TECHNIQUES D’ETUDES DE LA CELLULE Introduction L’organisation interne des systèmes biologiques est pour l’essentiel inaccessible à l’œil nu. Au 16eme siècle, les premières utilisations de lentilles grossissantes à des fins d’observation de structures biologiques, notamment par LEEWENHOEK, ont permis de définir l’entité biologique élémentaire : la cellule.(cellula en latin petite chambre). Les perfectionnements de la microscopie optique ont ainsi permis des observations de structures grandes de quelques micromètres à quelques millimètres . Puis l’avènement de la microscopie électronique a affiné ces observations ; on accède à des dimensions de l’ordre du nanomètre. TECHNIQUES D’OBSERVATION (première partie) A. LES INSTRUMENTS D’OBSERVATION : LES MICROSCOPES 1 . LA MICROSCOPIE OPTIQUE : Principe : les préparations sont éclairées par la lumière visible, soit par dessus (microscopie de réflexion) ,soit par dessous ( microscopie de transmission) . Dans ce dernier cas, les préparations sont suffisamment fines pour laisser passer la lumière. Des variantes en sont : - la microscopie polarisée : on intercale sur le faisceau lumineux un système de polarisation . Celui-ci crée des teintes artificielles qui peuvent révéler certains détails de la structure des objets observés, non repérables en lumière blanche. Très couramment utilisée en minéralogie, cette technique est également utilisée pour l’étude des polymères biologiques ( cellulose des parois végétales par exemple) ou des structures minéralisées (os par exemple). - la microscopie par contraste de phase : le système optique est conçu de façon à exploiter la diffraction des rayons lumineux par la préparation . Ainsi , les structures observées apparaissent en relief. On l’utilise fréquemment pour l’observation vitale de cellules animales. 2. LA MICROSCOPIE ELECTRONIQUE : Principe : la microscopie optique ne permet pas d’accéder à des détails inférieurs à quelques dixièmes de micromètres . En effet, le pouvoir de résolution d’un microscope est fonction de la longueur d’onde du rayonnement véhiculant l’information. En diminuant la longueur d’onde , on augmente le pouvoir de résolution de l’appareil . D’où l’idée d’utiliser un faisceau d’électrons (rayonnement de faible longueur d’onde ) ; ces particules présentent l’intérêt d’être faciles à obtenir , d’être facilement accélérer par un champ électrostatique, et d’être déviées par un champ magnétique comme le font les rayons lumineux au travers d’une lentille. Le faisceau d’électrons traverse l’échantillon étudié et atteint un écran fluorescent qui s’éclaire plus ou moins suivant le degré d’absorption des électrons par l’échantillon. L’observateur regarde au travers d’oculaires cet écran. Les clichés obtenus ne sont donc pas des photographies , mais des électronographies. On dira qu’une structure apparaissant en sombre est dense aux électrons, alors qu’une structure très claire sera transparente aux électrons. Des variantes en sont : - la microscopie électronique par transmission (MET) le faisceau d’électrons traverse l’échantillon. L’image est due à l’absorption différentielle des électrons par les différentes structures de l’échantillon. - la microscopie électronique à balayage (MEB) : l’objet observé est massif et est bombardé d’électrons. Les électrons incidents ne le traversent pas mais ils le pénètrent et subissent des chocs avec les atomes qui provoquent l’émission de rayons X , et d’électrons secondaires. Ces rayonnements réémis sont analysés et fournissent une image en trois dimensions de l’objet étudié. B. LA PREPARATION DES CELLULES : 1. L’OBSERVATION DE CELLULES VIVANTES : Celle-ci n’est possible qu’en microscopie optique. La microscopie électronique ne permet pas de réaliser des observations vitales. On utilise fréquemment des colorants vitaux ( ex : rouge neutre pour les cellules végétales) qui n’altèrent pas le fonctionnement cellulaire. 2. L’OBSERVATION DE CELLULES MORTES : C’est le cas de la plupart des observations d’histologie végétale, puisque les caractéristiques de la paroi des cellules suffisent à caractériser un tissu. Cependant, quand il s’agit d’observations de cellules complètes (végétales ou animales), et qu’il s’agisse de microscopie optique ou électronique, tuer les cellules revient à les fixer : la fixation est la première étape d’une observation de cellules mortes. a) la fixation : les préparations de microscopie électronique sont fixées au tétroxyde d’osmium. On peut également accentuer, voire créer des contrastes. b) la création de contrastes : ) technique du contraste positif : on fixe des atomes métalliques denses aux électrons sur les structures cellulaires que l’on souhaite observer . A l’observation, celles-ci apparaissent opaques dans un environnement transparent : le contraste obtenu est positif. Le métal utilisé peut être intégré au fixateur : c’est le cas de l’osmium du tétroxyde d’osmium. ) technique du cryodécapage : il s’agit d’obtenir, grâce à l’action du froid, des coupes de cellules ou d’organites selon des surfaces non planes, dont les irrégularités correspondent à des détails structuraux. La technique comprend trois étapes . (i) (ii) la congélation : l’objet vivant est congelé très rapidement, de façon à éviter la formation de cristaux de glace (qui lèseraient les structures fines ) par immersion dans l’azote liquide. La température s’abaisse d’une centaine de degrés en moins d’une seconde. L’obtention de la surface : la préparation est placée sous vide à –100°C. Dans ces conditions, l’objet se fracture, lorsqu’on le coupe , suivant des surfaces de faible résistance : c’est la cryofacture. Quand la surface est enrobée de glace ( par exemple des restes de milieu hyaloplasmique), la sublimation de la glace accentue le relief : c’est le cryodécapage. (iii) Réalisation d’une réplique : on projette obliquement des atomes de platine qui recouvrent inégalement la surface, dont on obtient ainsi une réplique ombrée. Cette réplique est alors recouverte d’un dépôt de carbone, transparent aux électrons, de façon à lui donner une rigidité suffisante. Puis , l’objet est dissous. TECHNIQUES CONDUISANT A DES DONNEES D’ORDRE FONCTIONNEL (deuxième partie) A. ETUDE FONCTIONNELLE « IN SITU » 1. CYTOCHIMIE Certaines réactions chimiques spécifiques peuvent être effectuées à l’échelle cellulaire . Elles sont réalisées sur blocs ou sur coupes avant ou après la fixation. Exemple : mise en évidence des polysaccharides Le principe de cette réaction se ramène à rendre visible sur les ultra-coupes certaines fonctions chimiques portées par les oses. Dans ce cas précis, il s’agit de mettre en évidence les groupements aldéhydes par une oxydation particulière ( technique de Thiery) Tous les grands groupes chimiques ne peuvent pas être mis en évidence sur ultra-coupes avec autant de facilité ; certains (les lipides par exemple ) n’étant pas caractérisés par un ou plusieurs groupements chimiques réactionnels, d’autres techniques seront nécessaires. 2. EXTRACTION SELECTIVE On peut par exemple digérer un constituant cellulaire à l’aide d’une enzyme hydrolytique ou l’extraire par un solvant spécifique. Exemple : action ménagée d’une amylase Après incubation à 37°C (température optimale) et à pH 7,2 , les échantillons sont fixés , inclus , puis coupés . C’est une digestion enzymatique permettant de localiser « in situ » un composé chimique particulier l’amidon. Exemple : extraction de lipides de réserve ou lipides neutres par le chloroforme L’action de solvants , le chloroforme en particulier , va permettre une extraction assez spécifique des lipides de réserve (lipides neutres). D’autres solvants , le méthanol par exemple, permettent d’extraire préférentiellement les phospholipides . Certains mélanges oxydants sont capables de provoquer également une extraction totale des composés lipophiles. 3. CYTOENZYMOLOGIE Il est possible également de mettre en évidence une activité enzymatique par les produits résultant de son action. Exemple : Détection de l’activité phosphatasique Les échantillons sont incubés dans un milieu renfermant un substrat de l’enzyme (à pH et température appropriés) et un sel soluble de plomb. L’activité phosphatasique se traduit par la libération de phosphate qui réagit avec le sel de plomb pour former un précipité opaque aux électrons permettant ainsi la visualisation de cette activité. La réaction s’effectue en deux temps 4. RADIOAUTOGRAPHIE Technique basée sur l’utilisation de traceurs radioactifs (voir le cours) 5. AUTRES TECHNIQUES On peut également localiser dans la cellule les propriétés antigéniques d’une substance : c’est l’immunocytochimie. Voir l’exemple du cours immunofluorescence indirecte. B. ETUDE FONCTIONNELLE IN VITRO La microscopie électronique permet également de vérifier certaines données fournies par la biochimie. Exemple : vérification de fractions cellulaires obtenues après centrifugations préparatives en gradient de densité. Il existe 2 types de centrifugations couramment utilisés : - la centrifugation de zone (v. fig 1) qui permet la séparation de constituants de taille très différente. - La centrifugation isopycnique (v. fig 2) qui permet une séparation plus fine. Les coefficients de sédimentation sont exprimés en unités Svedberg ( 1S=10 sec)* Le tableau suivant donne quelques coefficients de sédimentation caractéristique Ces méthodes sont si sensibles qu’elles sont capables de séparer des molécules ayant incorporé des isotopes lourds, comme N ou C ,des mêmes molécules non marquées . CONCLUSION Les techniques microscopiques ne doivent pas former une fin en soi même si elles fournissent des documents de bonne qualité. Elles doivent toujours être considérées comme une méthode d’étude adaptée au but recherché, de nombreuses techniques aussi bien microscopiques que biochimiques sont nécessaires pour la compréhension de la cellule.