Génétique Bactérienne - Fichier

UE :De l'agent infectieux à l'hôte – Bactériologie
Date :16/02/2011Plage horaire : 14h-16h
Promo : PCEM2 Enseignant : Pr Bebear
Ronéistes :
Ouvrard Gaëlle
Papin Florent
Génétique Bactérienne
I.L'ADN bactérien
1) Chromosomique
2) Extra chromosomique : plasmides
3) Application au diagnostic bactériologique
II.Les mutations
1) Définitions
2) Mécanismes moléculaires
III.Transferts génétiques-Principales caractéristiques
1) Définitions
2) Mécanismes
3) Résultats : devenir d'un ADN exogène après son transfert
IV.La transformation bactérienne
1) Mise en évidence
2) Mécanisme
3) Différentes variétés, applications
V.Conjugaison bactérienne
1) Mise en évidence
2) Transfert de l'ADN plasmidique
3) Transfert de l'ADN chromosomique
VI.Transfert par des bactériophages
1) Bactériophages
2) Mécanismes de transduction
3) Conversion lysogénique
VII.Transposons et intégrons
1) Transposons
2) Intégrons
VIII.Application : génie génétique, biotechnologies
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On va s'intéresser à comment les bactéries peuvent échanger leurs gènes, échanger leurs
informations génétiques. Les bactéries ont été très étudiées sur leur plan génétique. Cela fait longtemps
que l'on sait que les bactéries peuvent échanger leurs gènes puisque la première fois qu'on a mis en
évidence un échange de gènes entre les bactéries, c'était en 1928 avec la mise en évidence de la
transformation.
Depuis on a utilisé les bactéries comme outils génétiques pour plusieurs raisons et notamment
parce que ce sont des organismes capables de se multiplier rapidement.
Vous voyez sur cette courbe : la croissance bactérienne en fonction du temps et de la quantité de bactéries
par ml. La croissance d'escherichia coli c'est 20min et donc son temps de vie c'est 20 min. Il est très facile de
l'obtenir rapidement et pour grand nombre d'individus dans un volume réduit. Là sur ce schéma vous avez
100 bactéries au temps 0 et 18h après on a un millions de bactéries
La génétique bactérienne a eu de nombreuses applications et notamment permettre d'identifier
les bactéries pour les détecter et puis accéder à une épidémiologie :
- La première application de la génétique bactérienne : détecter les bactéries et leur ADN et
également c'est intéressant au niveau de l'épidémiologique des infections bactériennes.
-Comprendre par la génétique bactérienne les mécanismes du pouvoir pathogène des bactéries
et leur virulence
-comprendre leur résistance aux antibiotiques
- établir les bases de la biologie moléculaire et de l'utilisation industrielle des bactéries.
C'est pour ça que aujourd'hui on parle de l'étude des mécanismes d'acquisition de l'information
bactérienne et vous le allez voir quand on va s'attaquer à deux grands chapitres : les mutations qui sont un
mécanisme par lequel les bactéries vont acquérir de l'information et les transferts de gènes. Mais avant
d'attaquer ces deux grands mécanismes, petits rappels sur l'ADN bactérien :
I L'ADN bactérien
Sur ce schéma (à la page suivante) : vous voyez la structure d'une bactérie très schématique avec
ses enveloppes, sa paroi et son cytoplasme avec à l'intérieur une petite molécule d'ADN chromosomique et
on peut avoir de l'ADN extra chromosomique (notamment les plasmides) et toute la machinerie de la
traduction avec les ribosomes.
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1)Chromosomique
D'habitude la plupart des bactéries n'ont pas de noyau et ont une molécule d'ADN circulaire
double brin. Il y a bien sûr des exceptions, on peut avoir des bactéries avec deux ou trois chromosomes
( c'est rare ) et des bactéries dont l'ADN n'est pas circulaire (mais linéaire) mais retenez : une seule
molécule d'ADN circulaire double brin.
La structure de l'ADN est schématisée sur cette figure avec un core protéique qui comprend des protéines,
les ARN, les ribosomes d'où partent un certain nombre de boucles d'ADN double brin qui représentent le
chromosome et voyez que c'est de l'ADN sur enroulé. Il y a à peu près entre 40 et 50 boucles d'ADN qui
partent du core. (en plus sur le diaporama : pas d'enveloppe nucléaire)
La taille de cet ADN chromosomique est très variable parce que la plus petite bactérie capable de
réplication autonome est un mycoplasme : la bactérie qui s'appelle mycoplasma genitalium et la taille de
son ADN est de 580kilo pb, c'est la taille d'un gros plasmide bactérien. A coté de ça il y a des bactéries où
l'ADN est plus gros comme escherichia coli, la taille de son ADN est à peu près 8 fois plus grande : 4700kpb
mais on a encore des bactéries avec un ADN encore plus grand.
A l'heure actuelle on connait la séquence du génome pour de nombreuses espèces bactériennes
qu'elles soient pathogènes ou non. Les premiers génomes bactériens ont été séquencés en 1995. C'était
heamophilus influenzae qui est une bactérie responsable d'infections respiratoires et ORL et mycoplasma
genitalium, ce fameux mycoplasme responsable d'infections sexuellement transmissibles.
Dernier petit point sur l'ADN chromosomique qui peut être la cible d'antibiotiques : certains antibiotiques
vont agir sur l'ADN directement et ce sont par exemple les quinolones et les nitroimidazolés ( on y
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reviendra un petit peu plus tard).
A coté de l'ADN chromosomique on peut avoir de l'ADN extra chromosomique.
2)Extra chromosomique : plasmides
Cet ADN extra chromosomique est représenté par ce qu'on appelle les plasmides. Qu'est ce que
c'est les plasmides?
Vous avez vu sur le schéma de tout à l'heure : ce sont des petites molécules d'ADN extra chromosomiques
qui sont la plupart du temps circulaires double brin et qui sont capables de se répliquer : réplication
autonome.
Un autre paramètre à mentionner, c'est que ce sont des molécules facultatives, la bactérie n'a pas besoin
du plasmide pour vivre. Il n'est pas présent chez toutes les bactéries. Donc ces molécules d'ADN double
brin extra chromosomiques sont capables de réplication autonome et souvent elles peuvent être auto
transférables d'une bactérie à une autre. Elles peuvent parfois s'intégrer dans le chromosome de la
bactérie. On va y revenir largement en étudiant un mécanisme de transfert entre bactéries qui s'appelle la
conjugaison et qui est basé justement sur l'échange de ces plasmides.
Avant d'attaquer ces mécanismes de transfert de gènes, quelles sont les applications de
connaître l'ADN bactérien au diagnostic bactériologique?
3) Applications au diagnostic bactériologique
Elles sont de plus en plus importantes car on peut faire un diagnostic d'infection bactérienne et
d'identification bactérienne grâce à de l'hybridation moléculaire donc on va utiliser des sondes qui sont
capables de s'hybrider sur de l'ADN. Ça peut être des sondes froides ou des sondes radioactives dites
sondes chaudes. On l'utilise encore à l'heure actuelle pour l'identification des mycobactéries. Vous savez
que mycobacterium tuberculosis c'est l'agent de la tuberculose(BK) qui fait parti des mycobactéries.
Mais ces méthodes d'hybridation moléculaire ne sont pas très sensibles et ont été largement remplacées
ces dernières années par les méthodes de PCR ou encore les méthodes d'amplification d'acides nucléiques
avec la polymérisation en chaine de réactions. Par exemple pour les bactéries, la PCR est la méthode
utilisée pour faire le diagnostic des infections à chlamydia trachomatis qui donne des infections
sexuellement transmissibles.
Une autre application de la connaissance de l'ADN bactérien, c'est l'étude des profils de
restriction enzymatique de l'ADN et on utilise ça en immunologie. Le sigle anglais est RFLP pour Restriction
Fragment Lame Polyphormism. On couple l'ADN chromosomique bactérien avec des enzymes de
restriction. On fait migrer ça sur un gel d'agarose et ça nous donne des profils de restriction qui peuvent
être spécifiques de souches bactériennes.
Cela permet de comparer les souches entre elles et notamment des souches qui peuvent être responsables
d'infections nosocomiales ( infections acquises à l'hôpital par les patients ) ou encore des épidémies
d'infections comme la légionellose qui est une infection respiratoire due à une bactérie : la légionella. C'est
une infection attrapée la plupart du temps par l'intermédiaire d'eaux stagnantes : eau dans des climatiseurs
ou dans des tours aérées, des tours aéro-réfrigérées, les spa. Il est important de déterminer le réservoir
c'est pour ça que l'on est amené à étudier les souches de cette légionellose pour savoir si elles viennent du
même endroit. Si par exemple on doit fermer un spa dans notre région qui aurait contaminer plusieurs
personnes. Donc il faut pouvoir comparer les souches entre elles pour voir si elles sont identiques. Si elles
sont identiques c'est la même bactérie qui est responsable de l'infection.
On peut séquencer tout un tas de gènes présents chez les bactéries et impliqués dans la
résistance aux antibiotiques et des gènes impliqués dans la virulence des bactéries.
Après ces rappels sur l'ADN bactérien on va détailler les mécanismes de transfert, de modifications du
patrimoine génétique des bactéries
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II les mutations
1)définition
Les mutations vont entrainer une modification de l'ADN bactérien et c'est une modification qui
peut être spontanée ou induite, discontinue, stable, rare et spécifique. Cela entraine une variation de son
génotype, de son génome. Alors si on détaille un peu plus ces caractéristiques :
Mutations spontanées : cela veut dire qu'elles sont indépendantes de l'agent qui a permis de les
sélectionner. On a des bactéries mutantes qui sont capables de résister à certains antibiotiques. Mais ce
n'est pas l'antibiotique qui va entrainer l'apparition de la mutation. L'antibiotique va seulement
sélectionner des formes variantes qui existaient déjà dans la population bactérienne. C'est pour cela que
l'on dit que la mutation est spontanée.
A l'inverse on peut avoir des mutations induites . Dans ce cas là ce sont des mutations qui arrivent parce
qu'on soumet la bactérie à des agents mutagènes qui sont toxiques pour les gènes (agents génotoxiques).
Ça peut être tout simplement des UV ou alors des agents comme des analogues de la guanine qui
entrainent une modification de l'ADN bactérien et donc une mutation.
Ces mutations quand on dit qu'elles sont discontinues ou brusques c'est la loi du tout ou rien:
une voire plusieurs bases sont échangées pour une ou plusieurs autres.
Elles sont pour la plupart du temps stables . S' il y a une stabilité, cela veut dire qu'on aura une
transmission verticale à la descendance. La mutation apparaît chez la bactérie mère et cette bactérie se
divise : la mutation sera toujours transmise aux bactéries filles. Dans quelques cas, mais c'est rare on peut
avoir des mutations reverses, c'est à dire qu'on a un retour au phénotype sauvage (phénotype de départ).
Ces mutations sont également rares et on peut définir le taux de mutation : c'est la probabilité
pour une bactérie de muter pendant une unité de temps définie.
C'est un événement rare donc cette fréquence de mutation varie entre 10-5 et 10-10 et en moyenne 10-6 10-7
c'est à dire il faut une population de 10 6 à 10 7 bactéries pour que une mutation arrive.
Ces mutations ont une dernière caractéristique, elles sont spécifiques et indépendantes. Du fait
de ces caractéristiques, elles ont une probabilité de subir deux mutations distinctes en même temps égale
au produit des probabilités individuelles de ces mutations. Cela veut dire que c'est un événement rare et on
va prendre l'exemple de la résistance du BK aux antibiotiques.
Alors le BK c'est le nom historique de mycobacterium tuberculosis qui est l'agent de la
tuberculose. Cette bactérie a été découverte par un monsieur qui s'appelle Koch. Vous imaginez là une
caverne tuberculeuse donc un trou dans le poumon du patient dans laquelle le bacille va se multiplier. Le
BK est une bactérie capable de muter fréquemment. C'est notamment un moyen de lutter contre les
antibiotiques.
Dans une caverne tuberculeuse, on a à peu près 10 8 bactéries. Je vous montre l'exemple de deux
antituberculeux majeurs : l'INH (Isoniazide) (dont le nom n'est pas à retenir pour l'instant), il est majeur car
utilisé systématiquement et RIF (la rifampicine).Dans le cadre de la tuberculose, on utilise ces deux
antituberculeux en même temps parce que le BK est une bactérie qui mute fréquemment et que dans une
caverne où il y a 10 8 bactéries (ce qui est le cas la plupart du temps) si on utilise l'isoniazide tout seul, vous
voyez que la fréquence de mutation est de 10 -5 (soit un mutant pour 10 5 bactéries) donc quand il y a 10 8
bactéries on va avoir à peu près 1000 mutants. Il y a donc un gros risque d'échec thérapeutique. Si on prend
la rifampicine, sa fréquence de réplication est plus basse : 10 -7 et donc si on a 10 8 bactéries on aura quand
même 10 mutants qui seront potentiellement résistants à la rifampicine. En revanche si on donne les deux
antibiotiques en même temps, voyez que la probabilité d'avoir un mutant résistant à ces deux
antituberculeux est seulement de 10 -12. Donc normalement on ne devrait pas avoir de doubles mutants qui
soient capables de résister à la fois à la rifampicine et à l'isoniazide. A priori, notre patient devrait être
normalement guéri. C'est pour ça qu'avec la tuberculose, on utilise plusieurs antibiotiques pour soigner
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