SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE DS n°3

SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
DS n°3
28 novembre 2015
Durée : 2 heures
Le sujet comporte 2 parties indépendantes.
- Vous répondrez aux questions posées en construisant méthodiquement votre
argumentation sur l’analyse des documents proposés et sur vos connaissances.
- Vous ne rédigerez ni introduction, ni conclusion générales.
- Les documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition d’être exploités.
- Les numéros des documents étudiés seront clairement indiqués.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Partie 1
Pentecost, Kumaran, Ghosh et Amieva, PLOS Pathogens, volume 6, issue 5, mai 2010
Mengaud, Ohayon, Gounon, Mège et Cossart, Cell, volume 84, 923-932, mars 1996
Bonazzi, Veiga, Pizarro-Cerda et Cossart, Cellular Microbiology, volume 10, 2208-2222, 2008
Mostowy et Cossart, Cell Motility and the cytoskeleton 66 : 816-823, 2009
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PARTIE 1
LISTERIA MONOCYTOGENES, UNE BACTÉRIE PATHOGÈNE
Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène présente partout dans l’environnement. Elle
peut être retrouvée accidentellement dans les aliments et à l’origine de pathologie, les listérioses,
pouvant être graves dans le cas de personnes fragiles (nouveau-nés, personnes âgées ou ayant
un système immunitaire déficient) : sur 300 cas d’infections chaque année en France, 25%
provoquent le décès du malade.
La bactérie Listeria se multiplie à l’intérieur des cellules intestinales infectées et se répand ensuite
via le sang vers d’autres organes cibles, tels le foie, la rate ou le cerveau.
L’étude porte ici sur la première phase de l’infection de Listeria.
Après avoir étudié les documents suivants, vous construirez un schéma bilan de
l’internalisation de la bactérie Listeria dans une cellule épithéliale intestinale.
Document 1.1 - Intervention des internalines dans l’infection
1.1.a. Le rôle des internalines bactériennes
Les internalines constituent une famille de 24 protéines membranaires de Listeria. Ces 24
protéines possèdent des régions répétées riches en Leucine.
L’équipe de Mickey Pentecost a mis en culture des cellules épithéliales MDCK (analogues aux
cellules de la paroi intestinale) puis les a infectés avec une souche de Listeria sauvage (WT) ou
une souche ΔinlB dont le gène codant pour l’internaline a été supprimé. Après 10 minutes
d’incubation, la quantité de bactéries ayant adhéré sur les cellules est mesurée, ainsi que la
quantité de bactéries viables à l’intérieur des cellules. La figure 1 résume les résultats obtenus.
Figure 1 - Quantification de l’adhérence (Attached Listeria) et de l’internalisation (Intracellular
Listeria) des bactéries au bout de 10 min de mise en contact avec des cellules épithéliales MDCK.
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!1.1.b. Adhérence de l’internaline à la membrane cellulaire épithéliale
L’équipe de Pascale Cossart, de l’Institut Pasteur de Paris, travaille sur des cellules intestinales en
culture, nommées Caco-2.
Un extrait cellulaire de Caco-2 (cell extract) a été ajouté à une colonne de chromatographie
remplie par un gel contenant de l’internaline. La colonne a ensuite été lavée. Puis on a récupéré
les molécules retenues par le gel en faisant passer une solution d’élution d’EDTA pendant 1 heure.
Toutes les 5 minutes, le tube récoltant a été changé : les fractions ainsi recueillies sont
numérotées par chronologie de 1 à 12.
En parallèle, le même extrait cellulaire a été traité dans une colonne de chromatographie
contenant un gel contenant une autre protéine, de la serum albumine bovine (BSA).
Les fractions recueillies sont ensuite soumises à une électrophorèse, dont le résultat est présenté
sur la figure 2.
" " a) internaline"""""" "b) BSA
Figure 2 - Gels d’électrophorèse des extraits cellulaires Caco-2 (Cell extract), de marqueur de
poids moléculaire (MW) et des fractions d’élution de chromatographie dans un gel contenant de
l’internaline (a) ou du BSA (b).
Afin d’identifier les protéines P110 et P80, leur séquence a été établie. D’une part, on a découvert
que P80 est une forme dégradée de P110. D’autre part, on a comparé la séquence N-terminale de
cette protéine avec des banques de séquences connues, ce qui est résumé dans la figure 3.
!Protéine ! ! Séquence N-terminale
"P110" " " D X V I P X I S X P E N E K G P F P K N
"N-cadhérine" " D W V I P P I N L P E N S R G P F P Q E
"E-cadhérine" " D W V I P P I S C P E N E K G P F P K N
figure 3 - Séquence des 20 acides aminés N-terminaux de P110 et de 2 protéines membranaires
!1.1.c. Conséquence de l’adhérence de Listeria en surface de cellule épithéliale
Des cellules épithéliales en culture ont été incubées, ou non, avec 50 nM d’internaline A (InlA)
pendant 15, 30 et 60 minutes. À ces trois temps, les cellules ont été fixées et les molécules de E-
cadhérine ont été soumises à deux marquages, observés sur la figure 4 :
-soit une incubation avec des anticorps couplés à de la fluorescence rouge anti-E-cadhérine (a) ;
-soit les cellules ont d’abord été rendues perméables aux anticorps puis un marquage des E-
cadhérines a été réalisé avec des anticorps couplés à de la fluorescence verte (b).
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" " (a)" " " " (b)" " " détail de (b)
Figure 4 - Cellules épithéliales observées au microscope avec révélation de la fluorescence des
anticorps anti-E-cadhérine. Ligne du haut = cellules non traitées ; ligne du bas = cellules incubées
avec l’internaline A. Les conditions (a) et (b) sont expliquées dans le texte qui précède.
Document 1.2 - Mécanisme de l’internalisation de Listeria
1.2.a. Mode d’internalisation
Contrairement à la phagocytose de cellules, l’endocytose de particules met en jeu des vésicules
entourées par un réseau de clathrine. L’équipe de Pascale Cossart a cherché à préciser le mode
d’internalisation de Listeria en déterminant s’il s’agit de phagocytose ou d’endocytose.
Pour cela, des cultures de cellules épithéliales ont été marquées avec différents fluorochromes
lors d’une infection. La figure 5 rassemble les clichés obtenus.
Figure 5 - Localisation des bactéries Listeria totales (marquées en vert) et extracellulaires (bleu),
ainsi que la clathrine (rouge) d’une cellule épithéliale mise au contact 30 minutes avec des
bactéries. La bactérie fléchée a été zoomée dans le petit cadre inférieur à chaque cliché. Le cliché
de droite (Merge) superpose les 3 marquages. La barre d’échelle représente 6 µm.
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1.2.b. Recrutement de la clathrine
Le travail porte sur 2 lots de cellules épithéliales humaines :
-un lot témoin noté wt-E-cad ;
-un lot de cellules mutées dans leur séquence de la E-cadhérine : les tyrosines 755 et 756 ont été
enlevées de la séquence d’acides aminés. Ce lot est noté E-cad-ΔJM.
Ces 2 lots de cellules ont été mis en contact 45 minutes avec la bactérie Listeria. Par des
techniques de fluorescence quantitative, les chercheurs ont calculé le pourcentage de bactéries
ayant recruté la E-cadhérine et la clathrine. En parallèle, ils ont estimé l’internalisation des
bactéries. Les mesures ont été réalisées 3 fois sur environ 300 bactéries : les résultats sont réunis
sur la figure 6.
""" "
" " " " (a)" " " " " " " (b)
Figure 6 - (a) pourcentage de bactéries ayant recruté la E-cadhérine et la clathrine après 45
minutes d’infection. (b) pourcentage de bactéries internalisées au bout de 45 minutes d’infection.
1.2.c. Influence de l’internaline sur le recrutement de la clathrine
Les tyrosines étant des cibles privilégiées des
kinases, une étude a été menée pour préciser
l’état de la E-cadhérine lors de l’infection.
Des cellules épithéliales en culture ont été
incubées pendant différents temps avec
Listeria. La E-cadhérine a alors été récupérée
par immunoprécipitation et soumise à un
Western blot. La membrane de nitrocellulose
obtenue après électrophorèse a été révélée
avec :
-soit un anticorps anti-tyrosine phosphorylée ;
-soit un anticorps anti-E-cadhérine.
Les deux autoradiographies obtenues sont
présentées en figure 7.
La colonne 15’+PP1 correspond à une incubation réalisée après traitement des cellules
épithéliales avec un inhibiteur de la kinase Src.
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