Maîtrise et intérêts de la co-inoculation “levures-bactéries” SIECZKOWSKI Nathalie Martin Vialatte Œnologie, 51319 Epernay cedex La gestion des fermentations alcoolique et malolactique est un facteur clé de l’élaboration de vins de qualité. La pratique du levurage et de l’ensemencement en bactéries lactiques sélectionnées permet, par l’implantation de souches reconnues pour leur intérêt microbiologique et œnologique, une meilleure maîtrise des flores microbiennes et ainsi un bon déroulement de ces deux étapes fondamentales de la vinification. La co-inoculation, technique consistant à ensemencer le moût simultanément en levures et en bactéries lactiques se développe de plus en plus. Déjà mise en pratique en Champagne, pour l’élaboration des ferments lactiques (1), et dans l’hémisphère sud pour l’élaboration de certains vins primeurs, elle a démontré son efficacité au cours des deux derniers millésimes, dans le cadre du processus d’élaboration de vins primeurs ou de vins blancs présentant généralement des difficultés à faire la fermentation malolactique (bas pH notamment). Egalement, cette technique a été introduite aux Etats-Unis et en Australie afin de faciliter la réalisation de la fermentation malolactique sur des vins présentant un fort degré d’alcool. La société Martin Vialatte Œnologie a travaillé cette technique, au cours de ces trois derniers millésimes, afin d’en optimiser la mise en œuvre. 1 Présentation du contexte - intérêts de la co-inoculation V I N I F I C AT I O N 1.1- Démarrage de la fermentation malolactique : deux cas de figures. Le déclenchement de la fermentation malolactique est conditionné par des facteurs intrinsèques aux conditions de vinification (paramètres physico-chimiques, microbiologiques, technologiques…), de sorte que deux cas de figure opposés peuvent se présenter : • vins présentant un démarrage trop rapide de la fermentation malolactique avant même la fin de la fermentation alcoolique (cas notamment des pH élevés avec une forte pression bactérienne du moût), • vins présentant des difficultés à faire la fermentation malolactique (pH bas, alcool élevé, température basse, teneur en SO2 élevée…). Dans les deux cas, des conséquences dommageables sur la qualité du vin se présentent : • dans le premier : risque d’arrêt de la fermentation alcoolique et de piqûre lactique, ou de déviations organoleptiques provoquées par une flore lactique indigène indésirable (Lactobacilles, Pédiocoques…), • dans le deuxième : risque d’oxydation pendant la phase de latence ainsi que de contamination par des microorganismes indésirables (Brettanomyces, Pédiocoques, bactéries acétiques, levures de voile…). Toutefois, sa mise en œuvre nécessite une bonne maîtrise de la croissance respective des levures et des bactéries lactiques, en limitant les antagonismes possibles. Si le milieu a un impact important sur l’évolution des flores levurienne et lactique, l’activité fermentaire des levures influe également directement sur la croissance bactérienne et l’adéquation avec une souche de bactérie sélectionnée donnée peut varier d’une souche de levure à l’autre. 1.3- Le point sur les interactions levures-bactéries Les interactions entre levures et bactéries ont déjà été étudiées et il est admis qu’en condition de vinification, le développement des bactéries lactiques peut être inhibé ou stimulé par les levures fermentaires (2). Les travaux effectués par King et Beelman (3), Lafon-Fourcade (4, 5), ou encore Guilloux-Benatier (6) expliquent ce phénomène par : • d’une part, la production par les levures de métabolites inhibiteurs des bactéries, autres que l’alcool et le SO2 (acides gras à chaîne moyenne) et, • d’autre part, l’appauvrissement du milieu en substrats importants pour les bactéries (acides aminés tels que l’acide aspartique, la sérine, la phénylalanine et l’histidine). Par ailleurs, il a été montré, grâce à des études portant sur les interactions entre souches commerciales de Saccharomyces cerevisiæ et d’Œnococcus œni, que les levures induisent une inhibition de la croissance des bactéries lactiques (7) et que cette inhibition dépend largement des souches utilisées (8). Le service R&D a mis en place des essais de co-inoculation en milieu-vin au sein de son laboratoire de microbiologie. Ceci lui permet d’avoir aujourd’hui une meilleure connaissance des couples levure-bactérie et de préconiser la co-inoculation avec une meilleure maîtrise en fonction du processus de vinification et de l’objectif de vin fixé par l’élaborateur. 2 Travaux de caractérisation des “couples levure-bactérie” en laboratoire L’objectif de ces expérimentations était de guider le choix des “couples levure-bactérie” les plus compatibles, avant de les valider à grande échelle en vinification en cave. 2.1- Matériel 1.2- Intérêts de la technique de co-inoculation 24 • Adaptation aux conditions normalement limitantes (haut degré d’alcool surtout) avec une meilleure efficacité de l’ensemencement bactérien, • Démarrage rapide de la F.M.L. en fin de F.A. (limitation du risque d’oxydation, notamment en vinification en blanc), • Assurance d’une bonne implantation de la bactérie sélectionnée (rapport d’ensemencement nettement en sa faveur par rapport à la flore indigène potentiellement indésirable), • Limitation du risque de développement de microorganismes indésirables. Au regard de cette situation, la co-inoculation laisse entrevoir plusieurs intérêts : • Réduction de la durée de la vinification (étapes de fermentation alcoolique, F.A. et de fermentation malolactique, F.M.L.), Moûts • Chardonnay de Champagne, • Sauvignon du Bordelais, • Cabernet-Sauvignon du Bordelais, • Carignan-Mourvèdre du Languedoc. Revue Française d’Œnologie - juillet/août 2004 - N° 207 Les moûts ont été filtrés stérilement et complémentés en nutriments à base de levures inactivées. Microorganismes Les levures et les bactéries sélectionnées sont les suivantes (Cf. correspondances en annexe) : • 12 souches de levures notées LSA1, LSA2, LSA3, LSA4, LSA5, LSA6, LSA7, LSA8, LSA9, LSA10, LSA 11, LSA12, • 2 souches de bactéries lactiques à ensemencement direct, notées BL1 et BL2. Ces observations sont confirmées notamment par des travaux antérieurs effectués par King et Beelman (3), qui montraient que la population bactérienne, dans le cadre d’un ensemencement simultané en levures et bactéries, n’avait pas d’influence sur la croissance de la population levurienne (figure 3). log viable cell counts (cfu/mL) 9 8 7 6 2.2- Mode opératoire 5 Différentes modalités de micro-vinifications (triplicata, en erlenmeyer de 100 mL) ont été mises en place sur les différents moûts. Après préparation (filtration stérile et apport de nutriments), le moût était inoculé en levures sèches actives au taux de 20 g/hL. La fermentation alcoolique se déroulait à 20°C. Pour chaque “couple levure-bactérie”, trois modalités ont été comparées : • inoculation en bactéries lactiques (1 g/hL) 24 heures après le levurage : “co-inoculation”, • inoculation en bactéries lactiques (1 g/hL) à mi F.A.: “mi F.A.” , • inoculation en bactéries lactiques (1 g/hL) en fin de F.A.: “fin F.A.”. L’objectif étant d’étudier les déroulements respectifs de la fermentation alcoolique et de la fermentation malolactique, les paramètres suivants ont été étudiés : • analyse physico-chimique classique du moût avant la F.A., • cinétique de la F.A., suivie par pesée journalière, • cinétique de la F.M.L., suivie par dosage de l’acide malique, • analyse physico-chimique classique du moût à la fin de la F.A. 4 2.3- Résultats Les paramètres étudiés ont conduit à une interprétation des résultats selon trois critères : le déroulement de la F.A., la durée de F.A.+ F.M.L. et la teneur en acidité volatile du vin fini. Le déroulement de la F.A. Dans tous les cas de figure, les fermentations alcooliques ont été régulières et complètes (ni ralentissement, ni arrêt). C’est ce qui est observé notamment sur les deux exemples présentés sur les figures 1 et 2. 250 Consommation des sucres (g/L) 150 1 0 0 2 3 5 8 10 15 time (days) 20 30 35 40 50 Figure 3- Influence d’un ensemencement simultané sur l’évolution des flores levurienne et bactérienne (King et Beelman, 1986 (3)) La durée F.A.+ F.M.L. Il s’agit du nombre de jours entre le levurage et la fin de la F.M.L. Cette donnée constitue un paramètre très intéressant, d’autant plus que la rapidité de réalisation des deux étapes F.A.+ F.M.L. est un des objectifs de la co-inoculation. Au-delà de cet intérêt, il permet de comparer les différents “couples levure-bactérie” en terme de complémentarité. Ainsi, par exemple, sur le moût de Carignan-Mourvèdre, il est intéressant de noter la plus forte compatibilité de BL1 avec LSA3 que BL1 avec LSA4 (figure 4). co-inoculation mi F.A. 70 Durée (j) fin F.A. 60 50 co-inoculation 30 mi F.A. 20 fin F.A. 10 0 100 50 LSA 3 Levure / BL1 LSA 4 Durée totale F.A. + F.M.L. Raisins rouges 13° Figure 4- Comparaison des durées F.A.+ F.M.L. entre les couples LSA3 – BL1 et LSA4 – BL1 en fonction du moment de l’inoculation en bactéries lactiques 0 0 1 2 -50 5 6 Temps (j) 7 8 11 Figure 1- Cinétique fermentaire – caractérisation du couple LSA11 – BL2 sur moût de Chardonnay de Champagne Consommation des sucres (g/L) 200 VF début 150 VF fin 100 témoin 50 0 0 -50 2 40 200 250 yeast (pure culture) yeast (mixed culture) bacteria (pure culture) bacteria (mixed culture) 3 1 5 6 7 8 Temps (j) 9 12 13 14 16 Figure 2- Cinétique fermentaire – caractérisation du couple LSA1 – BL2 sur moût de Carignan-Mourvèdre du Languedoc Il est important de noter que, pour tous les couples étudiés dans les différentes conditions de moûts, la co-inoculation a permis une durée de F.A.+ F.M.L. au moins identique, sinon plus courte (majorité des cas) que celle observée avec le protocole classique de vinification (ensemencement bactérien en fin de F.A.). Toutefois des nuances sont à signaler et permettent de définir sur ce paramètre certaines compatibilités plus fortes, qu’il convient de rapprocher des autres paramètres analytiques du vin fini, comme l’acidité volatile. La teneur en acidité volatile du vin fini Bien que les teneurs en acidité volatile observées en fin de F.M.L. aient présenté des différences notables entre les modalités, aucun cas de piqûre lactique n’a eu lieu. Ceci est à corréler directement avec le bon déroulement de la fermentation alcoolique dans ces expérimentations, permis par une gestion adéquate de la nutrition des levures grâce à l’apport raisonné de nutriments complets. Revue Française d’Œnologie - juillet/août 2004 - N° 207 25 Ainsi, dans ces conditions, il est logique de ne pas observer d’augmentation importante de l’acidité volatile, ceci étant lié au métabolisme de la bactérie, qui consomme très peu de sucre (quelques centaines de mg/L seulement) en présence d’acide malique. Toutefois, pour certains “couples levure-bactérie” une production d’acidité volatile significativement supérieure a été observée sur les modalités en co-inoculation par rapport aux modalités avec un ensemencement bactérien successif à l’achèvement de la F.A. Ce constat a permis d’en déduire les couples incompatibles : c’est le cas notamment du couple “LSA7 – BL2” en conditions de co-inoculation. Il est toutefois important de préciser qu’en cas d’ensemencement bactérien “classique” en fin de F.A., la situation est différente et que ces mêmes couples ne présentent aucune incompatibilité. température (°C) 35 1100 densité densité témoin densité fin F.A. 30 densité co-inoculation température témoin 25 température fin F.A. température co-inoculation 20 1090 1080 1070 1060 1050 1040 15 1030 1020 10 1010 1000 5 990 980 15/9 16/9 17/9 18/9 19/9 date 20/9 21/9 Le tableau 1 représente la synthèse des résultats de la caractérisation des “couples levure-bactérie”. Les critères retenus (déroulement de la F.A., durée de F.A.+ F.M.L. et acidité volatile en fin de F.A.) ont permis de classer les couples en fonction de leurs compatibilités apparentes dans les conditions étudiées, en co-inoculation. 3.1.2- Durée de F.A.+ F.M.L. Dans les deux cas, l’inoculation bactérienne (BL2) à l’encuvage a permis un gain de temps significatif, de 11 jours (essais en cave, figure 6) à 21 jours (essais en minicuverie, figure 7) par rapport à la modalité où la F.M.L. est réalisée par des bactéries indigènes. Tableau 1- Caractérisation des “couples levure-bactérie” : degrés de compatibilité pour la co-inoculation. BL1 ++ ++ ++ + ++ ++ +++ ++ ++ BL2 +++ +++ +++ +++ +++ -++ +++ + +++ +++ Suite à ces expérimentations de caractérisation des “couples levure-bactérie”, des essais en grands volumes ont été mis en place et suivis dans des caves pendant les vendanges 2002 et 2003, en conditions réelles de vinification. Ainsi, les couples les plus compatibles sont : • pour la vinification en rouge, et plus particulièrement l’élaboration de vins primeurs : “LSA3 – BL2”, “LSA2 – BL2” ; • pour la vinification en blanc : “LSA9 – BL2”, “LSA11 – BL2” et “LSA12 – BL2”. 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 encuvage : 15/9 0,2 fin FA : 23/9 0 16-sep 5 Des essais ont été menés en Beaujolais pendant les vendanges 2002, à la fois en minicuverie et en grandeur réelle (Etablissements Dubœuf), en collaboration avec I.T.V.-Sicarex Beaujolais et Tecnicave (9). 3.1.1- Déroulement de la F.A. 26 Aucun impact sur le déroulement de la F.A. n’a été mis en évidence, comme le montre la comparaison des cinétiques fermentaires sur la figure 5. 22-sep 25-sep 28-sep 1-oct 4-oct 7-oct acide malique g/L Témoin BL2 encuvage BL2 décuvage BL2 fin F.A. 4 3 2 encuvage : 5 sept décuvage : 9 sept fin F.A. : 14 sept 0 5-sep 3.1- Elaboration de vins primeurs en Beaujolais (2002) 19-sep Figure 6- Ensemencement en bactéries lactiques à différents moments de la vinification : essai en cave coopérative 2002. (Martin Vialatte Œnologie / ITV-SICAREX Beaujolais). Suivi de la dégradation de l'acide malique. Essais en caves (vendanges 2002 et 2003) L’objectif était de valider l’intérêt de la méthode, dans le cadre de l’élaboration de vins rouges primeurs et de vins blancs présentant généralement des difficultés à faire la fermentation malolactique. témoin BL2 fin FA BL2 co-inoculation acide malique g/L 1 3 0 23/9 Figure 5- Ensemencement en bactéries lactiques à différents moments de la vinification : essai en cave coopérative 2002 – Cinétiques fermentaires. 2.4- Interprétation des résultats - Synthèse Souches LSA1 LSA2 LSA3 LSA4 LSA5 LSA6 LSA7 LSA8 LSA9 LSA10 LSA11 LSA12 22/9 10-sep 15-sep 20-sep 25-sep 30-sep 5-oct 10-oct Figure 7- Ensemencement en bactéries lactiques à différents moments de la vinification : essai minicuverie 2002. (ITV-Sicarex Beaujolais). Suivi de la dégradation de l'acide malique. Une inoculation au pressurage permet de gagner de 11 jours (en minicuverie, figure 7) à 13 jours (en cave, sur un autre essai non figuré ici) également par rapport à la modalité non ensemencée en bactéries lactiques. Enfin, un ensemencement précoce à l’encuvage a permis de gagner 7 à 10 jours (essais en cave et en minicuverie) par rapport à un ensemencement traditionnel réalisé en fin de F.A. 3.1.3- Teneur en acidité volatile du vin fini Aucune augmentation de l’acidité volatile n’a été observée ; ceci est logique, et s’explique par le métabolisme de la bactérie, qui Revue Française d’Œnologie - juillet/août 2004 - N° 207 consomme très peu de sucre (quelques centaines de mg/L seulement) en présence d’acide malique. 3.1.4- Qualité organoleptique des vins • en parallèle, la population bactérienne suit une évolution normale avec un fort développement en fin de F.A., sans risque de développement de piqûre lactique. Au niveau gustatif, aucune différence significative n’a été observée sur les vins des essais réalisés en minicuverie, même si dans le cadre des essais en cave, le vin issu de la co-inoculation tend à être préféré en fin d’élaboration. Ces résultats montrent donc que la pratique de l’ensemencement précoce en bactéries lactiques n’a aucun impact négatif sur la qualité de ce type de vin, notamment lorsqu’il s’agit d’un vin primeur. L’intérêt d’ensemencer précocement réside alors dans le fait que les bactéries co-inoculées s’acclimatent progressivement aux conditions du vin et sont donc plus efficaces et résistantes dès la fin de F.A. que des bactéries fraîchement ensemencées. Ceci se traduit en général par une durée F.A.+F.M.L. plus courte dans le cas de la co-inoculation “levure/bactérie” et avec un risque très limité de développement de contaminants indésirables (Lactobacilles, Pédiocoques,…). 3.2- Vin blanc présentant des difficultés à faire la F.M.L. : exemple Suisse (2003). 3.2.2- Durée de F.A.+ F.M.L. Pendant les vendanges 2003, un essai de co-inoculation a été mené en Suisse sur Chasselas, en vinification en blanc. Deux modalités ont été comparées : • une modalité “témoin” ensemencée en bactéries lactiques en fin de F.A., • une modalité “co-inoculation”, ensemencée en bactéries lactiques sur moût. 3.2.1- Déroulement de la F.A. Sur cet essai, les fermentations alcooliques se sont déroulées normalement sur les deux modalités, de manière complète et régulière, comme le montre la figure 8. 21,5 Densité (°Oe) 90 Température (°C) 21 80 20,5 70 20 40 18,5 30 18 17,5 20 17 10 0 16,5 1 2 3 4 5 Densité co-inoculation Densité témoin 6 7 8 9 10 Durée de F.A. (jours) Temp. co-inoculation Temp. témoin 11 12 en blanc, 1000000 100000 10000 1000 100 10 0 1 BL1 BL2 Pop. Bact. témoin Pop. Lev. témoin Pop. Bact. co-inoculation Pop. Lev. co-inoculation populations UFC/mL 10000000 1 Annexe- Correspondances entre les codes affectés aux souches de levures et de bactéries lactiques sélectionnées testées et leurs noms commerciaux. 3 5 7 9 Jours après levurage Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ Vitilevure‚ BC Primeur LB Rouge Syrah MT Grenache 58W3 KD DV10 Albaflor Chardonnay CH Pour les 2 souches de bactéries lactiques sélectionnées : Figure 8- Essai de co-inoculation en vinification sur Chasselas, 2003 : cinétiques fermentaires. 100000000 Les vins des deux modalités présentaient en fin de F.M.L. des acidités volatiles comparables. Par ailleurs, au niveau gustatif, aucune différence significative n’a été mise en évidence. LSA1 LSA2 LSA3 LSA4 LSA5 LSA6 LSA7 LSA8 LSA9 LSA10 LSA11 LSA12 50 19 3.2.3- Teneur en acidité volatile des vins finis et qualité organoleptique Pour les 12 souches de levures sélectionnées : 60 19,5 La co-inoculation a permis un gain de temps notable par rapport au protocole classique d’ensemencement en bactéries lactiques en fin de F.A. : 20 jours sur la modalité “co-inoculation” contre 35 jours sur la modalité “témoin”. 11 13 15 Figure 9- Essai de co-inoculation en vinification en blanc, sur Chasselas, 2003 : suivi des populations levurienne et bactérienne. Les populations levurienne et bactérienne ont été suivies par dénombrement après ensemencement sur des milieux de culture spécifiques. La figure 9 montre qu’aucun impact sur la croissance de la population levurienne n’a été observé. En effet : • les levures se développent à des niveaux de population normaux comme dans le cas d’une fermentation classique sans co-inoculation, Vitilactic‚ D MBR Vitilactic‚ F MBR CONCLUSION Ces expériences de terrain ont confirmé l’intérêt de la pratique de la co-inoculation “levure/bactérie” en début de fermentation alcoolique dans le cadre de l’élaboration de vins primeurs ou de vins présentant habituellement des difficultés à réaliser la fermentation malolactique. Que ce soit dans les essais présentés ici, ou dans le cadre d’autres expérimentations menées notamment sur des moûts de thermovinification en Languedoc et en Côtes du Rhône, ou encore sur des moûts issus d’autres cépages blancs en Côtes du Rhône et dans le Gers, aucune déviation organoleptique n’a été observée. De plus, la co-inoculation a toujours permis un gain de temps d’intérêt notable pour ce type de vinification. Dans tous ces essais, le choix du “couple levure-bactérie” a été raisonné, de même que l’apport de nutriments en fonction de la teneur du moût en azote assimilable ou encore de la turbidité pour ce qui est des vinifications en blanc. En effet, il est primordial d’assurer un bon déroulement de la fermentation alcoolique pour la pratique de la co-inoculation. Un autre paramètre important, et plus particulièrement en vinification en blanc, est la teneur en SO2. En effet, des essais complémentaires menés en laboratoire, ont montré la nécessité de décaler l’ensemencement en bactéries lactiques de 24 heures au moins par rapport au moment du levurage. Revue Française d’Œnologie - juillet/août 2004 - N° 207 27 En conclusion, la pratique de la co-inoculation doit, pour être efficace, être raisonnée et adaptée au processus de vinification. Elle implique dans tous les cas le respect de certaines règles : • une bonne maîtrise de l’hygiène, • un bon choix du “couple levure-bactérie”, • une bonne gestion de la nutrition de la levure, • un bon suivi des fermentations alcoolique et malolactique. Si tous ces paramètres sont maîtrisés, la co-inoculation levure/bactérie en début de F.A. présente des intérêts forts pour le vinificateur : gain de temps, réduction des risques de contaminants indésirables, implantation assurée de la bactérie ensemencée, réalisation de la F.M.L. dans des conditions difficiles grâce à l’acclimatation progressive des bactéries aux conditions du vin. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES (1) LAURENT M., VALADE M., 1993, La réactivation des bactéries lyophilisées sur moût pour l’ensemencement de la fermentation malo-lactique en Champagne. Entretiens scientifiques Lallemand 1 : les aspects microbiologiques de la fermentation malo-lactique, 49-55. (2) FUSTER A., KRIEGER S., HENICK-KLING T., ARNICK K., 2002. 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