TD 4 : Contrôle génétique Exercice 1 :

2016-2017
Biologie Biotech2
TD 4 : Contrôle génétique
Exercice 1 :
La figure 1 présente un schéma simple suivant lequel trois protéines régulatrices de
l’expression génique pourraient être utilisées pendant le développement pour créer huit
types cellulaires différents.
1) Combien de types cellulaires différents pourriez-vous créer, en utilisant les mêmes
règles, avec quatre protéines régulatrices de l’expression génique différentes ?
Figure 1 : Une illustration du contrôle génique combinatoire appliqué au développement. Dans
ce schéma simple et idéalisé, une « décision » de synthétiser une nouvelle protéine régulatrice
de l’expression génique (symboles numérotés) est prise après chaque division cellulaire. Dans
le schéma, la cellule de droite est poussée à synthétiser une nouvelle protéine régulatrice.
Chaque protéine régulatrice de l’expression génique est supposée rester active après son
induction, ce qui permet d’élaborer différentes combinaisons de protéines régulatrices. Dans
cet exemple, huit types cellulaires différents ont été créés.
MyoD est une protéine régulatrice qui induit l’expression de gènes muscle-spécifiques
dans les fibroblastes.
2) De quelle manière cette observation cadre-t-elle avec le schéma de la figure 1.
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Exercice 2 :
La protéine codée par le gène even-skipped (eve) de la drosophile est un régulateur
transcriptionnel nécessaire à la segmentation correcte au milieu du corps. Il apparait
environ 2 heures après la fécondation, à un niveau uniforme dans tous les noyaux
embryonnaires. Peu de temps après, il forme un profil de sept bandes le long de
l’embryon.
Chaque bande est sous le contrôle d’un module séparé dans le promoteur, qui fournit des
sites de liaison à la fois aux répresseurs et aux activateurs de la transcription de eve. Dans
le cas de la bande 2, il y a de multiples sites de liaison chevauchants pour des activateurs
et des répresseurs (Figure 1). Deux activateurs, hunchback (hb) et bicoid (bcd), et deux
répresseurs, giant (gt) et Krüppel (Kr), sont nécessaires pour observer le profil normal. Les
sites de liaison de ces protéines ont été localisés sur le segment de 670 nucléotides montré
dans la figure 1. ; la délétion de ce segment en amont abolit l’expression de eve dans la
bande 2.
Figure 1 : Sites de liaison des répresseurs et activateurs de la bande 2 de eve.
Les profils d’expression de hunchback, bicoid, giant et Krüppel dans l’embryon sont
présentés dans la figure 2. Il semble que l’expression de eve dans la bande 2 se produise
seulement dans la région de l’embryon qui exprime les deux activateurs mais aucun
répresseur : une règle assez simple.
Figure 2 : Expression des répresseurs et activateurs de la bande 2 de eve chez l’embryon de
drosophile.
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Pour vérifier que cette règle est correcte, vous construisez un gène rapporteur βgalactosidase sous le contrôle d’un segment de 5 kb présent en amont du promoteur de
eve. (Ce segment inclut aussi les éléments de contrôle des bandes 3 et 7). En plus de
l’élément en amont normal, vous construisez trois versions mutantes dans lesquelles
plusieurs des sites de liaison dans le segment de contrôle de la bande 2 de eve ont été
délétés. (Notez cependant qu’en raison du chevauchement existant entre plusieurs sites
de liaison, il n’est pas possible de déléter tous les sites d’une catégorie sans affecter
certains des autres sites).
Construction 1 : Délétion de tous les sites de liaison Krüppel.
Construction 2 : Délétion de tous les sites de liaison giant.
Construction 3 : Déletion de deux sites de liaison bicoid (indiqués par Δ dans la figure 1).
Vous fabriquez des mouches contenant ces nouvelles constructions génétiques intégrées
dans leurs chromosomes et déterminez dans leurs embryons les profils d’expression de la
β-galactosidase, qui sont montrés dans la figure 3.
Figure 3 : Expression embryonnaire de la β-galactosidase
à partir de constructions portant des éléments de contrôle
de la bande 2 de eve normaux ou mutés.
1)
Reliez les embryons mutants aux constructions
mutantes.
2)
Vous avez commencé ces expériences pour tester
la règle simple selon laquelle l’expression de eve dans la
bande 2 se produit dans l’embryon là où les deux
activateurs sont présents et les deux répresseurs, absents.
Les résultats obtenus avec les embryons mutants
confirment-ils cette règle ? Justifiez votre réponse.
3)
Donnez une explication à l’absence d’expression
de la β-galactosidase au pôle antérieur de l’embryon
mutant D de la figure 3.
4) Dans le segment de contrôle de la bande 2 de eve, les sites de liaison pour les deux
activateurs ne sont pas chevauchants, pas plus que les sites de liaison pour les deux
répresseurs ; par contre, il est fréquent que les sites de liaison des activateurs
chevauchent les sites de liaison des répresseurs.
Qu’est-ce-que ce chevauchement suggère concernant le mode de contrôle
génétique de eve dans la bande 2, et quelles peuvent en être les conséquences au
niveau de la morphologie des bandes ?
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Exercice 3 :
Le gène Hoxb-8 est invalidé chez la souris. Les phénotypes obtenus montrent des défauts
de développement des somites puis de leurs dérivés. Une fusion partielle des deux
premières côtes est observée : la deuxième vertèbre thoracique (T2) prend l’identité de la
première vertèbre thoracique (T1). Souvent, une modification de la première vertèbre
thoracique (T1) vers une identité de 7ème vertèbre cervicale (C7) adjacente est obtenue.
Ces modifications sont décelables chez ¼ des individus homozygotes.
1) Interprétez ces données et proposez une hypothèse pour expliquer pourquoi les
phénotypes observés ne concernent pas tous les individus.
Au sein des quatre complexes des gènes Hox des mammifères, trois présentent un gène
Hox8 : Hoxb-8, Hoxc-8 et Hoxd-8. Ces trois gènes sont dits gènes paralogues. Pour aller
plus loin dans la compréhension des phénotypes ci-dessus et du rôle des paralogues Hox8,
des doubles invalidations (double KO), puis des triples invalidations (triple KO) de ces
gènes ont été réalisées. Les phénotypes sont analysés et présentés dans le tableau cidessous :
Gènes invalidés
Hoxb-8
Hoxb-8 -/-, Hoxc-8 -/Hoxb-8 -/-, Hoxd-8 -/Hoxb-8 -/-, Hoxc-8 -/-,
Hoxd-8 -/-
Types et pourcentages des phénotypes observés
Changement d’identité :
Changement d’identité :
Vertèbre T2 vers T1
Vertèbre T1 vers C7
27
23
80
70
79
74
100
91
2) Interprétez ces données. Ces données valident-elles votre hypothèse ? Expliquez.
Exercice 4 :
On étudie l’expression de deux ARNm, produits des gènes goosecoïd et siamois chez
l’amphibien. Ces deux ARNm sont absents au début de la segmentation et ils apparaissent
dans la zone marginale où se met en place le mésoderme à la fin de la segmentation. On
réalise l’expérience suivante : des calottes animales sont isolées à mi- segmentation. Elles
sont mises en cultures seules, ou en présence des protéines Nodal ou FGF. On suit
l’apparition des ARNm Goosecoïd et Siamois ainsi que celles des cellules mésodermiques
après 2 ou 7 heures de culture. Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant :
2h cellules
mésodermiques
ARNm de Goosecoïd
Calotte animale
seule
Absentes
Calotte animale +
Nodal
Absentes
Calotte animale +
FGF
Absentes
Absent
Absent
Absent
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ARNm de Siamois
Absent
Présent
Absent
7h cellules
mésodermiques
Absentes
Présentes
Présentes
ARNm de Goosecoïd
Absent
Présent
Absent
ARNm de Siamois
Absent
Présent
Absent
Interprétez l’expérience. Quelles hypothèses peut-on formuler sur les rôles respectifs des
protéines Goosecoïd et Siamois ?
Annexe 1 : Gènes impliqués dans l’induction du mésoderme.
Gènes
Maternel (M)/
Zygotique (Z)
Type de protéine
vegT
M
Facteur de transcription
vg-1
M
Protéine sécrétée
wnt-11
M
Protéine sécrétée
β-caténine
M
Protéine cytoplasmique et
facteur de transcription de la
voie de signalisation Wnt
nodal
Z
Protéine sécrétée
FGF
Z
Protéine sécrétée
wnt-8
Z
Protéine sécrétée
BMP4
Z
Protéine sécrétée
siamois
Z
Facteur de transcription
noggin
Z
Protéine sécrétée
5
Fonction
Détermination de
l’endoderme
Activation de
l’expression des
inducteurs du
mésoderme
Induction du
mésoderme
Détermination des
structures dorsales
Détermination des
structures dorsales
Induction du
mésoderme
Développement du
mésoderme ventral
Ventralisation du
mésoderme
Ventralisation du
mésoderme
Activation de gènes
dorsaux
Induction du
mésoderme dorsal,
antagoniste de BMP4
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chordin
Z
Protéine sécrétée
frizbee
Z
Protéine sécrétée
goosecoïd
Z
Facteur de transcription
6
Induction du
mésoderme dorsal,
antagoniste de BMP4
Induction du
mésoderme dorsal,
antagoniste de Wnt-8
Activation de gènes
dorsaux