L`affiche scientifique primée

Imagerie 3D in-vivo
du cerveau de la Drosophile
A.MASSON, S.BENREZZAK, D. NUTARELLI, P. TCHENIO
La technique HiLo
Problématique
“Comment est encodée la mémoire ?” “Quel est le nombre
de cellules impliquées dans le processus ?” et “Comment
sont elles sélectionnées ?” Sont les questions fondamentales
non résolues dans la recherche sur la mémoire. Pouvoir
suivre l’organisation cellulaire de la confection de la mémoire
demande de créer une technique de microscopie optique
résolue en 3D et en temps réel dans les expériences in-vivo.
J.Mertz & all, 2008
Illumination
Uniforme
Filtre
passe
haut
Image « Hi »
Image haute résolution
Image « HiLo »
Image sectionnée
résolue optiquement
La microscopie HiLo est une combinaison de
l’illumination structurée (cad non uniforme) avec une
illumination uniforme standard (grand champs)
L’illumination structurée donne des informations basse
résolution sur l’échantillon grâce au sectionnement
optique basse fréquence.
Reconstruction
Difficultées
Faire des expériences in-vivo requiert une grande rapidité,
une haute sensibilité et une bonne résolution spatiale.
Comme nous devons étudier des tissus biologiques épais
d’une centaine de microns, nous proposons de développer
un microscope optique grand champ avec des possibilités de
sectionnement, basé sur le concept HiLo et associé à des
techniques de génétiques.
Illumination
Structurée
L’illumination uniforme nous permet d’obtenir les
informations complémentaires haute résolution.
Filtre
passe
bas
L’image HiLo d’une section fine de l’échantillon épais est
obtenue en combinant numériquement les informations
basses et hautes fréquences des deux images prises.
Image « Lo »
Image basse résolution
DLP : une technologie de micro-miroirs pour structurer l’illumination
Description du microscope
Lens
Mirror
Laser 488nm
Changement du motif d’illumination
Image 1
DLP
Lens
Lens
tube
Image 5
Position
« off »
Image 3
Image 6
Image 4
No illumination : Background noise
Image 7
Image 8
Position
« on »
Dichroïque
Un faisceau laser est envoyé à une matrice de micro-miroirs (DLP) qui
est imagée sur le plan arrière de l’objectif et focalisé sur l’échantillon.
La fluorescence résultante est imagée sur la CCD de la caméra. Deux
images sont prises pour chaque illumination : structurée et uniforme.
L’ensemble du matériel est piloté rapidement et synchronisé grâce à un
programme Labview.
Pour changer rapidement l’illumination, nous
utilisons un projecteur DLP (Digital Light
Processing) composé d’une matrice de micromiroirs.
Le DLP est composée de 1024x768 micro-miroirs
(pas = 13 µm). La déflection, positive ou negative,
des miroirs est individuellement contrôlé.
Vitesse maximale = 300 motifs par seconde
Résultats
Expérimentation
Microscopie grand champ
Drosophila Melanogaster
Section 1
+ ΔVpiezo
Section 2
Afin de suivre l’activité de ces
neurones, les KCs sont marqués par
une sonde de l’activité calcique
composée de protéine GFP :
GCaMP3
Reconstruction 3D des Mushroom Bodies
Traitement HiLo
Pas de sectionnement: 1 µm – profondeur: 65 µm
Objectif : air x40 NA = 0,6
Lobe alpha (α, α’)
160 μm
Calice (Ca)
CaM
Prochaine étape
Imagerie 3D rapide de la réponse calcique
des somas des cellules de Kenyon
70 μm
Etc….
Le logiciel peut charger une séquence de plusieurs
motifs dans le DLP ce qui permet d’adapter la fréquence
introduite dans l’échantillon en fonction de la
profondeur.
MB-Gal4;UAS-GCamp3
160 μm
+ ΔVpiezo
Chaque image binée est chargée dans le DLP (motif
uniforme, lignes, grilles,…) pour former le motif
d’illumination.
Mushroom bodies (MBs)
Parce que son système neuronal est
développé sur 400 microns par
dimension, la drosophile est depuis
longtemps utilisée en recherche
neurobiologique.
Nous
nous
intéressons
aux
mécanismes
impliqués dans la mémoire olfactive
au niveau d’un groupe de neurones
appelé « Mushroom bodies » (MBs)
qui constitue le centre neuronal de
la mémoire. Ces neurones sont les
cellules de Kenyon (KCs ).
cpEGFP
Image 2
Section 0
EMCCD
Camera
Sample
Objective
Structuration de l’illumination
Objectif à eau
x60 NA = 1,2