SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE DS n°5 Épreuve de biologie

SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
DS n°5
Épreuve de biologie
12 mars 2016
Durée : 2 heures
Le sujet comporte 2 parties indépendantes.
Thème 1
Le candidat répondra avec concision aux questions posées en relation avec l’étude de
la bactérie Listeria et proposer un schéma bilan en fin de thème.
Thème 2
Le candidat s’appuiera essentiellement sur une analyse détaillée des documents pour
répondre à la question posée en début de thème.
Aucune introduction n’est attendue.
Le candidat ne doit pas rédiger de longs développements de connaissances sur le
thème, indépendamment de l’exploitation des documents.
Les documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition d’être légendés,
commentés et exploités ; des croquis légendés peuvent également être proposés.
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THÈME 1
CONTRÔLE DE L’EXPRESSION GÉNÉTIQUE DE LA BACTÉRIE LISTÉRIA
Sources bibliographiques
David Ribet : conférence octobre 2015, MNHN, UPA
Toledo-Arana et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 2009;
459:950-956.
Kortmann J, Narberhaus F. Bacterial RNA thermometers : molecular zippers and switches Nat Rev Microbiol.
2012; 10:255.
O’Neil, Marquis, Listeria monocytogenes Flagella are used for motilty, not as adhesins, to increase host cell
invasion, Infection and Immunity, 2006, 6675-6681
Dickneite, Böckmann, Spory, Goebel, Sokolovic, Differential interaction of the transcription factor PrfA and the
PrfA-activating factor (Paf) of Listeria monocytogenes with target sequences, Molecular Microbiology (1998)
27, 915-928
Johansson et coll., An RNA Thermosensor controls expression of virulence genes in Listeria
monocytogenes, Cell, Vol 110, 551-561, 2002
Listeria monocytogenes est une bactérie qui possède plusieurs modes de vie. Elle représente un
pathogène intracellulaire facultatif, c’est-à-dire qu’elle peut aussi vivre à l’état libre dans un
environnement inerte, aquatique, alimentaire, en tant que saprophyte (se nourrissant des nutriments
disponibles) que dans une cellule hôte qu’elle infecte.
1.A. Conditions d’expression des gènes de virulence
1.A.1. Profil d’expression des gènes de virulence en fonction de l’environnement
Une méthode dérivée des puces à ARN permet de quantifier la transcription (donc le nombre de
molécules d’ARNm) de tous les gènes d’une culture de cellules : il s’agit du tiling array.
Dans notre étude, le niveau d’expression de référence (1:1) est celui de bactéries Listeria
monocytogenes mises en culture à 37°C et prélevées en phase exponentielle. Seuls les gènes
impliqués dans la virulence de la bactérie sont décrits dans les résultats suivants.
Figure 1 - Résultat de tilling array : profil d’expression des gènes de virulence de Listeria
dans différentes conditions de culture. Fold change = taux multiplicatif de variation
Stat. = phase stationnaire de culture bactérienne à 37°C
30°C = phase exponentielle de culture bactérienne à 30°C
Low O2 = phase exponentielle de culture bactérienne à 37°C en hypoxie
Intestin = extraction des ARNm de bactéries inoculées dans un intestin de souris pendant 48h
Blood = extraction des ARNm de bactéries mises en culture dans du sang murin à 37°C
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Question 1 - Reliez les conditions testées aux environnements rencontrés par la bactérie.
Question 2 - Analysez le résultat de tilling array afin de montrer l’effet de la température sur la
virulence.
Question 3 - Analysez les résultats obtenus pour l’intestin et le sang. Quel facteur de
l’environnement semble expliquer cette différence ?
1.B.2. Effet de la température sur l’expression de la protéine PrfA
Expérience 1
Une construction a été réalisée, associant la séquence 5’ de prfA avec le gène de la gfp, codant pour
une protéine fluorescente. Cette construction a été insérée dans des bactéries Listeria alors mises en
culture à 30 ou 37°C.
Question 4 - Comment appelle-t-on une telle construction ? Quelle est son utilité ?
L’observation microscopique en contraste de phase permet de localiser les bactéries. L’utilisation de
lumière à 395 nm (UV) permet de révéler la fluorescence. Les clichés obtenus sont indiqués dans le
document 2 ci-dessous.
Document 2 - Images 1-2 : bactéries en culture à 30°C observées au microscope sous 395 nm (1) ou
par contraste de phase (2).
Images 3-4 : bactéries en culture à 37°C observées au microscope sous 395 nm (3) ou par contraste de
phase (4).! ! ! ! ! ! ! ! Barre d’échelle : 10 µm
Question 5 - Décrivez les résultats obtenus et indiquez l’effet de la température sur l’expression
de la protéine PrfA.
Expérience 2
Des cultures de Listeria ont été réalisées dans des conditions de température entre 20 et 37°C. La
quantité d’ARNm et de protéine a été évaluée par des électrophorèses, dont les gels sont présentés
dans le document 4.
La ligne témoin n’apparaît pas sur les clichés mais valide les résultats quantitatifs.
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!!!!20°C! 37°C
Document 3 - Gels d’électrophorèse d’ARNm et de protéine PrfA dans des bactéries cultivées à 20°C,
30°C ou 37°C. ND = non détecté (Johansson et coll., Cell, Vol 110, 551-561, 2002)
Question 6 - Déterminez à quel niveau de l’expression génétique intervient la température.
Justifiez votre réponse.
Expérience 3
Grâce à des outils de cristallographie, on a pu comparer la structure tridimensionnelle de l’ARNm de
prfA en fonction de la température.
Le domaine 5’ de l’ARNm possède des séquences palindromes à l’origine de régions double-brin.
Figure 4 - Représentation schématique de la structure de l’extrémité 5’ de l’ARNm de prfA dans deux
conditions de température (la séquence Shine-Dalgarno est celle reconnue par le ribosome pour
commencer la traduction de la protéine).
Question 7 - D’une manière générale, quel est l’effet de la température sur la structure secondaire
des acides nucléiques ? Justifiez votre réponse.
Question 8 - Reliez la structure de l’ARNm à la présence de la protéine PrfA, en fonction de la
température. En quoi cette régulation génétique est-elle originale ?
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1.C. Étude de la protéine PfrA
1.C.1. Effet de PrfA sur l’expression des gènes de la virulence
Les bactéries Listeria possèdent différents types de facteurs sigma σ. Une souche dénuée du facteur σB
(notée ΔsigB) est testée dans 2 milieux : intestin et sang de souris.
Une souche mutée pour le facteur PrfA de la région de virulence, notée ΔprfA, est également testée. Le
niveau d’expression de gènes impliqués dans l’infection est alors comparé à la souche sauvage WT.
!!
!!!
Document 5 - profil d’expression dans l’intestin (à gauche) et dans le sang (à droite)
pour les 2 souches de Listeria mutées, ΔsigB et ΔprfA. La couleur indique le taux d’expression.
Question 9 - Analysez les résultats obtenus pour l’ensemble des gènes de virulence étudiés ici.
Que peut-on en déduire quant au rôle des facteurs σB et PrfA dans l’intestin ? dans le sang ?
Reliez votre analyse aux résultats du document 1.
b) Recherche du mode d’action de PrfA dans le sang
Expérience 1
Le gène de virulence suivi est le gène hly, impliqué dans l’activité intracellulaire de la bactérie au cours
de l’infection. Deux fragments de la séquence en amont de hly sont étudiés :
fragment hly 109 pb :
! ! ! ! -40! ! ! ! -10
5‘ ————————— TTAACATTTGTTAA ———— TATAbox ————— site +1 ————— 3’
3‘ ————————— AATTGTAAACAATT ———— TATAbox ————— site +1 ————— 5’
fragment hly 28 pb
! 5‘ ————— TTAACATTTGTTAA —— 3’
3‘ ————— AATTGTAAACAATT —— 5’
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