Spectrométrie de masse dans l`identification bactérienne

ACNBH
+
Agrément FMC
N° 100 168
38ème Colloque National
des Biologistes des Hôpitaux
Montpellier – 28/09 au 02/10/2009
DECLARATION D’INTERET
DANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION
REALISEES POUR L’ACNBH
Dr. Alain Gravet exerçant au CH de Mulhouse déclare sur l’honneur
ne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprises
pharmaceutiques, du diagnostic ou d’éditions
en relation avec le DMDIV et/ou le sujet présenté.
+
Spectrométrie de masse et
identification bactérienne
Dr. Alain Gravet
Laboratoire de Microbiologie
Centre Hospitalier de Mulhouse
+
L’identification bactérienne
identification phénotypique (1)

L’identification d’un micro-organisme est une étape
importante dans le diagnostic d’une maladie infectieuse

Orientation famille bactérienne, un genre, voire une espèce :

Morphologie des colonies, morphologie après coloration,
caractéristiques de croissance, pigmentation, odeur, caractère
hémolytique sur gélose au sang, catalase, oxydase

Pour une identification plus précise : utilisation de galeries
d’identification biochimique manuelles ou pouvant être lues
sur automates

Des tests d’agglutination peuvent également être utilisés
pour l’identification bactérienne
+
L’identification bactérienne
identification phénotypique (2)

Galeries biochimiques d’identification


Miniaturisation des tests : Système Api® de bioMérieux

Etude du métabolisme (incubation de 18-24h, éventuellement 48h)

Recherche d’activités enzymatiques (pas de croissance nécessaire,
inoculum plus important)
Automates

utilisation de substrat chromogénique, fluorescent ou
fluorogéniques lecture colorimétrique, tubidimétrique ou
fluorométrique. Méthode dépendant du fabricant

Systèmes Vitek®, Phoenix®, Walk-away®,

Taxons +/- différents selon le fabricant, différentes cartes ou
cartouches (BG-…)

Certains taxons absents : anaérobie… en développement
+
Identification moléculaire des
micro-orgnismes

Bouleversement de l’identification, mises en évidence des erreurs et des
insuffisances de l’identification phénotypique

Analyse de la séquence du gène de l’ARN 16S pour les bactéries et
comparaison avec les banques électroniques de séquences (GenBank,
MBL…)

99% de similarité identifie à l’espèce, 97-99 le genre, < 97% possible
nouvelle espèce

Autres possibilités : séquençage du gène rpoB, puce à ADN

Utilité:





Identification des bactéries fastidieuses
Les mycobactéries (PCR, hybridation)
Lorsque identification peu performante (Acinetobacter)
Discordance identification et antibiogramme par exemple
Isolement dans une circonstance inhabituelle
+
Identification
phénotypique/moléculaire
Méthode
Immuno
Rapidité Sensibilité
Spécificité
Universalité
Côut
+++
++
+
-
+/-
+
++
++
+/-
+
Automates
++
++
++
+/-
++
ARN16S
+/-
+/-
+++
++
+++
Puces à
ADN
+/-
+/-
++
++
++
API
+
Spectrométrie de masse et temps de
vol (TOF)

1897, Thompson, séparation de particules en fonction de leur
charge et de leur masse, découverte de l’élection, calcul du
ratio m/z

1919, Ashton, premier spectromètre de masse
Source
Particules
chargées
Analyseur
Système de
vide
Détecteur
Enregistrement
+
Spectrometrie de masse et temps de
vol (TOF)

1946, Stephen application du temps de vol à la spectrométrie de
masse

Accélération de molécules chargée

Vitesse dépend de la charge et de la masse (m/z)

Séparation en fonction du poids et de la charge
V 1,2,3
Source
Accélérateur
Vide
Détecteur
+
Spectrométrie de masse (MS)

1968 première utilisation de la Spectrométrie de masse pour
classification et identification bactérienne (acide acétique)

1977 à 1994, développement de plusieurs

Techniques MS, analyse de molécules chargées

GC/MS, Pyrolysis MS, FAB MS
+
Maldi-Tof

Technique MALDI (matix assisted laser desorption
ionisation)

Ionisation de biomolécules (peptides, protéines)

Ionisation douce

Utilisation en routine de la technique pour l’analyse de
biomolécules

Analyse sur de cellules entières
+
Maldi-Tof
+
Maldi-Tof
+
Maldi-Tof
+
Maldi-Tof
+
Maldi-Tof
+
Maldi-Tof
+
Maldi-Tof
+
Maldi-Tof
+
Maldi-Tof
+
+
Spectromètres

Microflex®

Bruker

Première commercialisation : juin 2005

Fréquence du Laser : 60 Hz

Longueur trajet jusqu’au détecteur 1,05 m

Gamme de masses (m/z) : 50 à 300 kDa

Dépôts :




Étapes d’extraction (ethanol, acétonitrile)
Possibilité de « smear »
Plaques 96 positions
Logiciel : Biotyper®

Spectres
+
Spectromètres

Axima®

Shimadzu

Première commercialisation : décembre 2007

Fréquence du Laser : 50 Hz

Longueur trajet jusqu’au détecteur : 1,2 m

Gamme de masses (m/z) : 1 à 500 kDa

Dépôt :




direct d’une partie de la colonies
extraction pour certains microorganismes
Plaques : 48 x 4 positions
Logiciel : Saramis® (AnagnosTec)


Superspectres
Spectres
+
Différences

Technique de dépôts

Bases taxonomiques




Nombre absolu plus important de taxons pour Biotyper® (mais
pas de superspectres)
La grande majorité des micro-organismes d’intérêt médical dans
les deux bases, quelques différences (début 2009)
Présents dans la base Biotyper®
 Candida incospicua, Campylobacter lari, Campylobacter fetus,
 Corynebacterium
Présents dans la base Anagnotec®
 Abiotrophia defectiva, Candida guillermondii, Candida lusitaniae
 Mycobacterium spp, Aspergillus, Filamenteux
+
Choix Microbiologie de Mulhouse

Solution spectromètre de masse Axima® Shimatzu

Base taxonomique Saramis® Anagnostec

Solution informatique avec SIL SirWeb® - I2A

Arrivée fin mai 2009

Utilisation en routine
+
+
Saramis® AnagnosTec
 Spectral
ARchive And Microbial Identifications
System
 Superspectres

« spectre moyen d’environs 15 souches d’une même
espèce, exclusions des identifications faussement positives
 Spectres


:
de référence :
comparaison en deuxième intention
Superspectres et spectres validées par le gold
Standards : ARN16S, MLST et méthodes biochimiques
 Centres
de référence et laboratoires de diagnostic
+
Saramis® AnagnosTec
 SARAMIS
Premium
Comparaisons avec Superspectres et spectres
 Visualisation des spectres
 Génération de dendrogramme
 Génération de superspectres

 Mai
2009
2160 superspectres, représentant 130 genres, 462
espèces de bactéries, 39 genres et 125 espèces de
levures et champignons
 40.000 spectres : 235 genres, 1110 espèces
bactériennes, 73 genres et 235 espèces de
champignons

+
Base taxonomiques actuelle

Adaptation et évolution
constante

Diversité des isolats cliniques
humains

Inclus des microorganismes
rares et atypiques
Spectres
Pantoea agglomerans
Acinetobacter lwoffi
0
4
m
/z
0
8
Burkholderia cepacia
Raoultella ornithinolytica
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
4000
m/z
8000
+
Choix de matrice
DHB
HCCA
• Formation de longs cristaux de la périphérie
vers le centre
• Peu de cristaux au centre
• Convient au dépôt directe de la majorité des
taxons
• Nécessite plus de tirs de laser
• Obtention de 100 à 200 pics par spectre
• Nombreux signaux avec m/z > 10 kDa
• Acide Alpha 4-cyano-4-hydroxycinnamice
•Formation de petits cristaux sphérique
• Distribution homogène
• Ne convient pas au dépôt direct pour certains
taxons
• Nécessite moins de tirs laser
• Obtention de 80-150 pics par spectre
• peu de signaux avec m/z < 10 kDa
+
Choix de la matrice :
Clostridium speticum
DHB ~150 pics
100
80
%Int. 60
CHCA ~100 pics
40
20
0
3000
4000
5000
6000
7000
8000
m/z
9000
10000
11000
12000
13000
+
Préparation de l’échantillon
Ac. formique 25%
dépôt
1 µL, sécher
ajout
1 µL de matrice
direct
Évaporation du sovlant
(T° ambiante)
Plaque Maldi
Dépôt simple mais exige :
• matériel adapté
• précision
• un certain entrainement
Analyse automatique
du spectre
Préparation de l’échantillon
Plaque Maldi avec
44 positions
addition of 1 µl de matrice
sélection et transfère
d’une colonie ou dépôt
D’une solution
Utilisation d’un contrôle
Identification des bactéries, levures et champignons filamenteux
+
Le dépôt

Dépôt d’une petite
quantité de colonie
avec un cône ou un
Inoclic®

Ajout de la matrice (0,5
ou 1µL), mélanger par
de petits mouvements
circulaires

Formation des cristaux
+
+ Acquisition
Acquisition automatique ~30-60sec
3775
<<C:\Dok umente und Eins tellungen\m.erhard\Eigene Dateien\Anagnos Tec -dc \Zwis c henablage\Dok ument Banner.tx t>> Spec [BP = 3
5000
7000
10939
11000
11906
11572
10608
10347
9000
Mass (m/z)
10226
9330
8450
10
0
3000
9994
7980
20
7863
30
7367
40
6837
7092
50
5931
5015
60
3581
% Intensity
70
9654
80
8744
8074
90
9453
1648.1
7075
100
13000
Spectre de masse des Enterobacteriaceae :
famille, genre, et espèces
Escherichia coli
Hafnia alvei
Signaux retrouvés pour
différents taxons
(ex m/z 4365 :
Protéine ribosomale L36)
Leclercia adecarboxylata
Klebsiella pneumoniae
Possibilité de
reconnaitre familles de
bactéries
Enterobacter aerogenes
Proteus mirabilis
3000
5000
7000
m/z
9000
11000
> 50 espèces
d‘entérobactéries
identifiées
13000
37
SuperSpectra: Klebsiella species
percent matching masses
56
82
Klebsiella
pneumoniae
95
33
41
*
22
30
47
54
62
88
63
94
43
9463
4122
4730
5408
5691
6138
Klebsiella
oxytoca
3395
*
11
71 362
7
91
56
7111
7362
7902
8256
8709
*
consensus
spectrum:
Klebsiella
oxytoca
2
10
29
2
12
82
Su perSp ectrum:
Kl ebsiella
oxytoca
type 9
10229
10809
30 40 50 60 70 80 90
Enterobacter
aero genes
species
genus
family
similar ity dendrogram
of mass fingerprints
#A006528-1:
Kl ebsiella
oxytoca
multiple mass spectra of a species
3000
mass m/z
Le superspectre inclut les spectres de masses spécifiques de l‘espèce
15000
Identification d‘une souche par recherche d‘une
concordence avec superspectres
relative in
ntensity
Trichophyton_rubrum_1
Superspectrum
5
56 368
2
3
45
51
04
44
35
5
5
39
61 5
6
61
Comparaison des
spectres de 2 souches
d’isolats cliniques
71
73
20
68
75
7
79 161 57 3 9
4
8 8 81 10 963
9
8
6
49
0
1
Meilleure similarité avec
T. rubrum SuperSpectre
539
582
3000
4600
6200
from Erhard et al. 2007, Exp. Dermatol.
m/z
7800
9400
11000
Les deux échantillons sont
identifiés
Trichophyton rubrum
Avec une confiance de
99%
39
+
Algorythme
Spectre
1 min
SuperSpectra
Reference Spectra
>50.000 Spectra
+
Approche : identification

Identification de spectres analysés avec des spectres validés
de la base
Famille
genre
espèce
Possibilité d’identification séquentielles par des signaux communs à
Une famille, un genre, une espèce
Etape 3 – Identification avec Saramis
3775
<<C: \ Dokum ent e und Einst ellungen\ m . er har d\ Eigene Dat eien\ AnagnosTec- dc\ Zwischenablage\ Dokum ent Banner . t xt >> Spec [ BP = 3
0
3000
5000
7000
9000
Mass (m/z)
10939
9994
11000
11572
11906
10608
10
10226
9330
7863
8450
20
7367
30
3581
40
6837
7092
50
5931
5015
60
10347
7980
70
9654
80
8744
8074
90
9453
1648.1
7075
100
% Intensity
+
13000
Comparaison avec les
SuperSpectra™ selon
algorithme propre
+ Etape 4 – Comparaison du spectre
aux spectres de la base si nécessaire
3775
<<C: \ Dokum ent e und Einst ellungen\ m . er har d\ Eigene Dat eien\ AnagnosTec- dc\ Zwischenablage\ Dokum ent Banner . t xt >> Spec [ BP = 3
0
3000
5000
7000
9000
Mass (m/z)
Comparaison simple
10939
9994
11000
11572
11906
10608
9330
8450
10
10226
10347
7980
20
7863
30
7367
40
6837
7092
50
5931
5015
60
3581
% Intensity
70
9654
80
8744
8074
90
9453
1648.1
7075
100
13000
Obtention d’un
dendrogramme
+
+ Identification – Intégration dans le
laboratoire
(1)
dépôt
AXIMA™
Acquisition
des spectres
(2)
(3 +/- 4)
Sp e c # 1 M C= > Ad v BC( 3 2 , 0 . 5 , 1 . 0 ) = > NF 0 . 7 [ BP = 9 7 4 0 . 9 ,
10269]
9741
Vo y a g e r
100
1.0E+4
7173
(5)
SARAMIS™
identification
90
7200
80
0
3000
5100
7200
11400
12225
10923
11741
10697
10302
9065
9300
Mass (m/z)
9555
9194
8851
8285
8327
7158 7186
7871
7706
5381
5565
6316
6858
8394
10
6111
20
3204
3410
3636
30
4611
4869
5096
40
5459
5723
50
6255
4365
60
9537
70
% Intensity
Transfert identification
13500
+
Organisation Laboratoire
Microbiologie
Saramis
Serveur
SirWeb®
Spectrométre
SIL
Hémocultures
Urines
Divers
Expectorations
Coprocultures
+
Laboratoire de Microbiologie

Personnel
 3 biologistes
 22 techniciens – 1 cadre

Identifications avant
 Galeries Api®
 Utilisation de milieux
chromogènes
 Tests immunologiques
 Envoi à l’extérieur pour
séquençage ARN 16S

Antibiogrammes sur boites
 Utilisation AutoScan
+
Programmation : création de projet
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Passage de contrôles qualités

Identification d’une souche d’Enterobacter gergoviae (99,9%
superspectre)


Identication d’une souche d’Acinetobacter ursingii (99,9%
superspectre)


Identification également donné à 99% par Api20E
Identification galerie Api NE : Acinetobacter lwoffi/junii
Identification d’une souche de Staphylococcus caprae (94,6%
superspectre, utilisation d’acide formique)

Galerie Api Staph : 1. Staphylococcus capitis, 2. Staphylococcus
caprae (faible pourcentage)
+
Contrôles qualités années
antérieures
Référence
Maldi-Tof
Commentair
es
Eikennella corodens
Eikennella corodens
99,9% SSp
Bacillus cereus
Bacillus
99,9% SSp
cereus/mycoides/thuringie
nsis/anthracis
86,1% SSp
Bacillus cereus
Escherichia hermannii
Escherichia hermannii
90,0% SSp
Escherichia vulneris
Escherichia vulneris
99,9% SSp
Pseudomonas fluorecens
Pseudomonas fluorecens
99,9% SSp
Acinetobacter junii
Acinetobacter ursingii
84,6% SSp
Acinetobacter baumannii
Acinetobacter baumannii
99,9% SSp
Pasteurella mutocida
Pasteurella multocida
99,9% SSp
+
Contrôles qualités années
antérieures
Référence
Maldi-Tof
Commentaire
s
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pyogenes
82,9% SSp
Streptococcus sanguis
Streptococcus sanguis
70,2% SSp
Staphylococcus hominis
Staphylococcus hominis
99,9% SSp
Enterococcus gallinarum
Enterococcus gallinarum
92,0% SSp
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
99,99% SSp
Erysipelothrix rhusiopathiae
Erysipelothrix
rhusiopathiae
99,9% SSp
Oligella urethralis
????
3 sp
+
Oligella urethralis - masse 104
+
Contrôles qualités années
antérieures
Référence
Maldi-Tof
Commentair
es
Candida paraspilosis
Candida parapsilosis
99,9% SSp
Candida krusei
Issatchenkia orietalis
99,8% SSp
Candida albicans
Candida
africana/albicans/dublinen
sis
Candida african/albicans
Candida albicans
Compare:
Candida albicans
99,9% SSp
Candida dublinensis
92,3% SSp
88,3% SSp
25 Sp (4932)%
Candida
92,5% SSp
africana/albicans/dublinen
sis
Compare :
SP
Candida dublinensis
+
Résultats sur 1000 identifications

Souches de routine

Certaines souches identifiées non passées :

Souches identifiées sur milieux chromogènes

Escherichia coli, Proteus mirablis (ECBU)

Staplylococcus aureus (test d’agglutination)

Candida albicans (milieux chromogènes)

Streptococcus pneumoniae

Haemophilus influenzae

Pseudomonas aeruginosa
+
Répartitions des microorganismes
identifiés
Entérobactéries
20
134
126
6
Autres Bactéries
GramStaphylocoques
52
571
93
Autres Gram+
Bactéries anaérobies
Champignons
Non identifiés
+
Entérobactéries n = 569
M. morganii
3%
S. marcencens
C. freundiiC. koseri
2%
1%
3%
K. oxytoca
3%
autres
3%
E. coli
46%
E. aerogenes
4%
P. mirabilis
5%
E. cloacae
14% K. pneumoniae
16%
+
Autres bacilles Gram – (n = 91)
Bactéries
Nbr
Bactéries
Nbr
Pseudomonas aeruginosa
38
Pseudomonas stutzeri
1
Acinetobacter baumanii
22
Neisseria subflava
1
Stenotrophomonas maltophilia
13
Neisseria meningitidis
1
Haemophilus influenzae
6
Haemophilus parahaemoliticus
1
Achromobacter xylosidens
4
Campylobacter jejunii
1
Rothia mucilanogenes
1
Bulkhoderia cenocepacia
1
+
Staphylocoques (n = 126)
Bactéries
nombre
Staphylococcus epidermidis
70
Staphylococcus aureus
15
Staphylococcus hominis
12
Staphylococcus capitis
12
Staphylococcus intermedius
5
Staphylococcus simulans
3
Staphylococcus lugdunensis
3
Staphylococcus haemolyticus
3
Staphylococcus warnerii
1
Staphylococcus sciuri
1
Staphylococcus saprophyticus
1
+
Autres Gram+ (n = 134)
Bactéries
nombre
Enterococcus faecalis
104
Streptococcus agalactiae
7
Streptococcus anginosus
6
Enterococcus facium
4
Streptococcus bovis
3
Streptococcus sanguis
2
Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis
1
Streptococcus dysgalactiae dysgalactiae
3
Corynebacterium pseudodiphtericum
2
Rothia mucilaginosa
1
Micrococcus luttae
1
+
Bactéries anaérobies (n = 20)
Bactéries
nombre
Bacteroides fragilis
9
Clostridium difficile
6
Clostridium bifermentens
2
Fusobacterium necrophorum
1
Bacteroides thetaiotaomicron
1
Bacteroides distiasonis
1
+
Champignons (n = 52)
Bactéries
nombre
Candida glabrata
25
Candida albicans
20
Candida tropicalis
2
Candida kefyr (Kluyveromyces marxianus)
2
Candida krusei (Issatchenkia orientalis)
2
Candida lusitaniae
1
+
Microorganismes non identifiés
Prélèvement
Identification
Maldi-Tof
Identification sortie
Hémoculture
Acinetobacter sp
Acinetobacter sp
Urines
Acinetobacter sp
Acinetobacter sp
Hémoculture
Acinetobacter sp
Streptococcus sp
Plaie
Bacillus
Bacillus sp
Crachats - BK
Identification
Matches < 22%
Contaminant
Hémoculture
Ochrobacter
En cours
+
Simplicité de l’identification,
multiplication des identifications



Faible coût en réactif

Identification en répliquât

Identification en dupliquât
Hémocultures :

identification de tous les flacons

Identification des souillures (arguments en faveur)
Gestion des problèmes de contamination
+
Conclusions (1)


Prise en main

Importance de la qualité du dépôts (maitrise et répétabilité)

Rôle des biologistes et techniciens préservé

Garder techniques simples d’identification

Expertise de l’antibiogramme, de interprétation clinique
Résultats d’identification très satisfaisants

Quelques lacunes qui se combleront

Streptocoques, corynebactéries…

Système très ouvert, possible intégration de « spectre maison »
après confirmation par S16

Echange possible avec autres laboratoires
+
Conclusion (2)

Parfaite intégration dans le laboratoire, avec l’informatique



Validation avec accès au dossier du patient (antériorités…)
Gain de temps à la validation des antibiogrammes, à l’envoi sur
l’informatique du laboratoire
Perspectives, développement



Identification sur flacons d’hémoculture
Utilisation du module de comparaison des spectres pour étudier
les souches dans le cadre de surveillance des BMR
Possibilité de reconnaître en fonction du spectre, de la présence
ou non de certains pics ÷
 Des résistances ou profils de résistance particuliers (SARM)
 La production de toxines