VBNC - Université de Poitiers

THÈSE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE POITIERS
(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École Doctorale : Ingénierie Chimique, Biologique et Géologique
Secteur de recherche : MICROBIOLOGIE DE L’EAU
Présentée par
Laëtitia ALLERON
ETUDE DE L’ETAT VIABLE NON CULTIVABLE
(VBNC) CHEZ LEGIONELLA PNEUMOPHILA LENS
APRES TRAITEMENTS MONOCHLORAMINE ET
THERMIQUE
Directeur de Thèse : Professeur Jacques FRERE
Soutenue de 08 Février 2008
Devant la Commission d’Examen :
Rapporteurs : Mme Sophie JARRAUD, MCU PH, HDR, Université de Lyon Nord
M. Sam DUKAN, Chargé de Recherche CNRS, HDR, Université de Marseille
Examinateurs : Mme Marie-Hélène RODIER, PU-PH, Université de Poitiers
M. Thierry JOUENNE, Directeur de Recherche CNRS, Université de Rouen
M. Jacques FRERE, Professeur, Université de Poitiers

1
SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE.................................................................................... 8
CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE................................................... 10
1. LEGIONELLA .................................................................................................................. 10
1.1. Historique.................................................................................................................. 10
1.2. La légionellose .......................................................................................................... 10
1.3. Présentation de la bactérie......................................................................................... 12
1.3.1. Classification...................................................................................................... 12
1.3.2. Description / Morphologie ................................................................................. 13
1.3.3. Caractères microbiologiques et biochimiques.................................................... 14
1.3.4. Caractères culturaux........................................................................................... 14
1.3.5. Facteurs de virulence.......................................................................................... 14
1.4. Ecologie des légionelles............................................................................................ 16
1.4.1. Interaction avec les amibes ................................................................................ 20
1.4.2. Colonisation des biofilms................................................................................... 21
1.5. Cycle de vie de L. pneumophila................................................................................ 21
1.5.1. La phase de réplication....................................................................................... 23
1.5.2. La phase de transmission.................................................................................... 23
1.5.3. La forme MIF (Mature Intracellular Form)........................................................ 24
2. L’ETAT VIABLE NON CULTIVABLE (VBNC).......................................................... 25
2.1. Définition ..................................................................................................................25
2.2 L’état VBNC chez L. pneumophila............................................................................ 28
2.2.1. Carence en nutriments........................................................................................ 29
2.2.2. Influence de la température................................................................................ 29
2.2.3. Influence de la teneur en oxygène dissous......................................................... 30
2.2.4. Influence du pH.................................................................................................. 30
2.2.5. Influence de la salinité........................................................................................ 30
2.2.6. Traitements oxydants ......................................................................................... 31
2.3 Analyse de l’état VBNC............................................................................................. 31
3. UN NOUVEAU FACTEUR DE RESSUCITATION : LA PROTEINE Rpf
(Resuscitation-promoting-factor)......................................................................................... 36
3.1. Rpf chez les bactéries Gram positives : .................................................................... 36
3.2. Rpf chez les bactéries Gram négatif.......................................................................... 38
3.3. Structure et mode d’action ........................................................................................ 40
CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES.......................................................... 42
1. Souches microbiennes, conditions de culture et de conservation .................................... 42
1.1. Legionella pneumophila............................................................................................ 42
1.2. Acanthamoeba castellanii ......................................................................................... 42
1.3. Escherichia coli......................................................................................................... 43
2. Traitement des bactéries en suspension par la monochloramine ..................................... 43
3. Traitement thermique ....................................................................................................... 44
4. Etude de la viabilité des cellules ...................................................................................... 44

2
4.1. Dénombrement des bactéries cultivables sur gélose................................................. 44
4.2. Etude de l’intégrité membranaire : LIVE/DEAD® BacLight™................................ 44
4.3. Etude de l’activité estérase : CHEMCHROME V6 .................................................. 46
4.4. Infection de l’amibe Acanthamoeba castellanii........................................................ 46
5. Evaluation du maintien de la synthèse protéique des bactéries à l’état VBNC ............... 47
6. Analyse protéomique........................................................................................................ 48
6.1. Préparation des échantillons : EXTRACTION DES PROTÉINES............................. 49
6.2. Electrophorèse bidimensionnelle : 2D-PAGE........................................................... 49
6.2.1. Principe............................................................................................................... 49
6.2.2. 1ère dimension : IEF............................................................................................ 50
6.2.3. 2NDE DIMENSION : SDS-PAGE....................................................................... 51
6.2.4. Coloration au nitrate d’argent ............................................................................ 52
6.2.5. Analyse d’image................................................................................................. 52
6.2.6. Spectrométrie de masse MALDI-TOF............................................................... 53
7. Méthodes de biologie moléculaire ................................................................................... 53
7.1. Plasmides................................................................................................................... 53
7.2. Clonage moléculaire et PCR ..................................................................................... 54
7.2.1. Réactions de PCR et amorces............................................................................. 54
7.2.2. Ligature du produit PCR dans pCR-Blunt ......................................................... 55
7.2.3. Clonage après digestion par les enzymes de restriction..................................... 55
7.3. Transformation d’Escherichia coli............................................................................ 55
7.4. Expression des protéines recombinantes................................................................... 55
7.5. Extraction et purification des protéines recombinantes ............................................ 56
7.5.1. Extraction ........................................................................................................... 56
7.5.2. Purification......................................................................................................... 56
7.5.3. Vérification des protéines induites par SDS-PAGE........................................... 57
7.5.4. Test de réveil de L. pneumophila par les protéines recombinantes.................... 57
CHAPITRE 3 : RESULTATS...................................................................................... 58
1. Impact du traitement par la monochloramine .................................................................. 58
1.1. Cultivabilité et viabilité............................................................................................. 59
1.2. Evaluation du maintien de la synthèse protéique des bactéries non cultivables ....... 60
1.3. Traitements des bactéries pour l’électrophorèse 2D ................................................. 62
1.4. Analyse protéomique................................................................................................. 64
1.4.1. Analyse par SDS-PAGE..................................................................................... 64
1.4.2. Analyse par électrophorèse bidimensionnelle.................................................... 65
2. Impact du traitement thermique ....................................................................................... 76
2.1. Cultivabilité et viabilité............................................................................................. 76
2.2. Analyse par électrophorèse bidimensionnelle........................................................... 80
3. Identification du gène Rpf chez L. pneumophila ............................................................. 82
3.1. Amplification du gène rpf chez L. pneumophila....................................................... 82
3.2. Expression des protéines recombinantes................................................................... 84
3.2.1. Protéines recombinantes marquée en N-terminal............................................... 84
3.2.2. Protéines recombinantes marquée en C-terminal............................................... 86
3.2.3. Test de réveil de L. pneumophila non cultivables.............................................. 86
CONCLUSIONS / PERSPECTIVES........................................................................... 88

3
ANNEXE 1 : Préparation des milieux de culture pour L. pneumophila et E. coli....... 92
ANNEXE 2 : Préparation des milieux de culture pour Acanthamoeba castellanii ...... 94
ANNEXE 3 : Préparation des solutions nécessaires au traitement NH2Cl.................. 95
ANNEXE 4 : Préparation des gels d’électrophorèse 2D.............................................. 97
ANNEXE 5 : Préparation des gels d’électrophorèse pour la SDS-PAGE.................... 98
ANNEXE 6 : Fixation et coloration des protéines ....................................................... 99
ANNEXE 7 : Liste des protéines dont la quantité augmente à l’état VBNC ............. 100
ANNEXE 8 : Liste des protéines dont la quantité varie après le stress
monochloramine ......................................................................................................... 101
ANNEXE 9 : Liste des protéines dont la quantité varie dans le milieu pauvre en
nutriments (carence nutritionnelle)............................................................................. 102
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.................................................................... 103
ARTICLE 1
ARTICLE 2

4
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Cycle de vie de Legionella pneumophila………………………...……………….17
Figure 2 : schéma d’infection d’une amibe par Legionella..................................................... 19
Figure 3 : Cycle de vie de L. pneumophila (Molofsky & Swanson, 2004)............................. 21
Figure 4 : Expression des phénotypes pendant les phases de réplication et de transmission.. 22
Figure 5 : Alignement partiel de séquences en AA de Rpfs chez les mycobactéries.............. 35
Figure 6 : comparaison de RpfBc avec d'autres glycosides hydrolases..…………………….39
Figure 7 : Cultivabilité de L. pneumophila en suspension après traitement à la
monochloramine (moyenne de 3 expériences)......................................................................... 59
Figure 8 : Autoradiographie de profils protéiques de L. pneumophila obtenus après marquage
à différents temps, par un mélange cystéine /méthionine S35 .................................................. 60
Figure 9 : Comparaison de profils protéiques par SDS-PAGE de L. pneumophila cultivables
ou non cultivables restées 0 jours (J0) ou 15 jours (J15) dans le milieu de repos ................... 64
Figure 10 : Exemple de gel obtenu en déposant 350 µg de protéines de L. pneumophila traitée
par 20 mg/L de monochloramine resté 15 jours dans le milieu de repos................................. 66
Figure 11 : Analyse protéomique de L. pneumophila traitées ou non par la monochloramine
après incubation dans le milieu de repos (150 µg de protéines déposées)............................... 67
Figure 12 : Exemple de gel obtenu en déposant 150µg de protéines d’un échantillon traité par
20mg/L NH2Cl et prélevé juste après traitement. .................................................................... 68
Figure 13 : Localisation des protéines dont la quantité est augmentée d’un facteur supérieur
ou égal à 2 à l’état VBNC ........................................................................................................ 71
Figure 14 : Dénombrement des L. pneumophila cultivables après traitement thermique....... 77
Figure 15 : Observation en microscopie à épifluorescence de l’activité estérase de L.
pneumophila, 169 j après traitement à 57,5°C (Chemchrome V6).......................................... 79
Figure 16 : Analyse protéomique de L. pneumophila traitées ou non par la chaleur après
incubation plusieurs jours dans le milieu de repos................................................................... 80
Figure 17 : Comparaison de séquences en AA de Rpf entre L. pneumophila et Salmonella...81
Figure 18 : Résultat de l’amplication du gène rpf chez L. pneumophila................................. 83
Figure 19 : Expression de la protéine Rpf marquée en N-terminal par une queue poly-
histidine .................................................................................................................................... 84
Figure 20 : Purification de la protéine Rpf marquée en N-terminal........................................ 85
Figure 21 : Comparaison de séquence en AA de Rpf entre L. pneumophila, Salmonella et
Micrococcus luteus...................................................................................................................87