PDF(10,27Mo) - Collection mémoires et thèses électroniques

Étude du rôle de la voie ERK/MAPK dans le
développement embryonnaire chez la souris
Thèse
Rifdat Aoidi
Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire
Philosophiæ doctor (Ph. D.)
Québec, Canada
© Rifdat Aoidi, 2017
Étude du rôle de la voie ERK/MAPK dans le
développement embryonnaire chez la souris
Thèse
Rifdat Aoidi
Sous la direction de
Jean Charron, directeur de recherche
Résumé
Les mammifères possèdent deux MAP kinases kinases (MEK1 et MEK2), impliquées dans
l’activation de la voie ERK/MAPK essentielle pour la différenciation, la prolifération et la survie
cellulaire. Le premier objectif de cette thèse était de déterminer si les fonctions des kinases MEK1 et
MEK2 sont redondantes durant le développement embryonnaire. Les souris Mek1-/- meurent à migestation d’une malformation du placenta. Les souris Mek2-/- ne présentent aucun phénotype majeur,
suggérant que ces deux protéines ont des rôles différents. Cependant, la plupart des mutants Mek1+/Mek2+/- meurent pendant la gestation d’un sous-développement du placenta, indiquant que Mek1 et
Mek2 ont chacun un rôle dans le développement des tissus extraembryonnaires. À ce jour aucune
évidence claire ne permet de statuer sur la redondance fonctionnelle de MEK1 et MEK2. Afin de
vérifier la spécificité fonctionnelle de Mek1 et Mek2, nous avons généré au laboratoire un allèle
« knockin », exprimant l’ADNc de Mek2 sous contrôle du locus Mek1 (Mek12). L’analyse de ces
souris a révélé la redondance fonctionnelle entre MEK1 et MEK2. L’analyse de combinaisons
alléliques de Mek a démontré qu’une expression minimale de protéines MEK est cruciale pour le
développement embryonnaire et la survie.
Le second objectif de cette thèse était de caractériser les mutants Mp1. Les protéines
d’échafaudage permettent de moduler l’activité de la voie ERK/MAPK et facilitent la transmission
rapide du signal. Parmi les protéines d’échafaudage connues, seule MP1 (Mek Partner 1) a été
identifiée comme étant un partenaire spécifique de MEK1 et ERK1. Cette spécificité suggère que
MP1 pourrait contribuer à la différence d’activation de MEK1 et MEK2 en spécifiant le signal qui
passe par Mek1. Afin d’étudier le rôle de Mp1 au cours du développement chez la souris, nous avons
généré des souris Mp1-/-. L’analyse de ces mutants indique que le gène Mp1 est essentiel pour la
survie et que sa fonction est nécessaire suite à la post-implantation.
La dérégulation de la voie ERK/MAPK dans le développement chez l’homme a aussi des
conséquences phénotypiques. Au cours des dernières années, une classe de syndromes a été
caractérisée : Les « Rasophaties ». Ces syndromes partagent des caractéristiques communes qui
sont, une mutation dans des gènes de la voie ERK/MAPK, une dysmorphologie cranio-faciale, des
malformations cardiaques et cutanées ainsi qu’un retard mental. Parmi les mutations de la voie
ERK/MAPK qui ont été identifiées, une mutation ponctuelle dans le gène Mek1 (Mek1Y130C) cause le
syndrome Cardio-Facio-Cutané (CFC). Le dernier objectif de cette thèse était de générer un modèle
animal pour le CFC portant la mutation Mek1Y130C. Les souris portant l’allèle Mek1Y130C présentent les
iii
phénotypes associés au CFC (i.e sténose pulmonaire, dysmorphologie cranio-faciale et défauts
neurologiques).
iv
Abstract
Mammals possess two MAP kinase kinase (MEK1 and MEK2), involved in ERK/MAPK pathway. This
pathway is essential for proliferation, differentiation and cell survival. The first objective of my thesis was to
determinate if MEK1 and MEK2 kinases are redundant during embryonic development. Mek1-/- mice die at
embryonic day E10.5 due to placental defects, whereas Mek2-/- mice survive with a normal lifespan
suggesting that MEK1 possesses functions not shared by MEK2. However, most Mek1+/-Mek2+/embryos also die from placental defects, indicating that both Mek genes contribute to placental
development. To date, no clear evidence on MEK1 and MEK2 redundancy has been provided. To assess
the functional specificity of the Mek1 and Mek2 genes, we produced a Mek1-knockin allele in which
the Mek2 coding sequences were placed under the control of Mek1 regulatory sequences. Analyzing
these mice allowed us to demonstrate that MEK1 and MEK2 can substitute for each other and that a
minimal amount of MEK is critical for placenta development and embryo survival.
The second objective of my thesis was to characterize Mp1 mutants. Scaffold proteins
modulate MAPK pathway by providing spatial and temporal specificity. Among known ERK/MAPK
scaffold proteins, only MP1 (Mek Partner 1) is specific to MEK1 and ERK1, raising the question of the
specificity of MP1 in the regulation of ERK/MAPK pathway via MEK1. In order to investigate Mp1
function in vivo, we generated Mp1 knock-out mice. Analyzing these mice enable us to suggest that
Mp1 is required for embryonic development and is essential during post-implantation.
Deregulation of Ras/MAPK pathway also causes developmental phenotypes in human.
During the last decade, a new class of syndromes, which share common phenotypes such as
mutations in Ras/MAPK pathway, cranio-facial dysmorphology, cardiac and cutaneous malformations
and neurological delay has been described and named Rasophaties. Among the DNA mutations
found in rasopathies, the Mek1 mutation, Mek1Y130C, causes cardio-facio-cutaneous syndrome (CFC).
The last objective of my thesis was to generate a mouse model of CFC, with the Mek1Y130C mutation.
I found that mice carrying the Mek1Y130C mutation partially recapitulate CFC syndrome (i.e pulmonary
stenosis, crani-facial dysmophia and neurological defects).
v
Table des matières
Résumé .............................................................................................................................................................. iii
Abstract ............................................................................................................................................................... v
Table des matières ............................................................................................................................................. vi
Liste des tableaux................................................................................................................................................ x
Liste des figures ................................................................................................................................................. xi
Liste des abréviations ........................................................................................................................................xiii
Remerciements ................................................................................................................................................xvii
Chapitre 1. Introduction ....................................................................................................................................... 1
1.1
Le développement embryonnaire....................................................................................................... 1
1.1.1 De la fertilisation au stade blastocyste : la préimplantation........................................................ 2
1.1.2 L’implantation ................................................................................................................................ 11
1.1.3 La gastrulation ............................................................................................................................... 14
1.2 Le développement du tissu extraembryonnaire : le placenta .................................................................. 15
1.2.1 Voie ERK/MAPK dans le développement des tissus extraembryonnaires ............................... 21
1.3 Les voies de signalisation MAPK ............................................................................................................ 26
1.3.1 La voie de signalisation c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 1-3 .................................................. 26
1.3.1.1 Propriétés de la voie JNK ...................................................................................................... 26
1.3.1.2 Activation de la voie ............................................................................................................... 26
1.3.1.3 Fonction biologique de la voie .............................................................................................. 27
1.3.1.4 Substrats et gènes régulés par la voie ................................................................................. 30
1.3.2 La voie de signalisation p38α-β-γ-δ ............................................................................................. 31
1.3.2.1 Propriétés de la voie p38 ....................................................................................................... 31
1.3.2.2 Activation de la voie ............................................................................................................... 31
1.3.2.3 Fonction biologique de la voie .............................................................................................. 32
1.3.2.4 Substrats et gènes régulés par la voie ................................................................................. 32
1.3.3 La voie de signalisation ERK5 ...................................................................................................... 32
1.3.3.1 Propriétés de la voie .............................................................................................................. 32
1.3.3.2 Activation de la voie ............................................................................................................... 33
1.3.3.3 Fonction biologique de la voie .............................................................................................. 33
1.3.3.4 Substrats et gènes régulés par la voie ................................................................................. 34
1.3.4 Les voies MAPK atypiques ........................................................................................................... 34
1.3.4.1 ERK3 et ERK4 ......................................................................................................................... 34
1.3.4.2 Nem-like kinase (NLK)............................................................................................................ 35
1.3.4.3 ERK7 ........................................................................................................................................ 36
1.4 La voie de signalisation ERK/MAPK classique ....................................................................................... 36
1.4.1 Activation de la voie ...................................................................................................................... 37
1.4.2 Les MAPKKKs RAF........................................................................................................................ 38
vi
1.4.3 Les MAPKKs MEK1 et MEK2 ........................................................................................................ 39
1.4.3.1 Structure des kinases MEK1 et MEK2 .................................................................................. 39
1.4.3.2 Différences entre MEK1 et MEK2 .......................................................................................... 40
1.4.3.3 Rôles des kinases MEK1 et MEK2 ........................................................................................ 45
1.4.4 Les MAPK ERK1/2 ......................................................................................................................... 49
1.4.4.1 Fonctions des kinases ERK1/2 ............................................................................................. 49
1.4.4.2 Processus cellulaires régulés par ERK1/2........................................................................... 50
1.4.5 Importance des protéines d’échafaudage dans le contrôle de la voie ERK/MAPK ................. 50
1.4.5.1 KSR1........................................................................................................................................ 51
1.4.5.2 Paxilline................................................................................................................................... 52
1.4.5.3 β-arrestine 2............................................................................................................................ 53
1.4.5.4 IQGAP1.................................................................................................................................... 53
1.4.5.5 MP1 .......................................................................................................................................... 54
1.4.5.6 MORG1 .................................................................................................................................... 55
1.5 Dérégulation de la voie ERK/MAPK et ses conséquences chez l’humain .............................................. 56
1.5.1 Les Rasopathies ............................................................................................................................ 56
1.5.1.1 Neurofibromatose de type 1 (NF1)........................................................................................ 57
1.5.1.2 Syndrome de Noonan (SN) .................................................................................................... 60
1.5.1.3 Syndrome de Costello (SC) ................................................................................................... 61
1.5.2 Le syndrome cardio-facio-cutané (CFC) ..................................................................................... 62
1.5.2.1 Les symptômes du CFC ........................................................................................................ 63
1.5.2.1.1 L’atteinte cardiaque ............................................................................................. 63
1.5.2.1.2 L’atteinte cranio-faciale ...................................................................................... 63
1.5.2.1.3 L’atteinte de l’ectoderme ................................................................................... 64
1.5.2.1.4 L’atteinte neurologique ...................................................................................... 64
1.5.2.1.5 Les autres atteintes ............................................................................................. 64
1.5.2.2 Les aspects moléculaires du CFC ........................................................................................ 65
1.5.2.2.1 Les mutations du gène BRAF.......................................................................... 65
1.5.2.2.2 Les mutations des gènes MEK1 et MEK2................................................... 66
1.5.2.3 Les modèles animaux pour le syndrome cardio-facio-cutané ........................................... 67
1.5.2.3.1 Les modèles animaux avec une mutation dans le gène BRaf .......... 67
1.5.2.3.2 Les modèles animaux avec une mutation dans les gènes Mek1 et
Mek2 .............................................................................................................................................. 68
1.6 Problématiques et objectifs ..................................................................................................................... 69
Chapitre 2.......................................................................................................................................................... 71
Functional redundancy of the kinases MEK1 and MEK2: Rescue of the Mek1 mutant phenotype by Mek2
knockin reveals a protein threshold effect ......................................................................................................... 71
2.1 Avant-propos .......................................................................................................................................... 73
2.2 Résumé .................................................................................................................................................. 75
2.3 Abstract................................................................................................................................................... 77
2.4 Introduction ............................................................................................................................................. 79
2.5 Results .................................................................................................................................................... 81
2.5.1 Mek2 cdna knockin into the Mek1 locus rescues the Mek1-null phenotype ............................ 81
2.5.2 MEK1 is approximately twice more abundant than MEK2 in the placenta ............................... 88
vii
2.5.3 Placental development requires a threshold of MEK activity .................................................... 89
2.6 Discussion ............................................................................................................................................... 92
2.7 Materials and Methods ............................................................................................................................ 98
2.7.1 Generation of the Mek1 knockin allele......................................................................................... 98
2.7.2 Mice, genotype and tissue collection .......................................................................................... 99
2.7.3 Histological, immunohistochemical, and immunofluorescence analyses ............................. 100
2.7.4 Western blot analysis .................................................................................................................. 100
2.7.5 RNA isolation and quantitative RT-PCR (qRT-PCR) ................................................................. 100
2.7.6 Statistical analyses...................................................................................................................... 100
2.8 References ............................................................................................................................................ 100
Chapitre 3. ....................................................................................................................................................... 119
Étude du rôle de Mp1 (Mek-Partner-1) au cours du développement embryonnaire de la souris..................... 119
3.1 Avant propos ......................................................................................................................................... 119
3.2 Introduction ........................................................................................................................................... 121
3.3 Matériels et méthodes ........................................................................................................................... 122
3.3.1 Génération de l’allèle Mp1- .......................................................................................................... 122
3.3.2 Souris, collecte de tissus et culture des embryons ................................................................. 123
3.3.3 Analyses d’histologie, d’immunohistochimie et d’immunofluorescence............................... 123
3.3.4 Hybridation in situ ....................................................................................................................... 124
3.4 Résultats ............................................................................................................................................... 125
3.4.1 L’inactivation du gène Mp1 cause une mortalité embryonnaire ............................................. 125
3.4.2 Dérégulation de l’expression des marqueurs des trophoblastes ainsi que de la voie MAPK
................................................................................................................................................................ 130
3.4.3 Défaut des cellules ES Mp1-/- in vitro ......................................................................................... 131
3.5 Conclusion et discussion....................................................................................................................... 131
Chapitre 4 ........................................................................................................................................................ 143
Mek1Y130C mice partially recapitulate human Cardio-Facio-Cutaneous syndrome........................................... 143
4.1 Avant propos ......................................................................................................................................... 145
4.2 Résumé ................................................................................................................................................. 147
4.3 Abstract ................................................................................................................................................. 149
4.4 Introduction ........................................................................................................................................... 151
4.5 Results .................................................................................................................................................. 152
4.5.1 Viability of MEK1Y130C mouse model........................................................................................... 152
4.5.2 The Mek1Y130C allele contains a partial duplication of the Mek1 gene ..................................... 156
4.5.3 Heart and cranial defects in Mek1Y130C mutants ........................................................................ 157
4.5.4 Brain defects in Mek1Y130C mutants ............................................................................................ 164
4.5.5 Mek1Y130C capacity to activate ERK/MAPK pathway ................................................................. 164
4.6 Discussion ............................................................................................................................................. 165
4.7 Materials and Methods .......................................................................................................................... 170
4.7.1 Mice, genotype and tissue collection ........................................................................................ 170
4.7.2 Histological analyses and pulmonary stenosis analysis ......................................................... 170
4.7.3 Brain immunostaining ................................................................................................................. 170
4.7.4 Western blot analysis .................................................................................................................. 171
viii
4.7.5 RNA isolation and quantitative RT-PCR (qRT-PCR) ................................................................. 171
4.7.6 Fibroblast isolation and pERK induction .................................................................................. 171
4.7.7 Skeletal analysis .......................................................................................................................... 171
4.7.8 Statistical analyses ..................................................................................................................... 172
4.9 References ........................................................................................................................................... 172
5. Discussion générale et conclusions ............................................................................................................ 175
5.1. Redondance fonctionnelle des kinases MEK1 et MEK2 ...................................................................... 176
5.2. Niveau d’expression des protéines MEK1 et MEK2............................................................................. 177
5.3 Développement du placenta et effet de dosage.................................................................................... 182
5.4. Rôle de la protéine d’échafaudage MP1 au cours du développement ................................................. 184
5.4.1 MP1 et la signalisation ERK/MAPK ............................................................................................ 185
5.4.2 MP1 et la signalisation mTORC1 ................................................................................................ 188
5.5 Modèle animal pour le syndrome cardio-facio-cutané avec la mutation Mek1Y130C ............................... 189
5.6 Conclusion générale ............................................................................................................................. 198
Bibliographie des chapitres 1, 3 et 5 ............................................................................................................... 199
Annexe I: Lung development requires an active ERK/MAPK pathway in the lung mesenchyme .................... 219
I.1 Avant-propos ......................................................................................................................................... 221
I.2 Résumé ................................................................................................................................................. 223
I.3 Abstract.................................................................................................................................................. 225
I.3 Abstract.................................................................................................................................................. 225
I.4 Introduction ............................................................................................................................................ 227
I.5 Result..................................................................................................................................................... 229
I.5.1 Tbx4Cre-directed Mek1 mesenchymal inactivation in a Mek2 null background causes
neonatal death ...................................................................................................................................... 229
I.5.2 Tracheal cartilage defects in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants .......................................... 231
I.5.3 Mesenchymal inactivation of Mek genes in the developing lung affects lung growth but not
cell differentiation................................................................................................................................. 231
I.5.4 Molecular impact of the mesenchymal inactivation of Mek genes in the lung ....................... 238
I.6 DISCUSSION......................................................................................................................................... 246
I.7 EXPERIMENTAL PROCEDURES ......................................................................................................... 247
I.7.1 Mice, genotyping and tissue collection ........................................................................................... 247
I.7.2 Histology, immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) analyses ........................... 248
I.7.3 Alcian blue cartilage staining .......................................................................................................... 249
I.7.4 Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) experiments .............................................................................. 249
I.7.5 Morphometry analysis .................................................................................................................... 250
I.7.6 Statistical analyses ......................................................................................................................... 250
I.8 ACKNOWLEDGMENTS ........................................................................................................................ 250
I.9 AUTHOR CONTRIBUTIONS ................................................................................................................. 250
I.10 REFERENCES .................................................................................................................................... 250
ix
Liste des tableaux
CHAPITRE 2
Tableau 2.1: Viability relative to Mendelian predicted ratios for Mek11/1, Mek11neo2/1neo2 ................... 84
Tableau 2.2: MTG phenotype in the different Mek1 Mek2 mutants ................................................... 88
Tableau 2.3: Viability of Mek1 Mek2 compound mutants produced by crossing Mek1+/2 Mek2+/- with
Mek1+/2 Mek2+/- mice ......................................................................................................................... 92
Tableau 2.S1: Viability of Mek11/1, Mek11neo2/1neo2, Mek12/2 and Mek12/- embryos and mice at various
ages ................................................................................................................................................ 107
Tableau 2.S2: A MEK1 and MEK2 protein dosage model in placenta development ....................... 109
CHAPITRE 3
Tableau 3.1: Survie des souris Mp1-/-.............................................................................................. 120
CHAPITRE 4
Tableau 4.1: Viability of Mek1Y130C mice ......................................................................................... 144
CHAPITRE 5
Tableau 5.1 : Quantité de MEKs dans le placenta et phénotypes associés .................................... 171
ANNEXE I
Tableau I.1: Ratios of genotypes in litters from crosses between Mek1;Mek2;Tbx4+/Cre and
Mek1;Mek2 mice ............................................................................................................................. 230
x
Liste des figures
CHAPITRE 1
Figure 1.1 : Représentation schématique des stades de préimplantation : de la fertilisation au stade
blastocyste ......................................................................................................................................... 05
Figure 1.2 : La voie de signalisation Hippo et son implication dans la différenciation au stade préimplantation ....................................................................................................................................... 09
Figure 1.3 : Illustration de l’implantation et des mécanismes impliqués ............................................. 13
Figure 1.4 : Représentation schématique du développement des tissus embryonnaires de
l’implantation à la gastrulation............................................................................................................ 17
Figure 1.5 : De la gastrulation au développement du placenta .......................................................... 19
Figure 1.6 : Structure du placenta de la souris : organisation des différentes couches cellulaires de la
région du labyrinthe de souris ............................................................................................................ 23
Figure 1.7 : Module d’activation des voies MAP kinase ..................................................................... 29
Figure 1.8 : Schéma comparatif des séquences et des structures protéiques des kinases MEK1 et
MEK2 ................................................................................................................................................. 43
Figure 1.9 : Module d’activation de la voie Ras/MAPK et mutations associées aux Rasopathies ..... 59
CHAPITRE 2
Figure 2.1: Underdevelopment of the labyrinth in the placenta from Mek11/1 and Mek11neo2/1neo2
mutants .............................................................................................................................................. 83
Figure 2.2: Normal development of the labyrinth in Mek12/2 mutants ................................................. 87
Figure 2.3: Abnormal development of the labyrinth in Mek12/2 Mek2+/-, Mek1+/2 Mek2-/-, and Mek12/2
Mek2-/- mutants .................................................................................................................................. 91
Figure 2.4: Reduced ERK pathway activation in placentas from Mek12/2 Mek2+/-, Mek1+/2 Mek2-/-, and
Mek1+/- Mek2+/- mice .......................................................................................................................... 95
Figure 2.5: Schematic representation of the phenotypes observed in Mek1 Mek2 mutants according
to the genotype .................................................................................................................................. 97
Figure 2.S1: Targeted replacement of Mek1 gene with cDNA encoding Myc-tagged MEK1 or Myctagged MEK2 ................................................................................................................................... 111
Figure 2.S2: Mek12/- mutants showed intrauterine growth restriction ............................................... 113
Figure 2.S3: Mek12 and Mek2+ alleles produce less Myc-tagged MEK2 and endogenous MEK2,
respectively, when compared to MEK1 produced by the Mek1+ wild-type allele.............................. 115
Figure 2.S4: Cover page of Science Signaling, January 2016 ......................................................... 117
CHAPITRE 3
Figure 3.1 : Vecteur de ciblage pour l’inactivation du gène Mp1...................................................... 127
Figure 3.2 : Conséquence de la perte de Mp1 sur le développement de l’embryon et sa survie ..... 129
Figure 3.3 : Profil d’expression des marqueurs de différents types cellulaires à E6.5 ..................... 133
Figure 3.4 : La diminution de l’activation de la voie ERK/MAPK affecte le développement des
embryons Mp1-/- ............................................................................................................................... 135
Figure 3.5 : Les blastocystes Mp1-/- se différencient sans aucun phénotype in-vitro ....................... 137
xi
Figure 3.6 : Évaluation de la pluripotence et de la différenciation des blastocystes Mp1-/- après 5 jours
en culture ........................................................................................................................................ 139
CHAPITRE 4
Figure 4.1: Generating Mek1Y130C allele .......................................................................................... 155
Figure 4.2: New screen of Mek1Y130C mice ..................................................................................... 159
Figure 4.3: Duplication analysis ...................................................................................................... 161
Figure 4.4: Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- and Mek1Y130C/Y130C mice present cardiac and facial defects .. 163
Figure 4.5: Mek1Y130C/Y130C mice exhibit an increased number of GFAP-expressing astrocytes in the
adult neocortex ............................................................................................................................... 167
Figure 4.6: Kinetic of ERK/MAPK pathway activation in Mek1Y130C/- MEF ...................................... 169
CHAPITRE 5
Figure 5.1: Séquences des 3’ et 5’ UTR des gènes Mek1 et Mek2 de souris ................................. 169
Figure 5.2 : Module d’activation de la voie ERK/MAPK ainsi que son ancrage à l’endosome tardif.175
Figure 5.3 : Recrutement des voies de signalisation ERK/MAPK et mTORC1 aux endosomes tardifs
........................................................................................................................................................ 177
Figure 5.4: Signalisation mTORC1.................................................................................................. 179
ANNEXE I
Figure I.1. Validation of the efficiency and specificity of the Cre recombinases in the developing lung
and placenta ................................................................................................................................... 233
Figure I.2. Morphology and body weight of Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant embryos .............. 235
Figure I.3. Abnormal tracheal development in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant embryos.......... 237
Figure I.4. Tbx4Cre-driven mesenchymal inactivation of Mek genes causes lung hypoplasia ........ 241
Figure I.5. Characterization of lung epithelium cell integrity and microvasculature in Mek1flox/flox;Mek2/-;Tbx4+/Cre mutant embryos ............................................................................................................. 243
Figure I.6. Changes in gene expression in lungs from Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant embryos
........................................................................................................................................................ 245
xii
Liste des abréviations
3T3: 3-day transfer, inoculum 3x105 cells
4EBP1 : 4E-binding protein 1
ADN : Acide Désoxy-ribonucléique
AP-1: Activator Protein-1
ARN : Acide Ribonucléique
AT1aR: angiotensin receptor subtype 1a
ATF: Activating Transcription Factor
BCIP : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate
BMK1: Big MAPK 1
BMP : Bone morphogenetic protein
BrdU : Bromodésoxyuridine
B-ZIP : motif leucine-zipper basique
CDK5 : Cycline-dependent kinase 5
CDX2 : Caudal type homeobox 2
CEP: Cône ectoplacentaire
CMI : Cellules de la masse interne
COX2: Cyclooxygenase 2
CRE : cAMP-repsonsive element
CSBP: Cytokine suppressive anti-inflammatory drugs binding protein
DAB2: Disabled homolog 2
Deptor : DEP domain containing MTOR-interacting protein
DMEM: Dulbecco’s Modofied Eagle Medium
EEx : Ectoderme extraembryonnaire
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor
EGFR: Epidermal growth factor receptor
EP: endoderme primitif
EPI : épiblaste
ER: Estrogen Receptor
ERK1/2 : Extracellular signal-regulated kinase 1/2
EV : Endoderme viscéral
EVA : Endoderme viscéral antérieur
EVD : Endoderme viscéral distal
FAK: focal adhesion kinase
FBS: Fetal bovine serum
FGF: fibrobloblast growth facor
FGFR: fibrobloblast growth facor receptor 2
FOS : FBJ osteosarcoma oncogene
GAB1: Growth factor receptor bound protein 2-associated protein 1
GATA4 : GATA binding protein 4
xiii
GCM1: Glial Cell Missing-1
GFAP : Glial fibrillary acidic protein
GLUT1 : Glucose transporter 1
GRB2: Growth factor receptor bound protein 2
HB-EGF: Heparin binding EGF
HeLa : Henrietta Lacks
HIPK2: Homeodomain-interacting protein kinase 2
HuR : Hu-antigen R
IL-1: Interleukine 1
IMP : impedes mitogenic signal propagation
IQGAP1: IQ Motif Containing GTPase Activating Protein 1
ITGA4: Integrin alpha 4
JNK: c-Jun NH2-terminal kinase
JUN: Jun proto-oncogene
K14Cre: Keratin14 Cre recombinase
KSR1: Kinase suppressor of Ras 1
LAMP-1 : Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMTOR : late endosomal/lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator
LATS1/2 : Large tumour suppressor 1/2
LBP1A/UBP1A: Upstream binding protein 1a
LIF: Leukaemia inhibitory factor
LIFR: Leukemia inhibitory factor receptor
LPS : Lipopolysaccharide
MAP2 : Microtubule-associated protein 2
MAPK: Mitogen-activated protein kinase
MAPKK: MAPK kinase
MAPKKK: MAPK kinase kinase
MBP : Myelin basic protein
MCT1 : Monocarboxylic acid transporter 1
MEF : Mouse embryonic fibroblast
MEK1/2: MAP kinase or ERK kinase 1/2
MEKK1: MEK kinase 1
MET: hepatocyte growth factor receptor
mLST8 : MTOR associated protein, LST8 homolog
MORG1: MAPK Organizer-1
MP1: MEK Partner-1
MST1/2: Mammalian Ste20-like kinases ½
MTG: Multinucleated Trophoblastic Giant cell
mTOR : mammalian target of rapamycin
mTORC1 : mammalian target of rapamycin complex 1
xiv
NBT : Nitro blue tetrazolium
NF1 : Neurofibromatose de type 1
NGF: Neuronal Growth Factor
NLK: Nemo-like kinase
OCT4: Octamer-binding transcription factor 4
PABP: poly(A)-binding protein
PAK: p21-activated kinases
PBS: Phosphate buffered saline
PDGF: Platelet-derived growth factor
PDGFR: Platelet Derived Growth Factor Receptor
PFA: Paraformaldéhyde
PGl2 : Prostaglandine 2
PK: Protéinase K
PKCζ : Protein kinase C, zeta
PP2A : Protein phosphatase 2A
PPARγ: Peroxisome proliferator activated receptor gamma
PR: Progesteron Receptor
PTP: Protein tyrosine phosphatase
PTPN11 : Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11
RAF: v-raf-leukemia viral oncogene 1
Rag : Ras-related GTP-binding protein
Rag: Ras-related GTP-binding protein
Raptor : regulatory-associated protein of mTOR
RBP: RNA-binding protein
RCPGs: Récepteurs couplés aux protéines G
RTK: Récepteurs tyrosine kinase
S6K1 : ribosomal protein S6 kinase, polypeptide 1
SAPK : Stress-Activated Protein Kinase
SAPK: Stress Activated MAP Kinase
SAV1: Sav family WW domain-containing protein 1
SH2 : Src homology domain 2
ShhCre: Sonic Hedgehog Cre recombinase
SHP2 : Src Homology 2 domain containing protein tyrosine phosphatase 2
SOS1: Son of sevenless homolog 1
SRE : Serum response element
S-TGC: Sinusoïdal trophoblastic mononuclear giant cell
SynA-B: Syncytine A-B
SynTI – SynTII : Syncytiotrophoblastes de type I et II
TAK1: TGF beta-activated kinase 1
TAZ: transcriptional co-activator with PDZ-binding motif
TCF/LEF: T-cell factor/lymphoïd enhence factor
xv
TCF: Ternary complex factors
TE: Trophectoderme
TEAD4: TEA Domain Transcription Factor 4
TEF: Transcriptional enhancer factor
TNF: tumor necrosis factor
TNFα: Tumor Necrosis Factor α
TRE: TPA responsive element
ULK1: unc-51 like autophagy activating kinase 1
UTR: Untranslated region
VCAM1: Vascular Cell-Adhesion Molecule 1
VEGF: Vascular endothelial growth factor
WD-40 :
WNT: Wingless-type MMTV integration site family
YAP: Yes-associated protein
ZP3: Zona Pellucida 3
xvi
Remerciements
Le travail présenté dans cette thèse est le résultat de plusieurs années de recherche pendant
lesquelles j’étais entourée de belles personnes.
J’aimerais tout d’abord remercier le Dr Jean Charron, qui, après quelques conversations
téléphoniques et courriels échangés m’a accordée sa confiance et m’a permis de vivre cette grande
aventure humaine et scientifique que de venir faire mon doctorat à Québec. Je me rappelle la
première fois que l’on s’est rencontré en vrai, un 4 Janvier, Jean m’a regardée et m’a dit : « On ne va
pas parler du projet de recherche. Tu ne vas pas survivre habillée comme ça, va t’acheter du linge et
on reparle après ! » S’en est suivi un cours 101 sur comment s’habiller en hiver à Québec (le type de
bottes à acheter etc…). Jean, en plus de vous assurer que je ne congèle pas sur place, vous m’avez
appris la rigueur scientifique, l’importance des contrôles dans toutes les expériences et de toujours
analyser ses résultats avec un regard critique. Vous m’avez appris à « mettre la ceinture, les
bretelles et s’il le faut apporter un pantalon de rechange ! » Merci pour votre disponibilité, vos
conseils et votre soutien tout au long de mon doctorat. Je tiens également à remercier la Dre Lucie
Jeannotte, qui a aussi été présente tout au long de mon doctorat. Merci Lucie pour tes
encouragements, tes conseils, ta franchise, les discussions que l’on a pu avoir autant sur les projets
de recherche que sur la vie, l’avenir de la recherche, la politique, la musique, le dernier « feel good
movie » que l’on a apprécié, la présence des femmes en recherche et nos recettes de saison. Merci
pour l’intérêt sincère à mes projets de recherche, d’avoir laissé la place à l’enthousiasme et partagé
mes excitations face à des résultats. Ton « c’est excitant ! » est très contagieux . Merci à vous
deux, Jean et Lucie ! J’estime que vous m’avez apporté les outils nécessaires pour mon évolution
personnelle dans la recherche.
Durant toutes ces années passées dans le laboratoire Charron, j’ai eu l’occasion de côtoyer
des personnes formidables. Annie Maltais, qui m’a initiée aux prélèvements à E6.5 et E3.5 dès mon
arrivée. J’ai développé grâce à toi des yeux bioniques capables de voir ces embryons qui font exprès
de se cacher. Ton travail rigoureux et consciencieux m’a permis de bien commencer mes projets de
recherche. Merci à Laurent Beuret, avec qui on n’était pas forcément d’accord sur tout mais avec qui
on était capables d’avoir des conversations enflammées. Merci pour tes encouragements ! Merci à
Julie Plante et Simon-Pierre Fortier-Beaulieu (ah ouain !), vous côtoyer a été une joie. Merci à Emilie
Pic, dernière arrivée au labo. Même si on n’est pas toujours d’accord, le chocolat et le café nous
rassemblent. Un grand merci du fond du cœur à Valérie Nadeau (aka ma brenda ou madame
xvii
placenta). Tu as été présente tout au long de mon doctorat et même après ton départ du labo. Tu es
une scientifique hors pair et avec qui il est agréable de brasser des idées. Nos discussions « brain
storm » m’ont beaucoup manquée après ton départ. Merci pour tes conseils, ta bonne humeur et ton
humour.
J’aimerais remercier les membres actuels et passés de l’équipe Jeannotte. Merci à Olivier
Boucherat et Florian Gotti. Merci à Pascale Ontchangalt (et Cyril Roblet) chez qui j’ai squatté
pendant mes premières années et avec qui il est toujours agréable de passer des bons moments de
rigolade. Merci à Felix-Antoine Bérubé-Simard (Toinou), ça a été un réal plaisir de te côtoyer, ça n’a
pas été très difficile tu es une crème ! Un grand merci du fond du cœur à Kim Landry-Truchon et
Nicolas Houde sans qui les deux dernières années auraient été bien plates. Merci pour votre bonne
humeur, votre sensibilité, votre écoute et vos jokes (je ne pensais jamais remercier vos jokes plates
!). Merci pour ce fameux mois de septembre 2014 pendant lequel la salle in vivo était notre maison et
les outils de dissection nos doigts. Merci de m’avoir supportée pendant mon écriture. D’avoir su ne
pas me parler parce que parfois ça fait autant de bien d’être entourée dans le silence ! Kim tu as été
un super coach d’écriture, tes « GO GO GO TU ES CAPABLE !!!! » ont été super efficaces. Merci
pour ces soirées macreuses-frites maison, chez Gaston ou chez Girard parce que #jspp ! J’aimerais
remercier les membres du centre de recherche qui, a un moment donné dans mon doctorat, m’ont
aidée et conseillée (Nourdine, Kevin, Clémence, Michel et Emmanuelle).
Cette grande aventure à Québec m’a permis d’apprendre beaucoup scientifiquement mais
aussi humainement. Toute fraîchement débarquée avec une valise je me suis faite une nouvelle
famille remplie de gens merveilleux. Je tiens à remercier toutes ces personnes qui font partie de ma
deuxième famille sans qui ma santé mentale n’aurait peut être pas survécue. Merci à Flavia, tu as
joué le rôle de sœur, mère, matante et amie ! Ta bonne humeur, ta joie et ton énergie ont toujours
été contagieuses. Que ce soit pour le parté ou un souper tu es toujours partante (même si ça finit
toujours par un souper suivie d’un parté !). On a construit au fil du temps une belle amitié. Grâce à toi
j’ai pu jouer avec Pé Na Rua et frapper sur un tambour tout les mardis soir pour sortir le méchant.
Merci à Josée. Tu es une personne entière et sincère, je suis contente que tu fasses partie de ma
deuxième famille ! À deux on était peut être capable de suivre l’énergie de Flavia qui « a une vie
réveillée très active ». Merci à ton petit Naoé qui, du haut de ses 3 ans, est capable de te mettre le
sourire aux lèvres. Qui a les mêmes goûts musicaux que moi et avec qui il est toujours agréable de
xviii
danser sur « Segnora chicheraaaaaa ». Merci à Rosalie, ma poète préférée. Même si je ne
comprends pas tous tes poèmes, on s’est très vite comprises et une belle amitié est née ! Merci pour
ta présence et ta sincérité. Tu as été une superbe coloc de jardin. Merci à Fabien et Anne pour votre
disponibilité, votre joie et votre bonne humeur. Merci de nous accueillir pour un dimanche à
Deschambault avec la duchesse. Je suis heureuse que vous fassiez partie de ma grande famille !
Merci à la belle gang de Pé Na Rua avec qui faire de la musique est très agréable. La bonne humeur
et la joie vous caractérisent. Dans toutes les situations on n’en ressort que le bon, que ce soit à
Saint-Tite ou à Québec. Merci particulièrement à Cyndie, Amy, Neto et Johanne. Merci à Guylaine et
Bernard pour votre belle énergie et votre bonne humeur. Merci d’avoir lu et corrigé le premier jet de
mon introduction. J’ai hâte de passer plus de temps avec vous. Merci à Justin et Geneviève avec qui
j’ai passé de beaux moments en colocation. Merci Justutu pour nos sessions Dj à l’appart. Merci
d’avoir été les gens chez qui je pouvais passer à l’improviste à 18h et m’inviter à souper (en plus de
me nourrir au souper je repartais avec un lunch !). Merci pour votre présence et votre soutien ! Une
autre personne qui m’a nourrie à l’improviste est Marie-Ève. Il a aussi été très agréable de faire de la
radio avec toi ! Giramundo était toujours le fun avec ma co-animatrice préférée. Merci à Mathieu pour
tes encouragements et tes petites tisanes « Rock that doc ». J’aimerais remercier Carole qui m’a
aidée à gérer mon stress/eczéma avec ses conseils en plantes médicinales. Merci particulièrement à
Marie, merci pour ta présence dans ma vie et dans ma nouvelle famille ! Merci pour nos discussions
jusqu’à pas d’heure sur la recherche, la vie, la politique ou la dernière chanson d’afro-house. Merci
d’avoir été présente pendant ma rédaction, grâce à toi j’ai pu me concentrer sur l’écriture ! Merci
d’avoir rempli mon frigo, d’avoir fabriqué des petits plats et rempli mon congélateur. Je n’avais qu’à
réchauffer (parfois tu les réchauffais pour moi…). MERCI ! Merci aussi à Katell et Stéphane qui se
sont assurées que Marie fasse bien son travail d’aide à l’écriture. Merci aussi à Tomy, Rodolphe et
Antje qui ont toujours su m’encourager. J’aimerais remercier mes amiEs outre atlantique qui malgré
la distance m’ont toujours soutenue. Merci à Jacqueline, Christelle, Lucile, Max, Alice, Carole,
Amadou, Laurent et Cybèle. Heureusement que skype existe 
Je tiens à remercier ma famille qui n’est pas physiquement avec moi mais qui a toujours été
présente. Merci à mes parents et à mes frères et sœurs, vous êtes la meilleure fraterie que l’on
puisse avoir ! Vous avez toujours été là pour moi Ndami nagni chondé rrrraaa !!!! Merci à Hilma, la
centrale, qui a toujours été la sœur qui rassemble tout le monde et qui, malgré les épreuves de la vie,
xix
est toujours présente pour nous tous ! Merci à Sahyat et Mariam my sisters from another mother and
another father !!!
Durant toutes ces années j’ai acquis des connaissances mais j’ai surtout appris à me
connaître. Connaître mes réactions face à des échecs, des déceptions et des succès. J’ai aussi
appris à connaître mes limites et mes besoins. Mon entourage me dirait « tu les connais mais tu ne
les écoute pas assez ! » C’est un peu vrai, mais j’apprends !
xx
À mes grands-mères (coco wa Rifdat, coco mo ntsini na coco mo darini)
« Fouwou dzima kali foussou nda » : « un seul ongle ne peut écraser un poux »
signifie « on ne peut pas réussir seul »
xxi
Chapitre 1. Introduction
1.1 Le développement embryonnaire
Le développement embryonnaire décrit le processus qui permet de passer de l’ovocyte fécondé
à l’embryon, du passage d’une cellule unique à un être pluricellulaire complexe. Certains l’expliquent
par le « miracle de la vie », et j’aime à croire à ce miracle, mais j’aime par-dessus tout essayer de
comprendre ce miracle.
La première étude scientifique sur l’embryogénèse a été publiée par Aristote, au IVème siècle
av J-C, sous le titre De Generatione Animalium (De la génération des animaux). Divisée en cinq
livres, cette étude décrit les caractéristiques générales de la reproduction des animaux (livre I), les
modes de reproduction des vivipares et ovipares (livres II et III), la formation de l’embryon et la
différenciation des sexes (livre IV) et les caractères congénitaux (livre V). Aristote distinguait deux
entités dans sa conception de la reproduction : une matière fécondable et un moteur fécondant, qui
sont représentés respectivement par la femelle et le mâle dans le processus de reproduction sexuée.
L’observation de plusieurs animaux (poissons, reptiles, oiseaux (poules)) lui a permis de décrire le
développement embryonnaire. La publication de cet ouvrage a permis de mettre en place un cadre
de réflexion sur la reproduction et le développement embryonnaire, qui a servi par la suite de base
aux scientifiques.
Au XVIIIème siècle, la théorie qui explique le développement embryonnaire est la théorie du
préformationnisme. Selon cette théorie, le développement embryonnaire représenterait uniquement
une expansion d’une miniature préexistante. Cet embryon miniature serait préformé dans l’œuf
(selon les ovistes) ou dans le sperme (selon les animalculistes). Pierre Louis Moreau de Maupertuis
réfute la théorie préformationniste par ses observations anatomiques ainsi que ses observations de
transmission de caractères héréditaires correspondant aux traits parentaux (Emery 1988).
Depuis le XIXème siècle, des découvertes majeures ont permis de mieux comprendre le
développement embryonnaire. Plusieurs modèles animaux ont été utilisés pour en définir les
principales étapes. Parmi ces modèles, les plus marquants, en ce qui a trait au développement
embryonnaire, sont le poulet, le xénope ainsi que le poisson-zèbre. La ponte extérieure, la taille de
l’œuf, la culture de celui-ci à l’extérieur de l’organisme ainsi que la rapidité des étapes du
développement ont facilité l’observation morphologique du développement. Ces trois modèles ont
1
permis une accumulation de connaissances du développement morphologique et des processus
cellulaires et moléculaires impliqués.
La souris, laquelle partage 99 % de son génome avec l’Homme et dont le développement
de l’embryon est interne, présente un placenta et une gestation courte. Elle constitue un modèle de
mammifère idéal pour l’étude du développement embryonnaire.
1.1.1 De la fertilisation au stade blastocyste : la préimplantation
La fertilisation est le moment de fusion des deux gamètes, le spermatozoïde et l’ovocyte, et
de la génération du zygote. Pour que la fertilisation ait lieu, le spermatozoïde doit tout d’abord subir
une étape de capacitation permettant son activation avant qu’il entre en contact avec l’ovule. Une fois
que celui-ci a atteint la surface de l’ovule, il peut y avoir fusion. La fusion entre le spermatozoïde et
l’ovule est propre à l’espèce et se fait via la glycoprotéine ZP3 (Zona Pellucida 3). La liaison du
spermatozoïde à ZP3 permet la réaction acrosomale, induit l’exocytose et ainsi la fertilisation de
l’ovocyte (Wassarman et al. 2008). L’entrée du spermatozoïde dans l’ovocyte active la fin de la
méiose et la production du deuxième corps polaire.
Vingt-quatre heures après la fertilisation, vont se produire les premières divisions cellulaires.
C’est durant ces premières étapes de division cellulaire qu’a lieu, chez la souris, l’activation du
génome zygotique précédée par la dégradation de la plupart des ARNs maternels présents dans
l’œuf (Li et al. 2013). Les premières divisions vont produire un nombre croissant de cellules appelées
blastomères, sans augmentation de la taille de l’embryon jusqu’au stade 8 cellules. À ce stade,
l’embryon est appelé morula, en raison de sa ressemblance avec une mûre. À partir du stade morula,
l’embryon va subir des changements morphologiques menant à l’établissement et à l’augmentation
des adhésions intercellulaires causant la compaction de l’embryon (Figure 1.1A). Durant la
compaction, en plus des adhésions intercellulaires, les cellules de l’embryon vont subir une
polarisation apico-basale. Au pôle extérieur, les cellules en surface présentent des microvilli et au
pôle intérieur, les cellules présentent une surface lisse. Il a été montré que la présence de Ecadhérine et d’ions Ca2+ est essentielle au maintien de la compaction. En effet, les souris invalidées
pour le gène codant pour E-cadhérine compactent normalement au stade 8 cellules, en raison de la
présence de E-cadhérine maternelle, mais subissent une décompaction peu après et perdent leur
polarisation cellulaire (Larue et al. 1994; Riethmacher et al. 1995).
2
Au stade 8 cellules, l’embryon est compact et polarisé. Il va, par la suite, subir deux divisions
cellulaires qui vont mener aux stades 16 et 32 cellules. Durant ces divisions, la polarité des cellules
va dépendre du plan de division du blastomère. En effet, si celui-ci est parallèle à l’axe intérieurextérieur de l’embryon, la division va générer deux cellules filles à l’extérieur, qui seront polarisées,
c’est ce qu’on appelle la division préclinale. Par contre, si le plan de division du blastomère est
perpendiculaire à l’axe intérieur-extérieur de l’embryon, la division va générer une cellule fille
polarisée -à l’extérieur- et une cellule fille non polarisée -à l’intérieur-. C’est ce qu’on appelle la
division anticlinale. Ces divisions cellulaires vont mener à une organisation polarisée de l’embryon
avec deux populations de cellules : des cellules externes polarisées et des cellules internes non
polarisées (Figure 1.1B) (Sutherland et al. 1990).
À partir du stade 32 cellules, l’embryon acquiert sa première identité cellulaire : l’identité de
cellules trophoblastiques ou cellules du trophectoderme (TE). Les cellules du TE sont caractérisées
par leur position à l’extérieur de l’embryon ainsi que par leur état polarisé. Les cellules
trophoblastiques vont contribuer uniquement à la formation du placenta. Deux modèles sont décrits
pour expliquer cette acquisition d’identité. Le modèle « intérieur-extérieur », aussi appelé modèle
positionnel, et le modèle de polarité. Le modèle positionnel, premier modèle décrit par Tarkowski,
A.K et Wroblewska, J en 1967, suggère que le devenir des cellules est déterminé par la position des
cellules dans l’embryon (Tarkowski et al. 1967). Les cellules à l’extérieur vont devenir des cellules du
trophectoderme (TE) tandis que les cellules à l’intérieur de l’embryon vont devenir des cellules de la
masse interne (CMI). Ces cellules vont contribuer à la formation de l’embryon ainsi qu’a des lignées
extraembryonnaires. Cette hypothèse a été vérifiée par l’équipe de Tarkowski en 2008. En effet, en
faisant des expériences de réagrégation forcée de blastomères (extérieurs, intérieurs ou d’un
mélange) issus d’embryons 16 cellules ou 32 cellules, les auteurs ont montré que, dans l’embryon
reconstitué, les blastomères réajustent leur devenir selon leur position (extérieur : TE, intérieur : CMI)
(Suwinska et al. 2008). Cette étude suggère que le devenir des cellules dépend de leur position dans
l’embryon.
Le second modèle proposé pour expliquer l’acquisition d’identité des cellules de l’embryon
est le modèle de polarité. Selon ce modèle, la polarité des blastomères définit leur devenir. Le
devenir des cellules TE serait donc défini au stade 8 cellules lorsqu’a lieu la polarisation épithéliale
des blastomères. Ainsi, lors des divisions cellulaires subséquentes, la transmission de l’état de
polarisation se fait selon le plan de division cellulaire du stade 8 cellules au stade 16 cellules
3
Figure 1.1 : Représentation schématique des stades de préimplantation : de la fertilisation au stade
blastocyste
(A) Premières étapes de développement. Après la fécondation, le zygote connait ses premières
divisions cellulaires, jusqu’au stade 8 cellules. L’embryon va ensuite se compacter et se polariser. (B)
Lorsque l’embryon se divise passant du stade 8 cellules au stade 16 cellules, les blastomères, dont
l’axe de division est parallèle à l’axe intérieur-extérieur génèrent deux cellules filles extérieures,
polarisées. Les blastomères dont l’axe de division est perpendiculaire à l’axe intérieur-extérieur
génèrent une cellule fille extérieure polarisée et une celllule fille intérieure non polarisée. (C) Au
stade 32 cellules, les blastomères acquièrent une identités trophectoderme (TE) en exprimant le
gène Cdx2 ou une identité masse interne cellulaire (CMI) exprimant le gène Oct4. Ces deux facteurs
exercent un rôle antagoniste. (D) Au stade E3.5, les CMI se différencient en épiblaste (EPI) donnant
naissance aux cellules de l’embryon et à l’endoderme primitif (EP), ce dernier étant à l’origine du sac
vitellin. Les cellules de l’EPI expriment le facteur Nanog, alors que les cellules de l’EP expriment le
facteur Gata4. (E) Interaction des gènes impliqués dans la différenciation de l’endoderme primitif et
de l’épiblaste.
Inspirée de Katie Cockburn and Janet Rossant, J Clin Inves, 2010.
4
5
(Figure1.1B). Les blastomères extérieurs, polarisés, acquièrent l’identité TE, alors que les
blastomères intérieurs, non polarisés, acquièrent l’identité CMI (Johnson et al. 1981).
Que ce soit dans le modèle positionnel ou dans le modèle de polarité, les facteurs qui
contrôlent l’acquisition de l’identité TE ou CMI sont les facteurs de transcription dont l’expression est
restreinte et associée au TE ou au CMI.
Plusieurs facteurs dont l’expression est associée à la ségrégation TE/CMI ont été mis en
évidence. Par exemple, l’expression du gène Cdx2 (Caudal type homeobox 2) est restreinte aux
cellules du TE dès le stade 32 cellules alors que l’expression des gènes Oct4 (Octamer-binding
transcription factor 4) et Nanog est limitée aux CMI (Nichols et al. 1998; Mitsui et al. 2003). Il a été
montré qu’au moment de la polarisation cellulaire (entre le stade 8 cellules et le stade 16 cellules) les
cellules extérieures expriment plus fortement le gène Cdx2 alors que les cellules intérieures
expriment plus fortement le gène Oct4 (Figure 1.1C). Strumpf et ses collaborateurs ont démontré, en
2005, que l’expression du gène Cdx2 est nécessaire et suffisante pour donner l’identité TE. En effet,
les embryons Cdx2-/- meurent avant l’implantation et présentent une perte de l’intégrité épithéliale
ainsi qu’une perte de l’identité TE, marquée par l’expression des gènes Oct4 et Nanog dans les
cellules du TE. Cependant, dans des embryons Cdx2+/+, l’expression de Oct4 et Nanog est restreinte
aux CMI (Strumpf et al. 2005). Par ailleurs, les embryons Oct4-/- meurent après l’implantation et ne
présentent pas de dérivés des CMI (épiblaste et sac vitellin) indiquant que le gène Oct4 est essentiel
pour le maintien des cellules ES (Nichols et al. 1998). Une analyse plus poussée de la régulation des
gènes Cdx2 et Oct4 a montré que ces gènes sont capables de réguler leur propre expression (Xu et
al. 1999; Okumura-Nakanishi et al. 2005). Niwa et ses collaborateurs ont montrés, via des analyses
d’immunoprécipitation de la chromatine et d’immunoprécipitation, que Cdx2 régule l’expression
d’Oct4 et inversement. En effet, la surexpression de Cdx2 dans des cellules ES entraine l’inhibition
de l’expression d’Oct4 et la réduction de l’expression d’Oct4 entraine une augmentation de
l’expression de Cdx2 (Niwa et al. 2000; Niwa et al. 2005). Ainsi, l’antagonisme mutuel entre Cdx2 et
Oct4 serait responsable de la ségrégation de leurs domaines d’expression, menant à l’expression
d’Oct4 dans les CMI ainsi que l’expression de Cdx2 dans les cellules du TE.
Deux équipes ont indépendamment mis en évidence le facteur de transcription de la famille
TEAD/TEF, TEAD4, comme étant essentiel à la mise en place de l’identité TE, en régulant
l’expression du gène Cdx2 (Yagi et al. 2007; Nishioka et al. 2008). Sachant que l’expression de
Tead4 n’est pas restreinte aux cellules du TE, son rôle spécifique dans ces cellules a été mis en
6
évidence par Nishioka et ses collaborateurs en 2009. En effet, ces auteurs ont montré que dans
l’embryon le co-activateur de TEAD4, YAP, est localisé dans le noyau des cellules à l’extérieur de
l’embryon, alors qu’il est localisé dans le cytoplasme des cellules à l’intérieur de l’embryon. YAP est
un membre de la voie de signalisation Hippo qui a été découverte par des études chez la drosophile
(Huang et al. 2005). Plusieurs membres de cette voie sont conservés de la drosophile aux
mammifères. La dérégulation de la voie Hippo conduit à des défauts de développements majeurs,
tels qu’une mortalité embryonnaire ainsi que des anomalies de croissance des organes (Halder et al.
2011). La voie Hippo peut être divisée en trois composants majeurs : 1-Les modulateurs en amont (le
contact cellulaire par l’intermédiaire de E-cadhérine (Kim et al. 2011)). 2-Les kinases (MST1/2 et
LATS1/2) ainsi que leurs cofacteurs respectifs (SAV1 et MOB1A/B). 3-Les facteurs de transcription
(TEAD1-4) et leurs co-activateurs transcriptionnels (YAP et TAZ) (Figure 1.2A).
L’ensemble des ces données suggère que, dans les cellules extérieures de l’embryon, la
voie de signalisation Hippo est inactive et les kinases LATS1/2 ne phosphorylent pas YAP,
permettant ainsi sa localisation nucléaire et son action comme co-activateur de TEAD4 menant ainsi
à l’activation de la transcription du gène Cdx2. Par contre, dans les cellules à l’intérieur de l’embryon,
la voie de signalisation Hippo est active, permettant aux kinases LATS1/2 de phosphoryler YAP,
entraînant sa séquestration dans le cytoplasme via le complexe 14.3.3. Conséquemment,
l’expression du gène Cdx2 n’est pas activée dans les cellules internes de l’embryon (Nishioka et al.
2009).
Sachant que le contact cellulaire influence l’activation de la voie de signalisation Hippo, ces
données suggèrent que, dans les CMI, la proximité des cellules augmente la densité cellulaire ainsi
que le contact cellule-cellule permettant ainsi l’activation de la voie Hippo et la séquestration de YAP
dans le cytoplasme. Par contre, dans les cellules du TE, la densité cellulaire ainsi que les contacts
cellule-cellule sont diminués, ce qui empêche l’activation de la voie Hippo. YAP est alors capable de
transloquer au noyau et d’activer, avec TEAD4, la transcription de Cdx2 (Figure 1.2B).
Au stade 32 cellules, au moment où les cellules acquièrent leur identité TE, l’embryon subit
ses premiers changements morphologiques, un processus appelé cavitation. La cavitation
correspond à la formation du blastocœle. Au stade morula tardif, il y a formation d’une cavité qui se
remplit progressivement d’un liquide aqueux et forme le blastocœle. Cette entrée d’eau dans
l’embryon est due à un gradient osmotique formé par une pompe ATPase Na+/K+ entraînant une
accumulation de Na+ du côté baso-latéral du TE (Watson et al. 2004). Dès que le blastocœle
7
Figure 1.2 : La voie de signalisation Hippo et son implication dans la différenciation au stade préimplantation
(A) La voie Hippo est activée entre autres par l’adhésion cellulaire médiée par E-cadhérine. Cette
activation entraine la phosphorylation de YAP par les kinases successives MTS1/2 et LATS1/2. YAP
phosphorylé est séquestré dans le cytoplasme. L’absence de YAP dans le noyau ne lui permet pas
de jouer son rôle de co-activateur de la transcription avec le facteur TEAD1/4. L’activation de la voie
Hippo diminue l’activité transcriptionnelle de TEAD1/4 (panneau de gauche). En revanche
l’inactivation de la voie Hippo en traine une translocation de YAP au noyau et induit l’expression des
gènes cibles (panneau de droite). (B) Dans les cellules à l’extérieur (cellules du TE), l’adhésion
cellulaire est peu fréquente, ce qui empêche l’activation de la voie Hippo et entraine l’expression du
gène Cdx2, cible du facteur de transcription Tead1/4. Par ailleurs, dans les cellules internes (CMI)
l’adhésion cellulaire est plus fréquente entrainant l’activation de la voie Hippo et l’inhibition de
l’expression du gène Cdx2.
Inspirée de Nishioka et al, Cell, 2009 et Sasaki et al, Seminar in Cell and Developmental Biology, 2015.
8
9
commence à se former, son maintien est facilité par le caractère épithélial du TE, notamment par les
jonctions serrées. À 3,5 jours après la fertilisation (E3.5), avec la formation du blastocœle, l’embryon
est alors considéré comme blastocyste.
Au stade blastocyste se produit la deuxième différenciation cellulaire. Les CMI vont se
différencier en deux types cellulaires : les cellules de l’épiblaste (EPI), qui vont donner naissance aux
cellules de l’embryon ainsi qu’au mésoderme allantoique, et les cellules de l’endoderme primitif (EP),
qui vont donner naissance, conjointement aux cellules du TE, aux structures extraembryonnaire.
L’EP se juxtapose au blastocœle et l’EPI se trouve entre l’EP et le TE (Figure 1.1D). Les cellules de
L’EP vont exprimer le gène Gata6, alors que les cellules de l’EPI vont exprimer le gène Nanog.
Plusieurs études montrent que le récepteur tyrosine kinase du fibroblast growth factor (FGF) FGFR2
est requis pour l’expression de Gata4 dans l’EP. En effet, les souris invalidées pour les gènes Fgf4 et
Fgfr2 ne développent pas d’EP (Feldman et al. 1995; Wilder et al. 1997; Arman et al. 1998). Chazaud
et collaborateurs ont montré que l’expression de Nanog et Gata6 est hétérogène et complémentaire
dans les CMI du blastocyste à E3.5, sans aucune spécificité positionnelle. De plus, ces auteurs ont
montré que la signalisation via Grb2 est requise pour la ségrégation de ces cellules progénitrices car
les embryons Grb2-/- ne génèrent pas de cellules de l’EP et toutes les CMI de ces embryons ont un
devenir EPI avec une expression du gène Nanog (Chazaud et al. 2006). L’invalidation du gène
Nanog a permis de mettre en évidence l’importance de ce facteur pour la mise en place de l’EP ainsi
que pour l’EPI. En effet, les embryons Nanog-/- ne développent ni EPI ni EP (Mitsui et al. 2003). Ces
données suggèrent qu’en plus de permettre l’identité EPI, des cellules de l’EPI exprimant le facteur
Nanog sécrètent un facteur permettant l’expression de Gata4 dans les cellules de l’EP. Ce facteur
serait le produit du gène Fgf4. FGF4 serait sécrété par les cellules de l’EPI, qui sont Nanog+, et il
agirait via le récepteur FGFR2 exprimé sur les cellules de l’EP qui sont Gata4+ (Goldin et al. 2003).
Ainsi l’initiation de la différenciation vers l’EPI ou l’EP serait dépendante de la voie FGF/MAP Kinase
(Yamanaka et al. 2010) (Figure 1.1E).
Au stade blastocyste tardif, on distingue donc trois lignées cellulaires qui sont l’épiblaste
(EPI), qui permet la mise en place des tissus embryonnaires, le trophectoderme (TE) qui permet la
mise en place du placenta et l’endoderme primitif (EP), qui permet la mise en place du sac vitellin. À
partir de ce stade, l’embryon subit des changements morphologiques majeurs qui faciliteront sa
synchronisation avec l’utérus, permettant une bonne implantation.
10
1.1.2 L’implantation
L’implantation est une étape du développement spécifique aux mammifères placentaires.
Elle correspond au moment de nidation où l’embryon et l’utérus fusionnent. L’implantation peut se
résumer en trois étapes : 1-Une maturation coordonnée entre le blastocyste et l’endomètre utérin, 2l’attachement du blastocyste et 3-l’invasion du tissu maternel par le trophectoderme (la déciduation)
(Figure 1.3A).
L’utérus passe d’un état pré-réceptif à un état réceptif permettant l’implantation du
blastocyste et la communication blastocyste-utérus : c’est la fenêtre d’implantation. Ce changement
d’état de réceptivité de l’utérus est régi par les hormones ovariennes : la progestérone (P4) ainsi que
l’œstrogène (E2). Chez la souris, il existe deux isoformes du récepteur à l’œstrogène (ESR1 (ERα) et
ESR2 (ERβ) et à la progestérone (PGRA et PGRB). Les études des souris invalidées pour chacune
des isoformes ont permis de mettre en évidence la fonction spécifique de chacune. En effet, les
souris invalidées pour le gène Esr1 présentent un utérus hypoplasique et incapable de supporter
l’implantation tandis que l’invalidation du gène Esr2 permet de supporter l’implantation (Lubahn et al.
1993). En outre, l’invalidation du gène Pgr chez la souris entraîne la perte des deux isoformes du
récepteur à la progestérone et l’apparition de défauts utérins majeurs menant à l’infertilité (Lydon et
al. 1995). Ces observations indiquent un rôle essentiel de ces deux isoformes à l’action de la
progestérone sur l’utérus (Mulac-Jericevic et al. 2000). Un des intermédiaires de l’action de
l’œstrogène sur la fenêtre d’implantation est la cytokine de la famille interleukin-6 : LIF (Leukaemia
inhibitory factor). La cytokine LIF est nécessaire à la réceptivité utérine ainsi qu’à l’implantation
puisqu’un utérus dépourvu de LIF ne permet pas l’implantation (Stewart et al. 1992). Des données
suggèrent que la cytokine LIF régule l’expression du récepteur de EGF, HB-EGF (Heparin binding
EGF). En effet, les souris Lif-/- n’expriment pas HB-EGF et ont une expression aberrante de COX2
(Cyclooxygenase 2), l’un des effecteurs de HB-EGF (Song et al. 2000). Il a été montré que la
synthèse de prostaglandine (PGl2) est régulée par Cox2 et est indispensable pour l’implantation par
son action sur le gène Pparγ (Lim et al. 1999) (Figure 1.3B). La voie de signalisation permettant une
coordination optimale entre l’embryon et l’utérus est la voie Wnt/β-caténine. Cette voie est activée au
site d’implantation et son activation requiert la présence de l’embryon ainsi que des hormones
ovariennes. Enfin, la cytokine LIF est essentielle à l’activation de la voie Wnt (Mohamed et al. 2005).
Ainsi, pour que l’implantation ait lieu, plusieurs facteurs sont impliqués : les hormones ovariennes, les
cytokines ainsi que la voie de signalisation canonique Wnt/β-caténine.
11
Figure 1.3 : Illustration de l’implantation et des mécanismes impliqués
(A) Après la fécondation, l’œuf commence ses premières divisions cellulaires et se déplace pour
atteindre l’utérus. Pour que l’implantation ait lieu l’œuf et l’utérus doivent avoir une maturation
coordonnée : l’utérus passe d’un état pré-réceptif à un état réceptif alors que l’œuf éclot de la zone
pellucide. Le blastocyste peut alors s’attacher à l’utérus ce qui active la déciduation. (B) Régulation
de la fenêtre d’implantation par les hormones ovariennes ainsi que par la cytokine LIF.
Inspirée de Wang and Dey, Nature, 2006 et Zhang et al, Molecular Aspect of Medecine, 2013.
12
13
Pendant que l’utérus devient réceptif permettant une implantation optimale, le blastocyste
« s’active ». Cette étape commence par son éclosion de la zona pellucida. Une fois qu’il est éclos, on
distingue dans le blastocyste : l’épiblaste, l’endoderme primitif, le trophectoderme polaire (le plus
proche des CMI) et le trophectoderme mural (le plus éloigné des CMI) (Figure 1.3B). Le
trophectoderme polaire continue de proliférer et engendre l’ectoderme extraembryonnaire et le cône
ecto-placentaire, tandis que le trophectoderme mural cesse de proliférer mais continue à répliquer
son ADN (endoréplication) et devient polyploïde générant les cellules trophoblastiques géantes
primaires (Figure 1.4). Les cellules épithéliales du trophectoderme vont exprimer des molécules
adhésives comme les lectines et subir des changements morphologiques menant à l’apparition de
protusions apicales au trophectoderme mural, ce qui permet le ralentissement du blastocyste à son
arrivée au site d’implantation dans l’utérus. Chez la souris, le blastocyste s’attache du côté du
trophectoderme mural. Lorsque le blastocyste est attaché au site d’implantation, les parois de l’utérus
se rapprochent. Les cellules du stroma utérin sont stimulées, prolifèrent et se différencient en une
structure appelée la décidua. Les cellules de l’épithélium utérin meurent par apoptose, la lame basale
est détruite et les cellules du trophoblaste envahissent le stroma utérin. L’implantation terminée (à
E5.5), on distingue quatre éléments qui constituent l’embryon : le cône ectoplacentaire (CEP),
l’ectoderme extraembryonnaire (EEx), l’épiblaste (Epi) (aussi appelé ectoderme primitif) et
l’endoderme viscéral (EV), entouré par les cellules trophoblastiques géantes (Figure 1.4).
1.1.3 La gastrulation
Quelque soit l’organisme, la gastrulation mène à l’émergence du plan corporel ainsi que la
mise en place des trois feuillets embryonnaires : l’endoderme, l’ectoderme et le mésoderme. Les
cellules de chacun de ces trois feuillets vont donner naissance à des organes, des structures et des
systèmes spécifiques présents chez l’individu adulte. L’ectoderme est le feuillet extérieur de
l’embryon en développement et donne la portion extérieure de la peau, les oreilles, les poils ainsi que
le système nerveux. L’endoderme est le feuillet interne qui donne l’épithélium pulmonaire, et celui
des organes digestifs, du foie et du pancréas. Le mésoderme est le feuillet intermédiaire qui se
trouve entre l’ectoderme et l’endoderme. Le mésoderme donne naissance à tout ce qui se trouve
entre la peau et l’épithélium, à savoir les os, le cartilage, les trois types de muscles (muscle
cardiaque, muscles lisses et muscles squelettiques), l’appareil cardio-vasculaire et l’appareil
reproducteur.
14
Au début de la gastrulation, l’embryon est formé de trois couches cellulaires distinctes :
l’épiblaste (Epi), l’endoderme viscéral et pariétal (EV), qui enveloppe l’embryon, et le trophectoderme
(constitué de l’ectoderme extraembryonnaire et du cône ectoplacentaire). Les cellules de l’épiblaste
ont un fort taux de prolifération comparativement aux cellules de l’endoderme viscéral. Cette
prolifération mène à la formation de l’embryon en « egg cylinder ». À E6.0, on distingue l’axe
proximo-distal. Du côté distal de l’embryon, les cellules de l’endoderme viscéral distal (EVD) vont se
séparer et migrer vers le futur côté antérieur de l’embryon formant ainsi l’endoderme viscéral
antérieur (EVA) (Figure 1.4). Ces cellules vont se différencier de l’endoderme viscéral car elles
expriment le facteur Hex1. Les voies de signalisation NODAL, BMP et WNT sont impliquées dans la
formation ainsi que le mouvement des cellules de l’EVD (Rossant et al. 2009). À E6.5, un bris
localisé va se produire à la jonction de l’ectoderme extraembryonnaire et de l’épiblaste. Ce bris
détermine le côté postérieur de l’embryon. Au niveau du bris, les cellules de l’épiblaste vont se
délaminer et la région où les cellules se délaminent est appelée ligne primitive (Figure 1.4). La ligne
primitive est marquée par l’expression des gènes Brachyury, Nodal ainsi que Wnt3. Ce sont trois
facteurs dont l’expression est inhibée dans l’EVA. Une fois la ligne primitive formée, les cellules
délaminées vont migrer le long de l’épiblaste et former le mésoderme, entre l’épiblaste et
l’endoderme viscéral.
La gastrulation se poursuit avec la formation du nœud ainsi que la mise en place de la
notochorde.
1.2 Le développement du tissu extraembryonnaire : le placenta
Le placenta est le premier organe qui se forme pendant le développement. C’est un organe
qui constitue l’interface entre l’environnement maternel et l’environnement fœtal. Il est essentiel pour
la survie de l’embryon car il permet les échanges de nutriments, de gaz ainsi que de déchets entre
l’embryon et la mère. C’est un organe producteur d’hormones qui fournit une barrière hématoplacentaire qui protège le fœtus contre le système immunitaire maternel (Rawn et al. 2008). Le
placenta est un organe dont l’origine est multiple. Les cellules qui constituent principalement le
placenta sont d’origine trophoblastique. La lignée trophoblastique est la première lignée cellulaire à
se différencier pendant les stades précoces du développement.
Au jour E7.5, pendant que le développement se poursuit, les cellules de l’ectoderme
extraembryonnaire vont former l’épithélium chorionique et les cellules du mésoderme vont donner
lieu à l’allantoïde (Figure 1.5A). Chez les rongeurs, la zone d’échanges entre les circulations
15
Figure 1.4 : Représentation schématique du développement des tissus embryonnaires de
l’implantation à la gastrulation
Une fois que l’embryon a éclos de la zone pellucide (E4.5) on distingue l’épiblaste (Epi), l’endoderme
primitif (EP), le trophectoderme polaire (TEP) (le plus proche des CMI) et le trophectoderme mural
(TEM) (le plus éloigné des CMI). Une fois l’implantation terminée (à E5.5), on distingue quatre
éléments qui constituent l’embryon : le cône ectoplacentaire (CEP), l’ectoderme extraembryonnaire
(EEx), l’épiblaste (Epi) (aussi appelé ectoderme primitif) et l’endoderme viscéral (EV), entouré par les
cellules trophoblastiques géantes. À E6.0, on distingue l’axe proximo-distal. Du côté distal de
l’embryon, les cellules de l’endoderme viscéral distal (EVD) vont se distinguer et migrer vers le futur
côté antérieur de l’embryon et former ainsi l’endoderme viscéral antérieur (EVA). À E6.5, c’est le
début de la gastrulation et on distingue la ligne primitive qui commence à se délaminer.
Inspirée de Rossant et Tam, Development, 2009.
16
17
Figure 1.5 : De la gastrulation au développement du placenta
(A) À E7.5 pendant que le développement embryonnaire se poursuit, les cellules de l’ectoderme
extraembryonnaire vont produire le chorion alors que les cellules du mésoderme vont générer
l’allantoïde. (B) À E8.5, l’allantoïde fusionne avec le chorion et continue sa ramification dans le
chorion. (C) Plusieurs gènes sont impliqués dans les étapes majeures de développement du
placenta. Les gènes Vcam (Vascular Cell-Adhesion Molecule 1) ainsi que Itga4 (Integrin alpha4) sont
impliqué dans la fusion chorio-allantoïde. Le gène Gcm1 (Glial Cell Missing-1) a un rôle prédominant
dans l’initiation de la ramification du labyrinthe. La voie de signalisation ERK/MAPK est essentielle
pour la ramification du labyrinthe.
Inspirée de Rossant et Cross, Nature, 2001.
18
19
maternelle et fœtale est appelée labyrinthe. Le labyrinthe est séparé du tissu maternel (decidua) par
les spongiotrophoblastes et les trophoblastes géants secondaires qui dérivent du cône
ectoplacentaire. Dans la région du labyrinthe, le mésenchyme ainsi que les vaisseaux sanguins
dérivent du mésoderme allantoïde tandis que les différents types de trophoblastes dérivent des
cellules trophoblastiques du chorion. Les cellules trophoblastiques forment trois couches différentes
qui séparent la circulation maternelle de la circulation fœtale. Les cellules qui juxtaposent les sinus
maternels sont les trophoblastes mononucléés sinusoïdaux géants (S-TGC) qui ont une fonction
endocrine et forment une couche cellulaire fenestrée. Les syncytiotrophoblastes de type I et de type
II (SynT-I – SynT-II) sont des cellules post-mitotiques multinucléées, formées par fusion cellulaire.
Elles forment un épithelium possédant une fonction de transport ; elles sont adjacentes aux S-TGC et
sont bordées de l’autre côté par des cellules endothéliales d’origine fœtale qui forment la circulation
fœtale (Watson et al. 2005) (Figure 1.6). Les cellules endiothéliales fœtales et les
syncytiotrophoblastes de type I et II séparant la circulation fœtale de la circulation maternelle
constituent la barrière hémato-placentaire.
La vascularisation du placenta se fait via l’invasion de la région du labyrinthe par les
syncytiotrophoblastes. L’invasion commence seulement après la fusion de l’allantoïde avec
l’épithélium chorionique à E8.5 (Figure 1.5B). L’analyse des souris invalidées pour différents gènes a
permis de mettre en évidence l’importance de ces gènes dans la fusion chorio-allantoïde ainsi que
dans la ramification du labyrinthe. Par exemple, la perte de fonction des gènes Vcam1 (Vascular
Cell-Adhesion Molecule 1) ainsi que Itga4 (Integrin alpha 4) entraîne des défauts de fusion chorioallantoïde et/ou des défauts du labyrinthe, montrant leur importance dans ces fonctions (Gurtner et
al. 1995; Kwee et al. 1995; Yang et al. 1995). VCAM1 est une glyco-protéine membranaire; elle a
une fonction d’adhésion cellulaire et est exprimée à l’extrémité de l’allantoïde. Elle va se lier à une
autre protéine impliquée dans l’adhésion cellulaire, ITGA4, exprimée dans le chorion. La liaison de
ces deux facteurs serait, parmi d’autres facteurs, à la base de la fusion chorio-allantoïde (Figure
1.5C). Après la fusion, l’initiation de la ramification du labyrinthe va suivre. Le gène Gcm1 (Glial Cell
Missing-1) est essentiel pour l’initiation de la ramification ainsi que pour la différenciation des
syncytiotrophoblastes. À E8.5, le gène Gcm1 est exprimé de manière ponctuelle dans le chorion. Les
cellules qui expriment Gcm1 sont celles qui vont initier l’invasion du chorion et la ramification du
labyrinthe. Tout au long de la ramification du labyrinthe, Gcm1 est exprimé à l’extrémité des
branches en cours de ramification (Figure 1.5C) et son expression diminue à E15.5, lorsque la
20
croissance du labyrinthe cesse (Basyuk et al. 1999). Les souris invalidées pour le gène Gcm1 se
développent normalement jusqu’à E9.5. À E10.5, les souris mutantes sont plus petites et ne
survivent pas après cet âge. Les placentas des souris Gcm1-/- ne forment pas de ramification du
labyrinthe, les cellules trophoblastiques chorioniques ne fusionnent pas et ne forment pas de
syncytiotrophoblastes, suggérant le rôle essentiel de Gcm1 dans l’initiation de la ramification ainsi
que la différenciation des syncytiotrophoblastes (Anson-Cartwright et al. 2000). La fusion des
trophoblastes en couches de syncytiotrophoblastes est l’un des évènements les plus importants
durant la placentogénèse. Les mécanismes sous-jacents à cette fusion des trophoblastes en
syncytiotrophoblastes de type I et de type II sont régulés par deux gènes fusogènes, syncytine-A et
syncytine-B, respectivement, vestiges d’une infection rétrovirale ancestrale (Dupressoir et al. 2005).
En effet, les souris Syna-/- présentent une mortalité embryonnaire entre E11.5 et E13.5 avec des
défauts de fusion de cellules trophoblastiques incapables de former des syncytiums (Dupressoir et al.
2009). Les souris Synb-/- survivent mais présentent un défaut de croissance in utero accompagné de
défauts de vascularisation du placenta. Les doubles mutants Syna-/- Synb-/- meurent à E9.5 suite à
des défauts de fusion des syncytiotrophoblastes, prouvant l’implication de ces deux gènes dans la
fusion des syncytiotrophoblastes (Dupressoir et al. 2011). De plus, l’interaction entre les SynT-I et les
SynTII semble essentielle pour la formation du placenta car l’ablation des SynT-II perturbe la fusion
des SynTI ainsi que la formation du placenta (Hernandez-Verdun 1974; Anson-Cartwright et al. 2000;
Nadeau et al. 2014). Une fois la ramification amorcée, plusieurs voies de signalisation sont
impliquées dans la régulation de la ramification. La signalisation passant par les récepteurs tyrosine
kinase (RTK) menant à l’activation de la voie Ras/MAPK a été décrite comme étant essentielle pour
l’efficacité de la ramification du labyrinthe. Parmi eux, les récepteurs LIFR (leukemia inhibitory factor
receptor), EGFR (epidermal growth factor), MET (hepatocyte growth factor receptor) ainsi que
FGFR2 (fibroblast growth factor receptor 2) ont été associés à la ramification du labyrinthe car leur
invalidation chez la souris entraîne une mortalité embryonnaire causée par des défauts de
développement du labyrinthe (Threadgill et al. 1995; Uehara et al. 1995; Ware et al. 1995; Xu et al.
1998) (Figure 1.5C).
1.2.1 Voie ERK/MAPK dans le développement des tissus extraembryonnaires
Le développement du placenta ainsi que son bon fonctionnement sont assurés, entre autres,
par la voie de signalisation ERK/MAPK. En effet, plusieurs études se basant sur l’analyse des souris
21
Figure 1.6 : Structure du placenta de la souris : organisation des différentes couches cellulaires de la
région du labyrinthe
(A) Représentation schématique du placenta de souris (panneau de gauche) et coupe histologique
d’un placenta d’un embryon au 12,5e jour de gestation (panneau de droite). La ligne pointillée sépare
les parties maternelle et embryonnaire. (B) Schéma de l’organisation de la triple couche de
trophoblastes et de l’endothélium foetal dans la région du labyrinthe permettant la formation de la
barrière hémato-placentaire (panneau de gauche). Visualisation de la double couche de
syncytiotrophoblastes par immunofluorescence avec des anticorps contre les transporteurs de
monocarboxylate MCT1 (en rouge) et MCT4 (en vert) (panneau de droite).
Figure extraite de l’article Nadeau et al, Med Sci, 2012.
22
23
invalidées pour des gènes associés à la voie de signalisation ERK/MAPK, tels que Grb2, Gab1,
Sos1, B-raf, Mek1 et Erk2 confirment l’importance de cette voie dans l’invasion du labyrinthe par le
mésoderme allantoïde. Toutes ces souris mutantes ont comme point commun un labyrinthe réduit et
les circulations maternelle et fœtale séparées, entraînant une diminution des échanges gazeux et de
nutriments causant la mort embryonnaire (Giroux et al. 1999; Itoh et al. 2000; Qian et al. 2000;
Saxton et al. 2001; Hatano et al. 2003; Galabova-Kovacs et al. 2006; Saba-El-Leil et al. 2016).
Le placenta est un organe mixte. Dans la région du labyrinthe, essentielle pour sa fonction
principale de zone d’échanges fœto-maternels, résident les érythrocytes maternels, les érythrocytes
fœtaux, les cellules endothéliales, les trophoblastes mononucléés sinusoïdaux géants (S-TGC) ainsi
que les syncitiotrophoblastes de type I et de type II (SynT-I – SynT-II). Les défauts d’invasion du
mésoderme allantoïde peuvent être dus à des défauts de chacun de ces types cellulaires. En 2006,
au laboratoire, Bissonauth et al, par l’analyse des mutants Mek1-/-, ont mis en évidence que l’hypovascularisation du labyrinthe observée chez les Mek1-/- n’est pas due à un défaut d’angiogenèse. Ils
ont aussi montré que l’initiation de la ramification se fait correctement, lorsqu’analysée par
l’expression du gène Gcm1, et que la différenciation des syncytiotrophoblastes n’est pas affectée,
mais que ceux-ci sont incapables d’envahir le chorion. Ces données suggèrent que la voie
ERK/MAPK passant par MEK1 n’est pas requise pour la différenciation des syncytiotrophoblastes,
mais est nécessaire pour leur ramification dans le labyrinthe (Bissonauth et al. 2006). Il est suggéré
que l’invasion du chorion par le mésoderme allantoïde est guidée par les cellules ayant quitté le cycle
cellulaire et exprimant le gène Gcm1. Ces cellules s’allongeraient, fusionneraient, généreraient les
SynT-II et l’espace nécessaire à la migration des vaisseaux embryonnaires à l’intérieur desquels les
érythrocytes fœtaux circulent (Cross et al. 2006). L’incapacité des cellules endothéliales à envahir le
chorion et à former des vaisseaux chez les Mek1-/- serait due à l’incapacité des SynT-II de migrer et
d’envahir la région du labyrinthe (Giroux et al. 1999). La voie ERK/MAPK serait donc nécessaire pour
la migration des SynT-II. Par ailleurs, il est difficile de valider cette hypothèse car les expériences in
vitro sur la migration cellulaire (« scratch test » ou chambre de Boyden) ne peuvent se faire avec des
cellules post-mitotiques car les conditions de culture sont encore inconnus. La même équipe a
montré, à l’aide de la délétion conditionnelle de Mek1 dans les tissus embryonnaires, que le gène
Mek1 est essentiel uniquement pour le développent du placenta (Bissonauth et al. 2006).
Les embryons invalidées pour le gène Mek1 meurent à mi-gestation, alors que les souris
Mek2-/- ne présentent aucun phénotype apparent (Belanger et al. 2003), suggérant l’incapacité de
24
Mek2 pour compenser l’absence de Mek1 dans les tissus extraembryonnaires, alors que Mek1 est
capable de compenser l’absence de Mek2. Cependant, la majorité des souris Mek1+/-Mek2+/- meurent
entre E14.5 et la naissance de défauts de développement du placenta avec une hypo-vascularisation
ainsi qu’une atrophie du labyrinthe. Ces données suggèrent que Mek1 n’est pas la seule kinase
importante pour le développement du placenta, mais que Mek2 participe aussi au développement et
à la morphogenèse du placenta. De plus, l’analyse des souris Mek2+/- auxquelles il manque un ou
deux allèle(s) de Mek1 développent une structure géante dans le labyrinthe appelée MTG
(Multinucleated Trophoblastic Giant cell). Ces cellules sont multi-nucléées, post-mitotiques, avec les
noyaux situés en périphérie, et dérivant des SynT-II positives pour Gcm1. La délétion conditionnelle
de Mek1 uniquement dans les cellules positives pour Gcm1 dans un environnement Mek2+/-, à l’aide
du transgène Gcm1-Cre, suffit à la formation de MTG. De plus, dans ces cellules MTG, la voie de
signalisation ERK/MAPK n’est pas activée, suggérant l’importance de la voie dans les SynTII
(Nadeau et al. 2009). En revanche, le phénotype de ces souris est moins sévère que celui des souris
Mek1+/-Mek2+/-, suggérant un rôle de la voie ERK/MAPK dans les autres tissus du placenta.
L’analyse du phénotype placentaire à l’aide de souris invalidées conditionnellement pour Mek1 dans
les SynT-II, le mésoderme allantoïde ainsi que les péricytes, dans un environnement Mek2+/-, avec
les souris Mek1+/flox Mek2+/- Tg+/Gcm1-Cre Tg+/Sox2-Cre, a permis de montrer que le niveau d’expression
des gènes Mek1 et Mek2, dans le mésoderme allantoïde et les tissus extraembryonnaires, est
essentiel à la formation et à la différenciation adéquates des SynT-II (Nadeau et al. 2009). Une
analyse plus poussée de l’origine des MTGs a mené à la conclusion que ceux-ci auraient une double
identité et seraient le résultat d’une fusion aberrante des SynT-I et SynT-II (Nadeau et al. 2014). Une
des fonctions des couches de syncytiotrophoblastes est d’assurer le transport directionnel entre la
circulation maternelle et la circulation fœtale. L’analyse chez les mutants combinés Mek1 Mek2 a
permis de montrer que la fusion aberrante des SynT-I et SynT-II résultant en la formation des MTGs
conduit à une perte de la polarité des couches de SynT. Cette perte de polarité est marquée par la
délocalisation de marqueurs apicaux des SynT comme PKCζ, MCT1 et GLUT1 ainsi que
l’accumulation de la forme inactive de YAP dans le cytoplasme des MTGs (Nadeau et al. 2014).
L’accumulation de MTG est aussi observée chez d’autres mutants de gènes impliqués dans
la voie ERK/MAPK, tels que B-raf, Lbp1a, Pparγ et Sos1/2, confirmant l’importance de cette voie de
signalisation dans les syncytiotrophoblastes (Kubota et al. 1999; Qian et al. 2000; Parekh et al. 2004;
Galabova-Kovacs et al. 2006).
25
1.3 Les voies de signalisation MAPK
Les voies de signalisation MAPK (Mitogen-activated protein kinase) sont des cascades
impliquées dans des processus cellulaires essentiels tels que la prolifération, la différenciation,
l’apoptose et la survie, processus importants lors du développement. Les voies de signalisation
MAPK ont été conservées tout au long de l’évolution. Ces cascades suivent le même schéma
d’activation par phosphorylation séquentielle de protéines kinases. Suite à une stimulation par
différents facteurs, tels que des facteurs de croissance, le stress, des cytokines ou des hormones, le
ligand se lie à son récepteur tyrosine kinase et active plusieurs paliers de kinases dont une kinase à
double spécificité (sérine/thréonine et tyrosine kinase). Le premier palier est constitué de MAPK
kinase kinases (MAPKKK). Celles-ci activent un deuxième palier de kinases les MAPK kinase
(MAPKK), qui à leur tour activent un troisième et dernier palier, les MAPK (Widmann et al. 1999). Les
MAPK sont constitués principalement d’un domaine kinase entouré d’extension en N- et C-terminal
de longueurs différentes. Les MAPK sont activées par une double phosphorylation sur des résidus
thréonine et tyrosine au sein d’un motif T-X-Y situé dans leur boucle d’activation. À ce jour, quatre
voies MAPK classiques, et trois voies MAPK atypiques ont été décrites. La voie c-Jun NH2-terminal
kinase (JNK)1-3, la voie p38α-β-γ-δ, la voie ERK5 et la voie ERK1/2 font partie des voies MAPK
classiques. Les voies ERK3/ERK, Nemo-like kinase (NLK) et ERK7 font partie des voies MAPK
atypiques (Morrison 2012).
1.3.1 La voie de signalisation c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 1-3
1.3.1.1 Propriétés de la voie JNK
La voie c-Jun NH2-terminale kinase (JNK), aussi connue sous le nom de SAPK (Stress
Activated Protein MAP Kinase), a été découverte au début des années 1990 (Pulverer et al. 1991).
Elle est activée principalement par des cytokines et par l’exposition à un stress environnemental
(Kyriakis et al. 2001).
1.3.1.2 Activation de la voie
Vingt MAPKKK ont été décrites, parmi lesquelles 14 activent la voie JNK (Cuevas et al.
2007). Selon le stimulus, ces 14 MAPKKK vont phosphoryler et activer, individuellement ou de
manière concertée, deux MAPKK : MKK4 (aussi connue sous le nom de SEK1) et MKK7/Map2k7
(Chen et al. 2002). Trois protéines kinases MKK4 ont été identifiées. Elles se différencient dans leur
région N-terminale, en raison d’un épissage alternatif. L’épissage alternatif du gène Mkk7 permet la
26
production de six protéines kinases qui se distinguent par leur région N-terminale ou C-terminale
(Tournier et al. 1999). Les protéines kinases MKK4 et MKK7 vont ensuite phosphoryler et activer les
MAPK JNK sur leur motif TPY (Thréonine-Proline-Tyrosine) (Figure 1.7A).
Les MAPK JNK sont codées par trois gènes Jnk1/Mapk8, Jnk2/Mapk9 et Jnk3/Mapk10.
L’expression de Jnk1 et Jnk2 est ubiquitaire alors que l’expression de Jnk3 est restreinte au cerveau,
au cœur et aux testicules. L’épissage alternatif de ces trois gènes mène à la traduction de dix
isoformes classés en deux groupes : les protéines JNK ayant une courte région carboxy-terminale et
les protéines JNK ayant une longue région carboxy-terminale, créant des isoformes de 46kDa et
55kDa respectivement (Gupta et al. 1996). Le rôle spécifique de ces variants d’épissage reste encore
mal compris.
1.3.1.3 Fonction biologique de la voie
L’étude des souris invalidées pour les gènes Jnk1, Jnk2 et Jnk3 a révélé le rôle de ces
kinases dans l’activation des cellules lymphocytaires T. Les souris mutantes simples Jnk1-/-, Jnk2-/- et
Jnk3-/- sont viables, fertiles et sans défaut apparent. L’analyse approfondie de ces mutants révèle
que les souris Jnk3-/- présentent une absence d’apoptose neuronale en réponse à un stress
excitotoxique (Yang et al. 1997). Les souris Jnk2-/- présentent un défaut dans la différenciation des
précurseurs de cellules lymphocytaires T-helper en cellules effectrices Th1 (Yang et al. 1998;
Sabapathy et al. 1999). Finalement, les souris Jnk1-/- présentent des défauts de différenciation des
lymphocytes T-helper (Dong et al. 1998; Constant et al. 2000). Ces données suggèrent un rôle de
Jnk3 dans l’apoptose neuronale induite par le stress ainsi qu’un rôle de Jnk1 et Jnk2 dans la
différenciation des lymphocytes T. L’étude des mutants combinés Jnk1/Jnk2, Jnk1/Jnk3 et Jnk2/Jnk3
a permis de mettre en évidence le rôle de Jnk1 et Jnk2 dans le développement précoce du cerveau.
En effet, aucun des mutants combinés Jnk1/Jnk3 et Jnk2/Jnk3 présente de défauts apparents mais
seuls les mutants Jnk1/Jnk2 meurent entre 11 et 12 jours de gestation. Ces mutants présentent une
exencéphalie et une diminution de l’apoptose dans la partie postérieure du cerveau et une
augmentation de l’apoptose dans la partie antérieure du cerveau. Ces données révèlent le rôle
essentiel de Jnk1 et Jnk2 dans la régulation de l’apoptose durant le développement du cerveau
(Kuan et al. 1999).
27
Figure 1.7 : Module d’activation des voies MAP Kinase
(A) Le module d’activation des MAPKs est constitué de trois paliers de kinases. Une MAPKKK, une
MAPKK et une MAPK. Il existe, à ce jour, quatre voies MAPK classiques (les voies JNK, p38, ERK5
et ERK1/2) et trois voies MAPK atypiques (les voie ERK3/4, ERK7/8 et NLK). (B) La voie de
signalisation ERK/MAPK est activée par différents stimuli tel que les facteurs de croissance (EGF,
FGF, PDGF). Après la liaison du ligand au récepteur tyrosine kinase, la protéine adaptatrice GRB2
est recrutée au récepteur. Elle se lie ensuite au facteur d’échanges GDP/GTD, SOS-1. SOS-1
permet le recrutement d’une protéine RAS activée en induisant l’échange du GDP par le GTP,
convertissant ainsi RAS dans sa forme active. RAS ainsi activée est capable de phosphoryler les
kinases MEK1 et MEK2. MEK1/2 activent ERK1/2 qui migrent au noyau et régulent l’expression de
plusieurs gènes impliqués dans la différenciation, la prolifération et la survie cellulaire.
Inspirée de Krens et al, FEBS, 2006 et Cuevas et al, Oncogene, 2007.
28
29
1.3.1.4 Substrats et gènes régulés par la voie
Les kinases JNK phosphorylent leurs cibles sur un motif Serine-Thréonine-Proline. Les
substrats connus des MAP kinases JNK sont des facteurs de transcription dont les plus étudiés
appartiennent au complexe AP-1 (Activator Protein-1). Le complexe AP-1 est composé d’homo ou
d’hétéro-dimères des protéines FOS (v-Fos, c-Fos, b-Fos, Fra-1 et Fra2), JUN (v-Jun, c-Jun, JunB et
JunD) ou ATF (Activating Transcription Factor) (ATF2, ATF3/LRF1 et B-ATF). Ces dimères
reconnaissent et lient un site consensus AP-1, aussi connu sous le nom de TRE (TPA responsive
element) ou un site CRE (cAMP-responsive element) ce qui permet la régulation de l’expression de
gènes possédant ce motif (Karin et al. 1997). La cible la plus étudiée des kinases JNK est c-Jun. Le
gène Jun code pour une protéine possédant dans sa région N-terminale un domaine d’activation
transcriptionnel, et dans sa région C-terminale, un domaine de liaison à l’ADN avec un motif leucinezipper basique (B-ZIP). La protéine c-Jun est un proto-oncogène essentiel pour le développement
embryonnaire. En effet, les souris invalidées pour le gène c-Jun meurent entre les jours
embryonnaires 11 et 13.5 (Hilberg et al. 1993; Johnson et al. 1993).
La phosphorylation de c-Jun par les kinases JNK entraîne une augmentation de la formation
d’homodimères c-Jun/c-Jun. Cette phosphorylation réduit l’ubiquitinylation de c-Jun et permet ainsi
sa stabilisation (Musti et al. 1997). Les kinases JNK régulent aussi deux partenaires de dimérisation
de c-Jun : Fos et ATF-2 et permettent l’augmentation et la stabilisation d’homo et hétérodimères. Par
conséquent, les kinases JNK ont la capacité d’activer des facteurs de transcription ainsi que de les
stabiliser, induisant un contrôle efficace des gènes cibles. Les gènes régulés par c-Jun sont
impliqués dans différents processus cellulaires, dont la régulation du cycle cellulaire et l’apoptose.
L’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) invalidées pour c-Jun a permis de mettre
en évidence son rôle dans le cycle cellulaire ainsi que son importance dans la progression de la
phase G1 du cycle. En effet, la prolifération des MEFs Jun-/- est arrêtée en début de phase G1 du
cycle cellulaire et elle est accompagnée par une diminution du transcrit ainsi que de la protéine
cycline D1, suggérant une régulation transcriptionnelle de la cycline D1 par c-Jun. L’expression
ectopique de la cycline D1 dans les MEFs Jun-/- restaure en partie le phénotype des MEFs Jun-/-. Ces
données suggèrent la cycline D1 comme étant une cible directe de c-Jun (Wisdom et al. 1999).
30
1.3.2 La voie de signalisation p38α-β-γ-δ
1.3.2.1 Propriétés de la voie p38
La kinase p38 a été mise en évidence par différents groupes au début des années 1990. Elle
a tout d’abord été identifiée comme étant une protéine de 38kDa phosphorylée en réponse à une
stimulation par l’endotoxine LPS (lipopolysaccharide) ainsi que par l’hyperosmolarité (Han et al.
1993; Han et al. 1994). Indépendamment, p38 a été caractérisée comme étant une molécule capable
de lier les dérivés pyridinyle imidazole responsables de l’inhibition de la biosynthèse de cytokines
pro-inflammatoires, comme l’IL-1 (interleukine 1) et le TNF (tumor necrosis factor). Elle est aussi
connue sous le nom de CSBP (cytokine suppressive anti-inflammatory drugs binding protein) (Lee et
al. 1994).
Chez les mammifères, quatre homologues de p38 ont été caractérisés : p38α, p38β (Jiang et
al. 1996), p38γ (ERK6/SAPK3/MAPK12) (Lechner et al. 1996) et p38δ (SAPK4/MAPK13) (Jiang et
al. 1997). p38α et p38β sont exprimés de manière ubiquitaire (Jiang et al. 1996), alors que
l’expression de p38γ et p38δ diffère selon les tissus. p38γ est exprimée de manière prédominante
dans le muscle squelettique (Lechner et al. 1996) et p38δ est enrichie dans les poumons, le rein, les
testicules, le pancréas et l’intestin grêle (Jiang et al. 1997).
1.3.2.2 Activation de la voie
La voie p38, comme la voie JNK, appartient à la famille des SAPK (Stress-Activated Protein
Kinase). L’activation de la voie p38 se fait en réponse à plusieurs stimuli liés au stress tel que les UV,
la température, le choc osmotique, les cytokines inflammatoires (IL-1 et TNF-α) ainsi que les facteurs
de croissance dont entre autres, FGF (fibroblast growth factor), VEGF (vascular endothelial growth
factor) et PDGF (platelet-derived growth factor). Les p38 sont activées sur leurs résidus thréonine et
tyrosine situés dans leur boucle d’activation TGY (Thréonine-Glycine-Tyrosine).
Plusieurs MAPKKK ont été décrites comme étant impliquées dans l’activation de la voie p38
parmi lesquelles MLK3/MAP3K11 (Tibbles et al. 1996), ASK1/MAP3K5 (Ichijo et al. 1997) et
TAK1/MAP3K7 (Moriguchi et al. 1996). Ces MAPKKK vont phosphoryler et activer trois ou quatre
MAP kinase kinases : MKK6 (ou MAPKK6/MAP2K6), MKK3/MAP2K3, MKK4 (ou SEK1/MAP2K4) et
MKK7/MAP2K7. Ces kinases sont aussi connues pour activer la voie JNK appartenant à la même
famille des SAPK (Stress-Activated Protein Kinase). Ces MAPKK vont ensuite activer les MAPK p38
en les phosphorylant sur leur motif TGY (Thr-Gly-Tyr) situé dans la boucle d’activation (Figure 1.7A).
31
1.3.2.3 Fonction biologique de la voie
L’étude des souris invalidées pour le gène p38α/Mapk14 a permis de mettre en évidence son
rôle au cours du développement embryonnaire. En effet, les souris p38α-/- meurent à mi-gestation de
défauts placentaires (Mudgett et al. 2000). Les placentas de ces souris présentent une réduction du
labyrinthe ainsi qu’une réduction des spongiotrophoblastes. Ces placentas présentent un défaut de
vascularisation de même qu’une apoptose augmentée. Les défauts de vascularisation sont aussi
observés dans l’embryon et le sac vitellin. Ces données suggèrent un rôle de p38α dans la
vascularisation du placenta ainsi que dans l’angiogenèse embryonnaire (Mudgett et al. 2000).
1.3.2.4 Substrats et gènes régulés par la voie
Les kinases p38α possèdent plusieurs substrats et régulent différents processus cellulaires
tels que l’inflammation, l’apoptose et le cycle cellulaire. Le premier substrat de p38α identifié est la
kinase MAPKAPK2 ou MK2 impliquée dans la régulation de la production des cytokines IL-6 et TNFα (Rouse et al. 1994; Kotlyarov et al. 1999). Cette activation permet la régulation de cytokines proinflammatoires ainsi que la régulation de facteurs impliqués dans l’inflammation tel que VCAM-1
(vascular cell adhesion molecule-1) (Pietersma et al. 1997). p38α a aussi été décrit comme étant
capable d’activer des facteurs de transcription tels que ATF1/2/6 (activating transcription factor 1/2/6)
et ELK1, associés à la régulation de gènes impliqués dans la survie cellulaire (Cuadrado et al. 2010).
Enfin, la voie p38 est affiliée à l’apoptose induite par FAS (Juo et al. 1997).
1.3.3 La voie de signalisation ERK5
1.3.3.1 Propriétés de la voie
La voie de signalisation ERK5/MAPK7 a été mise en évidence au début des années 1990 en
utilisant MEK5/MAP2K5 comme appât dans des expériences de double hybride (Zhou et al. 1995).
Ces expériences ont permis d’identifier ERK5 comme étant un partenaire de MEK5. De manière
concomitante, d’autres chercheurs ont identifié une protéine identique à ERK5 qu’ils ont appelée big
MAPK 1 (BMK1) (Lee et al. 1995). Cette voie de signalisation est impliquée dans différents
processus cellulaires tels que la survie, la signalisation anti-apoptotique, la différenciation et la
prolifération (Wang et al. 2006).
32
1.3.3.2 Activation de la voie
La voie ERK5 est activée par des facteurs de croissance (Kato et al. 1998), des cytokines
(Nakaoka et al. 2003) et le stress. Deux MAPKKK ont été décrites comme étant capables d’activer la
voie : MEKK2/MAP3K2 et MEKK3/MAP3K3. Ces deux kinases interagissent avec MEK5 permettant
son activation par phosphorylation (Chao et al. 1999; Sun et al. 2001) mais celles-ci ne lui sont pas
spécifiques car elles activent aussi les voies p38 et JNK. À ce jour, le seul substrat connu de MEK5
est ERK5. MEK5 possède deux variants d’épissage MEK5α (50kDa) et MEK5β (40kDa) différant
dans leur région N-terminale et dans leur efficacité de liaison avec ERK5. Il a été montré que MEK5α
est un meilleur activateur de ERK5 à cause de sa grande affinité pour ERK5 (English et al. 1995).
L’activation de ERK5 se fait par une double phosphorylation sur un motif TEY (Th-Glu-Tyr) (Figure
1.7A). Trois protéines ERK5, issues d’épissage alternatif, ont été identifiées : ERK5a, ERK5b et
ERK5c. Elles se différencient dans leur région N-terminale. Le rôle in vivo de ces variants d’épissage
n’a pas été encore élucidé (Yan et al. 2001).
1.3.3.3 Fonction biologique de la voie
L’étude des souris invalidées pour le gène Erk5/Mapk5 a permis de souligner son rôle au
cours du développement embryonnaire. En effet, les souris Erk5-/- meurent à mi-gestation de défauts
cardiovasculaires. Ces souris ont des défauts de maturation de la vascularisation, les cellules
endothéliales bordant les vaisseaux et le cœur étant désorganisées. Les mutants Erk5-/- présentent
un retard de développement du cœur ainsi qu’une angiogenèse perturbée dans l’embryon et dans les
structures extraembryonnaires, tels le sac vitellin et le placenta (Regan et al. 2002; Sohn et al. 2002;
Yan et al. 2003). La génération d’un mutant conditionnel Erk5 a permis d’éclairer son rôle au cours
du développement. En effet, l’invalidation de Erk5 dans les cellules endothéliales entraîne la mort à
mi-gestation avec un phénotype semblable à celui observé lorsque l’invalidation de Erk5 est totale.
Par contre, l’invalidation de Erk5 dans les cardiomyocytes n’affecte pas le développement cardiaque
et ne cause aucun phénotype apparent. Ces données suggèrent le rôle essentiel de Erk5 pour la
fonction des cellules endothéliales ainsi que pour le maintien de l’intégrité des vaisseaux sanguins
(Hayashi et al. 2004).
33
1.3.3.4 Substrats et gènes régulés par la voie
ERK5 régule des gènes impliqués dans différents processus cellulaires tels que la
prolifération cellulaire (Myc, CyclineD1/Ccnd1), l’apoptose (Foxo3, Mef2c) et la transition épithéliomésenchymateuse (Zeb1, Snai2) (Drew et al. 2012).
1.3.4 Les voies MAPK atypiques
1.3.4.1 ERK3 et ERK4
La kinase ERK3/MAPK6 a été identifiée en 1991 par recherche d’homologie de séquence
avec ERK1 lors d’un criblage génétique de banque d’ADNc de cerveau de rat (Boulton et al. 1991).
Quelques années plus tard, les orthologues chez la souris et chez l’humain ont été clonés. L’analyse
de ces orthologues a permis de mettre en évidence la présence d’un grand domaine C-terminal,
comparativement aux kinases ERK1/2, produisant une protéine d’environ 100 kDa. De la même
manière, ERK4/MAPK4 a été mise en évidence chez le rat et l’humain (Gonzalez et al. 1992; Garcia
et al. 1996). Malgré la grande similarité entre ces deux kinases et ERK1, ERK3/4 ont une structure
unique qui se différencie des autres MAPK. En effet, elles possèdent un grand domaine C-terminal et
le motif T-X-Y conservé chez les autres kinases est substitué par un motif serine-acide glutamiqueglycine (S-E-G) (Coulombe et al. 2007) (Figure 1.7A). Le domaine C-terminal est conservé durant
l’évolution, suggérant une fonction importante. Mais celle-ci n’est pas encore claire et un rôle a été
suggéré dans le ciblage cellulaire (Cargnello et al. 2011). L’expression de ERK3 est ubiquitaire tandis
que celle de ERK4 est restreinte à certains organes (cerveau, colon, yeux, reins, poumons, ovaires,
pancréas, placenta, prostate et peau) (Coulombe et al. 2007).
Le mécanisme de régulation des kinases ERK3 et ERK4 est peu connu. Il a été montré que
ERK3 et ERK4 possèdent deux sérines dans leur boucle d’activation (Ser189/Ser186) phosphorylées
in vivo. Les kinases responsables de cette phosphorylation sont les kinases du groupe I des
protéines PAKs (p21-activated kinases). Cette phosphorylation entraîne l’activation de ERK3/4 et
ainsi l’activation de leur substrat MK5 (Deleris et al. 2011). Cependant, la fonction exacte de ERK3/4
n’est pas connue.
ERK3 est une kinase qui est essentielle au cours du développement embryonnaire. En effet,
les souris invalidées pour le gène Erk3 ont un défaut de croissance intra-utérine. Les souris Erk3-/meurent de détresse respiratoire peu après la naissance et présentent une hypoplasie pulmonaire
(Klinger et al. 2009). Contrairement à ERK3, ERK4 ne semble pas être essentielle à la survie. En
34
effet, les souris invalidées pour le gène Erk4 sont viables, fertiles et ne présentent aucune anomalie.
De plus, la perte de Erk4 dans un contexte mutant pour Erk3 (Erk3-/- Erk4-/-) n’aggrave ni le retard de
croissance in utero, ni le phénotype pulmonaires des souris Erk3-/-, suggérant ces deux kinases ont
des fonctions qui ne sont pas redondantes dans ces tissus (Rousseau et al. 2010).
1.3.4.2 Nem-like kinase (NLK)
La Nemo-like Kinase a été identifiée chez Drosophila melanogaster en 1994 et nommée
nemo (Choi et al. 1994). La mutation du gène nemo cause, chez cette mouche, une viabilité réduite
et des défauts de rotation des cellules photoréceptrices de l’œil. En se basant sur sa grande
homologie de séquence (37 à 40 %) avec les kinases de la famille ERK/MAPKs, nemo a été classée
dans cette famille de kinases. Ce n’est que quatre années plus tard, en 1998 que son homologue a
été mis en évidence chez les vertébrés (Brott et al. 1998).
L’analyse de la séquence de la kinase NLK révèle une conservation du domaine kinase et la
substitution du motif de phosphorylation conservé des kinases conventionnelles, T-X-Y, par un motif
thréonine-glutamine-acide glutamique (T-Q-E). De plus NLK possède en N-terminal un domaine non
conservé riche en alanine-histidine-glutamine (A-H-Q). La fonction de ce domaine n’est pas connue.
Plusieurs études tendent à montrer que la thréonine 286 (Thr286) présente dans la boucle
d’activation est essentielle pour l’autophosphorylation et l’activité de NLK (Kanei-Ishii et al. 2004).
L’activateur le plus connu de NKL est le ligand de la voie Wnt, WNT-1. WNT-1 active la kinase NLK
en passant par l’activation de la MAPKKK TGF-beta-activated kinase 1 (TAK1) en association avec
sa sous-unité régulatrice TAK1 binding protein 1 (TAB1). Celles-ci activent la kinase homeodomaininteracting protein kinase (HIPK2) qui, à son tour, phosphoryle NLK (Figure 1.7A). Les substrats
connus à ce jour de la kinase NLK sont des facteurs de transcription de la famille des T-cell
factor/lymphoïd enhancer factor (TCF/LEF), impliqué dans la voie β-caténine (Ishitani et al. 1999),
ainsi que le proto-oncogène c-Myb (Kanei-Ishii et al. 2004).
L’expression de NLK est ubiquitaire, avec une prédominance dans le cerveau ainsi que les
organes lymphoïdes. Les souris invalidées pour le gène Nlk présentent un phénotype variable selon
le fond génétique. L’absence de Nlk chez des souris C57BL/6 entraîne une mort embryonnaire,
tandis que l’absence de nlk chez des souris 129/Sv permet la survie des souris jusqu’à 4 à 6
semaines. Par contre, ces souris ont un retard de croissance, des défauts neurologiques ainsi qu’une
35
différenciation aberrante des cellules stromales de la moelle épinière (Kortenjann et al. 2001),
montrant l’importance du gène Nlk pour la survie.
1.3.4.3 ERK7
La kinase ERK7/MAPK15 a été identifiée chez le rat en 1999 en raison de sa similarité de
séquence avec le domaine kinase de ERK1 (Abe et al. 1999). Ce n’est que trois années plus tard
que le même groupe a mis en évidence l’orthologue chez l’humain, ce dernier partage 69 % d’acides
aminés avec ERK7, qu’ils ont appelé ERK8 (Abe et al. 2002). L’analyse des orthologues a permis de
mettre en évidence la présence d’un grand domaine C-terminal, responsable de la localisation
cellulaire, ainsi que la présence du motif TEY (Thr-Gln-Tyr) (Figure 1.7A).
Le mécanisme d’activation d’ERK7 n’est pas connu à ce jour. La présence du motif TEY
dans leur domaine d’activation suggère qu’il existe une MAPKK responsable de son activation. Des
études montrent qu’ERK7 ne répond à aucun stimulus des voies MAPK classiques et indiquent que
ces sites sont autophosphorylés de manière constitutive (Abe et al. 2001), tandis que ERK8 répond à
certains stimuli de la voie classique MAPK qui promeuvent sa phosphorylation (Abe et al. 2002).
La fonction biologique de ERK7 et ERK8 n’est pas connue à ce jour. Aucune souris invalidée
pour le gène Erk7 n’a été répertoriée. Des substrats de la voie, tels que la Myelin Basic Protein
(MBP), ont été mis en évidence, in vitro, et permettent de lier les kinases ERK7 et ERK8 à la
régulation de la prolifération cellulaire (Abe et al. 1999).
1.4 La voie de signalisation ERK/MAPK classique
La voie ERK/MAPK est la première voie de signalisation MAPK caractérisée. C’est une voie
de signalisation hautement conservée de la levure à l’homme, reflétant son importance dans
plusieurs processus cellulaires. Elle a été mise en évidence en 1990 par Boulton et ses
collaborateurs, qui s’intéressaient à la réponse cellulaire suite à la phosphorylation d’un récepteur
tyrosine kinase qui entraîne l’activation de sérine/thréonine protéine kinases. La mise en évidence de
l’activité sérine/thréonine kinase de ERK1/2 a été faite par leur capacité à phosphoryler la
Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) ainsi que la Myelin Basic Protein (MBP) (Boulton et al.
1991). Chez les mammifères, cette voie de signalisation permet la régulation de différents acteurs
impliqués dans la différenciation, la prolifération ainsi que la survie cellulaires (Shaul et al. 2007).
36
1.4.1 Activation de la voie
Comme toutes les voies MAPK, la voie ERK/MAPK est activée par différents stimuli, tels que
le stress, des cytokines et des facteurs de croissance, ce qui entraîne une réponse cellulaire suite à
la succession des trois paliers d’activation. Les ligands activant la voie vont se lier à un récepteur
tyrosine kinase. Les principaux récepteurs impliqués dans l’activation de la voie ERK/MAPK sont le
récepteur de EGF : EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), les récepteurs de FGF : FGFR
(Fibroblast Growth Factor Receptor) et les récepteurs de PDGF : PDGFR (Platelet Derived Growth
Factor Receptor). La liaison du ligand à son récepteur entraîne l’activation de ce dernier. À l’état
activé, le récepteur est sous forme dimérique (homo ou hétérodimérique). Cette dimérisation permet
l’activation de l’activité tyrosine kinase du récepteur par autophosphorylation. Une fois activé, le
récepteur recrute la protéine à domaine SH2 (Src homology domain 2), GRB2 (Growth factor
Receptor-Bound protein 2) et permet l’interaction avec SOS-1 (Son Of Sevenless homolog 1) un
facteur d’échange GDP/GTP de la petite protéine G RAS. SOS-1 permet le recrutement d’une
protéine RAS activée en induisant l’échange du GDP par le GTP, convertissant ainsi RAS dans sa
forme active. RAS activée est alors capable d’activer plusieurs voies de signalisation dont la
signalisation AKT et la signalisation ERK/MAPK.
La famille RAS compte trois membres principaux, HRAS, NRAS et KRAS, impliqués dans
l’activation de la voie ERK/MAPK (Buday et al. 1993). Les membres de la famille RAS sont
principalement étudiés pour leur rôle oncogénique. L’étude des souris inactivées pour chacun des
membres de la famille a permis de mettre en évidence l’importance de Kras dans le développement
embryonnaire. En effet, seules les souris inactivées pour Kras présentent un retard de
développement, des défauts de vascularisation, des défauts hépatiques et une mortalité dès E12.5
(Johnson et al. 1997). Les souris invalidées pour Hras et Nras, individuellement ou en combinaison,
ne présentent aucun phénotype apparent (Esteban et al. 2001), ce qui suggère leur rôle non
essentiel dans le développement chez la souris ainsi que la capacité pour KRAS de palier à
l’absence de Hras et de Nras. La mutation de Kras dans un contexte nul pour Nras (Kras+/- Nras-/-)
entraîne une mortalité plus précoce (entre E10.2 et E12.5), suggérant que ces deux gènes ont des
fonctions similaires avec un rôle majeur de KRAS dans le développement embryonnaire (Johnson et
al. 1997).
37
1.4.2 Les MAPKKKs RAF
Les protéines kinases RAFs sont conservées au cours de l’évolution et englobent, chez les
vertébrés, trois protéines codées par trois gènes : a-Raf, b-Raf et c-Raf/Raf-1. Ces trois protéines
partagent trois régions conservées CR1, CR2 et CR3 (Wellbrock et al. 2004). Le domaine CR1
contient un domaine de liaison à Ras (Ras Binding Domain RBD) et un domaine riche en cystéine
(Cystein Rich Domain CRD), tous deux importants pour le recrutement de RAF par RAS à la
membrane plasmique. C-RAF/RAF-1 est la première kinase à être étudiée pour son implication dans
l’activation de la voie ERK/MAPK. Dans des cellules non stimulées, la phosphorylation sur sa sérine
259 permet à C-Raf d’être séquestrée dans le cytoplasme par les protéines 14-3-3. Après stimulation
par des facteurs de croissances, la sérine 259 est déphosphorylée permettant la liaison de C-Raf à
RAS et ainsi son recrutement à la membrane plasmique (Dhillon et al. 2002). Une fois recrutée à la
membrane, C-Raf sera activée et phosphorylée sur ces deux sites essentiels pour son activité, la
sérine 338 et la tyrosine 341 (Mason et al. 1999). Les kinases de la famille SRC semblent être
responsables de la phosphorylation de la tyrosine 341. La phosphorylation sur la sérine 338 semble
être effectuée par les kinases de la famille PAK (Zang et al. 2002).
La compréhension du rôle des membres de la famille Raf a été rendue possible grâce à la
génération de souris invalidées pour ces différents gènes. L’inactivation de Araf chez la souris
entraîne une mortalité embryonnaire dépendant du fond génétique. En effet, dans un fond génétique
C57Bl/6, les souris A-Raf-/- meurent entre 7 et 21 jours après la naissance à cause d’anomalies
neurologiques et gastro-intestinales. Cette même mutation dans un fond génétique 129/OLA
n’entraîne pas de mortalité ni d’anomalies gastro-intestinales mais cause toutefois des anomalies
neurologiques (Pritchard et al. 1996). L’invalidation du gène Braf chez la souris entraîne une
mortalité embryonnaire entre les jours 10.5 et 12.5 de gestation en raison d’un retard de croissance
ainsi que des anomalies vasculaires causées par une mortalité excessive des cellules endothéliales
(Wojnowski et al. 1997). Ces données suggèrent que Araf et Braf sont indispensables au
développement de différents tissus. L’inactivation de Craf chez la souris entraîne aussi une mortalité
embryonnaire. Selon le fond génétique, les souris Craf-/- meurent à différents moments allant de
E10.5 (129) à P0 (CD1). Les souris survivant jusqu’à P0 présentent un défaut de croissance, des
problèmes épidermiques, pulmonaires, de fermeture de l’œil ainsi que des anomalies du
développement de tissus extraembryonnaires. En effet, ces souris présentent une réduction de la
zone du labyrinthe ainsi que des spongiotrophoblastes (Wojnowski et al. 1998). Ces données
38
indiquent que les membres de la famille Raf ne sont pas redondants et que chacune de ces kinases
a une fonction qui lui est propre.
Malgré leurs fonctions différentes, il a été montré que les membres de la famille Raf vont
participer à la transduction du signal en réponse à la stimulation de récepteurs tyrosine kinase en
phosphorylant et en activant les kinases MEK1 et MEK2. Bien que les trois kinases RAF soient
capables de phosphoryler MEK1 et MEK2, l’efficacité de phosphorylation diffère. En effet, il a été
montré que BRAF est l’activateur principal de MEK1 et MEK2.
1.4.3 Les MAPKKs MEK1 et MEK2
La voie ERK/MAPK est impliquée dans la détermination cellulaire chez Caenorhabditis
elegans, Drosophila melanogaster et Xenopus laevis (Hsu et al. 1994; Kornfeld et al. 1995;
Umbhauer et al. 1995). Chez ces trois organismes, une seule MAPKK est connue pour activer la voie
ERK/MAPK. Par contre, chez les mammifères, deux kinases ont été mises en évidence comme étant
impliquées dans l’activation de ERK1/2 : MEK1 et MEK2.
MEK1 et MEK2 sont les seules MAPKK dans la voie classique ERK/MAPK. Une fois activées
par phosphorylation de deux sérines dans leur domaine d’activation, elles vont à leur tour
phosphoryler et activer ERK1 et ERK2 sur des résidus thréonine et tyrosine présents dans leur
domaine d’activation (Figure 1.7B).
1.4.3.1 Structure des kinases MEK1 et MEK2
La structure primaire de MEK1 (MAP kinase or ERK kinase 1) a été mise en évidence en
1992 et a été associée au gène bry1 de Schizosaccharomyces pombe et set7 de Saccharomyces
cerevisiae (Crews et al. 1992). Chez les souris, le gène Mek1/Map2k1 est codé par le chromosome 9
et produit une protéine de 393 acides aminés et de 43,5kDa. Peu après, la même équipe a découvert
une autre kinase avec une grande homologie de séquence avec MEK1. Cette kinase a été appelée
MEK2/MAP2K2. Elle est codée par un gène situé sur le chromosome 10 et produisant une protéine
de 401 acides aminés et de 44,5kDa (Brott et al. 1993).
Les kinases MEK1 et MEK2 sont deux protéines 80 % identiques et 90 % similaires. Elles
ont toutes deux, dans leur domaine N-terminal (nucléotides 1 à 44), un domaine de liaison à ERK
(nucléotides 1 à 32) (Fukuda et al. 1997) ainsi qu’une séquence d’exclusion nucléaire (NES)
39
(nucléotide 33 à 44) (Fukuda et al. 1996). Dans des cellules non stimulée, l’interaction de ERK avec
MEK permet sa localisation cytoplasmique. La stimulation de la voie ERK/MAPK entraine la
phosphorylation de ERK et la dissociation de MEK et ERK et permet la localisation nucléaire de ERK.
Ainsi, MEK agit non seulement comme un activateur de ERK mais elle permet aussi sa séquestration
cytoplasmique (Fukuda et al. 1997). Cette région N-terminale est un domaine régulateur important
car il est responsable de la localisation cellulaire de MEK et participe aussi à l’efficacité d’activation
de ERK. En effet, la délétion de la région N-terminale réduit la capacité de MEK1 à phosphoryler
ERK2 in vitro (Xu et al. 1999). Le domaine le plus important chez MEK1 et MEK2 est le domaine
catalytique (nucléotides 78 à 361 pour MEK1, et 80 à 370 pour MEK2). Ce domaine catalytique
contient une boucle d’activation (nucléotides 207 à 228 pour MEK1 et MEK2) où se fait l’activation de
MEK1 et MEK2 par phosphorylation par RAF sur les sérines 218 et 222 pour MEK1 et les sérines
222 et 226 pour MEK2. Dans le domaine catalytique se trouve un domaine riche en prolines
(nucléotides 262 à 307 pour MEK1 et 266 à 316 pour MEK2). Ce domaine riche en prolines est
responsable de l’activation de MEK1 et MEK2 car c’est via ce domaine que se lie RAF ainsi que des
protéines chaperonnes facilitant l’activation de MEK, et par le fait même, l’activation de ERK (Catling
et al. 1995; Dang et al. 1998) (Figure 1.8). En plus des résidus dans le domaine catalytique, MEK1/2
possèdent d’autres sites de phosphorylation, dont les fonctions sont peu connues à ce jour. La région
C-terminale des kinases MEK1 et MEK2 est suggérée comme étant impliquée dans leur localisation
cytoplasmique. Chez MEK1, la région essentielle pour cette fonction a été identifiée et elle s’étend du
résidu 330 au résidu 379 (Cha et al. 2001).
1.4.3.2 Différences entre MEK1 et MEK2
Malgré leur grande similarité, MEK1 et MEK2 diffèrent dans leurs domaines N-terminaux (sur
36 résidus, 25 % sont identiques et 53 % sont similaires) ainsi que dans leurs domaines riches en
proline (sur 18 résidus, 17 % sont identiques et 33 % sont similaires). Ces deux domaines sont
essentiels à la fonction de MEK car ils affectent l’efficacité de phosphorylation de ERK1/2, la liaison
des membres de la famille RAF ainsi que la localisation cellulaire de MEK. L’activité de MEK1/2 est
aussi régulée par la présence de sites de phosphorylation spécifiques à MEK1 ou MEK2. En effet,
plusieurs sites de phosphorylation spécifiques à MEK1 ont été mis en évidence comme étant
importants pour sa fonction. Ces sites sont principalement présents dans le domaine riche en
prolines. La sérine 298 phosphorylée par PAK1 a été montrée comme étant impliquée dans
l’efficacité de phosphorylation de MEK1 par RAF-1 en préparant MEK1 à la phosphorylation par
40
RAF-1 et en jouant sur l’efficacité d’interaction entre MEK1 et RAF-1 (Jelinek et al. 1994; Coles et al.
2002). De plus, la phosphorylation de la sérine 298 par PAK1 in vitro stimule l’autophosphorylation
de MEK1 dans sa boucle d’activation et ainsi l’activation de ERK1/2 (Park et al. 2007). Bien que
MEK2 possède un résidu similaire, la sérine 306, celle-ci ne semble pas être un substrat de
phosphorylation par PAK1, ni pour l’interaction avec RAF-1 (Jelinek et al. 1994; Frost et al. 1997;
Slack-Davis et al. 2003). Ces sites de phosphorylation permettent une régulation positive de
l’activation de MEK1. D’autres sites de phosphorylation ont été mis en évidence comme étant
responsables de la régulation négative de l’activation de la voie ERK/MAPK par MEK. Parmi eux,
seule la sérine 212 a été retrouvée chez MEK1 et MEK2, les thréonines 286, 292 et 386 étant quant
à elles présentes uniquement chez MEK1 (Brunet et al. 1994; Rossomando et al. 1994; Gopalbhai et
al. 2003; Eblen et al. 2004). Par ailleurs, les thréonines 395 et 397 sont retrouvées phosphorylées
uniquement chez MEK2 (Banks et al. 2015) (Figure 1.8).
La première phosphorylation conduisant à une boucle de régulation négative de la voie
ERK/MAPK mise en évidence est la phosphorylation de la thréonine 292 par ERK2. Ce résidu se
trouve dans le domaine catalytique de MEK1 et est impliqué dans l’efficacité de liaison de MEK1
avec RAF-1 (Jelinek et al. 1994). Il a été montré que la phosphorylation de ce résidu, d’une part,
entraîne une diminution de la liaison de MEK1 avec ERK2 et, d’autre part, inhibe la phosphorylation
activatrice de MEK1 sur la sérine 298 par PAK (Eblen et al. 2004). Catalanotti et ses collaborateurs
ont montré que MEK1 et MEK2 forment un hétérodimère et que la boucle de régulation négative de
ERK sur MEK1, en passant par la phosphorylation de la thréonine 292, régulerait aussi MEK2 dans
un contexte d’hétéro-dimère (Catalanotti et al. 2009). En effet, les auteurs ont montré que dans des
MEFs Mek1-/-, en l’absence de MEK1, MEK1 et MEK2 ne forment pas d’hétérodimère et MEK2 ne
subit pas le rétrocontrôle négatif et l’activation de ERK est prolongée.
La phosphorylation de la sérine 212, qui se trouve dans la boucle d’activation de MEK1/2,
diminue l’activité kinase de MEK1/2. La mutation du résidu en un résidu non phosphorylable
augmente l’activité basale des kinases MEK1 et MEK2. En revanche, la mutation de la sérine 212 en
un résidu phospho-mimétique, supprime l’activation (Gopalbhai et al. 2003). La kinase responsable
de cette phosphorylation n’est pas connue. Ces données rapportant une phosphorylation inactivatrice
sont contradictoires avec ce qui est en général attendu d’une phosphorylation dans la boucle
d’activation. La thréonine 286, qui se trouve dans le domaine riche en prolines de MEK1, a été
montrée comme étant le substrat de deux kinases : p34Cdc2 et CDK5 (Cycline-dependent kinase 5).
41
Figure 1.8 : Schéma comparatif des séquences et des structures protéiques des kinases MEK1 et
MEK2
(A) Représentation schématique des protéines MEK1 et MEK2 avec en N-terminal le domaine de
liaison à ERK (1-32) (mauve) et le domaine d’exclusion nucléaire (33-44) (rose), le domaine
catalytique couvrant la quasi-totalité de la protéine (78-361 : MEK1, 80-370 : MEK2) (rouge clair), la
boucle d’activation hébergeant les deux sites d’activation par RAF (S218 et S222 pour MEK1, S222
et S226 pour MEK2) (rouge), le domaine riche en prolines impliqué dans la liaison aux chaperonnes
ainsi que dans l’efficacité d’activation de ERK (bleu). À l’extrémité C-terminale on retrouve le
domaine important pour la localisation cellulaire (vert). (B) Alignement des séquences protéiques de
MEK1 et MEK2. * : résidus identiques, ˸ : résidus similaires.
Inspirée de Roskoski, R. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012
42
43
Des essais kinases pour ERK par MEK1 montrent une activation de ERK diminuée en présence de
ces deux kinases. Par contre, l’essai kinase pour ERK en présence de forme constitutivement active
de MEK1 ou phospho-nulle pour la thréonine 286, entraîne une activation accrue de ERK,
comparativement à l’essai en présence de MEK1 de type sauvage. Ces données suggèrent que la
phosphorylation de la thréonine 286 par p34Cdc2 et CDK5 est une phosphorylation inactivatrice de
MEK1 (Rossomando et al. 1994; Sharma et al. 2002). La kinase CDK5 est aussi responsable de la
phosphorylation des thréonines 395 et 397 de MEK2 tel que révélé par des essais kinases utilisant
des formes contrôles et/ou phospho-nulles pour ces sites. Cette phosphorylation conduit à l’inhibition
de l’activation de la voie (Banks et al. 2015). De plus, il a été montré que, dans les cellules PC12
(cellules de phéochromocytome de rat), l’activation de ERK par le NGF (Neuronal Growth Factor)
maintient l’expression de p35, un activateur neuro-spécifique de CDK5 (Harada et al. 2001). Ces
données réunies permettent de suggérer l’existence d’une boucle de rétroaction négative de la voie
ERK/MAPK via l’activation de CDK5/p35 par ERK. CDK5/p35 activé réprimerait l’activation de ERK
par la phosphorylation de MEK1 sur sa thréonine 286 et la phosphorylation de MEK2 sur ses
thréonines 395 et 397.
Le rôle de la phosphorylation sur la thréonine 386 de MEK1 est très peu connu. Brunet et
ses collaborateurs ont montré que ERK est la kinase responsable de cette phosphorylation et que
celle-ci a un rôle inhibiteur car la présence d’un résidu non phosphorylable à cette position entraîne
une augmentation de l’activité de MEK1 (Brunet et al. 1994).
Outre les différences dans leurs sites de phosphorylation, l’activation de MEK1 et MEK2 est
différente selon les cellules ou le stimulus utilisé. Par exemple, dans des cellules Swiss 3T3 après
activation de la voie ERK/MAPK par la bombésine, seul MEK1 est activé (Seufferlein et al. 1996).
Dans les macrophages de souris, la liaison du TNFα (Tumor Necrosis Factor α) à son récepteur p55
entraîne une transduction du signal menant à l’activation des kinases ERK1/2. Malgré la présence de
MEK1 et MEK2 dans les macrophages de souris, la stimulation par TNFα entraîne une activation
sélective de MEK1 (Winston et al. 1995). Dans des fibroblastes 3T3 (3-day transfer, inoculum 3x105
cells), seul MEK1 est capable de former un complexe avec RAF-1 et RAS après stimulation avec du
sérum indiquant que la transduction du signal passe préférentiellement par MEK1 dans ces
conditions (Jelinek et al. 1994). De la même manière, dans des cellules HeLa (Henrietta Lacks),
après stimulation à EGF, A-RAF active préférentiellement MEK1 (Wu et al. 1996). La kinase MEK2,
quant à elle, est préférentiellement activée dans les cellules musculaires lisses aortiques après
44
stimulation au lactosylcéramide (Bhunia et al. 1996). Elle est aussi la cible préférentielle après
stimulation à l’œstradiol dans des cellules du cortex cérébral de souris (Setalo et al. 2002).
En plus de l’activation préférentielle de MEK1 ou MEK2, il a été montré qu’elles agissent à
différentes étapes du cycle cellulaire. En effet, dans des cellules cancéreuses du colon, Ussar et ses
collaborateurs ont montré que l’activation de MEK1 conduit à un signal de prolifération alors que
l’activation de MEK2 entraine un arrêt du cycle cellulaire à la transition G1/S (Ussar et al. 2004).
Dans des cellules hépatocytaires de rat après stimulation par des facteurs de croissance, Skarpen et
ses collaborateurs ont montré que lorsqu’activée par MEK1, ERK2 est localisée au noyau. Cette
localisation est dépendante de la phosphorylation de MEK1 sur sa sérine 298 et sa thréonine 292 et
entraîne une réponse proliférative. Cependant, lorsqu’activée par MEK2, ERK2 est localisée au
cytoplasme et entraîne une réponse de survie (Skarpen et al. 2008). Ces données indiquent que la
localisation cellulaire de ERK2 détermine la réponse cellulaire après stimulation par des facteurs de
croissance et que la liaison avec MEK1 ou MEK2 permet la régulation de cette localisation (Skarpen
et al. 2008).
1.4.3.3 Rôles des kinases MEK1 et MEK2
La fonction des kinases MEK1 et MEK2 a été étudiée depuis de nombreuses années. La
grande similarité entre ces deux kinases, leur positionnement central dans la voie ERK/MAPK ainsi
que l’absence d’autres MAPKK dans la voie leur confèrent un rôle essentiel dans la voie ERK/MAPK.
MEK1 et MEK2 sont toutes deux des sérine/thréonine et tyrosine kinases capables d’activer, par
phosphorylation, ERK1 et ERK2 sur les thréonine 202 et leur tyrosine 204. À ce jour, aucun autre
substrat de MEK1/2 n’a été rapporté. L’analyse des souris invalidées pour chacun des gènes Mek1
et Mek2 a permis de mettre en évidence in vivo les fonctions spécifiques à MEK1 et MEK2.
La lignée de souris invalidée pour le gène Mek1 a été générée en 1999 par l’équipe du
laboratoire du Dr Charron. Ces souris meurent à mi-gestation d’un sous-développement des tissus
extraembryonnaires. Dans le placenta de ces souris, les spongiotrophoblastes sont mal définis et la
zone du labyrinthe est plus restreinte. Les circulations maternelle et fœtale sont éloignées, ce qui
restreint les échanges et cause la mort de l’embryon. L’analyse des fibroblastes embryonnaires
(MEFs) des souris Mek1-/- révèle une diminution de la capacité migratoire de ces cellules lorsqu’elles
sont stimulées par la fibronectine. L’expression protéique de MEK1 et MEK2 a été étudiée, par
western blot, dans les embryons des souris Mek1-/-. Cette analyse montre que chez les mutants
45
aucune expression de MEK1 n’est détectée alors que l’expression de MEK2 est comparable à celle
observée chez des individus Mek1+/+. L’expression génique de Mek1 et Mek2 a, quant à elle, été
étudiée par hybridation in situ dans les embryons et le placenta des individus Mek1-/-. L’expression
de Mek2 en absence de Mek1 demeure inchangée dans le placenta et l’embryon. Ces données
démontrent le rôle unique et essentiel de Mek1 dans le développement embryonnaire chez la souris
et suggèrent que les effets de la perte de Mek1 dans le placenta ne peuvent être compensés par
Mek2 (Giroux et al. 1999).
Le phénotype placentaire des mutants Mek1-/- a mené à considérer le rôle de Mek1 dans les
tissus extraembryonnaires. L’analyse plus poussée des placentas des mutants Mek1-/- a permis de
montrer que la réduction du labyrinthe est due à une baisse de la prolifération ainsi qu’à une hausse
de l’apoptose dans la région du labyrinthe. La diminution de la prolifération serait due à une
diminution de l’activation des kinases ERK1 et ERK2. Les placentas Mek1-/- présentent des
anomalies de vascularisation. Finalement, la voie ERK/MAPK passant par MEK1 semble essentielle
à la ramification des syncytiotrophoblastes (Bissonauth et al. 2006).
Afin de distinguer le rôle de Mek1 dans les tissus extraembryonnaires et les tissus
embryonnaires, les collègues du laboratoire du Dr Charron ont généré une lignée conditionnelle pour
l’allèle Mek1 (Mek1flox). Le gène Mek1 a été délété uniquement dans les tissus embryonnaires en
croisant les souris Mek1flox avec des souris portant le gène de la recombinase Cre placée sous
contrôle du gène Sox2, ce dernier étant exprimé de manière ubiquitaire uniquement dans l’embryon.
Les souris Mek1fox/flox Tg+/Sox2-Cre sont viables et fertiles, ce qui indique un rôle du gène Mek1
uniquement dans le développement des tissus extraembryonnaires. Chez les souris Mek1fox/flox
Tg+/Sox2-Cre, malgré l’absence de fonction Mek1 dans l’embryon, la voie ERK/MAPK est activée, ce qui
indique que MEK2 est capable de compenser pour l’absence de MEK1 dans l’embryon mais non
dans les tissus extraembryonnaires. Ainsi, chez les souris Mek1fox/flox Tg+/Sox2-Cre, le développement
normal du placenta permet de supporter la survie de l’embryon en l’absence de Mek1 (Bissonauth et
al. 2006). Ces données montrent l’importance de Mek1 dans les tissus extraembryonnaires.
La souris invalidée pour le gène Mek2 a été générée afin de définir le rôle biologique du
gène Mek2. Les souris Mek2-/- survivent, sont fertiles et ne présentent aucun phénotype apparent.
Ces données suggèrent que Mek1 est capable de compenser l’absence de Mek2. L’analyse de
l’expression protéique de MEK1 chez des embryons Mek2-/- montre qu’il n’y a aucune augmentation
de l’expression de MEK1 en l’absence de MEK2, ce qui indique que la compensation n’est pas due à
46
une différence d’expression protéique. L’analyse des MEFs Mek2-/- a permis d’examiner le rôle de
Mek2 dans la division cellulaire. Ces analyses ont montré l’absence d’anomalies lors de la division
cellulaire et l’activation adéquate de ERK1/2 après stimulation avec EGF et du sérum (FBS). Ces
données démontrent le rôle non-essentiel de Mek2 au cours du développement embryonnaire, dans
la division cellulaire ainsi qu’en réponse à la stimulation à l’EGF et au FBS (Belanger et al. 2003).
Donc, Mek1 est capable de remplacer Mek2 dans les tissus extraembryonnaires mais Mek2 ne peut
remplacer Mek1 dans ces mêmes tissus. Cependant, la génération de souris Mek1+/-Mek2+/- a mis en
évidence l’importance de MEK1 et MEK2 dans les tissus extraembryonnaires car les souris Mek1+/Mek2+/- meurent de défauts extraembryonnaires lié à un labyrinthe atrophié et la présence de
trophoblastes géants multi-nucléés (MTG, multinucleated trophoblast giant cells) (Nadeau et al.
2009). L’analyse de ces données suggère que Mek1 et Mek2 partagent certaines fonctions
essentielles au développement du placenta mais qu’elles ont toutefois des fonctions qui leurs sont
propres.
Le rôle de chacune des kinases dans le développement de différents tissus a aussi été
étudié à l’aide du mutant conditionnel de Mek1. Plusieurs Cre recombinases ont été utilisées pour
déléter Mek1 dans un contexte nul pour Mek2. L’ensemble de ces études a permis de montrer que
l’expression d’un seul allèle Mek est nécessaire à la survie de l’embryon. Ainsi, la délétion de Mek1/2
dans le mésenchyme, à l’aide de la lignée de souris Dermo1Cre, cause un large spectre de
phénotypes. Les souris Mek1flox/flox Mek2-/- Dermo1+/Cre meurent à la naissance avec un retard de
croissance intra-utérin, un omphalocèle sévère, une kyphose et de nombreux problèmes
squelettiques, un défaut de fermeture des paupières, une hypoplasie pulmonaire et une flaccidité de
la trachée due à une malformation des anneaux de cartilage (Boucherat et al. 2014). En parallèle, la
délétion de Mek1/2 dans l’épithélium pulmonaire à l’aide de la lignée ShhCre, entraîne une mortalité
à la naissance. La trachée de ces souris est plus courte et l’épithélium trachéal est mal différencié
indiquant le besoin de l’expression de Mek1 et Mek2 dans l’épithélium et le mésenchyme trachéal
pour la formation de la trachée. Toutefois, le phénotype le plus marquant des souris Mek1flox/flox Mek2/-
Shh+/Cre est l’absence de poumon démontrant le rôle essentiel de la voie ERK/MAPK dans
l’épithélium pulmonaire pour la formation de l’arbre bronchial (Boucherat et al. 2014). Par ailleurs, la
délétion de Mek1/2 dans l’épiderme, à l’aide de la lignée de souris K14Cre, entraîne une mortalité
dans les premières heures de vie. Les nouveau-nés sont plus petits, ont la peau translucide et
disposent d’une barrière épidermique peu efficace. L’épiderme des souris Mek1flox/flox Mek2-/- K14+/Cre
47
est hypoplasique avec peu de follicules pileux, démontrant l’importance de la voie ERK/MAPK
passant par les kinases MEK1 et MEK2 pour le développement et le maintien de l’épiderme (Scholl
et al. 2007). La délétion de Mek1/2 dans le système nerveux central et périphérique (incluant les
cellules précurseurs neuronales et gliales), à l’aide de la souris NestinCre, cause aussi une mortalité
néonatale suite à un défaut de spécification et du maintien des cellules gliales. La production et la
différenciation des cellules gliales, à partir des précurseurs neuronaux, est donc régulée par la
signalisation passant par MEK1 et MEK2 (Li et al. 2012). La délétion de Mek1/2 dans les cellules de
Leydig, à l’aide de la lignée Cyp17iCre, ne cause pas la mort. Le poids du nouveau-né des mutants
Mek1flox/flox Mek2-/- Cyp17i+/Cre ainsi que le poids des testicules ne sont pas affectés par la délétion
Mek1/2, mais une diminution d’expression des marqueurs des cellules de Leydig est observée. Ces
souris ont une production réduite de testostérone ainsi qu’un problème de fertilité qui ne s’explique
pas par un faible taux de spermatozoïdes. Ces données suggèrent que la fonction et le nombre de
cellules de Leydig par testicule après la naissance dépendent de la voie ERK/MAPK passant par
MEK1 et MEK2. Les auteurs montrent aussi que, dans les cellules de Leydig, la signalisation
MEK/ERK est requise pour la production d’androgènes et la fertilité mais n’est pas requise pour la
spermatogenèse (Yamashita et al. 2011). De plus, la délétion de Mek1/2 dans les cellules du
bourgeon urétéral, à l’aide de la souris Hoxb7Cre, entraîne une mortalité dans les premières 72
heures de vie en raison d’une hypodysplasie rénale démontrant l’importance de la signalisation
ERK/MAPK passant par MEK1 et MEK2 pendant la ramification du bourgeon urétéral (IhermannHella et al. 2014). Finalement, la délétion de Mek1/2 dans les cellules hématopoïétiques, à l’aide de
la lignée de souris VaviCre, cause une mortalité dans les premières 48 heures de vie en raison d’une
anémie sévère (données non publiées du laboratoire du Dr Charron).
Ensemble, ces différentes données démontrent clairement le rôle crucial des kinases MEK1
et MEK2 tout au long du développement embryonnaire. Contrairement au placenta, la présence d’un
seul allèle Mek suffit à la survie de tous les mutants conditionnels analysés. Ces résultats montrent
une redondance fonctionnelle entre MEK1 et MEK2 et qu’une quantité minimale de MEK est
suffisante pour sa fonction dans le développement de ces différents tissus. Par contre, le phénotype
plus sévère du placenta indique un rôle plus important des kinases MEK1 et MEK2 dans le placenta,
lequel demande un niveau d’expression plus élevé pour permettre son bon développement ainsi que
la survie de l’embryon.
48
Les analyses in vivo ont mis en évidence les fonctions communes et spécifiques des kinases
MEK1 et MEK2 permettant d’accréditer l’hypothèse selon laquelle la voie ERK/MAPK est complexe
et que son activité optimale dépend de différents facteurs. La question de la redondance
fonctionnelle entre MEK1 et MEK2 reste encore en suspend. Les données in vivo appuient l’idée que
les deux protéines MEK1 et MEK2 ont, outre leurs fonctions similaires, notamment dans le
développement de l’embryon, des fonctions différentes, principalement dans le développement du
placenta.
1.4.4 Les MAPK ERK1/2
Les kinases effectrices de la voie ERK/MAPK sont ERK1/2. Ces deux kinases sont les
seules cibles connues de MEK1/2. Ces sont les premières kinases à avoir été mises en évidence au
début des années 1990 (Boulton et al. 1991). Tout comme MEK1 et MEK2, ERK1 et ERK2 sont
similaires. En effet, elles ont 83% d’acides aminés identiques et sont 100% similaires pour les
résidus impliqués dans la fonction kinase et l’interaction avec les substrats (Busca et al. 2015).
1.4.4.1 Fonctions des kinases ERK1/2
L’analyse des souris invalidées pour chacun des gènes Erk1 et Erk2 a montré que Erk1 n’est
pas essentiel à la survie car les souris Erk1-/- survivent sans aucun phénotype apparent (Pages et al.
1999). Par contre, l’inactivation de Erk2 entraîne une mortalité au jour E6.5. Les embryons Erk2-/présentent des défauts de différenciation du mésoderme (Yao et al. 2003), du développement de
l’ectoderme extraembryonnaire ainsi que du cône ecto-placentaire (Saba-El-Leil et al. 2003) et des
défauts de développement du placenta (Hatano et al. 2003). Ces données indiquent que ERK1 et
ERK2 ne sont pas redondantes et que, tout comme MEK1, le rôle prédominant de ERK2 est dans les
tissus extraembryonnaires. Récemment, la délétion du gène Erk2 dans les tissus embryonnaires, à
l’aide de la souris Sox2Cre, a révélé le rôle essentiel de ERK2 dans les tissus embryonnaires. En
effet, les souris Erk2f/f;Sox2Cre survivent jusqu'à E16.5 mais les embryons sont plus petits, avec des
pattes antérieures plus courtes et sans pattes postérieures. Ces embryons présentent aussi des
anomalies cranio-faciales et des malformations cardio-vasculaires, indiquant un rôle plus large de
Erk2 lors du développement embryonnaire (Fremin et al. 2015). Ces mêmes auteurs montrent que
les anomalies dues à l’absence de Erk2 peuvent d’être restituées par une surexpression du gène
Erk1 par un transgène. Les anomalies observées concordent avec les domaines d’activation de la
voie ERK/MAPK pendant l’embryogenèse (Corson et al. 2003).
49
1.4.4.2 Processus cellulaires régulés par ERK1/2
Les kinases ERK1/2 sont les substrats de MEK1/2. Elles sont activées par phosphorylation
sur leurs deux résidus, thréonine 185 et tyrosine 187, présents dans un motif Thr-Glu-Tyr. ERK1/2
catalysent la phosphorylation de substrats sur des résidus sérine/thréonine dans une séquence
ProX(Ser/Thr)Pro (Clark-Lewis et al. 1991; Davis 1993). Outre l’implication de Erk1/2 dans le
développement embryonnaire, ces deux kinases sont connues pour réguler des protéines impliquées
dans différents processus cellulaires (Yoon et al. 2006). Une fois activées ERK1/2 migrent au noyau
et contrôle l’activité transcriptionnelle de facteurs de transcription. Parmi eux, le facteur le plus connu
et le plus étudié est le facteur ELK1, qui fait partie de la famille des facteurs TCF (Ternary complex
factors). La phosphorylation de ELK1 par ERK1/2 augmente son affinité pour le SRE (Serum
response element) de c-Fos et entraîne ainsi une augmentation de l’expression du gène Fos
impliqué dans la division cellulaire (Whitmarsh et al. 1995). ERK1/2 régulent aussi MYC en induisant
la stabilisation de la protéine et ainsi son activité transcriptionnelle nécessaire à la croissance
cellulaire (Sears et al. 1999; Sears et al. 2000). ERK1/2 modulent aussi l’activité de gènes impliqués
dans la mort cellulaire par l’intermédiaire de l’augmentation du niveau des ligands de mort (FasL,
TNFα, Fas, DR4, DR5) et de l’augmentation de l’expression de facteurs pro-apoptotiques (membres
de la famille Bcl-2) (Cagnol et al. 2010). MEK1/2 font partie des substrats de ERK1/2, permettant
ainsi un contrôle de leur propre activation via une boucle de rétroaction négative sur les résidus
thréonine 292 et 386 de MEK1. L’analyse des différents mutants de souris de la voie ERK/MAPK a
permis de confirmer son rôle majeur dans le développement du placenta (Nadeau et al. 2009;
Nadeau et al. 2014), dans le système cardio-vasculaire (Fremin et al. 2015), le système nerveux (Li
et al. 2012), le système urologique (Ihermann-Hella et al. 2014), le système respiratoire (Boucherat
et al. 2014) et le système immunitaire (données non publiées du laboratoire du Dr Charron).
La voie ERK/MAPK est une voie de signalisation dont le rôle est complexe et dont les cibles
sont multiples. Sa régulation fine est donc importante pour assurer l’homéostasie de l’organisme
ainsi que sa survie.
1.4.5 Importance des protéines d’échafaudage dans le contrôle de la voie
ERK/MAPK
La voie ERK/MAPK est de moins en moins vue comme une cascade linéaire dont l’activation
par des stimuli entraîne la phosphorylation de kinases successives menant à une signalisation dans
50
le noyau régulant l’expression de gènes impliqués dans différents processus biologiques. La
régulation fine de la voie ERK/MAPK est essentielle à la survie et à l’homéostasie cellulaire. La
question de la spécificité d’activation, la durée ainsi que la localisation de la signalisation ERK/MAPK
est de plus en plus étudiée. Il est maintenant reconnu que la flexibilité ainsi que la spécificité de la
voie sont orchestrées par un complexe protéique, constitué des kinases de la voie ainsi que de
protéines d’échafaudage, qui régulent le flux signalétique en intégrant et en redistribuant le signal.
La première démonstration de l’existence de protéines d’échafaudage pouvant moduler
l’activité des MAP kinases a été réalisée chez la levure S.cerevisiae (Gustin et al. 1998). Ces
protéines d’échafaudage sont aussi présentes dans d’autres espèces dont les mammifères. Ces
protéines peuvent agir à différents niveaux pour affiner l’activité MAPK. En effet, il a été montré que
la liaison aux protéines d’échafaudage 1- est nécessaire à l’activation des kinases; 2- permet une
activation rapide des kinases en les rapprochant physiquement; 3- favorise le recrutement des
kinases de manière localisée afin d’entraîner des réponses cellulaires distinctes; et 4- permet d’isoler
les kinases minimisant ainsi les interférences avec d’autres protéines comme certaines
phosphatases (Dhanasekaran et al. 2007). L’action des protéines d’échafaudage ajoute un niveau
additionnel de complexité à la régulation de la signalisation MAPK. À ce jour, six protéines
d’échafaudage ont été identifiées : KSR1 (Kinase Suppressor of Ras 1), Paxilline, β-arrestine 2,
IQGAP1 (IQ Motif Containing GTPase Activating Protein 1), MP1 (MEK Partner-1) et MORG1 (MAPK
Organizer-1).
1.4.5.1 KSR1
KSR1 est la protéine d’échafaudage la mieux caractérisée. Elle a été mise en évidence dans
un criblage génétique chez D.melanogaster et C.elegans comme un régulateur de la signalisation
Ras. Cette protéine possède une grande homologie avec RAS. Elle possède un domaine kinase dont
la fonctionnalité n’est pas claire car il possède des mutations sur des résidus essentiels à son activité
kinase (Sundaram et al. 1995; Therrien et al. 1995). La protéine KSR peut interagir avec RAF-1,
MEK1, MEK2 et ERK1/2 (Denouel-Galy et al. 1998). L’interaction avec MEK1/2 semble être
indispensable à la fonction de KSR1 (Yu et al. 1998). L’interaction de KSR1 avec MEK1/2 semble
être constitutive alors que l’interaction de KSR1 avec RAF-1 et ERK1/2 est dépendante de
l’activation par RAS. Plusieurs auteurs ont montré que la fonction de KSR1 est régulée par d’autres
partenaires tels que les protéines 14-3-3, PP2A (Protein Phosphatase 2A) ainsi qu’IMP (Impedes
51
Mitogenic signal Propagation) (Ory et al. 2003). Dans une cellule quiescente, le complexe KSRMEK1/2 est séquestré dans le cytoplasme via la liaison avec 14-3-3, IMP et PP2A. L’activation de
RAS par des facteurs de croissance stimule la déphosphorylation de KSR, par PP2A sur un résidu
responsable de l’interaction avec 14-3-3. Cette déphosphorylation entraîne la dissociation avec 14-33 et la translocation du complexe KSR-MEK1/2 vers la membrane où KSR joue sa fonction de
protéine d’échafaudage rapprochant RAF-1, ERK1/2 et MEK1/2 pour permettre une activation
efficace de la voie (Ory et al. 2003).
Les souris invalidées pour le gène Ksr1 survivent sans aucun phénotype développemental
majeur, suggérant que Ksr1 n’est pas un gène essentiel à la survie. Toutefois, les souris Ksr-/- ont,
tout comme les souris Egfr-/-, des anomalies de développement des follicules pileux, (Lozano et al.
2003). L’apoptose induite par le TNFα est augmentée dans l’épithélium du colon des souris Ksr-/- et
elle est accompagnée d’une absence d’activation de voies anti-apoptotiques (ERK/MAPK ou AKT).
Ces données indiquent que, en cas d’inflammation, KSR1 aurait un rôle protecteur, dans l’épithélium
intestinal, via l’activation de la signalisation de survie cellulaire (Yan et al. 2004).
1.4.5.2 Paxilline
Paxilline est une protéine du cytosquelette localisée dans les adhésions focales. Elle est
connue pour être associée à d’autres protéines d’adhésion focale, telle la vinculine, et pour réguler la
migration cellulaire. Dans les cellules quiescentes, la paxilline est associée à MEK1/2 de manière
constitutive. Ishibe et ses collaborateurs ont montré que, en réponse au HGF, la paxilline s’associe à
RAF-1 et ERK1/2 avec une affinité plus grande pour RAF-1 actif et ERK1/2 inactif. Ces données
suggèrent que la paxilline permet de recruter les kinases ERK1/2 inactives aux sites d’adhésion
focales, ce qui favorise l’activation de ERK1/2 par RAF-1 aux sites d’adhésion (Ishibe et al. 2003).
Une fois activées ERK1/2 phosphorylent la paxilline et promeuvent sa liaison avec FAK (Focal
Adhesion Kinase) et l’activation en aval de RAC. FAK induit le désassemblage local de l’adhésion
focale, alors que RAC initie la migration via l’extension de lamellipodes (Ishibe et al. 2004). Ainsi, la
paxilline permet de coordonner le désassemblage des adhésions focales ainsi que la migration en
connectant les voies ERK/MAPK et FAK.
52
1.4.5.3 β-arrestine 2
Le rôle de la β-arrestine 2 est associé à la signalisation des récepteurs couplés aux protéines
G (RCPGs). Elle permet la désensibilisation du récepteur ainsi que son internalisation. Outre cette
fonction primaire, la β-arrestine 2 permet de localiser et de prolonger la voie ERK/MAPK dans les
endosomes. En effet, des études sur l’activation du récepteur AT1aR (angiotensin receptor subtype
1a) ont permis de montrer que la β-arrestine 2 s’associe aux kinases RAF-1, MEK1/2 et ERK1/2. La
β-arrestine 2 phosphoryle et s’associe aux RCPGs, ce qui cause leur endocytose. Pendant
l’internalisation du récepteur, il a été observé que les kinases de la voie ERK/MAPK sont aussi
internalisées dans les vésicules d’endocytose. Cette signalisation via la β-arrestine 2 entraîne une
rétention de ERK dans le cytoplasme (Luttrell et al. 2001; Tohgo et al. 2002). Ainsi, cette
signalisation est caractérisée par une activation retardée, une persistance plus longue, une rétention
de ERK dans le cytoplasme entraînant une absence de régulation transcriptionnelle et permettant
une régulation spatio-temporelle de la voie ERK/MAPK (Lefkowitz et al. 2005).
1.4.5.4 IQGAP1
IQGAP1 est une protéine de 189kDa impliquée dans différentes voies de signalisation. Il a
été rapporté qu’elle lie directement RAF, MEK1/2 et ERK1/2 et module leurs activités (Roy et al.
2005). Cette modulation est directement liée à la quantité cellulaire d’IQGAP1. En effet, une
diminution ou une augmentation de la concentration intracellulaire d’IQGAP1 réduit l’activation de
MEK1/2 et ERK1/2. Ces données suggèrent que la stœchiométrie est importante pour l’activité
d’IQGAP1. Roy et ses collaborateurs ont montré que l’activité d’IQGAP1 peut moduler de manière
différentielle l’action de MEK1 et MEK2. En effet, dans des cellules MCF-7 quiescentes, IQGAP1 lie
plus MEK2 que MEK1. Après stimulation par EGF, la liaison MEK1-IQGAP1 est favorisée et plus
importante, alors que MEK2-IQGAP1 est moindre. Ainsi, EGF peut stimuler la signalisation via
MEK1-ERK et, dans le même temps atténuer la signalisation MEK2-ERK (Roy et al. 2005). De plus,
IQGAP1 module l’activation par EGF en se liant directement au récepteur EGFR (McNulty et al.
2011). Ces observations ajoutent à notre compréhension de l’activité différentielle de MEK1 et MEK2.
Cette activité différentielle peut donc être aussi régulée par les protéines d’échafaudage qui
favorisent l’interaction de l’une ou l’autre des kinases MEK avec ERK et ciblent cette interaction dans
des sous-compartiments cellulaires.
53
1.4.5.5 MP1
MP1 est une petite protéine de 13.5kDa qui a été mise en évidence par un criblage double
hybride chez la levure à la recherche de partenaires de MEK. Elle se lie spécifiquement à MEK1
dans le domaine riche en prolines. Des expériences d’immunoprécipitation de MEK1 dans des
fibroblastes pulmonaires de hamster (CCL39) ont montré que cette interaction spécifique entre MP1
et MEK1 avait aussi lieu dans ces cellules de mammifères. MP1 se lie préférentiellement à la forme
inactive de MEK1 favorisant l’activation de MEK1 par RAF-1, et conséquemment facilitant l’activation
de ERK par MEK1. De plus, MP1 se lie directement à ERK1, suggérant que l’augmentation de
l’activation de ERK par MEK1 via MP1 passerait par un rapprochement physique entre MEK1 et
ERK1 (Schaeffer et al. 1998). Sharma et ses collaborateurs ont montré que la phosphorylation de
ERK après activation de la voie entraîne une dissociation du complexe MP1-ERK1. Par contre,
l’activation de la voie n’affecte pas le complexe MP1-MEK1. Ces mêmes auteurs ont démontré que
MP1 fait partie d’un large complexe impliqué dans la régulation de la voie ERK/MAPK (Sharma et al.
2005). Le complexe associé à MP1 comprend aussi la protéine adaptatrice p14. Cette petite protéine
permet l’ancrage de MP1-MEK1-ERK1 à la surface des endosomes tardifs (Wunderlich et al. 2001).
Des analyses supplémentaires sur le rôle de ce complexe dans la réponse à la stimulation à EGF ont
montré que la surexpression de p14 dans des cellules HeLa entraîne une augmentation de
l’activation de ERK1. Cette modulation de l’activation de ERK se fait via MP1 et localise une partie de
la signalisation MAPK aux endosomes tardifs. De manière surprenante, l’utilisation de siARN afin de
diminuer l’expression de p14 entraîne une diminution protéique de MP1 (Teis et al. 2002). Ces
données montrent comment la localisation du complexe signalétique dans les compartiments
cellulaires joue un rôle dans la régulation de la signalisation cellulaire. L’analyse des souris
invalidées pour le gène p14 a révélé que ce gène est essentiel à la survie. En effet, les souris p14-/meurent avant E10.5. De plus, l’étude de MEFs p14-/- a permis de montrer que la signalisation
passant par le complexe p14-MP1-MEK1-ERK1 est impliquée dans la régulation du trafic endosomal
(Teis et al. 2006).
Un autre niveau de régulation du complexe MP1-p14 a été mis en évidence par Pullikuth et
collaborateurs. Les auteurs ont montré que le complexe MP1-p14 est impliqué dans l’activation de
ERK pendant la migration cellulaire dépendante de PAK1 (Pullikuth et al. 2005). En effet, dans des
fibroblastes de rat immortalisées spontanément (REF52), après stimulation à la fibronectine, la
réduction de MP1 (ou p14) à l’aide de siARN atténue la phosphorylation de MEK1 sur la sérine 298,
suggérant que le complexe MP1-p14 est requis pour la phosphorylation de MEK1 par PAK1. Cette
54
régulation passerait par l’association physique entre MP1 et PAK1. L’activation de ERK via MP1-p14
est aussi requise pour abolir la signalisation Rho dépendante ce qui entraîne un remodelage rapide
de l’actine ainsi que des adhésions permettant une migration cellulaire efficace. Ces données nous
permettent d’émettre l’hypothèse selon laquelle la localisation de MP1-p14 dans les endosomes
tardifs permet de déplacer MEK1 ainsi que la signalisation ERK/MAPK des endosomes vers
différentes localisations subcellulaires (comme les membranes périphériques) pendant l’adhésion et
la migration cellulaire (Pullikuth et al. 2005).
La dissection de l’ancrage du complexe MP1-p14 aux endosomes a permis de mettre en
évidence une autre protéine adaptatrice du complexe, p18. Cette petite protéine permet l’ancrage du
complexe Mp1-p14 aux endosomes tardifs (Nada et al. 2009). L’analyse des souris invalidées pour le
gène p18 a fait ressortir le fait que tout comme p14, p18 est essentielle à la survie. Les souris p18-/meurent à E6.5 à cause de défauts d’organisation des organelles dans l’endoderme viscéral qui n’est
plus capable d’assurer le trafic des nutriments vers l’épiblaste. Les auteurs ont montré que p18 lie
p14 et MP1. De plus, l’analyse des MEFs p18-/- a démontré que l’ancrage aux endosomes du
complexe MP1-p14-MEK1 se fait via p18, et que l’activation de la voie ERK/MAPK via le complexe
p18-p14-MP1-MEK1-ERK est essentielle pour assurer un trafic vésiculaire ainsi qu’une dynamique
des endosomes efficace (Nada et al. 2009). Donc, MP1 est la seule protéine d’échafaudage dont le
rôle est propre à MEK1.
1.4.5.6 MORG1
MORG1 a été mise en évidence par un criblage à la recherche de partenaires de MP1. C’est
une protéine de 35kDa, membre de la famille des protéines WD-40 (avec une répétition de
tryptophane et d’acide aspartique). En plus de lier MP1, MORG1 est capable de s’associer avec
RAF-1, MEK1/2 et ERK1 et elle stabilise le complexe RAF-1-MEK1/2-ERK1. Cette stabilisation
permet une meilleure activation de ERK1/2. Il est intéressant de constater que la potentialisation de
la voie ERK/MAPK via MORG1 est dépendante du stimulus (Vomastek et al. 2004). Les souris
Morg1-/- meurent à E10.5 d’anomalies du développement causées par une vascularisation
défectueuse du placenta, révèlant le rôle essentiel de Morg1 dans le développement.
Les protéines d’échafaudage sont donc des acteurs importants de la signalisation. Leur
localisation cellulaire, leur capacité à répondre à des signaux divers ainsi que leur spécificité
55
d’association les mènent à jouer un rôle essentiel dans la régulation de l’activation de la voie
ERK/MAPK. De plus, l’étude de l’action des protéines d’échafaudage a permis de montrer que la
stœchiométrie est importante pour une réponse efficace à la suite d’une stimulation. En effet, la
déplétion ou la surexpression de protéines d’échafaudage entraîne une dérégulation de la réponse
cellulaire à un stimulus.
1.5 Dérégulation de la voie ERK/MAPK et ses conséquences chez
l’humain
La voie ERK/MAPK joue un rôle important pour la survie. Son implication dans la régulation
de la prolifération, la différenciation ainsi que la mort cellulaire en font une voie de signalisation dont
le contrôle est essentiel à une bonne homéostasie cellulaire. Chez l’humain, les mutations
somatiques dans la voie ERK/MAPK sont les principales causes de cancer (Bos 1989). En effet, ces
mutations englobent tous les membres de la signalisation ERK/MAPK mais touchent principalement
les kinases en amont de MEK1/2, RAS et RAF. Ainsi, cette voie de signalisation est aussi appelée
Ras/MAPK. Outre les mutations somatiques du gène Ras et des membres de la voie Ras/MAPK
impliquées dans le cancer, des mutations germinales sont aussi observées sur ces mêmes acteurs
de la signalisation. Compte tenu du rôle de la voie Ras/MAPK lors du développement embryonnaire,
il n’est donc pas étonnant de constater que les mutations germinales des membres de la voie
engendrent des défauts développementaux. Les syndromes associés à ces défauts sont regroupés
sous l’appellation Rasopathies.
1.5.1 Les Rasopathies
Les Rasopathies sont un groupe de syndromes développementaux causées par des
mutations germinales dans des membres de la signalisation Ras/MAPK. Dans l’ensemble, l’incidence
de la maladie est d’une naissance sur 1000. À ce jour, les syndromes associés aux Rasopathies sont
la Neurofibromatose de type 1 (NF1), le syndrome de Noonan (SN), le syndrome de Costello (SC) et
le syndrome cardio-facio-cutané (CFC). Le regroupement sous le terme de Rasopathie sous-entend
que ces syndromes partagent des anomalies communes, mais chacun de ces syndromes a sa
particularité et des symptômes qui lui sont propres.
56
1.5.1.1 Neurofibromatose de type 1 (NF1)
La neurofibromatose de type 1, aussi appelée maladie de Von Recklinghausen, est la
première Rasopathie identifiée. Elle a été décrite dès 1793 par Tiselius, puis, en 1882 par Von
Recklinghausen. La prévalence de la maladie est de 1 naissance sur 3000 à 5000 (Williams et al.
2009). La caractéristique principale de la maladie est la présence de taches « café au lait » sur la
peau, la présence de tumeurs le long des nerfs, appelées neurofibrome, et la présence de gliomes
sur le nerf optique. Les patients présentent aussi des malformations squelettiques, des troubles
neurologiques, des anomalies cardiaques ainsi qu’une prédisposition au cancer. La
neurofibromatose de type 1 a été d’avantage étudiée depuis les années 1990. Elle résulte d’une
mutation autosomale activatrice du gène NF1 codant pour la neurofibronine (Viskochil et al. 1990;
Wallace et al. 1990). La neurofibronine est une protéine activatrice de GTPase qui régule
négativement RAS (Figure 1.9). Elle permet l’échange du RasGTP (active) en RasGDP (inactive).
Des mutations de différents types sont associées à la NF1 et entraînent toutes une perte de fonction
de la neurofibronine ainsi qu’une haploinsuffisance au sein de la cellule. Par conséquent, l’activité
RasGAP de la neurofibronine est réduite et une accumulation de RasGTP est observée. Cette
accumulation de RasGTP (actif) fait de la NF1 un syndrome qui prédispose au cancer (Brems et al.
2009).
Chez les sujets atteints, on observe une grande variabilité des phénotypes cutanés et
cardiaques. L’explication de cette variabilité s’appuie sur l’hypothèse de Knudson selon laquelle deux
évènements génétiques sont requis pour voir apparaître une anomalie. Dans le cas de la NF1, le
premier évènement serait l’héritage d’un allèle muté entraînant une perte de fonction suivie d’une
mutation somatique dans le gène NF1 dans un tissu donné permettant l’apparition d’anomalies dans
le tissu. Cette hypothèse a été validée par une analyse de fibroblastes et de cellules de Schwann
d’une dizaine de neurofibromes issus de 6 patients porteurs d’une mutation germinale dans le gène
NF1. Cette étude a montré que les fibroblastes des patients étaient hétérozygotes pour le gène NF1
alors que les cellules de Schwann étaient homozygotes nulles pour le gène NF1. Cela suggère que,
57
Figure 1.9 : Module d’activation de la voie Ras/MAPK et mutations associées aux Rasopathies
La voie Ras/MAPK est activée par différents stimuli. Après liaison du ligand au récepteur tyrosine
kinase, les protéines adaptatrices GRB2 et SOS activent RAS. RAS recrute RAF à la membrane et
participle à son activation, pour ensuite activer les MAP kinase kinases MEK1 and MEK2. MEK1/2
activent ERK1/2 qui migre au noyau et activent plusieurs gènes impliqués dans la différenciation, la
prolifération et la survie cellulaire. La mutation de plusieurs membres de la voie RAS/MAPK cause
l’apparition de maladies développementales telles que le syndrome de Noonan (SN) (bleu), la
Neurofibromatoses de type1 (NF1) (orange), le syndrome Cardio-facio-cutaneous (CFC) (vert), le
syndrome Legius (LG) (violet) et le syndrome Costello (SC) (rose).
58
59
dans les cellules de Schwann, une mutation somatique supplémentaire a eu lieu, ce qui explique la
présence de neurofibromes (Serra et al. 2000).
Il y a une grande hétérogénéité des phénotypes chez les patients NF1, mais la majorité
d’entre eux (40 % des enfants atteints) présentent des anomalies neurologiques de sévérité variable.
Une des anomalies du cerveau associées à la NF1 est l’astrogliose. En effet, l’analyse de cerveaux
provenant de patients NF1 a révélé une augmentation du nombres d’astrocystes positifs pour la
GFAP (Glial fibrillary acidic protein) (Nordlund et al. 1995). L’augmentation des astrocystes est
souvent associée à une lésion du système nerveux central.
En ce qui concerne les souris invalidées pour le gène Nf1, celles-ci meurent à E14.5. De
plus, les embryons Nf1-/- présentent un développement cardiaque anormal ainsi qu’un retard du
développement du foie, des reins et du squelette (Brannan et al. 1994). L’analyse des cerveaux des
souris Nf1+/- a montré que ces souris, tout comme les patients NF1, présentent une augmentation de
l’expression de GFAP dans les astrocystes reflétant l’astrogliose associée à la mutation de NF1
(Rizvi et al. 1999). La délétion spécifique de Nf1 dans le système nerveux central ainsi que dans les
neurones entraîne aussi une astrogliose chez les souris mutantes (Zhu et al. 2001; Zhu et al. 2005).
Aucun modèle animal ne récapitule toutes les anomalies observées chez les patients.
Cependant plusieurs modèles animaux chez différents organismes modèles, tels que la drosophile,
le poisson zèbre et la souris, ont été générés et permettent d’étudier la mécanistique derrière les
phénotypes (Jindal et al. 2015).
1.5.1.2 Syndrome de Noonan (SN)
Le syndrome de Noonan est une maladie affectant environ une personne sur 1000-2500.
Elle a été décrite en 1968 par la cardiopédiatre Jacqueline Noonan (Noonan 1968). La mortalité
associée au syndrome de Noonan est en majorité due à des anomalies cardiaques qui apparaissent
dans les premières années de vie. Le taux de mortalité de la maladie est de 9%. (Shaw et al. 2007).
La transmission de la maladie est autosomale dominante, mais certains patients présentant des
mutations de novo ont été répertoriés.
Les gènes PTPN11, SOS1, RAF1 ET KRAS sont associés à la maladie. Tous ces gènes
sont impliqués dans la voie de signalisation Ras/MAPK et les mutations qui sont liées sont
dominantes et entraînent la maladie à l’état hétérozygote. Les mutations de PTPN11, lequel code
pour la protéine SHP2, sont les plus fréquentes (50% des cas). Elles sont localisées dans les
60
domaines N-SH2 et PTP. Le domaine N-SH2 de SHP2 est responsable de son autoinhibition alors
que le domaine PTP est responsable de l’activité catalytique de la protéine. À l’état basal, les
domaines N-SH2 et PTP interagissent et gardent la protéine inactive. Lorsqu’un ligand se lie au RTK,
l’inhibition est levée et SHP2 est en mesure de recruter SOS1, la GTPase responsable de l’activation
de RAS. La mutation de SHP2 dans les domaines N-SH2 et PTP entraîne une inhibition de contact
entre les domaines N-SH2 et PTP et, par conséquent, un gain de fonction de SHP2 et une
augmentation de l’activation de la voie Ras/MAPK chez les patients (Tartaglia et al. 2006).
Le syndrome de Noonan est caractérisé par des phénotypes de pénétrance variable avec
des anomalies crânio-faciales, des malformations du squelette, un retard mental ainsi que des
anomalies cardiovasculaires. Parmi ces dernières, la sténose pulmonaire est la plus fréquente
(environ 50-60% des patients). Le premier modèle animal pour ce syndrome a été généré en 2004.
La souris Ptpn11D61G/+ présente une mutation observée chez les patients NS et leur viabilité est
variable. En effet, environ 50% des souris Ptpn11D61G/+ survivent, alors que toutes les souris
Ptpn11D61G/D61G meurent à E13.5. Parmi les souris Ptpn11D61G/+ qui survivent, 100% présentent des
anomalies crânio-faciales ainsi que des troubles de croissance et 50% présentent des malformations
cardiaques. Une augmentation de l’activation de ERK, tel que révélée par une augmentation du
marquage p-ERK est observée par immunohistochimie (Araki et al. 2004).
D’autres gènes sont associés au SN. Les mutations du gène SOS1 représentent 15% des
cas, alors que les mutations des gènes KRAS et RAF1 sont rares. Toutes ces mutations entraînent
un gain de fonction de la protéine mutée et une suractivation de la voie Ras/MAPK. À ce jour, il
existe des modèles animaux pour des mutations pour chacun de ces gènes : la mutation KRasV14I, la
mutation Raf1D486N et la mutation Sos1E846K (Chen et al. 2010; Wu et al. 2012; Hernandez-Porras et
al. 2014). Pour tous ces mutants, on rapporte la présence d’anomalies cardiaques et de croissance,
avec une pénétrance variable selon la mutation et le fond génétique. Ces observations sont en
accord avec la variété de phénotypes observés chez l’humain.
1.5.1.3 Syndrome de Costello (SC)
Le syndrome de Costello est un syndrome rare des Rasopathies. La prévalence de la
maladie est d’une naissance sur 380 000. À ce jour, environ 100 cas ont été répertoriés. Il s’agit
d’une maladie congénitale caractérisée par différentes anomalies. Les patients atteints présentent
principalement des anomalies cardiaques, faciales et cutanées. Les anomalies cardiaques affectent
61
environ 80% des patients et varient selon les cas. La plupart des sujets concernés souffrent d’une
hypertrophie cardiaque, d’anomalies des valves cardiaques ou d’arythmie. Le taux de mortalité est
élevé au cours des premières années surtout en raison des complications cardiaques (Tidyman et al.
2008).
Les patients portent une mutation germinale hétérozygote dans le gène HRAS. Le résidu le
plus fréquemment muté est le résidu G12. 80% de ces patients présentent une mutation dominante
HRASG12S. La seconde mutation la plus retrouvée est la mutation HRASG12A. Cette mutation cause la
substitution d’une guanine responsable de la liaison de HRAS avec la GTPase, ce qui entraîne une
diminution de l’activité GTPase et l’accumulation de HRAS actif. Par conséquence, la voie
Ras/MAPK est suractivée (Tidyman et al. 2008). Le SC est la seule Rasopathie qui présente un biais
parental avec une transmission du chromosome muté d’origine paternelle (Sol-Church et al. 2006).
Le premier modèle animal généré pour le SC porte la mutation HrasG12V. Les souris
hétérozygotes ne présentent aucun phénotype apparent, alors que les souris HrasG12V/G12V
présentent des malformations faciales ainsi que des anomalies cardiaques. Étonnamment, alors que
les mutations sur le résidu G12 sont connues pour être des mutations activatrices de la voie
Ras/MAPK cette mutation G12V chez la souris n’entraîne pas d’augmentation de l’activation de la
voie, ce qui se traduit par une phosphorylation inchangée de ERK (Schuhmacher et al. 2008). Un
autre groupe de recherche a produit une lignée de souris portant la même mutation HrasG12V en
utilisant une autre stratégie. Contrairement aux premières souris produites, les souris HrasG12V/G12V
meurent à la naissance. Elles ont des anomalies crâniennes et sont sujettes à développer des
angiosarcomes ainsi que des papillomes causés par la suractivation de la signalisation HRAS (Chen
et al. 2009). Ces données montrent bien la variabilité des phénotypes associés au syndrome.
1.5.2 Le syndrome cardio-facio-cutané (CFC)
Le syndrome cardio-facio-cutané est un syndrome très rare. Il a été décrit en 1986 comme
correspondant à des patients qui présentent une insuffisance cardiaque congénitale, un faciès
particulier, une petite stature ainsi que des anomalies de l’ectoderme (Reynolds et al. 1986). Même si
la prévalence de la maladie est inconnue, au Japon elle a été estimée à 1 naissance sur 180,000. À
ce jour, une centaine de cas ont été répertoriés dans la littérature et le nombre de cas dans le monde
est estimé à quelques centaines.
62
Comme le nom du syndrome l’indique, les principaux phénotypes sont cardiaques, faciaux et
cutanés. De plus, certains phénotypes observés dans le CFC sont communs à ceux observés chez
les patients souffrant du syndrome de Noonan ou du syndrome de Costello.
1.5.2.1 Les symptômes du CFC
1.5.2.1.1 L’atteinte cardiaque
Les patients souffrant du syndrome CFC vont présenter plusieurs anomalies cardiaques. La
majorité des patients CFC analysés présentent une sténose pulmonaire, qui résulte d’une anomalie
causant un obstacle qui empêche le sang de passer du ventricule droit vers le poumon par l’artère
pulmonaire. La sténose pulmonaire peut être provoquée par : 1- une malformation de la valve
pulmonaire, 2- un défaut du cône artériel (qui correspond à la partie du ventricule droit situé sous la
valve) ou 3- une sténose de l’artère pulmonaire elle-même. La sténose pulmonaire peut engendrer
une cardiopathie de sévérité variable.
La seconde atteinte cardiaque la plus fréquemment observée chez les patients est une
cardiomyopathie hypertrophique. Cette anomalie se caractérise par une hypertrophie du muscle
cardiaque et elle est responsable de la troisième atteinte cardiaque la plus observée, soit une atteinte
du septum auriculaire (qui sépare les deux oreillettes) et/ou ventriculaire (qui sépare les deux
ventricules) (Allanson et al. 2011). Des troubles du rythme cardiaque peuvent aussi être observés
chez certains patients.
Les malformations congénitales cardiaques, comme la sténose pulmonaire, sont présentes
dès la naissance. Cependant, la cardiomyopathie hypertrophique ainsi que les troubles du rythme
cardiaque peuvent se manifester plus tardivement dans la vie du patient.
1.5.2.1.2 L’atteinte cranio-faciale
L’anomalie la plus fréquemment observée chez les patients CFC est une macrocéphalie
relative, qui correspond à une augmentation conséquente du volume de la tête par rapport au reste
du corps. Cette anomalie est présente à la naissance. Les enfants atteints présentent un front long,
un nez petit et large, un large espace entre les deux yeux et des paupières tombantes. De plus, ces
enfants ont une largeur de crâne augmentée (Roberts et al. 2006).
63
1.5.2.1.3 L’atteinte de l’ectoderme
L’atteinte ectodermique concerne l’épiderme, les cheveux ainsi que les ongles. Au niveau de
l’épiderme, les patients sont atteints de xérose, qui consiste en un dessèchement de la peau, une
hyperkératose sur les jambes, les bras et le visage ainsi qu’une kératose pilaire. La kératose
correspond à une surproduction de kératine qui entraîne un épaississement de la partie la plus
superficielle de la peau. Les patients sont sujets à développer de l’eczéma ainsi que des érythèmes.
De plus, comme les patients atteints par les autres Rasopathies, les patients CFC vont présenter des
taches « café au lait » : Leurs cheveux ainsi que les sourcils de ces patients sont épars ou absents.
Enfin, la croissance de leurs ongles est altérée (Roberts et al. 2006).
1.5.2.1.4 L’atteinte neurologique
L’atteinte neurologique est présente chez tous les patients CFC. Un retard intellectuel ainsi
qu’un retard du développement sont observés, à des degrés différents, chez la majorité des patients.
Les patients CFC présentent aussi une hypotonie (diminution du tonus musculaire). D’autres
anomalies neurologiques, telles que l’épilepsie et l’hydrocéphalie, peuvent être observées chez
certains patients (Pierpont et al. 2014).
1.5.2.1.5 Les autres atteintes
D’autres symptômes sont aussi observés chez les patients CFC à une moindre fréquence
telle une atteinte ophtalmique, qui correspond à une diminution de l’acuité visuelle, un strabisme, un
astigmatisme et/ou une myopie. Certains cas d’hypoplasie du nerf optique et de cataracte ont été
rapportés. Les défauts oculaires sont liés à l’âge.
Certains patients CFC présentent aussi des troubles gastro-intestinaux. Ces troubles se
révèlent dès les premières années de vie. En effet, la première manifestation est la difficulté à se
nourrir qu’ont certains des patients CFC. Chez le nourrisson, ces troubles se manifestent par des
difficultés de succion et d’aspiration. Une des conséquences de cette difficulté à se nourrir est un
retard staturo-pondéral. Certains patients vont présenter des reflux gastro-œsophagiens ainsi que
des anomalies rénales.
Enfin, certains patients développent des problèmes musculo-squelettiques, dont les
principaux sont une déformation du pectus, une scoliose ainsi qu’une cyphose (Allanson et al. 2011;
Pierpont et al. 2014).
64
Le syndrome cardio-facio-cutané est donc caractérisé par un large spectre de phénotypes
ayant une grande variabilité. Il est rare qu’un patient présente toutes les caractéristiques de la
maladie.
1.5.2.2 Les aspects moléculaires du CFC
Le syndrome CFC a longtemps était classé dans la même catégorie que les syndromes de
Noonan et de Costello. Ce n’est qu’au début des années 2000, par la découverte des gènes
impliqués dans chacun des syndromes, que ces syndromes ont été distingués les uns des autres. En
2006, Rodriguez-Viciana et ses collaborateurs ont montré, après une analyse de 23 patients CFC,
que 18 d’entre eux avaient des mutations dans le gène BRAF et 5 avaient des mutations dans les
gènes MEK1 et MEK2 (Rodriguez-Viciana et al. 2006). La même année, une autre étude sur 43
patients a permis de mettre en évidence des mutations dans le gène KRAS (3 individus sur 43)
associées au syndrome CFC (Niihori et al. 2006). Ainsi, quatre gènes impliqués (BRAF, KRAS,
MEK1 et MEK2) dans la voie Ras/MAPK sont associés au syndrome CFC.
1.5.2.2.1 Les mutations du gène BRAF
La protéine BRAF partage trois régions conservées avec les autres kinases RAF, soit les
domaines CR1, CR2 et CR3. Le domaine CR1 contient un domaine riche en cystéines, responsable
de la liaison à RAS, alors que le domaine CR2 est riche en résidus sérine-thréonine. Finalement,
c’est dans le domaine CR3 que se trouve le domaine kinase. Plusieurs groupes de recherche ont
identifié différentes mutations dans le gène BRAF associées au CFC. La majorité des mutations se
trouvent dans le domaine CR3, le domaine catalytique de la protéine. Les autres mutations se
trouvent dans la région CR1. Toutes les mutations observées sont des substitutions. Aucune
mutation non-sens, d’épissage ou causant des changements de phase n’a été répertoriée. Ainsi
l’haploinsuffisance de BRAF n’est pas un mécanisme qui cause le CFC. La mutation la plus
fréquente est BRAFQ257R. La conséquence fonctionnelle des mutations a été analysée en comparant
l’activité kinase des protéines BRAF de type sauvage ou muté dans des cellules HEK293T
transfectées avec les différents vecteurs d’expression (Rodriguez-Viciana et al. 2006). L’activité
kinase a été quantifiée en comparant la phosphorylation des kinases situées en aval de BRAF, soit
MEK1/2 et ERK1/2, avec BRAF de type sauvage ou BRAF mutant. Parmi les mutations testées, la
65
plupart ont une activité kinase augmentée alors que d’autres ont une activité kinase diminuée par
rapport au témoin. Une étude a montré que la baisse d’activité kinase de BRAF peut entraîner
l’activation de MEK1/2 et ERK1/2 via CRAF (Heidorn et al. 2010).
Des mutations somatiques de BRAF sont connues pour être associées au mélanome. Ces
mutations ne sont pas dans le même domaine que les mutations associées au CFC.
1.5.2.2.2 Les mutations des gènes MEK1 et MEK2
Plusieurs mutations dans les gènes MEK1 et MEK2 sont associées au syndrome CFC et
elles représentent 25% des cas. Ce sont des mutations sporadiques. Pour le gène MEK1, les
mutations sont localisées dans les exons 2 et 3 alors que pour le gène MEK2, les mutations sont
localisées dans les exons 2, 3 et 7. La plupart des mutations sont dans le domaine kinase des
protéines. Certaines mutations ont été caractérisées biochimiquement par transfection dans des
cellules HEK293T. Quatre mutations ont été testées pour MEK1 : MEK1F53L, MEK1F53C, MEK1F53S et
MEK1Y130C. Deux mutations ont été testées pour MEK2 : MEK2F57C et MEK1Y134C. L’expression de
chacune des protéines mutées est transfectée dans des cellules HEK293T cause une hausse de la
quantité de ERK phosphorylée, comparativement à la transfection des protéines de type sauvage.
Cette augmentation de pERK reflète l’augmentation de l’activité kinase des protéines MEK1 et MEK2
testées (Rodriguez-Viciana et al. 2008). Les auteurs concluent de ces observations que le syndrome
CFC est dû à une suractivation de la voie Ras/MAPK. Cependant, dans cet essai, il nous est
impossible d’évaluer si la quantité de protéine produite après suractivation de MEK1 de type sauvage
est équivalente à la quantité de protéine produite après suractivation des MEK1 mutants. Il est donc
difficile d’associer ces mutations ponctuelles à la suractivation de la voie Ras/MAPK avec cet essai.
Parmi les mutations associées au CFC dans les gènes MEK1 et MEK2, les plus fréquentes
sont les mutations sur MEK1 et plus précisément la mutation MEK1Y130C (Dentici et al. 2009). Aucune
mutation entraînant une haploinsuffisance n’a été répertoriée pour MEK1. Récemment, sept patients
CFC portant une délétion incluant le gène MEK2 sur le chromosome 19, ont été identifiés. Cette
étude suggère que l’haploinsuffisance de MEK2 pourrait être associée au CFC (Nowaczyk et al.
2014).
66
1.5.2.3 Les modèles animaux pour le syndrome cardio-facio-cutané
Le syndrome CFC étant une maladie rare, très peu de modèles animaux ont été générés à
ce jour.
1.5.2.3.1 Les modèles animaux avec une mutation dans le gène BRaf
BRAF étant le gène le plus touché (75% des cas de CFC), il n’est pas étonnant que les
premiers modèles animaux soient consacrés à l’étude de ce gène. Le premier modèle animal a été
généré chez le poisson zèbre en 2009 (Anastasaki et al. 2009). Deux mutations ont été étudiées
durant cette recherche. La mutation BRAFQ257R représente la mutation la plus fréquente chez les
patients et elle a été montrée, in vitro, comme étant une mutation activatrice (Rodriguez-Viciana et al.
2006; Rodriguez-Viciana et al. 2008). La mutation BRAFG596V a, quant à elle, été associée à une
inactivation de l’activité kinase de BRAF (Rodriguez-Viciana et al. 2008). Par contre, la mutation
BRAFV600E associée au mélanome est activatrice. Anastasaki et ses collaborateurs prennent cette
mutation comme référence d’activation de l’activité kinase de BRAF. Les auteurs ont montré que la
présence des mutations BRAFQ257R, BRAFG596V et BRAFV600E n’empêche pas les premières étapes
des divisions cellulaires ni l’initiation de la gastrulation (Anastasaki et al. 2009). Cependant, pendant
les stades tardifs de développement, ces mutations bloquent le développement des parties caudales
de l’embryon. Ces données suggèrent que l’activation et l’inhibition de l’activité kinase de BRAF
entraînent le même phénotype in vivo. Les auteurs ont aussi utilisé des inhibiteurs de la voie
Ras/MAPK afin d’étudier le rôle de l’hyperactivation de la voie dans l’apparition du phénotype. En
utilisant deux types d’inhibiteurs, un inhibiteur des kinases MEK ainsi qu’un inhibiteur du récepteur
FGFR1, ils observent une disparition du phénotype uniquement chez les poissons injectés avec les
formes mutées associées au CFC (Anastasaki et al. 2009). L’administration de faibles doses
d’inhibiteur de MEK de manière continue montre que le phénotype développemental causé par la
présence de protéines BRAF mutées est dissipé (Anastasaki et al. 2012). Ces données suggèrent
que l’augmentation de l’activité de la voie Ras/MAPK serait responsable des phénotypes du
syndrome CFC.
Un autre modèle de souris portant une mutation Braf a été généré en 2011 par Urosevic et
ses collaborateurs. Sachant que les mutations associées au CFC sont toutes caractérisées comme
étant activatrices, les auteurs ont utilisé la lignée de souris hypomorphes pour la mutation
BRAFLSLV600E. Cet allèle exprime BRAFLSLV600E à un niveau correspondant à 5 à 10% le niveau de
67
l’allèle de type sauvage. Son expression n’entraîne pas la suractivation de l’activité kinase car
aucune augmentation de la phosphorylation de MEK1/2 et ERK1/2 n’a été observée. Ces souris
présentent une durée de vie qui varie selon le fond génétique, avec un effet drastique dans un fond
génétique C57BL6. Dans un fond génétique C57BL/6/129, 35 % des souris meurent dans les trois
premières semaines de vie. De plus, elles présentent des anomalies crânio-faciales, une cataracte,
une augmentation du nombre d’astrocystes, caractérisée par le nombre de cellules GFAP positives,
ainsi qu’une cardiomégalie (Urosevic et al. 2011). Cette étude montre que, contrairement à ce qui a
été observé chez le poisson zèbre, l’apparition des phénotypes du syndrome CFC n’est pas due à
l’augmentation de la voie Ras/MAPK. Sachant que la régulation de la voie Ras/MAPK est très
importante pour l’homéostasie cellulaire, il n’est pas exclu qu’une légère dérégulation localisée de la
voie puisse causer ces phénotypes.
Récemment, une équipe a généré un modèle animal avec la mutation la plus fréquemment
retrouvée chez les patients CFC, soit la mutation BRAFQ257R, qui correspond chez la souris à la
mutation BrafQ241R (Inoue et al. 2014). Les souris Braf+/Q241R meurent à E16.5 pendant la gestation.
Ces souris présentent plusieurs malformations cardiaques telles qu’une hypertrophie de la valve
pulmonaire et une anomalie du septum ventral, qui explique fort probablement la mortalité des
embryons. Aucune augmentation de la phosphorylation de ERK n’a été observée chez ces mutants.
Toutefois, les cibles suivantes de ERK, soit Etv1, Etv4 et Etv5, ont vu leur expression augmentée
dans le cœur. Le traitement avec un inhibiteur de MEK permet de réduire la mortalité et d’améliorer
les phénotypes faciaux. L’association d’inhibiteurs de MEK et de l’histone H3K27 deméthylase
empêche aussi la mortalité embryonnaire et améliore les phénotypes cardiaques. Le mécanisme
permettant cette amélioration du phénotype n’est pas encore connu (Inoue et al. 2014).
Ces données suggèrent que l’apparition des phénotypes du syndrome CFC est la résultante
de la dérégulation de plusieurs mécanismes dont les liens demeurent mal compris.
1.5.2.3.2 Les modèles animaux avec une mutation dans les gènes Mek1 et Mek2
Les mutations dans les gènes MEK1/2 représentent 25% des patients CFC. Le seul modèle
animal pour une mutation dans les gènes Mek1/2 est un modèle chez le poisson zèbre portant les
mutations MEK1Y130C et MEK2F57C. Les poissons qui expriment ces protéines mutées ont un
développement perturbé. En effet, pendant les stades tardifs de développement, les embryons ne
développent pas de queue. Ces mutations ont été caractérisées in vitro comme étant activatrices
68
(Rodriguez-Viciana et al. 2006; Rodriguez-Viciana et al. 2008). Ainsi, en utilisant des inhibiteurs de la
voie Ras/MAPK, le défaut développemental observé n’est plus présent. Ces données suggèrent que
ces anomalies seraient dues à une suractivation de la voie Ras/MAPK.
À ce jour, aucun modèle mammifère n’a été généré afin de répondre à la question de
l’impact des mutations Mek1/2 sur le développement embryonnaire ainsi que sur l’apparition des
phénotypes du syndrome CFC.
1.6 Problématiques et objectifs
Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont porté sur les kinases MEK1 et MEK2.
Au fil des années, la redondance fonctionnelle entre ces kinases a constitué le sujet de plusieurs
études. Dans le laboratoire, l’observation des souris invalidées pour chacun de ces gènes a permis
de montrer que, contrairement à Mek2, Mek1 est essentiel pour la survie. Cependant, la génération
de souris Mek1+/-Mek2+/- a permis de montrer que Mek1 et Mek2 sont essentiels au développement
du placenta et ce qui suggère que le dosage des gènes Mek1 et Mek2 est important pour la survie
(Giroux et al. 1999; Belanger et al. 2003; Bissonauth et al. 2006; Nadeau et al. 2009). Certaines
évidences suggèrent que les kinases MEK1 et MEK2 sont redondantes, alors que d’autres proposent
que chacune a une fonction qui lui est propre. Sachant que la protéine d’échafaudage MP1 est la
seule à avoir une spécificité de liaison avec MEK1, elle est présentée comme étant un modulateur de
la signalisation ERK/MAPK passant par MEK1. De plus, il est connu qu’une mutation germinale de
MEK1 chez l’Homme, entraîne la dérégulation de la voie ERK/MAPK et cause le syndrome CFC
classé parmi les rasopathies. Par conséquent, les objectifs de mes travaux de doctorat étaient :
- D’étudier, in vivo, la redondance fonctionnelle des kinases MEK1 et MEK2 via la génération
d’une souris qui exprime l’ADNc de Mek2 sous le contrôle des séquences régulatrices de
Mek1.
- D’étudier le rôle, in vivo, de la protéine d’échafaudage MP1 au cours du développement via
l’analyse de la souris invalidée pour le gène Mp1.
- De générer un modèle animal pour le syndrome CFC associé à la mutation Mek1Y130C.
69
Les chapitres qui suivent présentent les résultats obtenus à l’issue de mon doctorat (chapitres 2, 3 et
4). La liste de mes autres contributions effectuées au fil de mon doctorat est présentée en annexe.
70
Chapitre 2
Functional redundancy of the kinases MEK1 and MEK2: Rescue of the Mek1
mutant phenotype by Mek2 knockin reveals a protein threshold effect
Rifdat Aoidi1, Annie Maltais1 and Jean Charron1,2,*
1Centre de recherche sur le cancer de l’Université Laval,CRCHUQ, L’Hôtel-Dieu de Québec, Québec, Canada
G1R 3S3
2Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry and Pathology, Université Laval, Québec, Canada
G1V 0A6
* Corresponding author:
Jean Charron
Centre de recherche sur le cancer de l’Université Laval
CRCHU de Québec, L’Hôtel-Dieu de Québec
9, rue McMahon
Québec, QC
Canada G1R 3S3
Phone : 1-418-525-4444 ext. 15557
Fax : 1-418-691-5439
e-mail: [email protected]
(Article publié le 26 Janvier 2016 dans la revue Science Signaling, 9(412):ra9. doi: 10.1126/scisignal.aad5658)
71
72
2.1 Avant-propos
Les kinases MEK1 et MEK2 ont été l’objet de plusieurs études tentant de statuer sur la
redondance fonctionnelle ou la spécificité de ces deux kinases. Les membres du laboratoire du Dr
Charron ont permis d’approfondir la connaissance sur le rôle in vivo des gènes Mek1 et Mek2 à l’aide
de l’analyse de souris mutantes pour Mek. Les souris Mek1-/- meurent à mi-gestation alors que les
souris Mek2-/- survivent sans aucun phénotype apparent indiquant un rôle spécifique pour chacune
des kinases lors du développement. Les collègues du laboratoire Charron ont généré l’allèle
conditionnelle de Mek1 (Mek1flox/flox) afin d’analyser sont rôle dans différents tissus. L’inactivation de
Mek1 dans les tissus embryonnaires, obtenue en croisant les souris Mek1flox/flox avec des souris
portant le transgène Sox2-Cre, a mis en évidence le rôle essentiel de Mek1 dans le développement
du placenta. Ces données indiquent que les fonctions de MEK1 et MEK2 seraient les mêmes dans
le développement de l’embryon mais pas dans le placenta, et que MEK1 aurait un rôle essentiel dans
le développement du placenta. Cependant, les collègues du laboratoire Charron ont montré que les
souris Mek1+/-Mek2+/- meurent pendant la gestation de défauts placentaires, suggérant un rôle de
MEK1 et MEK2 dans le développement du placenta.
Afin de pousser l’analyse de la redondance fonctionnelle de MEK1 et MEK2 au cours du
développement chez la souris, nous avons émis l’hypothèse qu’une variation d’expression spatiotemporelle de MEK1 et MEK2 pourrait expliquer le rôle unique de chacune dans le placenta. Nous
avions pour objectif de répondre à la question suivante : Lorsqu’exprimé à la place de Mek1, est-ce
que Mek2 est capable de remplacer l’absence de Mek1 ? Pour cela nous avons généré une lignée
de souris exprimant l’ADNc de Mek2 sous contrôle du locus Mek1 (Mek12/2).
Les résultats présentés dans cet article nous ont permis de démontrer in vivo, pour la
première fois, la redondance fonctionnelle des kinases MEK1 et MEK2 via le sauvetage du
phénotype létal Mek1-/- chez les souris Mek12/2. Contrairement aux souris Mek1+/-, les souris
hétérozygotes Mek12/- meurent pendant la gestation avec un phénotype similaire aux mutants
Mek1+/-Mek2+/-. Cela suggère soit que MEK2 est moins active que MEK1 ou qu’il ya une différence
dans le niveau d’expression de MEK1 et MEK2. Nous avons montré que dans le placenta la protéine
MEK1 est deux fois plus exprimée que la protéine MEK2 et que notre allèle knockin Mek12 entraîne
l’expression d’une protéine au même niveau que MEK2. L’analyse de mutants combinés Mek1/2
nous a permis de montrer qu’un dosage minimal de protéine MEK est requis pour le développement
du placenta et la survie.
73
Annie Maltais et le Dr Charron ont contribué à la génération des différentes constructions du
vecteur de ciblage permettant l’insertion, dans l’exon 1 de Mek1, des ADNc de Mek1 et Mek2 (Figure
2.S1). Le Dr Jean Charron a effectué l’électroporation de la construction dans des cellules ES et la
sélection des cellules ES contenant l’évènement de recombinaison homologue. Avec la collaboration
de Mme Marcelle Carter, responsable de l’unité de transgénèse, le Dr Charron a micro-injecté les
cellules ES précédemment sélectionnées dans des blastocystes et ces derniers ont été réimplantés
dans les cornes utérines des souris receveuses. J’ai réalisé les études de transmission ainsi que
l’établissement de la lignée Mek12/2.
J’ai effectué toutes les analyses de caractérisation la lignée Mek12/2 et des mutants portant
les diverses combinaisons alléliques Mek1 et Mek2. J’ai effectué le maintien et le génotypage de la
colonie de ces lignées, les prélèvements des spécimens d’intérêt, les analyses histologiques et
immunologiques, les essais qPCRs et les immunobuvardages.
Finalement, j’ai contribué à l’analyse des résultats ainsi qu’à la rédaction de l’article,
conjointement avec mon directeur de recherche. J’ai rédigé la version initiale que mon directeur a par
la suite corrigée et modifiée. De plus, nous avons reçu une aide précieuse de la Dre Lucie Jeannotte
pour la correction du manuscrit.
74
2.2 Résumé
Les mammifères possèdent deux MAPK kinases (MEK1 et MEK2), impliquées dans l’activation de la
voie ERK essentielle pour la différenciation, la prolifération et la survie cellulaire. Les embryons
Mek1-/- meurent à E10.5 d’une malformation du placenta. Les souris Mek2-/- ne présentent aucun
phénotype majeur, suggérant que ces deux protéines ont des rôles différents. La plupart des mutants
Mek1+/-Mek2+/- meurent pendant la gestation d’un sous-développement du placenta, indiquant que
Mek1 et Mek2 ont chacun un rôle dans le développement des tissus extraembryonnaires. Afin de
vérifier la spécificité fonctionnelle de Mek1 et Mek2, nous avons généré un allèle knockin, exprimant
l’ADNc de Mek2 sous contrôle du locus Mek1 (Mek12). Les souris Mek12/2 sont viables, fertiles et ne
présentent aucun phénotype apparent, démontrant la redondance entre MEK1 et MEK2. Cependant,
les animaux Mek12/- meurent au cours de la gestation de défauts placentaires et quelques individus
survivent jusqu'à la naissance, un phénotype similaire aux individus Mek1+/-Mek2+/-. Ainsi, MEK2 est
capable de remplacer MEK1 chez les individus Mek12/2 mais non chez les Mek12/-, ces données
suggèrent soit que MEK2 est moins actif que MEK1 ou que les niveaux d'expression protéiques de
MEK1 et MEK2 sont différents. Nous avons montré que l'expression de MEK1 dans le placenta est
deux fois plus élevée que celle de MEK2. De plus, la quantité de protéine produite à partir de l'allèle
Mek12 est diminuée de moitié par rapport à Mek1+. Ainsi, chez des individus Mek12/2, le niveau
d’expression de MEK2 est suffisant pour sauver le phénotype Mek1-/- mais ce seuil n’est pas atteint
chez les individus Mek12/-. De plus, la génération d’une série allélique des gènes Mek1 et Mek2 a
montré l’importance du dosage protéique pour le développement des tissus extraembryonnaires.
Ces différentes observations démontrent la redondance fonctionnelle entre MEK1 et MEK2 et
suggèrent que le sauvetage du phénotype Mek1-/- chez nos individus Mek12/2 est dû à un dosage
protéique suffisant. De plus, ces résultats révèlent l’importance du dosage protéique MEK dans le
développement des tissus extraembryonnaires.
75
76
2.3 Abstract
The mammalian genome contains two mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinases encoding
genes, Mek1 and Mek2. MEKs phosphorylate and activate the two ERK isoforms ERK1 and ERK2.
Mek1-/- embryos die due to placental defects, whereas Mek2-/- mice survive with a normal lifespan
and fertility, suggesting that MEK1 possesses functions not shared by MEK2. However, most Mek1+/Mek2+/- embryos also die from placental defects, indicating that both Mek genes contribute to
placental development. To assess the functional specificity of the Mek1 and Mek2 genes, we
produced a Mek1-knockin allele in which the Mek2 coding sequences were placed under the control
of Mek1 regulatory sequences (Mek12 allele). Mek12/2 mice were viable with no apparent phenotype,
indicating rescue by MEK2 and functional redundancy between the two MEK proteins. However,
Mek12/- embryos with Mek2 in only one of the Mek1 alleles and the other Mek1 allele null died from
abnormal placenta, suggesting a dosage effect. Analysis of mice from a Mek1 Mek2 allelic series
revealed that the occurrence of the placenta phenotype correlated with the amount of MEK protein
independently of which MEK isoform was produced. Thus, although MEK1 and MEK2 can substitute
for each other, a minimum amount of MEK is critical for placenta development and embryo survival.
77
78
2.4 Introduction
Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways consist of cascades of protein kinases
that link extracellular stimuli to targets in different cellular compartments (Wortzel et al. 2011). The
extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway is a major MAPK pathway present in all cells and
is activated by growth factors. In mammals, the ERK pathway involves the kinases ERK1 (also
known as MAPK3) and ERK2 (also known as MAPK1), and the MAPK kinases MEK1 (also known as
MAP2K1) and MEK2 (also known as MAP2K2). The latter are dual-specificity kinases that activate
ERK1 and ERK2 by phosphorylation in response to agonist binding to cell surface receptors
(Morrison 2012). Activated ERK1 and ERK2 phosphorylate multiple intracellular substrates that
regulate cell behavior (Wortzel et al. 2011; Witzel et al. 2012). Consequently, diverse physiological
outputs can be elicited by the ERK pathway, including cell fate determination, differentiation,
proliferation, survival, migration, growth, and apoptosis (Shaul et al. 2007; Sun et al. 2015).
The presence of various isoforms for the different members along the mammalian ERK pathway
reflects the complexity of the controls required to produce the diversity of cellular responses. Gene
duplication is a common event leading to the production of gene families. Following gene duplication,
decreased selection pressure can enable production of proteins with novel function(s) or genes with
altered expression profiles, which results in only partial redundancy among family members. In
mammals, MEK1 and MEK2 proteins are 80% identical and 86% similar. They have two regions of
lower homology: (i) the N-terminus, which includes the ERK docking site (25% identical/53% similar
over 36 residues), and (ii) the proline-rich domain (17% identical/33% similar over 18 residues),
which interacts with the upstream activating kinases of the RAF family (Bromberg-White et al. 2012;
Roskoski 2012). The proline-rich domain also contains a PAK1 (p21-activated kinase 1)
phosphorylation site at Ser298 (numbering based on mouse), which regulates the efficiency of ERK
phosphorylation (Eblen et al. 2002; Park et al. 2007). Although Ser298 is present in MEK2, MEK2 is a
poor substrate for PAK1 (Frost et al. 1997; Park et al. 2007). Moreover, the Thr residues found at
positions 286 and 292 in MEK1, which are involved in feedback regulation of the pathway once
phosphorylated, are not conserved in MEK2, which can lead to distinct activation responses
(Rubinfeld et al. 2005; Catalanotti et al. 2009). Thus, the protein sequence differences between
MEK1 and MEK2 suggest that the two proteins possess unique functions in mammals.
The differential role of MEK1 and MEK2 in signal transduction has been demonstrated during embryo
development by the characterization of mice deficient in Mek1 or Mek2. The Mek1-null mutation
79
results in a recessive lethal phenotype, Mek1-/- embryos dying at embryonic (E) day 10.5 of gestation
from the underdevelopment of the labyrinthine region of the placenta. The placenta consists in three
distinct regions. The external layer in contact with the maternal tissues is composed of trophoblast
giant cells. This external layer is juxtaposed to a spongiotrophoblast cell layer, whereas the innermost
layer adjacent to the embryo constitutes the labyrinthine area where the syncytiotrophoblast cells
lined the maternal sinuses and are intermingled with the embryonic blood vessels (Charron et al.
2012). The highly vascularized labyrinth allows fetal-maternal exchange required to support the
development of the embryo. Decreased vascularization in the labyrinth also occurs in Mek1-/embryos (Giroux et al. 1999). Conversely, Mek2-/- mice are viable and fertile without an obvious
phenotype, suggesting compensatory effects by Mek1 (Bélanger et al. 2003). Conditional deletion of
Mek1 in the embryo but not in extraembryonic tissues generates viable Mek1-/- mice with no apparent
phenotype (Bissonauth et al. 2006), indicating functional redundancy between Mek1 and Mek2 genes
in embryo formation. Functional redundancy is further supported by the lack of phenotypes in animals
in which targeted tissues retain only one Mek1 or Mek2 functional allele; whereas developmental
defects are observed when all Mek1 and Mek2 alleles are deleted (Scholl et al. 2007; Newbern et al.
2008; Yamashita et al. 2011; Li et al. 2012; Shim et al. 2013; Boucherat et al. 2014; Ihermann-Hella
et al. 2014).
However, MEK interchangeability is not observed in the development of the extraembryonic
structures (Bissonauth et al. 2006). Mutants with combined Mek1 and Mek2 haploinsufficiency
(Mek1+/-Mek2+/-) die during gestation from the underdevelopment of the placenta labyrinthine region,
reduced vascularization of the placenta and abnormal differentiation of the syncytiotrophoblasts, the
latter causing the aberrant fusion between the syncytiotrophoblast from layer I and II and the
accumulation of multinucleated trophoblast giant (MTG) cells (Nadeau et al. 2009; Nadeau et al.
2014). Thus, Mek2 contributes to the development of the extraembryonic structures but cannot fully
complement the function of Mek1.
The partial redundancy between Mek1 and Mek2 genes in the placenta may be due to differences in
the spatiotemporal dynamics of gene expression, the amount of gene expression, or the properties of
the proteins. To address the functional equivalence between Mek1 and Mek2 genes in vivo, we
generated knockin mice in which the Mek1 gene was replaced by a cDNA encoding Myc-tagged
MEK2 and lacking the 5’- and 3’-untranslated regions. The Mek2 knockin sequence was controlled by
Mek1 regulatory elements. In mouse homozygous for the resulting allele (Mek12/2), no MEK1 protein
80
was produced and Myc-tagged MEK2 was produced from the Mek1 locus, although at lower
abundance than MEK1 was produced from its native locus. Mek12/2 mice survived and rescued the
Mek1-/- placenta phenotype, indicating a compensatory effect by MEK2. In contrast, we observed a
partial rescue of the placenta phenotype in Mek12/- embryos, which only have one copy of Mek2 in
the Mek1 locus, suggesting that a threshold of MEK activity may be required in the placenta.
Analysis of a series of Mek1 Mek2 allelic mutants revealed that the severity of the placenta
phenotype correlated with lower amounts of MEK. Thus, the data indicated that MEK1 and MEK2 are
functionally redundant once produced in sufficient quantities, but that a minimum threshold of MEK is
essential for placental development and embryo survival.
2.5 Results
2.5.1 Mek2 cdna knockin into the Mek1 locus rescues the Mek1-null
phenotype
To assess if the MEK2 protein can replace MEK1, we designed a targeting vector in which Mek1 and
Mek2 cDNAs were inserted in frame within the ATG of the Mek1 first exon. The first exon of the
resulting Mek11neo2 targeted allele contained a small artificial intron followed by the Mek1 cDNA, a
PGKneopA cassette flanked by FRT sites, the Mek2 cDNA, and a polyadenylation site (Figure
2.S1A). The Mek1 cDNA and the PGKneopA cassette were bordered by loxP sites. Both Mek1 and
Mek2 cDNAs encode a C-terminal Myc-tagged epitope. The Mek11neo2 allele should produce Myctagged MEK1. By Western blot analysis, we detected two bands corresponding to the endogenous
MEK1 protein and the Myc-tagged MEK1 form in Mek1+/1neo2 ES cells (Figure 2.S1B). Less Myctagged MEK1 was produced from the Mek11neo2 allele (Figure 2.S1B, left panel); however, we
confirmed the presence of Myc-tagged MEK1 by Western blotting with an antibody against the Myc
tag (Figure 2.S1B, right panel).
Heterozygous Mek1+/1neo2 mice were bred either with FLPeR mice to specifically remove the
PGKneopA cassette and generate the knockin of Mek1 cDNA into the Mek1 gene (Mek11 allele), or
with Sox2Cre mice to delete the Mek1 cDNA and the PGKneopA cassette and produce the Mek2
knockin into the Mek1 locus (Mek12 allele; Figure 2.S1C). Mek1+/1 and Mek1+/2 heterozygous mutants
were viable and fertile (Table 2.1, table 2.S1).
When we interbred the Mek1+/1 mice, no Mek11/1 mice were recovered at weaning (table 2.S1A). At
E10.5, all Mek11/1 embryos were found dead with no heartbeat. We performed histopathological
analysis of the placenta, comparing wild-type (Mek1+/+) (Figure 2.1A) and Mek11/1 embryos
81
Figure 2.1 : Underdevelopment of the labyrinth in the placenta from Mek11/1 and Mek11neo2/1neo2
mutants.
(A-C) H&E staining of placenta sections from E10.5 control (Mek1+/+), Mek11/1, and Mek11neo2/1neo2
embryos. (D-F) MEK1 immunostaining of placenta sections from E10.5 control, Mek11/1 and
Mek11neo2/1neo2 embryos. Arrows in the labyrinth of Mek11/1 mutants indicate the absence of MEK1 at
its normal location in the placenta. The boxed regions in the upper rows of A-F are magnified in lower
rows. Scale bars: 50 µm. (G) Western blot analysis of MEK1 and ERK2 expression in E10.5 embryos
of the indicated genotypes. (H) qRT-PCR analysis of Mek1 expression in placenta from E10.5
control, Mek11/1, and Mek11neo2/1neo2 embryos (n=3/genotype).
82
83
(Figure2.1B), which revealed the absence of labyrinth development in Mek11/1, a phenotype similar to
that observed in Mek1-/- mutants (Giroux et al. 1999; Bissonauth et al. 2006). Mek1+/1neo2 intercrosses
also led to the death of the Mek11neo2/1neo2 embryos from placental defects, but at a later stage starting
at E12.5 (Figure 2.1C; Table 2.1, table 2.S1B).
Because we detected less Myc-tagged MEK1 produced by the Mek11neo2 allele in ES cells (Figure
2.S1B), we assessed if the Mek11neo2 and Mek11 alleles produced Myc-tagged MEK1 in the embryo.
We performed MEK1 immunostaining on placenta sections from E10.5 Mek1+/+ (Figure 2.1D), Mek11/1
(Figure 2.1E), and Mek11neo2/1neo2 (Figure 2.1F) embryos. Mek11neo2/1neo2 specimens had reduced
MEK1 staining in the labyrinth, whereas the labyrinth of Mek11/1 embryos lacked any detectable
Table 2.1: Viability relative to Mendelian predicted ratios for Mek11/1, Mek11neo2/1neo2,
Mek12/2 and Mek12/- embryos and mice. For additional details, see tables S1 and S2.
Predicted distributions are indicated in parentheses. W is weaned; P is day of birth.
Percent of each genotype (predicted)
Age: Percent observed
Crosses
Mek1+/1 x Mek1+/1
Mek1+/+ (25)
E10.5: 45
W3-4: 24
Mek1+/1 (50)
E10.5: 55
W3-4: 76
Mek11/1 (25)
E10.5: 0
W3-4: 0
Mek1+/1neo2 x
Mek1+/1neo2
Mek1+/+ (25)
E12.5: 35
W3-4: 41
Mek1+/1neo2
(50)
E12.5: 46
W3-4: 59
Mek11neo2/1neo2
(25)
E12.5: 19
W3-4: 0
Mek1+/2 x Mek1+/2
Mek1+/+ (25)
E10.5: 33
W3-4: 16
Mek1+/2 (50)
E10.5: 33
W3-4: 56
Mek12/2 (25)
E10.5: 33
W3-4: 28
Mek1
-/-
x Mek1
Mek12/- (100)
E12.5: 5 alive/2 dead
P0: 7 alive/1 dead
2/2
Mek1-/- x Mek1+/2
Mek1+/- (50)
E18.5: 60
P0: 25
84
Mek12/- (50)
E18.5: 40
P0: 75
MEK1, likely explaining their death earlier during gestation. In parallel, Western blot analyses of total
protein extracts from E10.5 wild-type, Mek11neo2/1neo2, and Mek11/1 embryos with a MEK1 antibody
revealed a lack of detectable Myc-tagged MEK1 in the mutant embryos (Figure 2.1G).
The low amounts of Myc-tagged MEK1 could be due to reduced transcription of the Mek11neo2 and
Mek11 targeted alleles, inefficient translation of the mutant transcripts, or instability of the mutant
transcripts. Alternatively, the half-life of Myc-tagged MEK1 could be lower than that of wild-type
MEK1. We measured Mek1 transcript abundance by qRT-PCR analysis of RNA from E10.5 wild-type,
Mek11neo2/1neo2, and Mek11/1 placentas using primers located in the 5'-untranslated region common to
all Mek1 alleles (Figure 2.S1A). We observed a decreased trend in the amount of Mek11 and
Mek11neo2 transcripts (Figure 2.1H), suggesting that diminished transcription of the Mek11neo2 and
Mek11 alleles contributed to the reduced amounts of Myc-tagged MEK1. However, ineffective
translation and decreased protein half-life could also participate.
When Mek1+/2 heterozygotes were bred together, Mek12/2 homozygous mutants were obtained at the
expected Mendelian ratio (Table 2.1, table 2.S1C). Mutants from both sexes were fertile with a
normal lifespan and no obvious phenotypes. Histological analysis of placenta from wild-type, Mek1+/2
and Mek12/2 embryos showed that Mek12/2 specimens were indistinguishable from controls (Figure
2.2A-C). Quantification of the number and the surface of MTG cells and the size of the labyrinth
showed no differences (Table 2.2). These data demonstrated that Myc-tagged MEK2 functionally
replaced MEK1 for the development of the extraembryonic structures, rescuing the embryonic lethal
phenotype of Mek1-null mutants.
As a more stringent test, we performed breedings between Mek1-/- and Mek1+/2 or Mek12/2 mice to
generate Mek12/- heterozygotes, in which the amount of Myc-tagged MEK2 would be predicted to be
half the quantity present in Mek12/2 mice. Although at E12.5 and E14.5, the mice had normal litter
sizes, some embryos were dead (Table 2.1, table 2.S1D). Placentas from Mek12/- embryos were
abnormal with a smaller labyrinthine region and the presence of MTG cells (Figure 2.2D; Table 2.2).
At E18.5, the number of alive Mek12/- embryos was greatly reduced (table 2.S1D), but the surviving
embryos appeared to be growing normally when compared with Mek1+/- embryos (Figure 2.S2A,B).
Most Mek12/- embryos were found dead with a hemorrhaging placenta (Figure 2.S2C). Examination of
placentas from surviving and necrotic embryos revealed that the surviving embryos had some
placental defects (Figure 2.S2D, E); whereas necrotic embryos had severely disorganized placentas
with extensive hemorrhage (Figure 2.S2F). The surviving embryos also were of a similar weight as
85
Figure 2.2 : Normal development of the labyrinth in Mek12/2 mutants.
(A-D) H&E staining of placenta sections from E12.5 control, Mek1+/2, Mek12/2, and Mek12/- embryos.
The boxed regions in the left panels are magnified in the right panels. Asterisks in D (right panel)
indicate MTG cells associated with labyrinth underdevelopment. Scale bars: 50 µm. The scale bar for
A-D left side panels is in A, the scale bar for A-C right side is in A, the scale bar for D right side is in
D. (E) qRT-PCR analysis of Mek1 expression in placenta from E14.5 control and Mek12/2 embryos
(n=3/genotype). (F) Western blot analysis of MEK1, MEK2, Myc-tagged MEK2, p-ERK, and ERK2 in
placenta from E10.5 Mek1-/- and E.14.5 Mek1+/+, Mek1-/-, Mek2-/-, Mek1+/2, and Mek12/2 embryos. An
antibody detecting MEK1 and both MEK2 isoforms was used (upper panel). Data are representative
of at least three experiments.
86
87
Table 2.2. MTG phenotype in the different Mek1 Mek2 mutants. The number of
specimens with MTG out of the total number of specimens analyzed at E12.5. Four sections ∼100
μm apart were analyzed for each specimen to estimate the number of MTG. Mek1+/+ Mek2+/+,
Mek1+/2 Mek2+/+, and Mek1+/+ Mek2+/- littermates were used as controls.
Genotype
Number of
specimens
with MTG
Number of
MTG per
specimen
Surface occupied
by MTG
( x10–3 mm2)
Surface of the
labyrinth
(x10–3 mm2)
Controls
0/7
0±0
0±0
3.1±0.4
Mek12/2
1/4
0.3±0.57
4.1±2.1
3.1±0.4
Mek12/-
7/7
8.9±5
98.3±49.9
2.4±0.7*
Mek12/2 Mek2+/-
8/9º
7.3±5
89.4±85.6
2±0.8*
Mek1+/2 Mek2-/-
10/12º
8.9±7
73.9±56.9
2±0.6*
Mek1+/- Mek2+/- ‡
13/13
8.3±4
89.7±50.1
2.4±0.7*
º The specimens without MTG had no labyrinth development.
* P<0.05, the surface of the labyrinth was compared to the value from controls.
‡ Data from (25)
age-matched Mek1+/- embryos (Figure 2.S2G), indicating that the placental defects did not impede
growth. However, at birth, few Mek12/- pups were recovered (table 2.S1D-E). These data indicated
that Mek12/- mutants recapitulated the phenotype of the Mek1+/- Mek2+/- double heterozygotes, which
either died from an underdeveloped placenta or survived at birth (Nadeau et al. 2009). Thus, MEK2
can fully replace MEK1 function in Mek12/2 but not in Mek12/- embryos, suggesting either that MEK2 is
less active than MEK1 or that a difference in the amount of the proteins resulted in the different ability
to rescue.
2.5.2 MEK1 is approximately twice more abundant than MEK2 in the placenta
To assess the importance of MEK abundance in the placenta phenotype, we compared RNA and
protein levels from the Mek1+ and Mek12 alleles. Quantitative analysis of RNA from E14.5 Mek1+/+
and Mek12/2 placentas showed no significant difference in steady-state transcript abundance between
the two genotypes (Figure 2.2E), indicating that the RNA expression of Mek2 from the Mek1 locus
(Mek12 knockin allele) was equivalent to the expression of the endogenous Mek1 gene. We
performed Western blot analyses of protein extracts from the placentas of E10.5 Mek1-/- and E.14.5
88
Mek1+/+, Mek2-/-, Mek1+/2, and Mek12/2 embryos using an antibody recognizing an epitope common to
MEK1 and MEK2 (Figure 2.2F, Figure 2.S3A). Placentas from wild-type (Mek1+/+) embryos had more
MEK1 than MEK2. The abundance of MEK1 in Mek2-/- mutants was greater than that of MEK2 in
Mek1-/- mutants. Similar amounts of MEK2 and Myc-tagged MEK2 were produced from the Mek2+
endogenous and Mek12 knockin alleles, respectively (Figure 2.S3B, ratio of MEK2/Myc-tagged MEK2
~1). In the placenta of Mek1+/2 embryos [with 3 copies of Mek2 (the two wild-type alleles in the
endogenous locus and one copy in the Mek1 locus) and one copy of Mek1 in the Mek1 locus], the
amount of MEK1 was similar to the amount of MEK2 (Figure 2.S3B, ratio MEK1/MEK2 ~1)]. This
ratio in the Mek1+/2 embryo placentas suggested that MEK2 was two-fold less than MEK1 in wild-type
placenta. Because the amount of MEK2 and Myc-tagged MEK2 were equivalent in Mek12/2 mutants,
we predicted that the Mek12 knockin allele produced about two-fold less MEK than the Mek1 wild-type
allele. This difference in the amount of MEK produced was confirmed in Mek1+/2 mutants in which the
Myc-tagged MEK2/MEK1 ratio is ~0.4 (Figure 2.S3B).
Because ERK is the substrate of MEK1 and MEK2, we assessed if the differences in MEK1 and
MEK2 abundance affected ERK phosphorylation. Despite the presence of MEK2, the absence of
MEK1 in Mek1-/- placentas reduced the phosphorylation of both ERK1 and ERK2 in the placenta
(Figure 2.2F). In contrast in placentas from Mek12/2 embryos, significant amounts of ERK
phosphorylation was observed, indicating that the total amount of Myc-tagged MEK2 and MEK2 was
sufficient to activate the pathway (Figure 2.2F). The protein abundance analysis combined with the
transcript analysis indicated that the Mek12 allele is efficiently transcribed, but that posttranscriptional
processes may control Myc-tagged MEK2 abundance.
2.5.3 Placental development requires a threshold of MEK activity
To validate that protein dosage is critical for Mek function in the placenta, we intercrossed Mek1+/2
Mek2+/- mice to generate a Mek1 Mek2 allelic series. Upon 113 viable offspring recovered at weaning,
no Mek1+/2 Mek2-/-, Mek12/2 Mek2+/-, or Mek12/2 Mek2-/- mice were obtained (Table 2.3). At E10.5, alive
Mek1+/2 Mek2-/- and Mek12/2 Mek2+/- embryos were identified, whereas all Mek12/2 Mek2-/- embryos
were found dead. Two days later, Mek1+/2 Mek2-/- and Mek12/2 Mek2+/- embryos died. We performed
histological analysis of placentas from Mek1+/+ Mek2+/- (Figure 2.3A), Mek12/2 Mek2+/- (Figure 2.3B),
and Mek1+/2 Mek2-/- (Figure 2.3C) embryos at E12.5, which showed underdeveloped placentas with
reduced labyrinth size in Mek1+/2 Mek2-/- and Mek12/2 Mek2+/- embryos (Table 2.2). The labyrinth also
appeared disorganized with aberrant MTG cells (Figure 2.3B, C). The number and the size of MTGs
89
Figure 2.3 : Abnormal development of the labyrinth in Mek12/2 Mek2+/-, Mek1+/2 Mek2-/-, and Mek12/2
Mek2-/- mutants.
(A-C) H&E staining of labyrinth sections from E12.5 control (Mek1+/+ Mek2+/-), Mek12/2 Mek2+/-, and
Mek1+/2 Mek2-/- mutants. Asterisks represent MTG cells in Mek12/2 Mek2+/- and Mek1+/2 Mek2-/mutants associated with placenta underdevelopment. (D-E) H&E staining of placenta sections from
E10.5 control and Mek12/2 Mek2-/- mutants. The dotted region in D and E indicates the labyrinth from
the decidua. The boxed regions in the left sides of A-E are magnified in the right side. L: labyrinth.
Scale bars: 500 μm (left); 50 μm (right).
90
91
Table 3. Viability of Mek1 Mek2 compound mutants produced by crossing Mek1+/2
Mek2+/- with Mek1+/2 Mek2+/- mice. The percentage is indicated in parentheses.
*: Indicate moribund and dead embryos
Age
# of
litter
s
# of
pups Mek1+/+
Mek2+/+
Genotype
Mek1+/+
Mek1+/+
Mek1+/2
Mek2+/-
Mek2-/-
Mek2+/+
Mek1+/2
Mek2+/-
Mek1+/2
Mek2-/-
Mek12/2
Mek2+/+
Mek12/2
Mek2+/-
Mek12/2
Mek2-/-
E10.5
4
27
0
(0)
4
(15)
4
(15)
0
(0)
6
(22)
3
(11)
2
(7)
5
(19)
3*
(11)
E12.5
18
100
10
(10)
14
(14)
3
(3)
14
(14)
25
(25)
11*
(11)
8
(8)
12*
(12)
3*
(3)
E14.5
1
6
0
(0)
0
(0)
0
(0)
1
(17)
3
(50)
0
(0)
0
(0)
2*
(33)
0
(0)
W3-4
22
113
14
(12)
20
(18)
5
(4)
28
(25)
39
(35)
0
(0)
7
(6)
0
(0)
0
(0)
(6.25)
(12.5)
(6.25)
(12.5)
(25)
(12.5)
(6.25)
(12.5)
(6.25)
Expected (%)
in Mek1+/2 Mek2-/- and Mek12/2 Mek2+/- placentas corresponded to our previous observations made for
the most affected Mek1+/- Mek2+/- mutant placentas (Table 2.2) (Nadeau et al. 2009; Nadeau et al.
2014). Comparison of the placenta from Mek1+/+ Mek2+/- (Figure 2.3D) with that from Mek12/2Mek2-/(Figure 2.3E) embryos at E10.5 revealed a delayed development in the Mek12/2Mek2-/- embryos. The
placenta retained the ectoplacental cone shape characteristic of an E8.0 stage, and the maternal and
fetal blood circulations were not intermingled, impairing blood exchanges (Figure 2.3E).
To determine if the Mek12/2 Mek2+/- and Mek1+/2 Mek2-/- placental phenotypes were associated with
decreased ERK pathway activation, we assayed ERK1 and ERK2 phosphorylation by
immunostaining. Whereas activated ERK was ubiquitous throughout the labyrinth region of the
placenta of the Mek1+/+ Mek2+/+ embryos (Figure 2.4A); consistent with a lack of MEK activity, ERK
activation was undetectable in MTGs and in the surrounding SynTs in placentas from E12.5 Mek12/2
Mek2+/-, Mek1+/2 Mek2-/-, and Mek1+/- Mek2+/- embryos (Figure 2.4B-D). Thus, the amount of MEK
must reach a minimum threshold for the sufficient activation of the ERK pathway in SynT to enable
normal development of the placenta and the survival of the embryo.
2.6 Discussion
Our study provides genetic evidence for MEK1 and MEK2 functional redundancy in development.
The correlation between the phenotypes of the different Mek1 Mek2 compound mutants and the
92
estimated amounts of MEK suggested that placenta development requires that the amount of MEK
meets a threshold that is independent of the isoform of MEK and the gene encoding it (Figure 2.5
and table 2.S2). Similar to ERK1 and ERK2, MEK1 and MEK2 are considered functionally
interchangeable in signal transduction (Busca et al. 2015; Frémin et al. 2015). However, several
studies suggested that they might also possess exclusive functions (Kehat et al. 2010; Zhou et al.
2010; Lee et al. 2011; Bromberg-White et al. 2012). MEK1 and MEK2 act as homo- and
heterodimers, and they also form complexes with other proteins [Unified Human Interactome (UniHI)
http://www.unihi.org; (Kalathur et al. 2014)]. MEK1 and MEK2 share a subset of their interactome, but
they also have unique interactions. These specific interactions might be involved in the particular
responses to MEK1 or MEK2. Our data on the functional equivalence of MEK1 and MEK2 proteins
during placenta formation implied that amino acids specific to each protein or protein interactions not
shared by MEK1 and MEK2 are unlikely to be important for their actions in placental development.
The data presented here also indicated that although once produced in sufficient quantities, the
proteins are functionally interchangeable in development, there are differences in the amount of
MEK1 and MEK2 that may result from differences in translation or protein stability. We found that
there was approximately twofold more MEK1 than MEK2 regardless of whether MEK2 was produced
from its endogenous Mek2 locus or the Mek1 locus. A potential explanation is that the two mRNAs
encoding MEK1 and Myc-tagged MEK2 do not share the same 5' and 3' UTRs. The presence of a
small intron and a loxP site in the Mek1 first exon of the knockin targeted allele introduced an
insertion of 173 nucleotides in the 5' UTR of the Myc-tagged MEK2 encoding transcript that may
affect translation efficiency. Translation can also be regulated by control elements located in the 3'
UTR (Wilkie et al. 2003; Araujo et al. 2012), as 3' UTR-binding proteins can positively or negatively
impact translation efficiency (Liao et al. 2007; Matoulkova et al. 2012; Szostak et al. 2013). In the
knockin allele, the endogenous 3' UTR of Mek1 in the mRNA encoding Myc-tagged MEK2 was
replaced by the polyadenylation signal from the transcript of bovine growth hormone. Therefore, the
translation efficiency of these two mRNAs may differ leading to a different amount for each protein.
Another possibility is that MEK1 and MEK2 have different half-lives, as suggested by data showing
that the abundance of MEK2 is reduced by posttranslational mechanisms (Hong et al. 2015). Finally,
we cannot exclude that the Myc-tag affected the stability of Myc-tagged MEK2 resulting in lower
steady-state levels.
Despite the differences in protein abundance, the data demonstrated that Myc-tagged MEK2 can
93
Figure 2.4 : Reduced ERK pathway activation in placentas from Mek12/2 Mek2+/-, Mek1+/2 Mek2-/-, and
Mek1+/- Mek2+/- mice.
(A-D) Immunostaining for phosphorylated ERK was performed on placenta sections from E12.5
embryos of the indicated genotypes. MTG are indicated with asterisks in B-D. Scale bar: 50 μm
94
95
Figure 2.5 : Schematic representation of the phenotypes observed in Mek1 Mek2 mutants according
to the genotype.
Schematic diagram showing the extent of the placenta defects and the time of embryonic death
according to the genotypes of the Mek1 Mek2 specimens. The occurrence of the phenotypes
correlates with the amount of MEK, independently of the isoform produced and the Mek locus
involved (table S2). For each genotype, the first column indicates the relative amount of MEK1 (black
squares) and Myc-tagged MEK2 (gray squares) proteins produced by the Mek1+ and Mek12 alleles,
and the second column represents the amount of MEK2 (red squares) produced by the Mek2+ allele.
By quantitative Western blotting, one Mek1+ allele produced ~twice the amount of protein produced
by the Mek2+ and Mek12 alleles. Normal extraembryonic development and embryo survival require a
minimal threshold of MEK proteins, corresponding to the arbitrary number of 4.
96
97
rescue the embryonic death and the placenta phenotype of Mek1-null mice when introduced into the
Mek1 locus, which clearly establishes that MEK2 has the same function as MEK1. However, in
Mek12/- mice, the amount of MEK2 produced was insufficient, resulting in placental defects and
embryonic lethality. Therefore, normal development of extraembryonic structures required a minimal
dosage of MEK.
Our previous studies on the role of Mek1 and Mek2 in organogenesis have shown that only one allele
of Mek1 or Mek2 is necessary to provide sufficient MEK for a normal development (Scholl et al. 2007;
Newbern et al. 2008; Yamashita et al. 2011; Li et al. 2012; Shim et al. 2013; Boucherat et al. 2014;
Ihermann-Hella et al. 2014). Here, we showed that the formation of the extraembryonic tissues
required higher amounts of MEK, supporting the notion that extraembryonic development exhibits a
greater sensitivity to perturbations in MEK dosage than does embryogenesis. The placenta is
expanding quickly in the second half of the gestation (from E9.5 to E18.5) to favor fetal-maternal
exchange and provide sufficient nutrients to support the growth of the embryo. ERK signaling is
involved in proliferation and differentiation, two critical cellular processes during extraembryonic
development. Thus, it is not surprising to observe a higher threshold for MEK, and consequently ERK
activation, in extraembryonic tissues than in the embryo.
In conclusion, Mek1 and Mek2 play a similar role in development, but the total amount of MEK is
decisive for survival. MEK1 and MEK2 exert specific functions in pathogenic conditions that can lead
to what appear to be isoform-specific phenotypes. For instance, MEK1 appears necessary for the
induction of epidermal tumors using the two-step DMBA/TPA skin carcinogenesis model (Scholl et al.
2009). Mice lacking epidermal MEK1 develop fewer and smaller papilloma with a delayed onset when
compared to controls and Mek2 mutants. Our data on the functional redundancy of MEK1 and MEK2
and the protein dosage effect in placental development suggest that the difference observed between
Mek1 and Mek2 mutants in skin tumor formation could result from a MEK dosage effect, rather than
an isoform-specific pathogenic activity. Questions such as this one could be addressed in the Mek12/2
mice.
2.7 Materials and Methods
2.7.1 Generation of the Mek1 knockin allele
We produced a Mek1 knockin allele by inserting the cDNA of Mek1 and Mek2 into the first exon of
Mek1 (Figure 2.S1). Experiments were performed according to the guidelines of the Canadian
98
Council on Animal Care and approved by the institutional animal care committee.
The mouse 2.2-kb Mek1 promoter and first exon and the 3.0-kb Mek1 first exon and first intron
regions were cloned between the SacII-NotI and the SalI-EcoRV sites, respectively, of the
PGKneoF2L2DTA vector (provided by Dr. Soriano; figure 2.S1A). Mek1 and Mek2 murine cDNAs,
each encoding a C-terminal Myc-tag with a termination codon in the three reading frames and
including the 5'-untranslated sequences of Mek1 between the NotI site and the ATG, were introduced
into the SmaI and SalI sites of PGKneoF2L2DTA, respectively. The bovine growth hormone
polyadenylation signal was inserted downstream the Mek2 cDNA sequences to interrupt the
transcription of the knockin allele and to prevent the transcription of downstream Mek1 exons that
could cause premature degradation of knockin transcripts by nonsense-mediated mRNA decay
(Popp et al. 2014). The chimeric intron of the pCI mammalian expression vector (Promega, Madison,
WI) was inserted into the NotI site of PGKneoF2L2DTA vector upstream of the Mek1 cDNA
sequences to maximize expression levels (Nott et al. 2003). Correctly targeted ES clones were
identified and injected into blastocysts as previously described (Bissonauth et al. 2006). Chimeras
were obtained and bred with 129/Sv mice to transmit the targeted Mek11neo2 allele. The Mek1-knockin
control allele (Mek11), in which the Mek1 cDNA was put under the control of its own promoter, was
produced by breeding Mek1+/1neo2 mice with FLPeR deleter mice to eliminate neo selection
sequences flanked by FRT sites (Farley et al. 2000). The Mek2-knockin allele (Mek12) was produced
by breeding the Mek1+/1neo2 or Mek1+/1 mice with Sox2Cre deleter mice (Hayashi et al. 2002).
Specimens were genotyped by Southern analysis with a BstEII digestion and the 5' Mek1 genomic
probe (Figure 2.S1C). The Mek1 endogenous allele generates an 18.5-kb fragment, whereas the
Mek11neo2, Mek11 and Mek12 alleles produce bands at 6.8, 5.1 and 3.6-kb, respectively.
Protein production was assessed by Western blotting with antibodies recognizing MEK1, the Myc tag,
or ERK2 (Figure 2.S1B).
2.7.2 Mice, genotype and tissue collection
The Mek1 and Mek2 mutant mouse lines and the Sox2Cre and FLPeR deleter mouse lines and their
genotyping by Southern blot and PCR analyses were described (Farley et al. 2000; Hayashi et al.
2002; Bélanger et al. 2003; Bissonauth et al. 2006). The age of the embryos was estimated by
considering the morning of the day of the vaginal plug as E0.5. For RNA and protein extraction,
placentas and embryos were snap-frozen in liquid N2.
99
2.7.3 Histological, immunohistochemical, and immunofluorescence analyses
Paraffin-embedded placentas were sectioned at 4 μm for E10.5-E18.5 specimens. The placenta was
oriented with the maternal side at the top and the fetal (flat) side at the bottom. Morphology was
analyzed by hematoxylin and eosin (H&E) staining. The number and the area of MTG cells in the
sections were calculated at every 25 sections (~100 μm apart) on four sections for each specimen
(Nadeau et al. 2014). Immunohistochemical and immunofluorescence experiments were performed
using MEK1 (Epitomics, Burlingame, CA) and phospho-ERK primary (Cell Signaling Technology Inc.,
Pickering, ON), and secondary antibodies as described in (Nadeau et al. 2009).
2.7.4 Western blot analysis
Protein extracts were prepared as described (Bélanger et al. 2003). Total protein lysates (20 µg)
were resolved on a denaturing 10% SDS-PAGE and probed with rabbit monoclonal antibodies
against MEK1 and MEK2, phosphorylated (p)-ERK1 and p-ERK2, or the Myc tag (Cell Signaling
Technology Inc., Pickering, ON), or with rabbit polyclonal antibodies against ERK2 and MEK1
described in (Nadeau et al. 2009). The relative amounts of each protein were obtained by
densitometry analyses with the FluorS MAX Multi-imager–captured images using ImageJ, version
1.50c. The most representative Western blots are presented.
2.7.5 RNA isolation and quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
Total RNA was isolated using TRIzol reagent according to the manufacturer's procedure (Life
Technologies Inc., Burlington, ON). DNase treatment was performed on RNA. qRT-PCR experiments
were done as described (Boucherat et al. 2012). Mek1 primer sequences were: Forward 5'GGTTCTCCGCGTGGGTT-3' and Reverse 5'-CTTCCTCCCTCGGCTCTG-3'.
2.7.6 Statistical analyses
Two-tailed student's t-test was performed for comparative studies. P<0.05 was considered
statistically significant.
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105
Acknowledgments: We thank Dr. Lucie Jeannotte for critical comments, Dr. Andrew McMahon for
Sox2Cre mice, and Dr. Philippe Soriano for the PGKneoF2L2DTA vector. Funding: This work was
supported by CIHR (MOP-97801 to J.C.). Author contributions: R.A., A.M. and J.C. designed the
project. R.A., A.M. and J.C performed the experiments. R.A. and J.C. analyzed the data and wrote
the paper. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data
and materials availability: The Mek1 and Mek2 mutant mice are available upon request and require
an MTA.
106
Table 2.S1. Viability of Mek11/1, Mek11neo2/1neo2, Mek12/2 and Mek12/- embryos and mice
at various ages.
A
Age
# of
litters
E10.5
4
W3-4***
6
Expected (%)
B
Age
# of
litters
E10.5
3
E12.5
4
W3-4
4
Expected (%)
C
Age
# of
litters
E10.5
1
E12.5
2
E14.5
6
W3-4
6
Expected (%)
Mek1+/1 x Mek1+/1
Genotype of alive embryos and mice*
# of
pups
Mek1+/+
Mek1+/1
Mek11/1
5
6
0 [10**]
21
(45)
(55)
(0)
6
19
0
25
(24)
(76)
(0)
(25)
(50)
(25)
Mek1+/1neo2 x Mek1+/1neo2
Genotype of alive embryos and mice*
# of
pups
Mek1+/+
Mek1+/1neo2
Mek11neo2/1neo2
8
9
10
27
(30)
(33)
(37)
9
12
5 [3**]
26
(35)
(46)
(19)
7
10
0
17
(41)
(59)
(0)
(25)
(50)
(25)
Mek1+/2 x Mek1+/2
Genotype of alive embryos and mice*
# of
pups
Mek1+/+
Mek1+/2
Mek12/2
2
2
2
6
(33)
(33)
(33)
4
4
3
11
(36)
(36)
(27)
9
17
7
33
(27)
(52)
(21)
5
18
9
32
(16)
(56)
(28)
(25)
(50)
(25)
*: The percentage of alive embryos and mice are indicated in parentheses
** : Number of dead embryos
*** : Weaning at 3 to 4 weeks of age
† : Number of resorbed embryos
n.a.: not available
107
D
Age
# of
litters
E12.5
E14.5
E18.5
P0
1
1
2
5
E
Age
# of
litters
E18.5
1
P0
2
Expected (%)
Mek1-/- x Mek12/2
# of
pups
Alive
7
5
7
4
16
3
8
7
Genotype
Mek12/-
Dead
2
3 [2†]
13 [8†]
1
Mek1-/- x Mek1+/2
Genotype of alive embryos and mice*
# of
pups
Mek1+/Mek12/3
2 [2†]
7
(60)
(40)
1
3
4
(25)
(75)
(50)
(50)
*: The percentage of alive embryos and mice are indicated in parentheses
** : Number of dead embryos
*** : Weaning at 3 to 4 weeks of age
† : Number of resorbed embryos
n.a.: not available
108
Table 2.S2. A MEK1 and MEK2 protein dosage model in placenta development.
Western blot analyses indicated that one Mek1+ allele was considered to produce twice the amount
of MEK than was produced by one of the Mek2+ or Mek12 alleles. MEK is indicated in arbitrary units
with one Mek1+ equal to a value of 2.
Genotype
MEK abundance
arising from the
different Mek alleles
Mek1+
Mek2+ Mek12
Total
amount
of MEK
Phenotype
Mek1+/+ Mek2+/+
4
2
-
6
None
Mek1+/+ Mek2-/-
4
0
-
4
None
Mek12/2 Mek2+/+
0
2
2
4
None
Mek1+/2 Mek2+/-
2
1
1
4
None
Mek1+/- Mek2+/-
2
1
-
3
 Death was observed from E12.5 onwards.
 10% of the mice survive after birth.#
Mek12/- Mek2+/+
0
2
1
3
 Death was observed from E12.5 onwards.
 Some mice survive at birth.
Mek1+/2 Mek2-/-
2
0
1
3
 Death was observed from E12.5 onwards.
 Survival at birth?*
Mek12/2 Mek2+/-
0
1
2
3
 Death was observed from E12.5 onwards
 Survival at birth?*
Mek1-/- Mek2+/+
0
2
-
2
Death at E10.5
Mek12/2 Mek2-/-
0
0
2
2
Death at E10.5
*: According to the Mendelian distribution and the rate of survival of Mek1+/- Mek2+/- mutants, an
insufficient number of specimens was analyzed to conclude (25).
#: According to (25).
109
Figure 2.S1. Targeted replacement of Mek1 gene with cDNA encoding Myc-tagged MEK1 or
Myc-tagged MEK2. (A) Schematic diagram of the Mek1 genomic locus, the targeting vector, and the
targeted alleles. Exon 1 is represented as a white box, and the promoter and intron sequences are
represented as solid lines. The targeting vector contains an artificial intron (black boxes), a Myctagged Mek1 cDNA (gray and green boxes), the PGKneo selection cassette flanked by FRT sites
(black arrowheads), and a Myc-tagged Mek2 cDNA (gray and green boxes) with a polyadenylation
site (red box) inserted into exon 1. The Mek1 cDNA and the PGKneo selection cassette are bordered
by loxP sites (white arrowheads). Integration of the targeting vector by homologous recombination
will generate a Mek11neo2 targeted allele and the subsequent Flp- and Cre-mediated recombination
will produce the Mek11 and the Mek12 knockin alleles, respectively. Position of the qRT-PCR primers
(identified as F and R) and of the 5' and 3' probes used for genotyping by Southern analysis is
indicated. (B) Western blot analyses of MEK1, Myc-tagged MEK1, and ERK2 in ES cell clones. Blots
were probed with antibodies directed against MEK1 (left upper panel), MYC-tag (right upper panel),
and ERK2 (lower panels). (C) Southern blot analyses of DNA from E10.5 embryos obtained by
interbreeding Mek1+/1neo2 mice (left panel), and after breeding Mek1+/1neo2 females with FLPeR (right
panel, lanes 1-3) or Sox2Cre (right panel, lanes 4-8) males. DNA was digested with BstEII and blots
were hybridized with the 5' Mek1 genomic probe. Position of the different alleles is indicated.
110
111
Figure 2.S2. Mek12/- mutants showed intrauterine growth restriction. (A-C) Gross morphology of
E18.5 control (Mek1+/-) and Mek12/- embryos. Some Mek12/- embryos are alive and exhibit a normal
size (B), whereas others are dead and necrotic (C). Scale bar: 2mm. (D-F) H&E staining of labyrinth
sections of placenta from the E18.5 control and Mek12/- mutants shown in A-C. The boxed regions in
D-F are magnified in the panels to the right. Scale bars: 500 µm (left) and 50µm (right). (G) Body
weight of E18.5 Mek1+/- control (n=3) and alive Mek12/- mutant (n=5) embryos. The body weight of
Mek12/- alive embryos was normal, P=0.98.
112
113
Figure 2.S3. Mek12 and Mek2+ alleles produce less Myc-tagged MEK2 and endogenous MEK2,
respectively, when compared to MEK1 produced by the Mek1+ wild-type allele. (A) A
representative Western blot of MEK1, MEK2, and Myc-tagged MEK2 expression in placenta from
E.14.5 Mek1+/2 embryos. A pan MEK antibody recognizing MEK1 and both MEK2 isoforms was used.
The densitometric analyses were performed from FluorS MAX Multi-imager-captured images using
ImageJ, version 1.50c. The ratio between the indicated MEK proteins is shown below each lane. (B)
Comparative analysis to assess relative amounts of MEK1, MEK2, and Myc-tagged MEK2, as shown
in the representative blot, was performed on placentas from the number of embryos indicated for the
genotypes. The value of the MEK protein ratio with the SEM is shown. Data from the Mek12/2
specimens revealed that equivalent levels of MEK2 and Myc-tagged MEK2 proteins were produced
from the Mek2+ endogenous and Mek12 knockin alleles, respectively. As well, MEK1 protein levels
were similar to MEK2 levels in Mek1+/2 mutants indicating that MEK2 expression was two-fold less
than MEK1 in wild-type placenta.
114
A
B
Ratio of
Genotype of
placentas
analyzed
Ratio
value
# of biological
replicates
MEK1/MEK2
Mek1+/2
0.97 ± 0.06
8
Myc-tagged MEK2/MEK2
Mek1+/2
0.38 ± 0.03
5
Myc-tagged MEK2/MEK1
Mek1+/2
0.39 ± 0.03
5
Myc-tagged MEK2/MEK2
Mek12/2
0.94 ± 0.08
7
115
Figure 2.S4: Cover page of Science Signaling, January 2016.
The image shows mouse embryos of different genotypes, representing how some embryos die due to
placental defects when a single copy of Mek2 is introduced into a Mek1-null background
116
117
118
Chapitre 3.
Étude du rôle de Mp1 (Mek-Partner-1) au cours du développement
embryonnaire de la souris.
3.1 Avant propos
Les souris Mek1-/- meurent à mi-gestation de défauts de développement du placenta, les
souris Mek2-/- survivent indiquant que Mek1 serait capable de compenser l’absence de Mek2 et que
Mek1 aurait un rôle prédominant durant le développement embryonnaire. Cependant les souris
Mek1+/- Mek2+/- meurent à partir de E14.5 de défauts de développement du placenta, indiquant que
Mek1 et Mek2 jouent un rôle dans le développement extraembryonnaire. La délétion du gène Mek1
dans l’embryon à l’aide d’un allèle conditionnel pour Mek1 (Mek1flox) et de la souris exprimant la
recombinase Cre sous contrôle du promoteur du gène Sox2 (Tg Sox2+/Cre) a permis de montrer que
les souris Mek1flox/flox TgSox2+/Cre, Mek1+/flox Mek2+/- TgSox2+/Cre et Mek1+/flox Mek2-/- TgSox2+/Cre sont
viables alors que les souris Mek1flox/flox Mek2-/- TgSox2+/Cre meurent avant E10.5. Ce qui indique que
Mek1 et Mek2 contribuent au développement des tissus extraembryonnaires et qu’un seul allèle
Mek1 suffit pour le développement de l’embryon. Les résultats présentés au chapitre 2 montrent que
les kinases MEK1 et MEK2 sont redondantes et que le bon dosage protéique de MEK est essentiel
pour le développement du placenta et la survie. La protéine d’échafaudage MP1 est un partenaire de
MEK1 et non de MEK2. L’objectif des travaux présentés dans ce chapitre est de poursuivre la
caractérisation des mutants Mp1-/- afin de répondre à l’hypothèse selon laquelle MP1 serait un
modulateur de la voie ERK/MAPK en régulant l’activation de la voie passant uniquement par MEK1.
Ce travail est une collaboration avec le groupe d’Andrew Catling, qui a fourni le vecteur de
ciblage permettant la génération de l’allèle nul de Mp1. Cet allèle consiste en une délétion du
promoteur ainsi que des deux premiers exons du gène. La génération et la sélection des clones ES a
été effectuée par les Dr Jean Charron et Annie Maltais. La micro-injection des cellules ES dans les
blastocystes et le transfert des blastocystes dans la corne utérine de femelles receveuses ont été
réalisée par Madame Marcelle Carter, responsable de l’unité de transgénèse, et le Dr Jean Charron.
Les études de transmissions et l’établissement de la lignée ont été réalisés par Annie Maltais.
Annie Maltais a établi la lignée de souris Mp1-/- et fait l’étude de survie des souris mutantes.
Son analyse a permis de mettre en évidence que les souris Mp1-/- meurent à E6.5 (Figures 3.1-3.2 et
Tableau 3.1). La caractérisation des mutants Mp1-/- a aussi été initiée par Annie. Elle a montré par
119
hybridation in situ que les embryons Mp1-/- présentent un défaut dans l’ectoderme extraembryonnaire (Figure 3.3).
J’ai poursuivi l’analyse des embryons Mp1-/- à E6.5 par immunohistochimie à l'aide de
marqueurs de l’endoderme viscéral, de l’épiblaste ainsi que de prolifération. J’ai par la suite, via des
cultures in vitro de blastocystes, montré qu’aucune anomalie de prolifération des cellules ES et des
trophoblastes n’était observée chez les embryons Mp1-/- (Figure 3.4-3.5-3.6). J’ai effectué le maintien
ainsi que le génotypage de la lignée de souris. Ces analyses préliminaires suggèrent que les mutants
Mp1-/- meurent plus précocement que les mutants Mek1-/- indiquant que le gène Mp1 est essentiel à
la survie et que sa fonction ne serait pas restreinte à Mek1.
120
3.2 Introduction
L’étude effectuée au chapitre 2 nous a permis de faire la démonstration que les protéines
MEK1 et MEK2 possèdent des fonctions redondantes. En plus, notre analyse révèle que ce qui
différencie l'implication de ces deux protéines dans la survie et le développement des tissus
extraembryonnaires est leur niveau d’expression. La question de la spécificité d’activation de
chacune des kinases MEK1 et MEK2 demeure donc non-résolue. En effet, plusieurs études montrent
que selon le type cellulaire ou le stimulus, l’activation de MEK1 et MEK2 est différente (Xu et al.
1997; Ussar et al. 2004; Scholl et al. 2009). Il est maintenant admis que la voie ERK/MAPK n’est pas
une voie de signalisation simple et linéaire. Sa régulation est basée sur différents processus, incluant
les boucles de rétroaction négative ainsi que les protéines d’échafaudage. Il est proposé que les
protéines d’échafaudage seraient les actrices de cette régulation en positionnant la voie dans
différents compartiments subcellulaires.
Les premières mises en évidence de l’existence des protéines d’échafaudage dans la
signalisation ERK/MAPK ont été faites chez la levure S.cerevisiae. Les voies MAPK étant
conservées durant l’évolution, la fonction de ces protéines d’échafaudage a aussi été conservée. Il
existe plusieurs protéines d’échafaudage connues pour faciliter l’activation de ERK chez les
mammifères. La protéine d’échafaudage la plus étudiée est KSR1 (Kinase suppressor of ras 1).
Après activation de la voie ERK/MAPK, KSR1 est recrutée à la membrane plasmique où elle permet
de potentialiser l’activation de ERK et MEK (Muller et al. 2001). La protéine d’échafaudage MP1 a été
mise en évidence par un criblage double hybride à la recherche de partenaires spécifiques de MEK1
(Schaeffer et al. 1998). L’interaction entre MP1 et MEK1 se fait par la séquence riche en prolines de
MEK1. Par ailleurs, c’est dans cette séquence riche en prolines de MEK1 que se trouve le site de
rétrocontrôle par ERK2, suggérant que MP1 pourrait réguler la phosphorylation de MEK1 par ERK2
ainsi que la capacité de ERK2 à phosphoryler d’autres substrats (Kurzbauer et al. 2004; Brahma et
al. 2007). Cette spécificité suggère que MP1 agirait uniquement via MEK1. En outre, en favorisant
une proximité spatiale entre MEK1 et ERK1/2, MP1 faciliterait la phosphorylation de ERK1/2 par
MEK1. MP1 est recrutée aux endosomes tardifs par les protéines adaptatrices p14 et p18 (Nada et
al. 2009). Les endosomes sont des vésicules intracellulaires impliqués dans la voie de tri, de
recyclage ou de dégradation des molécules internalisées à la membrane plasmique.
121
Ceci soulève la question de l’implication de MP1 dans l’activation spécifique de MEK1 aux
endosomes. Afin d’analyser le rôle de Mp1 in vivo, nous avons généré et initié la caractérisation
d’une lignée de souris invalidées pour le gène Mp1.
3.3 Matériels et méthodes
3.3.1 Génération de l’allèle Mp1Nous avons produit l’allèle nul de Mp1 en remplaçant les exons 1 et 2 du gène par une
cassette de résistance à la néomycine (Figure 3.1). Le vecteur de recombinaison contient les
séquences en amont de l’exon 1 et en aval de l’exon 2 de part et d’autre de la cassette de sélection
néomycine conférant la résistance au G418 (Figure 3.1A). Le site d’initiation de la transcription du
locus Mp1 étant dans l’exon 2, l’intégration de la cassette de résistance à la néomycine par
recombinaison homologue abolit la transcription du gène et permet de générer un allèle Mp1neo. Les
cellules ES sélectionnées pour leur résistance à la néomycine et contenant un allèle Mp1
correctement ciblé ont été injectées dans des blastocystes tel que décrit précédemment (Bissonauth
et al. 2006). Les souris chimériques obtenues ont été croisées avec des souris 129/Sv afin de
transmettre l’allèle Mp1neo. L’allèle Mp1- a été généré en croisant des souris Mp1+/neo avec des souris
portant la recombinase Cre sous contrôle du promoteur du gène Sox2 (Sox2-Cre ; Figure 3.1A). Les
spécimens ont été génotypés par analyse Southern blot avec une digestion SacI ainsi qu’une sonde
génomique située en amont de l’exon 4 (Figure 3.1B). L’allèle endogène Mp1+ génère un fragment
de 7.2kb, l’allèle Mp1neo génère un fragment de 5.0kb et l’allèle Mp1- génère un fragment de 6.0kb.
Les spécimens ont aussi été génotypés par PCR en utilisant trois amorces (Figure 3.1C) permettant
de distinguer l’allèle Mp1+ (fragment d'amplification avec les amorces a et c : 579pb) et Mp1+
(fragment d'amplification avec les amorces b et c : 323pb). Au jour E6.5, l’ADN des embryons est
récupéré par capture laser sur des sections paraffine de quatre µm. L’ADN est extrait des sections
en les incubant toute la nuit à 55°C dans un tampon 50mM KCl, 10mM Tris-HCl pH8.3, 2mM MgCl2,
0.1mg/ml gélatine, 0.45% NP-40, 0.45% tween et 0.1µg/µl PK. Une réaction de PCR est ensuite
réalisée
en
utilisant
les
trois
amorces
mentionnées
précédemment
a:
5’
GCCCCGGAGATGATCAGCCCAA 3’ b : 5’ CTCGGGTGCGGGGGAAGTCA 3’ et c : 5’
ACTGGAAGGGCGGCCAGTCA 3’.
122
3.3.2 Souris, collecte de tissus et culture des embryons
La lignée Sox2Cre a été génotypée par Southern blot et PCR tel que décrit précédemment
(Bissonauth et al. 2006). L’âge des spécimens est estimé en considérant le jour du bouchon vaginal
comme E0.5. Les blastocystes ont été récoltés au jour E3.5 en injectant à travers la corne utérine du
milieu ES (DMEM avec 10% FBS, 1% L-glutamine, 1% pénicilline-streptavidine et 0,000007 % betamercapto-éthanol). Les embryons ont ensuite été cultivés pendant cinq jours dans des pétris
recouverts d'une mince couche de gélatine 0.1%.
3.3.3 Analyses d’histologie, d’immunohistochimie et d’immunofluorescence
Les embryons ont été prélevés aux âges indiqués et fixés une nuit à 4°C dans le
paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Après déshydratation, ils ont été enrobés dans la paraffine et
positionnés afin d'obtenir des sections sagittales comme décrit précédemment (Bissonauth et al.
2006). La morphologie a été analysée suite à une coloration hématoxyline-éosine. Les
immunohistochimies ont été réalisées en utilisant des anticorps dirigés contre OCT4 (anticorps
polyclonal de chèvre ; Santa Cruz sc-8628 dilué 1/100), DAB2 (anticorps monoclonal de souris ; BD
Biosciences #610464 dilué 1/250) et pERK (anticorps monoclonal de lapin ; Cell Signaling #4270
dilué1/250). Pour les analyses de prolifération, les femelles gestantes à E6.5 ont été injectées avec
100µg/g de BrdU 30 minutes et les embryons à E6.5, ont été prélevés après l’injection et fixés toute
la nuit dans de la PFA 4 %. Après déshydratation, les embryons ont été enrobés et découpés en
sections de 4 µm et une immunohistochimie avec un anticorps dirigé contre le BrdU (anticorps
monoclonal de souris ; Millipore MAB4072 dilué 1/1000) a été effectuée. Les anticorps secondaires
utilisés dans les expériences d’immunohistochimie sont biotynilés et dirigés contre les IgG des
espèces de l’anticorps primaire (anti-IgG de chèvre pour OCT4, anti-IgG de souris pour DAB2 et
BrdU). La présence d’anticorps a été révélée à l’aide du Vectastain HRP ABC Reagent (Vector
Laboratories, Burlingame, CA) et du DAB.
Pour les essais d'immunofluorescence sur des cultures de blastocystes après cinq jours de
culture, les cultures sont fixées cinq minutes dans le PFA 4 %. À ce stade, les cultures peuvent être
soit conservés dans du PBS1X ; 0.02 % sodium azide à 4°C ou soit lavés avec du PBS1X pendant
cinq minutes. Ils sont ensuite perméabilisés avec du PBS1X ; 0.3 % Triton pendant vingt minutes.
Après la perméabilisation, deux lavages avec du PBS1X ; 0.2 % tween sont réalisés. Pour
l’immunodétection, une étape de blocage avec du PBS1X ; 3 % BSA pendant trente minutes est
effectuée. L'exposition aux anticorps primaires est réalisée pendant deux heures à température
123
ambiante. Deux anticorps ont été utilisés : OCT4 (anticorps polyclonal de chèvre ; Santa Cruz sc8628 dilué 1/100) et TROMA-I (anticorps monoclonal de rat ; Hybridoma Bank dilué 1/100). Par la
suite, trois lavages de dix minutes avec du PBS1X ; 0.2 % tween sont effectués. L’anticorps
secondaire est ensuite incubé pendant une heure à température ambiante. Deux anticorps
secondaires couplés à des fluorophores ont été utilisés. Un anticorps anti-IgG de chèvre produit chez
l’âne et couplé à l’Alexa 594 a servi à détecter OCT4, alors qu'un anticorps anti-IgG de rat produit
chez le poulet et couplé à l’Alexa 488 a permis de détecter TROMA-I. Après incubation de l’anticorps
secondaire, trois lavages de dix minutes chacun ont été réalisés avec du PBS1X ; 0.2% tween. Cinq
minutes de réaction avec du DAPI (1/10000) ont permis de marquer les noyaux des cellules.
3.3.4 Hybridation in situ
Les embryons sont prélevés du déciduum à E6.5 dans du PBS1X traité pour le rendre
RNase Free. Ils sont ensuite fixés dans une solution de PFA 4% pendant une nuit à 4°C. Le
lendemain, les embryons sont déshydratés en passant de la PFA 4% au PBS1X ; 0.01 % Tween
(PBST) suivi de PBS1X : MetOH (50 :50). Les embryons sont ensuite conservés à 4°C dans du
MetOH 100 %. Les embryons sont réhydratés en passant du MetOH 100% au MetOH 25% pour finir
dans du PBS1X ; 0.01% Tween. Une étape de perméabilisation est ensuite réalisée en incubant
quatre minutes avec 10µg/µl de protéinase K. Deux lavages avec du PBST sont ensuite effectués.
Les embryons sont par la suite incubés pendant deux heures à 72°C dans la solution de préhybridation (50% formamide, 5X SSC, 50µg/ml ARN de levure, 0.1% riton, 0.5% CHAPS et héparine
50µg/ml). Après la pré-hybridation, les embryons sont incubés pendant la nuit à 72°C avec 100ng de
sonde ARN (Mash2, Cdx2 et Oct4) marquée à la dioxygénine (DIG) Après plusieurs lavages, les
embryons sont incubés dans une solution de blocage (10% sérum de mouton dans du TBST)
pendant deux heures à température ambiante. Ils sont ensuite incubés avec un anticorps anti-DIG
conjugué à la phosphatase alkaline (Roche #1-093-274 dilué 1/2000) pendant une nuit à 4°C. Après
plusieurs lavages, les embryons sont incubés avec les substrats de la phosphatase alcaline
(BCIP/NBT) dans le tampon NTMT (0.1M NaCl, 0.1M TrisHCl, 0.05M MgCl2 et 0.1% Tween) vingt
minutes avec agitation et ensuite de trente minutes à trois jours à température pièce (le temps varie
selon la qualité de la sonde). Une fois la coloration observée, la réaction est arrêtée avec une
solution de PBST + 0.2M EDTA. Après deux lavages avec du PBST, les embryons sont refixés dans
une solution de PFA 4%, 0.1% triton et 0.1% glutaraldéhyde à 4°C toute une nuit. Finalement, après
124
deux lavages dans du PBST, les embryons sont conservés dans une solution de PBS ; 0.01%
sodium azide à 4°C.
3.4 Résultats
3.4.1 L’inactivation du gène Mp1 cause une mortalité embryonnaire
Afin d’étudier le rôle du gène Mp1 in vivo, l’équipe du Dr Andrew Catling a généré un vecteur
de ciblage dans lequel les séquences régulatrices de Mp1 ainsi que les séquences en aval de l’exon
2 sont insérées de part et d’autre de la cassette de sélection à la néomycine, elle-même entourée de
sites loxP (Figure 3.1A). Ce vecteur a été transfecté dans les cellules ES et des clones ayant intégré
le vecteur de criblage par recombinaison homologues ont servi à générer des souris chimériques et à
l’établissement de la lignée de souris Mp1+/neo. Les souris Mp1+/neo ont été croisées avec des souris
exprimant la Cre recombinase sous contrôle du promoteur Sox2 (TgSox2+/Cre). Ce croisement permet
de générer des souris Mp1+/flox TgSox2+/Cre (Mp1+/-) (Figure 3.1A). Les souris Mp1+/- sont viables et
fertiles. Nous avons ensuite croisé les souris Mp1+/- entre elles. Aucune souris Mp1-/- n’a été
retrouvée au sevrage (Figure 3.1B ; Tableau 3.1).
Tableau 3.1 : Survie des souris Mp1-/♂ Mp1 +/- x ♀ Mp1 +/Age
# Portée
# Souris
# non
génotypé
E8.5
E9.5
Sevrage
2
2
5
15
14
30
0
2
2
Génotype
Mp1+/+
3 (20)
2 (14)
11 (37)
Mp1+/8 (53)
9 (64)
19 (63)
Mp1-/4* (27)
3* (22)
0 (0)
Le pourcentage des souris observées est indiqué entre parenthèse ; * : embryons moribonds ou morts.
À E8.5 et E9.5, tous les embryons Mp1-/- retrouvés sont morts (Figure 3.2H-I, Tableau 3.1). Une
analyse histologique comparative des individus Mp1+/+, Mp1+/- et Mp1-/- a révélé que les embryons
Mp1-/- sont plus petits à E6.5 et E7.5 suggérant un retard du développement (Figure 3.2J-K). Tant
chez les contrôles que chez les mutants Mp1-/-, une réaction déciduale est observée. Ceci indique
que les individus Mp1-/- peuvent s'implanter, induire la réaction déciduale et former une structure
ressemblant à l'egg cylinder. Toutefois, la gastrulation ne progresse pas plus avant. Donc, MP1 n’est
125
Figure 3.1 : Vecteur de ciblage pour l’inactivation du gène Mp1
(A) Représentation schématique du locus Mp1 et du vecteur de ciblage. Les exons 1, 2, 3 et 4 sont
représentés par des rectangles blancs. Le vecteur de ciblage contient les séquences du gène Mp1
en amont de l’exon 1, une cassette de sélection PGKneo (rectangle gris) entourée de sites loxP
(triangle noir) et les séquences entourant l’exon 3 du gène Mp1. L’intégration du vecteur de ciblage
par recombinaison homologue va générer l’allèle Mp1neo avec la cassette PGKneo qui remplace es
exons 1 et 2. La recombinaison à l'aide de la recombinase Cre de l'allèle Sox2Cre produira l’allèle
Mp1-. La sonde utilisée pour le génotypage par Southern blot est indiquée ainsi que la position des
amorces utilisées pour le génotypage par PCR. (B) Analyse par Southern blot d’ADN de queue de
souris i) provenant d’un croisement des souris Mp1+/- entre elles (panneau à gauche) et ii) provenant
d’un croisement de souris Mp1neo avec des souris Sox2Cre (panneau à droite). L’ADN a été digéré
avec l'enzyme SacI. La membrane a été hybridée avec la sonde 3’ (C) Analyse par PCR permettant
de génotyper l’allèle Mp1- (579pb) et Mp1+ (323pb) à l’aide des amorces a, b et c indiqués en (A).
126
127
Figure 3.2 : Conséquence de la perte de Mp1 sur le développement de l’embryon et sa survie
Analyse des embryons Mp1+/+, Mp1+/- et Mp1-/- de E6.5 à E9.5. (A, D, E, H et I) Embryons entiers à
E8.5 et E9.5. (B, C, F, G, J et K) Coloration hématoxyline-éosine de section d’embryons à E6.5 et
E7.5. À E6.5 et E7.5, les embryons Mp1-/- sont déjà plus petits et à E8.5 et E9.5, ils sont morts.
128
129
pas essentiel durant les étapes précoces du développement mais est nécessaire à la progression
de la gastrulation.
3.4.2 Dérégulation de l’expression des marqueurs des trophoblastes ainsi
que de la voie MAPK
Les embryons Mp1-/- meurent au jour E6.5, début de la gastrulation. La gastrulation est une
étape cruciale du développement, car c’est le stade de différenciation et de mise en place des trois
feuillets embryonnaires d’où dérivent tous les types tissulaires. Les individus Mp1-/- sont plus petits à
E6.5 et résorbés à E8.5 suggérant un problème de développement affectant différents types
tissulaires. Afin de déterminer quels types tissulaires sont affectés par l’invalidation du gène Mp1,
des expériences d'hybridation in situ ont été réalisées à E6.5 à l’aide de marqueurs spécifiques aux
types tissulaires afin de déterminer si des changements d'expression étaient observés chez les
embryons Mp1-/-. Des résultats préliminaires avec les marqueurs Cdx2 (ectoderme extraembryonnaire), Mash2/Ascl2 (cône ectoplacentaire et ectoderme extraembryonnaire) et Oct4/Pou5f1
(épiblaste) indiquent un problème de mise en place de l’ectoderme extraembryonnaire suite à la
perte du marquage Cdx2 (Figure 3.3). Le cône ectoplacentaire et l’épiblaste ne semblent pas
affectés par la perte du gène Mp1 car les marquages d’Oct4 et Mash2 sont inchangés chez les
embryons Mp1-/- comparativement aux contrôles (figure 3.3). Ceci suggère que Mp1 contribuerait au
développement de l’ectoderme extraembryonnaire. Par immunohistochimie, nous avons regardé
l’expression de DAB2, un marqueur de l’endoderme viscéral. Le marquage DAB2 nous indique que
l’endoderme viscéral est différencié chez les mutants Mp1-/- mais ne nous indique pas si les fonctions
de ce tissu sont maintenues (Figure 3.4B-B’). Les embryons Mp1-/- étant plus petits, nous avons émis
l’hypothèse que cette anomalie était due à un problème de prolifération. L’analyse de la prolifération
chez ces embryons Mp1-/- avec un marquage BrdU a montré qu’il n’y avait pas de différence majeure
comparativement aux embryons Mp+/+ (Figure 3.4C-C’). Des études précédentes ont montré que la
voie ERK/MAPK est activée après l'implantation entre les jours E5.5 et E8.0 dans le cône
ectoplacentaire et l’ectoderme extra-embryonnaire (Corson et al. 2003). La mort des embryons Mp1-/pourrait donc être due à un défaut de détermination des tissus suite à une signalisation incorrecte.
Les conséquences de la mutation Mp1 sur l’activation de la voie de signalisation ERK/MAPK ont été
analysées. Des résultats préliminaires indiquent une perte de la phosphorylation de ERK chez les
mutants Mp1-/- (Figure 3.4D-D’). Donc, la mortalité des embryons Mp1-/- pourrait résulter d'un défaut
de l’ectoderme extra-embryonnaire suite à une signalisation ERK/MAPK déficiente.
130
3.4.3 Défaut des cellules ES Mp1-/- in vitro
Il a été montré que les embryons mTOR-/- meurent à E6.5 (Gangloff et al. 2004; Murakami et
al. 2004). In vitro, ces embryons meurent suite à une prolifération insuffisante des cellules
trophoblastiques et des cellules de la masse interne. Nous nous sommes demandé si les embryons
Mp1-/- pouvaient proliférer in vitro. Des blastocystes ont été récupérés à E3.5 et mis en culture
pendant cinq jours. L’analyse morphologique ne montre pas de différence entre les cultures
d'embryons Mp1-/- et Mp1+/- en ce qui concerne l’étalement des cellules trophoblastiques et la
prolifération des cellules ES (Figure 3.5). Nous avons poussé l’analyse en faisant une étude
d’expression par immunofluorescence pour OCT4 (cellules ES) après cinq jours de culture. Cette
analyse a montré que chez les embryons Mp1-/-, les cellules OCT4+ semblent être moins
nombreuses comparativement au embryons Mp1+/+ (Figure 3.6). Ces données préliminaires
suggèrent que les cellules Oct4+ chez les embryons Mp1-/- perdent leur identité pluripotente.
3.5 Conclusion et discussion
La voie de signalisation ERK/MAPK est essentielle pour la survie de l'embryon. L’invalidation
du gène Mek1 codant pour une protéine kinases kinase de la voie ERK/MAPK cause une mortalité à
mi-gestation. Sachant que les protéines chaperonnes sont impliquées dans la régulation de la voie
ERK/MAPK en dirigeant l’activation de la signalisation dans différents compartiments cellulaires, il est
primordial d’étudier le rôle de ces protéines chaperonnes dans la régulation de l’activation de la voie
ERK/MAPK. À ce jour, seule MP1 a été identifiée comme étant une protéine chaperonne spécifique à
MEK1 (Schaeffer et al. 1998). Afin d’examiner les fonctions de MP1 in vivo, et de valider sa
spécificité pour MEK1, nous avons généré un allèle nul de Mp1. La délétion homozygote du gène
Mp1 entraine une mortalité vers E6.5 peu après l’implantation. Donc, Mp1 a un rôle essentiel durant
le développement embryonnaire chez la souris et sa fonction n’est pas nécessaire durant les stades
précoces de l’embryogénèse (au stade blastocyste, durant l’implantation et pendant la déciduation).
Le gène Mp1 semble toutefois essentiel pendant la gastrulation. La mortalité plus précoce des
embryons Mp1-/- comparativement aux embryons Mek1-/- indique que le rôle de Mp1 ne serait pas
uniquement associé au gène Mek1.
L’analyse des embryons Mp1-/- à E6.5 suggère que cette mortalité pourrait être due à un défaut des
tissus extraembryonnaires et embryonnaires. En effet, à E6.5 les embryons Mp1-/- semblent avoir un
131
Figure 3.3 : Profil d’expression des marqueurs de différents types cellulaires à E6.5.
Par hybridation in situ à E6.5, nous avons vérifié la présence de différents types cellulaires dans
l’embryon. L’expression du gène Oct4 a été utilisée pour vérifier le développement de l’épiblaste
(astérisque) tandis que l’expression des gènes Cdx2 et Mash2 a servi à marquer l’ectoderme
extraembryonnaire (flèche) et le cône ectoplacentaire (tête de flèche) respectivement. Le marquage
Cdx2 est perdu chez les mutants suggérant un défaut des trophoblastes dans les tissus
extraembryonnaires (n=2).
132
133
Figure 3.4 : La diminution de l’activation de la voie ERK/MAPK affecte le développement des
embryons Mp1-/Immunohistochimie anti-OCT4 (A-A’) et DAB2 (B-B’) indiquant que l’épiblaste (flèches) et
l’endoderme viscéral (têtes de flèches), respectivement, des embryons Mp1-/- ne sont pas affectés.
(C-C’) Le marquage BrdU indique bien que les embryons Mp1-/- soient plus petits, il n’y pas de
différence de prolifération. Par contre l’immunohistochinie anti-pERK (D-D’) indique une diminution
de l’activation de la voie ERK/MAPK.
134
135
Figure 3.5 : Les blastocystes Mp1-/- se différencient sans aucun phénotype in-vitro
Les blastocystes issus d’un croisement de souris Mp1+/- entre elles ont été isolés à E3.5 (J0) et
cultivés in vitro pendant 5 jours (J1 à J5). L’expansion des trophoblastes (TE) et la croissance de la
masse cellulaire interne (CMI) ne semblent pas altérés dans les cultures de blastocyste Mp1-/lorsque comparées aux cultures de blastocystes contrôles Mp1+/- et Mp1+/+.
136
137
Figure 3.6 : Évaluation de la pluripotence et de la différenciation des blastocystes Mp1-/- après 5 jours
en culture
La pluripotence et la différenciation sont évaluées chez des embryons Mp1+/+, Mp1+/- et Mp1-/- par
immunohistochimie à l'aide des marqueurs OCT4 (rouge). Les embryons Mp1-/- ont un marquage
OCT4 diminué.
138
139
marquage Cdx2 faible ou absent. Cette analyse préliminaire indique des défauts du tissu
extraembryonnaire. L’analyse des blastocystes Mp1-/- ne montre pas de différence majeure
comparativement aux embryons contrôles et confirment que le gène Mp1 n’est pas essentiel au
stade blastocyste. Cependant, après cinq jours de cultures, les embryons Mp1-/- ont un nombre
diminué de cellules OCT4+ comparativement aux contrôles, indiquant un problème de différenciation
des cellules ES. Ces données préliminaires sur la désorganisation des cellules trophoblastiques ainsi
que la différenciation des cellules ES doivent être reproduites pour confirmation.
De plus, sachant que MP1 est un partenaire des protéines adaptatrices p14 et p18 (Nada et
al. 2009) et que les souris p14-/- et p18-/- meurent à E6.5 de défauts de l’endoderme viscéral (Teis et
al. 2006), il serait judicieux d’analyser plus en profondeur l’endoderme viscéral chez les mutants
Mp1-/-. Avant la formation du placenta, l’endoderme viscéral permet le transport des nutriments de la
mère vers l’embryon en développement. Chez nos embryons Mp1-/-, un défaut du trafic de nutriments
dans l’endoderme viscéral pourrait être la cause de la mort des embryons. Donc, bien que
l’endoderme viscéral soit différencié et présent chez les embryons Mp1-/-, il ne remplierait pas sa
fonction de nutrition de l’épiblaste. Ainsi, il serait intéressant d’analyser l’état du trafic vésiculaire en
absence du gène Mp1 en étudiant la distribution des vésicules par microscopie électronique. Cette
technique permet de distinguer la localisation des vésicules dans l’endoderme viscéral (proche de
l’embryon ou proche du décidium) et de savoir si le contenu des vésicules est amorphe. Si le trafic
des endosomes est perturbé chez les mutants Mp1-/-, la localisation des vésicules et leur contenu
seront affectés. Un marquage LAMP-1 (marqueur des endosomes) par immunohistochimie permettra
aussi de localiser les endosomes dans l’endoderme viscéral. Enfin, le trafic vésiculaire peut être
analysé dans des MEFs Mp1-/-. Il est difficile d’établir des MEFs à E6.5, mais Nada et ses
collaborateurs ont montré que cela est possible à partir d’embryons qui meurent à E6.5 (Nada et al.
2009).
Nos données préliminaires nous permettent de conclure que le gène Mp1 est nécessaire à la
survie et que son rôle est essentiel pour les étapes post-implantation. Des analyses plus
approfondies de marqueurs de l’ectoderme extraembryonnaire tels que Bmp4, Spc4, Errβ et Sox2 et
des marquages de la ligne primitive avec des marquers tels que Fgf8, Hoxb1, Wnt3 et Brachyury
permettront de mieux caractériser les mutants Mp1-/-. MP1, en association avec p14 et p18, permet
d’ancrer la voie de signalisation ERK/MAPK aux endosomes tardifs via son association avec MEK1.
Ces données préliminaires suggèrent que le rôle de Mp1 ne serait pas restreint à Mek1, et pourrait
140
être lié à sa fonction associée aux protéines adaptatrices p14 et p18. Cependant l’analyse de
l’activation de la voie ERK/MAPK montre que chez les mutants Mp1-/-, la phosphorylation de ERK est
diminuée. Donc, le rôle de la voie ERK/MAPK ancrée aux endosomes tardifs via l’association MEK1MP1 est essentiel à la survie. Les embryons Mek1-/- Mek2-/- meurent avant E10.5 (Nadeau et al.
2009). Les analyses préliminaires de ces mutants montrent qu’ils meurent au même âge que les
mutants Mp1. Il serait donc intéressant d’analyser les mutants Mek1-/- Mek2-/- en comparaison avec
les mutants Mp1-/- afin de déterminer la spécificité ou non de MP1 à MEK1.
141
142
Chapitre 4
Mek1Y130C mice partially recapitulate human Cardio-Facio-Cutaneous
syndrome
Rifdat Aoidi1,3, Micheal Holter2, Jason Newbern2 , Benjamin Yu and Jean Charron1,3*
1Centre
de recherche sur le cancer de l’Université Laval,CRCHUQ, L’Hôtel-Dieu de Québec, Québec,
Canada G1R 3S3.
2School of life science, Arizona State University, Tempe, AZ, USA.
3Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry and Pathology, Université Laval, Québec,
Canada G1V 0A6.
* Corresponding author:
Jean Charron
Centre de recherche sur le cancer de l’Université Laval
CRCHU de Québec, L’Hôtel-Dieu de Québec
9, rue McMahon
Québec, QC
Canada G1R 3S3
Phone : 1-418-525-4444 ext. 15557
Fax : 1-418-691-5439
e-mail: [email protected]
(Article en préparation)
143
144
4.1 Avant propos
La voie ERK/MAPK est impliquée dans différents processus cellulaires cruciaux pour le
développement et la survie. Des mutations somatiques dans des gènes impliqués dans cette voie
sont associées à plusieurs cancers. Au cours des dernières décennies, plusieurs mutations
germinales ont été associées à des syndromes développementaux. Ces syndromes sont regroupés
sous le nom de Rasophaties. Le syndrome cardio-facio-cutané (CFC) est un syndrome rare touchant
1 individu sur 810,000. 75% des mutations associées aux CFC sont dans le gène BRAF et 25% sont
associées aux gènes MEK1 et MEK2. Parmi les mutations dans le gène MEK1, la mutation
MEK1Y130C est la plus fréquente. À ce jour, aucun modèle animal avec cette mutation spécifique dans
MEK1 n’a été généré. Les objectifs des travaux présentés dans ce chapitre étaient d’analyser le rôle
de la mutation MEK1Y130C dans le développement chez la souris et de générer un modèle animal
pour le CFC. Pour cela, nous avons généré et caractérisé des souris portant l’allèle Mek1Y130C.
Ces travaux ont été réalisés en collaboration avec le groupe du Dr Benjamin Yu et Catherime
Rauen, qui a fourni le vecteur de ciblage permettant la génération de l’allèle Mek1Y130C. Cet allèle
consiste en une substitution de l’exon 3 wt de Mek1 avec un exon 3 possédant une mutation
ponctuelle permettant la substitution de la tyrosine 130 en une cystéine. La génération de clone ES
ciblés suite à l’electroporation et la sélection ; l’injection des clones contenant la mutation dans les
blastocystes et le transfert des blastocystes injectés dans la corne utérine de femelles receveuses
ont été effectuées par le Dr Charron. J’ai par la suite effectué l’analyse de transmission,
l’établissement, le maintien et le génotypage de la lignée Mek1Y130C.
J’ai ensuite entrepris la caractérisation de la lignée de souris en réalisant les études de
survie, les analyses histologiques et les études morphométriques des souris Mek1Y130C avec l’aide de
Shella Gilbert-Girard qui a effectué un stage d’été dans le laboratoire. J’ai effectué les expériences
de qPCRs, de western blots et d’immunofluorescence. J’ai aussi établi des lignées de cellules MEFs
issus d’embryons Mek1Y130C/- avec lesquelles j’ai fait des expériences d’induction de l’activation de
ERK in vitro.
Les essais d’immunofluorescence sur des cerveaux ont été effectués par Michael Holter,
étudiant dans le laboratoire du Dr Jason Newbern à l’université d’Arizona. Les données obtenues
145
indiquent que la lignée Mek1Y130C reproduit une partie des phénotypes observés chez les patients
CFC incluant une sténose pulmonaire, un phénotype facial et des défauts neurologiques.
Nous avons donc généré une lignée de souris portant la mutation Mek1Y130C qui constitue le
premier animal modèle pour le syndrome CFC possédant une mutation dans Mek1. Ce modèle
animal constitue un outil clé qui va permettre d’effectuer des analyses plus approfondies de la
mutation Mek1Y130C afin de comprendre son rôle dans l’apparition des phénotypes CFC.
Finalement, j’ai contribué à l’analyse des résultats ainsi qu’à la rédaction de l’article,
conjointement avec mon directeur de recherche. J’ai rédigé la version initiale que mon directeur a par
la suite corrigée et modifiée.
146
4.2 Résumé
Le rôle de la voie de signalisation Ras/MAPK dans différents processus cellulaires tels que la
prolifération, la différenciation, la survie cellulaire et son implication dans différents cancers en fait
une des voies de signalisation les plus étudiées. Des mutations germinales dans des gènes de la
voie Ras/MAPK peuvent causer des syndromes développementaux appelés Rasopathies. Le
syndrome cardio-facio-cutané (CFC) fait partie des Rasopathies. Les Rasopathies partagent
plusieurs phénotypes tels que des malformations cardiaques et faciales, des anomalies cutanées
ainsi que des retards cognitifs. Le syndrome CFC est un syndrome rare associé à des mutations
dans les gènes BRAF, KRAS, MEK1 et MEK2. Les mutations des gènes MEK1 et MEK2 sont
retrouvées chez 25% des patients. Peu est connu sur les origines et la mécanistique impliquées dans
le développement des phénotypes observés chez les patients CFC. À ce jour, aucun modèle animal
avec une mutation CFC dans les gènes Mek1 et Mek2 n’a été généré. Parmi les mutations dans
MEK1 et MEK2, MEK1Y130C est la plus représentée. Dans le but d’étudier le rôle moléculaire et
développemental de la mutation MEK1Y130C dans le développement du CFC, nous avons généré une
lignée de souris portant cette mutation. Les souris portant la mutation Mek1Y30C présentent des
défauts cardiaques, neurologiques et faciaux. Par contre, l’analyse de l’activation de ERK dans des
MEFs Mek1Y130C/- ne montre pas d’hyperactivation de la voie ERK/MAPK. Toutefois, nos souris
Mek1Y30C récapitulent partiellement les phénotypes des patients CFC.
147
148
4.3 Abstract
RAS/MAPK signaling pathway is one of the most investigated signaling pathways due to its
role in various cellular processes such as proliferation, differentiation, survival and cell death, and its
implication in cancer. Germline mutations in genes encoding members of RAS/MAPK pathway also
cause several developmental syndromes gathered under the name of RASopathies, These
syndromes share overlapping characteristics such as craniofacial dysmorphology, cardiac
malformations, cutaneous abnormalities and developmental delay. Among them, the cardio-faciocutaneous syndrome (CFC) is a rare syndrome associated with mutations in members of the
RAS/MAPK pathway including BRAF, KRAS, MEK1 and MEK2. MEK1 and MEK2 mutations are
found in < 25 % of the CFC patients. Little is known of the origins and the mechanisms involved in the
development of the phenotypes observed in CFC patients. Thus far, no mouse model with a CFC
mutation in Mek1 or Mek2 has been reported. Among the MEK1 and MEK2 mutations, MEK1Y130C is
the most common. In order to investigate the molecular and developmental consequences of the
Mek1Y130C mutation, a mouse line carrying this mutation was generated. Mek1Y130C mice present
cardiac, neurological and facial phenotypes. The Mek1Y130C allele was suggested to be a dominant
mutation. However, mouse embryonic fibroblasts carrying one Mek1Y130C allele and a null allele of
Mek1 (Mek1Y130C/-) do not show hyperactivation of the ERK/MAPK pathway in response to serum or
EGF induction. Thus, our Mek1Y130C mice partially recapitulate the CFC syndrome phenotype.
149
150
4.4 Introduction
RAS/MAPK signaling pathway is one of the best characterized and most investigated
pathway due to its implication in various cellular processes including proliferation, differentiation,
survival and cell death (Shaul et al. 2007; Sun et al. 2015). The somatic deregulation of the
RAS/MAPK pathway is one of the first causes of cancer, leading this pathway to be studied in the
context of oncogenesis. Several phase II studies have been initiated to test different MEK inhibitors in
treatment of various types of tumors including breast, colon, endometrial, melanoma and non-small
cell lung cancer ((Rinehart et al. 2004; Haura et al. 2010; Catalanotti et al. 2013; Coleman et al.
2015). Germline mutations in genes encoding members of RAS/MAPK pathway also cause
developmental syndromes, such as the neurofibromatosis type 1, Noonan syndrome, Costello
syndrome, cardio-facio-cutaneous syndrome, LEOPARD syndrome and Legius syndrome, known as
the RASopathies. These syndromes share overlapping characteristics such as craniofacial
dysmorphology, cardiac malformations, cutaneous abnormalities and neurocognitive delay.
The first RASopathy described is the neurofibromatosis type 1 (NF1), caused by mutations in
the gene coding for the neurofibromin1, which is a RAS-GTPase-activating protein (RAS-GAP). The
clinical diagnostic of NF1 is based on the presence of café-au-lait maculae. Patients with NF1 have
variability in the severity of the disease but they all show changes associated with the central nervous
system. One of the brain abnormality associated with NF1 is astrogliosis. Astrogliosis, or astrocyte
activation, is a common response to brain injury, and is commonly marked by up-regulation of several
proteins including cytokines, growth factor, transcription factors and the astrocyte intermediate
filament protein GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) (Rizvi et al. 1999). During the past decade,
other RASopathies has been characterized with mutations in genes that encode members of
RAS/MAPK pathway. Among them, Noonan syndrome (NS), Noonan syndrome with multiple
lentigines, most known as LEOPARD syndrome, Costello syndrome (CS), Langius syndrome (LS)
and cardio-facio-cutaneous syndrome (CFC) (Rauen 2013).
Among these syndromes, the cardio-facio-cutaneous syndrome (CFC) is a very rare
syndrome with a prevalence of 1/810,000 in Japan; around 300 cases worldwild have been reported
to date (http://cfcsyndrome.org/syndrome.shtml). Patients have multiple congenital abnormalities,
with an overlapping with NS and CS, such as craniofacial defects, hypertrophic cardiomyopathy,
pulmonary valve stenosis, mental retardation and neurological defects (Roberts et al. 2006). Four
genes are associated with CFC: BRAF, KRAS, MEK1 and MEK2. Mutations in BRAF are found in
151
75% of the case whereas MEK1 and MEK2 mutations are more rarely found (< 25% of the cases;
(Niihori et al. 2006; Rodriguez-Viciana et al. 2006; Dentici et al. 2009). MEK1 and MEK2 are two
dual-specificity kinases responsible for ERK1 and ERK2 activation. Most of the CFC patients present
missense mutation on MEK1 and MEK2, but rare cases of MEK2 deletion have been reported
(Dentici et al. 2009; Nowaczyk et al. 2014). In order to study this genetic disease animal models have
been generated. The first CFC mouse model has been generated in 2011, with a constitutively active
BRAF mutation (Urosevic et al. 2011). This first model presents three of the major symptom of CFC:
skeletal, growth and cardiac defects, but this mutation is not observed in CFC patients. Mice carrying
L597V BRAF mutation a more genuine CFC syndrome mutation showed also CFC characteristics.
These mice display short stature, facial dysmophia, cardiac enlargement and hypertrophic
cardiomyopathy (Andreadi et al. 2012). Another model with the most prevalent CFC mutation,
Q241R, showed the embryonic skeletal abnormalities, lymphatic defects, cardiac defect and liver
necrosis (Inoue et al. 2014).
MEK1 and MEK2 mutation are more rarely found in CFC patients (< 25%), thus less is known
about the mechanism and the origins of the observed phenotypes. Thus far, no mouse model with a
CFC mutation in Mek1 or Mek2 has been reported. Of MEK1 and MEK2 mutation, the MEK1Y130C
mutation is the most common (Nava et al. 2007; Jindal et al. 2015). In order to investigate the
molecular and developmental effect of the Mek1Y130C mutation a mice line carrying a conditional
Mek1Y130C allele was generated. A point mutation was introduced in the third exon of Mek1 in order to
generate the MEK1 Y130C mutation. The Mek1+/Y130C mice are viable and fertile. However, the
Mek1+/Y130C and Mek1Y130C/Y130C mice present cranial and cardiac phenotypes observed in CFC
patients. Our study is the first to report a CFC mouse model with a MEK1 mutation which partially
recapitulate cardio-facio-cutaneous syndrome.
4.5 Results
4.5.1 Viability of MEK1Y130C mouse model
To assess if Mekl1Y130C mutation can recapitulate the CFC syndrome phenotype, we
designed a targeting vector in which the PGKneopA selection cassette flanked by loxP sites was
inserted into the second Mek1 intron (Figure 4.1A). In addition, a A to G substitution was inserted into
the third exon as well as a new XbaI site into the third intron in order to introduce the MEK1 Y130C
mutation and facilitate the identification of the targeted allele by Southern analysis (asterisk and XbaI
152
site in Figure 4.1A) . The targeting vector was electroporated in ES cells and targeted clones were
identified by Southern blot using XbaI digestion and a 3’ probe (Figure 4.1C). Targeted ES cells were
injected in blastocysts and chimeras were obtained. Germline transmitters were obtained and
transmission of the Mek1Y130C-neo allele was verified using an EcoRI digestion and a 5’ probe (Figure
4.1C). Genomic DNA was extracted from Mek1+/Y130C mice and used to amplify the third exon of
Mek1 for sequencing analysis. The sequence of the Mek1+/Y130C mice confirmed that both alleles, the
wild-type (wt) and the A to G substitution into the Mek1 third exon were present in Mek1+/Y130C mutant
(Figure 4.1D).
To assess the viability of Mek1+/Y130C mutants, we cross heterozygotes Mek1Y130C-neo/+ mice
with Sox2-Cre mice to remove the PGKneopA cassette and generate the Mek1Y130C allele. Southern
blot was performed, using NheI digestion and an internal probe, to identify Mek1+/Y130C mice (Figure
4.1C). Mendelian ratio of Mek1+/Y130C mice was obtained at weaning (Table 1A). Moreover, normal
transmission of the Mek1Y130C was obtained in Mek1+/Y130C x Mek1+/+ crosses indicating that the
Mek1+/Y130C mice were viable and fertile (Table 1B).
Table 1: Generation of Mek1+/Y130C mice.
(A)
Mek1+/Y130Cneo x Tg Sox2 +/Cre
Tg Sox2+/+
Tg Sox2+/Cre
Age
# of litter
# of
pups
Mek1+/+
Mek1+/Y130Cneo
Mek1+/+
Mek1+/Y130C
Adulte
4
23
7 (30.4)
3 (13)
6 (26.2)
7 (30.4)
25
25
25
25
Expected %
The percentage of live mice are indicated in parentheses.
(B)
Mek1Y130C/+ x Mek1 +/+
Genotype of live mice
Age
# of litter
# of
pups
Mek1+/+
Mek1Y130C/+
Adulte
11
60
18 (30)
42 (70)
50
50
Expected %
The percentage of live mice are indicated in parentheses.
153
Figure 4.1: Generating the Mek1Y130C allele
(A) Schematic diagram of the Mek1 genomic locus, targeting construct, and targeted alleles. Exons
are represented as grey boxes. The targeting vector contains the PGKneo selection cassette flanked
by loxP sites (black triangle), and a single nucleotide mutation in exon3 A>G130 (star). Insertion of
the targeting vector by homologous recombination will generate the Mek1Y130C-neo allele whereas the
CRE mediated recombination will generate the Mek1Y130C allele. The location of the 5', 3’ and internal
probes used for Southern analyses are indicated (A, B and C respectively). (B) Schematic
representation of Southern fragment obtained after EcoRI, XbaI and NheI digestion and using 3’, 5’
and internal probe respectively. (C) Southern blot analysis of ES cell screening (left panel), germline
transmission (right panel) and Sox2Cre deletion (lower panel). For ES cell screening, DNA was
digested with XbaI, blotted and hybridized with the 3' Mek1 genomic probe C (left panel). To assess
germline transmission tail DNA was digested with EcoRI, blotted and hybridized with the 5' Mek1
genomic probe A (right panel). For Sox2Cre deletion tail DNA was digested with NheI, blotted and
hybridized with the internal Mek1 genomic probe B (lower panel). (D) Mek1+/+ (left panel) and
Mek1+/Y130C (right panel) genome sequencing of exon 3, confirming the presence of the point
mutation leading to the substitution of a tyrosine by a cysteine.
154
155
4.5.2 The Mek1Y130C allele contains a partial duplication of the Mek1 gene
The in vitro studies showed that CFC mutation, including the MEK1Y130C mutation might be
activating mutations (Rodriguez-Viciana et al. 2006; Rodriguez-Viciana et al. 2008). Moreover, CFC
mouse model with mutations in Braf developed a severe phenotype and treatment of these mice with
MEK inhibitors partially rescued the phenotype suggesting that the observed phenotype was probably
due to the hyper-activation of the MAPK pathway (Inoue et al. 2014). To further investigate the
biochemical properties of the Mek1Y130C allele in vitro, we established mouse embryonic fibroblasts
(MEFs) to produce the MEK1Y130C mutated protein. No MEK1Y130C specific antibodies are available.
To bypass this lack of specific antibody and knowing that Mek1+/- mice have no phenotype, we
decided to generate MEFs from Mek1Y130C/- embryos. Mek1+/- mice were bred with Mek1+/Y130C mice
to generate Mek1Y130C/- mice. Using a StuI digestion and a probe derived from the second intron we
can resolve by Southern blot analysis the wt, null and Mek1Y130C allele as fragment of 2.0, 4.2 and 2.2
kb, respectively (Figure 4.2A). Unexpectedly in Mek1+/- by Mek1+/Y130C crosses, we observed mice
that were carrying the three Mek1 alleles (Fig. 4.2B). Moreover, the mice that are positive only for the
wt and Mek1Y130C allele showed stronger signal for the wt allele than for the Mek1Y130C allele, which is
equivalent to the wt signal observed in the Mek1+/+ mice. Altogether, these data suggested that the
chromosome 9 that carry the Mek1Y130C allele was containing a duplication of the Mek1 gene. To
confirm this hypothesis to determine if the duplication was complete and establish where the
duplication was inserted in chromosome 9, we performed a whole genome sequencing analysis of a
Mek1Y130C/Y130C individual. The sequence analysis revealed a 61.5 kb duplication that cover the
sequence starting 5.5 kb upstream of the Mek1 gene and finishing in the fifth intron. Only one break
junction was found by the sequence analysis between the fifth intron in 5’ and the upstream
sequence of Mek1 in 3’ suggesting that the intragenic duplication occurred by unequal crossing-over.
The representation of the duplication is presented in figure 4.2C.
The genomic structure of the duplication suggested the production of the heteronuclear
transcript or pre mRNA containing the duplicated exons and unique ones due to the presence of a
polyadenylation signal only after the exon 11 (Figure 4.2C). By differential splicing, the wt Mek1
transcript and/or the Y130C Mek1 transcript could be generated. Alternatively, only the region that
encode the consecutive eleven exon can generate a functional transcript and protein. To determine if
both transcripts containing the wt sequence and the Y130C mutation were produced, we prepared
total RNA from kidney, lung and thymus from adult Mek1Y130C/- mutants. Quantitative RT-PCR using
156
oligo dT primer for the reverse transcription and primers located in the third and fourth exon for qPCR
were performed to determine the level of Mek1 expression in wt and Mek1Y130C/- tissues (Figure
4.3A). The levels of Mek1 transcript in wt specimen was twice the level observed in Mek1Y130C/tissues (Figure 4.3B and data not shown). The PCR products were then sequenced to determine
which Mek1 transcript was synthesized. In all the tissues analyzed, both wt and mutant transcripts
were detected in Mek1Y130C/- specimens (Figure 4.3C and data not shown). Western blot analyses
revealed that the MEK1 protein levels in Mek1Y130C/- and Mek1+/- mutants was reduced by half when
compare to wt specimens indicating a correlation between mRNA and protein levels (Figure 4.3D).
Altogether, these results indicate that the Mek1Y130C allele contains duplicated sequences and that
the transcription of this allele leads to transcripts able to generate wt and Y130C MEK1 proteins.
Thus, Mek1Y130C/Y130C mutants should produce normal levels of MEK1 protein in 1:1 ratio for the wt
and Y130C MEK1 as for the CFC patients.
4.5.3 Heart and cranial defects in Mek1Y130C mutants
Patient with CFC syndrome present several congenital anomalies including hypertrophic
cardiomyopathy, pulmonary valve stenosis, craniofacial defects, mental retardation and neurological
defects. To verify if our Mek1Y130C allele can generate these phenotypes in mice we have generated
Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- and Mek1Y130C/Y130C mice to analyze their phenotype compared to Mek1+/+
and Mek1+/- mice. First, the heart weight/body weight ratio was measure in three and seven month old
mice to determine if they develop hypertrophic cardiomyopathy. No difference was observed in the
weight/body weight ratio (data not shown). We further investigated another heart defect present in
CFC patient, the pulmonary artery stenosis. This parameter was measured on E13.5 embryos. The
embryo gross morphology did not reveal major anomalies (Figure 4.4A). However, the comparison of
the pulmonary artery between wt and the various Y130C mutants showed a pulmonary artery
stenosis (Figure 4.4B-C). To confirm the difference in size of the pulmonary artery between the wt
(Mek1+/+) and the Y130C mutants, we measured the lumen area. No difference in lumen area was
observed between the Mek1+/+ and Mek1+/-, whereas a significant reduction in pulmonary artery
lumen area was observed in all the mutants carrying the Mek1Y130C allele. Our data suggest that one
allele with the Y130C mutation is sufficient to cause pulmonary stenosis.
CFC patients also present craniofacial dysmophia. Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- and
Mek1Y130C/Y130C skulls were analyzed at 6 weeks of age and compared to Mek1+/+ and Mek1+/specimens. After alcian blue and red alizarin coloration, three parameters were analyzed: the length
157
Figure 4.2: Mek1 dulplication
(A) Schematic diagram of the Mek1 genomic locus, Mek1- and Mek1Y130C alleles. Exons are
represented as grey boxes and a single nucleotide mutation in Mek1Y130C exon3 A>G130 is
represented with a star. The location of the internal probes used for Southern analyses is indicated
(black square). (B) Southern blot analysis of germline transmission of Mek1Y130C allele. Mek1+/Y130C
and Mek1+/- mice were crossed; tail DNA of the offspring was digested with StuI, blotted and
hybridized with the internal genomic probe. Mek1Y130C: 2.2kb, Mek1+: 2.0kb and Mek1-: 4.2kb. All
mice having the Mek1Y130C allele also have Mek1+ allele (C) Schematic representation of Mek1
duplication upstream of Mek1Y130C endogenous allele.
158
159
Figure 4.3 : Duplication analysis
(A) Schematic representation of Mek1 cDNA. Boxes indicating exon, red boxes indicate the kinase
domain. (B) qPCR analysis of Mek1 in Mek1+/+ (n=4), Mek1+/- (n=4) and Mek1Y130C/- (n=4) cDNA
obtained after a reverse transcription using oligo(dT) (blue arrow). Primers are located in exon 3 and
exon 4, flanking the mutation (purple arrows). (C) Mek1+/+ (C; left panel) and Mek1Y130C/- (C; right
panel) cDNA sequencing of exon 3 after a reverse transcription using oligo(dT). These sequences
indicate the presence of the both nucleotides (Adenine and Guanine) in Mek1Y130C/- mice, suggesting
the duplication of exon 3 in these mice. (D) MEK1 expression levels in Mek1+/+, Mek1+/- and
Mek1Y130C/- by Western blot analysis. VINCULIN is used as loading control. Quantification shows that
MEK1 levels in Mek1+/- and Mek1Y130C/- mutants are significantly reduced and correspond to half the
amount present in Mek1+/+.
160
161
Figure 4.4 : Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- and Mek1Y130C/Y130C mice present cardiac and facial defects.
(A) Whole mount E13.5 Mek1+/+, Mek1+/-, Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- and Mek1Y130C/Y130C embryos. No
size difference was observed in these embryos. (C) Hematoxylin & eosin staining of E13.5 Mek1+/+,
Mek1+/-, Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- and Mek1Y130C/Y130C transverse section of pulmonary arteries.
Pulmonary stenosis is observed in all Mek1Y130C genotypes (arrow). e: esophagi, lb: left bronchia, rb:
right bronchia, rpa: right pulmonary artery, lpa : left pulmonary artery. (B) The measurement of the
artery lumen’s area revealed a stenosis in Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- and Mek1Y130C/Y130C specimens.
Mek1+/+ and Mek1+/- are used as controls. (D) Morphometric characteristics of Mek1+/+, Mek1+/-,
Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- and Mek1Y130C/Y130C skulls. Length, Width and inner canthal width of each
group is measured in cm. All Mek1Y130C mice present facial dysmorphia.
162
163
and the width of the skull and the distance of the inner canthal (Figure 4.4D). Only the Mek1Y130C/mutants showed significantly changes in width/length ratios indicating a cranial disproportion. Thus,
all mutant carrying at least one allele of Mek1Y130C mice present pulmonary stenosis as seen in CFC
patients whereas the cranial dysmophia is observed only in Mek1Y130C/- mutants.
4.5.4 Brain defects in Mek1Y130C mutants
It has been reported that patient with CFC present neurologic abnormalities (Rauen 1993).
Moreover, it is known that astrocytes are involved in various central nervous system pathologies. In
general, astrogliosis is considered to be a consequence of neurodegeneration and is marked by an
increase of GFAP, known to be induced upon brain damage (Middeldorp et al. 2011). In order to
evaluate the brain damages in our Mek1Y130C mutant, we analyzed the density of GFAP in adult
sensory cortex and hippocampal CA1 (cornus ammonis 1) (Figure 4.5). Our data show an increase of
the density of GFAP-expressing astrocytes both in the sensory cortex and the hippocampal CA1
revealing an astrogliosis and neurologic abnormalities.
4.5.5 Mek1Y130C capacity to activate ERK/MAPK pathway
Experiment in which the MEK1Y130C transgene were overexpressed in 293T cells has
suggested that the Y130C MEK1 protein was more active than wild-type MEK1 (Rodriguez-Viciana et
al. 2006; Rodriguez-Viciana et al. 2008). In order to further investigate the biochemical properties of
the Mek1Y130C allele, we first looked in vitro at the activation levels of the ERK/MAPK pathway in
E13.5 pulmonary arteries by monitoring p-ERK signal by immunofluorescent staining to determine if
altered ERK activation could be linked to the pulmonary stenosis observed in Mek1Y130C mice (Figure
4.6A). No obvious difference in p-ERK staining was detected in Mek1Y130C/- embryo compared to
Mek1+/+ and Mek1+/-. We then look at the ability of the Y130C MEK1 protein to activate the ERK in
response to stimulation by growth factor and serum. Mouse embryonic fibroblasts were derived from
E13.5 wt and Mek1Y130C/- embryos as previously described in (Giroux et al. 1999). We next assessed
activation of ERK/MAPK pathway by quantification of ERK phosphorylation after overnight serum
deprivation and subsequently stimulated with 20% FBS or with 2ng/ml of EGF for 5, 10, 30 and
60minutes (Figure 4.6B-D). In serum deprivation the activation of ERK in reduced in Mek1Y130C/MEFs compared to wt cells. Moreover, in response to growth factor stimuli, wt and Y130C MEK1
mutant proteins showed the similar kinetic of ERK activation, but the levels of ERK phosphorylation is
164
reduced in Mek1Y130C/- MEFs most likely reflecting the reduced levels of MEK proteins. Together, the
results indicate that the Y130C MEK1 protein is not a constitutively active form of MEK1 or more
active than the wt form of MEK1.
4.6 Discussion
Patients with Rasopathies are characterized by facial and cardiac defects, with pulmonary
stenosis in most cases, as well as neurological defects (Aoki et al. 2016). In this study, we generated
mice expressing Mek1Y130C mutation. Neither heterozygous nor homozygous mice exhibit lethality.
Our Mek1Y130C allele presents duplicated sequences. The characterization of the Mek1Y130C locus
using southern blot, qPCR and whole genome sequencing has revealedthat the duplication contains
5.5kb upstream of Mek1 gene and the five first exons of Mek1 in chromosome 9 most likely
generated by unequal crossing-over.
Despite this duplication, mice expressing the Y130C mutation present CFC phenotype. One
of the most frequent cardiac defects observed in CFC patient is a pulmonary stenosis. Analyzing the
lumen of the pulmonary artery in our Mek1Y130C mutants (Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- and
Mek1Y130C/Y130C) show a pulmonary stenosis. The Mek1Y130C/- mutants also present facial dysmorphia
marked by a difference in width and length proportion. However, the analyzis of the activation of the
ERK\MAPK pathway using Mek1Y130C/- MEFs, showed no difference in the amount of pERK in
Mek1Y130C/- compared to Mek1+/+ in basal state or after induction with 20% FBS or 2ng/µl of EGF.
These observations are in opposition to the biochemical analysis of MEK1 Y130C mutation using
transfection in HEK293T cells (Rodriguez-Viciana et al. 2008). In fact, the authors showed that
transfecting vector expressing MEK1Y130C tagged protein in HEK293T lead to an increase of ERK
phosphorylation, when compared with transfection of wt MEK1 protein. These data are in agreement
with is the one reported with B-Raf mouse model of CFC. In both, BrafQ241R/+ and Mek1Y130Cmodels,
constitutive activation of the ERK/MAPK pathway was clearly not observed in E13.5 mice or in
Mek1Y130C/- MEFs (Inoue et al. 2014). In BrafQ241R/+ CFC mouse model, administration of Mek inhibitor
rescue the lethal phenotype. Altogether these observations indicated that the Braf mutation is not
linked to the constitutive activation of ERK/MAPK pathway but that it causes a deregulation in
signalization. It is possible that in our case the ERK/MAPK pathway is also imbalanced and leads to
the phenotype. It will be interesting to see if the use of MEK inhibitors can rescue the deregulation of
this signaling pathway.
165
Figure 4.5: Mek1Y130C/Y130C mice exhibit an increased number of GFAP-expressing astrocytes in
the adult neocortex.
(A) We analyzed the density of Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)-expressing astrocytes in a
region of sensory cortex (red boxes) and hippocampal CA1 (yellow boxes). Representative lowmagnification images of coronal brain sections stained for GFAP in wild-type and Mek1Y130C/Y130C
animals are shown (A). (B) Quantification of relative density (cells/mm2) is provided in B (n=3; * = p <
0.05; ** = p < 0.01). (C-J) Relative to wild-type cortices (C-D, G-H), high-magnification analysis of
Mek1Y130C/Y130C mice (E-F, I-J) revealed an increase in the density of GFAP+ astrocytes in the
sensory cortex (C-F, scale bar = 100 µm). Similar results were observed in hippocampal CA1 (G-J,
scale bar = 50 µm).
166
167
Figure 4.6: Kinetic of ERK/MAPK pathway activation in Mek1Y130C/- MEFs.
(A) pERK staining in Mek1+/+, Mek1+/- and Mek1Y130C/- E13.5 embryo. (B) Basal levels of p-ERK
(Arbitrary Unit) in Mek1+/+ (n=3) and Mek1Y130C/- mutant (n=3) MEFs after 16h of serum starvation. (C)
p-ERK levels in Mek1+/+ (n=3) and Mek1Y130C/- (n=3) MEFs after 16h of serum starvation and
induction with 20% serum for 3, 5, 10, 30 and 60 minutes.
168
169
Mice with the Mek1Y130C allele also exhibit astrogliosis marked by an accumulation of GFAP positive
cells in cortex and hippocampus of homozygote and heterozygote mice. Astrogliosis is a response
seen in neurogical disorders. This accumulation of GFAP positive cells is a defensive reaction aiming
at limiting tissue damage. Patients with CFC syndrome present cognitive delay from mild to severe,
developmental delay and seizure disorder. It has been reported that repeated seizures can increase
GFAP in hippocampus (Stringer 1996). It is possible that undistinguishable micro-seizure appeared in
our Mek1Y130C mutant causing accumulation of GFAP in the hippocampus at 6 week. Closer
monitoring will allow us to identify if our animals display such seizure disorder.
Therefore, the Mek1Y130C mice described here may help in understanding the physiopathology of at
least some of the clinical features such as pulmonary stenosis, facial defect and neurological
damages present in CFC patients.
4.7 Materials and Methods
4.7.1 Mice, genotype and tissue collection
The age of the embryos was estimated by considering the morning of the day of the vaginal plug as
E0.5. Control and mutant embryos were collected at E13.5. Adult skeleton and organs were collected
at 6 weeks. For RNA and protein extraction, organs were snap-frozen in LN2. Mice were genotyped
by southern blot using StuI digestion and an internal probe.
4.7.2 Histological analyses and pulmonary stenosis analysis
Paraffin-embedded E13.5 embryos were sectioned at 4μm. The embryos were oriented head down in
order to do transversal section. Morphology was analyzed by hematoxylin and eosin (H&E) staining.
Left and right pulmonary artery lumens were measured every 8µm as long as they were visible in the
section, about twenty measures per specimen were made ±200µm apart. Averages of the lumen
area were compared between wild-type and mutant.
4.7.3 Brain immunostaining
Six weeks old mice were anesthetized with isoflurane and hearts perfused with 20ml PBS and 60ml
of 4% paraformaldehyde using a 20ml/min pump (tail moving indicate a good perfusion). Brain tissu
was prepared as previously described (Xing et al. 2016). GFAP staining and quantification was
performed as described in (Li et al. 2012)
170
4.7.4 Western blot analysis
Protein extracts were prepared as described (Belanger et al. 2003). Total protein lysates (20 µg)
were resolved on a denaturing 10% SDS-PAGE and probed with rabbit monoclonal antibodies
against MEK1 (Nadeau et al. 2009) as well as mouse monoclonal antibody against Vinculin (Sigma
Aldrich) used at 1/2000 and 1/5000 respectively. The most representative western blots are
presented. The relative amount of MEK1 was obtained by densitometry analyses with the Fluor-S
MAX MultiImager–captured images using ImageJ version 1.50c.
4.7.5 RNA isolation and quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
Organs from six weeks wt, Mek1Y130C/- and Mek1-/- were collected as described (Nadeau et al. 2014).
Total RNA was isolated using TRIzol reagent according to the manufacturer's procedure (Life
Technologies Inc., Burlington, ON). cDNA was synthesized with the Superscript II Reverse
Transcriptase (Life Technologies Inc., Burlington, ON) with 1µg of total RNA and oligo(dT) primer.
qRT-PCR experiments were performed as described using Rpl19 gene as control (Boucherat et al.
2012). Mek1 primer sequences were: Forward 5'-CTGATCCACCTGGAGATCAAACC-3' and Reverse
5'- CTCCCGAAGATAGGTCAGGC -3'.
4.7.6 Fibroblast isolation and pERK induction
Primary fibroblasts were isolated at E13.5, cultured, and immortalized as described (Giroux et al.
1999). Cells were starved in medium containing 0.1% FBS overnight before treatment with 20% FBS
or EGF at 2 ng/ml for 0, 3, 5, 10, 30 and 60minutes. Protein extracts were prepared as described
(Belanger et al. 2003). Total protein lysates (20µg) were resolved on a denaturing 10% SDS-PAGE
(polyacrylamidegel electrophoresis) and probed with rabbit monoclonal antibodies against phosphoERK1/2 (Cell Signaling Technology Inc.), and with mouse monoclonal antibody against vinculin
(Sigma Aldrich) as a loading control uses at 1/5000 each. The relative amount of phospho-ERK1/2
was obtained by densitometry analyses with the Fluor-S MAX MultiImager–captured images using
ImageJ version 1.50c.
4.7.7 Skeletal analysis
Whole mount skeletons were prepared with alcian blue for staining the cartilage and alizarin red for
staining the bone. Briefly, mice were skinned, eviscerated, and fixed overnight at 4°C in 95% ethanol.
The next day, specimens were put into an alcian blue staining solution (0.015% alcian blue in 20%
acetic acid prepared in 95% ethanol) for 4 days at 37°C. Skeletons were then rinsed one hour in 95%
171
ethanol, clarified overnight in 2% KOH and stained overnight with 0.003% alizarin red prepared in 1%
KOH. Specimens were transferred in a solution of 1% KOH/Glycerol (1:1) for 7 days and then kept at
room temperature in a solution of glycerol/EtOH (1:1) until analysis. Skeletons were observed and
three measurements were done on the skull: the length, the width, and the inner canthal distance.
4.7.8 Statistical analyses
Student's t-tests were performed for comparative studies. P<0.05 was considered statistically
significant.
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173
174
5. Discussion générale et conclusions
Les voies de signalisation MAPK sont très conservées durant l’évolution. Que ce soit chez
C.elegans, X.laevis ou D.melanogaster, ces cascades sont impliquées dans des processus menant à
la détermination, la survie et la différentiation cellulaire (Hsu et al. 1994; Kornfeld et al. 1995;
Umbhauer et al. 1995; Wu et al. 1995). L’activation des voies MAPK se fait via différents stimuli et
entraîne une réponse cellulaire suite à la phosphorylation séquentielle de plusieurs kinases. Ce
mode d’activation est conservé de la levure à l’Homme (Widmann et al. 1999).
La voie ERK/MAPK est l’une des voies de signalisations les plus étudiées. Son activation
mène à la phosphorylation des protéines kinases MEK1 et MEK2 qui à leur tour, phosphorylent leurs
seuls substrats connus, ERK1 et ERK2. Plusieurs études ont montré que la régulation de la
signalisation ERK/MAPK est essentielle pour la croissance, la survie ainsi que la différenciation
cellulaire (Sun et al. 2015). Alors que chez S.cerevisiae, C.elegans, D.melanogaster et X.laevis, une
seule MAPK kinase est responsable de l’activation de la voie ERK/MAPK, deux MAPK kinases,
MEK1 et MEK2, remplissent cette fonction chez les mammifères (Crews et al. 1992; Brott et al.
1993). Par conséquent, la question de la redondance fonctionnelle entre les kinases MEK1 et MEK2
chez les mammifères s'impose. Plusieurs groupes de recherche ont tenté de mettre en évidence les
fonctions de MEK1 et MEK2. Depuis de nombreuses années, le laboratoire du Dr Jean Charron
s’intéresse à la voie de signalisation ERK/MAPK et plus particulièrement aux rôles in vivo des
kinases MEK1 et MEK2. L'équipe du laboratoire Charron a montré que le gène Mek1 joue un rôle
essentiel dans le développement du placenta (Giroux et al. 1999; Bissonauth et al. 2006). De plus, et
ce malgré la survie des individus Mek2-/-, MEK2 joue aussi un rôle dans le développement des tissus
extraembryonnaires (Belanger et al. 2003; Nadeau et al. 2009). Ces analyses montrent que MEK1 et
MEK2 partagent certaines fonctions mais qu’elles possèdent aussi des fonctions qui leur sont
propres. Mon hypothèse de recherche était donc qu’une différence dans l’expression spatiotemporelle entre MEK1 et MEK2 pourrait expliquer le rôle unique de chacune des protéines dans le
placenta. Par ailleurs, sachant que MP1 est une chaperonne partenaire de MEK1 et non de MEK2,
MP1 pourrait agir comme un modulateur de la voie ERK/MAPK en régulant l’activation de la voie
passant spécifiquement par MEK1. Les objectifs de ma thèse ont donc été d’étudier le rôle in vivo
des gènes Mek1, Mek2 et Mp1 au cours du développement chez la souris afin de démontrer la
présence ou non de redondance fonctionnelle entre MEK1 et MEK2, et d'établir l'importance de Mp1
dans le développement embryonnaire. De plus, j'ai caractérisé un modèle animal pour le syndrome
175
développemental CFC. Nous avons utilisé une approche génétique pour répondre à ces différentes
questions en générant et analysant des lignées de souris knockin Mek12 (chapitre 2), knockout Mp1(chapitre 3) et Mek1Y130C (chapitre 4). La souris est un modèle permettant de disséquer les fonctions
de MEK1 et MEK2 alors que les modèles non mammifères, possédant une seule kinase MEK, ne le
permettent pas. De plus l'allèle knockin Mek12 s’approche le plus du contexte in vivo de régulation de
l’expression de Mek1 et permet d’adresser de la manière la plus fidèle notre question sur la
redondance fonctionnelle de MEK1 et MEK2.
5.1. Redondance fonctionnelle des kinases MEK1 et MEK2
Plusieurs travaux antérieurs ont tenté de répondre à la question de la redondance
fonctionnelle de MEK1 et MEK2 (Zhang et al. 2010; Zhou et al. 2010; Kocieniewski et al. 2013). Ces
études se basent principalement sur des analyses in vitro, et n'abordent pas les répercussions in
vivo, tel le phénotype placentaire, causées par la perte de fonction des gènes Mek. Il est connu que
la duplication de gènes joue un rôle important dans l’apparition de nouveaux gènes et l’évolution du
génome. L'acquisition de nouvelles fonctions serait due à une pression sélective moins sévère qui
permettrait le maintien de la duplication malgré la présence de mutations. Cela favoriserait
l’apparition de gènes avec de nouvelles fonctions ou avec un profil d’expression différent permettant
une redondance partielle (Long et al. 2003). Sachant que chez S.cerevisiae, C.elegans,
D.melanogaster et X.laevis, une seule MAPK kinase est responsable de l’activation de la voie
ERK/MAPK, il est suggéré que la présence de deux kinases MEK1 et MEK2 chez les mammifères
serait le résultat d’une duplication génique (Caffrey et al. 1999). Busca et ses collaborateurs ont
analysé l’expression et les séquences protéiques de ERK1 et ERK2 de différents vertébrés et
invertébrés (Busca et al. 2015). Les auteurs ont ainsi révélé que la duplication menant à l’apparition
de ERK1 et ERK2 chez les vertébrés se serait produite il y a 400 millions d’années via une
duplication du génome entier. Chez les invertébrés analysés, une seule protéine ERK ancestrale est
exprimée alors que les tétrapodes expriment l’une ou l’autre des protéines ERK (ERK1 et/ou ERK2)
et que les mammifères expriment les deux protéines ERK1 et ERK2. Sachant que ERK1 et ERK2
sont les MAP kinases de la voie ERK/MAPK et qu’elles sont activées principalement par MEK1 et
MEK2, il ne serait pas surprenant que la duplication et la pression de sélection de MEK1 et MEK2
soient comparables à celles de ERK1 et ERK2.
176
L’analyse de notre lignée de souris qui exprime l’ADNc de Mek2 sous le contrôle des
séquences régulatrices de Mek1 a mis en évidence la redondance fonctionnelle des gènes Mek1 et
Mek2. En effet, la survie des animaux qui expriment Mek2 à la place de Mek1 permet de conclure
que, lorsqu’exprimé au locus Mek1, Mek2 est capable de remplacer Mek1. Ces résultats sont la
première démonstration génétique de la redondance fonctionnelle, durant le développement, des
proiéines MEK1 et MEK2. Ils révèlent que les protéines MEK1 et MEK2 ont des fonctions
redondantes et que la duplication menant à l’apparition de MEK1 et MEK2 chez les mammifères ne
crée pas de nouvelle fonction. Une étude récente sur la redondance fonctionnelle des kinases ERK1
et ERK2 est parvenue, en utilisant une autre méthode, aux mêmes conclusions, à savoir que les
fonctions des kinases ERK1 et ERK2 sont redondantes au cours du développement (Fremin et al.
2015). Ces données soutiennent l’idée selon laquelle les kinases MEK1 et MEK2 activent ERK1 et
ERK2 et l’importance de la voie ERK/MAPK au cours de l’évolution. La redondance fonctionnelle de
MEK1 et MEK2 nous amène à nous demander : Pourquoi les mammifères ont-ils besoin de
l’expression des deux kinases MEK1 et MEK2 si elles jouent le même rôle?
Dans les organismes pluricellulaires, trois critères indépendants déterminent l’évolution des
séquences codantes 1-l’importance fonctionnelle, 2-la taille du gène et 3-le niveau d’expression
protéique (Choi et al. 2013). Pour le premier critère, les résultats présentés au chapitre 2 montrent
qu’il n’y a pas de différence fonctionnelle entre MEK1 et MEK2. Pour le second critère, si l’on
compare les séquences des gènes Mek1 et Mek2 chez la souris, il est intéressant de constater que
le gène Mek2 (19 kb) est environ 3.5 fois plus petit que le gène Mek1 (68 kb). Une hypothèse est que
les gènes de longue taille ont une plus grande probabilité de recombinaison et qu’ils pourraient
affecter la sélection naturelle. Selon les mutations présentes dans la séquence, ce critère affecte
positivement ou négativement la sélection naturelle (Liao et al. 2006). De plus, aucune différence de
séquence n'est retrouvée dans les domaines fonctionnels des protéines MEK1 et MEK2, ce qui
écarte ce critère pour expliquer l’évolution des kinases MEK1 et MEK2.
5.2. Niveau d’expression des protéines MEK1 et MEK2
Le troisième critère qui détermine l’évolution des protéines est le niveau d’expression. Les
résultats présentés au chapitre 2 indiquent que l’expression des protéines MEK1 et MEK2 est
différente dans le placenta. En effet, nous avons mis en évidence que dans le placenta, les protéines
MEK1 et MEK2 ne sont pas exprimées au même niveau, MEK1 étant exprimée à un niveau plus
177
élevé que MEK2. Une explication serait que le promoteur de Mek1 est plus fort que celui de Mek2
entraînant un niveau protéique plus important. En clonant les séquences promotrices de Mek1 et
Mek2 (1kb en amont de l’ATG) en amont du gène rapporteur de la luciférase et en les transfectant
dans des fibroblastes de souris (MEFs ou NIH3T3) avec un normalisateur exprimant la Renilla
luciférase régulée par le promoteur de la thymidine kinase, il serait possible de définir si la faible
expression de MEK2 est due à son promoteur.
Toutefois, l’analyse de l’expression de notre allèle Mek12 révèle une expression de l'ARNm
Mek12 au même niveau que l’ARNm endogène Mek1 mais la production de la protéine MEK2-MYC
au même niveau que MEK2 suggérant que la régulation ded niveau d’expression de MEK1 et MEK2
est post-transcriptionnelle. Très peu de choses sont connues sur la régulation post-transcriptionnelle
de Mek1 et Mek2. Bien que plusieurs facteurs puissent contribuer à la traduction de l'ARNm, la
plupart des éléments qui contrôlent la traduction sont situés dans les régions non-traduites situées de
part et d'autres des séquences traduites (UTR) (Wilkie et al. 2003; Araujo et al. 2012; Matoulkova et
al. 2012). Chez les eucaryotes, la plupart des ARNm initie leur traduction de manière dépendante à
la coiffe située à l'extrémité 5’. Il a été montré que les protéines RBP (RNA-binding protein) se liant à
l’ARN jouent un rôle important dans la régulation de la traduction. Les sites de liaison des RBPs
peuvent se trouver le long de l’ARNm, mais sont plus généralement localisés dans la région 3’ UTR.
Plusieurs études montrent que l’association de RBP au 3’UTR peut réguler positivement ou
négativement l’efficacité de la traduction en affectant des mécanismes tels que : 1- l’initiation de la
traduction via le recrutement des ribosomes ; 2- le recrutement des facteurs d’initiation de la
traduction ; 3- l’interaction des sous-unités ribosomiques au site d’initiation de la traduction et 4l’élongation. Donc, la différence entre les quantités protéiques produites par les allèles Mek1, Mek12
et Mek2 pourrait s'expliquer par des différences dans leurs régions non codantes.
Les travaux de Wang et collaborateurs supportent un rôle d'une régulation différentielle par
des RBPs. Ils ont étudié le niveau de MEK1 dans des cellules épithéliales de l’intestin et montré que
les polyamines cellulaires régulent l’expression de MEK1 via la RBP HuR (hu-antigen R). En effet, la
diminution de la quantité cellulaire de polyamines augmente la stabilité et la traduction de Mek1 en
augmentant l’association de HuR avec le 3’UTR de Mek1 (Wang et al. 2010). Donc, l’association de
la RBP HuR peut varier selon la concentration cellulaire de polyamines. Cette association pourrait
aussi varier selon la séquence du 3’UTR. Le 5’ UTR de Mek1 est de 390pb et le 3’ UTR est de 927pb
(Figure 5.1) alors que le 5’ UTR de Mek12 est de 563pb (5’UTR de Mek1 + 173pb correspondant au
178
loxP) et le 3’ UTR correspond au signal de polyadénylation de l’hormone de croissance bovine.
Donc, l’efficacité de recrutement de protéines RBP (potentiellement HuR) aux 3’ UTRs des allèles
Mek12 et Mek1 pourrait être différente et affecter la production des protéines.
Catalanotti et collaborateurs ont montré que dans des fibroblastes de souris, l’expression de
MEK1 est deux fois plus importante que celle de MEK2 (Catalanotti et al. 2009), une observation
similaire à celle que nous avons faite dans le placenta. Il a été montré que HuR se lie aussi au 3’
UTR de MEK2. Mazan-Mamczarz et collaborateurs ont établi que dans des cellules de lymphocytes
B, HuR s’associe à MEK2 et le traitement aux radiations entraîne une augmentation de l’association
de HuR avec MEK2 et une augmentation du niveau protéique de MEK2 (Mazan-Mamczarz et al.
2011). Le 5’ UTR de Mek2 est de 201pb et le 3’ UTR est de 973pb (Figure 5.1). Donc, l’association
de la protéine RBP HuR au 3’ UTR de Mek1, Mek12 et Mek2 pourrait varier selon la séquence et
entrainer une expression protéique différente. Ce modèle pourrait être testé par un essai luciférase
en clonant les 3’ UTR de Mek1, Mek12 et Mek2 et en les transfectant dans des MEFs ou des
fibroblastes de souris NIH3T3. Ceci permettrait d'établir si les différences de séquences entraînent
une expression protéique différente.
Une étude récente montre que les niveaux protéiques de MEK1 et MEK2 sont
différentiellement régulés par ERK1/2 via une boucle de rétroaction négative. En effet, les auteurs
montrent qu’après activation de la boucle de rétroaction, le niveau de MEK1 est augmenté alors que
celui de MEK2 est diminué (Hong et al. 2015). Ces données supportent l’observation de l’expression
supérieure de MEK1 versus celle de MEK2 dans les fibroblastes de souris ainsi que le placenta.
Catalanotti et ses collaborateurs ont émis l’hypothèse selon laquelle la durée de l’activation de ERK
est déterminée par l’hétérodimère MEK1-MEK2 et par la boucle de rétroaction négative passant par
la phosphorylation de la thréonine 292 de MEK1 par ERK1/2. Ils suggèrent qu’en absence de Mek1,
cette boucle est absente et l’activation de ERK passant par MEK2 est prolongée (Catalanotti et al.
2009). Un second groupe a, pour sa part, suggéré, via un modèle mathématique, que le ratio
MEK1/MEK2 régule la durée de l’activation de ERK1/2 alors que le niveau total de MEK régule
l’amplitude de l’activation de ERK1/2. La validité de ce modèle requiert une activité catalytique de
MEK2 plus importante que celle de MEK1 et une quantité de MEK1 plus importante que celle de
MEK2 afin de permettre la répression des deux protéines via la boucle de rétroaction négative
(Kocieniewski et al. 2013). Il serait intéressant de mesurer et comparer l’amplitude ainsi que la durée
179
Figure 5.1: Séquences des 3’ et 5’ UTR des gènes Mek1 et Mek2 de souris
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly/av.cgi?db=mouse&term=Map2k1&submit=Go
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly/av.cgi?db=mouse&term=Map2k2&submit=Go
180
Mek1 5’UTR (Mus Musculus)390pb
caggcgggcgtgagggaagcgctgcagcccccgtgggggcggggcctgctcgtttccccgcccctccctcacc
ctccagtccctcactgggacgtctgtgcgcggcgtctcggagcgccggagcagcggtggccgcactttctcca
agctggggctgtagctgagctgtgggtagtgcgcagggagccgtccgagcccgaggaaccggtgtgctgaggc
gagagttcccggccggcgagcgcgcgcagctggttctccgcgtgggttgggcggagggtcccaggagcgcggc
gttgatcgagccgccccgactctgggcagagccgagggaggaagcgagaagcggccgcgcgctccctgctgag
ttgcaggctctttcccggctgcaag
Mek2 5’UTR (Mus Musculus)201pb
tgtggccgccccctgttccccgacctcccggctgcgctgcagcgtcagcttcactcggcctcggcgtcggtct
gctcgccccggcgctccgggctcgtccgccttccaccttctgcccggcctaggccgcagccccgggcccgcgt
cgcgccgccccctatgggccccggctgaggcgtcgccgctggccgtggagccccg
Mek1 3’UTR (Mus Musculus)926pb
gcctttaggaagcagcaaagaggaattctctgcccagtggcatgccatgttgctttcaggcctctcccatgct
tgtctatgttcagacgtgcatctcatctgtgacaaaggatgaagaacacagcatgtgccaaattgtacttgtg
tcatttttaatatcattgtctttatcactatggttactcccctaagtggattggctttgtgcttggggctatt
tgtctgttcatcaaacacatgccaggctgaactacagtgaaaccctagtgacctgggtggtcgttcttactga
tgtttgcactgctgttcatcgtgactcactagctggctgcctgtattgtcaggattctcggaccttggtactt
cactcttgctggtgacctctcagtctgagagggagccttgtgagacccttcacaggcagtgcatgcatggaaa
gcatgctttgctgctactgaaatgagcatcagaacgtgtacgtcatggtatttttattttttgcttttggtat
agaactcagcaattcccatcaaaaaaacctaagcagagcccatcactgccatgatagctgggcttcagtctgt
ctactgtggtgatttttagacttctggttgtatttctatatttatttttaaatatacagtgtgggatacttag
tggtgtgtgtctctaagtttggattagtgtttctaaattggtggttattttgaatgtcacaaatggattaaag
catcaatgtatcaagagttctatctttcttccagtctaagtaccaatgctattgtaaacaacgtgtatagtgc
ctacaaattgtatgaaaccccttttaaccactttaatcaagatgtttatcaaatctaatctcttattctaata
aaaatactatcaagttaaaataaaagggacaagagatttctgcttttgtg
Mek2 3’UTR (Mus Musculus)973pb
cagccagcgcccagcagtctgtgtccttgtccctgtcggcacagtggccgctgcctctggggacagtgatgct
gtttgttgtggcaggggacctatgcccatgcatttgaaaaccaaacaaaatgaagaaagagaaagaaagaaag
aaagctagctgcggctgtgctcctgcccattgcttgttgtgacctcactcagcaggtggaagaagggcaggcc
aagggatgaggagacactaccctcacctcccttcctgggccccagctcttgcagtgcacatgcagcctccttc
ctagcagggggtgtgggagcaggggacccctctgggctccagggagcatagctaactcagcatagtgcaaagg
cagtgccctgcatgagatccggaggagaccccagtggatctgggtcatggaactcaatgagagcctcgccaca
gcctgcagccaccccaccagggtcccacctatcccaccagtcagtcagactcagccacagtggcctgtaaggg
aagcctgaggcctcctgcccacaatctgaatgaagagcattcctgctaacacagagagatacacttgctaata
cagacctggtgcccgagcactgtacaagtctggggagtgtctgcaccttcttgctgcccctctcagggatgac
aaaagtattcctttttcagatgccccaaggaagccaccatgtggggcttcacatgctccagccaggttgtcca
agcaggtgccgtccaccacactgctggctgctcttgcactgtgcagggacccctactgcctaggggtgcccag
tgtggtgtgggagagcaatgcctactctccgcctctgccatgagctgcatccatccctcacattcctaaatac
taggaaggctgagtcgggaaaacgacaggttttgggccactgtgggctacctagtgagaatgtcttacatcat
ggaaatggtgcaatcacatgttgg
181
d’activation de ERK1/2, chez des MEFs Mek12/2 et des MEFs Mek2-/- (exprimant tous deux des
niveaux comprables de MEK1 ou MEK2). En quantifiant la quantité de pERK avant et après induction
de la voie ERK/MAPK in vitro (de 3 à 120 minutes), on pourrait répondre à cette question. Si
l’hypothèse de la boucle de rétroaction est valide, l’activation de ERK devrait être prolongée chez les
MEFs Mek12/2 car ceux-ci n’expriment pas de Mek1 et ne permettent pas la boucle de rétroaction
négative via la thréonine 292, alors que les MEFs Mek2-/- qui expriment Mek1 devraient permettre
l’inhibition rapide de l’activation de la voie. De plus, si l’hypothèse selon laquelle l’amplitude de
l’activation de ERK1/2 est régulée par la quantité totale de MEK, l’amplitude de l’activation devrait
être la même chez les MEFs Mek2/2 et Mek2-/-.
5.3 Développement du placenta et effet de dosage
Afin de valider l’hypothèse de l'effet de dosage protéique, nous avons généré des lignées de
souris ayant diverses combinaisons alléliques de Mek1 et Mek2. L’observation du placenta de ces
souris nous a permis de montrer pour la première fois qu’un seuil minimal de protéines MEK est
requis afin de soutenir le développement optimal du placenta (Figure 2.5).
Il est intéressant d’analyser les résultats produits sur l’activité et la spécificité de MEK1 et
MEK2 avec une autre perspective. En effet, dans la plupart des études utilisant la délétion ou
l’atténuation de l’expression de Mek1 et Mek2, l’effet de l’inactivation de Mek1 est plus dramatique
que celle de Mek2. Par exemple, l’inactivation de Mek1 cause la mortalité alors que celle de Mek2
n’entraîne pas de phénotype. Toutefois, les individus doubles hétérozygotes ne sont pas viables,
indiquant que Mek2 joue un rôle dans le développement des tissus extra-embryonnaires. Les
données présentées au chapitre 2 suggèrent que l’observation faite sur la prédominance
fonctionnelle de Mek1 lors du développement du placenta est à revoir. En effet, le dosage protéique
semble le seul facteur important dans la survie et le développement des tissus extraembryonnaires.
Si on suit l’hypothèse selon laquelle MEK1 est exprimé deux fois plus que MEK2 dans le
placenta, il est possible de corréler le niveau d’expression des MEK dans le placenta et le phénotype
observé. Les données recueillies suite aux délétions de Mek1 et Mek2 dans différents tissus du
placenta, en utilisant des recombinases Cre s’exprimant dans les péricytes (Dermo1Cre), l’allantoïde
(Sox2Cre) ainsi que dans les syncytiotrophoblastes de type II (Gcm1Cre), montrent qu’une baisse du
niveau des MEK dans ces tissus ne suffit pas à affecter la survie (Nadeau et al. 2014). En effet, le
seuil requis de protéines MEK pour la survie est de 50% (unité arbitraire; Figure 2.5). Ainsi, tant que
les autres tissus du placenta ont un niveau de MEKs supérieur à 50%, le niveau de MEK dans les
182
péricytes, l’allantoïde ou les syncytiotrophoblastes de type II peut être inférieur à 50% sans
empêcher un développement correct du placenta et la survie de l'embryon (Tableau 5.1). Par
exemple,
les
souris
Mek1f/-Mek2+/+Gcm1+/cre,
Mek1f/-Mek2+/+Tg+/Sox2Cre
et
Mek1f/-
Mek2+/+Gcm1+/creTg+/Sox2Cre ont environ 33% des niveaux normaux de MEKs dans les
syncytiotrophoblastes de type II, l’allantoïde, ou les deux, respectivement, alors que dans le reste du
placenta la quantité de MEK est de 66%. Le placenta de ces souris contient peu ou pas de MTGs et
les embryons survivent. Chez les souris Mek1f/f Mek2+/+Tg+/Sox2Cre, la quantité de protéines MEK dans
l’allantoïde est de 33%, alors que dans le reste du placenta ce niveau est à 100%. Ces souris ne
présentent aucune anomalie et survivent (Tableau 5.1). Cependant, chez les individus Mek1+/Mek2+/-, la quantité de protéines MEK dans le placenta est de 50%, ce qui est insuffisant au
développement du placenta et à la survie de l'embryon. Ces données n’excluent pas le fait que dans
un autre type cellulaire, par exemple les syncytiotrophoblastes de type I, le seuil des protéines MEK
puisse descendre en-dessous de 50%. Enfin, les souris Mek1flox/+Mek2-/-Tg+/Sox2Cre survivent
indiquant que dans l’embryon, le niveau minimal de MEK pour permettre la survie est de 17%.
Donc, chez les mammifères les deux kinases MEK1 et MEK2 seraient apparues il y a 400
millions d’années et ont des fonctions redondantes. On peut donc reposer la question : Pourquoi les
mammifères expriment-ils deux isoformes redondantes de MEK ? Ce à quoi on peut maintenant
répondre : À cause du placenta ! Les mammifères se différencient des autres vertébrés par la
présence, chez la majorité d’entre eux, de placenta. De E8.5 à E18.5, le placenta est en croissance
constante afin de favoriser un échange fœto-maternel efficace et de fournir suffisamment de
nutriments pour supporter la croissance de l’embryon. La voie ERK/MAPK est impliquée dans la
prolifération et la différenciation, deux processus cellulaires cruciaux pendant le développement
extraembryonnaire. Il n’est donc pas étonnant que dans ce tissu le seuil de MEK et, par conséquent,
l’activation de ERK soit plus élevée que dans l’embryon. Donc, chez les vertébrés non-mammifères,
l’expression de MEK1 et/ou MEK2 suffit à la survie, mais chez les mammifères, malgré la
redondance fonctionnelle, il est important d'avoir l’expression des deux protéines MEK1 et MEK2 afin
d’assurer d’un seuil adéquat de protéines MEK dans le placenta pour permettre la survie des
embryons.
183
5.4. Rôle de la protéine d’échafaudage MP1 au cours du
développement
La protéine MP1 est la seule protéine d’échafaudage qui a été montrée comme étant un
partenaire de MEK1 mais non de MEK2. Elle permet de localiser MEK1 et ERK1 aux endosomes
tardifs (Figure 5.2). La localisation de composantes de la voie ERK/MAPK dans différents
compartiments cellulaires et le changement dynamique de cette localisation après stimulation permet
de rapprocher la voie des cibles cytoplasmiques et de favoriser la spécificité de la signalisation. La
formation des endosomes est cruciale pour l’activation de fonctions telles que l’apport de nutriments,
le recyclage de protéines membranaires, la migration cellulaire et la signalisation intracellulaire. Les
endosomes précoces, formés principalement de vésicules de clathrine, sont initiés par
l’internalisation des récepteurs tyrosine kinase ou couplés aux protéines G. Après leur détachement
de la membrane plasmique, les endosomes précoces vont soit recycler le récepteur à la membrane
ou soit maturer en endosomes tardifs et migrer vers le lysosome où le récepteur est alors dégradé
(Wortzel et al. 2011). Il a été monté que l’endocytose et les endosomes sont requis pour une
signalisation adéquate via la voie ERK/MAPK (Luttrell et al. 1997). En effet, dans des fibroblastes de
rat, l’inhibition de l’endocytose ou de l’internalisation entraîne une atténuation de l’activation de ERK
après stimulation au LPA (Lysophosphatidic Acid), à la thrombine ou la bombésine. Donc,
l’endocytose des vésicules de clatherine est requise pour une rapide activation des kinases ERK
dans les fibroblastes (Luttrell et al. 1997).
La spécificité de l’activation de la voie ERK/MAPK peut être associée à la durée et la force
de l’activation. Par exemple, il a été montré que dans des cellules de la crête neurale PC12, la
stimulation par EGF entraîne une activation transitoire de la voie ERK/MAPK et cette activation de
courte durée promeut la différenciation cellulaire. Par ailleurs, dans ces mêmes cellules, la
stimulation par le NGF entraîne une activation prolongée de la voie ERK/MAPK et promeut la
différenciation cellulaire (Traverse et al. 1992; Marshall 1995).
Parmi les membres de la voie ERK/MAPK, la protéine MP1 s’associe uniquement à MEK1 et
ERK1 et permet leur ancrage aux endosomes tardifs. Nous avons donc émis l’hypothèse selon
laquelle MP1 pourrait contribuer à la spécificité de l’activation de la voie ERK/MAPK via son
association avec MEK1. Afin d’identifier le rôle du gène Mp1 pendant le développement, nous avons
généré des souris Mp1-/- dont l’analyse a fait l’objet du chapitre 3. Nous avons montré que les souris
Mp1-/- meurent au jour embryonnaire E6.5 indiquant que le gène Mp1 est essentiel pour la survie.
184
Ces données indiquent soit i) que la signalisation ERK/MAPK passant par MP1 est essentielle au
stade post-implantation, et ii) que le rôle de MP1 n’est pas restreint à la signalisation ERK/MAPK.
5.4.1 MP1 et la signalisation ERK/MAPK
Des analyses in vitro ont montré que MP1 lie MEK1 dans sa séquence riche en prolines
(résidus 207 à 307) et que cette liaison favorise la phosphorylation de MEK1 par BRAF et la
phosphorylation de ERK1/2 par MEK1 (Schaeffer et al. 1998). La thréonine 292 permettant le
rétrocontrôle négatif de MEK1 par ERK2 se trouve dans cette région de liaison de MEK1 avec MP1.
On peut donc supposer que l’association de MP1 à MEK1 inhibe le rétrocontrôle par ERK2 et
entraîne une signalisation prolongée de la voie ERK/MAPK. MP1 peut réguler la signalisation
ERK/MAPK passant par MEK1 en agissant sur l’ampleur de l’activation de ERK1/2, en dirigeant la
signalisation vers les cibles cytoplasmiques afin de faciliter l’activation de la voie ERK/MAPK après
internalisation du récepteur. Nous avons montré au chapitre 2 que pour permettre la survie de
l'embryon, une quantité suffisante de MEK, donc d’activation de ERK, est requise. MP1 pourrait jouer
un rôle dans la régulation de l’activation de ERK, en modulant l’intensité et la durée de l’activation. Il
a été montré que l’association entre MP1, MEK1 et ERK1 dépend de la quantité de ERK et de son
état de phosphorylation. À de fortes concentrations de ERK1, MEK1 se lie à ERK1 non phosphorylé
(Schaeffer et al. 1998). On peut donc supposer que la phosphorylation de ERK1 favorise sa liaison
avec MP1-MEK1. Plus on augmente la concentration de ERK1, plus la formation de ce complexe est
favorisée et plus la voie est activée. De plus, l’inhibition de la boucle de rétro-rétrocontrôle de MEK1
via son association avec MP1 accentuerait cette activation.
Nos résultats indiquent que le gène Mp1 est requis pour le développement embryonnaire, et
que son rôle est essentiel après l’implantation. L’analyse de l’activation de ERK chez les mutants
Mp1-/- montre une diminution de l’activation de ERK. Corson et collaborateurs ont monté qu’à E6.5 la
voie ERK/MAPK est activée principalement dans le cône ectoplacentaire et l’ectoderme
extraembryonnaire (Corson et al. 2003) indiquant son rôle dans l’établissement des tissus
extraembryonnaires. On peut donc proposer que chez les embryons Mp1-/-, MP1 n’est plus capable
de lier et de potentialiser l’activation de MEK1 et ERK1 ce qui entraîne une diminution de la
signalisation ERK/MAPK et la mort. La perte de l’expression de Cdx2 chez les embryons Mp1-/indique que la perte du gène Mp1 cause un défaut de l’ectoderme extraembryonnaire et une
diminution de l’activation de la voie ERK/MAPK dans ce tissu. Donc, MP1 serait nécessaire dans
l’ectoderme extraembryonnaire pour permettre l'activation de la voie ERK/MAPK.
185
Figure 5.2 : Module d’activation de la voie ERK/MAPK ainsi que son ancrage à l’endosome tardif.
L’activation de la voie de signalisation ERK/MAPK par différents stimuli mène à l’activation de MEK1
et MEK2 qui phosphorylent à leur tour ERK1/2, qui migrent alors au noyau et activent la transcription
de plusieurs gènes impliqués dans la différenciation, la prolifération et la survie cellulaire. La liaison
de MEK1 avec MP1, ERK1, p14 et p18 permet l’activation de la voie des endosomes tardifs causant
la régulation du trafic des endosomes.
186
187
La liaison de MP1 avec MEK2 n’a jamais été montrée. Cependant, il est connu que la quantité de
protéines joue un rôle important dans l’association avec des protéines d’échafaudage. Nous avons
montré que l’expression de MEK2 est deux fois moins importante que celle de MEK1 dans le
placenta, et cette observation a aussi été faite dans des fibroblastes de souris (Catalanotti et al.
2009), (Catalanotti et al. 2009). Donc il serait possible que MP1 se lie aussi avec MEK2 mais que
son partenaire privilégié soit MEK1 compte tenu de son abondance. L’association MP1-MEK2 n'a
tout simplement pas été détectée dans les essais précédents. Une observation qui appuie cette
hypothèse est celle de la mortalité à E6.5 des embryons Mek1-/- Mek2-/-. Chez ces embryons, comme
chez les mutants Mp1-/-, l’activation de la voie ERK/MAPK serait diminuée et empêcherait la
poursuite du développement après l’implantation. Une analyse comparative des mutants Mp1-/- et
Mek1-/- Mek2-/- permettra de répondre à cette question. De plus, une immunoprécipitation de MEK2
dans des MEFs Mek1-/- pourrait révéler si MP1 est capable de s’associer à MEK2.
5.4.2 MP1 et la signalisation mTORC1
MP1
est
une
petite
protéine
d’échafaudage
aussi
appelée
LAMTOR3
(late
endosomal/lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator). Elle est ancrée aux endosomes tardifs
grâce à deux protéines adaptatrices, p18 et p14 (LAMTOR1 et LAMTOR2, respectivement). Avec les
protéines C7orf59 et HBXIP (LAMTOR4 et LAMTO5, respectivement), elles forment un complexe
appelé Ragulator. Le complexe Ragulator (LAMTOR1 à 5) recrute les GTPases Rag (Ras-related
GTP-binding protein) RagA/B-RagC/D aux endosomes tardifs et permet l’activation de la voie de
signalisation mTORC1 (Figure 5.3) (Bar-Peled et al. 2012). En effet, il a été montré que dans les
cellules où l’expression de p18, p14 ou Mp1 est atténuée, via des siARN, les GTPases RAG et
mTORC1 ne sont plus présentes aux endosomes tardifs et la voie de signalisation mTORC1 est
inactive (Sancak et al. 2010). Ainsi, MP1 permettrait le recrutement des voies ERK/MAPK et
mTORC1 aux endosomes tardifs (Nada et al. 2014).
La voie de signalisation mTOR est associée à la réponse aux nutriments. La signalisation
mTORC1 est constituée de plusieurs composants ; mTOR, raptor, deptor et mLST8. Ce complexe
est activé par différents stimuli : les facteurs de croissance, le niveau d’acides aminés dans la cellule
ainsi que le glucose. L'activation de la voie mTORC1 mène à la régulation de facteurs impliqués dans
la croissance cellulaire et l’autophagie (Figure 5.4). De manière intéressante, l’invalidation du gène
mTOR chez la souris entraîne une mortalité embryonnaire à E6.5. Le gène mTOR est nécessaire
188
pour la prolifération des cellules ES et des trophoblastes in vitro. En effet, lorsque les embryons
mTOR-/- sont mis en culture, ils ne peuvent proliférer (Gangloff et al. 2004; Murakami et al. 2004).
L’invalidation du gène raptor cause le même phénotype que celui des mutants mTOR, soit une
mortalité à E6.5 et un défaut de prolifération des CMI et des trophoblastes en culture (Guertin et al.
2006). Donc, la mortalité des mutants Mp1-/- pourrait être associée à un défaut de signalisation
mTORC1. Afin de poursuivre la caractérisation des mutants Mp1-/-, l’activation de la voie mTORC1,
via le marquage de ses effecteurs S6K1 et 4EBP1, devra être analysée.
L’endoderme viscéral, au début de la gastrulation (à partir de E5.5), joue un rôle de barrière
entre l’environnement maternel et l’embryon. Il agit comme un échangeur de nutriments entre la
mère et l’embryon, rôle qui est par la suite pris en charge par le placenta (Bielinska et al. 1999)
Sachant que MP1 fait partie d’un complexe associé aux endosomes tardifs et que l’inactivation de
son partenaire p18 entraîne un défaut de trafic de nutriments de l’endoderme viscéral vers l’épiblaste
(Nada et al. 2009), il serait intéressant de caractériser le trafic vésiculaire dans les endosomes tardifs
des mutants Mp1-/- afin de voir si la mortalité des embryons Mp1-/- est associée à ce défaut.
Les données préliminaires obtenues des études in vitro de la prolifération des CMI et des
trophoblastes chez les embryons Mp1-/- n’indiquent aucune différence comparativement aux
embryons Mp1+/+. Les CMI et les cellules trophoblastiques des embryons Mp1-/- sont donc capables
de proliférer. Cependant chez les embryons Mp1-/-, peu de cellules OCT4+ sont détectées par
immunofluorescence après cinq jours de culture de blastocystes Mp1-/-. L’utilisation de marqueurs de
l’endoderme primitif (tel que GATA6) par immunofluorescence après cinq jours de culture permettra
d’analyser la différenciation des CMI en comparant le nombre de cellules Oct4 + (pluripotentes) au
nombre de cellules GATA6+ (endoderme primitif). Il a été montré qu’une culture de blastocystes
pendant neuf jours reproduit in vitro la différenciation de l’endoderme viscéral (Morris et al. 2002).
Une culture des blastocystes Mp1-/- pendant neuf jours permettrait de répondre à l’hypothèse selon
laquelle la mortalité des embryons Mp1-/- est due à des défauts de l’endoderme viscéral.
5.5 Modèle animal pour le syndrome cardio-facio-cutané avec la
mutation Mek1Y130C
La voie de signalisation ERK/MAPK est essentielle à la survie et sa régulation garantit une
homéostasie cellulaire. Les Rasopathies correspondent à un groupe de syndromes génétiques
causés par des mutations germinales dans des gènes impliqués dans la voie ERK/MAPK. Ces
189
Figure 5.3 : Recrutement des voies de signalisation ERK/MAPK et mTORC1 aux endosomes tardifs.
Les protéines p18, p14, MP1, C7orf59 et HBXIP font partie d’un complexe appelé Ragulator
permettant de recruter aux endosomes tardifs la voie de signlisation ERK/MAPK via la liaison avec
MEK1 et ERK1 ainsi que la voie de signalisation mTORC1 via la liaison avec les GTPases RagA/BRagC/D.
190
191
Figure 5.4 : Signalisation mTORC1
La voie de signalisation mTORC1 est activée par plusieurs stimuli dont les facteurs de croissance, le
glucose ou les acides aminés. Le complexe est constitué des protéines mTOR, raptor, deptor et
mLST8. Son activation va mener à la régulation de facteurs tels que S6K1 et 4EBP1 impliqués dans
la croissance cellulaire et l’autophagie.
192
193
syndromes partagent plusieurs caractéristiques phénotypiques. Le syndrome cardio-facio-cutané
(CFC) fait partie de la famille des Rasopathies. Les patients CFC présentent des défauts cardiaques,
une dysmorphie faciale, des défauts épidermiques, un retard de développement et enfin des défauts
neurologiques. Il est suggéré que les défauts observés chez les patients sont la conséquence d’une
mutation ponctuelle dominante du gène BRAF, dans 75% des cas, et des gènes MEK1 et MEK2,
dans 25% des cas. L’analyse in vitro de la fonction biochimique de ces protéines mutées, à l’aide
d’essais de surexpression de ces protéines, a permis aux chercheurs de suggérer que ces mutations
causent une hyper-activation de la voie ERK/MAPK (Rodriguez-Viciana et al. 2006; RodriguezViciana et al. 2008). À ce jour, aucun modèle animal pour le CFC portant une mutation dans Mek1
n’avait été généré. Un des objectifs de cette thèse était de produire un modèle animal pour le
syndrome CFC portant la mutation Mek1Y130C et d’identifier les répercussions de cette mutation in
vivo. Pour cela, nous avons généré et analysé une lignée de souris Mek1Y130C.
La caractérisation de la lignée Mek1Y130C indique la présence d’une duplication. L’analyse de
la séquence génomique des souris Mek1Y130C/- nous a permis de montrer que les séquences
régulatrices de Mek1 ainsi que les exons 1 à 5 sont dupliqués en amont du gène Mek1. La mutation
permettant l’expression de la protéine MEK1Y130C est une mutation ponctuelle située dans l’exon 3.
L’analyse des transcrits Mek1 par q-RT-PCR indique que les transcrits de type sauvage et muté sont
produits chez les individus Mek1Y130C/-. Ainsi, la duplication pourrait, étant proche de l’allèle Mek1,
permettre la production par épissage alternatif, tantôt d’un ARNm avec l’exon 3 muté, tantôt d’un
ARNm avec l’exon 3 de type sauvage. Ces différences ne seraient pas visibles par western blot car
nous utilisons un anticorps qui n’est pas spécifique à la protéine MEK1 Y130C. Ainsi l’allèle Mek1Y130C
chez les individus Mek1Y130C/-, produit 50% de protéine MEK1. Parmi ce 50%, une proportion
correspondrait à MEK1+ et l’autre proportion correspond à MEK1Y130C. Les souris Mek1+/- ne
présentent pas de phénotypes et les patients CFC possèdent la mutation MEK1Y130C à l’état
hétérozygote. Nos souris constituent donc un bon modèle animal pour l’analyse du syndrome CFC.
Les souris Mek1+/Y130C, Mek1Y130C/- et Mek1Y130C/Y130C présentent des phénotypes similaires à
ceux observés chez les patients CFC, tels qu’une sténose pulmonaire, des anomalies faciales et des
défauts neurologiques. L’analyse biochimique de l’allèle Mek1Y130C, à l’aide de MEFs Mek1Y130C/-, a
permis de montrer que cette mutation n’engendre pas une sur-activation de la voie ERK/MAPK.
Cette observation va à l’encontre de certaines données de la littérature qui montrent dans des études
de surexpression de protéines mutantes in vitro, que la mutation Y130C entraine une sur-activation
194
de la voie ERK/MAPK (Rodriguez-Viciana et al. 2006; Rodriguez-Viciana et al. 2008). La différence
entre les observations que nous avons faites et celles des autres groupes peut être expliquée par le
type d’expériences effectuées. En effet, contrairement aux analyses de Rodriguez-Viciana, nous ne
sommes pas dans un contexte de surexpression d’une protéine MEK Y130C tagguée dans des cellules
HEK293T mais dans un contexte de fibroblastes de souris exprimant la protéine MEK1 Y130C de
manière endogène. De plus, les études sur les modèles animaux pour le CFC portant une mutation
BrafQ241R ne montrent pas non plus une augmentation de l’activation de ERK chez la souris. Par
contre, ces études montrent que l’administration d’inhibiteurs de MEK suffit à récupérer totalement ou
en partie le phénotype causé par la mutation (Inoue et al. 2014). Ces données suggèrent que
l’activation accrue de la voie ERK/MAPK n’est pas détectable par notre technique ou bien qu’à défaut
de causer une augmentation de l’activation de la voie, la mutation Y130C dérégule la signalisation
ERK/MAPK. Ainsi, il serait intéressant d’administrer un inhibiteur de MEK chez une femelle gestante
et d’analyser les embryons Mek1Y130C/- au jour E13.5 afin de définir si cela a un effet sur la sténose
pulmonaire. En établissant des MEFs de ces souris, nous pourrons aussi analyser in vitro l’activation
de la voie à l’état basal et après stimulation par 20% de FBS ou avec 2ng/µl de EGF.
L’analyse neurologique des souris portant la mutation Mek1Y130C devra être poursuivie car les
patients CFC présentent plusieurs atteintes neurologiques dont la gravité varie selon les patients,
allant d’un retard mental léger jusqu’aux convulsions présentes dans peu de cas seulement (Pierpont
et al. 2014). Chez les souris Mek1Y130C/- et Mek1Y130C/Y130C, aucune convulsion n’a été observée. Mais
nous avons détecté une augmentation des astrocystes positifs pour GFAP, signe de la présence
d’anomalies neurologiques. Il serait donc nécessaire d’effectuer des tests de comportement afin
d’établir si l’attention, la mémorisation ou l’apprentissage sont affectés chez ces souris.
Les substitutions nucléotidiques constituent 70% des mutations associées à des maladies
génétiques (Krawczak et al. 1998; Hanna et al. 2005). Les souris Mek1Y130C possèdent une mutation
faux-sens qui correspond à une transversion de deux bases puriques (A>G) entraînant la substitution
de la tyrosine 130 en une cystéine. La présence de phénotypes variés chez les patients CFC et
l’analyse des phénotypes de nos souris nous amènent à poser la question du rôle de la tyrosine 130
de MEK1. La majorité des mutations du gène MEK1 associées au CFC sont retrouvées dans les
exons 2 et 3 indiquant que cette région de MEK1 correspond à un « hot spot » de mutations. La
majorité des résidus mutés sont dans le domaine catalytique de MEK1 indiquant son importance
dans le mécanisme contrôlant l’activité de MEK1. La tyrosine 130 est le résidu retrouvé le plus
195
souvent muté chez les patients CFC. Ces mutations correspondent à une substitution en cystéine
(Y130C), asparagine (Y130N) ou histidine (Y130H) (Dentici et al. 2009). Pour ce qui est de la
mutation Y130C, il est intéressant de noter qu’un acide aminé phosphorylable (Y) est remplacé par
un acide aminé non phosphorylable (C). À ce jour, aucune évidence n’a montré que la tyrosine Y130
de MEK1 est phosphorylée. Le résidu Y130 se trouve entre le site de liaison à ERK et la boucle
d’activation de MEK1. C’est un acide aminé avec une chaîne latérale aromatique et encombrante. Sa
substitution en cystéine qui est un résidu peu encombrant et capable de former des ponts disulfures
pourrait perturber la structure tertiaire de MEK1. En effet, la présence de la cystéine à cette position
pourrait affecter positivement ou négativement l’association avec ERK à son site de liaison ainsi que
l’accessibilité des sérines 218 et 222 phosphorylables par RAF. Ce changement de conformation
pourrait perturber les fonctions de MEK1 et entraîner les défauts observés après la substitution
Y130C de MEK1.
Cependant une question reste en suspend. Pourquoi cette mutation n’affecte principalement
que certains organes tels que le cœur, le cerveau, le squelette et la peau ? Il a été montré que chez
les mammifères, les cardiomyocytes ventriculaires sont des cellules différenciées qui perdent leur
capacité mitotique peu après la naissance. Cependant, en réponse à une surcharge contractile in
vivo, les cardiomyocytes s’adaptent en s’hypertrophiant. Ce processus contribue de manière
considérable à l’hypertrophie cardiaque observée dans certaines pathologies telles que les
Rasopathies (Chien et al. 1991). Cette hypertrophie est accompagnée par la re-expression de gènes
normalement exprimés dans le ventricule fœtal tel que ANF (atrial natriuretic factor) et βMHC (betamyosin heavy chain) (Chien et al. 1991). Un groupe de recherche a montré dans des cardiomyocytes
que l’activation constitutive de MEK1 est associée à l’augmentation de l’expression de certains gènes
comme ANF et βMHC associés à la réponse à l’hypertrophie (Gillespie-Brown et al. 1995).
L’hypertrophie étant l'un des phénotypes des Rasopathies, elle pourrait s’expliquer par une reactivation ou une activation constante des gènes fœtaux des cardiomyocytes entraînant les défauts
cardiaques observés chez les individus atteints de Rasopathies. Il serait donc intéressant de
regarder l’expression de ces gènes par qPCR chez nos souris qui présentent des anomalies de
l’artère pulmonaire.
La voie ERK/MAPK a été impliquée dans la formation de la mémoire (Atkins et al. 1998).
L’astrogliose est souvent associée à plusieurs défauts du système nerveux central tels un
traumatisme, des convulsions, une inflammation ou une maladie neurodégénérative. Elle correspond
196
à une augmentation de l’activité des astrocytes et est marquée par une expression accrue de la
GFAP. Il a été montré chez l’humain et la souris que l’activation des astrocystes coïncide avec une
sur-activation de la voie ERK/MAPK (Mandell et al. 1999; Mandell et al. 2001; Carbonell et al. 2003).
Il a aussi été montré que la voie ERK/MAPK est importante pour la gliogenèse. En effet, Li et
collaborateurs ont révélé, via l’inhibition de l’expression des kinases MEK1/2 ou par surexpression,
que le niveau d’activation des kinases MEK régule la gliogenèse dans le cortex en développement (Li
et al. 2012). Il n’est donc pas étonnant que dans les Rasopathies la dérégulation de la voie soit
associée à des retards mentaux, des défauts d’apprentissage et dans certains cas des crises
épileptiques. Compte tenu de l’association de la suractivation de la voie ERK/MAPK dans le cœur et
le cerveau à des défauts observés dans les Rasopathies, il est cohérent que l’hypothèse émise pour
expliquer les phénotypes des Rasopathies soit basée sur la suractivation de la voie ERK/MAPK.
Le syndrome CFC est un syndrome rare et très peu de cas sont répertoriés (environ 300 cas
dans le monde). La similarité des symptômes du CFC avec les autres syndromes de la famille des
Rasopathies rend son diagnostic difficile. Un nouveau patient a récemment été répertorié avec une
nouvelle mutation dans le gène MEK1, MEK1E102G, mais celui-ci a été diagnostiqué avec le syndrome
de Noonan avec lentigines multiples (qui correspondent à des tâches cutanées pigmentées
localisées sur tout le corps) aussi appelé syndrome LEOPARD. Ce patient présente un retard de
croissance, des lentigines multiples, des défauts d’audition et une puberté précoce. Par contre, il ne
présente pas d’anomalies cardiaques congénitales, de retard mental, ni d’anomalies faciales, tel
qu'observés chez les patients CFC (Nishi et al. 2015). Les lentigines multiples, la puberté précoce et
le défaut d’audition sont les caractéristiques qui ont permis au diagnostic différentiel d’associer cette
mutation et ce patient au syndrome LEOPARD. C’est le premier cas avec une mutation dans le gène
MEK1 qui correspond au syndrome LEOPARD. Le gène principalement associé à ce syndrome est
PTPN11 qui encode pour la protéine SHP2 impliquée dans l’activation de la voie ERK/MAPK. Les
mutations les plus communes affectent le domaine catalytique de PTPN11 et entrainent une perte de
fonction de la protéine (Kontaridis et al. 2006). On peut donc suggérer que la mutation MEK1E102G
serait une mutation de perte de fonction.
Les Rasopathies sont une vaste classe de maladies dont la caractérisation est récente. Ces
données suggèrent que les syndromes au sein des Rasopathies ne devraient pas être classés
seulement selon le gène muté mais aussi selon le type de mutation (gain ou perte de fonction). La
197
génération de modèles animaux nous permet de mieux caractériser ces mutations et leur association
aux phénotypes pour une meilleure compréhension de mécanismes complexes.
5.6 Conclusion générale
Bien que les kinases MEK1 et MEK2 aient été mises en évidence depuis le début des
années 1990 et qu’elles soient étudiées de manière approfondie, tous ne s’accordent pas sur la
redondance fonctionnelle entre ces deux kinases. Nous avons généré une lignée de souris exprimant
l’ADNc de Mek2 au locus de Mek1 pour étudier la redondance entre ces deux kinases. Le travail
présenté dans cette thèse a permis de faire la démonstration génétique et d'établir clairement que les
kinases MEK1 et MEK2 sont redondantes. Nous avons aussi mis en évidence que, dans le placenta,
le niveau protéique des kinases MEK1 et MEK2 n’est pas identique ; MEK1 est exprimé deux fois
plus que MEK2. Finalement, nous avons démontré pour la première fois que le développement du
placenta est dépendant de la quantité de protéines MEK qui y ait exprimée.
Nous nous sommes aussi intéressées à la protéine d’échafaudage MP1, partenaire
spécifique de MEK1. Nos données préliminaires sur la caractérisation des souris invalidées pour le
gène Mp1 ont permis de montrer que ce gène est essentiel pour le développement et que MP1 est
requis pour les stades suivant l'implantation. La mortalité précoce des embryons mutants ainsi que
l’existence d’autres partenaires de MP1 suggèrent que les fonctions de MP1 seraient plus larges que
celles associées uniquement à MEK1.
Enfin, nous avons généré, pour la première fois, un modèle animal pour le syndrome CFC.
Cette lignée récapitule, en partie, les phénotypes des patients atteints de ce syndrome. Malgré la
présence d’une duplication, cette lignée peut être utilisée pour une étude plus approfondie de la
sténose pulmonaire ainsi que des anomalies faciales et neurologiques observée chez les patients.
198
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218
Annexe I: Lung development requires an active
ERK/MAPK pathway in the lung mesenchyme
Olivier Boucherat1,3,#, Kim Landry-Truchon1,#, Rifdat Aoidi1, Nicolas Houde1, Valérie Nadeau1,3, Jean
Charron1,2,* and Lucie Jeannotte1,2,*
1Centre
de recherche sur le cancer de l’Université Laval, CRCHUQ, L’Hôtel-Dieu de Québec, QC, Canada
G1R 3S3
2Department
of Molecular Biology, Medical Biochemistry and Pathology, Université Laval, Québec, Canada
G1V 0A6
3Present
#Both
*
address: CRIUCPQ, Québec, Canada G1V 4G5
authors contribute equally to this work.
Corresponding authors: Lucie Jeannotte & Jean Charron
Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval
CRCHU de Québec, L’Hôtel-Dieu de Québec
9, rue McMahon
Québec, QC
Canada G1R 3S3
Phone: (418) 681-5281
Fax:
(418) 691-5439
e-mail:[email protected]
[email protected]
(Article publié en 2016 dans Developmental Dynamics)
219
220
I.1 Avant-propos
La voie de signalisation ERK/MAPK comprend deux MAPK kinases, Mek1 et Mek2. Afin
d’établir leur rôle dans le développement pulmonaire, l’inactivation du gène Mek1 a été effectuée
dans le mésenchyme à l’aide de la Dermo1Cre, dans un contexte Mek2-/-. Les souris Mek1flox/flox Mek2/-
Dermo1Cre présentent une cyphose, un omphalocèle, des défauts de la trachée et une hypoplasie
pulmonaire entraînant la mort. Afin de mettre en lumière le rôle de la voie ERK/MAPK dans le
développement pulmonaire, les gènes Mek ont été inactivés dans le mésenchyme pulmonaire à
l’aide de la Tbx4Cre. Les souris Mek1flox/flox Mek2-/- Tbx4Cre présentent des défauts de la trachée et une
hypoplasie pulmonaire qui entraîne la mort. Ces données indiquent que la voie de signlisation
ERK/MAPK dans le mésenchyme est essentielle pour le développement pulmonaire et trachéal.
Les données de ce projet de recherche sont issues principalement du travail d’Olivier
Boucherat et de Kim Landry-Truchon durant leur stage post-doctoral et maîtrise, respectivement,
dans le laboratoire de la Dre Lucie Jennotte. Ils ont effectué l’ensemble des travaux qui ont permis de
récolter la majorité des données présentées dans ce chapitre. Olivier Boucherat a effectué les
immunohistochimies des figures I.3 et I.5, la coloration des trachées au Bleu-d’Alcian (figure I.3) et la
caractérisation de la Tbx4Cre dans le poumon (Figure I.1). Kim Landry-Truchon a effectué les
immunohistochimies (Figure I.4), les expériences de qPCR (Figure I.6) et les expériences de
révisions de l’article. Nicolas Houde a effectué les extractions d’ARN. Enfin, Valérie Nadeau a
effectué lors de son doctorat dans le laboratoire du Dr Jean Charron la caractérisation de la Tbx4Cre
dans le placenta et le génotypage des individus d’intérêts (Figure I.1).
Pour ma part, j’ai contribué au génotypage de certains spécimens de l’étude. J’ai aussi
effectué les immunofluorescences pERK ainsi que les décomptes du marquage (Figure I.6).
La rédaction finale du manuscrit a été effectuée par le Dr Jean Charron et la Dre Lucie
Jeannotte.
221
222
I.2 Résumé
Contexte : La communication réciproque entre le mésenchyme et l’épithélium est critique tout au
long du développement pulmonaire. Elle dicte la morphogenèse de la ramification et la spécification
cellulaire. Plusieurs molécules de signalisations sont impliquées dans ces interactions. Comment la
communication entre l’épithélium et le mésenchyme est coordonnée reste peu clair. La voie
ERK/MAPK est impliquée dans la transduction de signaux important dans la formation du poumon.
L’inactivation épithéliale des gènes Mek1 et Mek2, codant pour les kinases de la voie ERK/MAPK,
cause une agénésie pulmonaire et la mort. Inversement, la mutation des gènes Mek dans le
mésenchyme cause une hypoplasie pulmonaire, une malformation du cartilage de la trachée, une
cyphose, un omphalocele et la mort. Considérant l’impact négatif de la cyphose et de l’omphalocèle
sur l’espace intra thoracique et donc sur la croissance du poumon, le rôle exacte de la voie
ERK/MAPK dans le mésenchyme pulmonaire reste non résolu.
Résultats : Afin de connaître le rôle de la signalisation ERK/MAPK dans le mésenchyme pulmonaire
en absence de la cyphose et de l’omphalocèle, nous avons utilisé la lignée Tbx4Cre qui exprime la
Cre recombinase spécifiquement dans le mésenchyme pulmonaire. Les mutants Mek ne
développement pas de cyphose ni d’omphalocèle mais ils présentent une hypoplasie pulmonaire,
des anomalies trachéales et une mortalité néo-natale. Les anomalies du cartilage de la trachée
suggèrent un rôle de la signalisation ERK /MAPK dans le contrôle de l’hypertrophie des
chondrocytes. De plus, les données sur l’expression de gènes indiquent une potentielle interaction
entre la voie ERK/MAPK et la voie Wnt canonique pendant la formation du poumon.
Conclusion : Le développement du poumon nécessite une signalisation ERK/MAPK fonctionnelle
dans le mésenchyme pulmonaire dans le but de coordonner efficacement les interactions entre
l’épithélium et le mésenchyme.
223
224
I.3 Abstract
Background: Reciprocal epithelial-mesenchymal communications are critical throughout lung
development, dictating branching morphogenesis and cell specification. Numerous signaling
molecules are involved in these interactions but how epithelial-mesenchymal crosstalk is coordinated
remains unclear. The ERK/MAPK pathway transduces several important signals in lung formation.
Epithelial inactivation of both Mek genes, encoding ERK/MAPK kinases, causes lung agenesis and
death. Conversely, Mek mutation in mesenchyme results in lung hypoplasia, trachea cartilage
malformations, kyphosis, omphalocele and death. Considering the negative impact of kyphosis and
omphalocele on intrathoracic space and consequently on lung growth, the exact role of ERK/MAPK
pathway in lung mesenchyme stays unresolved.
Results: To address the role of the ERK/MAPK pathway in lung mesenchyme in absence of
kyphosis and omphalocele, we used the Tbx4Cre deleter mouse line, which acts specifically in lung
mesenchyme. These Mek mutants did not develop kyphosis and omphalocele but they presented
lung hypoplasia, tracheal defects and neonatal death. Tracheal cartilage anomalies suggested a role
for the ERK/MAPK pathway in the control of chondrocyte hypertrophy. Moreover, expression data
indicated potential interactions between the ERK/MAPK and canonical Wnt pathways during lung
formation.
Conclusion: Lung development necessitates a functional ERK/MAPK pathway in the lung
mesenchymal layer in order to coordinate efficient epithelial-mesenchymal interactions.
225
226
I.4 Introduction
Reciprocal communications between epithelium and mesenchyme are primordial for development.
In the respiratory tract, classical grafting experiments show that the mesenchymal layers of the
trachea and lung have different inductive capacities, which define two distinct morphogenetic fields.
Distal lung mesenchyme apposed to tracheal epithelium causes ectopic budding with distal epithelial
cell marker expression. In contrast, graft of tracheal mesenchyme to distal lung epithelium inhibits
branching and induces the differentiation of ciliated and mucus-producing cells, which are not
normally seen in the distal lung (Alescio & Cassini, 1962; Shannon et al., 1998). Epithelialmesenchymal crosstalk thus governs bud outgrowth, airway branching and cell fate determination. As
a consequence, perturbations in signaling pathways mediating tissue interactions can impair
pulmonary functions and cause diseases (Chao et al., 2015).
Despite accumulated evidence showing that mesenchymal cells can instruct the epithelial
phenotype, the exact nature of epithelial-mesenchymal interactions still remains an issue. Many
soluble factors important for lung development are involved in epithelial-mesenchymal crosstalk.
Several of them traffick via the ERK/MAPK pathway, including members of the fibroblast growth
factor (FGF) family, the platelet-derived growth factor A (PDGFA), the epidermal growth factor (EGF)
and the insulin-like growth factor 1 (IGF1) (Morrisey & Hogan, 2010; Warburton et al., 2010). The
ERK/MAPK pathway is a network of protein kinases that connects extracellular signals to intracellular
targets. In mammals, this pathway involves the mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinases
MEK1 and MEK2, two dual specificity kinases. MEK1 and MEK2 activate the extracellular signalregulated kinases ERK1 and ERK2 by phosphorylation upon ligand binding to their respective
receptor (Crews et al., 1992). Activated ERKs phosphorylate numerous intracellular substrates
located in different cell compartments (Wortzel & Seger, 2011). ERK/MAPK pathway activation is
crucial for embryo development since it elicits various physiological outputs including growth,
differentiation, survival, migration and morphogenesis (Pearson et al., 2001; Sun et al., 2015). In
mice, the loss of Mek1 function causes placental defects and embryonic death whereas Mek2 mutant
mice do not present overt phenotype (Giroux et al., 1999; Bélanger et al., 2003). We recently showed
that the MEK1 and MEK2 proteins are functionally redundant and that differences between the Mek1
and Mek2 mutant phenotypes are due to a protein threshold effect (Aoidi et al., 2016).
To circumvent the embryonic lethality of Mek1 null mutants and to establish the contribution of the
ERK/MAPK pathway to lung development, the conditional deletion of Mek1 was performed in the lung
227
epithelium using the ShhCre deleter mouse in a Mek2 null background (Boucherat et al., 2014). Lack
of all four Mek alleles in lung epithelium results in lung agenesis, a phenotype resembling that of
Fgf10 and Fgfr2b mutants (Min et al., 1998; Sekine et al., 1999; De Moerlooze et al., 2000). This
demonstrates the necessity of a functional ERK/MAPK pathway to transduce FGF10 signal in the
lung epithelium. The mesenchyme-specific loss of Mek gene function with the Dermo1Cre deleter
mouse, which acts in the mesenchymal component of several organs including the lung, results in
multiple phenotypes. These include intrauterine growth restriction, giant omphalocele, kyphosis, lung
hypoplasia, altered trachea patterning, and death at birth (Boucherat et al., 2014). Lung hypoplasia is
accompanied with decreased mesenchymal cell proliferation, increased apoptosis, and reduced
branching. Gene expression profiling in mutant lungs revealed a downregulation of genes involved in
cell proliferation, an upregulation of genes associated with cell death, and a deregulation of genes
implicated in lung development, concurring with the lung phenotype observed. However, the
defective branching and diminished cell proliferation phenotypes detected in vivo were rescued in
lung explant cultures raising the possiblity that the lung has the capacity to correctly develop in vitro
in absence of Mek function in lung mesenchyme. This also suggests the implication of kyphosis and
omphalocele in the lung phenotype as these two malformations can reduce intrathoracic space, a
constraint that can perturb lung growth (McMaster et al., 2007; Kamata et al., 2008; Danzer et al.,
2012).
To directly assess the role of the ERK/MAPK pathway in lung mesenchyme in the absence of
kyphosis and omphalocele, we used the Tbx4Cre deleter mouse line, which specifically directs Cre
activity in lung, limb and genital mesenchyme, to delete Mek1 gene function (Luria et al., 2008;
Naiche et al., 2011). Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants did not develop omphalocele and abnormal
axial skeleton. Nevertheless, they died at birth from respiratory distress due to lung hypoplasia. Thus,
the ERK/MAPK pathway integrates signals in the lung mesenchyme that are essential for lung growth
and embryo survival.
228
I.5 Result
I.5.1 Tbx4Cre-directed Mek1 mesenchymal inactivation in a Mek2 null
background causes neonatal death
The Tbx4+/Cre mouse was generated by inserting the Cre recombinase gene into the 3' UTR of the
Tbx4 gene. It does not disrupt the Tbx4 gene, which remains expressed (Luria et al., 2008). We
compared Cre activity in the Dermo1+/Cre and Tbx4+/Cre mouse lines using the R26mT/mG reporter
mouse that carries the mTmG gene coding for the membrane-targeted tandem dimer Tomato
fluorescent protein (mT) prior to Cre-mediated recombination and the membrane-targeted green
fluorescent protein (mG) after excision. The Tbx4Cre allele had a more restricted range of actions than
the Dermo1Cre allele, specifically deleting in the mesenchymal component of the respiratory tract and
not in the surrounding tissues (Fig. I.1A-D; Naiche et al., 2011). The Mek1 mesenchymal deletion
with the Tbx4Cre allele in a Mek2 null background resulted in the death of Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre
mutants. Out of 57 mice produced, only one Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant survived up to
weaning, but was sacrificed due to its small size and health problems (Table I.1). The other
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre pups died at birth or shortly after. As predicted, Mek1flox/flox;Mek2-/;Tbx4+/Cre mutants did not develop omphalocele and kyphosis. However, they were smaller. They also
presented a hindlimb deformity, a phenotype coherent with Tbx4 expression and lineage analyses,
thus confirming the role of the ERK/MAPK pathway in hindlimb formation (Fig. I.2A-B; Chapman et
al., 1996; Naiche et al., 2011; Boucherat et al., 2014). Analysis of embryonic (E) day 18.5
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants revealed a decreased body weight of ~15% versus controls (Fig.
I.2C). This decrease was less dramatic than the 38% reduction reported for Mek1flox/flox;Mek2-/;Dermo1+/Cre mutant embryos, which caused intrauterine growth restriction associated with placental
underdevelopment (Boucherat et al., 2014). Comparison of the Tbx4Cre and Dermo1Cre
recombinase activities in the placenta showed that both alleles targeted recombination in the
pericytes (Fig. I.1E-J). However, this action was less efficient with the Tbx4Cre recombinase.
Consequently, no placental defects were observed in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants. This
might explain the less severe growth deficit in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants. Moreover, a more
broader spectrum of action of the Dermo1Cre allele in organs and tissues likely contributed to the
aggravated growth problems observed in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre mutants.
229
Table I.1. Ratios of genotypes in litters from crosses between Mek1;Mek2;Tbx4+/Cre and
Mek1;Mek2 mice
Mek1+/flox;Mek2+/-;Tbx4+/Cre x Mek1flox/flox;Mek2-/Tbx4+/+
Age
# of # of Mek1+/flox
litters pups Mek2+/-
Expected
(%)
Mek1+/flox
Tbx4+/Cre
Mek1flox/flox Mek1+/flox Mek1+/flox Mek1flox/flox Mek1flox/flox
Mek2+/- Mek2-/Mek2+/Mek2-/Mek2-/-
Mek2-/-
Mek1flox/flox
Mek2+/-
(12.5)
(12.5)
(12.5)
(12.5)
(12.5)
(12.5)
(12.5)
(12.5)
E14.5
1
12
1 (8)
2 (17)
2 (17)
0 (0)
3 (25)
1 (8)
2 (17)
1 (8)
E18.5
1
12
1 (8)
0 (0)
1 (8)
1 (8)
3 (25)
4 (33)
1 (8)
1 (8)
D21
9
57
7 (12)
12 (21)
4 (7)
8 (14)
6 (11) 11 (19)
8 (14)
1 (2)
Mek1flox/flox;Mek2+/-;Tbx4+/Cre x Mek1flox/flox;Mek2-/Tbx4+/+
Age
Tbx4+/Cre
# of # of
Mek1flox/flox;Mek2+/- Mek1flox/flox;Mek2-/- Mek1flox/flox;Mek2+/- Mek1flox/flox;Mek2-/litters pups
Expected
(%)
(25)
(25)
(25)
(25)
E14.5
1
7
3 (43)
1 (14)
1 (14)
2 (29)
E18.5
2
14
3 (21)
3 (21)
5 (36)
3 (21)
Mek1+/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre x Mek1flox/flox;Mek2-/Tbx4+/+
Age
# of # of
litters pups
Expected
(%)
Mek1+/flox;Mek2-/-
Tbx4+/Cre
Mek1flox/flox;Mek2-/- Mek1+/flox;Mek2-/- Mek1flox/flox;Mek2-/-
(25)
(25)
(25)
(25)
E14.5
1
4
1 (25)
0 (0)
1 (25)
2 (50)
E18.5
5
28
9 (32)
5 (18)
6 (21)
8 (29)
Percentages are indicated in parentheses.
230
I.5.2 Tracheal cartilage defects in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants
In Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre embryos, the tracheal cartilage did not form causing the
flaccidity of the trachea (Boucherat et al., 2014). In Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre embryos, the tracheal
cartilage was present but the trachea was narrower with thin cartilage rings that showed less Alcian
blue staining when compared to control specimens (Fig. I.3A-B). One likely explanation for the
difference in the tracheal phenotype could be the weaker activity of the Tbx4Cre recombinase, versus
the Dermo1Cre recombinase, in the developing trachea as shown by the less intense EGFP signal in
Tbx4+/Cre specimens (Fig. I.1B, D). In agreement with this observation, MEK1 immunostaining
revealed residual expression of MEK1 in both mesenchyme and cartilage (Fig. I.3C-D).
The epithelial expression of the transcription factor sex-determining region Y (SRY)-box 2 (SOX2),
a lineage commitment marker of proximal endodermal progenitors, appeared normal in E18.5
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre trachea specimens, which showed uniform expression along the
epithelium lining the conductive airways (Fig. I.3E-F; Tian et al., 2011). This indicated that the
decreased mesenchymal ERK/MAPK activity did not interfere with the tracheal epithelial progenitor
cell population.
Tracheal cartilage does not normally undergo proper osteogenesis in mice (Takeda et al., 2001).
Observation of cartilage rings in trachea from Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre embryos showed the
presence of large chondrocytes with a hypertrophic appearance not seen in control littermates (Fig.
I.3E-F). We also investigated the expression of SOX9, a transcriptional regulator of chondrogenesis
that is essential for tracheal cartilage patterning and formation. At E14.5, the segmented SOX9
distribution, corresponding to the pattern of the future cartilage rings, was not reproduced in
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants. They instead presented continuous SOX9 expression along the
trachea mesenchyme (Fig. I.3G-H). Thus, the ERK/MAPK pathway plays a cell-autonomous function
in trachea chondrogenesis.
I.5.3 Mesenchymal inactivation of Mek genes in the developing lung affects
lung growth but not cell differentiation
Comparison of the lung weight/body weight ratio at E18.5 revealed that Mek1flox/flox;Mek2-/;Tbx4+/Cre mutants showed a 34% reduction when compared to controls (Fig. 4A). This decrease was
identical to what was observed in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre mutants, thus indicating that a
defective ERK/MAPK pathway in lung mesenchyme was sufficient to impair lung growth. To identify
231
Figure I.1. Validation of the efficiency and specificity of the Cre recombinases in the
developing lung and placenta.
Dermo1+/Cre and Tbx4+/Cre mice were bred with R26mT/mG reporter mice to compare the activity of each
recombinase in embryo and placenta. The double-fluorescent R26mT/mG reporter mouse line
expresses the membrane-targeted tandem dimer Tomato (mT) prior Cre-mediated excision and
membrane-targeted enhanced green fluorescent protein (mG) after excision. At E12.5, EGFP
expression was detected in mesenchymal component of several tissues, including lung, trachea and
placenta in R26+/mTmG;Dermo1+/Cre specimens (A-B, E). In R26+/mTmG;Tbx4+/Cre specimens, EGFP
expression was restricted to the respiratory tract mesenchyme while the surrounding tissues
remained EGFP-negative (C-D). Co-immunofluorescence staining with PECAM or α-smooth muscle
actin (α-SMA), which are specific markers of endothelial cells and pericytes, respectively, was
performed on placenta sections from E12.5 R26+/mTmG;Dermo1+/Cre (E-G) and R26+/mTmG;Tbx4+/Cre
embryos (H-J). Both Tbx4Cre and Dermo1Cre recombinases direct Cre-mediated specific deletion in
pericytes of placenta as shown by the co-localization of EGFP with α-SMA. However, Tbx4Cre
recombinase is less efficient as shown by the lack of co-labeling in some pericytes (G, J; arrows). No
co-labeling with PECAM was detected with both recombinases indicating absence of recombination
in endothelial cells (F, I). epi, epithelium; eso, oesophagus; mes, mesenchyme, tr, trachea. Scale
bars: 250µm (A, C), 100µm (A’, B, C’, D) and 25µm (E-J).
232
233
Figure I.2. Morphology and body weight of Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant embryos. Gross
morphology (A-B) and body weight (C) of E18.5 control (n=36) and Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre
(n=12) specimens. Mutant embryos were smaller and they presented hindlimb deformity (arrow).
***p<0.001. Scale bar: 1mm (A-B).
234
235
Figure I.3. Abnormal tracheal development in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant embryos.
Alcian blue staining revealed tracheal cartilage malformations in E18.5 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre
embryos with a smaller width and thin cartilage rings that were weakly stained (A-B). MEK1 IHC
assay showed residual MEK1 expression in trachea mesenchyme and cartilage from E18.5
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant embryos (C-D, arrowheads). SOX2 immunostaining showed that
SOX2 expression was comparable in tracheal epithelium from E18.5 controls and Mek1flox/flox;Mek2-/;Tbx4+/Cre mutants (E-F). Hypertrophic chondrocytes were detected in cartilage rings from mutants (F;
arrows). Unsegmented SOX9 expression was observed along the upper airways of E14.5
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre embryos when compared to controls as revealed by IHC experiment (GH). c, cartilage; epi, epithelium; mes, mesenchyme. Scale bars: 100µm (C-H).
236
237
contributing factors for lung hypoplasia, we measured lung cell proliferation and apoptosis. At E14.5,
phospho-histone H3 (pHH3)-positive cells were significantly less abundant in lung mesenchyme from
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants while no difference was detected in lung epithelium (Fig. 4B-C,
F). No significant variation in apoptosis levels was detected in lung epithelium or mesenchyme at the
same age. However, at E18.5 the number of apoptotic cells, as detected by activated caspase-3
immunostaining, was significantly augmented in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre lung specimens (Fig.
4D-E, G). This suggested that deregulated proliferation and apoptosis occurring during lung formation
in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre embryos underlied the reduced lung growth. Decreased lung
branching also participates in lung hypoplasia (Kotecha, 2000). We evaluated the number of acini at
E14.5 since, at this stage, the ramifying bronchial tree gives rise to epithelial tubular branches ending
in terminal acini. Branching was less extensive in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre embryos with a mean
reduction of 28% (Fig. 4H-J). Thus, insufficient proliferation, increased apoptosis and reduced
branching converged to cause lung hypoplasia, a likely explanation for the neonatal death observed
in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants.
We assessed whether lung cell differentiation was affected in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre
embryos. No significant difference was observed for the secretory club cells and the alveolar type I
and type II pneumocytes using the CC10, T1 (podoplanin), and pro-SPC markers, respectively (Fig.
5A-F). The distribution of PECAM-positive capillary endothelial cells also appeared normal (Fig. 5GH). We examined the expression of SOX2 and SOX9, the latter being a marker of distal endodermal
lung progenitors (Tian et al., 2011). Similar expression profiles were detected in control and mutant
specimens (Fig. 5I-L). Quantitative RT-PCR expression analysis confirmed the lack of significant
changes in gene expression levels in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants (Fig. 5M). Thus, a
functional ERK/MAPK cascade in the lung mesenchyme is not necessary for lung cell differentiation.
I.5.4 Molecular impact of the mesenchymal inactivation of Mek genes in the
lung
We verified the effectiveness of Mek1 inactivation in lung mesenchyme from Mek1flox/flox;Mek2-/;Tbx4+/Cre embryos. Immunostaining experiments showed a near-complete loss of MEK1 expression
in lung mesenchyme in E14.5 and E18.5 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre specimens, while MEK1
epithelial expression remained unchanged (Fig. 6A-D). Residual MEK1 mesenchymal
immunostaining detected in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre lung specimens corresponded to endothelial
238
cells, which are not targeted by the Tbx4Cre recombinase as shown by the lack of co-labeling with
PECAM (Fig. 1I). As a consequence of the loss of Mek function in lung mesenchyme, ERK activation
was diminished in this tissue (Fig. 6E-G). However, phospho-ERK (pERK) expression was
augmented in the lung epithelium, suggesting deregulated communication in the ERK/MAPK pathway
between lung mesenchymal and epithelial layers (Fig. 6G). This was previously reported for
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre lung specimens (Boucherat et al., 2014).
We studied the expression of genes shown to be deregulated in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre
mutants to determine if the similitudes in the lung phenotypes between Mek;Dermo1+/Cre and
Mek;Tbx4+/Cre mutants extended at the molecular level. As expected, deletion of the Mek function in
lung mesenchyme either with the Tbx4Cre or the Dermo1Cre recombinases caused similar changes
in gene expression. For instance, expression of the Map2k6 gene, which encodes an upstream
activator of p38/MAP kinase known to be involved in lung branching, was decreased in E18.5
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre specimens, mimicking the data obtained in Mek1flox/flox;Mek2-/;Dermo1+/Cre mutants (Fig. 6H; Boucherat et al., 2014). Likewise, expression of the Scgb3a2 gene,
which encodes a growth factor and anti-apoptotic agent that induces lung branching and promotes
fetal lung development, was reduced in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre specimens as in
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre mutants (Kurotani et al., 2008; Boucherat et al., 2014). Interestingly,
Scgb3a2 expression was also diminished in lungs from Mek1flox/flox;Mek2-/- mutants suggesting that
the loss of Mek2 function was itself sufficient to impact on Scgb3a2 expression in lung (Fig. 6H). This
also indicated that the decreased Scgb3a2 expression may contribute, with other factors, to the lung
phenotype observed in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants.
Reminiscent of the Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant phenotype, the R-spondin 2 (Rspo2)
hypomorphic allele footless causes severe lung malformations including decreased lung weight and
defective branching morphogenesis (Bell et al., 2008). Rspo2 encodes a secreted cysteine-rich
protein that activates the canonical Wnt signaling pathway. It is expressed in the lung mesenchyme.
Interestingly, Rspo2 expression was downregulated in lungs from E18.5 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre
mutants (Fig. 6H). Expression of Lef1, a Wnt target gene, was also reduced in mutant specimens
(Fig. 6H). Numerous studies have shown the interplay between ERK/MAPK and canonical Wnt
pathways in developmental processes (Wang et al., 2012; Zhang et al., 2014; Buchtova et al., 2015).
Our results suggested that during lung development, canonical Wnt signaling may be affected by the
absence of a functional ERK/MAPK pathway in the lung mesenchyme.
239
Figure I.4. Tbx4Cre-driven mesenchymal inactivation of Mek genes causes lung hypoplasia.
The lung weight-to-body weight ratio was significantly reduced in E18.5 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre
embryos (n=12) versus controls (n=36), indicating lung hypoplasia (A). pHH3 IHC experiment
showed a specific and significant decrease in the number of proliferative cells in lung mesenchyme
from E14.5 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants (B-C, F). Cleaved caspase-3 IHC experiment
revealed a significant increased number of apoptotic cells in the lung from E18.5 Mek1flox/flox;Mek2-/;Tbx4+/Cre mutants (D-E, G). Arrows indicated cleaved caspase-3 positive cells. Frontal sections of
E14.5 controls and Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants showed the smaller size of the lungs and the
reduced number of acini in mutants (H-I). Arrows designated the epithelial tubules. Quantitative
morphometry of lungs from E14.5 controls and Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants indicated that the
number of acini per mm2 was significantly reduced in mutant specimens (J). The numbers of
specimens were 4 controls and 3 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants. Values are expressed as
mean±s.e.m. (F-G, J). *p <0.05, ***p <0.001. Scale bar: 100µm (B-E, H-I).
240
241
Figure I.5. Characterization of lung epithelium cell integrity and microvasculature in
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant embryos.
As assessed by IHC using CC10 (A-B), T1a (C-D) and proSP-C (E-F) specific cell markers, club
cells, type I and type II pneumocytes were correctly specified in lungs from E18.5 Mek1flox/flox;Mek2-/;Tbx4+/Cre mutant embryos when compared to controls. The vascular network was also properly
developed as shown by PECAM immunostaining (G-H). Finally, IHC assays for SOX2 and SOX9,
markers of proximal and distal endodermal lung progenitors, respectively, did not reveal major
changes in their expression (I-L). Quantitative RT-PCR expression analysis confirmed the lack of
significant changes in the expression levels of Sox2, Sox9, T1a and Scgb1a1 in Mek1flox/flox;Mek2-/;Tbx4+/Cre mutants (n=4) versus controls (n=8) (M). Scale bars: 100µm (A-L).
242
243
Figure I.6. Changes in gene expression in lungs from Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant
embryos.
MEK1 IHC assay demonstrated a near-complete loss of MEK1 expression in lung mesenchyme from
E14.5 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant embryos (A-B). The residual MEK1 mesenchymal
immunostaining detected in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant lung specimens corresponded to
endothelial cells (arrowheads). A similar result was observed at E18.5 (C-D). Accordingly, phosphoERK IF assay showed decreased ERK phosphorylation in lung mesenchyme. Increased pERK
immunolabeling was also detected in lung epithelium from mutants (E-F). pERK immunofluorescence
intensity within lung epithelium and lung mesenchyme was quantified with the ImageJ software.
Values represent the average fluorescence intensity (arbitrary units) of the epithelium (surrounded by
dotted lines) and the remaining mesenchyme for 6 controls and 3 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre
mutants (G). Quantitative RT-PCR expression analysis revealed significant decreased levels of
Map2k6, Scgb3a2, Rspo2 and Lef1 in lungs from E18.5 Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre embryos (n=4)
versus controls (n=10) (H). Mek1flox/+;Mek2-/-;Tbx4+/Cre specimens also presented Scgb3a2 and
Rspo2 reduced expression. Finally, Scgb3a2 expression was diminished in lungs from
Mek1flox/flox;Mek2-/- embryos. epi, epithelium; mes, mesenchyme; v, vessel. Values are expressed as
mean±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01. Scale bars: 100µm (A-F).
244
245
I.6 DISCUSSION
Normal lung growth needs adequate intrathoracic space. The kyphosis and the omphalocele
observed in mesenchyme-specific Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre mutants can impose a significant
physical restriction on lung growth and function that may challenge the survival of mutant pups at
birth (McMaster et al., 2007; Kamata et al., 2008; Danzer et al., 2012;). The Tbx4Cre recombinase
specific action in the respiratory tract mesenchyme did not cause kyphosis and omphalocele, thus
allowing us to precisely evaluate the role of the ERK/MAPK pathway in lung mesenchyme.
Trachea from Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants presented a milder phenotype than
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre mutants, being narrower with thin cartilage rings. This likely reflects
the difference in efficiency between the Tbx4Cre and Dermo1Cre recombinases. Despite that, a
similar unsegmented SOX9 expression profile was observed along the trachea of both mutants
indicating that chondrocyte specification did occur. However, aggregation and condensation into
nodules required a functional ERK/MAPK pathway. Due to the partial action of Tbx4Cre
recombinase, these processes were not completely impaired in Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants.
We also observed the abnormal presence of large hypertrophic chondrocytes in tracheal cartilage
rings from Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutant embryos. Tracheal rings do not normally ossify and
these cartilagenous structures are considered as permanent cartilage (Pacifici, 1995). In the rat,
hypertrophic chondrocytes were reported in trachea from two month-old animals. They were
associated with cartilage calcification, not with ossification (Sasano et al., 1993; Sasano et al., 1998).
In contrast, no mineralization of the tracheal cartilage was observed in mice from the same age,
indicating differences between species. However, gain of expression of RUNX2, a transcriptional
regulator of osteoblast differentiation and bone formation, was reported to induce hypertrophic
chondrocytes in tracheal cartilage rings in transgenic mice. This shows that the determination of the
cartilage phenotype can be modified by the sustained expression of Runx2 (Takeda et al., 2001; Ueta
et al., 2001). It was also observed that activation of the ERK/MAPK pathway in chondrocytes during
endochondral ossification inhibits their hypertrophic differentiation, a result that concurs with our
observations (Murakami et al., 2004). Thus, the presence of large hypertrophic chondrocytes in
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre mutants suggests that the ERK/MAPK pathway may be involved in the
control of tracheal chondrocyte hypertrophy by means that remain to be identified.
Both Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre and Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre mutants presented the same
lung phenotype: reduced mesenchymal proliferation, increased apoptosis, and less branching, which
246
together led to lung hypoplasia and death at birth. These findings establish the cell-autonomous role
of the ERK/MAPK pathway in lung mesenchyme for correct lung growth and newborn survival. They
also demonstrate that the impact of kyphosis and omphalocele on lung development was not major in
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre mutants. However, we cannot rule out a potential role of these two
pathological phenotypes on survival after birth, a condition that cannot be assessed since both
Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre and Mek1flox/flox;Mek2-/-;Dermo1+/Cre mutants die at birth.
The deletion of Mek genes in lung epithelium reproduces the lung phenotypes found in Fgf10 and
Fgfr2b mutants since all three mutants failed to develop primary bronchial buds (Min et al., 1998;
Sekine et al., 1999; De Moerlooze et al., 2000; Boucherat et al., 2014). This supports the notion that
one of the main roles of the epithelial ERK/MAPK pathway in early lung development is to mediate
signals triggered by mesenchymal FGF10 binding to epithelial FGFR2b receptors. Interestingly, the
lung phenotype resulting from the mesenchymal deletion of Mek genes is reminiscent to the Fgf9 null
mice phenotype. Fgf9-/- mice die shortly after birth from respiratory distress (Colvin et al., 2001). They
exhibit lung hypoplasia with reduced mesenchymal proliferation, decreased airway branching and
normal epithelial cell differentiation as do Mek mutants. FGF9 is expressed in lung mesothelium and
epithelium and it primarily acts on lung mesenchyme via the FGFR1 and FGFR2 receptors. Ablation
of both Fgfr1 and Fgfr2 gene functions in lung mesenchyme with the Dermo1Cre deleter mice also
causes lung hypoplasia (White et al., 2006). Altogether, these results suggest that FGF9 signaling via
the FGFR1 and FGFR2 receptors is predominantly mediated by the ERK/MAPK pathway in lung
mesenchyme.
In conclusion, the use of the Tbx4Cre deleter mouse line has allowed us to define the importance
of a functional ERK/MAPK pathway in the respiratory tract mesenchyme for the correct formation of
trachea and lung. Together with our previous studies, these findings establish that the ERK/MAPK
cascade is required in both mesenchymal and epithelial cell layers to coordinate efficient epithelialmesenchymal interactions during lung development.
I.7 EXPERIMENTAL PROCEDURES
I.7.1 Mice, genotyping and tissue collection
Mek1flox/flox and Mek2-/- mouse lines were previously described (Bélanger et al., 2003;
Bissonauth et al., 2006). The R26mT/mG reporter line (Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo) was
247
purchased (Jackson Laboratory, Bar Harbor, MN; Muzumdar et al., 2007). Dermo1Cre and Tbx4Cre
deleter mice were provided by Drs. Ornitz and Kania, respectively (Yu et al., 2003; Luria et al., 2008).
For the ablation of Mek1 in a Mek2 null background, Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre specimens were
obtained from different breedings between Mek1;Mek2;Tbx4+/Cre and Mek1;Mek2 mice. As only
individuals carrying the Mek1flox/flox;Mek2-/-;Tbx4+/Cre genotype presented defects, the other genotypes
were referred hereafter as controls, unless specified. Age of the embryos was estimated by
considering the morning of the day of the vaginal plug as E0.5. Experimental specimens were
genotyped by Southern blot and PCR analyses.
Lungs from control and mutant embryos were collected at E12.5, E14.5 and E18.5. The wet
lung and body weights were obtained by direct measurement to determine the ratio. Experiments
were performed in respect of the guidelines of the Canadian Council on Animal Care and approved
by the institutional animal care committee.
I.7.2 Histology, immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF)
analyses
Embryos, placenta and lung specimens were processed for paraffin (4 µm) or frozen (6 µm)
sections. Morphology was analyzed by hematoxylin staining. IHC experiments were performed as
described (Gendronneau et al., 2012). Slides were counterstained with either nuclear Fast Red or
hematoxylin. For IF studies, nuclei were visualized by DAPI staining.
Proliferation index was obtained by counting the number of pHH3-immunoreactive cells divided by
the total cell number in lung epithelium or mesenchyme for each section analyzed. For the apoptotic
index, the number of cleaved caspase-3-immunoreactive cells was divided by the total lung cell
number per section. For the proliferation assay, five or six random fields were analyzed for an
average number of 500 cells per field. For the apoptosis index, four random fields were considered
for an average number of 3000 cells per field. For each experiment, three to five embryos were used
per genotype tested.
The primary antibodies used were: a rabbit polyclonal against SMA (1/200 dilution; Abcam), a
goat antibody against CC10 (1/400; gift from Dr. Singh), a rabbit antibody against cleaved caspase-3
(1/200; Cell Signaling), a rabbit monoclonal antibody against MEK1 (1/100; Epitomics), a rabbit
monoclonal antibody against pHH3 (1/200; Cell Signaling), a rat monoclonal antibody against
PECAM (1/50; BD Biosciences Pharmingen), a rabbit monoclonal antibody against pERK (1/200; Cell
248
Signaling), a rabbit antibody against proSP-C (1/1500; Millipore), a rabbit monoclonal antibody
against SOX2 (1/150; Cell Signaling), a rabbit antibody against SOX9 (1/100; Santa Cruz
Biotechnology), a Syrian hamster monoclonal antibody against podoplanin (T1 ; 1/75; DSHB). The
biotinylated secondary antibodies were: a goat anti-rabbit (1/250; Vector Laboratories), a swine antigoat (1/250; Cedarlane), a goat anti-Syrian hamster (1/250; Cedarlane), a goat anti-rat (1/500;
Cedarlane). The fluorescent secondary antibodies were: Cy5-conjugated donkey anti-rabbit (1/150;
Jackson Immunoresearch Laboratories) and Cy5-conjugated goat anti-rat (1/200; Molecular Probes).
The Cyanine 3 Tyramide Signal Amplification (TSA) system (Perkin Elmer) was used for IF pERK
detection (at 1/150 dilution).
I.7.3 Alcian blue cartilage staining
Dissected respiratory tracts from E18.5 embryos were stained in a solution of 0.03% Alcian blue
and 20% acetic acid in 95% ethanol.
I.7.4 Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) experiments
Total RNA was extracted from paraffin-embedded sections of lungs from E18.5 embryos with the
RNeasy FFPE kit according to manufacturer's procedure (Qiagen, Toronto, Canada). qRT-PCR
experiments were performed as previously described (Boucherat et al., 2012). Four to ten specimens
were used for each genotype tested. The following primer sequences were used: Lef1 forward 5'AAATGGGTCCCTTTCTCCAC-3', reverse 5'-CTCGTCGCTGTAGGTGATGA-3'; Map2k6 forward 5'AATTCCAAAGAACGGCCCAC-3', reverse 5'-GGGTCGACCAGTTAAGTCCA-3'; Rspo2 forward 5'ACCGAGCCCCAGATATGAAC-3', reverse 5'-GGTGCAAAACCATCTGGACA-3'; Scgb1a1 forward
5'-AAGCCTCCAACCTCTACCATG-3', reverse 5'-ATGTCCGAAGAAGCTGAGCTG-3'; Scgb3a2
forward 5'-CCAAAGTCCCGGAAAACATCA-3', reverse 5'-TGTCAACAACAGGGAGACGG-3'; Sox2
forward 5'-ACAGCATGTCCTACTCGCAG-3', reverse 5'-GGAGTGGGAGGAAGAGGTAAC-3'; Sox9
forward 5'-GTCGGTGAAGAACGGACAAG-3', reverse 5'-CTGAGATTGCCCAGAGTGCT-3'; T1
forward 5'-TGGCAAGGCACCTCTGGTA-3', reverse 5'-GGTGGACAGTTCCTCTAAGGGA- 3'. The
Rpl19 gene was used as control with the primers forward 5'-GATCATCCGCAAGCCTGTGA-3' and
reverse 5'-GCATCCGAGCATTGGCAGTA-3'.
249
I.7.5 Morphometry analysis
Total lung surface and number of epithelial tubules were measured using Adobe Photoshop CS5
software. The number of acini was normalized according to the total lung area. Four random fields
from three to four specimens were used for each genotype tested.
I.7.6 Statistical analyses
Student's t test was performed for comparative studies. A significance level inferior to 5% (p<0.05)
was considered statistically significant.
I.8 ACKNOWLEDGMENTS
We are grateful to Drs. N. Bisson and D. Richard for critical reading of the manuscript, and to Drs.
A. Kania, D. Ornitz and G. Singh who kindly provided mouse lines and antibody.
I.9 AUTHOR CONTRIBUTIONS
O.B., K.L.T., R.A., J.C. and L.J. designed the experiments; O.B., K.L.T., R.A., N.H. and V.N.
performed the experiments; O.B., K.L.T., R.A., N.H., V.N., J.C. and L.J. analyzed the data; K.L.T.,
J.C. and L.J. wrote the paper.
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