SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE DS n°3
publicité
1/8 SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE DS n°3 28 novembre 2015 Durée : 2 heures Le sujet comporte 2 parties indépendantes. - Vous répondrez aux questions posées en construisant méthodiquement votre argumentation sur l’analyse des documents proposés et sur vos connaissances. - Vous ne rédigerez ni introduction, ni conclusion générales. - Les documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition d’être exploités. - Les numéros des documents étudiés seront clairement indiqués. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES Partie 1 Pentecost, Kumaran, Ghosh et Amieva, PLOS Pathogens, volume 6, issue 5, mai 2010 Mengaud, Ohayon, Gounon, Mège et Cossart, Cell, volume 84, 923-932, mars 1996 Bonazzi, Veiga, Pizarro-Cerda et Cossart, Cellular Microbiology, volume 10, 2208-2222, 2008 Mostowy et Cossart, Cell Motility and the cytoskeleton 66 : 816-823, 2009 DS C.Escuyer - BCPST1 - 2015/2016 2/8 PARTIE 1 LISTERIA MONOCYTOGENES, UNE BACTÉRIE PATHOGÈNE Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène présente partout dans l’environnement. Elle peut être retrouvée accidentellement dans les aliments et à l’origine de pathologie, les listérioses, pouvant être graves dans le cas de personnes fragiles (nouveau-nés, personnes âgées ou ayant un système immunitaire déficient) : sur 300 cas d’infections chaque année en France, 25% provoquent le décès du malade. La bactérie Listeria se multiplie à l’intérieur des cellules intestinales infectées et se répand ensuite via le sang vers d’autres organes cibles, tels le foie, la rate ou le cerveau. L’étude porte ici sur la première phase de l’infection de Listeria. Après avoir étudié les documents suivants, vous construirez un schéma bilan de l’internalisation de la bactérie Listeria dans une cellule épithéliale intestinale. Document 1.1 - Intervention des internalines dans l’infection 1.1.a. Le rôle des internalines bactériennes Les internalines constituent une famille de 24 protéines membranaires de Listeria. Ces 24 protéines possèdent des régions répétées riches en Leucine. L’équipe de Mickey Pentecost a mis en culture des cellules épithéliales MDCK (analogues aux cellules de la paroi intestinale) puis les a infectés avec une souche de Listeria sauvage (WT) ou une souche ΔinlB dont le gène codant pour l’internaline a été supprimé. Après 10 minutes d’incubation, la quantité de bactéries ayant adhéré sur les cellules est mesurée, ainsi que la quantité de bactéries viables à l’intérieur des cellules. La figure 1 résume les résultats obtenus. Figure 1 - Quantification de l’adhérence (Attached Listeria) et de l’internalisation (Intracellular Listeria) des bactéries au bout de 10 min de mise en contact avec des cellules épithéliales MDCK. DS C.Escuyer - BCPST1 - 2015/2016 3/8 !1.1.b. Adhérence de l’internaline à la membrane cellulaire épithéliale L’équipe de Pascale Cossart, de l’Institut Pasteur de Paris, travaille sur des cellules intestinales en culture, nommées Caco-2. Un extrait cellulaire de Caco-2 (cell extract) a été ajouté à une colonne de chromatographie remplie par un gel contenant de l’internaline. La colonne a ensuite été lavée. Puis on a récupéré les molécules retenues par le gel en faisant passer une solution d’élution d’EDTA pendant 1 heure. Toutes les 5 minutes, le tube récoltant a été changé : les fractions ainsi recueillies sont numérotées par chronologie de 1 à 12. En parallèle, le même extrait cellulaire a été traité dans une colonne de chromatographie contenant un gel contenant une autre protéine, de la serum albumine bovine (BSA). Les fractions recueillies sont ensuite soumises à une électrophorèse, dont le résultat est présenté sur la figure 2. " " a) internaline" " " " " " " b) BSA Figure 2 - Gels d’électrophorèse des extraits cellulaires Caco-2 (Cell extract), de marqueur de poids moléculaire (MW) et des fractions d’élution de chromatographie dans un gel contenant de l’internaline (a) ou du BSA (b). Afin d’identifier les protéines P110 et P80, leur séquence a été établie. D’une part, on a découvert que P80 est une forme dégradée de P110. D’autre part, on a comparé la séquence N-terminale de cette protéine avec des banques de séquences connues, ce qui est résumé dans la figure 3. ! " " " Protéine ! ! Séquence N-terminale P110" " " DXVIPXISXPENEKGPFPKN N-cadhérine" " DWVIPPINLPENSRGPFPQE E-cadhérine" " DWVIPPISCPENEKGPFPKN figure 3 - Séquence des 20 acides aminés N-terminaux de P110 et de 2 protéines membranaires !1.1.c. Conséquence de l’adhérence de Listeria en surface de cellule épithéliale Des cellules épithéliales en culture ont été incubées, ou non, avec 50 nM d’internaline A (InlA) pendant 15, 30 et 60 minutes. À ces trois temps, les cellules ont été fixées et les molécules de Ecadhérine ont été soumises à deux marquages, observés sur la figure 4 : - soit une incubation avec des anticorps couplés à de la fluorescence rouge anti-E-cadhérine (a) ; - soit les cellules ont d’abord été rendues perméables aux anticorps puis un marquage des Ecadhérines a été réalisé avec des anticorps couplés à de la fluorescence verte (b). DS C.Escuyer - BCPST1 - 2015/2016 4/8 " " (a)" " " " (b)" " " détail de (b) Figure 4 - Cellules épithéliales observées au microscope avec révélation de la fluorescence des anticorps anti-E-cadhérine. Ligne du haut = cellules non traitées ; ligne du bas = cellules incubées avec l’internaline A. Les conditions (a) et (b) sont expliquées dans le texte qui précède. Document 1.2 - Mécanisme de l’internalisation de Listeria 1.2.a. Mode d’internalisation Contrairement à la phagocytose de cellules, l’endocytose de particules met en jeu des vésicules entourées par un réseau de clathrine. L’équipe de Pascale Cossart a cherché à préciser le mode d’internalisation de Listeria en déterminant s’il s’agit de phagocytose ou d’endocytose. Pour cela, des cultures de cellules épithéliales ont été marquées avec différents fluorochromes lors d’une infection. La figure 5 rassemble les clichés obtenus. Figure 5 - Localisation des bactéries Listeria totales (marquées en vert) et extracellulaires (bleu), ainsi que la clathrine (rouge) d’une cellule épithéliale mise au contact 30 minutes avec des bactéries. La bactérie fléchée a été zoomée dans le petit cadre inférieur à chaque cliché. Le cliché de droite (Merge) superpose les 3 marquages. La barre d’échelle représente 6 µm. DS C.Escuyer - BCPST1 - 2015/2016 5/8 1.2.b. Recrutement de la clathrine Le travail porte sur 2 lots de cellules épithéliales humaines : - un lot témoin noté wt-E-cad ; - un lot de cellules mutées dans leur séquence de la E-cadhérine : les tyrosines 755 et 756 ont été enlevées de la séquence d’acides aminés. Ce lot est noté E-cad-ΔJM. Ces 2 lots de cellules ont été mis en contact 45 minutes avec la bactérie Listeria. Par des techniques de fluorescence quantitative, les chercheurs ont calculé le pourcentage de bactéries ayant recruté la E-cadhérine et la clathrine. En parallèle, ils ont estimé l’internalisation des bactéries. Les mesures ont été réalisées 3 fois sur environ 300 bactéries : les résultats sont réunis sur la figure 6. " "" " " " " " (a)" " " " " " " (b) Figure 6 - (a) pourcentage de bactéries ayant recruté la E-cadhérine et la clathrine après 45 minutes d’infection. (b) pourcentage de bactéries internalisées au bout de 45 minutes d’infection. 1.2.c. Influence de l’internaline sur le recrutement de la clathrine Les tyrosines étant des cibles privilégiées des kinases, une étude a été menée pour préciser l’état de la E-cadhérine lors de l’infection. Des cellules épithéliales en culture ont été incubées pendant différents temps avec Listeria. La E-cadhérine a alors été récupérée par immunoprécipitation et soumise à un Western blot. La membrane de nitrocellulose obtenue après électrophorèse a été révélée avec : - soit un anticorps anti-tyrosine phosphorylée ; - soit un anticorps anti-E-cadhérine. Les deux autoradiographies obtenues sont présentées en figure 7. La colonne 15’+PP1 correspond à une incubation réalisée après traitement des cellules épithéliales avec un inhibiteur de la kinase Src. DS C.Escuyer - BCPST1 - 2015/2016 6/8 PARTIE 2 LA PROTÉINE GLUT1, PROTÉINE DE TRANSPORT DU GLUCOSE L’étude porte ici sur la protéine dite perméase GLUT1. Après avoir étudié les documents suivants, vous schématiserez la structure de la protéine GLUT1 et caractériserez sa fonction au sein de la membrane de l’hématie. Document 2.1 - Étude structurale de la protéine GLUT1 2.1.a. Caractéristiques de GLUT1 On traite des membranes d’hématie avec un détergent de façon à isoler les protéines. On réalise une électrophorèse en conditions dénaturantes sur un gel de polyacrylamide, en présence du détergent SDS et de mercaptoéthanol (qui rompt les ponts disulfure). Puis on révèle l’électrophorèse par la méthode du Western blot à l’aide d’anticorps anti-GLUT1 marqués radioactivement. Enfin, on réalise une autoradiographie du gel, qui est présentée en figure 1 : la radioactivité est visible au niveau de la flèche (le reste des bandes grises est une coloration parasite). Par ailleurs, une analyse en conditions non dénaturantes a montré que la protéine GLUT1 a une masse moléculaire d’environ 220 kDa. Figure 1 - Gel d’électrophorèse en conditions dénaturantes de la protéine membranaire GLUT1 DS C.Escuyer - BCPST1 - 2015/2016 7/8 2.1.b. Caractéristiques de GLUT1 À partir de membranes d’hématies, les protéines GLUT1 sont extraites et purifiées. Puis on établit un profil d’hydropathie en utilisant l’échelle de Kyte et Doolittle pour laquelle les valeurs positives de l’indice d’hydropathie correspondent à un comportement hydrophobe du segment. Il est retranscrit dans la figure 2 ci-dessous. Figure 2 - Profil d’hydropathie de GLUT1 2.1.c. Orientation de la protéine GLUT1 Etape 1 - On commence par obtenir des « fantômes » de globules rouges. Pour cela, des hématies sont éclatées par choc osmotique. Les fragments de membrane se referment ensuite spontanément : - soit en conservant leur orientation : la face externe de la membrane de l’hématie reste tournée vers l’extérieur (vésicules notées « normales ») ; - soit en se retournant, ainsi la face interne de la membrane de l’hématie se retrouve vers l’extérieur de la vésicule (alors appelée vésicule « inversée »). Etape 2 - un anticorps fluorescent est dirigé spécifiquement contre la portion 450-492 de la protéine GLUT1. Il est noté Ac-450. Les vésicules, normales ou inversées, sont incubées avec l’anticorps, Ac-450 puis observées avec un microscope à fluorescence. Les résultats sont dans le tableau ci-dessous. DS C.Escuyer - BCPST1 - 2015/2016 8/8 Document 2.2 - Rôle de la protéine GLUT1 Des hématies intactes sont placées dans des solutions de concentrations croissantes en Dglucose ou en L-glucose. On mesure le flux entrant de glucose (en mmol/s) dans les cellules. Sur le graphique de la figure 3 sont portés aussi les résultats obtenus sur une membrane artificielle perméable au glucose. Dans le sang, la concentration en glucose (glycémie) est de 1 g.L-1. Figure 3 - Flux entrant de glucose dans 3 conditions expérimentales DS C.Escuyer - BCPST1 - 2015/2016
