dépendra de la densité de la carte obtenue par les DArT. De toute façon, on en utilisera au moins deux par bras chromosomique afin d’identifier les groupes de liaison. La confrontation des données de cartographie et des données phénotypiques d’appariement aboutira à la détection de gènes/QTL impliqués dans l’appariement homologue.* L’effet sur la recombinaison des QTL détectés pourra être mis en évidence en génotypant puis en analysant les évènements de recombinaison au niveau d’un groupe d’homéologie chez les quatre populations F2 (étudiées en F1) : SYN 109 × JOY 109, SYN 25 × JOY 25, JOY 25 × JOY 109, SYN 25 × SYN 109 * (A plus long terme, la population pourra être utilisée pour localiser sur le génome du blé des gènes homologues de ceux impliqués dans l’appariement homologue chez d’autres espèces. Si certains étaient dans les zones chromosomiques (QTL) identifiées ci-dessous, ils pourraient être des candidats pour expliquer le caractère) Quelle est la variabilité du niveau d’appariement homologue en fonction du parent tétraploïde ? Nous avons signalé plus haut que les synthétiques SYN dont le parent blé est Tétra Courtot ont un comportement méiotique proche de ceux des blés tendres contemporains contrairement aux synthétiques créés à partir de la variété de blé dur cv. Joyau. Afin de savoir si les blés synthétiques dont le parent blé 4X est la composante tétraploïde (AABB) d’un blé tendre ont un niveau d’appariement homologue en méiose plus élevé que les synthétiques créés à partir de tout blé 4X (sauvage ou cultivé), nous allons créer en 2008 de nouveaux blés synthétiques. Les deux accessions d’Ae. tauschii 25 et 109 seront croisés avec a) des composantes tétraploïdes extraites de blés tendres d’origine très différente : - Tétra Isengrain (produit par le labo) - Tétra Canthacht - Tétra Chinese Spring - Tétra Courtot (croisement avec Ae. tauschii 25 seulement, celui avec 109 déjà obtenu) b) des deux blés botaniques - T. dicoccoides : l’ancêtre des blés tétraploïdes issu de l’hybridation entre T. urartu (2n=14, AA) et Ae. speltoides donneur du génome B - T. dicoccum : issu de T. dicoccoides, il est le parent tétraploïde à l’origine des blés hexaploïdes (T. dicoccum × Ae. tauschii) L’analyse du comportement méiotique de ces synthétiques et aussi ceux déjà obtenus avec Tétra Courtot et Joyau permettra de démontrer que les génomes A et B du blé tétraploïde ont subi des modifications à la suite de leur introduction dans un contexte hexaploïde pour aboutir à des génotypes ayant une méiose très régulière avec environ 90% des bras chromosomiques appariés. N.B. : L’hypothèse ci-dessus est confortée par d’autres observations sur les blés synthétiques issus de Tétra Courtot. Ces derniers ont un phénotype ‘moins sauvage’ que les autres synthétiques (ceux issus de Joyau et aussi d’autres utilisés antérieurement ou en collection) B- Travaux concernant la deuxième question de recherche Q2 : Quelles sont les conséquences d’un déficit d’appariement homologue sur la fréquence de plantes aneuploïdes ? Quelle est la relation entre déficit d’appariement en méiose et fréquence d’aneuploïde ? Il est communément admis que la fréquence d’aneuploïdes dans la descendance d’une plante euploïde est une fonction linéaire du nombre moyen d’univalents par CMP. Notre objectif est de, pour la première fois vérifier et préciser cette assertion. En effet il est tout à fait réaliste de supposer que, outre la fréquence d’univalents en méiose, d’autres facteurs interviennent (fonds génétique, cinétique différente des chromosomes lors de la migration aux pôles en anaphase….). Nous prévoyons de dénombrer les chromosomes d’un échantillon de 20 plantes F3 de chaque plante F2 de la population SYN 109 × JOY 25. Nous serons ainsi en mesure de mesurer la corrélation entre d’une part le nombre de bras appariés en F2 (et/ou le nombre moyen d’univalents par CMP) et d’autre part la fréquence de plantes aneuploïdes en F3. Ce travail sera poursuivi par la recherche et la localisation de QTL impliqués dans la fréquence d’aneuploïdes et de vérifier si ces QTL se superposent aux QTL impliqués dans la synapsis des chromosomes. Perspectives à plus long terme Notre objectif à plus long terme est de comprendre comment les blés synthétiques hexaploïdes apparus il y a 10000 ans ont évolué pour aboutir à des formes cultivées ou non présentant un appariement chromosomique homologue régulier (figure ci-dessous). T. dicoccon × Ae. tauschii - 8 000 ans B.C. croissant fertile Blés synthétiques naturels Evolution Méiose régulière Méiose irrégulière Mécanismes ? Domestication Création variétale 21ème siècle Blés non cultivés Blés cultivés Déterminants génétiques Méiose régulière F- Originalité du sujet présenté A notre connaissance, l’étude proposée est originale et aucun autre labo n’est sur le même créneau, le contrôle de l’appariement chromosomique et de la recombinaison homologue et sa contribution à la stabilisation des espèces polyploïdes étant à élucider. Nous avons abouti à la présente proposition en partie grâce à la création de blés synthétiques à partir de la composante tétraploïde AABB du blé tendre Courtot. Nous sommes convaincus que les blés 4X extraits constituent des outils remarquables pour démontrer et analyser l’évolution des génomes A et B de T. dicoccum à la suite de leur introduction dans un contexte hexaploïde T. aestivum. D’après nos contacts, parmi les labos travaillant sur les blés synthétiques, nous serions les seuls à explorer cette voie. L’originalité du sujet se prolonge par le fait qu’elle offre des perspectives pour remonter aux causes génétiques de l’aneuploïdie chez certaines variétés de blé. En effet ces dernières présentent une fréquence élevée d’aneuploïdes dans les multiplications de semences. Une partie de ces aneuploïdes ont un phénotype hors-type. Si leur fréquence est trop élevée, on aboutit à des non-inscriptions au catalogue ou à la non-certification de lots de semences. G - Matériel disponible en octobre 2008 Matériel végétal F2 ‘JOY 25 ×SYN 109’ : grains F2 disponibles en novembre 2008 Nouveaux synthétiques : grains S0 disponibles en décembre 2008 Marqueurs moléculaires Nous disposons des amorces de plus de 500 marqueurs microsatellites. H - Compétences du laboratoire d’accueil - cytogénétique classique et cytogénétique moléculaire (hybridation in situ : FISH, GISH, Fiber FISH) moléculaire : marquage, cartographie, analyse de séquences grande expérience sur la cytogénétique du blé, l’aneuploïdie chez le blé I – Calendrier GISH sur synthétiques parents de la F2 Cartographie Observations des méioses F2 Recherche de QTL d’appariement Analyse de l’aneuploïdie en F3 Fin 2008 X 2009 2010 X X X X 20011 Etude méiotique de la génération S0 des nouveaux synthétiques Idem en génération S1 X Rédaction de publis Rédaction de la thèse X X X X J - Proposition d’un comité de thèse - CHÈVRE Anne-Marie,UMR APBV - CHALHOUB Boulos, GAP Evry, partenaire blé dans le programme ANR… - MERCIER Raphael, GAP Versailles - MÉZARD Christine, GAP Versailles - DAVID Jacques, Supagro, Montpellier K - Publications envisageables - Manifestations cytologiques du déficit d’appariement : génome(s) concerné(s) (A et/ou B et/ou D? QTL impliqués dans appariement et fréquence d’aneuploïdes Intérêt des composantes tétraploïdes extraites des blés hexaploïdes comme parents de synthétiques. L - Compétences Le doctorant acquerra des compétences en priorité en cytogénétique, en organisation des génomes, en cartographie. Sur un plan technique, il maîtrisera des techniques en Biologie moléculaire, en cartographie, en cytogénétique. M - Partenariat scientifique et industriel dans lequel s’inscrit le travail Nous avons signalé que nous participons au programme ANR ’Effet de la polyploÏdie sur la biodiversité et l’évolution du génome des plantes’. Ce programme qui regroupe 7 équipes françaises a pour objectif de préciser l’évolution des génomes chez les allopolyploïdes (blé, colza, Nicotiana, spartine). Dans le cas du blé, nos travaux et ceux de B. Chalhoub à Evry sont menés en étroite collaboration. Le programme ce termine en fin 2008. Nous espérons pouvoir le poursuivre sur un nouveau financement. Le doctorant pourra suivre les travaux et résultats, en particulier ceux qui concernent la recombinaison homologue chez les synthétiques de blé. D’autres programmes sont en cours sur les blés synthétiques. Ils concernent : - la gestion de la variabilité des synthétiques (en collaboration avec le groupe d’espèces ‘Céréales à paille’ du GAP) - exploitation de la variabilité dans l’amélioration du blé tendre (collaboration avec le Club5, Pathologie SPE Grignon, GAP Clermont-Ferrand) Le doctorant participera aux réunions et travaux du groupe ‘Cytogénétique & Polyploïdie’. du ‘Réseau Français Polyploïdie’ du groupe ‘Céréales à paille’ Il participera également au Congrès international ‘Polyploïdie’ à Rennes en 2009. N - Publications du laboratoire d’accueil sur le sujet Jusqu’à présent nous étions plus impliqués par des travaux sur l’appariement homéologue. L’étude génétique de l’appariement homologue chez le blé débute dans notre groupe. C’est pourquoi nous n’avons pas de publication à notre actif. Dans la thèse sera traitée l’aneuploïdie. Au cours des 20 dernières années, on a : - démontré des problèmes d’aneuploïdie chez des variétés ou lignées en cours d’inscription - été leader d’un programme financé par le CTPS et intitulé ‘Etudes des causes conduisant à des fréquences élevées de plantes hors-types aneuploïdes dans des variétés de blé tendre’. Un rapport sur les résultats obtenus a été produits. Une publication est en cours d’écriture : ‘Frequency, cytological types and phenotypes of wheat aneuploids’. O - Avis du directeur de laboratoire Sujet en cohérence avec le projet d’unité évalué en 2007. Sujet original sur le contrôle génétique de l’appariement homologue chez une espèce polyploïde Avis favorable Références citées Boden S.A. 2007. Expression and functional analysis of TaASY1 during meiosis of bread wheat (Triticum aestivum). BMC Molecular Biology 8:65 doi: 10.1186/1471-2199-8-65 Chen Z.J., NI Z. 2006. Mechanisms of genomic rearrangements and gene expression changes in plant polyploids. BioEssays 28, 240-252. Crismani W. et al 2006. Microarray expression analysis of meiosis and microsporogenesid in hexaploid bread wheat. BMC Genomics 7: 267 doi:10.1186/1471-2164-7-267. Doerge R.W. et al 2003. Understanding mechanisms of novel gene expression in polyploids. Trends in Genetics 19: 141-147. Griffiths S. et al 2006. Molecular characterization of Ph1 as a major chromosome pairing locus in polyploid wheat. Nature 439: 749-752. Levy A., Feldman M. 2004. Genetic and epigenetic reprogramming of the wheat genome upon polyploidization. Biological Journal of the Linnean Society 82: 607-613. Osborn T.C. et al. 2003. Understanding mechanisms of novel gene expression in polyploids. Trends in Genetics 19: 141-147. Otto S.P., Whitton J. 2000. Polyploid incidence and evolution. Annua. Rev. Genet. 34: 401-437. Ross-Ibarra J. 2004. The evolution of recombination under domestication: a test of two hypotheses. The American Naturalist 163: 105-112.
