revue Virologie 2005, 9 : 431-42 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Circovirus et pathologies associées chez les animaux B. Grasland L. Bigarré P. Blanchard C. Loizel Y. Blanchard C. de Boisséson A. Jestin Unité de génétique virale et biosécurité, Agence française de sécurité sanitaire des aliments (Afssa), BP53, 22440 Ploufragan Résumé. Les Circovirus représentent un des deux genres de la famille des Circoviridae. À ce jour, seuls les suidés (porc et sanglier) et les oiseaux ont été identifiés comme leurs hôtes. Ils possèdent tous un génome à ADN circulaire simple brin d’environ 2 000 nucléotides. Leur ADN contient une séquence nonanucléotidique nécessaire pour la réplication, flanquée de séquences répétées inversées représentant un motif tige-boucle et deux cadres de lecture principaux d’orientation opposée, l’un codant pour la protéine Rep associée à la réplication et l’autre pour la protéine de capside Cap. Tous les circovirus décrits à ce jour, excepté le circovirus porcin de type 1 (PCV1), sont associés à des pathologies caractérisées par une immunosuppression ou immunodépression de leur hôte. Des lésions histopathologiques, telles que les inclusions intracytoplasmiques dans les macrophages et des déplétions lymphocytaires des lymphocytes T et B au niveau des organes lymphoïdes, sont généralement constatées. Actuellement, aucun moyen de prophylaxie médicale n’est disponible pour prévenir les infections à circovirus. Mots clés : circovirus, ADN simple brin, génome circulaire, cofacteur d’infection Abstract. Animal circoviruses belong to the Circovirus genus of the Circoviridae family. Nowadays, only swine and birds were identified as circovirus hosts. Circoviruses have a single-stranded circular genome of approximately 2000 nucleotide long. DNA of these viruses possesses : (i) a nonanucleotide sequence essential for replication, flanked by inverted repeat sequences, a palindrome that has the potential to form a stem-loop structure and (ii) two major ORFs, located on the viral and complementary strands, which encode respectively the replication-associated protein (Rep) and the capsid protein (Cap). All the circoviruses described at the present time, except porcine circovirus of type 1, are associated with immunosuppressive or immunodepressive diseases. Histopathological lesions such as cytoplasmic inclusions of virus in histiocytic cells and T and B lymphocyte depletion in lymphoid organs, are commonly noticed. No medical prophylaxis of circovirus infections is currently available. Key words: circovirus, single-stranded DNA, circular genome, infection cofactor Historique et classification Les circovirus infectant les vertébrés possèdent un ADN circulaire simple brin et présentent des similitudes avec les virus appartenant aux Geminiviridae et aux Nanoviridae qui infectent les plantes. Le génome des Geminiviridae est constitué d’une ou deux molécules d’ADN simple brin Virologie, Vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2005 circulaire de 2 500 à 3 000 nucléotides (tableau 1) [1]. Celui des Nanoviridae est réparti sur au moins 6 à 8 molécules d’ADN simple brin circulaire, d’environ 1 000 nucléotides chacune [2]. Les particules virales de ces deux familles sont non enveloppées, de forme icosaédrique simple d’un diamètre de 18 nm pour les nanovirus et de forme icosaédrique double d’environ 18 × 30 nm pour les géminivirus (ta431 revue Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Tableau 1. Classification et caractéristiques générales des familles Nanoviridae, Geminiviridae et Circoviridae Famille Nanoviridae Geminiviridae Hôte Génome Plantes ADN circulaire simple brin 6 à 8 segments de 1 kb Non enveloppé capside de 18 à 20 nm de Ø* Plantes ADN circulaire simple brin 1 ou 2 segments de 2,5 à 3 kb Non enveloppé capside géminée de 20 nm de Ø* Virion Circoviridae Genre Genre Gyrovirus Circovirus Chicken anemia virus (CAV) Beak and feather disease virus (BFDV) Canary circovirus (CaCV) Goose circovirus (GoCV) Pigeon circovirus (PiCV) Porcine circovirus 1 (PCV1) Porcine circovirus 2 (PCV2) Vertébrés Vertébrés ADN circulaire simple brin Vertébrés 1 segment de 1,8 à 2 kb Non enveloppé Non enveloppé capside de 14 à 20 nm de Ø* *Ø diamètre. bleau 1). Il a été émis l’hypothèse que les circovirus dériveraient d’un nanovirus qui aurait recombiné avec un virus infectant les vertébrés [3]. En 1974, des particules virales ressemblant à des picornavirus sont observées comme contaminant d’une lignée cellulaire de reins de porc (PK15) [4]. Il faudra attendre 1982 pour réaliser que ces particules virales contenaient un génome à ADN simple brin, circulaire, de petite taille, à l’origine du nom de circovirus porcin (PCV) [5]. Par la suite, des virus de même structure génomique, le virus de la maladie du bec et du plumage des Psittacidae (beak and feather disease virus, BFDV) et le virus de l’anémie du poulet (chicken anemia virus, CAV), sont découverts chez les oiseaux. De par leurs caractéristiques biochimiques et morphologiques communes [6, 7], ces trois virus ont été regroupés dans la famille des Circoviridae, créée en 1995 par l’International Committee for the Taxonomy of Viruses (ICTV) [8]. En 1996, une nouvelle pathologie appelée maladie d’amaigrissement du porcelet (MAP) fait son apparition en France et en Espagne [9]. Elle affecte sévèrement les rendements des élevages porcins, la mortalité pouvant atteindre 20 %, voire plus dans les cas les plus sévères. Elle touche les porcelets en croissance âgés de 2 à 4 mois et est aujourd’hui présente dans la majorité des pays producteurs de porcs. Un circovirus a été identifié à partir de lésions de porcelets malades. Il s’est révélé être différent du circovirus porcin identifié dès 1982 [10], en termes d’antigénicité et de séquence nucléotidique. Le circovirus porcin isolé de cellules PK15 est alors appelé circovirus porcin de type 1 (porcine circovirus type 1, PCV1) et celui isolé d’animaux atteints de MAP, circovirus porcin de type 2 (porcine circovirus type 2, PCV2). En 2005, l’ICTV distingue deux genres dans la famille des Circoviridae : le 432 genre Gyrovirus avec un représentant unique, le CAV, et le genre Circovirus incluant les deux autres virus déjà connus et de nouveaux membres découverts chez des espèces aviaires dont le circovirus du pigeon (pigeon circovirus, PiCV), de l’oie (goose circovirus, GoCV) et du canari (canary circovirus, CaCV) (tableau 1) [11]. Des espèces isolées chez le pinson (finch circovirus, FiCV), le canard (duck circovirus, DuCV) et la mouette (gull circovirus, GuCV) sont en attente d’y être classées [11]. Le Torque teno virus (TTV) et le TTV-like mini-virus (TLMV), découverts chez l’homme à partir de 1997 et décrits initialement comme « circovirus humains », sont désormais regroupés dans le genre Anellovirus, dans l’attente d’être assignés à une famille [12]. La revue présente les circovirus, tels que définis dans la dernière classification présentée par l’ICTV, et leurs pathologies associées. Les auteurs s’appuient essentiellement sur les modèles des circovirus porcins qui ont été très étudiés ces dernières années. Les virus du genre circovirus Caractéristiques biologiques Spectre d’hôte Le PCV1 a été isolé dans la lignée cellulaire de reins de porc PK15 (ATCC-CCL33) [4]. Il a été montré qu’il pouvait infecter et se multiplier dans d’autres lignées cellulaires porcines primaires ou semi-continues [5, 13]. Des études sérologiques ont démontré que des anticorps contre le PCV1 étaient communément présents chez les porcs dans de nombreux pays [14]. Cependant, des réactions croisées avec le PCV2 pourraient avoir conduit à une surestimation Virologie, Vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2005 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue de la prévalence du PCV1. Le PCV2 a quant à lui été isolé chez des suidés (porc et sanglier) en Europe [15, 16], en Amérique du Nord, centrale et du Sud [16, 17] ainsi qu’en Asie [18]. Des anticorps anti-PCV2 ont été détectés dans des sera antérieurs de 30 ans à l’émergence de la MAP, indiquant que les porcs étaient infectés par le PCV2 bien avant l’isolement du virus [19]. Les circovirus porcins n’ont été retrouvés que chez les suidés, indiquant une grande spécificité d’hôte. Les recherches sérologiques effectuées dans les populations humaines exposées et animales (bovins, ovins, poulet, lapin) sont restées négatives [20, 21]. Des essais d’inoculation de PCV1 et PCV2 sur diverses lignées bovines et ovines ont montré que les virus pouvaient infecter ces cellules sans qu’il y ait cependant production de virions [20]. En outre, l’infection de différentes lignées cellulaires humaines et simiennes par le PCV1 ou le PCV2 est non productive de virus bien que le PCV1, comme le PCV2, puisse entrer et se répliquer dans certaines cellules humaines [22]. Plus de 60 espèces d’oiseaux de la famille des Psittacidae, comprenant notamment les perroquets et les perruches, peuvent être infectées par des variants du BFDV [23]. Le virus a une distribution mondiale et se rencontre dans les populations sauvages d’Amérique du Sud, d’Afrique, d’Australie et du Pacifique sud ainsi que dans les populations captives. À l’heure actuelle, chaque circovirus aviaire n’a qu’un seul hôte connu, l’espèce chez laquelle il a été détecté. Mis à part les circovirus porcins, les autres virus n’ont pu être répliqués sur système cellulaire in vitro. Morphologie Les particules de circovirus sont non enveloppées, en forme d’icosaèdre et ont un diamètre compris entre 14 et 20 nm (figure 1). Les circovirus porcins et le BFDV seraient constitués de 12 pentamères comprenant 60 sous-unités répétées d’une protéine de capside unique [24]. Propriétés physicochimiques et biologiques La densité du PCV1 est évaluée à 1,37 g/ml en chlorure de césium. Le virus ne provoque pas l’hémagglutination d’érythrocytes de nombreuses espèces dont le porc. Il résiste à l’inactivation à pH 3 ainsi qu’au chloroforme, et reste stable à 56 et 70 °C pendant 15 minutes [20]. Peu de données existent sur les propriétés physicochimiques du PCV2. In vitro, ce virus est résistant aux désinfectants contenant de la chlorhexidine, du formaldéhyde, de l’iodine et des alcools. Cependant, il montre une sensibilité aux désinfectants à base de phénol, d’ammonium quaternaire, d’hydroxyde de sodium et d’agents oxydants [25]. Le BFDV agglutine les érythrocytes de perroquets mais pas ceux de l’homme, du porc, de l’oie et du cobaye [26] même si, pour ce dernier, les résultats sont contradictoires [27]. Virologie, Vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2005 100 nm Figure 1. Particules virales de circovirus porcin de type 2 semipurifiées après coloration négative au PTA (microscope électronique × 200 000). Des particules de 20 nm de diamètre environ sont visibles. Génome et expression Organisation génomique et réplication Le génome des circovirus est une molécule d’ADN simple brin circulaire, d’une taille d’environ 2 000 nucléotides (figure 2). Leur structure est composée d’une région intergénique comprise entre deux cadres de lecture majeurs, d’orientation opposée et appelés ORF1 et 2. L’ORF1, situé sur le brin viral de polarité positive (+), est compris dans le gène rep qui code pour deux protéines initiatrices de la réplication (Rep et Rep’) tandis que l’ORF2, situé sur le brin de polarité négative (–), est compris dans le gène cap qui code pour l’unique protéine de structure de la capside. L’origine de réplication se trouve dans la région intergénique qui inclut une séquence nonanucléotidique flanquée de séquences palindromiques, l’ensemble formant un motif tige-boucle (figure 2). En aval de cette tige-boucle, se trouvent des séquences hexanucléotidiques répétées. La réplication du génome impliquerait un mécanisme en cercle roulant comme pour les Geminiviridae. Cependant, chez les circovirus, l’originalité repose sur le choix de la matrice à copier au niveau de la tige-boucle, reposant sur une organisation en melting-pot, différente de celle qualifiée de « cruciforme » utilisée par les Geminiviridae. Dans ce modèle, une forme réplicative double brin est obtenue à partir du génome viral simple brin après infection des cellules. Puis un complexe REP, formé des protéines Rep et Rep’, se lie à la séquence nonanucléotidique comprise dans la séquence de la tige-boucle de l’intermédiaire bicaténaire superenroulé. Le complexe déstabilise l’origine de réplication et coupe alors la séquence nonanucléotidique en amont de l’avant-dernier nucléotide (A) (la position du nucléotide 1 du génome étant fixé sur ce nucléotide dans la figure 2), ce qui engendre la création d’une extrémité 3′ OH libre. Aucune structure en croix n’est formée au niveau de l’ori433 revue A T G C G T C G C G T G A A G Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. A 1 T 5’ G T T T A C C A G C G C A C T T C G G C AG C G G C AG C AC C T C G G C AG C G T C AG 3’ 13 19 30 36 Origine de réplication Tige boucle ORF2 cap Génome des circovirus ~ 2000 nt ORF1 rep Figure 2. Organisation génomique générale des circovirus animaux. Deux cadres de lecture majeurs, de sens contraire, sont compris dans les gènes rep et cap. Une partie de la région intergénique du PCV1 contenant le motif tige-boucle et la séquence nonamérique essentielle pour la réplication (indiquée en gras), est agrandie en exemple. La position du premier nucléotide ainsi que celles des hexamères sont indiquées. gine de réplication, mais plutôt une sphère d’instabilité, appelée melting-pot où les brins (+) et (–) sont proches mais non liés par des liaisons hydrogène. Le brin (–) et le brin (+) du génome viral au niveau de la séquence palindromique de la tige-boucle sont donc disponibles simultanément comme modèles pendant les phases d’induction et de terminaison de la réplication [28]. Les circovirus dépendent de l’ADN polymérase de leur hôte pour effectuer leur cycle de réplication du génome et produire la forme réplicative double brin. La nécessité de cette polymérase conforte le fait que les circovirus porcins requièrent des cellules en phase S du cycle cellulaire pour réaliser un cycle d’infection complet [29]. Des études in vivo ont permis d’établir que les cellules supportant la réplication du PCV2 dépendaient du stade de développement de leur hôte au moment de l’infection. Chez des fœtus infectés in utero, le PCV2 a été détecté dans des cardiomyocytes, des hépatocytes et des macrophages au début de la gestation et dans des macrophages majoritairement en fin de gestation [30]. Des études réalisées in vitro avec une lignée cellulaire de monocytes ont montré que le PCV2 entre dans ces cellules par endocytose dépendante de la 434 clathrine essentiellement et que l’acidification du compartiment endosomal est nécessaire à l’infection par le PCV2 [31]. Le génome du PCV1 compte 1 759 nucléotides et celui du PCV2, 1 767 ou 1 768, en fonction des souches [11, 15]. L’origine de réplication du PCV1 a pu être expérimentalement bornée à un fragment de 111 bases (b) de longueur englobant le nonanucléotide 5’TAGTATTAC ainsi que le promoteur du gène rep [32]. La séquence de ce motif nonanucléotidique ne varie que par la première base chez le PCV2 5’AAGTATTAC. Des modifications de nucléotide dans ce motif par mutagenèse dirigée montre que la séquence importante pour la réplication peut être condensée à un octanucléotide 5’AxTAxTAC [33]. En aval de la tigeboucle, se trouvent quatre répétitions de l’hexamère 5’CGGCAG (figure 2) qui forment un site de fixation aux protéines codées par le gène rep. Les gènes rep des deux PCV présentent plus de 85 % de similitude alors que les gènes cap sont moins conservés avec 62 % de similitude. La séquence nucléotidique du génome du BFDV est composée de 1 993 nucléotides et comprend la même séquence nonanucléotidique indispensable pour la réplication que le PCV1. Deux répétitions d’un motif de 8 nucléotides 5’GGGGCACC sont situées en aval du motif tige-boucle. Le circovirus du pigeon (PiCV) possède quant à lui un génome de 2 036 ou 2 037 b, celui de l’oie (GoCV) de 1 821 b, du canard (DuCV) de 1 996 b et du canari (CaCV) de 1 952 b [11]. Transcription et protéines virales Les génomes des circovirus porcins présentent deux cadres de lecture permettant, par un phénomène d’épissage alternatif, la synthèse de trois protéines majeures : les protéines Rep et Rep’ via le brin d’ADN viral (+) et la protéine Cap via le brin (–) complémentaire (figure 3). Un troisième cadre de lecture, appelé ORF3, a été mis en évidence chez le PCV2. Le gène serait situé au niveau du gène rep mais transcrit en sens inverse. L’ARNm de 315 nt coderait pour une protéine qui jouerait un rôle dans l’induction de l’apoptose dans les cellules infectées [34]. L’incapacité de propager les circovirus autres que les circovirus porcins en culture cellulaire aura été un frein à l’analyse des transcrits produits chez les autres circovirus. Néanmoins, pour le BFDV, deux protéines majeures de 26 et 23 kDa associées à la capside ont été caractérisées à partir de virus purifiés provenant de plumes infectées [35]. Leur fonction n’est cependant toujours pas établie. – Cap. Pour les PCV, un ARNm majeur est transcrit à partir du brin complémentaire. Il subit un épissage produisant un transcrit codant pour la protéine Cap. Chez le PCV1, le site d’induction de la transcription est localisé au nt 457, le site d’épissage compris entre les nt 348 et 1724, et le site de terminaison au nt 998 (figure 3). La région codant pour la Virologie, Vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2005 revue ARNm Cap 457 ARNm Cap 348 1724 998 1723 469 361 1737 1024 1735 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Génome du PCV1 Génome du PCV2 1005 997 ARNm Rep et Rep’ Rep 1037 1768/1 1759/1 998 1005 1004 ARNm Rep et Rep’ 19 997 47 19 Rep 1004 51 983 403 18 18 787 997 992 416 800 1004 416 800 967 Rep’ Rep’ 47 403 787 934 51 Figure 3. Génomes et transcrits principaux du PCV1 et du PCV2. La direction de transcription est indiquée par les flèches au niveau des génomes. Les séquences codantes apparaissent en gris ainsi que leur localisation par rapport au génome, signalée sous chaque transcrit. et .... Les queues polyA de chaque ARNm et les sites d’épissage sont indiqués respectivement par protéine Cap s’étend du nt 1 723 au nt 1 024. Pour le PCV2, les sites d’induction et de terminaison sont les nt 469 et 1 005. La région d’épissage est bornée par les nt 361 et 1 737. La région codante est comprise entre les nt 1 735 et 1 037 [36]. L’épissage se fait donc en dehors du cadre de lecture. Chez ces deux virus, les ARNm codent pour une protéine de 233 acides aminés. Les protéines Cap des PCV présentent 67 % d’homologie. Leurs masses moléculaires calculées sont de 28 kDa, valeur inférieure aux masses observées après électrophorèse sur gel dénaturant (30 kDa), ce qui suggère des modifications posttraductionnelles [37]. La protéine Cap se localise dans le noyau, le ciblage nucléaire faisant intervenir les 41 preVirologie, Vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2005 miers acides aminés de la région N-terminale. Une analyse par mutagenèse dirigée confirme la présence de deux signaux de localisation nucléaire potentiels, constitués d’acides aminés basiques comprenant les résidus aminés 12 à 18 et 34 à 41 [38]. La détection de la protéine n’est possible que 24 heures après infection in vitro, suggérant que la protéine interviendrait à la fin du cycle de multiplication. Quatre épitopes immunodominants, situés au niveau des acides aminés 65-87, 113-147, 157-183 et 193-207, ont été identifiés dans la protéine de capside du PCV2 [39]. – Rep et Rep’. Chez le PCV1, un ARNm d’une taille de 978 nt a été détecté et code pour la protéine Rep (312 acides aminés) impliquée dans la réplication (figure 3). Cet 435 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue ARNm subit un épissage qui génère le transcrit codant pour la protéine Rep’ composée de 168 acides aminés [36]. Les équivalents de ces deux ARNm sont présents chez le PCV2. Les tailles des protéines Rep et Rep’ du PCV2 diffèrent avec 314 et 178 acides aminés respectivement [36]. Toutefois, la protéine Rep du PCV1 et celle du PCV2 affichent près de 87 % de similitude. Dans la région N-terminale de Rep et Rep’ des PCV, trois motifs typiques des protéines d’induction de la réplication par le mode en cercle roulant sont conservés. Le fragment d’ADN contenant le promoteur du gène rep, Prep, englobe la région intergénique et présente un élément de réponse à la stimulation interféron (ISRE), présumant une régulation par les cytokines. Il subirait également une régulation négative par la protéine Rep mais pas par Rep’ [40]. La présence de ces deux protéines est essentielle pour lancer la réplication de l’ADN que, séparées, ces protéines ne peuvent amorcer. Rep et Rep’ interagissent avec des fragments d’ADN double brin inclus dans l’origine de réplication [40]. La protéine Rep se lie in vitro au côté droit de la tige-boucle (figure 2) ainsi qu’aux deux premiers hexamères, tandis que Rep’ nécessite uniquement deux répétitions d’hexamères (figure 2) [41]. Cependant, des expériences ont montré qu’in vivo la protéine Rep interagissait seulement avec deux cytosines du motif tige-boucle situées en positions 3 et 10 [42]. Dans le domaine C-terminal, la protéine Rep contient un motif de liaison de l’ATP, indiquant un éventuel rôle d’hélicase alors que la protéine Rep’ n’en possède pas et agirait plutôt comme nucléase. Le complexe Rep-Rep’ est interchangeable d’un PCV à l’autre. Les protéines produites par le PCV2 sont capables de se fixer au niveau de l’origine de réplication des deux PCV, de même que celles du PCV1 [43]. Elles peuvent s’associer en homomultimères mais aussi en hétéromultimères [40]. – Autres transcrits. En plus de ces trois transcrits, neuf autres ont été identifiés pour le PCV1 et six pour le PCV2 [36]. Ces ARNm résultent, comme pour Rep’, de l’épissage alternatif de la même unité de transcription, l’ARNm codant pour la protéine Rep. On ne sait pas pour l’instant si ces transcrits nouvellement identifiés sont traduits. Ce qui est certain, c’est la complexité de l’organisation transcriptionnelle des circovirus porcins. Néanmoins, il existe des différences dans les profils de transcription car un seul ARNm subit un double épissage chez le PCV2 contre quatre chez le PCV1. Il a été avancé que ces particularités pouvaient servir de base pour expliquer des différences de propriétés biologiques entre ces deux virus [36]. Variabilité génétique Après la découverte du PCV2, il est apparu que le virus avait une forte prévalence dans les élevages à l’échelle mondiale. Par exemple, en Bretagne, il infectait la totalité des animaux dans les élevages touchés par la MAP contre 436 76 % des animaux dans les autres élevages non frappés par la maladie [44]. Par ailleurs, par le séquençage de l’intégralité du génome de nombreux isolats, il a été constaté une très forte homogénéité génétique, avec une homologie nucléotidique comprise entre 95 et 100 %, entre les isolats provenant de continents différents ou de porcs présentant des pathologies différentes. En outre, aucun marqueur moléculaire viral n’a pu être spécifiquement associé à des animaux atteints de MAP, écartant l’hypothèse que la maladie ait émergé à la suite de l’apparition d’un variant viral très virulent [45]. La comparaison de la séquence de plusieurs isolats de BFDV a fait paraître une identité nucléotidique comprise entre 84 et 97 %. Cette faible variabilité est due à des mutations ponctuelles mais aussi à des délétions ou insertions de 1 à 17 nt dans les régions codantes et non codantes [46]. L’hypothèse d’une association génotypique entre le BFDV et ses hôtes a été avancée puis confortée lorsque des travaux ont démontré qu’il existait des variants spécifiques à chaque espèce de Psittacidae [47]. Pathologies associées À l’exception du PCV1 [14], tous les circovirus sont associés à des pathologies qui affectent le système immunitaire en provoquant une déplétion lymphocytaire sévère chez leurs hôtes. Toutefois, de nombreux animaux peuvent être infectés sans manifester de signes cliniques. La maladie d’amaigrissement du porcelet (MAP) Émergence Les émergences de la MAP et du PCV2 dans la population porcine ne sont pas simultanées. En effet, comme décrit précédemment, la présence de PCV2 a pu être confirmée dans des sera datant de 1970 tandis que les premières manifestations de MAP ont été décrites au Canada en 1991 [9]. Cependant, la véritable émergence de la MAP a eu lieu parallèlement en Europe et en Amérique du Nord à partir de 1996. Dès lors, il est probable que des circonstances précises, communes aux deux continents, y ont contribué. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées : 1) augmentation de la charge virale du circovirus dans l’environnement consécutive à certaines évolutions des pratiques d’élevage et/ou à l’intervention d’un cofacteur infectieux aujourd’hui inconnu ; 2) augmentation de la sensibilité du porc consécutive, soit à une modification génétique le rendant plus vulnérable, soit à une modification du mode d’élevage. S’il est communément admis que le PCV2 joue un rôle pivot dans l’étiologie de la maladie, l’implication de facteurs environnementaux favorisant le développement de la MAP clinique est également reconnue. Virologie, Vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2005 revue Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Afssa Ploufragan Figure 4. Porc présentant les signes cliniques caractéristiques de la maladie d’amaigrissement du porcelet, notamment une ligne dorsale prononcée et des flancs creux. Aspects cliniques La MAP affecte les porcelets âgés de 2 à 4 mois. Les animaux affichent un état léthargique associé à une anorexie et généralement à une hyperthermie (figure 4). Ils apparaissent pâles et les désordres digestifs et respiratoires sont fréquents. Leur dépérissement est très rapide, généralement fatal ou conduisant à un état général profondément dégradé. Les taux de morbidité et de mortalité varient selon les élevages et les lots considérés. Dans les élevages concernés, 4 à 20 % des animaux peuvent être atteints de MAP (taux de morbidité) et 70 à 80 % d’entre eux succombent (taux de mortalité). Parfois des dermatites apparaissent en région postérieure sur une faible proportion de l’effectif des porcs en croissance (entre 0 et 5 %) et, malgré l’absence de dépérissement avéré, ces animaux meurent rapidement. Les nécropsies font apparaître de sévères lésions rénales, d’où le nom de « syndrome dermatite-néphropathie » [48]. A Lésions macroscopiques et histopathologiques À l’autopsie, l’hypertrophie des ganglions lymphatiques est généralement observée sans être systématique. Les ganglions inguinaux sont particulièrement affectés et peuvent avoir une taille multipliée par cinq. Ils sont alors décelables par simple palpation. Les ganglions trachéobronchiques et mésentériques sont aussi souvent atteints. La pneumonie est également fréquente ainsi qu’un œdème interlobulaire. Les animaux affectés par la MAP peuvent présenter un foie atrophié et décoloré et/ou des reins localement décolorés (présence de points blancs). Une ulcération nette de l’estomac peut aussi être notée. Les lésions histopathologiques les plus caractéristiques affectent les tissus lymphoïdes. Des degrés variables de déplétion lymphocytaire avec une perte des follicules sont observés (figure 5). Une infiltration d’histiocytes et/ou de cellules géantes multinucléées est très fréquente. Des inclusions cytoplasmiques (agrégats de virions) peuvent être visibles dans les histiocytes. Au niveau pulmonaire, une pneumonie interstitielle est couramment décrite avec, dans certains cas, la présence d’histiocytes au niveau des parois alvéolaires épaissies. Une inflammation des espaces portes du foie peut se manifester ainsi qu’une nécrose d’hépatocytes isolés avec une désorganisation des travées d’hépatocytes. À plus faible fréquence, des lésions microscopiques peuvent être observées au niveau du rein, du pancréas, des intestins et du cœur [25, 48]. Diagnostic Comme les lésions macro et microscopiques varient, le diagnostic de la MAP ne peut être posé que lorsque plusieurs critères sont réunis. Pour qu’un animal soit considéré comme atteint de MAP, il doit présenter des signes clini- B Figure 5. Coupes histologiques de ganglions inguinaux prélevés sur un porcelet sain (A, × 50) et sur un porcelet affecté par la maladie d’amaigrissement du porcelet (B, × 25) présentant une déplétion lymphocytaire sévère associée à une perte des follicules (zone de présence des lymphocytes B). Virologie, Vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2005 437 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue ques et des lésions histopathologiques caractéristiques de la MAP, notamment au niveau des tissus lymphoïdes, et une forte accumulation du PCV2 dans ces lésions [25]. Dans tous les cas, des quantités variables de PCV2 sont révélées dans au moins un tissu présentant des lésions histopathologiques. Pour détecter le PCV2 dans les tissus affectés, les antigènes ou les acides nucléiques de PCV2 sont révélés par immunohistochimie ou par hybridation in situ respectivement. La technique de PCR classique est aussi couramment utilisée [25] mais, de par le caractère endémique du virus, elle ne permet pas à elle seule d’établir le diagnostic de MAP. Toutefois, la PCR quantitative en temps réel s’est révélée un outil précieux par la mise en évidence d’une très bonne corrélation entre la maladie et la charge génomique virale ; en effet, cette charge génomique est significativement plus faible chez les porcs sains. Des seuils de 107 copies de génomes par millilitre de sérum [49] et de 1011 copies de génomes par gramme de tissu [50] ont été proposés comme seuils pour établir un diagnostic de MAP clinique. De plus, le développement de plusieurs techniques d’Elisa a permis le suivi sérologique de l’infection des élevages et des individus affectés ou non par la maladie [51, 52]. La cinétique d’infection peut être ainsi corrélée avec des facteurs de risques potentiels. Transmission Expérimentalement, la transmission horizontale du virus ainsi que la reproduction de la maladie ont été établies après inoculation de suspensions virales (homogénat de tissus, suspension provenant de culture cellulaire) par voies oronasale, intratrachéale et intramusculaire [53, 54]. L’hypothèse d’une transmission du PCV2 par les sécrétions oronasales et les fèces a été émise après mise en évidence de virus dans des écouvillons nasaux et fécaux [55]. La transmission verticale du PCV2 par les femelles a également été étudiée. Des travaux ont imputé au virus des troubles de la reproduction (avortement, mortalité à la naissance et momification de fœtus) [56]. L’infection de fœtus par le PCV2 a été testée à plusieurs stades de la gestation. La multiplication du virus était très élevée chez les fœtus infectés à 57 jours de gestation avec des lésions sérieuses. Des anticorps dirigés contre le PCV2 ont été détectés uniquement chez les fœtus infectés à 75 et 92 jours de gestation [57]. De plus, il a été montré que le virus circulait librement dans le sang ou associé à des cellules, cette dernière forme étant prédominante et persistante [57]. En conséquence, une dissémination par le sang maternel serait possible et permettrait le passage de la barrière placentaire. L’hypothèse d’une transmission placentaire du PCV2 est soutenue par des travaux qui ont montré que le PCV2 était détecté chez des fœtus issus de l’avortement de truies infectées par le virus par voie intranasale [58]. Cependant, l’hypothèse d’une infection transplacentaire est 438 réfutée par d’autres travaux. En effet, des infections par voies intramusculaire et intratrachéale à différents stades de la gestation ont été réalisées sur des truies dépourvues d’anticorps spécifiques du PCV2 [59]. La voie trachéale et musculaire a induit des symptômes caractéristiques de la MAP et des troubles de la reproduction. Néanmoins, les porcelets ne présentaient aucun anticorps avant la tétée de colostrum et étaient indemnes de PCV2 à la naissance. Ces résultats suggèrent que la transmission transplacentaire du PCV2 n’a pas eu lieu [59]. Même si l’infection transplacentaire des fœtus reste ambiguë, il est établi que le PCV2 est à l’origine de troubles de la reproduction. Le rôle du mâle dans la dissémination verticale du virus a également été considéré. Du génome de PCV2 a été détecté par PCR dans la semence de verrats [60]. Reproduction expérimentale Les premiers essais, utilisant comme inoculum des homogénats de tissus infectés [61] ou du virus isolé après propagation en culture cellulaire [62], n’ont reproduit que des lésions légères à modérées et non la MAP clinique. Toutefois, de nouvelles expérimentations ont permis de reproduire tous les symptômes et lésions de la pathologie en utilisant uniquement du PCV2 [54]. Malgré cela, les inocula employés pouvaient contenir des facteurs favorisant l’expression clinique de la MAP, pouvant être aussi bien d’autres virus du porc que des molécules immunomodulatrices comme les cytokines. D’autres facteurs tels que le statut sanitaire des animaux (conventionnel, exempts d’organismes pathogènes spécifiques...), leur âge et l’isolat de PCV2 utilisé, peuvent aussi jouer un rôle dans la pathogenèse. Pour pallier le risque de contamination de l’inoculum par de tels cofacteurs, une stratégie utilisant un clone génomique de PCV2 infectieux a été appliquée. Une première étude a examiné l’infectiosité d’ADN nu de PCV2 (cloné en tandem dans un plasmide) injecté directement dans le foie et les ganglions inguinaux [63]. Seules des lésions peu sévères à modérées ont été observées chez les porcelets de 4 semaines d’âge, malgré une distribution générale du virus dans l’organisme. Bien que le rôle du PCV2 comme agent étiologique de la MAP soit confirmé, l’implication de cofacteur nécessaire pour la manifestation de MAP clinique chez des porcs infectés par le PCV2 semble importante. Identification de cofacteurs Les premiers cofacteurs évoqués par la communauté scientifique ont été viraux ou bactériens. En effet, le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire du porc (SDRP) a été fréquemment retrouvé, chez 20 à 60 % des animaux naturellement infectés par la PCV2 et ayant développé la MAP [64]. Des études de co-infections expérimentales par le PCV2 et le virus du SDRP ont montré que la gravité de la maladie et le taux de mortalité étaient accrus chez les animaux ayant reçu les deux virus [65] et que le PCV2 se Virologie, Vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2005 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue répliquait plus fortement chez les porcelets doublement infectés [66]. Une explication possible repose sur l’infection simultanée des macrophages par ces deux virus et l’activation subséquente de ces cellules par le SDRP qui stimulerait la réplication du PCV2 [66]. Le parvovirus (PPV) activerait également la réplication du PCV2 [67]. D’autres agents pathogènes, comme le virus de la grippe porcine, Mycoplasma hyopneumoniae, Streptococcus suis et Pasteurella multocida [68], interagiraient aussi en synergie avec le PCV2 pour développer des pathologies plus sévères. Le rôle des agents co-infectants pourrait être de stimuler la sécrétion de certaines cytokines qui activeraient ensuite les cellules cibles du PCV2 ou de provoquer des dommages cellulaires suivis d’un processus de réparation qui pourrait aussi activer les cellules cibles du PCV2. Des cofacteurs non infectieux agissant sur l’immunité des animaux ont ensuite été envisagés comme promoteurs de l’infection circovirale dans un organisme. Dans ce cadre, l’impact d’une immunostimulation générale sur des porcelets infectés par le PCV2 a été évalué. L’injection d’adjuvants, de l’hémocyanine en émulsion dans de l’adjuvant incomplet de Freund (KLH/ICFA) et du milieu thioglycollate, à des porcelets préalablement infectés par le virus est suivie de l’apparition de la forme sévère de la maladie [69]. Il en a été conclu que l’activation du système immunitaire était un facteur déclenchant de la MAP clinique. Afin d’évaluer uniquement l’impact de cette immunostimulation générale sur l’évolution clinique de la pathologie, les mêmes immunostimulants ont été injectés après transfection de porcelets par de l’ADN nu de PCV2 infectieux. L’immunostimulation a eu une influence positive sur la réplication virale et le développement de la maladie [70]. Dans une optique identique à la précédente, l’influence sur la pathogenèse d’une immunostimulation plus ciblée a été évaluée chez des animaux également transfectés par l’ADN de PCV2. Pour cela, une cytokine produite par les lymphocytes T et B, le GM-CSF, a été choisie. L’immunostimulation ciblée n’a eu aucun impact sur la réplication virale et l’expression clinique [71]. En parallèle, l’activation du système immunitaire par la vaccination a aussi été suspectée d’influencer indirectement l’évolution clinique de la MAP. Plusieurs vaccins ont été testés mais ces études ont abouti à des résultats contradictoires [72]. Il semble donc que l’influence de l’immunostimulation ne soit pas générale pour favoriser l’apparition de la maladie et que le phénomène étudié soit complexe. Prévention et contrôle Des observations réalisées en élevage ont montré le rôle des conditions zootechniques dans la sévérité de l’expression de la pathologie. Des modifications zootechniques visant à réduire la pression d’infection ont alors été proposées [48]. Les mesures insistent sur une amélioration de l’hygiène et Virologie, Vol. 9, n° 6, novembre-décembre 2005 une réduction du stress à différentes périodes. Leur application a permis une évolution globale favorable dans des élevages sévèrement touchés. Une approche vaccinale en termes de prophylaxie a rapidement été envisagée. Depuis 1997, plusieurs brevets relatifs à la mise au point de vaccins ont été déposés. Des travaux décrivant deux protocoles de vaccination, reposant l’un sur l’utilisation d’un vaccin à ADN et l’autre sur un vaccin sous-unitaire, ont été réalisés [73]. Le premier vaccin de type génique, comprenant les trois plasmides portant les gènes Rep et Cap du PCV2 et le gène du GM-CSF, a été réalisé en deux injections à 15 jours d’intervalle. Il a permis d’induire une protection efficace chez les porcelets. De même, le vaccin sous-unitaire, à base de protéines recombinantes (Rep et Cap de PCV2) produites en baculovirus, a permis d’induire, après addition d’un adjuvant, une réponse immunitaire dirigée contre le PCV2. Un vaccin à base de circovirus inactivé par des méthodes conventionnelles a également conféré une protection des porcelets contre une infection à PCV2 [74]. Enfin, l’injection en intramusculaire de clones chimères de PCV1 et PCV2 a induit une immunité protectrice vis-à-vis du PCV2 [75]. Les circoviroses aviaires Excepté les circovirus porcins, tous les circovirus ont été identifiés chez des oiseaux. Toutefois, parmi ces circovirus aviaires, seuls le virus de la maladie du bec et du plumage des Psittacidae (BFDV) et le circovirus du pigeon (PiCV) sont associés à des maladies cliniques bien décrites. Aspects cliniques et lésions Chez les oiseaux, la pathologie causée par un circovirus la mieux connue à l’heure actuelle est la maladie du bec et du plumage des Psittacidae (PBFD). Elle a été décrite dans les années 1980 chez des perroquets en Australie et ensuite associée au BFDV [6]. Elle affecte les oiseaux de la famille des Psittacidae, âgés de moins de 3 ans. Ses symptômes classiques sont une dystrophie des plumes (nécroses, fractures ou courbures souvent associées à une hémorragie) se concluant par leur perte progressive et une nécrose du bec. Les lésions histologiques principales sont détectées au niveau du fourreau et de la pulpe des plumes. Une nécrose lymphocytaire ainsi qu’une atrophie du thymus et de la bourse de Fabricius peuvent survenir. Comme pour l’infection par le PCV2 chez le porc, des inclusions intracytoplasmiques, composées de particules virales agrégées, sont observées dans les macrophages. Bien que des oiseaux infectés puissent vivre plusieurs années, dans la majorité des cas, ils meurent après quelques mois et, la plupart du temps, d’une infection secondaire [23]. L’infection d’un pigeon par le PiCV a été découverte aux États-Unis en 1993 [76]. La présence du virus a été depuis rapportée dans de nombreux pays [23]. Le PiCV infecte également les jeunes pigeons âgés de moins de 1 an. À 439 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue l’instar du PCV2, il provoque un taux de morbidité faible et un taux de mortalité élevé [77]. Il induit le plus fréquemment une léthargie, une anorexie, une diarrhée, une perte de poids rapide et une multitude d’autres signes relatifs à des infections concomitantes. Contrairement à la PBFD, aucune perte et/ou dystrophie de plumes et aucune déformation du bec n’ont été observées chez des animaux infectés par ce virus. À la nécropsie, la principale lésion macroscopique est une atrophie de la bourse de Fabricius. Néanmoins, cette caractéristique n’est pas nécessairement visible chez tous les pigeons infectés. La gravité des lésions histopathologiques de cet organe va de l’hyperplasie folliculaire à la nécrose lymphoïde. Le virus peut être détecté par hybridation in situ dans plusieurs organes tels que la bourse de Fabricius, la rate, le thymus, le rein et le foie. Des agrégats de particules virales ont été également trouvés dans des cellules folliculaires de la bourse de Fabricius et des cellules épithéliales [23]. Diagnostic La PBFD est diagnostiquée sur la base des altérations du plumage et de la détection du virus (antigènes ou acides nucléiques). Une infection par le PiCV est suspectée lorsque l’animal manifeste les signes cliniques caractéristiques et qu’une atrophie de la bourse de Fabricius est visible à l’autopsie. La détection du PiCV au niveau de lésions histopathologiques par hybridation in situ permet de confirmer le diagnostic. Pour les deux pathologies, le diagnostic est généralement validé par l’observation au microscope des inclusions intracytoplasmiques [23]. Transmission La transmission du BFDV serait la voie horizontale, par contact direct ou indirect entre animaux. Du virus a été décelé au niveau du bec, du jabot, des sinus, des fientes et des poussières de plumes. La contamination se ferait par inhalation ou par ingestion des particules virales [78]. La contamination verticale est aussi suspectée. Il en est de même pour le PiCV. La présence de ce dernier dans des fientes a permis de suggérer que le virus peut se transmettre par la voie fécale et/ou orale [23]. Reproduction expérimentale La première reproduction expérimentale de la PBFD a été conduite en 1987 par inoculation d’homogénats préparés à partir de plumes d’oiseaux naturellement infectés par le BFDV [79]. La présence de particules virales dans l’homogénat avait été confirmée par observation au microscope électronique. Aucun essai de reproduction expérimentale n’a eu lieu à l’heure actuelle pour les autres circoviroses aviaires. Prévention et contrôle Seule la PBFD a fait l’objet de recherches de moyen de contrôle et de prophylaxie. L’infection des perroquets en 440 captivité peut être prévenue en limitant leurs contacts avec des animaux infectés ou avec des environnements contaminés tels que les cages. Une étude a montré que l’injection de virus inactivé à des femelles induit la production d’anticorps maternels anti-BFDV protégeant temporairement leur progéniture [80]. Comme le virus n’est pas cultivable in vitro, la production de virus inactivé pour ce type de vaccin n’est pas envisageable. Conclusion Bien que beaucoup de données moléculaires et épidémiologiques sur les circovirus porcins aient été accumulées ces dernières années, de nombreuses interrogations persistent. Quel est le récepteur cellulaire responsable de l’entrée du virus ? Pourquoi une proportion variable de porcelets infectés par le PCV2 développe-t-elle une MAP clinique ? Quel processus ou changement a-t-il entraîné l’émergence simultanée de cette maladie dans plusieurs zones géographiques alors que le virus associé est présent depuis au moins plusieurs décennies dans les élevages ? Les réponses à ces questions sont fondamentales en termes d’évaluation des risques sanitaires liés à des populations virales déjà bien caractérisées et a fortiori à des virus encore inconnus. En effet, si les circovirus décrits à ce jour ont fait l’objet de recherches toujours en réponse à des pathologies associées (sauf le PCV1 découvert par hasard), on peut imaginer que le monde animal héberge de nombreuses espèces de Circoviridae, qui pourraient émerger soudainement lors d’un changement de pratiques d’élevage. Remerciements. Les auteurs remercient tous les membres de l’unité de génétique virale et de biosécurité (UGVB), de l’unité d’épidémiologie et du bien-être porcin (UEBEP) et le service d’expérimentation animale (SPPAE) de l’Afssa Ploufragan, pour leurs précieux conseils et la relecture du manuscrit. Références 1. Gutierrez C, Ramirez-Parra E, Mar Castellano M, Sanz-Burgos AP, Luque A, Missich R. Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions. Vet Microbiol 2004 ; 98 : 111-9. 2. Gronenborn B. Nanoviruses : genome organisation and protein function. Vet Microbiol 2004 ; 98 : 103-9. 3. Gibbs MJ, Weiller GF. Evidence that a plant virus switched hosts to infect a vertebrate and then recombined with a vertebrate-infecting virus. Proc Natl Acad Sci USA 1999 ; 96 : 8022-7. 4. Tischer I, Rasch R, Tochtermann G. Characterization of papovavirus and picornavirus like particles in permanent pig kidney cell lines. Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infekyionskr Hyg Abt 1 Orig 1974 ; 26 : 153-67. 5. 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