Microbiologie et Cytométrie en flux
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La cytométrie capillaire: un outil de prédiction pour l’efficacité de désinfection d’un isolateur par le peroxyde d’hydrogène Gaëlle CARRE Faculté de Pharmacie-UMR7213 – Université de Strasbourg Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 Sommaire 1. Isolateur 2. Désinfection par H2O2 - système de nébulisation cycle de désinfection 3. Efficacité de désinfection - indicateurs biologiques analyse visuelle à J+7 4. Cytométrie - principe réglages 5. Prédiction de l’efficacité de désinfection - cytométrie vs analyse visuelle 6. Conclusions Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 1/17 1.Isolateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytom étr ie 5.Prédic tion ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Isolateur 1 2/17 • Barrière physique: – préparation – manipulateur – environnement Isolateur de production aseptique 1 • • • • 1 2 Gélose RODAC2 Atmosphère contrôlée: microbiologique + particulaire Préparation de produits cytotoxiques Conditionnement aseptique (poudre, substance active...) Test de stérilité https://www.skan.ch/en/products consulté le 3 mars 2015 http://www.bd.com/ds/productCenter/PM-RodacCriticalEnvironments.asp consulté le 18 mars 2015 Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 1.Is olateur 2.Désinfection par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytom étr i e 5.Prédic tio n ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Désinfection par H2O2 • Désinfection des surfaces par voie aérienne (DSVA) • Nébulisation de peroxyde d‘hydrogène H2O2 Gaz fortement oxydant E0(H2O2/H2O)= 1,77 V Effets irritants/brûlures • Dégagement de radicaux libres de l’oxygène (O2°-, OH°) oxydation des lipides, des protéines... • Action bactéricide, sporicide, virucide, fongicide • Sous produits de désinfection: eau + oxygène • Compatibles avec la plupart des matériaux Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 2 3/17 1.Is olateur 2.Désinfection par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytom étr i e 5.Prédic tio n ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Isolateur désinfecté par nébulisation • Isolateur (1 m3 de volume) • Nébulisation: système piézoélectrique microgouttelettes H2O2 <5 µm • Différents sondes: T°C (9) Traçabilité HR (1) du cycle ppm H2O2 (1) 4/17 B A A: isolateur + CTA B: système de nébulisation Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 3 1.Is olateur 2.Désinfection par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytom étr i e 5.Prédic tio n ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Cycle de désinfection 5/17 Efficacité de désinfection ? 100 250 90 225 80 200 ppm H2O2 % HR 70 60 150 50 125 40 100 refroidissement 20°C 75 rinçage 40°C nébulisation 25°C 30 50 20 25 10 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 minutes Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 % HR H2O2 (ppm) 175 4 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Efficacité de désinfection 4. Cytom étr ie 5.Prédic tion ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Indicateurs Biologiques (BIs) • BIs: « systèmes d’essais contenant des micro-organismes viables, garantissant une résistance définie à un procédé de stérilisation spécifié »3 • Plus résistants que les microorganismes pouvant être isolés de l’environnement de production4,5 tyvek ≈ 2.106 spores/ coupon 6 Geobacillus stearothermophilus Coupons déposés 3 Norme ISO 14161: 2009, Stérilisation des produits de santé – Indicateurs biologiques – Directives générales pour la sélection, l’utilisation et l’interprétation des résultats 4 Castro et al., Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences, 2011, 32(3):335-339. 5 Meszaros et al., Applied Biosafety, 2005, 10:91-100 6 Singh et al., New Journal of Physic, 2009, 11: 115027 Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 6/17 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Efficacité de désinfection 4. Cytom étr ie 5.Prédic tion ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Efficacité de désinfection 7/17 • Retrait des BIs au cours du cycle de désinfection • Intervalles de retrait régulier (3 min) Eau φ + coupon Incubation 7 jours à 56°C bouillon Trypticase Soja + - t1 t2 … + : non exposé à H2O2 - : eau φ stérile sans bactéries Trouble = croissance (+) Translucide = absence de croissance (-) Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 6 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Efficacité de désinfection 4. Cytom étr ie 5.Prédic tion ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Efficacité de désinfection à J+7 8/17 • Norme ISO 14161:2009: incubation de 7 jours3 - + t16 t19 t22 t25 t28 t31 t34 t37 t40 7 j d’incubation à 56°C 3 Norme ISO 14161: 2009, Stérilisation des produits de santé – Indicateurs biologiques – Directives générales pour la sélection, l’utilisation et l’interprétation des résultats Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 7 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytométrie 5.Prédic tio n ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Efficacité de désinfection par cytométrie 8 9/17 • But: déterminer l’efficacité de désinfection en 24 h par cytométrie à la place des 7 j recommandés ISO 14161:2009 7 - Cytomètre capillaire (24h) + t16 t19 t22 t25 t28 t31 t34 t37 7 j d’incubation à 56°C Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 t40 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytométrie 5.Prédic tio n ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Principe de la cytométrie 9 10/17 Cytométrie capillaire 8 -automatisée -sensible -rapide -pas de liquide de gaine -microvolume Principe du cytomètre (A); Passage des échantillons dans le capillaire (B) • FSC: diffusion de la lumière dans l’axe (taille) • SSC: réfraction de la lumière à 90° (granularité) 8 Carré et al., Photochemical and Photobiological Sciences, 2013, 12:610-620 Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytométrie 5.Prédic tio n ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Kit de fluorescence Live/dead 9 11/17 • Syto 9 pénètre aussi bien dans les bactéries dont la membrane est intacte que celles dont la membrane est endommagée Membrane intacte • Iodure de Propidium (IP) pénètre seulement dans les bactéries avec une membrane endommagée Membrane intacte Membrane endommagée Membrane endommagée Intégrité membranaire = reflet de la viabilité cellulaire Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytométrie 5.Prédic tio n ef f ic ac ité 6. Conc lus ions Réglages • 5000 évènements/puits • 60 s maximum • R1: région caractéristique des bactéries vivantes • R2: région caractéristique des bactéries mortes • R3: région centrée sur les bactéries 12/17 cytogramme histogramme Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytom étr i e 5.Prédiction efficacité 6. Conc lus ions Prédiction de l’efficacité de désinfection • Analyse par cytométrie à 24 h d’incubation sur les bouillons translucides - + t16 t19 t22 t25 t28 t31 t34 t37 t40 + Syto9 / IP 100µL 24h à 56°C Plaque 96 puits Guava EasyCyte Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 13/17 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytom étr i e 5.Prédiction efficacité 6. Conc lus ions Cytométrie à 24 h vs analyse visuelle à J+7 14/17 24h • R1: région caractéristique des bactéries vivantes - + t16 t19 t22 t25 t28 t31 t34 t37 • R2: région caractéristique des bactéries mortes 7 j d’incubation à 56°C Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 t40 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytom étr i e 5.Prédiction efficacité 6. Conc lus ions Prédiction de l’efficacité de désinfection 10 7 — 10 6 10 2 10 1 — 10 0 15 — 10 4 10 3 16 n=118 au total — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 10 5 17 — 100% de probabilité — trouble— — — — — 105 évènements/ml — — — — — 74% de probabilité — translucide — — — — — — — — — — — — — — Trouble Translucide — — 18 15/17 19 20 21 22 Durée d’incubation (h) 23 24 25 Analyse visuelle (J+7) R1: région caractéristique des bactéries vivantes Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytom étr i e 5.Prédiction efficacité 6. Conc lus ions Prédiction de l’efficacité de désinfection 10 100% de probabilité trouble 7 — 10 6 — — — — — — 10 2 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 10 1 — 10 0 15 — 10 5 10 4 10 3 16 17 — — — — — — — — — — — — — n=170 au total Trouble 105 évènements/ml — — — — — — — — — — — — — — Translucide 96 % de probabilité translucide — — 18 19 20 21 22 Durée d’incubation (h) 23 24 16/17 25 Analyse visuelle (J+7) R1: région caractéristique des bactéries vivantes Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 1.Is olateur 2.Dés inf ec tion par H 2 O 2 3.Ef f ic ac ité de dés inf ec tion 4. Cytom étr i e 5.Prédic tio n ef f ic ac ité 6. Conclusions Conclusions • Cytométrie: - technique automatisée, sensible, rapide - validation de l’efficacité de désinfection en 24 h vs analyse visuelle à J+7: si <105 évènements/ml translucide à J+7 (96% de probabilité) si >105 évènements/ml trouble à J+7 (100% de probabilité) - applicable sur d’autres BIs (Escherichia coli CIP 54217 9) 9 NFT 72-281. Procédés de désinfection des surfaces par voie aérienne. Novembre 2014. Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015 17/17 Merci de votre attention Gaëlle CARRE 03 68 85 43 08 [email protected] Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015
