Diversité et propriété fonctionnelles des bactéries lactiques isolées
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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université d’Oran Es-senia Faculté des Sciences Département de Biologie Laboratoire de Microbiologie appliquée Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de magister en Microbiologie fondamentale et appliquée Mémoire Intitulé : Diversité et propriété fonctionnelles des bactéries lactiques isolées des margines d’olives fermentés Présenté par Melle Gomri Aicha Membre du jury Président Examinateur Examinateur Examinateur Rapporteur Sahraoui Toufik Professeur, Université d’Oran Es Senia Hennni Jamal Eddine Professeur, Université d’Oran Es Senia Kihal Mebrouk Professeur, Université d’Oran Es Senia Hadadji Miloud Professeur, Université d’Oran Es Senia Guessas Bettache Professeur, Université d’Oran Es Senia Année universitaire 2012/2013 Remerciements En premier lieu, je remercie Dieu le Tout Puissant de m’avoir donné la volonté, la santé et le courage pour réaliser ce travail. Ce mémoire a été réalisé au laboratoire de Microbiologie fondamentale et appliqué (LMA), Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université d’Oran, Es-sénia ; sous la direction de Monsieur GUESSAS.B. À qui j’exprime mes sincères remerciements pour ses connaissances, sa compétence, sa rigueur scientifique et ses conseils. Qu’il trouve ici mes sincères remerciements et mon entière reconnaissance. Aussi je tiens à exprimer ma profonde gratitude ainsi que mes plus vifs remerciements à Monsieur Kihal, Professeur et responsable du laboratoire. Je désire remercier tous les professeures chacun par son nom. Professeur Sahraoui .T ; qui nous a fait un grand honneur en acceptant de présider le jury. Professeur KIHAL.M ; d’avoir honoré notre sollicitation et d’avoir accepté d’examiner ce travail et pour son attention et son aide. Qu’il veuille bien accepter l’expression de mon profond respect. Professeur Henni J.E ; pour m’avoir fait l’honneur d’examiner ce travail. Qu’il veuille bien accepter l’expression de mon profond respect. Professeur Hadadji .M ; pour m’avoir fait l’honneur d’examiner ce travail. Qu’il veuille bien accepter l’expression de mon profond respect. Et je tiens à remercier avec beaucoup de plaisir, mes collègues du Laboratoire de Microbiologie fondamentale et appliqué (LMA), en particulier : Hanane, Fouzia, Fatima, Nour, Amina, Wassila, Meriem, Kenza, Halima, Asma, Aicha, Soumya, khaira pour tout ce qu’ils ont fait pour moi. Je tiens aussi à remercier beaucoup M Nawel technicienne du laboratoire de microbiologie appliquée et Mr Ahmed technicienne du laboratoire de pédagogie. En fin, je voudrais tout autant exprimer ma reconnaissance à tous ceux qui m’ont permis de mener à bien ce travail. Dédicaces Je dédie ce modeste mémoire -A mes chers parents pour les quels je dois mon existence et ma réussite, je leur souhaite une longe et heureuse vie pleine de santé. -A mes frères : Cheikh, Abdelkader, Abdelrahman, Djaloul, Lahcen, Mokhtar, mouloud et yousef. -Ames sœurs : Rabia, Khaira, Fatima, Meriem, Kenza. -A mon oncle Mohamed et mes tantes Ammaria ,siti et rabiaa. -A toute ma famille. -Mes Deux intimes : Fatima et Rachida -A mes amis Hafida, Karima, Khadra, Amina, Minine, Bomadien, Sihame, Hadjer, feyza, soumya, Meriem(Chleff). Etudiants de ma promotion de Magister : Fatima, Nabila, Wafaa, Bachir, Yahia pour leurs aides. Résumé Résumé Résumé Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des agents protecteurs dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes dans une grande variété d'aliments, tel que les laits fermentés, les yaourts, les fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi, différentes souches d'intérêt commercial ou scientifique y sont couramment isolées. Dans ce travail, 32 souches de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées à partir du margine d’olives des différentes régions d’Algérie. Les lactobacilles représentent 34,37% de la flore lactique.L’espèce la plus dominante pour ce groupe est Lactobacillus rhamnosus 63,63%. Lactobacillus manihotivorans est aussi représenté parmi les souches isolées 36,36%. Les lactocoques sont représentés par deux espèces qui sont Lactococcus lactis subsp. lactis 27,27% et lactococcus. lactis subsp. Diacetylactis 72,72%. Les entérococcus . L’étude des interactions a révélé la capacité de toutes les souches à inhiber Staphylococcus aureus. Et Escherichia coli ont montré leur capacité antagoniste envers ces deux souches par la production de substances protéiques dans le milieu de culture. Les bactéries lactiques isolées et identifiée montrent une capacité à inhiber les souches de Staphylococcus aureus, Escherichia coli par la production de substances protéiques (substances antimicrobiennes) dans le milieu de culture. L’activité protéolytique, nous a permis de déceler que l’ensemble des souches lactiques possédées une activité protéolytique. L’activité lipolytique est constatée toutes les souches possède pas une activité lipolytique. Enfin l’antibiogramme des bactéries lactiques testées, montre une sensibilité pour l’ensemble des antibiotiques Mots clés : bactéries lactiques, margine d’olives, Lactobacillus, lactocoques, Staphylococcus, Escherichia coli .antibiogramme, substances antimicrobiennes, activité lipolytique, activité protéolytique Abstract ABSTRACT Abstract Lactic acid bacteria are used for centuries as protective agents in fermented foods. These bacteria are present in a wide variety of foods such as fermented milks, yogurts, cheeses, and fermented meat products. Thus, different strains of commercial or scientific interest are commonly isolated. In this work, 32 strains of lactic acid bacteria were isolated and identified from the vegetable olives from different regions of Algeria. Lactobacilli represent 34.37% of the flora lactique.L species most dominant for this group is 63.63% Lactobacillus rhamnosus. Lactobacillus manihotivorans is also represented among the isolates 36.36%. Lactococci are represented by two species that are Lactococcus lactis subsp. Lactococcus lactis and 27.27%. lactis subsp. Diacetylactis 72.72%. The Enterococcus . Interaction studies revealed the ability of all strains to inhibit Staphylococcus aureus. Escherichia coli and have shown their ability to counter these two strains by the production of protein substances in the culture medium. Lactic acid bacteria isolated and identified show an ability to inhibit strains of Staphylococcus aureus, Escherichia coli by the production of protein substances (antimicrobial substances) in the culture medium. The proteolytic activity, has revealed that all the lactic strains possessed proteolytic activity. The lipolytic activity is found not all strains has a lipolytic activity. Finally the sensitivity of lactic acid bacteria tested, shows a sensitivity to all antibiotics Keywords: lactic acid bacteria, vegetable olives, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Escherichia coli. Antibiotic, antimicrobial substances, lipolytic, proteolytic activity. ملخص Résumé en arabe ملخص ذسرخذو تكدٌشٌا انهثٍُح نقشوٌ كؼايم وقائً فً األعؼًح انًخًشج .هزِ انثكرٍشٌا يىجىدج فً يجًىػح واسؼح يٍ انًىاد انغزائٍح يثم انحهٍة انًخًشج ،انضتادي ،وانجثٍ ،ويُرجاخ انهحىو انًخًشج .وتانرانً، ٌرى ػضل سالالخ يخرهفح ورنك ألسثاب ذجاسٌح أو ػهًٍح. فً هزا انؼًم ،ذى ػضل 32سالنح يٍ تكرٍشٌا انهثٍُح وانرً ذى ذحذٌذها يٍ ػصاسج انضٌرىٌ يٍ يُاعق يخرهفح يٍ انجضائش. انؼصٍاخ انهثٍُح ) (lactobacillesوذًثم ٪ 34،37يٍ انُثاذاخ انهثٍُح .أكثش األَىاع انسائذج فً هزِ انًجًىػح هى Lactobacillus rhamnosusتُسثح Lactobacillus manihotivorans .٪63،63وًٌثم ٌ.٪36.36رىاجذ َىػاٌ يٍ lactocoquesهً Lactococcus lactis subsp. lactis :تُسثح .٪27،27و lactococcus. lactis subsp. Diacetylactisتُسثح . ٪72، 72وانًؼىٌح انثشاصٌح ( . )Les entérococcus وكشفد دساساخ ذفاػم قذسج كم هزِ انسالالخ نًُغ Staphylococcus aureusو Escherichia coliوقذ ذثٍٍ أَها قادسج ػهى يىاجهح َىػاٌ يٍ انثكرٍشٌا ورنك تإَراج انًىاد انخاضؼح نهثشوذٍٍ فً انىسظ انًؼٍشً .حًض انالكرٍك انًؼضول و انًحذد ٌظهش قذسج ػهى يُغ أَىاع يٍ انًكىساخ انؼُقىدٌح انزهثٍح ( ،) Staphylococcus aureusو كىالي ( )Escherichia coliيٍ اَراج يىاد تشوذٍٍُح (انًىاد انًضادج نهًٍكشوتاخ) فً انىسظ انًؼٍشً َشاط تشوذٍىنرٍك( ، )protéolytiqueكشف نُا أٌ جًٍغ أَىاع انهثٍُك ذًرهك َشاط تشوذٍىنرٍك( .)protéolytiqueوقذ نىحظ َشاط ( )lipolytiqueفً جًٍغ انسالالخ انرً نٍس نذٌها َشاط ( .)lipolytiqueوفً االخٍش وتُاءا ػهى انذساسح انًخثشٌح نثكرٍشٌا حًض انالكرٍك واخرثاسها ذثٍٍ نُا أٌ نها حساسٍح نجًٍغ انًضاداخ انحٍىٌح. كلمات مفتاحية :انثكرٍشٌا انهثٍُح انًىسج lactobacilles ، lactocoques، staphylococcus،Esherichia coli ، المضادات الحيوية والمواد المضادة للميكروبات ،دهون ،النشاط بروتيه . sommaire SOMMAIRE Sommaire Remerciements Dédicace Résumé Résumé en anglais Résumé en arabe Sommaire Liste des abréviations Liste des tableaux Liste des figures Chapitre I Synthèse bibliographique Partie I Introduction ……………………………………………………………………………………1 1-généralistes sur la culture d’olive……………………………………………………………2 1.1. Les olives………………………………………………………………………………….2 1.2. Secteur oléicole en Algérie………………………………………………………………..3 2. l’extraction d’huile d’olive……………………………………………………………….….4 2.1. Opérations de réception …………………………………………………………….…….4 2.2. Broyage……………………………………………………………………………………4 2.3. Malaxage………………………………………………………………………………..…4 2.4. Séparation des phases…………………………………………………………………...…4 2.4.1. Séparation des phases liquides-solides ……………………………………………………….4 2.4.2. Séparation des phases liquides-liquides ………………………………………………………4 3. Les systèmes de séparation ………………………………………………….…………...…5 3.1. Le système discontinu………………………………………………………………....…..5 3.2. Les systèmes en continu à 3 et 2 phases …………………………………………………5 4. Sous produits de l’oléiculture……………………………………………………..…...........7 5. Problématique environnementale générée par les margines………………………...………8 5. 1. Origine des margines…………………………………………………………….……….8 5.2. Pollution par les margines…………………………………………………………………9 sommaire SOMMAIRE 6. Caractérisation physico-chimique des margines…………………………………...………..9 6. 1. Fraction minérale…………………………………………………………….…….……10 6.2. Fraction organique…………………………………………………………………….…12 6.2. 1. Sucres……………………………………………………………………………….…12 6.2.2-Composés azotés……………………………………………………………………..…12 6.2.3. Vitamines……………………………………………………………..……………..…12 6.2.4. Acides organiques…………………………………………………………………...…12 6.2. 5. Huiles……………………………………………………………………………….…12 6.2. 6. Composés phénoliques…………………………………………………………...……13 6.2. 6. 1. Les monomères phénoliques…………………………………………………..……13 6.2. 6. 2. Les polymères phénoliques…………………………………………………………15 7. Origine de la coloration des margines ……………………………………………….….…16 8. Caractérisation microbiologique des margines……………………………………….……17 8.1. La flore des olives………………………………………………………………….….…18 8.1. 1. Les bactéries…………………………………………………………….…………….19 ● Les Bacillus ……………………………………………………………………………………….…19 ● Les Enterobacter …………………………………………………………………………………….19 ● Les Pseudomonas ……………………………………………………………………………………19 8.1. 2. Les Levures……………………………………………………………………………20 8.1. 3. Les moisissures………………………………………………………………………..20 ● Le genre Aspergillus ………………………………………………………………………….…….20 ● Le genre Rhizopus ………………………………………………………………………….…….…20 9. traitements des margines…………………………………………………………………..21 9.1. Processus thermique………………………………………………………………...……21 9.1.1. Evaporation naturelle (lagunage)………………………………………………………21 9.1.2. Evaporation forcée…………………………………………………………………..…22 9.1.3. Incinération………………………………………………………………………….…22 9.1.4. Distillation…………………………………………………………………………...…22 9.1.5. Floculation/clarification……………………………………………………………..…22 9.1.6. Cryo-concentration………………………………………………………………..……23 9.2 Procédés physico-chimiques……………………………………………….......................23 9.2.1. Ultrafiltration/Filtration…………………………………………………………..……23 9.2.2. Ozonation………………………………………………………………………………23 9.2.3. Coagulation…………………………………………………………….........................23 sommaire SOMMAIRE 9.3 Procédés biologiques………………………………………………………………...……23 9.3.1. Traitements anaérobies………………………………………………………..…….…23 9.3.2. Traitements aérobies…………………………………………………………..….……24 10. Valorisation des margines…………………………………………………………...……25 10.1. Utilisation des margines comme fertilisant……………………………………….….…25 10.2. Utilisation des margines en compostage…………………………………………….….27 10.3. Récupération de quelques composants…………………………………........................27 10.4. Production de biogaz……………………………………………………………………28 10.5. Production des protéines d’organismes unicellulaires (POU)…………………….……28 10.6. Production d’enzymes……………………………………………………………..……29 10. 7. Epandage…………………………………………………………………………….…29 10. 8. Utilisation en alimentation animale……………………………………………………30 Partie II Les bactéries lactiques……………………………………………………………………..…32 1. Introduction……………………………………………………………………………...…32 2. Habitat…………………………………………………………………………………..….33 3. Classification…………………………………………………………………………….…34 3.1. Les coques lactiques………………………………………………………………...……35 3.1.1. Les genres Enterococcus, Lactococcus et Streptococcus …………………………………35 3.1.2. Le genre Leuconostoc……………………………………………………………………….…36 3.1.3.Le genre Pediococcus ……………………………………………………………………….…36 3.1.4. Le genre Lactobacillus……………………………………………………………………...….36 3.1.4.1. Les Lactobacilles homofermentaires stricts ……………………………....................36 3.1.4.2.Les Lactobacilles hétérofermentaires stricts …………………………………………37 3.1.4.3. Les Lactobacilles hétérofermentaires facultatifs ………………………………….…37 4. Utilisation industrielle des bactéries lactiques…………………………………………..…38 4.1. Activité acidifiante ……………………………………………………………………………….38 4.2. Production de métabolites d.intérêt ……………………………………………………………38 4.3. Propriétés enzymatiques ………………………………………………………………..……….38 4.4. Propriétés probiotiques………………………………………………………….......................38 4.5. Critères de performance…………………………………………………………………………39 5. les probiotiques………………………………………………………………………….....39 5.1. Définition des probiotiques………………………………………....................................39 5.2. Quatre grands groupes de probiotiques ………………………………….........................39 sommaire SOMMAIRE A) Les ferments lactiques……………………………………………………….……………39 B) Les bifidobactéries …………………………………………………….............................39 C) Les différentes levures de type Saccharomyces …………………………………………….…40 D) Les autres bactéries sporulées, dont Bacillus subtilis et cereus………………………………40 5.3. Les probiotiques pour lutter contre les bactéries pathogènes……………………….……40 5.4. Les amines biogènes…………………………………………………………..................41 5.4.1. Rôle des amines biogènes …………………………………………………………..…42 5.4.2. Toxicité des amines biogènes …………………………………………………………42 5.4.3. Les bactéries impliquées dans la production des amines biogènes……………………43 Chapitre II Matériels et méthodes 1 .Isolement des souches de bactéries lactiques ………………………………………...……44 1.1. Provenances des échantillons …………………………………………………...……….44 1.2. Milieux des cultures...........................................................................................................44 1.3. Isolement et purification des souches……………………………………………………44 2. Conservation des souches …………………………………………………………………45 3. identification des souches bactérienne …………………………………………….………46 3.1. Critères morphologiques………………………………………………………….….…..46 L’examen microscopique ……………………………………………………….……46 Test de mobilité……………………………………………………………..………...46 3.2. Critères biochimiques et physiologiques……………………………………..………….47 3.2.1. Hydrolase de l’arginine………………………………………………………..……….47 3.2.2. Effet de la température sur la croissance…………………………………….…………47 3.2.3. pH de croissances…………………………………………………………………...….47 3.2.4. Croissance milieu en hypersalé…………………………………………………….….47 3.2.5. Le lait de Sherman……………………………………………………………………..47 3.2.6. Recherche du type fermentaire…………………………………………………………48 3.2.7. L’utilisation du citrate…………………………………………………………….……48 3.2.8. Esculine………………………………………………………………………..….……48 sommaire SOMMAIRE 3.2.9. La production d’acétoine………………………………………………………………49 3.2.10. L’utilisation des carbohydrates…………………………………………….…………49 4. Caractérisation technologiques…………………………………………………….………50 4.1. Etude de la cinétique……………………………………………………………………..50 4.2. Protéolyse ………………………………………………………………………..………51 4.3. Recherche de l’activité lipolytique sur Agar au tween80………………………….…….51 5. Probiotiques ……………………………………………………………………………….52 5.1. Resistance au pH acide …………………………………………………………...……..52 5.2. Test d’hémolyse………………………………………………………………...………..52 5.3. Resistance aux sels biliaires ……………………………………………………………..52 5.4. Antibiogramme……………………………………………………………………..……53 5.5. Les interactions…………………………………………………………………………..53 5.5.1. Interactions entre les bactéries lactiques………………………………………...……..53 5.5.2. Interaction par méthode directe (méthode de double couche) ………………….……..54 5.5. 3.Méthode indirecte………………………………………………………………….…..54 Détermination de la nature de l’agent inhibiteur…………………………………………………..55 a- inhibition due à l’acide lactique………………………………………………………..…..55 b- recherche de la nature protéique de la substance antimicrobienne……………...…………55 c-Effet de la température……………………………………………………………….……..56 Chapitre III Résultat et discutions 3.1.Résultat................................................................................................................................57 3.1.1. Isolement et identification des bactéries lactiques………….…………………..…..….57 Le lait de Sherman.........................................................................................................59 L’utilisation du citrate....................................................................................................60 Esculine..........................................................................................................................60 La production d’acétoine................................................................................................61 Recherche du type fermentaire.......................................................................................61 sommaire SOMMAIRE 3.1.2. Caractérisation technologiques………….………………….………………………….64 Etude de la cinétique......................................................................................................64 Protéolyse et lipolyse Resistance au pH acide et d’hémolyse……………………………………………...…67 Étude des interactions bactériennes ...............................................................................68 Étude des interactions entre les bactéries lactiques …………………………….……..68 Les interactions et la recherche de la nature de l’agent inhibiteur ……………………69 Détermination de l’agent inhibition (méthode indirecte)……………………….….… 70 Resistance aux sels biliaires...........................................................................................72 Antibiogrammes.............................................................................................................74 Discussion générale…………………………………………………………………...………77 Conclusion……………………………………..………………………………….………….79 Références bibliographiques……………………...…………………………………..………80 Annexes milieux de culture…………………………………………………..………………95 . Lb. : Lactobacillus Sc. : Streptococcus Lc :Leuconostoc Cl : Clostridium H : Heures PH : Potentiel d’hydrogène °C : Degré Celsius °D : Degré dornic % : pourcentage min : Minute S : Seconde L : Litre ml : Millilitre g : Gramme µg : Microgramme mg : Milligramme mm: Millimètre µm: Micromètre cm : centimètre KJ: Kilo joule Kcal: Kilo calorie Kg : kilo gramme Pa: Pascal Abs : Absence ND : Non déterminé Ind : Indénombrable UFC : Unité Formant colonies LISTE DES ABREVIATIONS . LISTE DES ABREVIATIONS Gr : Grossissement ADH : Arginine dihydrolase BCP: Pourpre de bromocrésol Na Cl : Chlorure de sodium Na OH : Hydroxyde de sodium H Cl : Acide chlorhydrique H2O2 : Peroxyde d’hydrogène H2O : Hydroxyde d’hydrogéne CO2 : Dioxyde de carbone J.O.R.A : Journal Officiel de la République Algérienne FIL : Fédération International du Lait O.M.S.: Organisation Mondiale de Santé F.A.O.: Food and Agriculture Organization UHT : Ultra haute température GC: Guanine Cytosine MG: Matière grasse POU : Production des protéines d’organismes unicellulaires DCO : Demande Chimique en Oxygène DBO : Demande Biologique en Oxygène O3 : M : mètre LiP : la lignine peroxydase MnP : la manganèse peroxydase HPLC : chromatographie liquide à haute performance CPG V : volume MES ;matière en suspension Zn :Zinc ELL : L’extraction liquide-liquide . LISTE DES ABREVIATIONS ATP: adenosine triphosphate peptidoglycanes (PTG) ADN :nicotinamide adenine dinucléotide MH: Muller Hinton KMK: Kempler Mac Kay MRS: Man Rogosa Sharp MRS BCP: Man Rogosa Sharp additionné de pourpre de bromocrésol LISTES DE TABLEAUX Liste des tableaux Tableau 1. Composition chimique de d’olive (BIANCHI, 1999)……………………………..3 Tableau.2: Conséquences environnementales des rejets de margine dans le milieu naturel………………………………………………………………………………………..…9 Tableau3: Principales composantes des margines (Lutwin et al., 1996)………………...…..10 Tableau4: Composition minérale des margines (Salvemini, 1985)……………………….…11 Tableau 5 : Constituants minéraux des margines (Lutwin et al., 1996)……………….…….11 Tableau 6: Teneur de quelques composés phénoliques identifiés dans les margines (Balice et al.,1984)………………………………………...………………………………………..…...14 Tableau 7. Structure des composantes phénoliques rencontrés dans les margines………………………………………………………………………………….…15 Tableau 8. Levures pour la production de protéines d’organismes unicellulaire à partir des effluents d’huileries d’olive (Hamdi, 1993)…………………………………………………..29 Tableau 9 : Composition chimique de la pâte des margines obtenue par le procédé Dalmolive (Martilotti, 1993)………………………………………………………..…………………….31 Tableau10. Les différents genres de bactéries lactiques………………………………….….35 Tableau11. Classification des lactobacilles selon ORLA- JENSEN (1919)…………….…...37 Tableau 12 : microorganismes considérés comme probiotiques (d’après Hozalpfel et al ., 1998)……………………………………………………………………………………….…40 Tableau 13 : principales amines biogènes trouvée dans les produites alimentaires (ten Brink et al., 1990)……………………………………………………………………………..….…41 Tableau 14 : les caractéristiques biochimiques, physiologiques des souches de lactobacilles isolées………………………………………………………………………………………....62 Tableau 15 : les caractéristiques biochimiques, physiologiques des souches de lactocoques isolées…………………………………………………………………………………………63 Tableau 16: Activités protéolytiques chez les lactobacilles et lactocoques…………..……67 LISTES DE TABLEAUX Tableau 17. Résultat de la résistance les lactobacilles à déférentes PH (0.1.2)………...……68 Tableau18: l’interaction entre les bactéries lactiques………………………………………..69 Tableau19. Activité antimicrobien de lactobacille vis–à-vis staphylococcus aureus et Escherichia coli on utilisant milieu tamponné traité avec la chymotrypsine et température 100°C…………………………………………………………………………………………71 Tableau 20: Nombres des colonies caractéristiques de Lactobacilles sur MRS……...…….73 Tableau21: Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles……………………….…75 LISTE DES FIGURES Liste des figures Figure 1. Coupe schématique du fruit de l’olive (Bianchi, 1999)……………………….……2 Fig.2 : Principaux pays producteurs d’huile d’olive en 2001 [Sourcehttp://www.internationaloliveoil.org/downloads/production1.PDF]…………………..3 Figure3: Procédés d’obtention d'huile d'olive (Centre d’Activités Régionales pour la Production Propre, 2000)………………………………………………………………………5 Figure4: Système de centrifugation à 2 et à 3 phases (Alburquerque et al., 2004)………..…6 Figure.5 : grignon et margine…………………………………………………………………7 Figure 6. Schéma montrant l’arbre phylogénique basée sur la comparaison du gène de l’ARN 16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentage CG et la relation lointaine avec les germes à gram positif de haut pourcentage CG du genre Bifidobacterium et propionibacterium (Holzapfel et al., 2001)…………………………………………………..32 Figure 7 formations d’histamine à partir de l’acide aminé histidine au travers de la dégradation enzymatique du groupe acide (décarboxylation)…………………………..……43 Figure 8. Schéma de conservation longue durée des bactéries lactiques purifiées (Saidi et al. 2002)……………………………………………………………………………………...…..46 Figure 9: schéma représentant le mini préparation pour le test de la fermentation des sucres……………………………………………………………………………………...…..50 Figure 10. Instruments pour la mesure de l’acidité titrable…………………………….……51 Figure 11 : Les différentes méthodes utilisées pour la recherche de substances antimicrobienne. (a) méthode de la double couche, (b) méthode de diffusion en puits………………………………………………………………………………………...…55 Figure12.Aspect macroscopique des colonies de bactéries Lactiques sur MRS +CaCo3 solide………………………………………………………………………………………….57 figure13. Aspect macroscopique des colonies de bactéries lactiques sur MRS acidifiées solide………………………………………………………………………………………….57 Figure14. Purification des souches de Lb sur milieu lait MRS solide écrémé agar………..57 figure15. Purification des souches lactocoque sur milieu MRS……………………………..57 Figure 16. Aspect microscopique de La souche Lactobacilles Gram et observation au G x100)…………………………………………………………………………………..….. …58 LISTE DES FIGURES Figure 17. Aspect microscopique de La souche lactocoque Gram et observation au G x100)………………………………………………………………………………………….58 Figure 18. Test de l’hydrolyse de l’arginine…………………………………………...…….58 Figure 19. Résultats de test Sherman à 1% entérocoques……………….……………...….59 Figure 20. Résultats de test Sherman à 3% lactocoques..........................................................59 Figures 21. La révélation de l’utilisation de citrate par l’apparition des colonies de contour bleu sur milieu KMK des souches………………………………………………………...….60 Figures 22. Résultat de dégradation de l’esculine…………………..…………..……..…….60 Figure 23. Le résultat du teste des sucre chez les lactobacilles…………………………….……61 Figure 24. Le résultat du teste des sucre chez les lactocoques……………………………..……61 Figure 25: Répartition des différents groupes de bactéries lactiques des souches de bactéries lactiques isolées du margine d’olive……………………………………………….…………64 Figure 26. L’évolution de pH des souches Lb3, Lb1, Lb6 Lb8, Lb9, Lb4dans lait écrémé avec extrait de levure………………………………………….……………………………………65 Figure 27. L’évolution de pH des souches Lb2, Lb5, Lb10, Lb7, Lb11 dans lait écrémé avec extrait de levure……………………………………………………………………………….65 Figure 28. L’évolution de l’acidité titrable des souches Lb3, Lb1, Lb6, Lb8, Lb9, Lb4 dans lait écrémé avec extrait de levure……………………………………………….……….……66 Figure 29. L’évolution de l’acidité titrable des souches Lb2, Lb5, Lb10, Lb7, Lb11 dans lait écrémé avec extrait de levure…………………………………………………....……………66 Figure 30. Activités protéolytiques. …………………………………………………………67 Figure 31. Inhibition de staphe par les lactobacilles en utilisant la méthode directe……………………………………………………………………………………..….69 Figure 32. Activité antimicrobien de lactobacille vis–à-vis staphylococcus aureus et Escherichia coli on utilisant milieu tamponné traité avec la chymotrypsine et température……………………………………………………………………………………72 Figure33. Nombres de colonies caractéristiques de Lactobacilles sur MRS………………………………………………………………………………………..…72 Figure34. Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles Lb5……………………………………………………………………………………………………..…76 Figure 35. Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles Lb8……………………………………………………………………………………………………….76 LISTE DES FIGURES Chapitre I SYNTHESE BIBLIOGRAOHIQUE Chapitre I : Synthèse bibliographique Synthèse bibliographique Partie I MARGINES D’OLIVES Partie I : margines d’olives Synthèse bibliographique CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Introduction : L‟industrie oléicole est une activité importante, concentrée principalement dans les pays du bassin méditerranéen, qui tiennent approximativement 95% de la production mondiale, dont 1% produit par l‟Algérie en 2001. Comme toutes les industries agro-alimentaires, l‟opération d‟extraction nécessite de grandes quantités d‟eau, par conséquent cette industrie engendre d‟importantes quantités d‟effluents liquides (les margines). Les margines, ou eaux de végétation, sont des rejets liquides très riches en matières organiques (composés phénoliques, lipides), souvent répandues en l‟état dans la nature, de manière incontrôlée sur les sols agricoles ou parfois stockées provisoirement dans des cuves, exposant ainsi les systèmes eau-sol-plante, a une pollution inéluctable. Différents traitements d‟épuration leurs sont appliqués : biologiques, physiques chimiques. Coûteux et encore insuffisants, ces traitements consistent tous à réduire leur impact sur l‟environnement. L‟objectif de cette étude l'isolement des bactéries lactiques à partir du margines d‟olives fermentes à leur identification selon les critères morphologiques, physiologiques et biochimiques, biotechnologiques. 1 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 1-généralistes sur la culture d’olive 1.1. Les olives Le fruit de l‟olivier est une drupe de forme ovoïde ou ellipsoïde. Il est constitué : -d‟épicarpe : la pellicule qui recouvre le fruit. -de mésocarpe : la partie charnue appelée pulpe, riche en lipides dont la taille reste variable selon les variétés. -d‟endocarpe : le noyau fusiforme, constitué d‟une amande ayant une texture rigide, protégeant une seule graine à albumen huileux cellulaire (Figure 1). La forme de l‟olive est variable et caractéristique de la variété. Au cours de la maturation du fruit, le mésocarpe passe de la couleur vert tendre (olive verte) à la couleur violette ou rouge (olive tournante) et en fin de maturité à la coloration noirâtre (olive noire) (Bianchi, 1999). La composition chimique de l‟olive est constituée principalement d‟eau, de polysaccharides, d‟huile et d‟autres composés sous forme de traces (Tableau 1). Malgré leur faible représentation, ces composés ont une très grande importance, car ils vont d‟une part, conférer à l‟huile une grande Partie de ses qualités gustatives et nutritionnelles, et d‟autre part, la stabiliser. Péricarpe Mésocarpe Endocarpe Tégument Cotylédon Albumen Embryon Figure 1. Coupe schématique du fruit de l‟olive (Bianchi, 1999) 2 de la graine CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Tableau 1. Composition chimique de d‟olive (BIANCHI, 1999) Eau Polysaccharides a Huiles Mono- et disaccharides Cires, triterpènes, phénols Autres composés b 48% 27% 21% 3% 1% Traces a: hémicellulose, cellulose, pectines ; b: alcanes, alkyl-esters, methyl-phenyl-esters, sterylesters, aldéhydes, alcools, stérols, triterpénoïdes polycycliques et acides gras à très longue chaîne carbonée 1.2. Secteur oléicole en Algérie Le patrimoine oléicole mondial compte actuellement environ 750 millions d‟oliviers cultivés sur une superficie de 9,23 millions d‟hectares. Les pays méditerranéens comptent 715 millions d‟oliviers sur une superficie d‟environ 8.16 millions d‟hectares, soit 95 % du patrimoine oléicole mondial (El hajjouji, 2007; Fiorentino et al., 2003;Tsagarikiet al., 2007 ). L‟Algérie fait partie des principaux pays méditerranéens dont le climat est des plus propices à la culture de l‟olivier. Elle se positionne après l‟Espagne, l‟Italie, la Grèce et la Tunisie qui sont par ordre d‟importance, les plus gros producteurs d‟huile d‟olive (Tsagarikietal., 2007). Le patrimoine oléicole algérien est estimé à 32 millions d‟oliviers, ce qui représente 4,26% du patrimoine mondial. La production annuelle en huile a atteint 35.000 tonnes et celle de l‟olive de table 80.000 tonnes (Bensemmane, 2009). En 2001 La production d‟huile d‟olive se concentre principalement dans les pays du pourtour méditerranéen : Espagne, Italie, Grèce, Turquie, Syrie, Tunisie et Maroc. La production de ces pays représente 94% de la production mondiale. Atteignait les 2.5 millions de tonnes. (Benyahia etZein., 2003). (figure. 2) Fig. 2: Principaux pays producteurs d‟huile d‟olive en 2001 [Source : http://www.internationaloliveoil.org/downloads/production1.PDF] 3 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE L‟huile d‟olive vierge peut être considérée comme le jus de fruit d‟olive directement consommable, obtenue par des procédés mécaniques et physiques et dans des conditions appropriées pour ne pas altérer l‟huile. Pour cela l‟industrie d‟huile d‟olive est une activité économique importante de plusieurs pays, particulièrement, ceux du bassin méditerranéen. En revanche cette industrie génère des quantités importantes d‟effluent liquide (margines), qui présente un véritable problème environnemental. 2. l’extraction d’huile d’olive La production d‟huile d‟olives a toujours été le principal objectif de la culture de l‟olivier. Les méthodes d‟extraction ont évolué mais, le processus d‟extraction d‟huile d‟olives reste toujours le même. Il inclut quatre opérations principales : les opérations de réception, et le broyage le malaxage, la séparation des phases liquides ; huile et eau (Chimi, 1997)et système discontinu de pression, système Continu à 3 phases et à 2 phases. 2.1. Opérations de réception Sont les opérations préliminaires de nettoyage et de lavage des olives (éliminer des impuretés adhérentes à l‟olive), et de stockage et qui ont pour objectif de préparer les olives pour la suite de procédé. 2.2. Broyage Cette opération consiste à la dilacération du tissu des olives pour libérer les gouttelettes d‟huile contenues dans les vacuoles à l‟intérieure des cellules d‟olives. 2.3. Malaxage Il consiste en un broyage lent et continu de la pâte d‟olive préalablement chauffée. Il a pour but de libérer le maximum d‟huile en brisant les vacuoles qui sont restées entières durant la phase précédente et d‟amasser les gouttelettes d‟huile en gouttes plus grosses. 2.4. Séparation des phases Cette opération consiste à : 2.4.1. Séparation des phases liquides-solides : Le broyage et le malaxage aboutissent à la formation d‟une pâte qui contient de la matière solide et des fluides. La matière solide appelée grignon est formée de débris de noyaux, d‟épiderme, de parois cellulaires…etc., alors que la partie fluide est composée d‟huile et d‟eau de végétation appelée margine. 2.4.2. Séparation des phases liquides-liquides : La séparation entre la phase aqueuse de la phase huileuse se fait essentiellement par simple décantation ou par centrifugation. Elle est basée sur la différence de densité entre l‟huile d‟olive et l‟eau de végétation. 4 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 3. Les systèmes de séparation Les systèmes de séparation utilisés sont trois : système discontinu de pression, système continu à 3 phases et à 2 phases (figure3). Figure3: Procédés d‟obtention d'huile d‟olive (Centre d‟Activités Régionales pour la Production Propre, 2000). 3.1. Le système discontinu C‟est l‟unique procédé traditionnel d‟obtention d‟huile d‟olive, utilisé depuis 20 à 30 ans. Ce sont les systèmes classiques par pression avec broyeurs. Le broyage des olives suivi du malaxage se font sous des meules. Une pâte est obtenue au bout d‟une demi-heure environ. Elle est composée de grignon et un moût contenant l‟huile et les margines. La séparation des deux phases solide-liquide se fait par simple pression, alors que l‟huile est séparée des margines par décantation naturelle. 3.2. Les systèmes en continu à 3 et 2 phases Les systèmes en continu à 3 et 2 phases sont les plus récents, ils utilisent des centrifugeuses pour la séparation de la pâte. 5 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Dans le système à 3 phases, la quantité d‟eau ajoutée dans le malaxeur est supérieure à celle du système traditionnel (entre 80 -100 l/100kg d‟olive), et la production des margines est très importante (Martinez-Garcia et al., 2006). Pour le système écologique à 2 phases, il ne nécessite pas d‟ajout d‟eau pour le processus d‟extraction mais il y a génération de grignon humide (Centre d‟Activités Régionales pour la Production Propre, 2000). Dans les deux cas, le grignon contient des polyphénols (Martinez-Garcia et al., 2006). La figure 4présente un bilan comparatif des deux systèmes continus. Olives (1000 Kg) 0,1- 0,12 m3 Lavage (à froid) Broyage et malaxage Eau chaude 0,6- 1,3 m3 Centrifugation (Décanteur à 3 phases) Grignon (~ 550 Kg) Eau de lavage Lavage d‟huile/récupération Margine 1-1,6 m3 D‟huile dans la phase liquide Huile d‟olive (≈ 210Kg) Système à 3 phases Olives (1000 Kg) 0,1- 0,12 m3 Lavage (à froid) Broyage et malaxage Centrifugation (Décanteur à 2 phases) Eau de lavage Grignon (~ 800 Kg) Lavage d‟huile/récupération D‟huile dans la phase liquide Margine 0.2m3 Huile d‟olive (≈ 200Kg) Système à 2 phases Figure4: Système de centrifugation à 2 et à 3 phases (Alburquerqueet al., 2004). 6 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4. Sous produits de l’oléiculture L‟industrie oléicole, en plus de sa production principale qui est l‟huile (l‟huile d‟olive vierge et l‟huile de grignon), engendre la production de deux résidus : un liquide et l‟autre solide (Nefzaoui, 1991). - Margines ou eaux de végétation : sont des effluents liquides, parfois nommés alpechine (Ramos-Cormenzanaet al., 1995).Le pressage de 1 tonne d‟olives produit en moyenne 1,5 tonnes de margines avec les modes de production modernes(Benyahiaet al.,2003). - Grignons ou tourteaux d‟olive : sont des résidus solides issus de la première pression ou centrifugation, ils sont formés des pulpes et des noyaux d‟olives. Ce produit peut être ans formé en un produit destiné à l‟alimentation animale ou en huile dite : grignons d‟olive après extraction chimique (Chiofaloet al.,2004 ;Martin-Garciaetal., 2003.)(figure.5). Grignon Margine Figure.5 : grignon et margine 7 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 5. Problématique environnementale générée par les margines 5. 1. Origine des margines Le processus de trituration des olives produit principalement l‟huile d‟olive vierge et l‟huile de grignon (huile secondaire extraite par des solvants organiques) et engendre deux résidus l‟un liquide, les margines et l‟autre solide, les grignons. Les olives contiennent environ 20% d‟huile, 30% de grignons et 50% d‟eau de végétation (Di-Giovacchinoet al., 1988 ; Hamdiet al., 1992). Les margines sont composées de 40 à 50% de l‟eau végétal qui provient du fruit (olive) et le reste de l‟eau de fabrication ajoutée lors du processus de trituration (Nefzaoui, 1987 ; DiGiovacchino, 1996). 5.2. Pollution par les margines Les margines sont considérées parmi les effluents les plus polluants des industries agroalimentaires, et lorsqu‟elles sont déchargées dans la nature sans aucun traitement, elles causent de sérieux dégâts environnementaux. Leur pouvoir polluant est dû principalement à des causes diverses, parmi lesquelles : 1. Le pH : qui est la première cause directe de la mort des poissons, lorsque la margine est déversée dans les lits des fleuves (Centre d‟Activités Régionales pour la Production Propre, 2000). 2. Le contenu organique qui contribue à la consommation de l‟oxygène dissous (Centre d‟Activités Régionales pour la Production Propre, 2000) et empêche les eaux d‟autoépurer, et la pollution peut s‟étendre sur de très longues distances (Benyahiaetal., 2003). 3. La teneur en matière grasse provoque la formation d‟une couche à la surface de l‟eau empêchant sa correcte oxygénation et le passage de la lumière et faisant obstacle au développement normal de la faune et la flore au sein des fleuves (Centre d‟Activités Régionales pour la Production Propre, 2000). Les acides gras et leurs dérivés inhibent les bactéries sporulées de sol (Nefzaoui, 1991). 4. La présence des composés phénoliques inhibe le développement des micro-organismes aussi bien en présence et en absence d‟oxygène (Nefzaoui, 1991). Ces substances, ont un effet phytotoxique et une activité antimicrobienne (Khoufietal., 2007 ; Khoufiet al.,2007 ) et présentent un faible niveau de biodégradabilité. Pour ces raisons, les traitements biologiques ne peuvent pas être appliqués pour ce type d‟effluent (Pharm Minh etal.,2006). 8 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Le tableau.2, résume les conséquences de ces rejets non seulement sur l‟environnement, mais aussi au niveau des stations d‟épuration et égouts. Tableau.2: Conséquences environnementales des rejets de margine dans le milieu naturel. Cause - composés phénoliques - acidité - huiles et matières grasses - MES Sols Espèces aquatiques -matières organiques - huile et MG - MES - composes phénoliques Egouts - acidité - MES Station d’épuration des eaux usées - acidité - MES - huile et matière grasse - matières organiques - polyphénols Effet - sols obturés et suffoqués - mauvaise odeur - pollution de l‟aquifère - coloration des eaux naturelles - effet phytotoxique sur la population microbienne -augmentation de la demande en O2 - formations des croûtes - dégradation de l‟esthétique - toxicité de la microflore - la corrosion des matériaux - destruction de l‟écoulement - putréfaction - perturbation persistances de l‟activité des boues - perturbation de l‟activité des digesteurs des boues à cause de l‟aspect saisonnier Référence Kestioğlua et al., 2005 Bousdira, 2004 Kestioğlua et al., 2005 Kestioğlua et al., 2005 Amirante et Di Renzo., 1991 Bousdira, 2004 Bousdira, 2004 Bousdira, 2004 Office National des Produits Oléicoles du Centres, 1997 Bousdira, 2004 Bousdira, 2004 6. Caractérisation physico-chimique des margines Les margines se présentent comme un liquide résiduel aqueux, de couleur brune rougeâtre à noire avec une forte odeur d‟olive et un aspect trouble (Ranalli, 1991a). Leur pH est acide (4 - 5,5) avec un fort pouvoir tampon et une odeur fétide qui se développe au fur et à mesure que les margines vieillissent (Ranalli, 1991a ; Hamdi, 1993c ; Mouncifet al., 1993a). Elles ont généralement une forte salinité due à l‟ajout important de sel pour la conservation des olives (conductivité supérieure à 10 mS.cm-1) (Zenjariet al., 1999 ; Tsioulpaset al., 2002). La composition des margines a été étudiée par plusieurs chercheurs et comporte approximativement 83 à 94% d‟eau, 4 à 16% de matières organiques et 0,4 à 2,5% de substances minérales (Ramos-Cormenzana, 1986 ; Ranalli, 1991a). La caractérisation physico-chimique des margines est généralement tributaire des techniques et des systèmes d‟extraction de l‟huile d‟olives, elle diffère d‟un pays à l‟autre (Khoufiet al .,2007).En général, les margines contiennent une variété de composés organiques et minéraux, de nature et de concentration très différentes. Cette variation est due essentiellement aux facteurs suivants (Karapinaretal., 1983 ; Bambalovet al., 1989): − Stade de maturation des olives, − Conditions climatiques, 9 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE − Variété des oliviers, − Système de culture, − Situation géographique, − Temps de stockage des olives avant la trituration, − Techniques et lieu de stockage, − Nature de conservation des olives, − Procédé d‟extraction d‟huile d‟olive qui représente l‟élément le plus important (DeFelice et al., 1997 ; Ramos-Cormenzana, 1986 ; Annakiet al., 1999b). Les analyses menées sur les margines peuvent nous renseigner sur les intervalles de variation de leurs différents composants chimiques (Fiestas Ros de Ursinosetal., 1992 ; Lutwinet al., 1996).(tableau 3) Tableau3:Principales composantes des margines (Lutwinet al., 1996) Composant Matière sèche Matières minérales Sucres divers Graisses et huiles diverses Composés phénoliques Azote organique % en poids de la matière fraîche 1,4-17 10-15 30-50 12-35 5,0-25 <10% 6. 1. Fraction minérale Les margines contiennent des quantités significatives en sels minéraux (Ranalli, 1991a) dont 80% sont solubles (phosphates, sulfates et chlorures) et 20% insolubles (carbonates et silicates). D‟après Fiestas Ros de Ursinoset al .,(1992), les éléments les plus représentatifs sont le potassium (47%), les carbonates (21%), les phosphates (14%) et le sodium (7%). La fraction minérale a été analysée par Salvemini (1985). Le tableau 4 regroupe les concentrations de ces éléments. 10 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Tableau4:Composition minérale des margines (Salvemini, 1985). Elément Concentration (mg.l-1) Orthophosphates (po4-3) Chlorures (Cl-) Sulfate (SO4-2) Sodium (Na+) Potassium (K+) Calcium (Ca2+) Magnésium (Mg2+) Fer (Fe) Aluminium (Al) Chrome (Cr-) Nickel (N) Cobalt (Co) Manganèse (Mn) Cadmium (Cd) Oxyde de silicium (SiO2) Zinc (Zn) 800,6 270,2 16,68 5370,9 15295,5 1167,6 410,3 103,4 8,34 0,66 3,36 1,33 1,66 0,83 41,7 10,0 Ce tableau montre que les margines sont riches en phosphore, sodium, potassium et calcium. Par conséquent elles peuvent être utilisées comme fertilisants des terres agricoles (Buldiniet al., 2000 ; Capassoet al., 2002a, 2002b). La composition minérale des margines a été aussi étudiée par Lutwinet al. (1996).Le tableau 5montre les valeurs des éléments minéraux en % du poids de la matière sèche. Tableau 5 : Constituants minéraux des margines (Lutwinet al., 1996). Elément Valeur en % du poids de la matière sèche Potassium (K2O) Calcium (CaO) Phosphore (P2O5) Magnésium (MgO) Sodium (Na2O) 5-15 0,2-2,5 0,5 3,0 <1% 6.2. Fraction organique Les margines comportent deux fractions organiques : − Fraction insoluble constituée essentiellement de pulpes d‟olives. Cette fraction représente les matières en suspension et colloïdales (Hamdi, 1991a). 11 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE − Fraction soluble dans la phase aqueuse et contient les sucres, les lipides, les acides organiques et les composés phénoliques (Hamdi, 1991a). 6.2. 1. Sucres Les études effectuées sur les margines par Hamdi (1993a) ont montré que la teneur en glucides varie entre 2 et 8% du poids de la pulpe d‟olive fraîche. Les glucides rencontrés dans les margines contiennent principalement des composés lignocellulosiques et des pectines qui représentent respectivement 3% et 0,6% (Fernandez Diaz, 1983). La présence d‟autres sucres simples tel que : glucose, saccharose, mannose, arabinose, raffinose et xylose a été également signalée par Salvemini (1985). 6.2.2-Composés azotés La fraction azotée est représentée principalement par les protéines avec une concentration variant entre 1,2 et 2,4% (p/v). Presque tous les acides aminés sont présents dans les margines. Les plus abondants sont l‟acide aspartique, l‟acide glutamique, la proline et la glycine (Salvemini, 1985 ; Ranalli, 1991a ; Capassoet al, 2002a). 6.2.3. Vitamines Plusieurs vitamines ont été identifiées. Les plus fréquentes sont les vitamines du groupe D et la vitamine PP avec une concentration de 124 mg.kg-1 de margines (Salvemini, 1985). Cette teneur peut être exploitée à l‟échelle industrielle. 6.2.4. Acides organiques La proportion des acides organiques présente dans les margines varie entre 0,5 et 1,5% (p/v). Les principaux acides organiques rencontrés sont les acides fumarique, glycérique, lactique, malique et malonique (Fiestas Ros de Ursinos, 1981 ; Salvemini, 1985). 6.2. 5. Huiles La concentration d‟huile résiduelle contenue dans les margines est très variable selon le procédé d‟extraction utilisé. Elle varie entre 0,02 et 1% (v/v) (Fiestas Ros de Ursinosetal .,1992). L‟acide oléique est l‟acide gras le plus abondant avec un pourcentage de 65% par rapport à la totalité d‟huile (Ranalli, 1991a). 6.2. 6. Composés phénoliques Les composés phénoliques des margines sont très divers et leur structure est très variable. Ils proviennent de l‟hydrolyse enzymatique des glucides et des esters de la pulpe 12 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE d‟olive au cours du processus d‟extraction. Leur solubilisation dans l‟huile est cependant bien inférieure à celle dans les eaux de végétation, ce qui explique leur concentration élevée détectée dans les margines (Ranalli, 1991a). Les caractéristiques organoleptiques de l‟huile d‟olive vierge dépendent de la présence des composés phénoliques et des substances volatiles (Vazequez, 1978). La teneur en composés phénoliques dans les margines dépend du système d‟extraction de l‟huile d‟olive (Annakiet al., 1999b). En général, elle varie entre 3 et 5 g.l-1 (Feniceet al., 2003) et elle peut même dépasser les 9 g.l-1 (Aissamet al., 2002). Plus de 50 composés phénoliques et plusieurs alcools ont été identifiés (Casa et al., 2003). La composition des margines en composés phénoliques diffère aussi selon la procédure d‟extraction et la variété d‟olive traitée (RamosCormenzana, 1986). 6.2. 6. 1. Les monomères phénoliques Plusieurs monomères aromatiques ont été identifiés dans les margines par des techniques de chromatographie (HPLC ou CPG). Ils sont représentés essentiellement par des acides et des alcools phénoliques. - Acides phénoliques Les acides phénoliques sont les monomères les plus abondants dans les margines, ce qui explique leur acidité. Plusieurs acides phénoliques ont été identifiés dans différents types de margines : - Acide caféique (Borjaet al., 1995a). - Acide p-coumarique(Borjaet al., 1995a). - Acide protocatéchuique(Borjaet al., 1995a). - Acide vanillique(Borjaet al., 1995a). - Acide 4-hydroxyphénylacétique (Borjaet al., 1995a). - Acide syringique(Borjaet al., 1995a). - Acide p-hydroxybenzoique(Borjaet al., 1995a). - Acide vératrique(Martinez et al., 1992). - Alcools phénoliques Parmi les alcools phénoliques les plus rencontrés dans les margines, nous citons : - 4-Hydroxyphényléthanol (Cichelli et al., 1984). - 3,4-dihydroxyphényléthanol (Borjaet al., 1995a), appelé aussi hydroxytyrosol. - 4-hydroxyphényléthanol (tyrosol) (Borjaet al., 1995a). - Syringaldéhyde(Borjaet al., 1995a). 13 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Ces alcools peuvent être parfois liés à des glucosides comme le 4-diglucoside β (3,4dihydroxyphényl) éthanol. - Autres composés phénoliques : (Wagner et al., 1984 ; Capasso, 1997) D‟autres composés phénoliques monomères ont été identifiés : - Oleuropéine - L-caféyl- glucose - Apégine - Lutéoline L‟oleuropéine est très abondant dans les margines et se caractérise par un goût amère, elle peut atteindre jusqu‟à 2% du poids d‟olives (Wagner et al., 1984). Les composés phénoliques sont essentiellement contenus dans la fraction soluble desmargines. Baliceet al .,(1984) ont quantifié certains composés phénoliques des margines par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (tableau6). Tableau 6:Teneur de quelques composés phénoliques identifiés dans les margines (Baliceetal., 1984). Composé phénolique Teneur en mg.l-1 - Acide vanillique - Acide 4-hydroxyphénylacétique - Acide syringique - Acide vératrique - Acide 3,4,5- triméthoxybenzoïque 242 145 710 500 80 14 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Tableau 7. Structure des composantes phénoliques rencontrés dans les margines. Composés phénoliques Structure Références Acide cafféique D‟Annibale et al.,2004 ; El Hajjouji et al., 2007 Acide p-coumarique D‟Annibale et al., 2004 ; El Hajjouji et al., 2007 Oleuropéine El Hajjouji et al.,2007 Hydroxytyrosol Fki et al., 2005 ; Ergül et al., 2009 Tyrosol Fki et al., 2005 ; Ergül et al., 2009 Acide vanillique Azabou et al., 2007 Acide ferrulique D‟Annibale et al.,2004 ; Fki et al., 2005 6.2. 6. 2. Les polymères phénoliques Les polyphénols identifiés dans les margines sont essentiellement : − Les anthocyanes (Tanchevet al., 1980). − Les tannins : leur structure est très complexe, leur concentration peut atteindre 12 g.l-1 (Baliceet al., 1982) . Ils sont classés conventionnellement en tanins hydrolysables et tanins condensés (Monties, 1980). 15 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE I. Les tannins hydrolysables renferment trois groupes : * Esters d‟acides phénoliques, * Esters d‟acides phénoliques et sucres, * Glucosides, est le groupe le plus abondant où l‟acide gallique est le plus important. L‟action de l‟enzyme tannase chez Aspergillus niger hydrolyse ce type de tanins en glucose et en acide gallique. Les gallotanins sont les plus représentatifs de ce groupe. II. Les tanins condensés, appelés aussi flavotanins. Ils sont formés par la polymérisation de la catéchine à différents degrés. Leur poids moléculaire est compris entre 500 et 3 000. Le catécholmélaninique est le flavotanin le plus retrouvé en quantité élevée dans les margines. Les flavotanins sont souvent associés aux anthocyanes. En milieu alcoolique et en présence de HCl 5N, ils sont dégradés avec formation de pigments anthocyaniques de coloration rouge (cyanidine). − La lignine est un hétéropolymère formé par la polymérisation oxydative de trois types de monomères dérivés de l‟alcool hydroxycinnamique : le 4-hydroxycinnamate, le 4-hydroxy 3méthoxycinnamate (coniférylate) et le 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamate (sinapylate) (Hamdi, 1991a). 7. Origine de la coloration des margines En général, les margines sont de couleur brune-rougeâtre à noire. Cette variation de couleur est due à plusieurs facteurs (Karapinaretal., 1983 ; Bambalovet al., 1989W) : − Variété et degré de maturité des olives, − Etat de fraîcheur des margines, − Etat de dégradation des composés phénoliques, − Proportion relative entre les deux groupes des composés phénoliques. Le pigment brun ou catécholamine est un polymère de nature phénolique responsable de la couleur foncée des margines. Ce polyphénol ne se trouve pas dans les olives. Il se forme au cours du broyage à partir des orthodiphénols, très abondants dans la pulpe, sous l‟action des phénoloxydases. Cette enzyme est inactive dans les drupes entières (Ranalli, 1991a). L‟étude des composés phénoliques de différents échantillons de margines tunisienne a montré qu‟ils contiennent pratiquement les mêmes composés phénoliques simples, mais à des concentrations variables suivant la maturité des olives et la conservation des margines (Hamdi, 1991a). Cette fraction phénolique renferme deux groupes de composés : - Composés de poids moléculaires inférieur à 2. 104 qui sont responsables de la couleur rouge violette. Ces composés correspondent aux polymères phénoliques de faibles poids 16 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE moléculaires (anthocyanes, tannins). Ils renferment également une classe de composés correspondant aux monomères et oligomères phénoliques qui sont responsables de la coloration jaune masquée par la coloration rouge (Hamdi, 1993b). - Composés phénoliques de poids moléculaire supérieur à 2.104 responsables de la coloration noire des margines. Ce sont des polymères phénoliques obtenus après oxydation des polyphénols du premier groupe (Saezet al., 1992 ; Hamdi, 1993b). Cette 2ème catégorie semble constituer une forme de la lignine (pseudolignine) (Hamdi, 1993b). Donc, selon Hamdi (1993b), la couleur des margines qui varie du rouge violet foncé au noir est sous la dominance d‟un groupe de composés phénoliques par rapport à l‟autre. Durant le stockage des margines, il a été constaté que leur coloration devient de plus en plus noire. Ceci peut être expliqué par : � l‟oxydation des polyphénols du premier groupe qui se polymérisent et donnent les polyphénols du second groupe (Hamdi, 1993b ; Saezet al., 1992). �La biodégradation naturelle des polyphénols du premier groupe. Ces phénomènes de biodégradation et de polymérisation des tanins et des anthocyane sont été signalés aussi par Field et Lettinga (1991). La décoloration des margines a été étudiée par plusieurs auteurs. Ces derniers ont constaté que le champignon Phanerochae techrysosporium est capable de décolorer les margines grâces aux deux enzymes, la lignine peroxydase (LiP) et la manganèse peroxydase (MnP) (Sayadiet al ., 1992, 1993, 1995 ; Sayadiet al., 1996, 2000 ; Gharsallahet al., 1999 ; Kahramanetal ., 1999 ; Garcia Garciaet al., 2000 ; Kissiet al., 2001). D‟autres travaux ont montré la capacité du champignon Pleurotusostreatusà décolorer les margines grâce à l‟enzyme phénol oxydase ou laccase (Tomatiet al., 1991 ; Martiraniet al., 1996 ; Flouriet al., 1996 ; Kissiet al., 2001 ; Fountoulakis et al., 2002). L‟effet de prétraitement des margines par Pleurotus ostreatusa montré ses performances lors d‟un traitement anaérobie ultérieur (Fountoulakiset al., 2002). Une étude menée sur plusieurs souches de Pleurotussp. a montré qu‟elles sont toutes capables de croître sur les margines sans prétraitement ni ajout des nutriments (Tsioulpas et al., 2002). La coloration noire des margines est devenue jaune marron avec un taux d‟élimination des composés phénoliques de 76% après 15 jours d‟incubation. L‟oxydation chimique représente aussi un moyen efficace pour la décoloration des margines. Flouriet al. (1996) ont obtenu une décoloration de 50% des margines en ajoutant 20 g.l-1 du peroxyde d‟hydrogène (H2O2). 17 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 8. Caractérisation microbiologique des margines 8.1. La flore des olives Les olives de par leur richesse en substances pectiques et autres constituants, représentent un milieu favorable pour la prolifération d‟une flore très diverse. Selon Borcakli et al.(1993a) et Kotzekid ou (1997), cette flore est constituée essentiellement de bactéries Gram négatif, de Lactobacillus et de levures : - Les microorganismes isolés à partir des olives vertes commercialisées sous forme saumurées appartiennent pour la plupart d'entre eux aux bactéries lactiques et aux levures. Les bactéries lactiques sont plus abondantes que les levures. Les aérobies mésophiles générateurs de spores tels les Bacillus, qui peuvent être considérés comme des contaminants du produit lors de sa manipulation, ont aussi été isolés à partir de quelques échantillons mais leurs effectifs n‟étaient pas très important (Lopez-lopez et al.,2004). - Une flore microbienne complexe favorisant la fermentation des olives noires du Portugal, constituée principalement de bactéries lactiques et de levures, a été mise en évidence par Catulo et al. (2002). L‟étude taxonomique des mêmes auteurs a prouvé que plusieurs espèces de levures sont présentes durant le temps de fermentation avec des possibilités métaboliques particulières. Alors que les bactéries lactiques constituées principalement de Lactobacillus se sont développées pendant le premier et/ou les dernières phases de fermentation. Les études réalisées sur des échantillons d‟olives noires fermentées selon les techniques artisanales et industrielles, ont également confirmé la prédominance des espèces de Lactobacillus par ces mêmes auteurs. Dans le cas des olives vertes conservées en saumure, il peut y avoir une fermentation indésirable avec la production de gaz, due à des Enterobacter, Bacillus et Clostridium (Cl. Butyricum qui peut entraîner une fermentation butyrique). Dans le cas des olives stockées et exposées à l‟air, le développement sur la surface dufruit d‟un film de levures (Candida) et de moisissures (Aspergillus, Penicillium, Fusarium) est très fréquent ce qui entraîne la dégradation de l‟acide lactique et permet ensuite l‟implantation de contaminants (Pseudomonas et Bacillus) qui modifient l‟aspect et la qualité organoleptique du produit (Guiraud, 1998). Des germes pectinolytiques constitués le plus souvent de Bacillus, Aeromonaset de moisissures provoquent l‟apparition de viscosité dans le fruit. 18 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 8.1. 1. Les bactéries ● L‟isolement de nouvelles souches de bactéries lactiques à partir des olives crues et fermentées ainsi que leurs dérivés (huiles d‟olives et margines) a suscité l‟intérêt de plusieurs auteurs des pays méditerranéens (Van den berg et al.,1993 ; Chamkha, 2001). Plusieurs souches de bactéries lactiques ont été isolées des olives vertes traitées à la saumure pendant quatre à neuf mois et sont identifiées comme étant : Lactobacillus brevis, Lb. plantarum,Lb. caseisubspcasei ; Leuconostoc mesenteroides, Lc. dextranicum et Pediococcus cerevisiae(Asehraou et al.,1993). Parfois la présence d‟espèces du genre Enterococcus a été constatée (Guiraud, 1998). D‟autres souches de bactéries lactiques sont également isolées à partir des olives de table en Italie par La vermicocca et Gobbetti(1998) et à partir d‟olives fermentées au Portugal (Clafardini et al.,1994). Les travaux récents de Campaniello et al., (2005) sur l‟identification d‟espèces de bactéries lactiques dans les olives naturelles ou traitées, selon la tradition espagnole qui traite les olives avec une solution aqueuse de NaOH (1,3 à 2,6 %) durant 12 à 15 h, ont prouvé que lactobacillus plantarumétait l'espèce prédominante, bien que Lactobacillus pentoseus et Leuconostoc mesenteroides soient aussi présents. ● Les Bacillus sont des contaminants des olives traitées en saumure. Parmi l‟espèce de ce genre, la plus fréquemment rencontrée est Bacillus subtilis, considérée pectinolytiques et causait le ramollissement du fruit (Campaniello et al.,2005 ; Lanciottiet al., 1999). ● Les Enterobactersont présents dans le sol et les plantes. Ce sont des contaminants alimentaires très fréquents et capables de dégradation importante. Les espèces (Enterobacter cloacae, Enterobacter amnigenus) de ce genre ont été isolées à partir des olives vertes traitées et non traitées avec de la soude. Elles apparaissent dés leur première phase de fermentation et persistent dans les échantillons durant 80 jours de conservation (Thierry, 1997 ;Campaniello et al.,2005). ● Les Pseudomonas : Les espèces de ce genre sont dotées d‟une grande activité métabolique (protéolyse, lipolyse et dégradation des substances carbonées) (Thierry, 1997). Ce groupe est très répandu dans la nature. Ce sont des agents phythopatogène (Xanthomonas, Photobacterium,Agrobacteriumet Pseudomonas). Les Pseudomonas sont aussi des contaminants des olives ;pendant le stockage des olives traitées en saumure, le développement des Pseudomona sprotéolytiques cause la détérioration du produit. Elle est caractérisée par une diminution de l'acidité des saumures et le gonflement du fruit (Campaniello et al.,2005). 19 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 8.1. 2. Les Levures Les levures sont classées en deux groupes selon la proportion de lipides qu‟elles contiennent (groupe 1 : 20 % ; groupe 2 : 20 à 80 % de lipide). Les espèces du deuxième groupe sont appelées des levures oléagineuses et incluent principalement les espèces des genres :Lipomyces, Rhodotorula, Candida, Trichosporonet Cryptococcus. Elles sont rencontrées dansl‟air, les eaux, les sols et les végétaux où les sucres simples sont peu représentés (Kreger, 1987). Parmi ces genres, les espèces isolées à partir d‟olives traitées avec de la soude sont : Candida pelliculosaa, Candida ciferrii, Candida glabrata, Cryptococcus laurentii et Rhodotorulamucilaginosaet sont toutes dotées d‟activité polygalacturonase(Campaniello et al.,2005). Les espèces isolées des olives fermentées et stockées en vrac sont : Candida et chellsii, Candida versatilis, Rhodotorulaglutinis var. glutinis, R. minuta var. minuta, et R.rubra, Saccharomyces cerevisiae et Pichia anomala. Elles possèdent des activités estérase et polygalacturonase et sont la cause du ramollissement du fruit (Vaughinet al.,1969 ; Asehraouet al., 2000). 8.1. 3. Les moisissures Les moisissures saprophytes (Mucorales, Pénicillium, etc.) se développent sur les fruits crus ou cuits, les fruits séchés placés à l‟humidité, les déchets de betteraves et de bagasse de canne à sucre. Elles sont utilisées depuis fort longtemps par l‟homme pour la préparation d‟aliments et interviennent comme agents de fermentation dans la fabrication du fromage. Elles synthétisent un grand nombre de substances complexes économiquement très importantes comme les enzymes, des acides organiques, des antibiotiques et des alcaloïdes (Moreau, 1989;Roquebert, 1997). ● Le genre Aspergillus est très répandu dans l‟environnement et généralement trouvé comme contaminant banal dans les cultures surtout des céréales et dérivés telle que l‟espèce Aspergillus niger(Derache et al., 1986 ; Davise Larone, 1987). Tandis que l‟espèce Aspergillus versicolor a été isolée à partir des olives et des huiles végétales (Kavitha et al., 1997). ● Le genre Rhizopuscontient plusieurs espèces. Les plus communes sont : Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus et Rhizopus stolonifer isolées du sol, des graines des céréales et des matières végétales en décomposition. L‟espèce Rhizopus stoloniferus a été isolée à partir 20 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE d‟huile d‟olives. Les espèces de Rhizopus sont des moisissures qui, en se développant sur les légumes et les fruits(Bananes, Fraises) les rendent mous (Breton, 1985). 9. traitements des margines Les techniques suivantes ont été décrites comme les plus utilisées ou comme étant potentiellement applicables. Ces techniques de traitement peuvent être classées en procédés thermiques, physico-chimiques et biologiques. 9.1. Processus thermique 9.1.1. Evaporation naturelle (lagunage) Les effluents d‟huileries d‟olive sont placés dans des bassins ou étangs d‟évaporation de profondeur de 0.7 à 1.5 m (El Alami, 2000). Cette profondeur est choisie pour assurer une évaporation totale avant la campagne oléicole suivante. Après séchage, les effluents d‟huileries d‟olive sont, soit incinérés soit utilisés comme engrais organique ou comme additifs dans un compostage ou tout simplement jetés à la décharge. L‟évaporation naturelle est tributaire des conditions climatiques. Elle dépend étroitement de la vitesse du vent, du degré d‟ensoleillement et de l‟humidité de l‟air. Cette méthode permet la diminution du volume des effluents d‟huileries d‟olive écoulés dans les réseaux hydrauliques superficiels ou dans les réseaux de collecte des eaux usées. Elle présente beaucoup d‟avantages à savoir : - La simplicité de fonctionnement : ces installations ne nécessitent pas de travaux de maintenance réguliers, seuls une surveillance périodique du site et un curage tous les 3 à 5 ans sont nécessaires ; - L‟autoépuration pendant l‟évaporation qui se fait par les microorganismes présents dans les effluents d‟huileries d‟olive ; - Le coût d‟investissement et d‟exploitation faible. Néanmoins, ce procédé présente les inconvénients suivants : - Le transport des effluents d‟huileries d‟olive jusqu‟au site du traitement ; - La nécessité de grandes surfaces pour le séchage à cause du développement d‟un film imperméable gênant l‟évaporation ; - Le dégagement d‟odeurs indésirables ; - La pollution éventuelle des nappes phréatiques si l‟étanchéité des bassins n‟est pas parfaite. 21 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 9.1.2. Evaporation forcée Les effluents d‟huileries d‟olive sont pompés à partir de bassins de stockage, puis projetés par des asperseurs sur des panneaux juxtaposés, ayant une importante surface d‟échange avec l‟air (Nucleos d‟Interface, 1992). Ce système est généralement applicable lorsque la température de l‟air est supérieure à10°C et le taux d‟hygrométrie inférieur à 80%. En effet, plus la température est élevée, plus l‟hygrométrie relative est faible et plus les quantités d‟eaux évaporées par l‟air avant la saturation sont importantes. Les inconvénients de cette méthode sont : le dégagement des mauvaises odeurs, l‟évaporation de composés organiques et la possible mise en suspension d‟aérosols s‟il y a du vent. 9.1.3. Incinération L‟incinération consiste à éliminer les effluents d‟huileries d‟olive par combustion. Pour éliminer l‟excès d‟eau, on est obligé d‟utiliser un combustible supplémentaire soit les noyaux d‟olives, soit d‟autres combustibles comme le gas-oil. Ce procédé est complexe et coûteux tant à l‟investissement qu‟à l‟exploitation (Fiestas Ros de Ursenos, 1983 ; Ranalli,1991). 9.1.4. Distillation Les effluents d‟huileries d‟olive peuvent être concentrés à l‟aide d‟un distillateur. Ce processus permet de réduire le volume de ces effluents de 70% et le résidu peut être utilisé comme combustible pour chauffer le distillateur ou comme fertilisant dans l‟agriculture. L‟eau condensée peut être réutilisée après une épuration adéquate dans les processus des huileries (Ranalli, 1991). 9.1.5. Floculation/clarification Elle consiste à traiter les effluents d‟huileries d‟olive avec des produits tensioactifs afin d‟éliminer les solides et les colloïdes en suspension. Une expérimentation avec de la chaux a montré une réduction de la DCO de 40 à 50%(Mendia et al., 1964). Ce traitement peut être utilisé après un traitement biologique pour éliminer les matières en suspension et les polluants résiduels. L‟inconvénient majeur de ce procédé réside dans le fait qu‟on a seulement un transfert de la pollution de l‟état solide à l‟état pâteux. De même, la plupart des composés organiques qui se trouvent dans les effluents d‟huileries d‟olive sont difficiles à précipiter (sucres, acides volatiles). 22 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 9.6. Cryo-concentration Ce processus se base sur le fait que les effluents d‟huileries d‟olive, en se refroidissant jusqu‟a la congélation, se séparent, d‟une part en un sirop constitué de substances organiques et de l‟eau résiduelle, et d‟autre part en cristaux de glace qui à cause de leur faible densité flottent sur le sirop (El Alami, 2000). Ce processus ne conduit pas à l‟élimination des polluants, mais provoque leur concentration. 9.2 Procédés physico-chimiques 9.2.1. Ultrafiltration/Filtration L‟ultrafiltration est un procédé de séparation physique utilisant une membrane. Elles „applique à la séparation des particules de 0.005 à 0.1μm. Cependant, pour les particules les plus petites, on utilise la nano filtration. On obtient une phase liquide contenant les polluants dissous d‟une part et une phase pâteuse contenant les phases solides. 9.2.2. Ozonation L‟ozonation consiste à l'utilisation de l'ozone, O3 comme produit d‟oxydation qui permet la destruction d'un grand nombre de micropolluants et l'amélioration des odeurs. La réduction de la pollution par ce procédé est très limitée et les réactifs sont très couteux. 9.2.3. Coagulation Elle consiste à favoriser l‟agglomération des particules hydrophiles par des tensioactifs. Les principaux agents de coagulation utilisés sont à base du sel d‟aluminium et du fer. Dans certains cas, des produits synthétiques tels, le chlorure ferrique et la chaux sont utilisés. On obtient une phase liquide où les polluants sont dilués et des boues dans lesquelles les polluants sont concentrés. 9.3 Procédés biologiques Ces procédés consistent à utiliser les microorganismes pour dégrader les composés organiques des effluents d‟huileries d‟olive. Ils sont subdivisés en processus aérobie et anaérobie. 9.3.1. Traitements anaérobies Les traitements anaérobies sont adaptés à plusieurs types de résidus : biomasse humide, sous-produits agricoles, déchets des eaux résiduaires. Ils sont le plus utilisés pour le traitement et l‟exploitation des effluents d‟huileries d‟olive à cause de leur charge élevée en matière organique (Fiestas Ros de Ursenos et al., 1981 ; Hamdi et al., 1991 ; Borja et al., 1994). Des études ont montré que pour une efficacité d‟épuration de 80%, il faut un temps de rétention de seulement 20 jours, avec en plus l‟avantage de produire une quantité non 23 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE négligeable du biogaz : 855 litres/ kg de matière organique digérée (El Alami, 2000).La digestion anaérobie permet une réduction de DCO de l‟ordre de 70 à 85%. Son rendement est proportionnel à la concentration en microorganismes et varie largement selon la nature du support (montmorillonite ou sepiolite) (Martin et al., 1991). Cependant, cette digestion peut être inhibée par les acides gras à chaines longues, notamment l‟acide oléique (Koster et al., 1980). De même à partir d‟une concentration de 100 mg/L d‟acides phénoliques dans les effluents d‟huileries d‟olive, les bactéries méthanogènes sont inhibées (Hamdi et al., 1991). Ces traitements anaérobies permettent de réduire la consommation en énergie et la production des boues (Borja et al., 1995). Ils présentent aussi l‟avantage de produire du méthane et de limiter les dégagements de mauvaises odeurs. Par contre, ils sont aussi très limités et ce à cause de la toxicité élevée des composés phénoliques et des tanins, de la faible biodégradabilité des polymères de couleur foncée et de l‟acidification des réacteurs (Mouncif et al., 1995). 9.3.2. Traitements aérobies Les effluents d‟huileries d‟olive étant très chargés en matière organique, ils ne peuvent pas être traités directement par voie aérobie. De ce fait plusieurs auteurs ont recommandé de les diluer avant leur traitement, soit avec l‟eau (El Hajjouji et al., 2007), soit avec des eaux usées domestiques (Annaki et al., 1999).Baliceet al. (1988) ont recommandé de diluer les effluents d‟huileries d‟olive 70 fois avec de l‟eau claire non polluée lors de leur épuration avec les boues activées. Plusieurs travaux ont été réalisés sur le traitement et le prétraitement des effluents d‟huileries d‟olive par voie aérobie en utilisant des souches de microorganismes telles que les basidiomycètes (Dias Albino et al., 2004),Pleurotus ostreatus(Fountoulakis et al., 2003) et Aspergillus niger(Cereti et al., 2004) en raison de leur grand pouvoir de dégrader les composés phénoliques (Hamdi et al., 1993). Les tests de toxicité ont montré une diminution de la toxicité des effluents d‟huileries d‟olive après traitement par ces microorganismes. En effet, les microorganismes aérobies dégradent les composés organiques par oxydation avec l‟oxygène de l‟air ou l‟oxygène pur et utilisent la plupart de ces composées organiques présents dans le milieu pour leur nutrition et leur reproduction. D‟autres auteurs ont utilisé des suspensions mixtes de microorganismes et ont abouti à des abattements très importants en termes de DCO et de polyphénols (Zenjari et al., 1999 ; Hafidi et al., 2005). Ces abattements sont très variables et varient en fonction de la performance des 24 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE souches sélectionnées. Certaines souches de bactéries et de champignons ont été également testées pour décolorer les effluents d‟huileries d‟olive et réduire leur toxicité, parmi ces microorganismes on peut citer : Baccilus pumilus(Ramos, 1986) ; Coriolus versicolor et Funaliatroggi(Yesilada et al., 1998) ; Phanerochae techrysosporium(Sayadi et al., 1996) et Pleurotus ostreatus(Martirani et al., 1996). Les procédés aérobies tels que les boues activées sont aussi utilisés pour éliminer les polluants dissous et colloïdaux à faibles concentrations dans les eaux usées. Toutefois, les concentrations élevées en matière organique peuvent être tolérées lorsque le temps de rétention est long et/ou avec un pourcentage de recyclage élevé. Les effluents d‟huileries d‟olive étant très chargés en matière organique ne peuvent pas être traités directement par ces procédés. L‟inconvénient majeur du traitement aérobie est la consommation importante d‟oxygène. Dans le but de réduire cette consommation ainsi que la toxicité des effluents d‟huileries d‟olive vis-à-vis des microorganismes épurateurs, des prétraitements physiques de ces déchets (filtration, distillation, évaporation) ont été recommandés par plusieurs auteurs. L‟utilisation de ces deux procédés à la fois (physique et biologique) a permis d‟avoir de meilleurs résultats par rapport à l‟utilisation d‟un procédé biologique direct (Zenjari, 2000). 10. Valorisation des margines Parallèlement aux recherches réalisées sur le traitement des margines, des études de valorisation ont été effectuées. Les margines sont riches en éléments nutritifs minéraux et organiques. Ce critère a amené les chercheurs à mettre au point de nombreux procédés de valorisation et d‟exploitation des margines aussi bien à l‟échelle de laboratoire qu‟à l‟échelle pilote (Fiestas Ros de Ursinos, 1981). Cette valorisation a pour objectif l‟élimination des composés phénoliques d‟une part et l‟utilisation des margines dans les domaines de la biotechnologie, de la chimie et de l‟agriculture d‟autre part (Levis-Menzi et al., 1992). 10.1. Utilisation des margines comme fertilisant De nombreux travaux ont été publiés concernant les effets de l‟épandage des margines fraîches directement ou après traitement, sur des sols complantés de céréales ou d‟autres cultures annuelles (Di Giovacchino et al., 2002), de vigne (Di Giovacchino et al., 2001) et d‟olivier. 25 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE D‟autres travaux ont porté sur l‟influence de l‟épandage de ces eaux sur la microflore, la faune du sol, et la toxicité à l‟égard des plantes ou des micro-organismes (Di Giovacchino et al.,2002). Les caractéristiques des margines et leurs traitements Des expérimentations agronomiques menées avec des doses d‟apport conforme aux règles de fertilisation, ont toutes montrée l‟effet favorable des margines sur la fertilité des sols (DeMonpezat et al., 1999), car d‟une part, elles ne contiennent pas des métaux lourds et des microorganismes pathogènes (Sierra et al., 2007), et d‟autre part, elles sont riches en éléments minéraux nutritifs (K, N, P, Mg). En plus, comme elles sont constituées de matière organique, elles représentent un excellent substrat pour le développent de la microflore qui permet d‟améliorer les propriétés physico-chimiques du sol (Amiranteetal., 2002), et dégrader les composés phénoliques après une période de latence liée au pouvoir antimicrobien (DeMonpezat et al., 1999). Di Giovacchino et al., (2002) ont fait une étude dont le but est de contribuer à la connaissance des effets de l‟épandage des margines pendant une longue période sur des sols complantés de maïs (plus de 10 ans) et de vigne (plus de 5 ans). Les résultats obtenus ont montré que, pour les deux sols complantés de maïs et de vigne, la productivité des sols a augmentée. L‟emploi des margines à des doses élevées avait permis d‟obtenir une biomasse totale supérieure de 30 à 40 % que celle obtenue sur des parcelles témoins. Différents groupes microbiens ont été dénombré durant un suivi de six mois d‟épandage de margine sur une semée des grains de maïs. La margine a servi comme un substrat pour la flore mésophile totale. Ce qui a induit à une multiplication importante des champignons et des levures (El Hassani et al., 2005). L‟utilisation des margines comme fertilisant n‟est pas sans inconvénients pour le sol et sa composition, tel que: l‟acidité et la salinité élevées, accumulation des lipides, des acides organiques et les composés et phénoliques (Nefzaoui, 1991). Les composés phénoliques se comportent comme des herbicides et phyto-toxiques, qui altèrent le cycle d‟azote en changeant l‟activité microbienne du sol et contaminant les eaux de surface (Sierra et al., 2007). Sierra et al., (2007) ont proposé de ne pas dépasser des vitesses d‟application de 180 m3/ha.an pour éviter le problème de salinité et l‟accumulation des polyphénols. Chapitre I Les caractéristiques des margines et leurs traitements 26 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 10.2. Utilisation des margines en compostage Le compostage est l‟une des techniques de recyclage des margines et leur transformation en fertilisant. Les margines sont absorbées sur un substrat solide (déchet lignocellulosique) avant d‟être utiliser comme un compost (Roig et al., 2006). Donc, ce compost s‟obtient principalement par dégradation aérobie-anaérobie de substance organique des résidus solides (margines + résidus agricoles). Afin que ce processus se réalise, il faut prolonger le temps de contact de ces résidus agricoles dans les margines dont le taux en substances organiques et minérales appropriées pour mener à bien le processus d‟obtention du compost (Nefzaoui, 1991). Dans un travail de recherche fait par Zenjari et al., (2006), le compostage des margines avec des pailles d‟orge en conditions aérobies a permis de réduire la teneur en matière organique de 52 % après 3 mois d‟incubation dans des sacs en plastique, et la toxicité devient non détectable. A la fin de la période de maturation, la dégradation des phénols est de l‟ordre de 95%. Roig et al., (2006) ont trouvé que la fertilisation avec des taux élevés d‟humidification et sans effets phytotoxiques, a été obtenu par le compostage des margines avec des pailles de blé. Paredes et al., (2005) ont trouvé que l‟effet positif sur la fertilité du sol augmente avec l‟augmentation de la vitesse d‟application du compost-margine. D‟autre part, ils ont constaté que la salinité du sol augmente avec l‟augmentation des doses (au delà de 60 t/ha). 10.3. Récupération de quelques composants Les études dans ce domaine sont très récentes et les résultats sont encore à un état embryonnaire. Il s‟agit en particulier de la récupération des composés aromatiques et phénoliques et des solutions de glucides (Nefzaoui, 1991). Les phénols et les substances antioxydants sont des composés évaluables, et peuvent être utilisés en industries pharmaceutique et cosmétique (Roig et al., 2006). Briante et al., (2004) ont proposé l‟utilisation d‟un bioréacteur pour la production des antioxydants d‟une pureté élevée qui sont ensuite convertis en composés pharmacologiques actifs. Turano et al., (2002) ont proposé aussi un système intégré de centrifugation-ultrafiltration qui permet la réduction de la pollution et la séparation sélective de quelques produits utilisables (lipides, sucres, polyphénols). De Marco et al., (2007) ont fait une étude pour la récupération des biophénols existants dans les margines. L‟extraction liquide-liquide (ELL) a été utilisée pour obtenir un extrait de biophénols. Ces extraits ont été fractionnés par la suite par une extraction liquide-solide. Cette deuxième 27 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE extraction a été faite en utilisant une colonne C18 en phase renversée, dans le but d‟obtenir des composés purifiés dont l‟ordre est de déterminer la contribution relative de différents composés en énergie anti-oxydante. D‟après la procédure utilisée : 1 litre de margine permet d‟obtenir un extrait contenant 1,2 g d‟hydroxytyrosol et environ 0,4 g de flavonoïdes, qui peuvent être fractionné en produisant 1 g d‟hydroxytyrosol purifié. Les composés aromatiques peuvent être aussi obtenus par distillation sous vide et les arômes sont récupérés par extraction aux solvants (Nefzaoui, 1991). Les extraits phénoliques obtenus ont été comparés aux antioxydants de synthèse, les plus connus tel que le BHA à partir des essais de résistance à l‟oxydation. Il a été constaté que l‟extrait de margine protège l‟oxydation d‟huile plus efficacement que l‟addition du BHA. D‟autre part, le coût de production de ces extraits est inférieur à celui des antioxydants de synthèse. 10.4. Production de biogaz L‟application du processus de la digestion anaérobie aux margines permet de transformer environ 80% des substances organiques en biogaz (65 à 70% de méthane). Ainsi, la fermentation méthanique permet la dépollution des margines tout en produisant de l‟énergie (Nefzaoui, 1987 ; Loulan et al., 1987). 10.5. Production des protéines d’organismes unicellulaires (POU) L‟obtention des protéines unicellulaire constitue une des solutions optimale pour la valorisation des effluents d‟huileries d‟olive. La plupart des procédés appliqués sont basés sur l‟utilisation des levures capables de transformer les substances organiques en biomasse à haut contenu en protéines et vitamines de grande valeur pour l‟alimentation animale et même humaine (El Alami, 2000). L‟usage des microorganismes pour la production des POU peut être considéré comme un prétraitement pour les eaux résiduelles à charge organique élevée, permettant d‟obtenir d‟une part, une diminution de 50 à 70% de la charge polluante et d‟autre part, une biomasse protéique qu‟on peut utiliser pour l‟alimentation animale (Zenjari, 2000). Les microorganismes les plus utilisés et les plus adaptés pour la production de Protéines sont représentés dans le tableau 8 : 28 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Tableau 8. Levures pour la production de protéines d‟organismes unicellulaire à partir des effluents d‟huileries d‟olive (Hamdi, 1993). Souche Biomasse (g/L) Torulopsisutilis Saccharomycopsislipolitica Saccharomyces Candida Saccharomyces cerevisiae 13 18-26 20-26 30 Selon Hamdi (1993), l‟emploi de ce genre de POU pour l‟alimentation animale est limité par les composés phénoliques qui se fixent sur les levures. Ces dernières s‟avèrent incapable de dégrader les pectines, les tanins et les polyphénols. Synthèse Bibliographique De même, l‟utilisation des moisissures comme Aspergillus sp et Geotrichium codidum donne une biomasse très digestible avec une teneur en protéines brutes allant jusqu‟à 30%, bien que ces microorganismes présentent l‟inconvénient de se développer plus lentement que les levures (Hamdi, 1993). 10.6. Production d’enzymes Les margines peuvent servir aussi comme milieu favorable pour la production d‟enzymes par des micro-organismes. La culture de Cryptococcus albidus sur les margines pendant 48 heures élimine un taux important de la matière organique tout en produisant de la biomasse et des enzymes (13 UV.ml-1). Cette production peut atteindre 29,5 UV.ml-1 si on élimine les polyphénols par floculation-clarification (Francesco, 1993). L‟addition de 2 litres d‟une solution de ces enzymes concentrées par ultrafiltration (90 UV/ml) pendant un cycle de broyage augmente le rendement de l‟huile de 84,3 à 90,7% (Petruccioli et al., 1988). La production de l‟enzyme laccase par la culture de deux champignons Coriolu sversicolor et Funaliatrogii sur les margines a été étudiée (Kahraman et al., 2001). Cette étude a montré que l‟addition des tiges du coton augmente significativement l‟activité laccase (phénol oxydase). 10. 7. Epandage La valorisation des margines par épandage a été largement étudiée par plusieurs auteurs (Tomati et Galli, 1992). Les margines peuvent être utilisées dans l‟irrigation en raison de leur richesse en eau et en minéraux nutritifs (Fiestas Ros de Ursinos, 1986). Un mètre cube de margines apporte 3,5 à11 kg de K2O; 0,6 à 2 kg de P2O5 et 0,15 à 0,5 kg de MgO par hectare de terrain irrigué. 29 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Cependant, cette technique présente certains inconvénients : - Problèmes du stockage vu que la période oléicole coïncide avec la période pluviale (Ranalli, 1991a). - Colmatage du sol (Ranalli, 1991a) - L‟acidité et la salinité élevées peuvent provoquer des brûlures sur les plantes (Sierra et al., 1994). - Contamination des eaux souterraines (Ranalli,1991a). - Inhibition de la germination due à l‟effet phytotoxique exercé par les composés phénoliques sur les plantes (Ranalli, 1991a ;Ehaliotis et al., 1999 ; Casa et al., 2003). - Modification de la composition de la flore du sol (Parades et al., 1986 ; Pérez etal., 1987, 1992). - Modification des caractéristiques physico-chimiques du sol (Sierra et al., 2001 ; Zenjari et Nejmeddine, 2001). - Coût élevé de transfert des margines des huileries vers les terres agricoles. Quoique le potassium et le phosphore contenus dans les margines puissent remplacer ceux des engrais chimiques, l‟acidité, la forte salinité et la haute conductivité, ainsi que le contenu en composés phénoliques sont à l‟origine d‟une limitation de toute utilisation efficace des margines comme fertilisant. Pour résoudre partiellement ce problème, Buldini et al. (2000) ont développé une méthode automatique pour la détermination et la récupération des anions inorganiques totaux présents dans les margines après 10 minutes. Cette technique repose sur l‟utilisation de la dialyse couplée à la chromatographie d‟échange ionique sans l‟addition de réactifs qui risquent d‟infecter les quantités d‟anions solubles. 10. 8. Utilisation en alimentation animale Les margines ont été utilisées directement comme aliment pour le bétail (Ercoli et al., 1983). Cependant, cette pratique reste à risque, en raison des taux élevés en sodium et en composés phénoliques pouvant engendrer un effet antitrypsique. De même, elles ont été fournies aux volailles à la place de l‟eau potable (Fedeli, 1977). Cette expérience a montré qu‟il y avait un léger abaissement du taux de mortalité de ces animaux. L‟apport des margines déshydratées a provoqué des diarrhées chez les ruminants (Salvemini et al., 1984 ; Salvemini, 1985). Le procédé Dalmolive décrit par Martillotti (1993) semble remédier au problème. Il consiste à mélanger 50 kg de margines avec 20 kg de grignons et 12,6 kg de divers résidus et 30 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE sous produits agricoles pour réduire l‟effet inhibiteur des composés phénoliques. Ceci produit 29 kg d‟aliments en pellettes dont la composition est indiquée dans le tableau8. Tableau 9 : Composition chimique de la pâte des margines obtenue par le procédé Dalmolive(Martilotti, 1993). Composant Valeur (% de la matière sèche totale) Matière azotée totale Matière grasse Cellulose brute Matière minérale Extrait non azoté Matière azotée digestible 21,6 4,0 13,1 8,9 52,5 17,2 Malgré les multiples procédés testés pour le traitement et la valorisation des margines, seulement quelques-uns sont appliqués à l‟échelle industrielle en raison du coût élevé des installations. En plus, les résultats obtenus montrent pour la plupart des procédés, que le coût et l‟énergie consommée étaient trop élevés par rapport au rendement d‟épuration obtenu. Ceci est lié essentiellement à la grande quantité des margines produites annuellement et à leur forte et complexe charge polluante. 31 Partie I MARGINES D’OLIVES Partie II : les bactéries lactiques Synthèse bibliographique CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Les bactéries lactiques 1. Introduction Les bactéries lactiques sont des coques ou des bâtonnets, Gram positif, immobiles, non sporulées, catalase négative et généralement nitrate réductase négative. Elles synthétisent leur ATP grâce à la fermentation lactique des glucides. Lorsque l‟acide lactique est le seul produit terminal, il s‟agit des bactéries lactiques homofermentaires (Certaines espèces peuvent produire au moins 18 moles d‟acide lactique par mole de glucose fermenté). Parfois, en plus de l‟acide lactique, d‟autres composés constitués principalement d‟acide acétique, d‟éthanol et de gaz carbonique sont produits : c‟est le cas des hétérofermentaires (produisent uniquement 1 mole d‟acide lactique par mole de glucose fermenté). Les bactéries lactiques sont aéro-anaérobies facultatives ou micro-aerophiles. En présence d‟oxygène, elles sont incapables de phosphorylation oxydatives car elles ne peuvent synthétiser les cytochromes et les enzymes à noyau hème. Elles ont des besoins complexes en facteurs de croissance, acides aminés, peptides, bases puriques et pyrimidiques, des vitamines B et des acides gras. C‟est la raison qui explique leur abondance dans le lait (Larpent, 1989 ; Novel, 1993). Figure 6. Schéma montrant l‟arbre phylogénique basée sur la comparaison du gène de l‟ARN 16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentage CG et la relation lointaine avec 32 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE les germes à gram positif de haut pourcentage CG du genre Bifidobacterium et propionibacterium (Holzapfel et al., 2001) Les bactéries lactiques appartiennent aux genres suivants:Carnobacterium,Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc,Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,Vagococcuset Weissella(Vandamme et al., 1996; Stiles et Holzapfel, 1997,Axelson, 2004)(Figure 6). D‟autres bactéries gram positive non sporulées etproductrices d‟acide lactique appartenant à la famille des actinobacteriacée et au genre, Aerococcus, Microbacterium, et Propionibacterium(Sneath et Holt,2001) ainsi que le genre Bifidobacterium(Gibson et Fuller, 2000;Holzapfel et al., 2001) sont aussi impliquées dans l‟industrie agro-alimentaire. Les travaux récents sur la taxonomie effectué sur la caractérisation des bactéries lactiques basée l‟étude de la comparaison de l‟ARN ribosomal 16S ont révélé une différence dans les relations entre les la caractérisation phénotypiqueet la caractérisation phylogénique. Les techniques de biologie moléculaire spécialement la PCR (réaction de la chaine polymerase), RFLP (Restriction Fragment Long Polymorphisme), DGGE (Electrophorèse en Gradient Gel Dénaturé) et TGGE (Gel Electrophorèse en Gradient de Température) sont utilisées pour confirmer l‟identification précise des espèces bactériennes. 2. Habitat Les bactéries lactiques ont pour habitat de nombreux milieux naturels, des végétaux (plantes et fruits), des animaux et des humains (cavités buccales et vaginales, fèces et dans le lait). Mais certaines espèces semblent s‟adapter à un environnement spécifique et ne sont guère trouvées ailleurs que dans leurs habitats naturels (de Roissart, 1986). Les espèces du genre Lactococcus sont isolées du lait ou des végétaux qui sont les réservoirs naturels de la plupart de ses espèces. L‟espèce Lactococcus lactissubsp. lactis est isolée pour la première fois à partir du lait fermenté par Lister en 1873 et reconnue comme agent primaire de l‟acidification du lait caillé (Sandine, 1988). Parmi les espèces du genre Streptococcus, Streptococcus thermophilus est isolée du lait pasteurisé, du matériel de laiterie et de levains artisanaux (Jones, 1978). Les espèces du genre Leuconostoc sont isolées du lait, des produits laitiers, des fruits, des légumes (en particulier la betterave), des végétaux en fermentation (comme la choucroute), des produits de la panification (Suhigara, 1985) et des solutions visqueuses de sucre dans les sucreries (Devoyod et al.,1988). 33 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Boubekri et Yoshiyuki (1996) ont isolé deux souches de Leuconostoc sp. à partir de fromage traditionnel El-Klila fabriqué à Batna (Algérie). Tandis que, Ryhanen et al., (1996) ont identifié trois espèces (Leuconostoccurvatus, Ln. Citreumet Ln. Mesenteroides subsp. Mesenteroides) isolées à partir de blé fermenté. Seule l‟espèce Leuconostocoenos est isolée du vin (Fleminget al.,1985 ; Sugihara, 1985 ; Devoyod et Poullain, 1988 ; Hounhoigan et al., 1993). Les espèces du genre Pediococcus sont présentes surtout dans les végétaux en décomposition, parfois dans les boissons alcoolisées, le lait, les différents fromages (Parmesan et autres fromages italiens) et les préparations culinaires (Saucisses, anchois salés ou sauce de soja) (Chapman et al., 1981; Dellaglio et al., 1981A ; Uchida, 1982; Bacus et al., 1985B ; Villar et al., 1985). Les espèces du genre Lactobacillus sont présentes dans plusieurs milieux différents : dans le lait et les fromages (Lb. Casei subsp. casei, Lb. plantarum, Lb. curvatus et Lb. brevis), dans les laits fermentés (Lb. kefir, Lb. brevis et Lb. fermentum), dans les produits végétaux fermentés, les marinades, l‟ensilage, le vin et les viandes fraîches ou fermentées (Lb. brevis, Lb. curvatus, Lb. buchneri et Lb. sanfranscisco) (Demazeaud, 1996). 3. Classification La taxonomie a longtemps reposé sur les critères morphologiques et biochimiques permettant de différencier les espèces et de caractériser des variantes au sein d‟une même espèce. Ces testes sont : -Le type de gram, la morphologique et la disposition cellulaire. - Les différents métabolismes glucidiques, protéiques, lipidiques, le caractère fermentaire. - La croissance des cellules sur des milieux hostiles - Et la synthèse d‟enzymes (de protéases), de métabolites (exopolysaccharides), de bactériocines,et la résistance aux bactériophages. Puis, des études basées sur les critères moléculaires ont permis de classer les espèces selon les critères suivants : - La détermination de la composition des peptidoglycanes (PTG) permet d‟observer le type d‟espèce selon la nature de la liaison peptidique. - Et la composition de l‟ADN mesurée par hybridation permet de différencier les genres et les espèces entre eux. Le pourcentage en bases Guanine+Cytosine (G-C %) permet le rapprochement des genres Streptococcus 34 (34-46%), Leuconostoc(36-43 %) et CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Pediococcus(34-42 %) (Schleifer et al., 1985;Schleifer, 1986 ; Farrowet al., 1989). Le pourcentage de G-C des espèces du genre Lactobacillus est très hétérogène et varie d‟une espèce à une autre de 32 à 53 % (Tableau. 10) (Scardovi, 1986). Cependant, les espèces des genres Lactobacillus, Pediococcus. Leuconostocou streptococcus, dont le G-C % de l‟ADN est inférieur à 50 %, peuvent être regroupées dans la branche des Clostridium avec Bacillus, et séparées de la branche des Actinomycétales au G-C % supérieur à 50 %, comprenant Propionobacterium et Bifidobacterium(Stackebrandt et al.,1983 ;Kandler et al., 1986b ; Stackebrandt et al., 1988). Tableau10. Les différents genres de bactéries lactiques Genres Cellules Fermentation ADN G-C (%) Références Forme Arrangements Streptococcus Coques Chaînes Homolactiques 34 - 46 SCHLEIFER, 1986 Leuconostoc Coques Chaînes Hétérolactiques 36 - 43 FARROW et al.,1989 Pediococcus Coques Tétrade Homolactiques 34 - 42 SCHLEIFER, 1986 Lactobacillus Bacilles Chaînes Homolactiques et Hétérolactiques 32 – 53 KANDLER et WEISS, 1986a et b 3.1. Les coques lactiques Elles appartiennent à la famille des Streptococcaceae. Les cellules sont groupées en paires ou en chaînes et de longueurs variables. La différenciation des genres est basée sur l‟arrangement des cellules et sur le type de fermentation lactique (homo ou hétérolactique). Les coques lactiques ont des exigences nutritives parfois complexes. Certains ont des activités protéasiques et peptidasiques. Actuellement, ils regroupent les genres : Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella(Stiles et al., 1997). 3.1.1. Les genres Enterococcus, Lactococcus et Streptococcus : Ils étaient anciennement groupés en un seul genre Streptococcus. Ils sont très fréquents dans l‟industrie alimentaire comme contaminant et surtout comme agents de fermentation homolactique (avec production d‟acide lactique de type dextrogyre). Ils sont très exigeants sur le plan nutritionnel et se développent bien à 37 °C. Parmi le genre Streptococcus, le groupe viridans comprend les agents d‟acidification fréquents dans certains fromages et yaourts comme le cas de l‟espèce Sc. thermophilus.(Skinnel et al., 1978). 35 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Les Enterococcus représentent le groupe des entérocoques, ils sont composés de streptocoques fécaux (Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium) et considéré comme contaminants. Les Lactococcus regroupent l‟espèce Sc. Lactis, ses trois sous espèces Sc. Lactis., Sc. diacetilactiset Sc. cremoris, Sc. Raffinolactis et de nouvelles espèces mal classées : Sc. plantarumet Sc. garviae(Garvieetal., 1982 ; Collinset al.,1983). Et Selon Guiraud (1998), le genre Lactococcusest représenté par les espèces suivantes : Lc. Lactissubsp. cremoris, Lc. Lactissubsp. Lactiset Lc. diacetilactis. La sous espèce Streptococcus Lactis subsp. diacetylactisest remplacée par la sous espèce Lactococcus Lactis subsp. Lactis. 3.1.2. Le genre Leuconostoc Il représente les coques hétérofermentaires. La classification des espèces basée sur le GC% a permis de distinguer trois espèces : Ln. mesenteroides(et ses trois sous espèces : subsp.Mesenteroides., subsp. Dextranicum et subsp. Cremoris), Ln. lactis, Ln. Paramesenteroides et Ln.enos(Yang et al., 1989; Leveau et al.,1993). 3.1.3. Le genre Pediococcus Il rassemble des coques homofermentaires dont la particularité qui les différencie des autres genres est le regroupement en paires ou en tétrades. Le genre Pediococcus est mésophile. Leur exigence nutritionnelle, leur faible activité protéolytique et le plus souvent leur incapacité à utiliser le lactose, ne leur permettent pas d‟acidifier et de coaguler le lait. Leur fermentation homolactique donne parfois de l‟acide lactique racémique (acide D. L.lactique). Mais, fréquemment la forme lévogyre L prédomine : les espèces osmophiles non acidophiles ne donnent que cette forme. Ce genre est parfois utilisé comme levain lactique pour les charcuteries (Guirau, 1998). 3.1.4. Le genre Lactobacillus Ce genre regroupe plus de 70 espèces (dont plusieurs sont divisées en sous-espèces). Le genre Lactobacillus est quantitativement le plus important des genres du groupe des bactéries lactiques. Les souches de Lactobacilles sont constituées de bacilles long et fin (parfois incurvés) ou de coccobacilles dont la forme est proche à celle des corynébactéries. Les cellules sont généralement immobiles (pour les souches mobiles, la ciliature est péritriche). La production d‟acide lactique issue du métabolisme fermentaire représente au moins 50 % des produits de fermentation (Axelsson, 1993). 36 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Orla- Jensen (1919) a proposé de diviser le genre Lactobacillus en trois sous genres : Thermobacterium, Bêtabacterium, Streptobacterium(Tab. 11). 3.1.4.1. Les Lactobacilles homofermentaires stricts regroupent les espèces de l‟ancien sous-genre Thermobacterium, qui dégrade les hexoses en acide lactique. 3.1.4.2. Les Lactobacilles hétérofermentaires stricts regroupent les espèces de l‟ancien sous-genre Bêtabacterium, fermentent les hexoses en acide lactique, en acide acétique ou en éthanol et CO2 (voie hétérofermentaire de la 6-phosphogluconate déshydrogénase/phosphocétolase). Ils dégradent les pentoses en acide acétique et en acide lactique (voie hétéfermentative de la glycéraldéhyde-3- phosphate/pyruvate kinase/lactate déshydrogénase). Ces bactéries produisent du CO2 lors de la fermentation du glucose et du gluconate. 3.1.4.3. Les Lactobacilles hétérofermentaires facultatifs regroupent les espèces de l‟ancien sous-genre Streptobacterium, métabolisent les hexoses en acide lactique par la voie homofermentaire d‟Embden-Meyerhof-Parnas et dégradent les pentoses par voie hétérofermentaire. Ils ne produisent pas de CO2 lors de la fermentation du glucose mais ils en produisent lors de la Fermentation du gluconate (Kandler et al., 1986b ; Stiles et al., 1997). L‟établissement d‟un arbre phylogénique construit à partir des séquences d‟ARN 16S a démontré que les genres Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcu ssont très liés (malgré leurs caractères morphologiques et physiologiques très différentes) (Schleifer et al., 1995). Tableau11. Classification des lactobacilles selon ORLA- JENSEN (1919) Groupe 1 : Thermobacterium (Homofermentaires stricts) Groupe 2 : Streptobacterium (Homofermentaires facultatifs) Groupe 3 : Bêtabacterium (Hétérofermentaires stricts) Groupe delbruekii Groupe plantarum Groupefermentum G-C: 49-51 % Lb. Plantarum Lb. Delbrekii Lb. Pentoseus Lb. ssp. Delbrekii Lb. Sake Lb. ssp. Lactis Groupe casei Lb. ssp. Bulgaricus Lb. caseissp. casei Lb. caseissp. alactosus Lb. caseissp. Pseudoplantarum Lb. caseissp. rhamnosus Lb. Johnsoni Lb. ssp. Leichmani G-C: 33-41 % Lb. acidophilus Lb. helveticus Lb. amylovorus Lb. crispatus Lb. gallinarum Lb. jensenii Lb. kefiranofaciens Lb.Kefirgranum Lb. san francisco Lb. Brevis Lb. reuteri Lb. Kefir Lb. Fructivorans 37 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4. Utilisation industrielle des bactéries lactiques Les bactéries lactiques présentent des activités métaboliques assez diversifiées et une capacité D‟adaptation à différents environnements (Axelsson, 1998). Cette diversité est responsable de leur large gamme d‟applications à l‟échelle industrielle. Dans l‟industrie alimentaire, ces microorganismes permettent la conversion d.une grande variété de matières premières (d‟origine animale et végétale), conduisant ainsi à de nombreux produits. Parmi ces applications, l‟industrie laitière est, sans doute, le plus grand consommateur de ferments lactiques commerciaux, pour la production de laits fermentés, fromages, crèmes et beurres. La fermentation du lait par des bactéries lactiques est à l‟origine de nombreux produits différents, chacun avec ses caractéristiques spécifiques d‟arôme, de texture et de qualité (Daly et al., 1998 ; Hugenholtz et al., 2002). L‟utilisation des bactéries lactiques pour une application industrielle donnée est déterminée par leurs propriétés fonctionnelles et technologiques. Celles-ci recouvrent les propriétés suivantes : 4.1. Activité acidifiante: la transformation du sucre assimilable en acide lactique conduit à l‟acidification du produit. Cette acidification accroît sa durée de vie, en limitant sa contamination par les microorganismes d.altération ou pathogènes, et lui confère des caractéristiques organoleptiques particulières (Frank et al., 1998; Mäyrä-Mäkinen et al., 1998) 4.2. Production de métabolites d.intérêt: selon les espèces et selon les souches, les bactéries lactiques sont capables de produire des métabolites tels que l‟acide acétique, l‟éthanol, des arômes (diacétyle, acétaldéhyde,), des bactériocines (activité antimicrobienne), des exopolysaccharides, des enzymes (protéases, peptidases, lipases,)et du CO2 (formation d‟ouvertures dans les fromages) (Frank et al., 1998; Mäyrä-Mäkinen et al., 1998; Béal et al., 2008). 4.3. Propriétés enzymatiques : les activités protéolytiques et peptidasiques sont importantes car elles déterminent la capacité des bactéries lactiques à utiliser la fraction azotée du milieu. L‟activité lypolytique présente, de plus, un intérêt pour les applications fromagères (Béal et al., 2008). 38 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 4.4. Propriétés probiotiques: en plus des activités précédentes, les souches probiotiques doivent être résistantes aux acides gastriques et aux sels biliaires rencontrés lors de leur passage dans l‟estomac, le duodénum et l‟intestin (Da Cruz et al., 2007). De plus, elles présentent des propriétés thérapeutiques spécifiques à chaque souche, principalement en termes d‟activités immunostimulantes et anti-diarrhéiques. 4.5. Critères de performance: indépendamment de la propriété fonctionnelle envisagée, les bactéries lactiques doivent être résistantes aux bactériophages, aux traitements mécaniques, à la congélation ou à la lyophilisation et au stockage. Elles doivent également être tolérantes aux inhibiteurs de la croissance (antibiotiques, acidité, éthanol, chlorure de sodium) (Béal et al., 2008). 5. les probiotiques 5.1. Définition des probiotiques Le terme “probiotique” est un mot relativement nouveau qui signifie “en faveur de la vie” et qui est actuellement utilisé pour désigner des bactéries associées à des effets bénéfiques chez l‟homme et les animaux. (FAO/OMS. 2001) Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui, lorsqu‟ils sont ingérés en quantité adéquate, ont des effets bénéfiques sur l‟organisme hôte en améliorant les propriétés de sa flore intestinale. Il s'agit le plus souvent de bactéries ou de levures présentes soit dans des aliments, notamment les produits laitiers fermentés, soit dans des compléments alimentaires sous forme lyophilisée. Les micro-organismes tués par la chaleur ne répondent pas à la définition des probiotiques, même si certains effets thérapeutiques leur ont été attribués. (Jean marc robin, et al., 2001) 5.2. Quatre grands groupes de probiotiques A) Les ferments lactiques Ils sont capables de produire de l‟acide lactique parla fermentation de certains sucres comme le lactose. Ils sont regroupés en 2 catégories, en fonction de leur morphologie : les lactobacilles (Lactobacillus bulgaris, Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus caséi) et les coques (Enterococcus et Streptococcus) 39 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE B) Les bifidobactéries D‟origine humaine ou animale, elles appartiennent à la flore intestinale normale et possèdent une bonne résistance aux sucs gastriques. La population de Bifidobactérium diminue avec l‟âge et leurs espèces varient selon l‟âge. C) Les différentes levures de type Saccharomyces Elles sont principalement utilisées par l‟industrie agroalimentaire. D) Les autres bactéries sporulées, dont Bacillus subtilis et cereus. Les genres bactériens les plus utilisés sont Bifidobacterium,Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, L.plantarum, Enterococcusfaecium et Saccharomyces. Le nombre de micro-organismes vivants présents dans chaque produit est très élevé.(Jean marc robin, et al.,2001) Tableau 12 : microorganismes considérés comme probiotiques(d‟après Hozalpfel et al ., 1998). lactobacillus bifidobacterium Autres bactéries lactique Autres micro-organismes L.acidophilus B.adolescentis Enterococcusfaecalis Bacillus spp. L.amylovirus B.animalis Enterococcusfaecium Escherichia coli strainnissle L.brevis B.bifidum Lactococcuslactis Propionibacteriumfreudenreichii l. casie B.breve Leuconstocmesenteroides Saccharomyces cereviae L.cellobius B.infuntis Pediococcusacidialactici Saccharomyces bourlardii L.crispatus B.lactis Sporolactobacillusinnulinus L.curvatus B.longum Streptococcus thermophilis L.delbrueckii B.thermophilum Streptococcus diacetylactis L.farcinimis Streptococcus intermedius L.fermentum L.gallinarum L.gasseri L.johnsonii L.paracasei L.plantarum L.reuteri L.rhamnosus 40 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 5.3. Les probiotiques pour lutter contre les bactéries pathogènes L‟inhibition des bactéries indésirables ou pathogènes par les probiotiques peut se faire de différentes façons. La production d‟acides organiques (acide lactique ou acide acétique) à partir de glucides ingérés lors de la prise alimentaire limite, en abaissant le ph, le développement des Escherichia coli et des Salmonella. La baisse des coliformes dans le tube digestif serait due au ph très bas. Ce faible ph est obtenu grâce à l‟apport de lait acidifié par de l‟acide lactique. En milieu humide, les lactobactéries produisent du peroxyde d‟hydrogène inhibiteur de nombreuses souches bactériennes pathogènes, mais respectant l‟écosystème des bactéries elles-mêmes. Cette production de peroxyde d‟hydrogène et d‟acide lactique peut bloquer le développement de certaines espèces pathogènes comme le virus de la fièvre aphteuse, certains virus de la poliomyélite, certains champignons comme le Candida Albicans, ou encore certaines bactéries comme Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Clostridium butyricum, Pseudomonas spp., Salmonella. De plus, l‟acidification favoriserait la régulation du transit intestinal.(Jean marc robin, et al., 2001) 5.4. Les amines biogènes Les amines biogènes sont des bases organiques de faible poids moléculaire provenant du animales, végétales ou microbiennes. Elles possèdent une structure aliphatique (putrescine, cadavérine, sperimidine), aromatique (tyramine, phényléthylamine) ou hétérocyclique (histamine, tryptamine). Dans le domaine alimentaire, les amines biogènes, souvent d‟origines microbienne, résultent de la décarboxylation des acides aminés, de l‟amination des cétones ou des aldéhydes et de l‟hydrolyse de composés azotés (santos.1996).Certains aliments fermentés renferment des quantités importantes d‟amines biogènes suites à l‟activité de décarboxylases microbiennes (santos.1996). Les amines biogènes peuvent aussi être d‟origine endogène, mais elles sont présentes seulement à de faibles concentrations dans les aliments non fermentés comme les fruits, les légumes, la viande, le lait ou le poisson. La plupart de ces amines endogènes possèdent de fortes activités biologiques et physiologiques (Shalaby, 1996). Elles sont également présentes dans une grande variété d‟aliments comme le chocolat, la choucroute, les produites de la mer, la bière, le vin, le fromage…. Les amines biogènes trouvées dans les aliments, ainsi que leurs acides aminés précurseurs, sont rapportées dans le tableau 13. 41 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Tableau 13 : principales amines biogènes trouvées dans les produits alimentaires (ten Brink et al., 1990) Acides aminés Amines biogènes Basiques Ornithine Lysine Aromatiques Tyrosine Phénylalanine Hétérocycliques Histidine Arginine Tryptophane Polyamines Putrescine Cadavérine Monoamines Tyramine Phényléthylamine Hétérocycliques Histamine Agmatine, spermidine, spermine tryptamine 5.4.1. Rôle des amines biogènes Les amines biogènes ont des rôles physiologiques et pharmacologiques importants. Elles se forment et se dégradent pendant le processus métabolique normal des cellules vivantes comme la régulation de la croissance (spermine, spermidine et cadavérine), la transmission nerveuse (catécholamine et sérotonine) et les médiateurs d‟inflammation (histamine et tyramine) (onal, 2007). Ces amines biogènes jouent un rôle notable dans des fonctions physiologique telles que la régulation de la température corporelle, du pH de l‟estomac et de l‟activité cérébrale. Les amines biogènes, sources du groupement NH2, servent également de précurseurs pour la synthèse d‟hormones, d‟alcaloïdes, d‟acide nucléique et de protéines. Dans des aliments, ce sont des composés aromatiques de premier plan (santos, 1996). les polyamines sont impliquées dans les processus physiologiques importants comme le développent et la croissance des fruits (Estis et al., 1998) ; elles ont par ailleurs un autre intérêt physiologique lié à la stabilisation de la membrane et à la prolifération cellulaire puisqu‟elles impliquent l‟ADN et l‟ARN et la synthèse protéique ( Bardocz, 1993). Elles sont considérées comme des microcomposants alimentaires importantes pendant la période de croissance cellulaire intense (développement intestinal des nourrissons et rétablissement post-opérationnel), bien que dans certains cas pathologiques (tumeurs) , leur consommation doive être minimisée ( Bardocz, 1993). 5.4.2. Toxicité des amines biogènes Les amines biogènes sont à l‟origine d‟intoxications directes ou indirectes du système nerveux ou du système vasculaire humain. La tyramine, la tryptamine et la B-phénylamine sont impliquées dans les crises d‟hypertension ( shalaby , 1996 ;parente et al .,2001). En 42 CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE général, les amines biogènes peuvent provoquer des urticaires, des maux de tète, des nausées, de l‟hypotension, des palpitations cardiaques, des hémorragies intracérébrales et des chocs anaphylactiques spécialement si de l‟alcool et des monoamines oxydases ont été ingérés au même moment (lange et wittmann, 2002). Les amines biogènes, comme la putrescine et la cadavérine jouent un rôle important dans l‟intoxication alimentaire.la putrescine, la spermidine , la spermine et la cadavérine n‟ont pas d‟effet toxique direct sur la santé mais peuvent réagir avec les nitrites pour former des nitrosamine cancérigènes : la formation de ces nitrosamines constitue un risque toxicologique additionnel associé aux amines biogènes , spécialement dans les produits carnés ( scanlan , 1983) . dans le cas spécifique du fromage, il est possible d‟utiliser les amines biogènes comme paramètre de qualité hygiénique de production et comme indicateur du degré de protéolyse et de typicité de certains fromages (innocente et al. 2007). la quantification des amines biogènes peut aussi être considérée comme un paramètre d‟évaluation du degré de détérioration des aliments ( leuschner et hammes, 1999) il est par conséquent important de maitriser leurs productions. 5.4.3. Les bactéries impliquées dans la production des amines biogènes Les amines biogènes peuvent être produites, lors du stockage ou du procédé de fabrication des aliments (fromages, poisson et produits carnés), par des décarboxylases bactériennes des bactéries appartenant aux genres bacillus. Clostridium , hafnia ,klebsiella , morganella , proteus , lactobacillus et enterococcus( udenfriend et al .,1959 ;halasz et al ., 1994). Ces décarboxylases possèdent une spécificité extrêmement étroite. Elles utilisent le pyridoxal-5-phosphate comme coenzyme (figure). une corrélation positive a été constatée entre la formation d‟amines biogènes et la croissance de certains micro-organismes (Jorgensen et al ., 2000 ;Marino et al.,2000). De nombreux micro-organismes, appartenant aux bactéries à gram-positif, comme les bactéries lactiques sont capables de décarboxyler un ou plusieurs acides amines et produire des amines biogènes. Figure 7 : formations d‟histamine à partir de l‟acide aminé histidine au travers de la dégradation enzymatique du groupe acide (décarboxylation). 43 Chapitre II MATERIEL ET METHODES Chapitre II : Matériel et Méthodes Matériel et Méthodes CHAPITREII MATERIELS ET METHODES 1 .Isolement des souches de bactéries lactiques 1.1. Provenances des échantillons Les échantillons de margine d’olive proviennent des régions de bordj Bou Arreridj et de Bejaia. Les échantillons sont prélevés dans des conditions d’hygiène adéquate dans des flacons stériles de 250 ml et laisser fermenté durant 4 à 6 mois. Le pH des échantillons est mesuré avant le début de l’expérimentation. 1.2. Milieux des cultures Les milieux de cultures utilisées au cours de nos expériences sont : -Milieu MRS (de Man, Rogosa et Sharpe, 1960) gélosé ou liquide est utilisé pour le repiquage et le maintien des souches de bactéries lactiques. -Milieu MRS gélosé acidifiée à pH =5.4 est utilisé pour l’isolement des lactobacilles, et incubé à 37°C -MRS gélosé additionné de 0,1% de CaCo3 (pH =5.4) pour l’isolement de la flore lactique acidifiante. Le ph du milieu favorise le développement des lactobacilles l’incubation en faite à 37°C -M17 gélosé pour l’isolement des lactocoques. -Le milieu MRSBCP (sans extrais de viande, au pourpre de bromocrysol) à 0,1% est utilisé pour l’étude du profil fermentaire des souches, -Le milieu M16BCP gélosé est utilisé pour la recherche de l’arginine dé hydrolase (ADH), -Le milieu Kempler et Mac Kay (1980) KMK est utilisé pour l'isolement des microorganismes fermentant le citrate. -Le milieu lait gélosé est utilisé pour l’étude de l’activité protéolytique. 1.3. Isolement et purification des souches Une aliquote d’un ml est prélevé de l’échantillon et une série de dilution décimale jusqu’à 10-6 est réalisée dans une solution physiologie. 1 ml des dilutions 10-4,10-5 et 10-6 est prélevé pour être ensemencé en profondeur dans le milieu approprié. Les 44 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES boites ainsi ensemencées sont incubées dans les conditions d’anaérobiose dans une jarre d’anaérobiose (MRS au CaCo3, MRS acidifie, MRS pH 6,8, M17). Après incubation 5 colonies choisies de la dilution la plus élevé à sont repiques dans du milieu MRS liquide puis incubées à 37 °C pour 18 à 24 h. Après incubation l’apparition du trouble indique la croissance des bactéries, 0.1 ml de chaque tube positif est ainsi ensemencé par stries sur milieu MRS solide, incubation à 37 °C pendant 24 heures, les souches ainsi obtenue sont repiqués sur milieu MRS solide afin de les purifies 2. Conservation des souches : Les souches sont ensemencées sur gélose MRS incliné en tube. Ces cultures sont gardées à 4 °C. Les repiquages se font toutes les deux semaines. Pour conservation de longue durée une culture de 18 h est centrifugée (4000 tr/min pendant 10 min), puis le culot est lavé. Le milieu de conservation est représenté par du lait écrémé auquel est additionnée du glycérol à 30% et 1% d’extrait de levure. La culture est conservée à 20°C pour longue durée. 45 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES Culture de 18h sur bouillon MRS Centrifugation à 4000 tours par minutes pendant 10 minutes Conservation du culot Culot est additionné de 2 ml de lait écrémé stérile à l’extrait de Levure plus 30% de glycérol Répartition dans des tubes eppendorfs Conservation a -20C° Figure 8. Schéma de conservation longue durée des bactéries lactiques purifiées (Saidi et al. 2002) 3. identification des souches bactérienne 3.1. Critères morphologiques L’examen microscopique des frottis Après coloration de Gram permet de déterminer la morphologie des cellules bactériennes (taille, forme et mode d’association) ainsi que leur affinité pour les colorants liés à la structure générale de leur paroi. Les bâtonnets à Gram positif seront examinés pour la recherche de la catalase. Les bactéries à Gram positif et catalase négatif sont présumé des bactéries lactiques. Test de mobilité Le test de mobilité consiste à réaliser un frottis bactérien vital en déposant une colonie repiquée à partir des souches isolées entre lame et lamelle puis on ajoute une goutte 46 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES de bleu de méthylène pour enfin passer à l'observation. Ce test nous permet de déterminer la mobilité ou l'immobilité de la souche étudiée (Bourgeois et Leveau, 1991). 3.2. Critères biochimiques et physiologiques 3.2.1. Hydrolase de l’arginine Pour la mise en évidence de cette enzyme, les souches à tester sont ensemencées sur milieu M16 BCP. Les boites sont incubées à 37°C pendant 24 à 48 heures. 3.2.2. Effet de la température sur la croissance Ce test est important car il permet de distinguer les bactéries lactiques mésophiles des thermophiles. Les souches sont ensemencées sur MRS liquide (pH =6.8), puis incubés à 15 C° et 45C° pendant 24h à 48h. La croissance se manifeste par un trouble bien défini du milieu et l’apparition du dépôt au fond du tube. 3.2.3. pH de croissances Les souches sont ensemencées dans du milieu MRS liquide à pH (2.4.5, 4.6, 8.9, 6) puis incubés à 37°C pour 24 à 48heures. 3.2.4. Croissance milieu en hypersalé Ce test est réalisé spécifiques pour les cocci Après l’observation d’une culture jeune des isolats (culture de 18h à 37 °C ), ces derniers sont ensemencés dans un milieu MRS liquide contenant 3% et 6.5% de chlorure de sodium (NACL) et incubés à 37°C témoin est représenté par la culture de la souche dans du MRS liquide sans sel les tubes ainsi ensemencés sont incubé pendant 5 jours. La croissance des bactéries est appréciée par l’apparition d’un trouble dans les tubes (Guiraud, 1998). 3.2.5. Le lait de Sherman On teste l’aptitude des souches à pousser en présence de bleu de méthylène. Ce test est appliqué pour différencier les Streptococcus et les Lactococcus. Les souches purifiées sur MRS liquide sont ensemencées dans deux séries de tubes contenant 9ml de lait écrémé stérile additionné à 1ml de bleu de méthylène à (1%) stérile pour la 47 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES première série, et à 1ml de bleu de méthylène (3%) pour la deuxième. L’incubation se faire à 37°C pendant 24 à 48 heures. Le bleu de méthylène tire sa couleur grâce à l'oxygène, ce test porte toujours sur le système respiratoire des lactocoques, car vu que se sont des microaérophiles, ils ne vont utilisés qu'une faible partie de l'oxygène présent dans le bleu de méthylène (3%) et de ce fait la couleur du lait (bleue) ne virera que légèrement ver le blanc et ce contrairement aux entérocoques (aérobies) qui utilisent tout l'oxygène du bleu de méthylène (Larpent et al., 1990). Les streptocoques fécaux se développent en présence de 0,1% de bleu de méthylène. Quant à Streptococcus thermophilus, il est très sensible au colorant utilisé dans ce test. 3.2.6. Recherche du type fermentaire Le test permet d’apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat carboné est transformé; il consiste à mettre en évidence la formation du gaz (CO2). C’est ainsi qu’on peut classer les bactéries lactiques en homo ou hétéro-fermentaires. Les souches sont cultivées dans des tubes contenant du MRS liquide avec une cloche de Durham pour apprécier la production de CO2. Après incubation à 37°C pendant 48 heures, la présence ou l’absence du gaz dans la cloche indique le type fermentaire (Kihal, 1996 ; Hariri et al., 2009 ). Les souches homofermentaires vont produire 90% d'acide lactique et seulement 1% de CO2, Les souches hétérofermentaires quand à elles, vont produire de l'acide lactique et du CO2 à proportions égales, ce qui va être mis en évidence par la cloche de Durham qui se remplie de gaz (Carr et al., 2002). 3.2.7. L’utilisation du citrate L’utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980).ce milieu contient une solution de ferricyanure de potassium et une solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l’ion ferrique et le potassium ferricyanide.les colonies qui fermentent le citrate lance la réaction entre ces ions, il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu (après 18h72h d’incubation à t =37°C).les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanchâtre. 3.2.8. Esculine A partir de pré-cultures bactériennes en milieu MRS, les cellules sont ensemencées en touche sur milieu gélose à l’esculine. Les boites sont incubées à 37°C pendant 48h. 48 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES L’esculine est un hétéroside formé d’un glucide complexe qui peut être dégradé par l’esculinase. Les produits de la réaction sont le glucose et l’ésculétine. L’ésculétine forme peut réagir avec les ions de fer pour donner des colonies noir. 3.2.9. La production d’acétoine La production d’acétoine est testée sur milieu Clark et Lubs (Samelis et al., 1994 ;Guiraud,1998) qui est inoculé par les souches à tester et incubé à 37°C. après 24h et dans un tube à hémolyse on dépose 2ml de cette culture avec 0,5ml de reactif α-naphtol à 6% dans l’alcool absolu (VP1) et 0,5ml d’une solution de soude (NaOH) à 16% dans l’eau distillée (VP2) pour assurer la réaction de Voges Proskaeur dite réaction de VP, on agite soigneusement les tubes et on les laisse en contact avec l’aire libre pendant 5 à 10 min à température ambiante. La production d’acétoine se traduit par l’apparition d’un anneau rose à la surface du milieu. 3.2.10. L’utilisation des carbohydrates La fermentation des carbohydrates a été menée sur milieu MRS sans extrait de viande et additionné de pourpre de bromocrysol (BCP) comme indicateur de pH (MRSBCPEV). La source de carbone est représentée par l'un des sucres suivant : arabinose, glucose, fructose, galactose, lactose, maltose, mannitol, raffinose, rhamnose, saccharose, et xylose. Les solutions sucres sont préparées à 3% et stérilisées par autoclavage. Un millilitre de la solution sucrée est additionné à 10 ml de MRSBCPEV. Vu le nombre important de souches étudiées ainsi que le nombre de tubes à essai à utiliser avec chaque souche, une mini préparation est réalisé au laboratoire. Une plaque d'Elisa est utilisée pour ses puits. Les puits de chaque ligne contiendront une source de carbone qui sera utilisée par différentes souches (figure9). Une solution bactérienne servant à ensemencer les puits contenant les différentes sources de Carbonne à été préparée. Une culture de 18 heures de la souche appropriée est centrifugée à 8000 tr/mn pendant 15 min. Le culot Matériel et méthodes ainsi récupéré est additionné de 2 ml de tampon phosphate puis recentrifugé aux mêmes conditions pour le débarrasser des restes du milieu de culture et obtenir un culot cellulaire pur. A ce culot, 5 ml de milieu MRSBCP-EV est additionné pour former la solution cellulaire servant à ensemencer les puits contenant différentes source de carbone ; 100 μl de cette solution bactérienne est déposée dans chaque puit. La lecture des résultats sa fait après 24 et 48 heures d’incubation. (Guessas, 2006) 49 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES Figure 9: schéma représentant le mini préparation pour le test de la fermentation des sucres 4. Caractérisation technologiques 4.1. Etude de la cinétique Chaque souche a été ensemencée d’abord sur MRS liquide et incubée à 37°C pendant 18h, ensuite 0,3 ml de la culture précédente a été inoculé dans un tube contenant 10 ml de lait écrémé puis Incubé à 37°C pendant 18h, 9 ml de cette préculture a été additionné à une fiole contenant 300 ml de lait écrémé sans extrait de levure. Ces 300 ml sont ensuite réparti en une série de 10 tubes de 10 ml chacun. En retirant les deux tubes de t0, les 24 tubes restant sont incubés à 37° C. chaque deux heures deux tubes ont retirés pour évaluer le pH et l’acidité titrable . le dosage de l’acidité au cours de la croissance des souches dans le lait est effectué selon la méthode décrite par Accols et al ., (1977) en utilisant :un statif avec noix et pince , une solution de NAOH , une burette de 25 ml , une pipette de 10 ml et une solution de phénolphtaline à 1% dans l’éthanol. On remplit la burette de la solution de NAOH, on la fixe au statif et on règle le niveau du liquide à zéro. Les tubes incubés contenant les cultures en lait, sont versé dans un bêcher dans lequel sont ajoutées 5gouttes de phénolphtaléine. Le titrage s’effectue sous agitation. On considéré que le virage est atteint, quand la couleur blanche du lait vire à la rose pale 50 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES et persiste pendant une dizaine de secondes. Les résultats sont exprimés en degrés dornic selon la formule suivante : acidité =n*10 dont n : volume de la souche dornic. 1 degré dornic =1°D =0,1 g d’acide lactique dans un 1 l de lait. Figure 10. Instruments pour la mesure de l’acidité titrable. 4.2. Protéolyse L’activité protéolytique a évaluée en milieu agar-lait (M-A) selon la méthode de Fransen et al., (1997) A partir de pré-cultures bactériennes en milieu MRS, les cellules sont ensemencées en touche sur milieu agar-lait tamponné. Les boites sont incubées à 37°C pendant 48h. Les bactéries possédant une activité protéolytique donne des zones claires autour de la colonie. 4.3. Recherche de l’activité lipolytique sur Agar au tween80 Le milieu est préparé par ajout de: 10 g de peptone, NaCl, 5.0g, CaCl2·2H2O 0.1g et 20 g d’agar dans 1 litre d’eau distillée le pH est ajusté à 6. Le milieu est autoclave pendant 20 minutes. 2,5 ml de Tween80 est stérilisé séparément puis ajouté au milieu. 20 ml du milieu est coulée en boite et après solidification les souches lactiques sont ensemencées par un multi-ensemenceur. L’activité lipolytique est indiquée par l’apparition d’un précipitât visible, résultant du dépôt des cristaux du sel de calcium formé par la libération des acides gras libérés par les enzymes ou un précipitât autour de la colonie dû à la dégradation complète des sels des acides gras. A intervalle régulier de 24 h d’incubation à T=37°C, les boites sont examinées pour un monitoring d’une activité lipolytique (Guessas et al ,2012) 51 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES 5. Probiotiques : 5.1. Resistance au pH acide A partir de pré-cultures bactériennes en milieu MRS liquide à déférentes pH (0.1.2) les tubes sont incubés à 37 °C pendant 3h. Après incubation les souches bactériennes sont ensemencées par strie sur milieu MRS solide les boites sont incubées à 37°C pendant 24h. . (Barbara Ripamonti ,et al.,2011). 5.2. Test d’hémolyse A partir de pré-cultures bactériennes en milieu MRS, les souches sont ensemencées en touche sur milieu gélose au sang cuit. Les boites sont incubées à 37°C pendant 48h. Une zone claire indiquant une béta hémolyse, l’halo verdâtre pour l’hémolyse alpha, et absence d’halo pour gamma hémolyse.(hosseini et al., 2009) 5.3. Resistance aux sels biliaires Etude de la survie des souches lactiques dans les conditions extrêmes du tube digestif Le but de cette étude est de sélectionner des souches lactiques extrêmophiles qui peuvent résister aux barrières physiologiques du tube digestif (pH stomacal bas, péristaltisme intestinale et concurrence bactérienne au niveau du gros intestin). La méthode utilisée est celle de Dilmi Bouras et al.,(2002) qui consiste à préparer deux fractions de bouillon MRS dont la première à Ph=2 et dépourvue de sels biliaires et le pH de cette milieu est 2 , alors que la deuxième est additionnée de 0,3% des billes avec un pH6,8. A ces différentes fractions sont additionnées : 3 % d’inoculum d’une souche lactique. Ces fractions sont dénombré à l’état initiale (0°C) et après incubation à 37°C sur boîtes de Pétri pendant les intervalles de temps suivant : 0, 3 h. ( Barbara Ripamonti ,et al.,2011). Les résultats sont évaluée pour le démembrement sur milieu solide et suivante la relation (Joffin et leyral, 2006) N= ΣC V (n1 + 0,1 n2) d1 N: Nombre d’UFC par g ou par ml de produit initial; Σ C: Sommes des colonies des boites interprétables; 52 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES V : Volume de solution déposée (ml); n1 : Nombre de boites considérées à la première dilution retenue; n2 : Nombre de boites considérées à la deuxième dilution retenue; d1 : Facteur de la première dilution retenue. 5.4. Antibiogramme L’antibiogramme des souches de lactobacilles sp. est déterminé par la technique standardisée de diffusion (d’après le comité de l’antibiogramme de la société françaises de microbiologie, 2010) sur milieu Muller-Hinton (MH) .a partir d’une culture de 18h en milieu liquide MRS et à l’aide d’un écouvillon stérile, on ensemence toute la surface du milieu. Après le séchage les disques des l’antibiotiques sont déposés à la surface du milieu (maximum 6 disques par boites de pétri) les boites sont incubé à 37°C pendant 18h à 24h. La lecture du résultat consiste à mesurer le diamètre de la zone d’inhibions de croissance provoquée par l’antibiotique. Nous avons considéré par convention, que pour un diamètre inférieure à 15mm la souche est résistante (R) a l’antibiotique et que pour un diamètre supérieur à 15mm et inférieure à 20mm est considère comme intermédiaires (I) pour un diamètre supérieur à 20mm elle est sensible (S). Les antibiotiques testés sont représentés dans le tableau(22). 5.5. Les interactions 5.5.1. Interactions entre les bactéries lactiques Les interactions entre deux populations microbiennes constituent un ensemble comble complexe de phénomènes biologiques hétérogènes. Elles sont définies selon leurs effets avantageux. Des bactéries appartenant au même système taxonomique peuvent montrer des attitudes différentes. Qui dit association de souches, dit possibilité d’interaction. Si ces interactions sont bénéfiques pour une ou plusieurs souches, on parlera de « coopération », si elles sont néfastes pour une ou plusieurs souches on parlera d’ « inhibition ». Dans un ferment constitué de plusieurs souches de bactéries, les interactions peuvent être à double sens, c'est-à-dire que chaque des souches peut Une action stimulante ou 53 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES inhibitrice sur les autres. La recherche d’éventuelle production de substances inhibitrices par les bactéries lactiques isolées est réalisée selon la méthode de la double couche. On inocule 1ml de cultures jeunes de chaque dans un tube contient 5ml de milieu MRS semi solide qui est coulé sur les colonies des bactéries lactiques déjà les développées sur milieu MRS solide tamponnée .après solidification de la sur couche, les boites de pétri sont incubées à 37°C pendant 24 à 48h. D’une zone claire autour des colonies, indiquant l’absence de croissance de la souche test, et la zone d’inhibition est mesurée. 5.5.2. Interaction par méthode directe (méthode de double couche) : Les souches pures sont ensemencées par touche à l’aide d’un multipoint sur MRS gélosé et incubées pendant 24h à 37°C (Barefoot et al, 1983). Après la croissance des souches on inocule la deuxième couche qui contient 10ml du milieu MH semi solide contenant 100µl d’une culture jeune de la souche considérée indicatrice. On laisse solidifier le milieu puis on incube à 37°C pendant 24h. Le résultat positif se manifeste par l’apparition d’une zone autour de la souche pure. 5.5. 3.Méthode indirecte Cette méthode permet de mettre en contact le surnageant des souches lactiques productrices de substance antimicrobienne avec la souche test. Les souches précédemment sélectionnées pour leur production de substances antimicrobienne sont concernées par ce test. Les souches sont cultivées dans du milieu MRS liquide et incubées pendant 18 heures. Après incubation, le milieu est centrifugé (8000 tr/mn 10 min) et le surnagent est conservé. Dans une boite de Pétri contenant du MRS solide et ensemencé par les souches test (staphylococcus aureus ATCC 6538 et Eschirichia .coli ATCC 8739), des puits sont réalisés avec un emporte pièce et celée par 10 μl de gélose MRS (figure). Les puits recevront 100 μl du surnageant de la souche à testée et les boites sont incubée à 37°C pendant 24 à 48 heures. Les colonies entourées d'une zone claire dans la nappe de culture de la souche test et ayant un diamètre supérieur à 2 mm sont considérées comme positive. 54 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES Figure 11 : Les différentes méthodes utilisées pour la recherche de substances antimicrobienne. (a) méthode de la double couche, (b) méthode de diffusion en puits. Détermination de la nature de l’agent inhibiteur. Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite par nos bactéries lactiques, il est impératif de réaliser une série de test. a- inhibition due à l’acide lactique L’acide lactique est un facteur majeur dans les inhibitions par les bactéries lactiques. Afin d’éliminer son effet, les bactéries lactiques sont cultivées dans du MRS liquide tamponné; ainsi l’acide lactique produit par la souche lactique sera neutralisé et seule la substance antimicrobienne si elle est produite exprime son action sur Staphylococcus aureus et Escherichia.coli. b- recherche de la nature protéique de la substance antimicrobienne La recherche de substances antimicrobiennes comme les bactériocines, nécessitent la recherche de la nature de cette substance qui si elle appartenait aux bactériocines devrait avoir une nature protéique. Pour ce faire le filtrat de culture de la bactérie lactique productrice est traité par différents types d’enzymes protéolytiques. Ainsi, 1 ml du filtrat de culture est traité par 1 mg/ml de trypsine ou chymotrypsine et incubé à 37°C pendant 1 heure. Le filtrat ainsi traité est stérilisé par filtration sur filtre millipore de 45 μm de diamètre. L’action de ce filtrat est testée par la méthode des puits sur milieu Chapman et incubé à 37°C pour 24 à 48 heure. 55 CHAPITREII MATERIELS ET METHODES c-Effet de la température Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur résistance à la température et la conservation de leur activité vis-à-vis de Staphylococcus aureus. Le filtrat de culture de la souche lactique productrice est traité par température 100°C puis testé sur Staphylococcus aureus et Eschirichia.coli sur milieu gélosé Chapman par la méthode des puits. 56 Chapitre III RESULTATS Chapitre III : Résultats et discutions Résultats Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Résultat et discutions 3.1. Résultat Par l’utilisation du milieu de culture sélectif (milieu MRS milieu sélectif par l’acidification ou l’ajoute de CaCo3) non sont permis d’isoler des lactobacilles et des lactocoques en se basant sur les critères morphologiques et microscopiques (figures 12/13/14/15/16/17) Les lactocoques sont confirmées pour des tests simplementair à savoir le lait de Sherman qui nous permis de déférences les entérocoques les lactocoques (figure19/20) le test de l’arginine et l’un des tests Clef pour l’identification de l’espèces (figure18), l’utilisation du citrate a et constate chez les souches de lactobacilles et lactocoques (figure21),test l’esculine une seul souche chez les lactocoques n’a pas réaliser l’hydrolyse de dernière il s’agit de le son de La2(figure22). 3.1. 1.Isolement et identification des bactéries lactiques Figure12.Aspect macroscopique des colonies de bactéries Lactiques sur MRS +CaCo3 solide Figure14. Purification des souches de Lb sur milieu lait MRS solide écrémé agar. figure13. Aspect macroscopique des colonies de bactéries lactiques sur MRS acidifiées solide figure15. Purification des souches lactocoque sur milieu MRS. 57 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Figure 16. Aspect microscopique de La souche Lactobacilles Figure 17. Aspect microscopique de La souche lactocoque Gram et observation au G x100). Gram et observation au G x100). Figure 18. Test de l’hydrolyse de l’arginine. 58 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Le lait de Sherman Après incubation aucune croissance des souches purifiées n’a été constatée sur le lait à 1% et 3% de bleu de méthylène et remarque croissance de quelque souche sur le lait à 1% et 3% de bleu de méthylène. Figure 19. Résultats de test Sherman à 1% et 3%(entérocoques). Figure20. Résultats de test Sherman à 1% et 3% ( lactocoques). 59 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION L’utilisation du citrate Toutes les souches sont dégradé le citrate. La couleur bleu reflète l’utilisation de citrate(+) Figures 21. La révélation de l’utilisation de citrate par l’apparition des colonies de contour bleu sur milieu KMK des souches. Esculine Presque la totalité des souches dégradant l’esculine .sauf la souche Lb2 a donnée de moins résultat (figure 22) Figures 22. Résultat de la dégradation de l’esculine. 60 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION La production d’acétoine Trois souches de lactoccoque sont incapables de produire de l’acetoine (La9, La10etLa4). Recherche du type fermentaire Le profile fermentaire par l’utilisation de la mini plaque Eliza nous a permes de dresser le tableau(14) qui montrent le fermentation des sucres utilisé et nous permettent d’identification nos souches. Sucres souches Figure 23. Le résultat du teste des sucre chez les lactobacilles. Sucres Souches Figure 24. Le résultat du teste des sucre chez les lactocoques 61 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Tableau 14 : les caractéristiques biochimiques, physiologiques des souches de lactobacilles isolées. souches gram catalase ADH Type fermentaire mobilité T°15 T°37 T°45 PH 2 PH 4 Utilisation de citrate Lb1 + + - Lb2 + + - Lb3 + + - Lb4 + + - Lb5 + + - Lb6 + + - Lb7 + + - Lb8 + + - Lb9 + + - Lb10 + + - Lb11 + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Hydrolyse de l’esculine L’activité protéolytique Production d’acide à partir de : Sorbitol Fructose Xylose Raffinose Maltose Galactose Amidon Tréhalose Mannitol Arabinose Rhamnus sucrose + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+ +/+ + + +/+ + + +/+ +/+ + +/+ + + + + + +/+ + +/+ + + + + +/+ + + + + +/+ +/+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + (+) résultat positif ou croissance. (-) résultat négatif ou pas de croissance D’après les résultats obtenus des tests biochimiques et physiologiques effectués, on a pu donc identifier les onze souches lactobacilles isolées comme suivante : Lactobacilles manihotivorans Lactobacilles rhamnosus (Lb1, Lb2, Lb3, Lb4) (Lb5, Lb6, Lb7, Lb8, Lb9, Lb10, Lb11) 62 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Tableau 15 : les caractéristiques biochimiques, physiologiques des souches de lactocoques isolées. souches gram catalase ADH Type fermentaire mobilité T°15 T°37 T°45 PH 2 PH 4 Test Sherman 1% La1 + + - La2 + + - La3 + + - La4 + + - La5 + + - La6 + + - La7 + + - La8 + + - La9 + + - La10 + + - La11 + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Test Sherman 3% - - - - - - - - - - - Na Cl 6,5% Utilisation de citrate Hydrolyse de l’esculine La production d’acétoine L’activité protéolytique Production d’acide à partir de : Sorbitol Fructose Xylose Raffinose Maltose Galactose Amidon Tréhalose Mannitol Arabinose Rhamnus sucrose + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + - + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+ + +/+ + + + +/+ +/+ + +/+ + + + + + +/+ + +/+ + + + + + + + +/+ + + + + + + + +/+ + + + + + + + +/+ + + + + + + + + +/+ + + + + + + + + +/+ + + + + + + + + +/+ + + + + + + + + +/+ + + + + + + + + +/+ (+) résultat positif ou croissance. (-) résultat négatif ou pas de croissance. D’après les résultats obtenus des tests biochimiques et physiologiques effectués, on a pu donc identifier les onze souches lactobacilles isolées comme suivante : Lc . lactis subsp. Lactis Lc. lactis subsp. diacetylactis (La4. La10. La9) (La1. La2. La3. La5. La6. La7. La8. La11) 63 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION En conclusion de cette étude écologique de la flore lactique les lactobacilles représentent 34,37% au même niveau que les lactocoques. La distribution entre lactocoques lactobacilles et entérocoques est à pour égale. Les espèces les plus abondante sont lactococcus.lactis subsp.diacetylactis (72,72%) et lactobacilles rhamnosus(63,63%). enterococcus lactobacillus 31,25 34,37 lactococcus 34,37 Figure 25 : Répartition des différents groupes de bactéries lactiques des souches de bactéries lactiques isolées du margine d’olive. Lc . lactis subsp. Lactis Lc. lactis subsp. diacetylactis 27,27% 72,72% Lactobacilles manihotivorans 36,36% Lactobacilles rhamnosus 63,63% Entérococcus sp 3.1.2. Caractérisation technologiques Etude de la cinétique La production de l’acide lactique à été suivie en fonction du temps en utilisant les cultures pures des nos souches, cette acidifiante est souvent utilisée dans le choix des souches pour l’industrie alimentaire. L’évolution de pH et l’évolution de l’acidité sont représente dans les figures (26/27/28/29) ont été observées nos souches (Lb2, Lb11, Lb1, Lb10) sont les plus acidifiante par apport les 64 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION autres qui confirme une possibilité de fermentation du lait avec la présence de factures de croissances. 6,9 6,4 Lb3 pH Lb1 Lb6 5,9 Lb8 Lb9 5,4 Lb4 4,9 0h 3h 6h temps(h) 9h 18h 24h Figure 26. L’évolution de pH des souches Lb3, Lb1, Lb6, Lb8, Lb9, Lb4dans lait écrémé avec extrait de levure. 6,9 pH 6,4 Lb2 Lb5 5,9 Lb10 Lb7 5,4 Lb11 4,9 0h 3h 6h temps(h) 9h 18h 24h Figure 27. L’évolution de pH des souches Lb2, Lb5, Lb10, Lb7, Lb11 dans lait écrémé avec extrait de levure. 65 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION 70 60 50 acidité(D°) Lb3 40 Lb1 Lb6 30 Lb8 Lb9 20 Lb4 10 0 0h 3h 6h 9h 18h 24h temps(h) Figure 28. L’évolution de l’acidité titrable des souches Lb3, Lb1, Lb6, Lb8, Lb9, Lb4 dans lait écrémé avec extrait de levure. 70 60 acidité(D°) 50 Lb2 40 Lb5 30 Lb10 Lb7 20 Lb11 10 0 0h 3h 6h 9h 18h 24h temps(h) Figure 29. L’évolution de l’acidité titrable des souches Lb2, Lb5, Lb10, Lb7, Lb11 dans lait écrémé avec extrait de levure. 66 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Protéolyse et lipolyse Toutes les souches ainsi testées possédant une activité protéolytique (figure 30, tableau 16) Figure 30. Activités protéolytiques (0%) Tableau 16: Activités protéolytiques chez les lactobacilles et lactocoques. Souches lactobacilles d/2 Souches lactocoques d/2 Lb1 Lb2 Lb3 Lb4 Lb5 Lb6 Lb7 7lb8 Lb9 Lb10 Lb11 12mm 17mm 10mm 10mm 13mm 4mm 11mm 11mm 14mm 5mm 12mm La1 La2 La3 La4 La5 La6 La7 La8 La9 La10 La11 5mm 4mm 6mm 3mm 4mm 5mm 4mm 2mm 6mm 4mm 7mm Aucune activité lipolytiques n’est a signalés pour l’ensemble des souches isolées. Resistance au pH acide et d’hémolyse La résistance au pH acide des souches de lactobacilles montre que ces dernies résistent au pH =2 concernant, le type d’hémolyse, aucune de nos souches n’a donne une hémolyse B. les souches Lb9, Lb7, Lb4, Lb11 n’ont donné aucune hémolyse. (Tableau 17) 67 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Tableau 17. Résultat de la résistance les lactobacilles à déférentes PH (0.1.2) souches PH=0 PH=1 PH=2 Type d’hémolyse et diamètre Lb3 - + + Alpha hémolyse halo verdâtre 9mm Lb2 + + + Alpha hémolyse halo verdâtre 8mm Lb1 + + + Alpha hémolyse halo verdâtre 8mm Lb6 - + + Alpha hémolyse halo verdâtre 15mm Lb8 - - + Alpha hémolyse halo verdâtre 11mm Lb9 - - + Gamma hémolyse absence 0mm d’hémolyse Lb5 + + + Alpha hémolyse halo verdâtre 10mm Lb10 + + + Alpha hémolyse halo verdâtre 12mm Lb7 - + + Gamma hémolyse absence 0mm d’hémolyse Lb4 + + + Gamma hémolyse absence 0mm d’hémolyse Lb11 - - + Gamma hémolyse absence 0mm d’hémolyse (+) résultat positif ou présence zone claire. (-) résultat négatif ou pas présence zone claire. Étude des interactions bactériennes Étude des interactions entre les bactéries lactiques La confrontation entre les mêmes espèces lactiques permet de détecter la présence d’une interaction antagonisme par la présence d’une zone d’inhibition autour des colonies productrices, ce qui nous oriente vers la présence d’une substance proche de bactériocine. 68 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Tableau18: l’interaction entre les bactéries lactiques. Lb3 Lb2 Lb1 Lb6 Lb8 Lb9 Lb5 Lb10 Lb7 Lb4 Lb11 Lb3 - + + - - + + + + - - Lb2 + + + - - + + + + - + Lb1 + + - - - + - - + - - Lb6 + + + - - - - - + - - Lb8 + + + - - - + - + - - Lb9 + + - - - + - - - - + Lb5 + + - - - - - - - - - Lb10 + + - - - - + - - - - Lb7 + + + - - + + - + - - Lb4 + + + - - + + - + - - Lb11 + + + - - + + - + - - (+) résultat positif ou présence zone claire. (-) résultat négatif ou pas présence zone claire. Les interactions et la recherche de la nature de l’agent inhibiteur La détermination de l’activité antimicrobienne des nos isolats sont mettre en évidence par la diffusion sur milieu solide en utilisant la méthode d’interaction directe (Rayan et al 1996), vis-à-vis les bactéries pathogènes (Escherichia coli ATCC8739, staphylococcus aureus ATCC6538). Après l’incubation à 37°C et pendant 18h nous avons remarqué l’apparition d’une zone claire autour de la souche productrice. Cette zone indique l’inhibition des deux bactéries indicatrices par les souches sélectionnées. (Figure31) Zone claire Figure 31. Inhibition de staphylococcus par les lactobacilles en utilisant la méthode directe. 69 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION La zone claire est l’indice de l’inhibition des bactéries pathogènes alors certain nos souches sont des souches productrices de substances antimicrobiennes. Notre étude d’interaction nous a permis de conclure que le diamètre d’inhibition varis selon les espèces. Le tableau(19) illustre les diamètres des zones d’inhibition de la croissance des bactéries indicatrices. Détermination de l’agent inhibition (méthode indirecte) Nos souches produisent des acides organiques tels que l’acide lactique qui libèrent dans le milieu de culture ce qui conduit à l’acidification et qui peuvent être une cause principale d’inhibition des souches indésirables. On a remarqué que le diamètre de la zone d’inhibition sur milieu tamponné (pour élimine l’acidité) est mois important que celui sur milieu normal. Après le traitement du surnageant avec la température on a remarqué quelques souches il y à une inhibition après les chauffages d’une température de 100°C. Que veux dire que la substance résiste à la température (Lachance, 2000 ;Labioui et al ,2005). Après le traitement du surnageant avec la chymotrypsine il y à une disparition de la zone d’inhibition, ceci indique que l’agent inhibiteur est sensible à la protéase. Les résultats obtenus après le traitement thermique du surnageant contenant la substance et les tests des enzymes protéolytiques ainsi que l’élimination de l’acidité nous on permit de sélectionner des souches productrices de substance antimicrobienne d’une nature protéique thermorésistant (Hugas et al, 2003) (tableau19). 70 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Tableau19. Activité antimicrobien de lactobacille vis–à-vis staphylococcus aureus et Escherichia coli on utilisant milieu tamponné traité avec la chymotrypsine et température 100°C. Lactobacilles Lb3 Lb2 Lb1 Lb6 Lb8 Lb9 Lb5 Lb10 Lb7 Lb4 Lb11 Escherchia coli 24mm 18mm 30mm 15mm 15mm 21mm 19mm 27mm 33mm 20mm 34mm Staphylococcus - 17mm 20mm 15mm 18mm 30mm 14mm 24mm - 12mm 22mm - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 16mm 14mm - - 13mm - - 7mm - - 17mm - - - - 13mm - - - - - - Souches pathogènes aureus Eschechia coli (surnageant + enzyme) Staphylococcus aureus (surnageant + enzyme) Escherchia coli (surnageant traité par la température100°C 10 min) Staphylococcus aureus (surnageant traité par la température100°C 10 min) - : absence la zone d’inhibition 71 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Zone d’inhibition Figure 32. Activité antimicrobien de lactobacille vis–à-vis staphylococcus aureus et Escherichia coli on utilisant milieu tamponné traité avec la chymotrypsine et température Resistance aux sels biliaires Toutes les souches ensemencées sur milieu MRS contenant de bille développent un trouble confirmant leur résistance aux sels biliaires. Figure33. Nombres de colonies caractéristiques de Lactobacilles sur MRS. Pour confirmer la résistance au pH acide et aux sels biliaires des dénombrements ont été effectuée pour évaluée la croissance de nos souches dans les conditions. Le dénombrement a été effectué à 0h et 3h pour le pH=2 et à la concentration des 0,3% de sels biliaires. 72 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Tableau 20: Nombres de colonies caractéristiques de Lactobacilles sur MRS. Dilutions souches 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Dénombrement Lb5+ bille (h0) >300 >300 >300 >300 294 >300 232 194 44 43 42 11 6,95 x106 UFC/ml >300 >300 >300 >300 >300 >300 196 182 61 40 29 32 2,31 x107 UFC/ml >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 280 260 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 300 280 >300 175 151 128 290 300 270 200 300 ND >300 >300 >300 >300 300 295 300 >300 240 280 280 200 200 188 245 175 85 110 280 270 190 187 250 150 121 93 290 191 190 200 250 230 85 126 174 140 74 81 150 129 42 55 80 82 45 39 58 140 32 39 31 149 64 69 130 126 33 21 30 35 28 33 18 36 42 20 ND ND 11 16 49 55 ND 37 20 26 32 35 50 ND 4 7 7 7,01 7,45 x106 UFC/ml x106 UFC/ml 3,05 x106 UFC/ml 7,68 6,17 x106 UFC/ml x105 UFC/ml 3,16 1,45 x107 UFC/ml x107 UFC/ml >300 >300 >300 >300 210 160 45 26 240 129 36 ND >300 >300 >300 >300 248 170 60 5 231 184 55 10 >300 >300 >300 >300 >300 290 120 110 9 130 119 16 >300 >300 >300 >300 190 74 21 7 160 79 18 8 >300 >300 >300 >300 100 50 36 ND 150 40 37 ND >300 >300 >300 >300 200 60 40 32 210 75 56 24 Lb5+bille (h3) Lb5:pH=2(h0) Lb5 : pH=2(h3) Lb9+ bille (h0) Lb9+bille (h3) Lb9:pH=2(h0) Lb9:pH=2(h3) Lb11+ bille (h0) Lb11+bille (h3) Lb11:pH=2(h0) Lb11:pH=2(h3) Lb4+ bille (h0) Lb4+bille (h3) Lb4:pH=2(h0 Lb4:pH=2(h3) Lb7+ bille (h0) Lb7+bille (h3) Lb7:pH=2(h0 Lb7:pH=2(h3) ND : Non déterminé 73 3 x107 UFC/ml 6,67 x106 UFC/ml 7,87 x106 UFC/ml 3,45 x106 UFC/ml 3,86 x106 UFC/ml 3,49 x106 UFC/ml 4,27 x106 UFC/ml 6,30 x105 UFC/ml 2,28 x106 UFC/ml 10 1,8 x106 UFC/ml 2,85 x106 UFC/ml Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION La suite de Tableau 20: Nombres de colonies caractéristiques de Lactobacilles sur MRS. dilutions souches 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Dénombrement Lb2 + bille 0h >300 >300 >300 >300 270 255 55 37 10 9 2 1 2,80 x106 UFC/ml Lb2 + bille 3h >300 >300 >300 >300 >300 >300 291 285 272 259 157 176 6,48 x107 UFC/ml Lb3 + bille 0h >300 >300 >300 >300 290 280 260 250 63 58 17 8 5,4 Lb3 + bille 3h >300 >300 >300 >300 >300 >300 286 279 180 197 140 155 5,12 x107 UFC/ml Lb1 + bille 0h >300 >300 >300 >300 240 220 200 190 95 112 35 21 4,91 x106 UFC/ml Lb1 + bille 3h >300 >300 >300 >300 >300 >300 252 277 205 210 198 186 5,98 x107 UFC/ml Lb8 + bille 0h >300 >300 >300 >300 290 280 150 180 73 76 30 50 5,08 x106 UFC/ml Lb8 + bille 3h >300 >300 >300 >300 >300 >300 299 288 248 237 230 188 6,71 x107 UFC/ml Lb10 + bille 0h >300 >300 >300 >300 >300 290 298 257 150 168 71 55 1,05 x107 UFC/ml Lb10 + bille 3h >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 278 281 240 260 4,8 x108 UFC/ml Lb6 + bille 0h >300 >300 >300 >300 >300 >300 108 105 51 46 10 7 1,5 x107 UFC/ml Lb6 + bille 3h >300 >300 >300 >300 >300 >300 >300 298 255 280 203 199 1,01 x106 UFC/ml x108 UFC/ml Antibiogrammes L’antibiogramme a été effectué sur 11 souches de lactobacilles, en utilisant quinze antibiotiques avec des doses différents sur milieu Muller-Hinton(MH). Le but de l’antibiogramme est de voir les souches ainsi isolés développent une quelque résistance aux antibiotique qui représente une barrière à l’encoure de l’utilisation des souches résistance an tant que ferment lactique (tableau 22/figure42*43) La constatation faite est que toutes nos souches sont résistante aux antibiotiques suivantes : acide nalidixque (30µg) colistin(50µg) Sulphonamides(200µg) oxacillin(1µg) et acide pipimidique (20µg). 74 Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION La souche Lb3 résiste a toues les antibiotiques testés on cite l’amoxicilline gentamicine et la chloramphenicol. Tableau21: Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles. Antibiotiques Charge du disque symbo le Lb3 Lb2 Lb1 Lb6 Nalidixie acid 30µg NA 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R spiramycine 100µg SP 0 R 30 S 35 S 34 S 28 S 0 R 32 S 37 S 34 S 0 R 0 R Lincomycine 15µg L 0 R 0 R 25 S 29 S 12 R 0 R 26 S 22 S 33 S 19 I 0 R Trimethoprimsulfamethoxazole 1.25/2 3.75µg SXT 0 R 0 R 0 R 30 S 0 R 12 R 0 R 33 S 35 S 0 R 0 R Colistin 50µg CS 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R Gentamicin 10ul GM 20 I 22 S 23 S 25 S 25 S 0 R 28 S 22 S 23 S 18 I 21 S Erythromycin 15µg E 10 R 25 S 25 S 24 S 22 S 0 R 21 S 20 I 22 S 15 R 18 I Sulphonamides 200µg SSS 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R Amoxycilin + clavulanic acid 20/10µ g AMC 25 S 24 S 40 S 42 S 31 S 0 R 31 S 30 S 37 S 21 S 30 S Nitroxolin 20µg NI 15 R 22 S 26 S 27 S 20 I 27 S 21 S 25 S 29 S 22 S 25 S Pristinamycin 15µg PT 0 R 0 R 35 S 35 S 33 S 35 S 38 S 32 S 38 S 25 S 30 S Oxacillin 1µg OX1 0 R 0 R 12 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R Chloramphenicol 30µg C 0 R 28 S 32 S 32 S 33 S 37 S 34 S 25 S 32 S 25 S 25 S Amoxicillin 25µg AMX 0 R 26 S 41 S 30 S 29 S 29 S 35 S 40 S 32 S 24 S 25 S Pipemidic acid 20µg PI 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R : résiste /S : sensible /I : intermédiaire. 75 Lb8 Lb9 Lb5 Lb10 Lb7 Lb4 Lb11 R Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION Zone claire Figure34. Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles Lb5 Zone claire Figure 35. Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles Lb8 76 Chapitre IV DISCUTIONS Discutions générale L’étude de la microflore lactique isolées des margines d’olives fermentés, nous a permis d’isoler, de caractériser, et d’identifier 32 souches de bactéries lactiques réparties essentiellement comme suit : 11souches de lactocoques dont 3 espèces de Lc. lactissubsp. lactis, 8 especes de Lc. lactissubsp. diacetylactis et de 11souches lactobacilles réparti en 7 espèces de Lb.Rhamnosus et 4 espèces de Lb .manihotivoran. Les entérocoques sont représentés par 10 souches. Les lactobacilles représentent 34,37% de la flore lactique.L’espèce la plus dominante pour ce groupe est Lactobacillus rhamnosus 63,63%. Lactobacillus manihotivoranse st aussi représenté parmi les souches isolées 36,36%. Les lactocoques sont représentés par deux espèces qui sont Lactococcuslactissubsp. lactis 27,27% et lactococcus.lactissubsp. Diacetylactis 72,72%. De ces résultats nous avons constaté que la quantité d’acide lactique produite change selon le stade de vie des bactéries cette différence de production peu être expliqué par une déficience dans le système du transport des substances fermentescibles du milieu vers le cytoplasme cellulaire. (Albenzino et al., 2001) L’activité protéolytique et lipolytique sont des activités très recherchées dans la sélection des ferments lactiques pour l’industrie de plusieurs produits laitier et surtout celle des fromages comme rapporte plusieurs autheurs (Essidet al., 2009 ; Nieto-Arribaset al., 2010). Les lactobacilles isolés du margine d’olives n’ont pas exprimés une activité lipolytique. Des études faites par Guessas et al.,(2012) confirme nos résultats en trouvant la plupart de leur souches de lactobacilles incapable d’exprimer une activité lipolytique. De même d’autre travaux arrive à la même conclusion (Kenneallyet al., 1998; Papamaloniet al., 2003). Les bactéries possédant une activité protéolytique donne des zones claires autour de la colonie. Avec des diamètres différents. Des résultats similaire ont été trouvés par (Kacem et Kaid-Harache,. 2008). Nos souches présentent une résistance aux sels biliaires confirmé par la croissance variable sur milieu MRS solide ce ci nous permet de dire que nous souches sont de bonnes candidat pour être probiotiques (Rui-XiaGu 2008). La résistance au pH acide des souches de lactobacilles montre que ces dernies résistent au pH =2 pour le type d’hémolyse, aucune de nos souches n’a donne une hémolyse B. les souches 77 Chapitre IV DISCUTIONS Lb9, Lb7, Lb4, Lb11 n’ont donné aucune hémolyse cette propriété appuyé fortement notre conclusion pour l’effet probiotiques. Des résultats similaires ont être trouvés par (Santiago et al., 2009). Les souches de bactéries lactiques testées pour leur pouvoir inhibiteur vis-à-vis de Staphylococcus aureus et Escherichia coli ont montré leur capacité antagoniste envers ces deux souches par la production de substances dans le milieu de culture. Pour l’antibiorésistance indiquent que toutes les souches sont résistantes à la Colistin(10µl) , Oxacillin(1µg), Pipemidicacid(20µl), selonGuessas et al., (2012). Trimethoprim- sulfamethoxazole(1,25/23,75 µg) (Santiago Ruiz et al ., 2009) et sensible à Amoxycilin + clavulanicacid (20/10µg), Amoxicillin (25µg), gentamicine (10µl), (Guessas et al., 2012), Chloramphenicol (30µg) (Kacem et Kaid-Harche.2008). 78 conclusion CONCLUSION Conclusion conclusion Conclusion CONCLUSION Conclusion L’industrie oléicole est une activité importante, concentrée principalement dans les pays du bassin méditerranéen, qui tiennent approximativement 95% de la production mondiale, dont 1% produit par l’Algérie en 2001. Dans ce travail, 32 souches de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées à partir du margine d’olives des différentes régions d’Algérie. Les lactobacilles représentent 34,37% de la flore lactique. L’espèce la plus dominante pour ce groupe est Lactobacillus rhamnosus avec 63,63%. Lactobacillus manihotivorans 36,36%. Les lactocoques sont représentés par deux espèces qui sont Lactococcus lactis subsp. lactis 27,27% et lactococcus. lactis subsp. Diacetylactis 72,72%. On note la présence des entérococcus sp. Les bactéries lactiques isolées et identifiée montrent une capacité à inhiber les souches de Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Ces deux souches indésirables sont connues comme contaminant des produits laitier acidifiés. Toutes les souches représentent une activité protéolytique et ne possèdent aucune activité lipolytique. Nos souches elles sont résistes aux variations du pH à présence ou en absence de sels biliaires c'est-à-dire elles sont présence un effet probiotique. L’étude de la cinétique d’évolution de pH et de l’acidité en milieu lait de nos souches, ont été observées nos souches (Lb2, Lb11, Lb1, Lb10) sont les plus acidifiante par apport les autres qui confirme une possibilité de fermentation du lait avec la présence de factures de croissances. L’antibiogramme des nos souches sont résistante aux antibiotiques (acide nalidixque, colistin Sulphonamides, oxacillin, acide pipimidique). Et sensible aux antibiotiques (gentamicin, acide clavulanique, nitroxolin, pristinamycin, chloramphenicol, amoxicillin). 79 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Aissam H., Errachidi F., Merzouki M., Benlemlih M. (2002) Identification des levures isolées des margines et étude de leur activité catalase. Cahiers de l'Association Scientifique Européenne pour l'Eau et la Santé, 7, 23-30. Alain, L. Servin 2004 .Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens Institut National de la Sant_e et de la Recherche M_edicale (INSERM), Unit_e 510, Pathog_enes et Fonctions des Cellules Epith_eliales Polaris_ees, Facult_e de Pharmacie Paris XI, F-92296 Ch^atenay-Malabry, France. Alburquerque, J.A., Gonzálvez, J., García, D., Cegarra, J., 2004. Agrochemical characterisation of ''alperujo'', a solid by-product of the two phase centrifugation method for olive oil extraction. Bioresource Technology 92 (2), 195-200. Amirante, P., Pipitone, F., 2002. Utilisation des sous-produits de la filière oléicole. Science et Technique. OLIVÆ/N° 93-Octobre 2002. Annaki, A., Chaouch, M., Rafiq, M. (1999b) Influence de la durée du stockage des olives sur l'évolution de la composition des margines. L'eau. L'industrie. Les nuisances, 218, 24-28. Annaki, A., Chaouchi, M. (1999). Traitement des margines mélangées avec les eaux usées urbaines par digestion aérobique. Revue Marocaine du génie civil, N° 83, septembre/octobre, pp 53-57. Asehraou, A., Faid, M. and Akhartouf, R. (1993). Pure culture fermentation of green olives by Lactobacillus strains. Microbiologie-Aliments-Nutrition, 11, pp: 221-228. Asehraou, A., Peres, C., Brito, D., Faid, M. and Serhrouchni, M. (2000). Characterization of yeast strains isolated from bloaters of fermented green table olivesduring storage. Grasas y Aceites, 51, pp: 225-229. Axelsson, L. (1993). Lactic acid bacteria: classification and physiology. In: Lactic acid bacteria. Salminen S. and von Wright A., pp: 1-63. Marcel Dekker Inc. New York. Axelsson, L. (1998). Lactic acid Bacteria: Classification and Physiology in Lactic acid Bacteria, Microbiology and Functionnal Aspects. Salminen S., Von, Wright A, Ed. Marcel Dekker, New York. 1-72. Azabou, S., Najjar, W., Gargoubi, A., Ghorbel, A. et Sayadi ,S., 2007. catalytic wet peroxide photo-oxidation of phenolic olive oil mill wastewater contaminants: part ii. degradation and detoxification of low-molecular mass phenolic compounds in model and real effluent. applied catalysis b: environmental. 77: 166-174. 80 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Bacus, J.N. and Brown, W.L. (1985b). The pediococci: meat products. In: Bacterial Starter Cultures for foods. Gilliland S. E., 7, pp: 86-96. CRC Press Inc. Boca Baton. Florida. Balice, V., Boari, G., Cera, O., Abbaticchio, P. (1982) Indagine analitica sulle acque di vegetazione. Nota 1., Inquinamento, 7, 49-53 Balice, V., Carrieri, C., Carrieri, G. (1997) Trattamento chimico-fisico seguito dal biologic delle aque di vegetazione delle olive, Ricerca, 2, 50-53. Balice, V., Carrieri, C., Cera, O., Rindone, B. (1988). The fate of tannin-like compounds from olive mill effluents in biological treatments. In Hill and Robinson: Proceedings of the Fifth International Symposium on anaerobic digest. Balice, V., Cera, O. (1984) Acidic phenolic fraction of the juice of olives determined by gas chromatographic method. Grasas y Aceites, 25, 178-180. Bambalov, G., Israilides, C., Tanchev, S. (1989) Alcohol Fermentation in olive Oil Extraction Effluents, Biological Wastes, 27, 71-75. Barbara, R., Alessandro, A., Carla, B., Paola, D, D., Chiara, P., Silvia, P., Raffaella, R. , Giovanni, S. , Simone, S., Alberta, S, Erica, T., Cinzia, D. (2011).Screening of species-specific lactic acid bacteria for veal calves multi-strain probiotic adjuncts. Contents lists available at ScienceDirect Anaerobe Bardocz S .(1993) the role of dietary polyamines. European journal of clinical nutrition . 47 , 10, 683-90. Barefoot, SF, Klaenhammer, TR. 1983. Detection and activity of lactacin B,. a bacteriocin produced by Lb. acidophilus. Appl Environ Microbiol. ;45(6):1808–1815. Béal, C., Marin, M., Fontaine, E., Fonseca, F. and Obert, J. P. (2008). Production et conservation des ferments lactiques et probiotiques. In Bactéries lactiques, de la génétique aux ferments. Corrieu G. et Luquet F. M, Ed. Tec et Doc Lavoisier, Paris. 661785. Benhamouche,N., (2005). Sélection de bactéries lactiques productrices de substances antimicrobiennes de la collection du laboratoire de microbiologie appliquée (LMA). Thèse de magister. Université d’Oran Es-senia. Bensemmane, A. 2009. Le trait d’union des opérateurs économiques pour le Renouveau du Monde Agricole et Rural. 1er forum méditerranéen de l’oléiculture, 1111- 4762. Benyahia, N., et Zein, K. (2003). Pollution and development issues in the Mediteranean basin, 2nd conference international Swiss environmental Solutions for emerging Countries (SESECII), Lausane, Suisse, 28-29 . 81 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Bianchi, G. (1999). Extraction systems and olive oil. Dans: Oléagineux, Corps gras, lipides, 6 (1), pp: 49-55. Borcakli,, M., Orzay, G., and Alperden, I. (1993a). Fermentation of Turkish olives with traditional and aerated systems. In: Food flavours, ingredients, and composition. pp: 263277. Elsevier Science Publisher. Borja, R., Banks, C.J., Alba, J. (1995a) A simplified method for determination of kinetic parameters to describe the aerobic biodegradation of two important phenolic constituents of olive mill wastewater treatement by a heterogeneous microbial culture. Eniro, Sci. Health., A., 30 (3), 607-626. Borja, R., Martin, A., Alonso, V., Garcia, I., Banks, C.J. (1994). Influence of different aerobic pre-treatment on the kinetic of anaerobic digestion of olive mill wastewater. Water Research. 19, 489-495. Borja, R., Martin, A., Alonso, V., Garcia, I., Banks, C.J. (1995). Influence of different aerobic pretreatments on the kinetics of anaerobic digestion of olive mill waste water. Pergamon. 2, 489-495. Boubekri, K., and Yoshiyuki, O. (1996). Identification of lactic acid bacteria from Algerian traditional cheese, El-Klila, Journal of the Science of Food and Agriculture, l70, Breton, A. (1985). Identification des moisissures. Dans : Moisissures utiles et nuisibles, importance industrielle. Botton et al., Ed. Masson Paris, pp : 34-209. Briante, R., Patumi, M., Febbraio, F., Nucci, R., 2004. Production of highly purified hydroxytyrosol from Olea Europaea leaf extract biotransformed by hyperthermophilic βglycosidase. Journal of Biotechnology 111, 67-77. campaniello, d., bevilacqua, a., d’amato, d., corbo, m.r., altieri, c. and sinigaglia, m. (2005). Microbial Characterization of Table Olives: Processed According to Spanish and Natural Styles. Food Technology and Biotechnology, 43, (3), pp: 289–294 Capasso, R. (1997) The chemistry, biotechnology and ecotoxicology of the polyphenols naturally occurring in vegetable wastes. Curr. Top. Phytochem., Res. Trends, 1, 145-156. Capasso, R., De Martino, A., Arienzo, M. (2002a) Recovery and characterization of the metal polymeric organic fraction (polymerin) from olive oil mill wastewaters. J Agric Food Chem., 50 (10), 2846-55. Capasso, R., De Martino, A., Cristinzio, G. (2002b) Production, characterization, and effects on tomato of humic acid-like polymerin metal derivatives from olive oil mill waste waters. J Agric Food Chem., 50 (14), 4018-24. 82 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Castano,S.,Desbata, B., Delfour, A.,Dumas, J.M., Silva, A., Durfourcq, J.(2005) ; study of structure and orientation of mesenterocin Y105, a bactériocin from gram - positive leuconostoc mesenteroides, and its trp-substituted analogues in phospholipids environnements. Bioch. Bioch. Acta 1668 :87-98. Catulo, L., Leitão, F., Silva, S., Oliveira, M.M., Peres, C., Gomes, M.L. and Fernandes, I. (2002). Table Olive Fermentation of Galega Portuguese Variety. Microbiological, Physico-Chemical and Sensorial Aspects. ISHS Acta Horticulturae, 586 IV International Symposium on Olive Growing (October 2002). Centre d'Activités Régionales pour la Production Propre (CAR/PP), 2000. Prévention de la pollution dans la production d'huile d'olive. Ministère de l'Environnement, Espagne. Cereti, C.F., Rossini, F., Federici, F., Quaratino, D., Vassilev, N., Fenice, M. (2004). Reuse of microbially treated olive mill wastewater as fertiliser for wheat (Triticum durum Desf.). Bioresource Technology. 91, 135-140. Chamkha, M. (2001). Etude du métabolisme de composés aromatiques par des bactéries anaérobies isolées de margines d’olives et de tourteaux de karaté. Université de Provence Aix-Marseille, 85 p. Chapman, H.R. and Sharpe, M.E. (1981). Microbiology of cheese. In: Dairy Microbiology, Robinson R.K., Eds., Vol. 2, The microbiology of milk products, Applied Sciences Publishers LTD, London, pp: 157-243. Chimi, H. (1997) Sous produits de la transformation des olives: possibilités de valorisation et de traitement des margines. Cours international sur l’amélioration de la qualité de l’huile d’olive. 30-11. Chiofalo, B., Liotta, L. Zumbo, A., Chiofalo, V. 2004. Administration of olive cake for ewe feeding: effect on milk yield and composition. Small Ruminant Research, 55 : 169–176. Ciafardini, G., Marsilio, V., Lanza, B. and Pozzi, N. (1994). Hydrolysis of Oleuropein by Lactobacillus plantarum strains associated with olives fermentation. Applied Environmental Microbiology, 60, pp: 4142-4147. Collins, M.D., Farrow J.A.E., Phillips, B.A. and Kandler, O. (1983). Streptococcus garviae sp. Nov. and Streptococcus plantarum sp. Nov. Journal of General Microbiology, 129, pp: 3427-3431. Da Cruz, A. G., Faria, J. A. F., Van Dender, A. G. F. (2007). Packaging system and probiotic dairy foods. Food Res. Int. 40: 951-956. 83 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Dalache, F .,Kacem, M ., et Karam, N.E.2003.antibiorésistance de bactéries lactiques Isolées de laits crus de vache , chévre , brebis et chamelle d’algérie . Renc. Rech.Ruminants. p231 Daly, C., Fitzgerald, G. F., O’Connor, L., Davis, R. (1998). Technological and health benefits of dairy starter cultures. Int. Dairy Journal. 8: 195-205. D'Annibale ,A., Stazi, S.R., Vinciguerra, V., Giovannozzi Sermanni, G. (2000) Oxiraneimmobilized Lentinula edodes laccase: stability and phenolics removal efficiency in olive mill wastewater. J Biotechnol., 77 (2-3), 265-73. Davis larone, H. (1987). Medically important fungi. A guide to identification. 2nd edition Elsevier, London, 230 p. De Felice, B., Pontecorvo, G., Carfagna, M. (1997) degradation of waste waters from olive oil mills by Yarrowia lipolytica ATCC 20 255 and pseudomonas pitida. Acta Biotechnol., 17, 231-239. De Marco, E., Savarese, M., Paduano, A., Sacchi, R., 2007. Characterization and fractionation of phenolic compounds extracted from olive oil mill wastewaters. Food Chemistry 104, 858-867. De Monpezat, G., Denis, J-F., 1999. Fertilisation des sols méditerranéens avec des issues oléicoles. Oléagineux corps gras lipides: volume 6, numéro 1, Janvier/Février 1999. De Roissart, H.B. (1986). Les bactéries lactiques. Dans : le lait et les produits laitiers. Luquet F. M., 3, Eds. Techniques et Documentations Lavoisier. Paris, pp: 343-407. Dellaglio, F., Sarra, P.G. and Vescovo, M. (1981A). DNA-DNA homology ofn Pediococcus strains isolated from some Italian cheeses. Zentralbi. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg., 1 Abt. Orig. C2, pp: 278-281. Dellaras, C., 2007. Microbiologie pratique pour le laboratoire d’analyses ou de contrôle sanitaire. Lavoisier Tec et Doc. Paris. PP 476. Derache, PH., et Derache, R. (1986). Toxicité des champignons. Dans :Technologie et s écurité des aliments. pp : 199-228. Tech. et Doc. Lavoisier, Paris. Desmazeaud, M. (1996). Les bactéries lactiques dans : L’alimentation humaines : utilisation et innocuité. Cahiers Agricultures, 5, pp: 331-343. Devoyod, J.J., et Poullain, F. (1988). Les Leuconostocs propriétés : leur rôle en technologie laitière. Revue Le lait, 68 (3), pp: 249-280. 84 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Di Giovacchino, L., Basti, C., Costantini, N., Ferrante, M.L., Surricchio, G. (2001). Effects of olive vegetable water spreading in the soil cultivated with maize and grapevine. Agricoltura Mediterranea. 131, 33-41. Di Giovacchino, L., Basti, C., Costantini, N., Surricchio, G., Ferrante, D., Lombardi, D. (2002). Effet de l’épandage des eaux de végétation des olives sur des sols complantés de mais et de vigne. Olivae. 91, 37-43. Dias Albino, A., Bezerra, M., Nazare, P.A. (2004). Activity and elution profile of laccase during biological decolorization and dephenolization of olive mill waste water. Bioresource Technology. 92, 7-13. Di-Giovacchino, L. (1996) L’influence des systèmes d’extraction, sur la qualité de l’huile d’olive, Olivea, 63, 52-63. Di-Giovacchino, L., Mascolo, A., Seghitti, L. (1988) Sulle caractteristiche telle delle acque divegetazione delle olive. La Rivista delle Sotanze Grasse. 65. El Alami, B. (2000). Contribution à l’étude de l’activité anti-oxydante de la fraction phénolique des margines. Mémoire de 3ème cycle, Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, Rabat, Maroc. 93 p El hajjouji ,H. 2007. Evolution des caractéristiques physico-chimiques, spectroscopiques et écotoxicologiques des effluents d’huileries d’olive au cours de traitements biologique et chimique. Thèse de doctorat. Université de Marrakech. 148p. El Hajjouji, H., Fakharedine, N., Baddi, G.A., Winterton, P., Bailly, J.R., Revel, J.C. et Hafidi, M., 2007. Treatment of olive mill waste water by aerobic biodegradation: an analytical study using gel permeation chromatography, ultraviolet–visible and Fourier transform infrared spectroscopy. Bioresource Technology. 98: 3513-3520 El Hassani, F.Z., Mdaghri Alaoui, S., Errachidi, F., Aissam, H., Merzouki, M., Benlemlih, M., 2005. Effet de l’épandage des margines sur le rendement d’une culture de maïs et sur les abondances de certains groupes microbiens du sol. 3ème Journées Internationale des Géosciences de l’Environnement. El Jadida. Ergül, F.E., Sargin, S., Ongen, G. et Sukan, F.V., 2009. Dephenolisation of olive mill wastewater using adapted Trametes versicolor. International Biodeterioration and Biodegradation. 63: 1-6. Esti, M ., Volpe,G., Massignan,L., Compagnone,D., La Notte,E. and Palleschi,G. (1998) determination of amines in fresh and modified atmosphere package fruits using electrochemical biosensors .jornal of agricultural and food chemistry . 46 ,4233-4237. 85 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES FAO/OMS. 2001. Consultation mixte d’experts FAO/OMS sur l’évaluation des propriétés sanitaires et nutritionnelles des probiotiques dans les aliments, y compris le lait en poudre contenant des bactéries lactiques vivante. Organisation des Nations Unies Organisation mondiale de la santé pour l’alimentation et l’agriculture. Cordoba, Argentine Farrow, J.A.E., Facklam, R.C. and Collins, M.D. (1989). Nucleic acid homologies of some vancomycyn-resistant Leuconostocs and description of Leuconostoc citreum sp. Nov. and Leuconostoc pseudomesenteroides sp. Nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 39, pp: 279-283. Fenice, M., Giovannozzi Sermanni, G., Federici, F., D'Annibale, A. (2003) Submerged and solid-state production of laccase and Mn-peroxidase by Panus tigrinus on olive mill wastewater-based media. J Biotechnol, 100 (1), 77-85 Fernandez Diaz, M.J. (1983) Olives. In Rehm HJ, Reed G (eds) Biotechnology, Verlag Chemie, Weinheim, 5, 379-397. Field, J.A., Lettinga, G. (1991) Treatment and detoxification of acqueous spruce bark extracts by Aspergillus niger, Water Sci. Technol., 24, 3/4 127-137. Fiestas Ros de Ursenos, A.J., Navarro, G.R., Leon, C.R., Garcia, A.J., Maestro, G.M. (1983). Epuration des margines par digestion anaérobie en vue de leur utilisation comme source d’énergie, valorisation des sous-produits de l’olivier, pp 131-139. Fiestas Ros de Ursenos, J.A. (1981). Différentes utilisations des margines : Actes séminaire international sur la valorisation des sous-produits de l’olivier. FAO-UNDP. Tunisie, pp 93-110. Fiestas Ros de Ursinos, J.A., Borja, R. (1992) Use and traetement of olive mill wastewater : Current situation and prospects in Spain. Grasas y Aceites, 2, 101-106. Fiorentino, A., Gentili ,A., Isidori, M., Monaco, P., Nardelli, A., Parrella, A., Temussi, F. 2003. Environmental effects caused by olive mill Waste waters : toxicity comparison of low-molecularweight phenol Components. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51 : 1005–1009. Fki, I., Allouche, N. et Sayadi, S., 2005. The use of polyphenolic extract, purified hydroxytyrosol and 3,4-dihydroxyphenyl acetic acid from olive mill wastewater for the stabilization of refined oils: a potential alternative to synthetic antioxidants. Food Chemistry. 93: 197-204. Fleming, H.P., MC Feeters, R.F. and Daeschel, M.A. (1985). The lactobacilli, pediococci and leuconostocs; vegetable products. In: Bacterial Starter Cultures for foods. Gilliland S. E., pp: 98-118, CRC Press Inc, Boca Raton. Florida. 86 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Flouri, F., Sotirchos, D., Ioannidou, S., Balis, C. (1996) Decolorization of olive oil mill liquid wastes by chemical and biological means. International Biodeterioration & Biodegradation, 189-192. Fountoulakis, M.S., Dokianakis, S.N., Kornaros, M.E., Aggelis, G.G., Lyberatos, G. (2002) Removal of phenolics in olive mill wastewaters using the white-rot fungus Pleurotus ostreatus. Water Res., 36 (19), 4735-44. Francesco, G.L. (1993) Evaluations économiques sur l’innovation technologique. Les problèmes de l’environnement dans le lecteur oléicole en Italie. Olivae, 47, 15-20. Frank, J. F., et Hassan, A. N. (1998). Starters cultures and their use. In Applied Dairy Microbiology. Marth E. H. et Steele J. L. Ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 131-172. Garcia Garcia, I, Jimenez Pena, PR, Bonilla Venceslada, JL, Martin Martin, A, Martin SantosMA, Ramos Gomez, E.(2000) Removal of phenol compounds from olive mill wastewater using Phanerochaete chrysosporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Geotrichum candidum. Process Biochem, 1, 35 (8), 751-758. Garvie, E.I. and Farrow, J.A.E. (1982). Streptococcus lactis subsp. cremoris (Orla- Jensen) comb. nov. and Streptococcus lactis subsp. diacetylactis. (Matuszewski et al.) nom. rev., com. nov., International Journal of Systematic Bacteriology, 32, pp: 453-455. Gharsallah, N., Labat, M., Aloui, F., Sayadi, S. (1999) The effect of Phanerochaete chrysosporium pretreatment of olive mill wastewaters on anaerobic digestion. Ressources Conservation and recycling, 27, 187-192. Guessas B, Adjoudj F, Hadadji M and Kihal M.(2012)Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Dhan, a Traditional Butter and Their Major Technological Traits.Laboratoire de Microbiologie Appliquée, Département de Biologie Faculté Des Sciences,Université D’Es-Senia Oran BP 1524 El-Menaouer 31000 Algeria .ciences Journal 17 (4): 480-488, ISSN 1818-4952 Guessas, B. et Kihal,M.(2004).characterization of lactic acid bacteria isolated from Algerian arid zone raw goats ‘milk. African Journal of biotechnology, 3, pp.339-342. Guiraud, J.P. (1998). Microbiologie alimentaire. Technique et Ingénierie. Série Agroalimentaire, Eds. Dunod Paris, 652 p. Hafidi, M., Amir, S., Revel, J.C. (2005). Structural characterization of olive mill waster-water after aerobic digestion using elemental analysis, FTIR and 13C NMR. Process Biochemistry. 40, 2615-2622. 87 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Halah, AISSAM.( 2003) Etude de la biodégradation des effluents des huileries (margines) et leur valorisation par production de l’enzyme tannase. Thèse Doctorat. universite sidi mohamed ben abdellah .laboratoire de microbiologie de l’environnement dept de biologie fac. sc. dem b.p 1796 fès 30000 .faculte des sciences dhar el mehraz fes. Halasz, A, Barath,A., Simon-Sarkadi,L., and Holzapfel,W. (1994) Biogenic amines and their production by microorganisms in food. Trends in food science and technology. 5, 2 , 4249. Hamd,i M., Ellouz, R. (1993). Treatment of detoxified olive mill wastewater by anaerobic filter and aerobic fluidized bed process. Environmental Technology. 19, 183-188. Hamdi M. (1993c) Valorisation et épuration des effluents des huileries d’olives: l’utilité de la microbiologie industrielle. Olivae, 46, 20-24. Hamdi, M. (1991a) Nouvelle conception d’un procédé de dépollution biologique des margines, effluents liquides de l’extraction de l’huile d’olive, Thèse de l’université de Provence. Marseille, France. Hamdi, M. (1993a) Future prospects and constraints of alive mill waste waters use and treatment : A. Review. Bioprocess Engineering, 8, 209-214. Hamdi, M., Garcia, J.L., Ellouz, R. (1992) Integrated biological process for olive mill wastewaters treatment. Bioprocess. Eng., 8, 79. Hamdi, M., Kadir, A., Garcia, A.L. (1991). The use of Aspergillus niger for bioconversion of olive mill wastewaters. Applied Microbiology and Biotechnology. 34, 828-831. Hariri, A., Ouis, N., Sahnouni, F., Djilali, B., 2009. Mise en œuvre de la fermentation de certains ferments lactiques dans des milieux a base des extraits de caroube. Congrès international BIOMED 1 Marrakech. Rev. Microbiol. Ind. San et Environn.37-55. Holzapel, WH., Haberer, P., Snel, J., Schillinger, U., Huis in’t Veld JHJ (1998): Overview of gut flora andprobiotics. Intl J Food Microbiol, 41: 85-101. Holzapfel, W.H., P. Haberer, R. Geisen, J. Bjerkroth, U. Schillinger. 2001. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food nutrition. Am. J. Clin. Nutr. 73, 365S-373S. Hosseini, S.V, Arlindo, S, Bohme, K, Fernandez-NO, C., Calo-Mata, P., et BarrosVelàzquez.2009.molecular and probiotic characterization of bacteriocin-produsing enterococcus faecium isolated from nonfermented animal foods.jornal of applied microbiology issn 1364-5072. 88 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Hounhoïgan, D.J., Nout, M.J.R., Nago, C.M., Houben, J.H. and Rombouts, F.M., (1993). Characterization and frequency distribution of species of lactic acid bacteria involved in the processing of maw fermented maize dough from Benin. International Journal of Food Microbiology. 18 (4), pp: 279-287. Hugas, M., Garriga, M., Aymerich, T.,(2003). Functionally of enterococci in meat product. Inter. J. Food Microbiol.88(2-3) :22-33. Hugenholtz, J., Sybesma, W., Groot, M. N., Wisselink, W., Ladero, V., Burgess, K., van Sinderen, D., Piard, J.C., Eggink, G.J., Smid, E., Savoy, G., Sesma, F., Jansen, T., Hols, P., Kleerebezem, M. (2002). Metabolic engineering of lactic acid bacteria for the production of nutraceuticals. Antonie Van Leeuwenhoek. 82: 217-235. Innocente, N., Biasutti,M.,Padovese,M. and Moret,S. (2007) Determination of biogenic amines in cheese using HPLC technique and Direct derivatization of acid extract. Food Chemistry.101, 3, 1285-1289. Jean marc, R., Armelle, R. 2001. les probiotiques. centre d’etude et de développement de la nutrithérapie. Jones, D. (1978). Composition and differentiation of genus Streptococcus. In: Streptococci. Skinner, F. A., Quesnel, L. B., Eds. Academic Press, London, pp: 1-49. Jorgensen, L. V., Dalgaard,P. and H Huss,H. (2000) Multiple compound quality index for cold-smoked salmon (salmo salar) developed by multivariate regression of biogenic amines and pH . Journal of agricultural and food chemistry. 48, 6, 2448-2453. Juillard, V., Foucaud, C., Flambard, B., Furlan, S., Bellengier, et Richard, J.(1998). Interactions entre bactérie mésophiles rôle des facteurs nutritionnels. Le lait, 78 :91-97. Kacem Maurad* and Kaid-Harche Meriem.(2008) Probiotic characteristics of Lactobacillus plantarum strains from traditional butter made from camel milk in arid regions (Sahara) of Algeria Département de Biotechnologie, Faculté des Sciences,Université d’Es-Senia, Oran BP.1524 Oran el M’Naouar 31000, Oran, Algérie Kahraman, S., Yesilada, O. (1999) Effect of spent cotton stalks on color removal and chemical oxygen demand lowering in olive oil mill wastewater by white rot fungi. Folia Microbiol., 44 (6), 673-676. Kahramann, S., Yesilada, O. (2001) Industrial and Agricultural wastes as substrates for laccase production by white-rot Fungi. Folia microbial., 46 (2), 133-136. Kandler, O., and Weiss, N. (1986b). Genus Lactobacillus Beijerinck 1901, 212AL. In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Williams, Wilkins, Baltimore, 2, pp: 12091234. 89 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Karapinar, M., Worgan, M.J.T. (1983) Bioprotein production from the waste products of olive oil extraction, J. Chem. Tech. Biotechnol., 33, 185-188. Kavitha, N.S., Hilda, A., Gopinath, S. and Latha, k. (1997). Hydrolysis of Oils and Marine Environmental Ethics. Bioethics in India: Proceedings of the International Bioethics Workshop in Madras: Biomanagement of Biogeoresources, University of Madras, Eds. Jayapaul Azariah, Hilda Azariah, Darryl, R.J., Macer, pp:16-19. Kestioğlua, K., Yonara, T., Azbarb, N., 2005. Feasibility of physico-chemical treatment and Advanced Oxidation Processes (AOPs) as a means of pretreatmentof olive mill effluent (OME). Process Biochemistry 40, 2409–2416. Khoufi ,S., Feki, F., Sayadi, S., 2007. Detoxification of olive mill wastewater by electrocoagulation and sedimentation processes. Journal of Hazardous Materials 142, 5867. Kissi, M., Mountadar, M., Assobhei, O., Gargiulo, E., Palmieri, G., Giardina, P., Sannia, G. (2001) Roles of two white-rot basidiomycete fungi in decolorisation and detoxification of olive mill waste water. Appl Microbiol Biotechnol., 57 (1-2), 221-6. Klibanov, A.M., Tu ,T.M., Scott, K.P. (1983) Peroxidase catalysed removal of phenols from coal-conversion wastewater’s. Science, 22, 259-261. Koster I.W., Cramer A. (1980). Inhibition of methanogenesis from acetate in granular sludge by long chain fatty acids. Applied Environmental Microbiology. 53, 403-409. Kotzekidou, P. (1997). Identification of yeasts from black olives in rapid system microtitre plates. Journal of Food Microbiology, 14, pp: 609-616. Kreger, Van rij, N.J.W. (1987). Classification of yeasts. In: The yeasts, Rose and Harrison 2nd edition, London, pp: 5-55. Labioui, H., Elmoualdi, L., El Yachioui, M et Ouhssine, M. (20005) : sélection de souches de bactéries lactiques antibactériennes. Bull. soc. Pharm. Bordeaux. 144 :237-250. Lachance, M.(2000). Purification et caractérisation d’une bactériocine produite par lactococcus lactis supp.lactis MJC15. Mémoire (MSc.) faculté des études supérieures de l’université Laval. Lanciotti, R., Corbo, M.R., Sinigaglia, M. and Guerzoni, M.E. (1999). Microbial characterization of table olives from the Apulian market, Advances in Food Science, 21, pp: 159–165. Lange, J. And Wittmann,C(2002) Enzyme sensor array for the determination of biogenic amines in food sample.s . Analytical and Bioanalytical chemistry. 372 , 2,276-83. 90 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Larpent, J.P. (1989). Les bactéries lactiques, Les microorganismes de fermentations. Dans : Microbiologie alimentaire, Tome 2, Bourgeois, C.M., Larpent, J.P., Eds. Techniques et documentation Lavoisier, pp: 3-15. Larpent, J.P., Larpent, G.M., 1990. Mémento technique de microbiologie. 2ème édition. Lavoisier Tec et Doc. Paris. PP 417. Lavermicocca, P. and Gobbetti. M. (1998). Characterization of lactic acid bacteria isolated from olive phylloplane and table olive brines. Italian Journal of Food Science, 10, pp: 27-39. Leuschner, R. C. and Hammes,W.P. (1999), Formation of biogenic amine in mayonnaise , herring and tuna fish salad by lactobacilli . International journal of food sciences and nutrition. 50, 3, 159-64. Leveau, J.Y. et Bouix, M. (1993). Les levures. Dans : Microbiologie industrielle, les microorganismes d’intérêt industriel. Eds.Tech. et Doc. Lavoisier. Paris, pp : 2-39. Lopez-lopez, A., Garcia-Garcia, P., Duran-Quintana, M.C. and Garrido-Fernandez, A. (2004). Physicochemical and Microbiological Profile of Packed Table Olives. Journal of Food Protection, 67 (10), pp: 2320-2325. Loulan, P.Y., Thelier, Y. (1987) Procédé et dispositif de traitement par fermentation méthanique des eaux résiduaires lipidiques, Brevet français, 2620439. Lutwin, B., Fiestas, Ros De Ursinos, J.A., Geissen, K., Kachouri, M., Klimm, E., De Ladorde Monpezat, G., Xanthoulis, D. (1996) Les expériences méditerranéennes dans le traitement et l’élimination des eaux résiduaires des huileries d’olives, Editions (GTZ) Gmbh, Eschborn. République Fédérale d’Allemagne. Marino, M., Maifreni,M.,Moret,S and Rondinini,G. (2000) the capacity of enterobacteriaceae species to produce biogenic amines in cheese. Letters in applied microbiology. 31, 2, 169-173. Martin, A., Borja, R., Garcia, I., Fiestas, J.I. (1981). Kinetics of methane production from olive mill wastewater. Process Biochemistry. 26, 101-107. Martinez-Garcia, G., Bachmann, R.T., Williams, C.J., Burgoyne, A., Edyvean, R.G.J., 2006. Olive oil waste as a biosorbent for heavy metals. International Biodeterioration & Biodegradation 58, 231–238. Martin-Garcia, A.I., Moumen, A., Yanez-Ruiz, D.R., Molina-Alcaide, E., 2003. Chemical composition and nutrients availability for goats and sheep of two-stage olive cake and olive leaves. Animal Feed Science and Technology, 107 : 61–74. 91 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Martirani, L., Giardina, P., Marzullo, L., Sannia, G. (1996) Reduction of phenol content and toxicity in olive mill wastewaters with the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Water Researsh, 1 (30), 1914-1918. Mäyrä-Mäkinen, A., et Bigret, M. (1998). Industrial use and production of lactic acid bacteria. In Lactic acid bacteria: microbiology and functional aspects. Salminen S., et Von Wright A. Ed. Marcel Dekker, Inc. New York. 73-102. Mendia, L., Procino, L. (1964). Studion sol trattamento delle acque di rificito dei frantvi oleari. Pro. ANDIS conference, Bologna, Italy. Monties, B. (1980) Les polymères végétaux. Gautier-Villars (eds). Moreau, C. (1989). Les moisissures. Dans : Microbiologie alimentaire. Aspect microbiologique de la sécurité et de la qualité alimentaire. Bourgeois, C.M., Mescle, J.F. et Zulla, J., (1), pp : 174-185. Moreno-Arribas, M.V., Torlois, S., Joyeux, A., Bertrand, A., Lonvaud-Funel, A., 2000. Isolation, properties and behaviour of tyramine-producing lactic acid bacteria from wine. J. Appl. Microbiol. 88, 584e593. Mouncif, M., Tamoh, S., Faid, M., Achkari-Begdouri, A. (1993a) A study of chemical and microbiological characteristics of olive mill waste water in Morocco. Grasas y Aceites, 44, 335-338. Mouncif, M., Tamoh, S., Faid, M., Achkari-Begdouri, A., Lhadi, K. (1995). Biotechnological valorization and treatment of olive mill waste waters by selected yeast strains. Grasas y aceites. 44, 335-338. Nefzaoui A. (1987) Contribution à la rentabilité de l’oléiculture par la valorisation optimale des sous-produits. Séminaire sur l’économie de l’olivier. Tunis. Nefzaoui, A, 1991. Contribution à la rentabilité de l'oléiculture par une valorisation optimale des sous-produits. Options méditerranéens 153-173. Novel, G. (1993). Les bactéries lactiques. Dans : Microbiologie industrielle, les microorganismes d’intérêt industriel. Leveau, J.Y, Bouix, M., Tech. et Doc. Lavoisier Paris, pp: 170-374. Nucleos de Interface. (1992). Ministerio de obras publicas y transportes confederacion hifrografica de guadalquivir. Onal A. (2007) A review: current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods food chemistry. 103, 4, 1475-1486. 92 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Orla-Jensen, S. (1919). The lactic acid bacteria. Copenhagen. I Komision Hos Ejnar Munksgaard. Paredes ,C., Cegarra, J., Bernal, M.P., Roig, A., 2005. Influence of olive mill wastewater in composting and impact of the compost on a Swiss chard crop and soil properties. Environment International 31, 305-312. Parente, E ., Martuscell , F., Gardini , S ., Grieco , M.Crudele, A. and Suzzi ,G. (2001) evolution of microbial populations and biogenic amine production in dry sausages produced in southem italy. Journal of applied microbiology. 90, 6, 882-91. Petruccioli, M., Servili, M., Montedoro, F., Federicio, F. (1988) Development of recycle procedure for the utilization of vegetation waters in the olive-oil extraction process. Biotechnol. Lett., 10, 55-60. Pharm Minh, D., Gallezot, P., Besson, M., 2006. Degradation of olive oil mill effluents by catalytic wet air oxidation. 1. Reactivity of p-coumaric acid over Pt and Ru supported catalysts. Applied Catalysis B: Environmental 63, 68–75. pp: 501-50 Provence AixMarseille, 85 p. Ramos, A. (1986). Physical, chemical, microbiological and biochemical characteristics of vegetation water. Proc. International symposium of olive by-products valorisation. FAO.UNDP, Sevilla, Spain, pp 19-40. Ramos-Cormenzana, A., Monteoliva-Sanchez, M., Lopez, M. J. 1995. Bioremediation of Alpechin. Intemational Biodeterioration & Biodegradation, 249-268. Ranalli, A. (1991a) The effluent from olive mills : Proposals for re-use and purification with reference to Italian legislation. Olivae, 37, 30-39. Roig, A., Cayuela, M.L., Sánchez-Monedero, M.A., 2006. An overview on olive mill wastes and their valorisation methods. Waste Management 26, 960-969. Roquebert, M.R. (1997). Les moisissures. Dans : Nature, biologie et contamination.SiteInternethttp://www.culture.gouv.fr/culture/conservation/fr/cours/roque ber.htm. Ryhänen, E.L., Särkkä-Tirkkonen, M., and Mantere-Alhonen, S. (1996). Isolation and identification of lactic acid bacteria in fermented wheat drink. Microbiologie Aliment Nutrition, 14 (4), pp 369-372. Saez, L., Perez, J., Martinez, J. (1992) Low Molecular weight Phenolics Attenuation during Simulated Treatment of Wastewater from Olive Oil Mills in Evaporation Ponds. Wat. Res., 26, 1261-1266. 93 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Saidi, N., Guessas, B., Bensalah, F., Badis, A., Hadadji, M., Henni, D.E., Prevost, H., Kihal, M., 2002. Caractérisation des bactéries lactiques isolées du lait cru de chèvre des régions arides d’Algérie. Journal Algérien des Régions Arides. 01: 01-14. Salvemini, F. (1985) Composizione chimica e valutazione biologica di un mangime ottenuto essicando tercamente le acque di vegetazione delle olive. Riv. Delle Sostanze Grasse, 112, 559-564. Sandine, W.E. (1988). New nomenclature of the non-rod-shaped lactic acid bacteria. Biochimie, 70, pp: 519-522. Santos, M.H.S.,(1996) Biogenic amines: their importance in foods, Int. J. Food Microbiol. 213– 231. Sayadi, S., Ellouz, R. (1992) Decolouration of olive mill wastewaters by the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium involvement of the lignin-degrading system. Appl. Micrbiol. Biotechnol., 37, 813-817. Sayadi, S., Ellouz, R. (1995) Role of lignin peroxidase and manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium in the decolorization of olive mill waste-waters. Applied and Environmental Microbiology, 61, 1098-1103. Sayadi, S., Zorgani, F., Ellouz, R. (1996). Decolorization of olive mill waste waters by free and immobilized Phanerochaete chrysosporium cultures. Applied Biochemistry and Biotechnology. 3, 265-276. Scanlan, R .A. (1983) Formation and occurrence of nitrosamines in food . Cancer research. 43, 5 Suppl , 2435s -24405s. Scardovi, V. (1986). Genus bifidobacterium. Orla-Jensen 1924, 472AL. In : Bergey’s Manual of systematic Bacteriology, Williams et Wilkins, Baltimore, 2, pp: 1418-1434. Schleifer, K. and Ludwig, W. (1995). Phylogeny of the genus Lactobacillus and related genera. Systematic and Applied Microbiology, 18, pp: 461-467. Schleifer, K.H. (1986). Gram-positive cocci. Dans: bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Williams et Wilkins, Baltimore, 2, pp: 999-1002. Schleifer, K.H., Kraus, J., Dvorak, C., Kilpper-Bälz, R., Collins, M.D. and Fischer, W. (1985). Transfer of Streptococcus lactis and related Streptococci to the genus Lactococcus gen. nov. Systematic and Applied Microbiology, 6, pp: 183-195. 149. Shalaby, A.R., 1996. Significance of biogenic amines in food safety and human health. Food Res. Int. 29, 675e690. 94 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Sierra, J., Martí, E., Garau, A.M., Cruañas, R., 2007. Effects of the agronomic use of olive oil mill wastewater: Field experiment. Science of the Total Environment 378, 90–94. Skinnel, F.A. and Quesnel, L.B. (1978). Streptococci. Symposium N° 7, The Society for Applied Bacteriology, Academic Press. London. Stackebrandt, E. and TeubeR, M. (1988). Molecular taxonomy and phylogeneticn position of lactic acid bacteria. Biochimie, 70, pp: 317-324. Stackebrandt, E., Fowler, V.J. and Woese, C.R. (1983). A phylogenetic analysis of Lactobacilli. Pediococcus pentosaeus and Leuconostoc mesenteroides. Systematic and Applied Microbiology, 4, pp: 326-337. 165. Stiles, M. and Holzapfel, W. (1997). Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International Journal of Food Microbiology, 36, pp: 1-29. Suhigara, T.F. (1985). The Lactobacilli and Streptococci: bakery products. In:Bacterial Starter Cultures for Foods. Gilliland S.E. Eds. CRC Press Boca Raton. Florida, 9,pp: 120-125. Tanchev, S., Joncheva, N., Genov, N., Codounis, M. (1980) Identification of anthocyanins contained in olives. Georgike Ereuna, 4, 5-73. Ten Brink, B., Damink, C., Joosten, H.M.J.L., Huis In't Veld, J.H.J., 1990. Occurrence and formation of biologically active amines in foods. International Journal of Food Microbiology 11, 73–84. Thierry, E. (1997). Les infections microbiennes. Eds. Nathan, Paris, (1), 128 p. Thomas, T.D., 1973. Agar medium for differentiation of Streptococcus cremoris from the other bacteria. N.Z.J. Dairy. Sci. Technol.8: 70-71. Tomati, U., Galli, E., Di Lena, G., Buffone, R. (1991) Induction of laccase in Pleurotus ostreatus mycelium grown in olive oil astewaters. Agrochimica, 35, 273-279. Tsagariki, E., Harris, N., Lazarides., Konstantinos, B. P. 2007. Olive mill waste water treatment. Sprigerlink, 133-157. Turano, E., Curcio, S., De Paola, M.G., Calabrò, V., Iorio, G., 2002. An integrated centrifugation-ultrafiltration system in the treatment of olive mill wastewater. Journal of Membrane Science 209, 519- 531. Uchida, K. (1982). Multiplicity in soy pediococci carbohydrate fermentation and its application for analysis of their flora. Journal of General and Applied Microbiology, 28, pp: 215223. 95 Références REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Udenfriend, S., Lovenberg, W., and Sjoerdsma,A. (1959) physiologically active amines in common fruits and vegetables . Archives of biochemistry and biophysics. 85, 487-490. Van den berg, j.c., smits a., pot, b., ledeboer, a.m., keresters, k., verbakel, j.m.a. and verrips, c.t. (1993). Isolation, screening and identification of lactic acid bacteria from traditional food, fermentation processes and culture collection. Food Biotechnology, 7, pp: 183-205. Vandamme, P., Pot, B., Gillis, M., de Vos, P., Kersters, K., Swings, J. 1996. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol Rev 60, 407-438 Vaughn, I. L. H., Jakubczyl, T., MC Millan, J. D., Higgins, T. E., Dave, B. A., and Crampton, V. M. (1969). Some pink yeast associated with softening of olives. Journal of Applied Microbiology, 18: pp: 771-775. villar, m., de ruiz holgado, a., sanchez, j.j., trucco, r.e. and oliver, g. (1985). Isolation and characterization of Pediococcus halophilus from salted anchovies (Engraulis anchoita). Applied and Environmental Microbiology, 49, pp: 664-666. Wagner, H., Bladf, S., Zgainski ,E.M. (1984) plant drug analysis. Translated by Scott Th.A.Springer-Verlag. Yang, D. and Woese, C.R. (1989). Phylogenetic structure of the Leuconostocs: an interesting case of rapidly evolving organism. Systematic and Applied Microbiology, 12. Pp 145149. Yesilada, O., Sik, S., Sam, M. (1998). Biodegradation of olive oil mill waste-waters by Coriolus versicolor and Funalia trogii. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 1, 3742. Zenjari, B. (2000) Etude ecotoxicologique des effluents liquides des huileries de la ville de Marrakech : Impact sur les milieux récepteurs et détoxication. Thèse de 3éme cycle, Faculté des Sciences de Marrakech (Maroc). Zenjari, B., El Hajjouji, H., Ait Baddi, G., Bailly, J.-R., Revel, J.-C., Nejmeddine, A., Hafidi, M., 2006. Eliminating toxic compounds by composting olive millwastewater– straw mixtures. Journal of Hazardous Materials. A138, 433–437. Zenjari, B., Hafidi, M., El Hadrami, I., Bailly, J.R., Nejmeddine, A. (1999). Traitement aérobie des effluents d’huilerie par les micro-organismes du sol. Agrochimica. XLIII, 3443. 96 Référence bibliographiques REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Références bibliographiques Références bibliographiques Annexes ANNEXES Annexes Annexes Annexe MILIEUX DE CULTURE Annexe -milieu MRS (de Man Rogosa et Sharp, 1960) o Composition (g/l) : -extrait de levure………………………………………………………………………….……5 -extrait de viande…………………………………………………………………………..….10 -peptone……………………………………………………………………….……………....10 -acétate de sodium……………………………………………………………………………...5 -citrate de sodium………………………………………………………………...…………….2 -glucose …………………………………………………………………………..………..…20 -KH2PO4………………………………………………………………………………………..2 -MgSO4………………………………………………………………………….……….…0.25 -MnSO4……………………………………………………………………….………….…0.05 -agar……………………………………………………………………………..……………15 -eau distillée q.s.p…………………………………………………………..…………...1000ml PH=6.8 Autoclavage 120C°pendant 20munites. -MRS liquide tous les ingrédients de MRS solide mais sons agar. -Milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) o Composition (g/l) : Peptone de farine de soja ............................................................................................................ 5 Peptone de viande.................................................................................................................... 2.5 Peptone de caséine Trypsique ................................................................................................. 2.5 Extrait de levure ......................................................................................................................... 5 Extrait de viande......................................................................................................................... 5 Lactose ....................................................................................................................................... 5 97 Annexe MILIEUX DE CULTURE Acide ascorbique ..................................................................................................................... 0.5 Glycérophosphate de sodium ................................................................................................... 19 Sulfate de magnésium ........................................................................................................... 0.25 Agar (manque dans le bouillon) ............................................................................................... 20 Eau distillée ..................................................................................................................... 1000 ml pH= 7.2 Autoclavage 120C°pendant 20munite -Milieu M16 BCP (Thomas et al., 1973) o Composition (g/l) : Extrait de levure ..................................................................................................................... 2,5 Extrait de viande ........................................................................................................................ 5 Lactose ...................................................................................................................................... 2 Biopolytone ............................................................................................................................... 5 Peptone papainique de soja ........................................................................................................ 5 Acide ascorbique .................................................................................................................... 0,5 Acétate de sodium ................................................................................................................... 1,8 L-Arginine ................................................................................................................................. 4 Pourpre de bromocrésol ....................................................................................................... 0,05 Eau distillée .................................................................................................................... 1000 ml pH=6,5 Autoclavage 120C°pendant 20munite - Milieu MRS BCP o Composition (g/l) : -extrait de levure………………………………………………………………….……………5 -extrait de viande……………………………………………………………………..……….10 -peptone………………………………………………………………………………..….…..10 -acétate de sodium………………………………………………………………………..…….5 -citrate de sodium……………………………………………………………………………....2 -glucose ………………………………………………………………………………………20 98 Annexe MILIEUX DE CULTURE -KH2PO4………………………………………………………………………………………..2 -MgSO4……………………………………………………………………………….….…0.25 -MnSO4………………………………………………………………………...………...…0.05 -bromocrésol pourpre …………………....………………………………………………...…15 -eau distillée q.s.p…………………………………………………………………….....1000ml PH=7 Autoclavage 120C° pendant 20munite -Milieux KMK (Kempler et Mc Kay ,1980) -Extrait de levure……………………………………………………………………………..3g -Biopolytone………………………………………………………………………………...2,5g -Glucose………………………………………………………………………………………5g -Agar………………………………………………………………………………………...15g pH=6,6 Le milieu est réparti à raison de 100ml par flacon , puis autoclave 15 minutes à 120°C. Au moment de l’emploi on ajoute : 1ml d’une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10%(p/v) 1ml d’une solution aqueuse à 2,5 %(v/p) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p) Ces solutions sont stérilisée par filtration sur filtre millipore 0,22µm et sont conservées à l’obscurité à 4°C. Milieu Muller –Hinton (Muller et Hinton, 1941) -Infusion de viande de bœuf………………………………………………….………..3000cm3 -Peptone de caséine………………………………………………………………………..17,5g -Amidon de mais……………………………………………………………………………1,5g -Agar-agar…………………………………………………………………………………….17 -pH=7,4 99 Annexe MILIEUX DE CULTURE -Milieu Chapman -Pepton ……………………………………………………………………………………...10g -Extrait de viande …………………………………………………………………………….1g -Chlorure de sodium ………………………………………………………………………...75g -Mannitol ……………………………………………………………………………………10g -Rouge de phenol …………………………………………………………………….….0,025g -Agar-agar…………………………………………………………………………………...15g -pH=7,4 Autoclavage 120°C pendant 20 minutes. -Gélose nutritive -Extrait de viande……………………………………………………………………………..1g -Extrait de levure ……………………………………………………………………………..2g -Peptone………………………………………………………………………………………5g -Chlorure de sodium…………………………………………………………………………..5g -Agar-agar…………………………………………………………………………………...15g -Eau distillée ……………………………………………………………………………1000ml -pH=7,4 Autoclavage 120°C pendant 20 minutes. -bouillon nutritive -Extrait de viande …………………………………………………………………………….1g -Extrait de levure……………………………………………………………………………...2g -Peptone………………………………………………………………………………………5g -Chlorure de soduim…………………………………………………………………………..5g -Eau distillée ……………………………………………………………………………1000ml -pH=7,4 100 Annexe MILIEUX DE CULTURE -Esculines -Peptone ……………………………………………………………………………………………………………………………………...10g -Esculine……………………………………………………………………………………………………………………………………………1g -Citrate de fer ammoniacal ………………………………………………………………………………………………………………1g -Agar……………………………………………………………………………………………………………………………………………….20g pH=7,5 -Lait agar -Agar………………………………………………………………………………………..1,5g -Extrait de levure……………………………………………………………………………0,1g -Eau distillée …………………………………………………………………………….96,5ml -Autoclavage 120°C pendant 15 minutes. -on ajoute 3,5ml de Candia silhouette et mélange bien. -Agar au tween 80 -peptone ……………………………………………………………………………………..10g -NaCl …………………………………………………………………………………………5g -CaCl2*2H2………………………………………………………………………………….0,1g -Agar………………………………………………………………………………………...20g -Eau distillée ……………………………………………………………………………1000ml -autoclavage 120°C pendant 20 minutes. -2,5ml de tween 80 est stérilisé séparément puis ajouté au milieu , le pH est ajusté à 6. -Eau physiologique -peptone………………………………………………………………………………....…..0.5g -chlorure de soduim……………………………………………………………………..….8.5g -Eau distillée q.s.p………………………………………………………………….……1000ml PH=7 Autoclavage 120C° pendant 20munite 101 Annexe MILIEUX DE CULTURE -Lait écrémé Lait écrémé……………………………………………………………………….…..…….100g -extrait de levure……………………………………………………………………...…….0.5g Eau distillée………………………………………………………………………………100ml PH=7 Autoclavage 120C° pendant 20munites Le lait de SHERMAN (Bourgeois et Leveau, 1991) o Composition (g/l): Lait écrémé ............................................................................................................................... 10 Extrait de levure ...................................................................................................................... 0,5 Eau distillée ..................................................................................................................... 1000 ml pH=6,8 Pour obtenir un lait à 0,1% de bleu de méthylène, on ajoute au moment de l’emploi 1ml de bleu de méthylène à 1% déjà stérilisé à 120°C pendant 20min. Et pour avoir un lait à 0,3% de bleu de méthylène, on ajoute au moment de l’emploi 1ml de bleu de méthylène à 3%. 102 perspectives perspectives Perspectives perspectives perspectives perspectives perspectives Perspectives Les bactéries lactiques ayant fait l’objet de cette études ce sont montrées très intéressantes par rapport à la lutte contre les pathogènes responsables des différents troubles et pathologies notamment gastriques.ces agents microbiens peuvent être considérés comme des probiotiques, ils méritent un suivi et une traçabilité en matière d’étude et de perspective a l’avenir afin d’établir leur incidence en santé humaine. Recherche des flores totales qui présences dans le margines d’olives fermentés comme les levures, les champignons, les bactéries contaminants (bactéries pathogènes). Une identification par les méthodes moléculaires des souches de lactobacilles est devenue indispensable pour compléter l’identification phénotypique. perspectives perspectives Résumé Résumé Résumé Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des agents protecteurs dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes dans une grande variété d'aliments, tel que les laits fermentés, les yaourts, les fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi, différentes souches d'intérêt commercial ou scientifique y sont couramment isolées. Dans ce travail, 32 souches de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées à partir du margine d’olives des différentes régions d’Algérie. Les lactobacilles représentent 34,37% de la flore lactique.L’espèce la plus dominante pour ce groupe est Lactobacillus rhamnosus 63,63%. Lactobacillus manihotivorans est aussi représenté parmi les souches isolées 36,36%. Les lactocoques sont représentés par deux espèces qui sont Lactococcus lactis subsp. lactis 27,27% et lactococcus. lactis subsp. Diacetylactis 72,72%. Les entérococcus . L’étude des interactions a révélé la capacité de toutes les souches à inhiber Staphylococcus aureus. Et Escherichia coli ont montré leur capacité antagoniste envers ces deux souches par la production de substances protéiques dans le milieu de culture. Les bactéries lactiques isolées et identifiée montrent une capacité à inhiber les souches de Staphylococcus aureus, Escherichia coli par la production de substances protéiques (substances antimicrobiennes) dans le milieu de culture. L’activité protéolytique, nous a permis de déceler que l’ensemble des souches lactiques possédées une activité protéolytique. L’activité lipolytique est constatée toutes les souches possède pas une activité lipolytique. Enfin l’antibiogramme des bactéries lactiques testées, montre une sensibilité pour l’ensemble des antibiotiques Mots clés : Bactéries Lactiques; Margine D’olives; Lactobacillus; Lactocoques; Staphylococcus; Escherichia Coli .Antibiogramme; Substances Antimicrobiennes; Activité Lipolytique; Activité Protéolytique.
