N° d’Ordre .............................../LABIOGENE UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU --------------- LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE (LABIOGENE) SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE (UFR/SVT) Mémoire Présenté Par TRAORE Lassina Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées de l’Université de Ouagadougou SUR LE THEME: Diagnostic moléculaire du Cytomégalovirus, du virus d’Epstein Barr et de l’Herpes virus 6 chez les donneurs de sang à Ouagadougou, Burkina Faso Soutenu le 16 Novembre 2013 devant le jury composé de : Président : Pr Nicolas BARRO, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Dr Djénéba OUERMI, Maître assistant, Université de Ouagadougou Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester. Le master en Biologie Moléculaire et en Génétique Moléculaire Appliquées (BioGeMA) a pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires. Le master BioGeMA est : Un Master à dimension sous-régionale Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie moléculaires Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité. Professeur Jacques SIMPORE Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire UFR/SVT - École Doctorale Sciences et Technologie Université de Ouagadougou – Burkina Faso [Texte] Page i Dédicaces A mon père Bougoungo TRAORE et à ma mère Djenebou TRAORE ; A mes frères et sœurs, Sali, Diakalya, Nassara, Jeanne, Elisabeth et Marie A ma bien aimée Ebenezer OUEDRAOGO A Dramane TRAORE, cousin et ami fidele A tous ceux qui donnent leur sang afin de sauver des vies Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page ii Remerciements Ce travail a été réalisé au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI (CERBA/LABIOGENE) et au Centre Médical Saint Camille (CMSC) en collaboration avec le Centre National de transfusion sanguine (CNTS). Nous exprimons nos profondes gratitudes à l’endroit du : Professeur Jacques SIMPORE, Professeur titulaire de génétique et de biologie moléculaires, Directeur du CERBA/LABIOGENE, Directeur du laboratoire du CMSC, Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin, notre Directeur de mémoire ; nous sommes très marqués de l’honneur que vous nous avez fait pour nous avoir accepté dans vos laboratoires bien équipés, pour nous avoir conseillé et dirigé dans l’élaboration du présent mémoire. Nous avons aussi bénéficié de votre encadrement scientifique et de votre soutien moral, financier et matériel. Veuillez trouver dans ce travail l’expression de notre sincère gratitude et de notre profond respect. Professeur Nicolas BARRO, Vice-président de l’Université de Ouagadougou, pour avoir accepté de présider notre jury. Malgré vos multiples occupations, vous avez accepté de suivre et de juger ce travail. Soyez-en remercié. Dr Djénéba OUERMI, pour avoir accepté de faire partie du jury. Trouvez ici l’expression de toute notre gratitude. Au Professeur Jean-Baptiste NIKIEMA, aux Dr Charlemagne GNOULA et Dr Virginio PIETRA pour la qualité de vos enseignements; Au Docteur Cyrille BISSEYE, pour l’encadrement technique au laboratoire et son aide précieuse dans la réalisation de ce travail, Dr Florencia DJIGMA, Dr Tani SAGNA, pour votre assistance précieuse durant notre formation, au cours de nos manipulations au laboratoire et au cours de la rédaction du présent mémoire. À toute l’équipe du Laboratoire du Centre Médical Saint Camille et du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI. A tous nos enseignants du Master BioGéMA A la Commission de l’UEMOA pour leur soutien financier à travers le PACER 2 A toute l’équipe du CERBA/LABIOGENE et à tout le personnel du laboratoire du Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou; Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page iii Résumé Introduction : Les herpès virus sont très rependus dans le monde entier. La présente étude se porte sur trois herpès virus, notamment EBV, CMV et HHV-6. Ces trois virus évoluent sous le modèle pandémique. Ils sont impliqués dans diverses pathologies comme la mononucléose infectieuse et plusieurs types cancers. Notre étude vise à déterminer les prévalences de CMV, EBV et HHV-6 chez les donneurs de sang de Ouagadougou, diagnostiqués positifs à l’hépatite B. Méthodes : Les donneurs de sang diagnostiqués positifs à l’Hépatite B ont été retenus pour la présente étude, soient 198 donneurs. Après centrifugation du sang, le plasma à été retenu comme produit biologique à analyser. Nous avons utilisé la DNA sorbent pour l’extraction de l’ADN puis la PCR en temps réel qualitative pour le diagnostic simultané de l’infection à EBV, CMV et HHV-6. Pour la PCR, nous avons utilisés le kit CMV/EBV/HHV6 Quant Reel Time PCR en suivant les instructions du fabriquant. L’appareil PCR utilisé était la SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de “Sacace Biotechnologie”. Les résultats obtenus ont été analysés avec les logiciels statistiques tels que SPSS 17.0 et Epi Info 3.5.1. Résultats : Sur les 198 échantillons testés, 18 (9,09%) étaient positifs à au moins un des trois virus, 10 (5,10%) étaient positifs au EBV, 10 (5,10%) positifs au CMV et 12 (6,10%) positifs au HHV-6. En fonction de l’âge, nous avons trouvé que seul ceux qui avaient un âge inferieur ou égal à 30 ans étaient infectés. L’infection à EBV, CMV et HHV-6 chez les femmes représentaient respectivement 8,57%, 8,57% et 11,43%. Par contre chez les hommes, les taux d’infection étaient faibles soient 4,29%, 3,68% et 4,90% respectivement pour EBV, CMV et HHV-6. En fonction du statut VIH nous avons constatés que les séropositifs étaient plus infectés que les séronégatifs, EBV (12,5% versus 4,74), CMV (12,5% versus 4,74), HHV-6 (12,5% versus 5,79). Sept (7) échantillons étaient Co-infectés par EBV/CMV/HHV-6, soit 38,89% des échantillons positifs. Conclusion : Les prévalences que nous avons enregistrées sont faibles par rapport à celles trouvées par les études précédentes menées dans la sous région chez les donneurs de sang. Cette différence peut s’expliquer par le fait que les études antérieures ont utilisé des techniques sérologiques. Mots clés : Burkina Faso, PCR Multiplexe en Temps Réel, CMV, EBV et HHV-6 Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page iv Summary Introduction: The herpes viruses are widespread in the world. This study focuses on three herpes viruses, including EBV, CMV and HHV -6. These three viruses evolve as the pandemic model. They are involved in various diseases such as infectious mononucleosis and several types of cancer. Our study aims to determine the prevalence of CMV, EBV and HHV6 infection in blood donors in Ouagadougou, diagnosed positive for hepatitis B. Methods: 198 Blood donors diagnosed positive for Hepatitis B were selected for the present study. After centrifugation of blood, plasma was chosen as a biological product to be analyzed. We used DNA sorbent for the extraction of DNA and PCR qualitative real-time simultaneous diagnosis of infection with EBV, CMV and HHV -6. For PCR, we used the CMV/EBV/HHV-6 Reel Time PCR kit following the manufacturer's instructions. The PCR product was used SaCycler -96 Real Time PCR V.7.3 of " Sacace Biotechnology " . The results were analyzed with statistical software such as SPSS 17.0 and Epi Info 3.5.1. Results: Among the 198 samples tested , 18 ( 9.09% ) were positive for at least one of the three viruses , 10 ( 5.10% ) were positive for EBV , 10 ( 5.10 %) were positive for CMV and 12 ( 6.10% ) positive for HHV -6. According to age, we found that only those who had a less than or equal to 30 years were infected. EBV, CMV and HHV-6 Infection in women were 8.57%, 8.57% and 11.43% respectively. By against men, infection rates were low are 4.29%, 3.68 % and 4.90 % respectively for EBV, CMV and HHV -6. Depending on the HIV status we found that HIV-positive was more infected than HIV-negative, EBV (12.5 % versus 4.74), CMV (12.5 % versus 4.74), HHV-6 (12.5% versus 5.79). Seven (7) samples were co- infected EBV/CMV/HHV-6 or 38.89 % of positive samples. Conclusion: The prevalence that we recorded is low compared to those found in previous studies in the sub-region in blood donors. This difference can be explained by the fact that previous studies have used serological techniques. Keywords: Burkina Faso, Multiplex Real-Time PCR, CMV, EBV and HHV-6 Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page v Sommaire Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA ................................................................... i Dédicaces ................................................................................................................................... ii Remerciements ........................................................................................................................ iii Résumé ..................................................................................................................................... iv Sommaire ................................................................................................................................. vi Liste des figures ....................................................................................................................... ix Liste des tableaux ..................................................................................................................... x Abréviations............................................................................................................................. xi INTRODUCTION .................................................................................................................. xiii 1. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE .......................................................................................... 1 1.1 LE CYTOMEGALOVIRUS (CMV)................................................................................ 1 1.1.1 HISTORIQUE.......................................................................................................... 1 1.1.2 EPIDEMIOLOGIE .................................................................................................. 1 1.1.3 CLASSIFICATION ................................................................................................. 2 1.1.4 BIOLOGIE DU VIRUS .......................................................................................... 2 1.1.5 STRUCTURE ET GENOME .................................................................................. 3 1.1.6 INFECTION A CMV ET REPONSE IMMUNITAIRE ......................................... 5 1.1.7 PATHOLOGIES DUES A L’INFECTION A CYTOMEGALOVIRUS................ 6 1.1.8 DIAGNOSTIC DE L’INFECTION A CYTOMEGALOVIRUS ............................ 8 1.1.9 PREVENTION ET TRAITEMENT ........................................................................ 8 1.2 LE VIRUS D’EPSTEIN BARR (EBV)....................................................................... 9 Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page vi 1.2.1 HISTORIQUE.......................................................................................................... 9 1.2.2 CLASSIFICATION ............................................................................................... 10 1.2.3 EPIDEMIOLOGIE ................................................................................................ 10 1.2.4 BIOLOGIE DU VIRUS ......................................................................................... 10 1.2.5 GENOME ET STRUCTURE ................................................................................ 12 1.2.6 INFECTION A CMV ET REPONSE IMMUNITAIRE ....................................... 15 1.2.7 PATHOLOGIES DUES AU EBV......................................................................... 16 1.2.8 DIAGNOSTIC ....................................................................................................... 18 1.2.9 PREVENTION ET TRAITEMENT ...................................................................... 21 1.3 HERPES VIRUS HUMAIN-6 (HHV 6) ................................................................... 21 1.3.1 HISTORIQUE........................................................................................................ 21 1.3.2 EPIDEMIOLOGIE ................................................................................................ 21 1.3.3 CLASSIFICATION ............................................................................................... 22 1.3.4 BIOLOGIE DU VIRUS ......................................................................................... 22 1.3.5 STRUCTURE ET GENOME ................................................................................ 23 1.3.6 INFECTION A HHV-6 ET REPONSE IMMUNITAIRE..................................... 24 1.3.7 PATHOLOGIES DUES A L’INFECTION AU HHV-6 ....................................... 24 1.3.9 THERAPIE ET PROPHYLAXIE.......................................................................... 26 2. OBJECTIFS DE L’ETUDE ........................................................................................... 27 2.1 2.2 OBJECTIF GENERAL ............................................................................................. 27 OBJECTIFS SPECIFIQUES ................................................................................. 27 Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page vii 3. PROBLÉMATIQUE : ENONCE DU PROBLEME ET CONTEXTE JUSTIFICATIF DE L’ETUDE............................................................................................. 28 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES .................................................................................... 30 4.1 SITE DE L’ETUDE................................................................................................... 30 4.2 ECHANTILLONS D’ETUDE .................................................................................. 30 4.3 DIAGOSTIC MOLECULAIRE PAR LA REAL TIME PCR DU CMV, D’EBV ET DU HHV-6 ........................................................................................................................... 31 4.3.1 EXTRACTION DE L’ADN (kit d’extraction DNA-Sorb-B) ............................... 31 4.3.2 PROTOCOLE D’AMPLIFICATION DE L’ADN (kit : CMV/EBV/HHV-6 Quant Real-TM)........................................................................................................................... 32 4.3.3 ANALYSE ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS.................................... 34 4.3.4 PERFORMANCE .................................................................................................. 34 5. RESULTATS ET DISCUSSION ................................................................................... 35 5.1 RESULTATS............................................................................................................. 35 5.1.1 CARACTERISTIQUES SOCIODEMOGRAPHIQUES ..................................... 35 5.1.2 PREVALENCE D’EBV, CMV ET HHV-6 .......................................................... 35 5.1.3 INFECTION A L’EBV, CMV, HHV-6 EN FONCTION DE L’AGE, DU SEXE ET DU STATUT VIH ...................................................................................................... 36 5.2 6. DISCUSION .............................................................................................................. 38 CONCLUSION ET PERSPECTIVES .......................................................................... 42 CONCLUSION........................................................................................................................ 42 PERSPECTIVES.................................................................................................................... 43 7. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...................................................................... 44 Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page viii Liste des figures Figure 1 : Arbre phylogénique des Herpesviridae ..................................................................... 2 Figure 2: Image du cytomégalovirus.......................................................................................... 4 Figure 3 : Structure du génome du cytomégalovirus ................................................................. 5 Figure 4 : Model de l’infection à EBV chez l’Homme ............................................................ 12 Figure 5 : Mécanisme d’échappement d’EBV au système immunitaire .................................. 15 Figure 6 : Représentation schématique du cycle lytique de HHV-6 ........................................ 23 Figure 7 : Carte du Burkina...................................................................................................... 30 Figure 8 : Extraction de l'ADN au CMSC et au CERBA ........................................................ 32 Figure 9 : Appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de “Sacace Biotechnologie” ............ 33 Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page ix Liste des tableaux Tableau 1: Les antigènes latent d’EBV.................................................................................... 14 Tableau 2 : Maladies associées à l'infection à EBV................................................................. 17 Tableau 3 : Pathologies et profils sérologiques........................................................................ 19 Tableau 4 : Techniques utilisées en routine pour le diagnostic d’EBV ................................... 20 Tableau 5 : Programme d'amplification ................................................................................... 33 Tableau 6 : Exemple d'analyse qualitative des résultats .......................................................... 34 Tableau 7 : Prévalence d’EBV, CMV et HHV-6 chez les donneurs de sang VHB positif...... 35 Tableau 8 : Infection à CMV, EBV et HHV-6 en fonction de l'âge, du sexe, du statut VIH et du lieu....................................................................................................................................... 37 Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page x Abréviations Ac : Anticorps ADN : Acide désoxyribonucléique Ag : Antigène ARN : Acide ribonucléique CD4 : Classe de Différenciation de type 4 CERBA : Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité CMV : Cytomégalovirus CNTS : Centre National de Transfusion Sanguine. CRTS : Centre Régional de Transfusion Sanguine. DRL : Direct Repeats Left DRR : Direct Repeats Right EBER : EBV-Encoded RNA EBNA : EBV Nuclear Antigen EBV : Epstein Barr Virus ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Gp : Glycoprotéines. HHV : Human Herpes Virus HSV : Human Simplex Virus LaBioGene : Laboratoire de biologie et de génétique Moléculaire LB : Lymphome de Burkitt LH : Lymphome de Hodgkin LM : Lymphomes malins LMNH : Lymphomes malins non Hodgkinien LMP : Latent Membrane Protein MCP-1 : Monocyte Chemoattractant Protein 1 MIP1 : Macrophage Inflammatory Protein 1 MNI : Mononucléose infectieuse NK : Naturel Killer ORF : Open Reading Frame Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page xi PNN : Polynucléaire Neutrophile RANTES : Regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted SNC : Système Nerveux Centrale SNP : Système Nerveux Périphérique TRAF : Tumornecrosis Receptor-Associated Factors UL : Unique Longue US : Unique Short VCA : Virus Capsid Antigen VIH : Virus de l’Immunodéficience Humain VZV : Virus de la Varicelle et du Zona Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page xii INTRODUCTION Les herpes virus font parti des virus les plus répandus dans le monde. Ils sont responsables de diverses maladies chez les humains et les animaux. Chez l’Homme, huit types d’herpes virus (human herpesvirus : HHV-1, …HHV-8) sont responsables de pathologie. Dans cette étude nous nous intéresseront à l’herpès virus 4 ou Epstein Barr Virus (EBV), à l’herpès virus 5 ou Cytomégalovirus (CMV) et à l’herpès virus 6 (HHV-6). L’EBV, le CMV et le HHV-6 évoluent tous sur le mode pandémique. Ces virus sont responsables principalement de la mononucléose infectieuse (EBV et CMV) et de l'exanthème subit ou roséole (HHV-6). Ils sont également impliqués dans de nombreux cancers tels que le cancer de Burkit, le cancer du naso-pharynx, le cancer du colon, du cerveau… (Macsween et al., 2003 ; Gandhi et Khanna, 2004 ; Boeckh et al., 2011). L’EBV, le CMV et le HHV-6 vivent surtout en latence dans les organismes qu’ils infectent et ne causent des pathologies que dans quelques rares cas. Les maladies graves surviennent surtout lorsque les défenses de l’organisme hôte sont défaillantes. En Afrique de l’Ouest et surtout au Burkina Faso, il existe très peu d’études effectuées sur ces trois types de virus. Or les prévalences des pathologies dont ils sont en causent croient. L’étude de Zongo et al., au Burkina Faso (Zongo et al., 2010), avait enregistré 120 cas de lymphomes malins (LM) dont 11 maladies de Hodgkin et 109 lymphomes malins non hodgkiniens (LMNH). Les Lymphomes de Burkit (LB) représentaient 33,33 % des LM et 36,69 % des LMNH (avec une moyenne de 4 LB par an). La même étude a également montré que 52,5 % des cas de LB étaient enregistrés les deux dernières années (c'est-à-dire en 2003 et en 2004). Zongo et al., ont ainsi montrés que le nombre de cas par an augmentait régulièrement (un cas en 1995 contre 11 cas en 2004). En plus, selon l’OMS les pays de l ’Afrique subsaharienne enregistreront plus d’un million de nouveaux cas de cancer d’ici à 2020 (Dangou et al., 2009). Ces chiffres montrent l’importance et la nécessité de mener des recherches sur les virus responsables de ces pathologies. C’est dans ce cadre que nous avons entrepris cette étude visant à faire le point sur la prévalence d’EBV, CMV et HHV-6 chez les donneurs de sang positifs à l’hépatite B. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page xiii 1. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 1.1 LE CYTOMEGALOVIRUS (CMV) 1.1.1 HISTORIQUE La maladie des inclusions cytomégaliques est connue depuis 1904 et en 1956 le virus responsable a été isolé sur culture de cellules fibroblastiques humaines, le cytomégalovirus humain, plus couramment désigné par le sigle CMV (Birdsond, 1956 ; Takos, 1956). 1.1.2 EPIDEMIOLOGIE Réservoir et mode de transmission. Le réservoir du CMV est strictement humain. On le retrouve principalement dans le sang, les urines, les sécrétions des voies aériennes supérieures, les sécrétions génitales, la salive, le lait (Kurath et al ; 2010) et le Liquide lacrymal. Le virus est transmis par la salive, par les rapports sexuels, de la mère à l’enfant à travers le placenta ou pendant l’allaitement, par la transplantation d’organe solide ou de cellule souche hématopoïétique et la transfusion (Gandhi et Khanna, 2004) Répartition dans le monde. L’infection à CMV évolue sur le mode pandémique. Dans le monde 50 à 80 % des adultes de 40 ans portent des anticorps anti-CMV. Dans les pays développés la séroprévalence du CMV est compris entre 30 et 70%. Par contre dans les pays sous-développés, elle excède les 90% (Gandhi et Khanna, 2004). L’étude menée au Ghana par Adjei et al en 2008 a montré que la prévalence du CMV était de 59,2% chez les donneurs de sang VIH+ et de 77,6% chez les donneurs VIH-. Au Burkina Faso selon l’étude de Ouedraogo et al en 2012 la séroprévalence des anticorps anti-CMV de la classe des IgG était de 92,2 % chez les donneur de sang. Chez les femmes séronégatives, le risque d’une primo infection est de 0,6 à 1,4 % avec un risque d’infection congénitale de 40% (Gandhi et Khanna, 2004). Ce risque augmente, lorsque l’infection de la mère a lieu pendant le premier trimestre de la grossesse. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 1 1.1.3 CLASSIFICATION Le cytomégalovirus est classé dans la famille des herpesviridae humains (figure 1). Cette famille comprend huit virus : les herpes simplex de types 1 et 2 (HSV1 et HSV2), le virus de la varicelle et du zona (VZV), le cytomégalovirus (CMV), le virus d’Epstein-Barr (EBV) et les herpes virus lymphotropes (HHV6, HHV7 et HHV8 associé au sarcome de Kaposi). Les herpesviridaes sont répartis en trois sous-familles selon leurs propriétés biologiques, α (HSV1, HSV2 et VZV), β (CMV, HHV6 et HHV7) et γ (EBV et HHV8). Dans la sous famille des betaherpesvirinae, le cytomégalovirus humain est classé dans le genre cytomégalovirus. Figure 1 : Arbre phylogénique des Herpesviridae (Source : Moore et al., 1996) 1.1.4 BIOLOGIE DU VIRUS L'acquisition du virus est suivie d'une phase de dissémination sanguine transitoire ou virémie, qui permet au virus d’atteindre ses organes cibles (moelle osseuse, glandes salivaires, poumons, reins, foie, tube digestif, le système nerveux central, le système nerveux périphérique, œil). Les cellules cibles du cytomégalovirus sont les monocytes - macrophages (réplication virale : présence d’ARNm virale précoces et tardif), les polynucléaires neutrophiles, les cellules endothéliales (cellules endothéliales infectées dans le flux sanguin), les cellules épithéliales (cellules épithéliales pulmonaires et rénales), les cellules nerveuses Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 2 (cellules de Schwann, neurones des ganglions optiques). La dissémination du virus suit celle des monocytes et des macrophages infectés. Après une primo-infection, le virus persiste à l’état latent dans les cellules souches de la moelle osseuse, dans les cellules endothéliales des vaisseaux et dans les monocytes du sang périphérique. Des infections secondaires, réinfections par une souche exogène, ou réactivations du virus endogène, favorisées par une immunodépression, une stimulation immunitaire allogénique, sont possibles. Au cours des réactivations, survenant chez des sujets séropositifs le virus excrété au niveau du pharynx et des urines constitue une source potentielle d'infection. Les mécanismes moléculaires de maintien de la latence sont encore mal connus. 1.1.5 STRUCTURE ET GENOME Le cytomégalovirus (figure 2) est le plus gros des herpes virus connu avec un diamètre de 105 nm. Il comporte trois (3) enveloppes, dont : - la capside : comporte 162 capsomères dont les protéines mineures et majeures de capsides ainsi que les protéines d’ancrage de l’ADN viral - le tégument : fait de plus de 20 phosphoprotéines dont la pp65 et la pp150 fortement immunogènes - un double feuillet lipidique externe : dérivant de la membrane nucléaire de la cellule hôte comportant les glycoprotéines virales de surface que sont les glycoprotéines gB et gH. Il existe également 2 glycoprotéines réceptrices des chemiokines (facteur chimioattractants) et une glycoprotéine réceptrice du fragment Fc des immunoglobulines qui favorisent l’entrée du VIH dans les cellules infectées par le CMV. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 3 Figure 2: Image du cytomégalovirus (Source : Gandhi and Khanna, 2004) Ces enveloppes entourent un génome de 230Kb représenté par un ADN double brin linéaire, codant environ 200 protéines dont 35 de structure. Il possède 2 sous-unités, dont une longue (unique long ou UL) et une courte (unique short ou US) encadrées par des séquences répétitives (figure 3). Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 4 Figure 3 : Structure du génome du cytomégalovirus (Source : Boeckh et all, 2011) 1.1.6 INFECTION A CMV ET REPONSE IMMUNITAIRE Les NK jouent un rôle important dans le contrôle expérimental de l’infection à CMV chez la souris. En absence des NK, l’infection à CMV est létale chez la souri. Les résultats de la recherche suggèrent que cette résistance mediée par les NK serait due à l’activation de leur récepteurs Lys-49H (Gandhi et Khanna, 2004). Des études ont également montré qu’une déficience en NK, chez les patients entraine une infection récurrente aux herpes virus, induisant ainsi une infection à CMV associée aux pneumonies. La primo infection à CMV induit une production d’IgM spécifiques après 4 à 6 semaines d’infection qui perdure 16 à 20 semaines. Des anticorps neutralisant sont produits contre la gpB. Les protéines de surface comme les pp150, pp28 et pp65 évoquent une réponse humorale durale (Akhter et al., 2011). Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 5 Le Cytomégalovirus s’échappement parfois au système immunitaire en passant de cellules en cellules. La fixation de la microglobuline B2 sur l’enveloppe virale masque les sites antigéniques. Le virus utilise aussi le mimétisme moléculaire pour échapper à la lyse par les cellules NK par expression du gène UL18 qui code pour un homologue des molécules du CMH de classe I (Farrell et al., 1997). En plus la séquestration des chimiokines dans l’environnement cellulaire par expression d’homologues viraux des récepteurs de ces chimiokines (RANTES, MCP-1, MIP1…) est utilisée également par le virus pour échapper au système immunitaire. L’infection à cytomégalovirus peut aussi inhiber l’expression des molécules du CMH de classe I et II limitant ainsi la lyse des cellules infectées par les lymphocytes T cytotoxiques. Elle est aussi souvent responsable de la dégradation des molécules CMH par rétrogradation dans le cytosol ou du maintien des molécules CMH néoformées dans ergastoplasme (Warren et al., 1994 ; Miller et al., 1998). 1.1.7 - PATHOLOGIES DUES A L’INFECTION A CYTOMEGALOVIRUS L’infection à CMV chez le sujet immunocompétent Chez les immunocompétents, l’infection à CMV est généralement inapparente, dans 90% des cas. La principale manifestation clinique de l’infection à CMV chez les immunocompétents est le syndrome mononucléosique, décrit depuis 1965 chez les adultes (Akhter et al., 2011). Ce syndrome est associé à une fièvre prolongée (3 semaines), des céphalées, des myalgies, apparaissant après une incubation longue (30 jours), observés essentiellement au cours des primo-infections. Une fois infecté, le sujet reste porteur du virus à l’état latent. Dans quelques rares cas, chez le sujet immunocompétent, les infections graves peuvent survenir, entrainant des ulcérations coliques, des gastro-œsophagiennes et des méningo-encéphalites ; des myocardites et parfois le syndrome de Guillain-Barré dans 5-10% de cas (Gandhi et Khanna, 2004). La pneumopathie interstitielle à CMV peut survenir de manière isolée ou accompagner les atteintes précédentes. - Infection à CMV chez les sujets immunodéprimés L’infection materno-fœtale et périnatale L’infection à CMV est la plus fréquente des infections congénitales, faisant plus de 40000 cas par ans, chaque année aux Etats Unis. Chez les femmes séronégatives le risque d’une primoinfection pendant la grossesse est de 0,7 à 4,1% avec un risque d’infection congénitale de 40% (Stagno et al., 1986). Des études récentes montrent que 13% des enfants présentent des Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 6 symptômes à la naissance et que dans 0.5% de cas l’infection est fatale (Dollard et al., 2007). Les maladies associées à l’infection congénitales à CMV sont difficiles à identifier et ne sont pas fréquemment reconnues. Les résultats de la recherche indiquent que 10 à 17% des enfants à infection asymptomatique présente dans le futur des séquelles auditives et neurologiques. En plus, 5 à 10% des infectées nouveau-nés présente des symptômes irréversibles du SNC tel que des micro-céphalées, des encéphalites, de la surdité, des retard psycho- moteurs et rarement des myopathies (Boppana et al., 1992). Ces nouveau-nés présentent d’autres signes cliniques tels que les retards intra-utérins, de la jaunisse, des hepathosplénomégalies, des trombocytopenies, des pétéchies et des hépatites. L’infection à CMV chez les transplantées d’organes solides Les signes typiques d’une infection à CMV sont observés après transplantation d’organes solides chez un patient, ou après usage des médicaments immunosuppressifs visant à empêcher le rejet de l’organe transplanté. Malgré l’amélioration des traitements et de la surveillance, l’infection à CMV reste une grande cause de morbidité chez les transplantés d’organes solides (Kim et al., 2000). Le risque de développer une maladie due à l’infection s’accroit lorsque le receveur d’organe est séronégatif et le donneur séropositif. Ce risque élevé est due à l’absence d’une réponse immunitaire humorale spécifique au CMV. Des études histologiques montrent que les maladies dues au CMV qui surviennent après une transplantation d’organe sont en générale une inflammation de l’organe transplanté ; par exemple une hépatite après transplantation de foi, ou une pancréatite après transplantation de pancréas (Tolkoff-Rubin et al., 1994). Les résultats de la recherche montrent également que le CMV est responsable des rejets d’organe (Evans et al., 2000). l’infection à CMV chez les transplantées de cellules souches hématopoïétiques Deux options sont utilisées pour réduire la transmission du CMV lors de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques, l’utilisation de produit sanguin séronégatif ou deleucocyté. L’infection à CMV chez les transplantés de cellules souches hématopoïétiques est généralement due à une réactivation. La principale manifestation de l’infection à CMV après transplantation de cellules souches hématopöétiques est la pneumonie avec 60 à 80% de morbidité sans traitement au ganciclovir et 50% si traitement antiviral chemothérapeutique plus des hyperimmunoglobuline anti CMV. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 7 l’infection à CMV chez les personnes vivant avec le VIH (pv-VIH) La rétinite est la principale manifestation clinique de l’infection à CMV chez les PV-VIH. Mais l’utilisation de la thérapie HAART a contribué à la réduction des rétinites à 25%, chez les PV- VIH (Jacobson et al., 1997). L’infection à CMV peut également exercer d’autres effet indirects accélérant l’état du patient vers le stade SIDA et la mort. L’utilisation de la trithérapie HAART réduit considérablement les maladies dues à l’infection au CMV chez les pv-VIH (O’Sullivan et al., 1999). 1.1.8 DIAGNOSTIC DE L’INFECTION A CYTOMEGALOVIRUS Diverses techniques sont utilisées pour diagnostiquer l’infection à CMV. Ces techniques se basent sur la recherche des signes cliniques, du virus, de ses Antigènes, de son ADN ou de son ARN. - Examen clinique : elle se base sur les signes d’une infection à CMV associé à la détection du virus. - Microscopie électronique: cette technique est peu utilisée car elle est très limitée - la culture virale : c’est une technique très spécifique mais longue (exige au moins 21 jours). L’isolement du virus est réalisé à partir des liquides biologiques tels que la salive, l’urine, le sang, le liquide amniotique… Cette technique n’est pas utilisée en routine, mais elle est utilisée lors de la recherche de résistance aux antiviraux. - Recherche des Antigènes viraux : c’est une technique couramment utilisée, car fiable, sensible et rapide. Elle consiste à rechercher les Ag pp65 dans les polynucléaires circulants par une méthode d’immunofluorescence sur lame. - La PCR : elle reste la technique de choix dans le diagnostic des pathologies et dans la recherche. 1.1.9 PREVENTION ET TRAITEMENT A l’heure actuelle de nos connaissances, il n’existe pas de vaccin contre le CMV. La prévention repose essentiellement sur le respect des règles d’hygiène. En transfusion sanguine la transmission peut être évitée en utilisant soit du sang déleucocyté soit du sang CMV négatif. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 8 Les molécules utilisées pour le traitement préventif et curatif de l’infection à CMV sont essentiellement la Ganciclovir, la Valganciclovir, la Foscarnet, la Cidofovir et la Valaciclovir. L’Aciclovir et la valaciclovir sont des inhibiteurs de la thymidine kinase. La Ganciclovir, un analogue nucléotidique mono phosphate, est un inhibiteur compétitif du DNA polymérase UL54. Une mutation du gène UL54 (gène de l’ADN polymérase) entraine une résistance du CMV à la Gancyclovir, à la Valacyclovir et à la cidofovir. La mutation du gène UL97 (gène de la protéine kinase) entraine une résistance à la Gancyclovir et à la Valacyclovir (Hakki et al., 2011). Si l’utilisation des gammaglobulines reste controversée, les traitements prophylactiques par la Ganciclovir oral ou par le Valaciclovir, prodrogue de l’Aciclovir, contribuent à retarder les premières manifestations de l’infection et diminuent la mortalité associée au CMV après greffe. (Meyers et al., 1988). 1.2 LE VIRUS D’EPSTEIN BARR (EBV) 1.2.1 HISTORIQUE Le virus d’Epstein Barr a co-évolué avec l’espèce humaine, son hôte, pendant des millions d’année. Ceci a permis à ce virus d’adapter son cycle de vie à la vie humaine pour ainsi devenir un de ses parasites effectifs. Vers les années 1950 Denis Burkitt décrit l’existence de lymphome de cellule B chez les enfants Africain d’âge compris entre 2 et 14 ans en zone endémique de paludisme. Le virus en cause a été découvert en 1964 par l’analyse d’une biopsie d’un spécimen de tumeur en microscopie électronique (Epstein et al, 1964), et il fut nommé ainsi en l’honneur de Michael Anthony Epstein et de son étudiante Yvonne Barr. En 1968, Gertrud et Werner Henle établirent un lien entre la mononucléose infectieuse et le virus d’Epstein Barr. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 9 1.2.2 CLASSIFICATION Le virus d’Epstein-Barr est classé dans la famille des herpesviridae humains (confère 1.1.3). Dans la sous-famille des gamma-herpesvirinae, le virus d’Epstein-Barr est classé dans le genre lymphocryptovirus. Dans le génome de EBV des répétitions internes en tandem, « internal repeat » (IR1) s’intercalent entre deux régions uniques : « unique short » (US) et « unique long » (UL). Il existe plusieurs sites majeurs de variation dans le génome viral au sein de ces régions uniques. Ces variations ont permis de classer les souches virales en deux types, 1 et 2 (ou types A et B). 1.2.3 EPIDEMIOLOGIE Réservoir et mode de transmission. Le réservoir du virus Epstein-Barr est strictement humain. Le virus est transmis par la salive, les rapports sexuels, la transplantation d’organe solide, la transfusion sanguine, de la mère a l’enfant. (Macsween et Crawford ; 2003). Répartition dans le monde. Le virus de Epstein-Barr fait partie des virus humains les plus communs et est retrouvé partout dans le monde. Plus de 90% des adultes dans le monde sont infectés par ce virus (Macsween et Crawford ; 2003). Aux États-Unis, 95 % des adultes entre 35 et 40 ans sont infectés. Le virus Epstein-Barr est plus fréquemment acquis pendant l’enfance dans les pays sous-développés (plus de 90 % des enfants d’âge préscolaire). Dans les pays développés, beaucoup de personnes ne sont pas infectées lors de l’enfance, mais le sont plutôt lors de l’adolescence ou durant la vie adulte. Cependant, leur prédominance diffère selon la région du monde où ils sont retrouvés. L’étude menée au Ghana par Adjei et al en 2008 a montré que la prévalence d’EBV était de 20% chez les donneurs de sang VIH- et de 87% chez les donneurs VIH+, malade du SIDA. 1.2.4 BIOLOGIE DU VIRUS EBV infecte les surfaces des muqueuses et maintient son cycle vital dans les cellules épithéliales, pour lesquelles il a un bon tropisme. Dans les cellules épithéliales il se multiplie, causant ainsi plusieurs maladies tumorales. Le virus peut infecter directement les lymphocytes B, ou infecter d’abord les cellules épithéliales, se multiplié et infecté par la suite les lymphocytes B (Figure 4). Sa pénétration dans les lymphocytes B se fait grâce à la Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 10 glycoprotéine gp 350/220 sur le virus et la protéine de surface CD21 du lymphocyte permettant ainsi l’attachement du virus à la cellule (Tanner et al, 1987). D’autres glycoprotéines virales, gp 25, gp 85 et gp 42 forment un complexe nécessaire à la pénétration du virus dans la cellule. La protéine gp 42 se lie aux molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de type II (CMHII) et est nécessaire à la fusion du virus avec la membrane cellulaire du lymphocyte (Mullen et al., 2002). Durant la primo infection, les cellules B infectées entrent en cycle lytique, produisent des virions et expriment les protéines virale de latence. Certaines cellules B initialement infectées sont maintenues en quiescence par l’effet des NK et des cellules T cytotoxiques. Après convalescence, EBV est présent dans le sang périphérique en latence dans les cellules B mémoire. Une réactivation du virus peut survenir avec expression d’autre protéine virale de latence, entrainant leur reconnaissance et leur destruction par les cellules T cytotoxiques. Par contre certaines cellules infectées entrent en cycle lytique dans l’oropharynx entrainant une production de virions et de leurs disséminations dans la salive ainsi que l’infection d’autres cellules épithéliales (figures 4). Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 11 Figure 4 : Model de l’infection à EBV chez l’Homme (Source : Cohen ; 2000) 1.2.5 GENOME ET STRUCTURE Le virus d’Epstein Barr est un virus enveloppé. L’enveloppe dérive de la membrane cellulaire et contient un nombre de glycoprotéine virale variable d’un virus à l’autre. A sa surface le virus présente les glycoprotéines d’enveloppe comme les gp350/220, les gp85/25 et la gp42 nécessaire à l’infection. Il est constitué d’une capside icosaédrique d’environ 100 nm de diamètre qui comprend 162 capsomères et d’un core qui contient le génome du virus. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 12 Le génome du virus Epstein Barr est un ADN linéaire double brin de 172 Kpb. Il code approximativement 100 gènes dont 10 exprimés lors de la phase de latence du virus. Les gènes du virus d’Epstein exprimés durant la latence sont (tableau 1) : EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3 EBNA-LP, LMP-1, LMP-2, EBER-1 et EBER-2 (Mascween et Crawford, 2003). Ainsi : EBNA-1 assure le maintien du génome viral et coordonne la réplication de l’épisome lors de la division cellulaire. EBNA-2 est essentiel à l’expression des protéines EBNA-1 et EBNA-3 et au processus d’immortalisation des lymphocytes B. Il transactive l’expression du marqueur d’activation CD23 du lymphocyte B et régule positivement l’expression du récepteur CD21 du virus, c-fgr et les gènes de latence LMP-1 et LMP-2. EBNA-3 est très polymorphique et diffère selon le type de virus. Il est constitué d’une famille de 3 gènes (EBNA-3A, EBNA-3B et EBNA-3C) de haut poids moléculaire localisée en tandem sur le génome du virus Epstein-Barr. EBNA-LP est un ensemble de protéines extrêmement polymorphiques. Cependant la fonction d’EBNA-LP demeure floue, elle pourrait jouer un rôle dans le traitement de l'ARN ou être associée avec certaines protéines de régulation nucléaire. LMP-1 est exprimé en absence d’EBNA-2 pendant l’activation du cycle lytique des lymphocytes B. Cette protéine protège les lymphocytes B infectés de l’apoptose en partie par l’activation de l’oncogène bcl-2. De plus, l’action de transformation de LMP-1 semble impliquer les protéines de signalisation de TRAF (tumornecrosis factor receptor-associated factors) LMP-2 est une protéine de membrane contenant 12 domaines transmembranaires hydrophobiques qui est colocalisée avec LMP-1 dans la membrane plasmique des lymphocytes infectés. EBER-1 et EBER-2 sont les ARN du virus d’Epstein-Barr les plus abondants durant la latence des cellules B infectées. Ces petits ARN sont codés sous forme non polyadénylé. La majorité des EBER est localisé dans le noyau où ils sont complexés avec la protéine. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 13 Tableau 1: Les antigènes latent d’EBV (Adapté de Mascween et Crawford 2003) Antigène d’EBV Requis pour Exprimé in vivo dans l’immortalisation MSP MI LB CNP LH MLPB CLT CG EBNA1 + ? + + + + + + + EBNA2 + - + - - - + - - EBNA3A + - + - - - + - - EBNA3B - - + - - - + - - EBNA3C + - + - - - + - - EBNA/LP +/- - + - - - + - - LMP1 + - + - + + + + ? LMP2 - + + - + + + + + MSP : Mononucléaire du Sang Périphérique, MI : mononucléose Infectieuse, LB : Lymphome de Burkit, CNP : Carcinome du Naso-Pharynx, LH : Lymphome de Hodgkin, MLPB : Maladies Lympho-prolifératives des cellules B, CLT : Cellule Lymphocyte T, CG : Carcinome Gastrique, (+) : exprimé ou requis, (-) : non exprimé ou non requis, ( ?) : non connue Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 14 1.2.6 INFECTION A CMV ET REPONSE IMMUNITAIRE L’infection à CMV induit une réponse immunitaire humorale et cellulaire. Bien que les Anticorps dirigés contre les protéines de structures et les EBNA soient importants pour le diagnostic, la réponse cellulaire est plus importante pour le contrôle de l’infection à EBV. Pendant la primo infection, les NK et les lymphocytes T CD4+ et CD8+ contrôlent la prolifération des lymphocytes B infectés (Rickinson et al., 1997) pendant la mononucléose infectieuse, 40% des CD8+ sont dirigées contre les protéines de réplication virale et 2% contre les protéines virales de latence (Callan et al., 1998). La plupart des cellules T cytotoxiques dirigées contre les protéines de latences ont pour cible la protéine EBNA-3. La capacité qu’a EBV à persister malgré l’action du système immunitaire montre que le virus a pu développer des mécanismes d’échappement à celui-ci. Ainsi, la protéine BCRF1 du virus partage 70% de ses aminoacides avec l’interleukine 10 (Moore et al., 1990) et mime l’activité de celle-ci en inhibant la synthèse in vitro de l’interféron-γ par les mononucléaires humains du sang périphérique (Hsu et al., 1990). La protéine BARF1 d’EBV quant à elle stimule la production d’interféron-α qui bloque l’action des cytokines (figure 5). Les protéines BCRF1 et BARF1 aideraient ainsi le virus à s’échapper au système immunitaire de l’hôte durant l’infection à EBV ou une réactivation dans les cellules infectées latentes. La protéine EBNA-1 est capable de bloquer sa propre dégradation par les protéasomes dans la cellule. Cela empêche leur présentation au lymphocyte T cytotoxique ainsi que l’activation de ces derniers. EBV code également des protéines qui inhibent l’apoptose, tels que BHFR1 et LMP-1, homologues des protéines humaines Bcl-2 (figure 5) (Henderson et al., 1991). Figure 5 : Mécanisme d’échappement d’EBV au système immunitaire (Source : COHEN, 2000) Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 15 1.2.7 PATHOLOGIES DUES AU EBV L’infection à EBV est présente à l’état latent de manière endémique dans toutes les populations humaines et associés à une gamme variée de pathologie (tableau 2). Elle est responsable principalement de la mononucléose infectieuse, chez les immunocompétents (Vetsika et al., 2004 ; Wang et al., 2010), généralement sans manifestation apparente. C’est une maladie caractérisée par une prolifération poly clonale de lymphocytes B infectés suivie de l’apparition de grandes cellules T cytotoxiques spécifiques. La mononucléose infectieuse est due principalement à la primo infection à EBV (Godshall et al., 2000). La réactivation d’EBV peut se faire de façon inapparente. Mais, elle est parfois associée aux lymphoproliferation B ou T. Le virus de Epstein Barr est également considéré de nos jours comme étant étiologiquement associé à la forme endémique du lymphome de Burkit (LB) décrit en 1958 par Denis Burkitt, au carcinome du nasopharynx, au lymphome classique de Hodg-Kin’s (LH) (Flavell et Murray, 2000) et au lymphome extra nodal nasal NK/T-cel (Adjei et al., 2008), au carcinome gastrique (Lizasa et al., 2012) et à la leucoplasie orale chevelue (Webster-Cyriaque et al., 2000). De plus il est probable que EBV soit associé au cancer du cerveau, aux tumeurs des glandes salivaires, au carcinome hépatocellulaire (Mascween et Crawford, 2003) L’immunodépression observée notamment chez les transplantés ou chez les patients atteints du SIDA est un facteur de risque dans le développement de lymphoproliférations majoritairement de type B associées à l’EBV. Chez les transplantés d’organe (Holmes and Sokol, 2002) le risque de développement d’une lymphoprolifération est variable selon le tissu greffé, la nature et l’intensité du traitement immunosuppresseur. Le rôle de l’EBV dans leur pathogénie est étayé par le fait que le virus est détecté dans toutes les cellules et dans tous les cas (Timms et al, 2003). La plupart des personnes infectées par le VIH sont infectées par l’EBV, et avec une immunodéficience progressive le nombre de cellules B infectées par l’EBV dans la circulation augmente (van Baarle et al, 2001) et peut développer des lymphomes dit opportunistes (lymphome de Burkitt, les lymphomes diffus à grandes cellules et les lymphomes primitifs cérébraux), tous associés à l’EBV. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 16 Tableau 2 : maladies associées à l'infection à EBV (Adapté de Mascween et Crawford 2003) Maladies Mononucléose Infectieuse Populations à risque Adolescents et jeunes adultes des sociétés de l’ouest à conditions de vie favorable Maladies Lymphoproliférative des cellules B - Transplantés d’organe, - les infectées du V IH Lymphome de Burkitt (LB) - Enfants Africains (LB endémiques) - les infectées du V IH (LB sporadiques) Enfants et jeune adultes des pays développés Maladies de Hodgkin Lymphomes des cellules T/NK - Infection active chronique d’EBV - les infectées du V IH Leucoplasie orale chevelue - les infectées du V IH - autres formes d’immunodéficiences - chinois et race Inuit : haute incidence - Maya, Indonésien, Vietnamien… : faible incidence Carcinome du Nasopharynx Non identifié Carcinome Gastrique Autres : cancer du cerveau, tumeur des glandes salivaires, carcinome hépatocellulaires… - les infectées du V IH - autres formes d’immunodéficiences Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 17 1.2.8 DIAGNOSTIC Selon le type de prélèvement et l’objectif recherché le diagnostic de l’infection à EBV peut se faire soit par culture, ou par des méthodes sérologiques, soit par la PCR ou par Hybridation. Toutefois, il n’existe pas de méthode standardisée et des résultats discordants sont parfois rapportés. Il n’existe pas non plus d’unanimité sur le prélèvement. Par contre, la recherche dans les cellules mononuclées du sang périphérique ou du sang total semble préférable à la recherche dans le plasma (DEHEE et al., 2001). La culture : Les techniques de culture sont longues, fastidieuses et sont réservées à des laboratoires spécialisés. En plus, l’isolement du virus sur culture cellulaire est difficile et aléatoire. Le développement de techniques de détection du génome a permis la mise en évidence fiable et facile du virus. La Sérologie : Autrefois réalisée par la détection d’anticorps hétérophiles de type IgM, appelée MNI-test (test rapide d’agglutination) ou bien par le test de Paul Bunnell-Davidsohn (agglutination plus spécifique de globules rouges de mouton par les mêmes anticorps), la sérologie de l’EBV utilise maintenant des méthodes ELISA. Les tests sérologiques consistent à la mise en évidence des IgG et IgM anti-VCA précoces (antigènes de capside) marqueurs de l’infection récente et à des IgG anti-EBNA plus tardifs (EBV Nuclear Antigen) marqueurs de l’infection latente (figure 6). Figure 6 : Courbe de la cinétique d’apparition des anticorps pendant l’infection à EBV (Source : Gulley et al., 2001) Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 18 L’interprétation des résultats de la sérologie se base sur le tableau suivant (Tableau 3) Tableau 3 : Pathologies et profils sérologiques (Source : Hess et al., 2004) La PCR : actuellement, c’est la technique la plus utilisée et la plus sensible. Elle repose sur l'amplification des séquences génomiques conservées, ou de séquences répétées. Hybridation : La détection du génome EBV peut également être effectuée par hybridation in situ (HIS) qui offre l'avantage de pouvoir identifier le type et le pourcentage de cellules infectées. L’HIS s'effectue soit sur l’ADN génomique, soit sur l’ARN codant les EBERs. Les techniques de quantification moléculaire, destinées à évaluer la “charge virale” dans un tissu ou un liquide biologique, sont en cours d’évaluation. Elles sont effectuées après amplification de séquences nucléotidiques conservées et si possible uniques. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 19 Tableau 4 : Techniques utilisées en routine pour le diagnostic d’EBV (adapté de Hess et al., 2004) Méthodes Analytes, Antigène substrats Commentaire IFA Lignées cellulaire comme les P3HR-1 et les Raji Méthode classique à spécificité élevée Réaction de fixation du complément Lysats des cellules transformées par EBV Faible sensibilité, faible spécificité, non utilisé en généralement EIA, ELISA Lysats des cellules transformées par EBV, protéine recombinantes, peptides synthétiques… Rapide, haute sensibilités, automatisable, Western Blot Lysats des cellules transformées par EBV, protéine recombinantes, peptides synthétiques… Haute spécificité, méthode de confirmation Isolement du virus Lymphocytes de la lignée lymphoblastoïde Utilisé dans des laboratoires spécialisé, méthode longue (4 à 8 semaines) Détection d’acides nucléiques (PCR) Lymphocytes, plasma, sérum, fluide cérébrospinal, tissu Méthode de choix si une méningo-encéphalite associée à l’infection à EBV est soupçonnée, utilisé pour la détection de la charge virale ou en cas de réactivation Hybridation in situ, PCR in situ Tissus tumoraux Utilisé pour détecter des tumeurs associées à EBV Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 20 1.2.9 PREVENTION ET TRAITEMENT A l’heure actuelle aucun vaccin n’est disponible contre l’infection à EBV. La prévention se fait par le respect strict des règles d’hygiène. Chez les donneurs de sang l’idéale serait d’utilisé du sang séronégatif mais vue la prévalence du virus (90% environ) cela s’avère très difficile. Pour pallier cela on utilise du sang deleucocyté. Pour la prophylaxie, les antiviraux tels que l’acyclovir, la valacyclovir, la ganciclovir et la valganciclovir sont utilisés en routine après transplantation d’organe pour prévenir les infections aux herpes virus. 1.3 HERPES VIRUS HUMAIN-6 (HHV 6) 1.3.1 HISTORIQUE Le HHV6 est plus proche du CMV et a été découvert par Salahuddin et Coworkers en 1986 (Salahuddin et al, 1986). Il a été isolé chez des patients immunodéprimés (SIDA, lymphome et leucémie) à partir de cellules mononuclées du sang périphérique et appelé Human B-lymphotrope virus, par Salahuddin. Initialement appelé HBLV (Josephs et al., 1986) puis HHV-6 lorsque son appartenance aux Herpesviridae fut mis en évidence (Ablashi et al., 1987). Des études cliniques et moléculaires ainsi que le séquençage du génome viral montre qu’il existe deux sous types de HHV6 : HHV6-A et HHV6-B (Dominguez et al., 1999). En 1988, Yamanishi et al établirent que la primo infection au HHV6-B est étiologiquement associée à l’exanthème ou roséole infantile. 1.3.2 - EPIDEMIOLOGIE Répartition : Très largement répandu dans le monde, le pic de primo-infection est entre 6 mois et 4 ans. 90% des enfants ont des anticorps anti-HHV6 avant la fin de leur 2ème année (surtout pour les enfants en collectivité). On estime la population portant le HHV-6 de façon intermittente dans la salive entre 80 et 90% (Di Luca et al., 1995). Le taux de séropositivité diminue au cours de l’enfance et de l’adolescence pour remonter au cours de la vie adulte (à environ 90% de séropositivité) - Mode de transmission : La transmission maternéofœtale en cours de grossesse et au moment de l’accouchement est rare mais possible. L’allaitement ne paraît pas être un facteur de contamination. Par contre, le virus est essentiellement transmis par la salive, les sécrétions respiratoires, le don de sang, de tissus ou d’organes. HHV6 est également une infection sexuellement transmissible. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 21 1.3.3 CLASSIFICATION L’Herpes virus 6 est classé dans la famille des herpesviridae humains comme le CMV et l’EBV (confer 1.1.3). C’est un beta-herpès virus constitué de deux variant majeur, A et B (HHV-6A et HHV-6B). 1.3.4 BIOLOGIE DU VIRUS L’herpès virus 6 infecte principalement les lymphocytes T CD4+ (Lusso et al., 1988, Takahashi et al., 1989), les lymphocytes T CD8+, les cellules NK (Natural Killers), les monocytes/macrophages, les cellules endothéliales tubulaires rénales, les cellules endothéliales des vaisseaux, les astrocytes, les hépatocytes, les oligodendrocytes, les cellules épithéliales (notamment des glandes salivaires) (Hall et al., 1990). Le HHV-6 entre dans la cellule par interaction avec les récepteurs CD46, présents sur la membrane de toutes les cellules nucléées (Santoro et al., 2003) (figure 7). Il a été démontré que le ligand de HHV-6A qui interagit avec le récepteur CD46 de la cellule est le complexe gH-gL-gQ (glycoprotéines H, L, et Q codé respectivement par les gènes U48, U82 et U100) (Mori et al., 2004). Pour le HHV-6B les mécanismes de pénétration du virus dans la cellule ne sont pas jusque-là bien définis (Takatsuka et al., 2003). Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 22 Figure 6 : Représentation schématique du cycle lytique de HHV-6 (Source : De Bolle et al., 2005) 1.3.5 STRUCTURE ET GENOME HHV-6 a un diamètre d’environ 200 nm et est composé de quatre éléments structuraux majeurs (Josephs et al., 1988 ; De Bolle et al,2005) : - un noyau, d’environ 60 nm de diamètre, contenant le génome viral composé d’ADN bicaténaire linéaire de 160 et de 162 kb respectivement pour le type A et B. - une nucléocapside à symétrie icosaédrique contenant 162 capsomères, et de taille comprise entre 90 et 110 nm, Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 23 - un tégument protéique, correspondant à l’espace situé entre la nucléocapside et l’enveloppe, d’épaisseur comprise entre 20 et 40 nm. Il est constitué de phosphoprotéines et d’enzymes nécessaires au métabolisme nucléotidique et à la réplication de l’ADN, - une enveloppe, dérivant des membranes cellulaires, composée d’une bicouche lipidique dans laquelle sont enchâssés de nombreux spicules de glycoprotéines virales. Les génomes de la souche U1102 de l’HHV-6A et des souches Z29 et HST de l’HHV-6B ont été entièrement séquencés (Dominguez et al., 1999). Elle consiste en une région unique (U1 à U100) de 143kb (variant A) à 145 kb (variant B), flanquée de régions terminales répétées et orientées dans le même sens, nommées DRL et DRR pour Direct Repeats Left et Direct Repeats Right Le génome de l’HHV-6B contient 97 gènes codant 119 cadres ouverts de lecture (ou ORFs : Open Reading Frame) dont 9 sont absents dans le génome de l’HHV-6A. Ces 9 ORFs sont annotés B1 à B9. Par ailleurs 9 autres ORFs de l’HHV-6A n’ont pas de correspondance chez l’HHV-6B, à cause de mutations dans le cadre de lecture (Dominguez et al., 1999). 1.3.6 INFECTION A HHV-6 ET REPONSE IMMUNITAIRE La primo-infection à HHV-6 chez les enfants induit une production d’Anticorps, détectable après trois à sept jours d’infection (Dockrell et al., 2003). La production d’IgM atteint son pic la deuxième semaine et reste détectable jusqu'à deux mois. Par contre les IgG augmentent deux semaines après deux semaines d’infection et reste détectable toute la vie chez plus de 90% des adultes (Yamanishi et al., 1988; Dockrell et al., 2003). La réponse immunitaire cellulaire est assuré par les lymphocytes T et les NK (Yasukawa et al., 1993). L’infection à HHV-6 stimule la production des lymphocytes T CD4 et des NK (Flamand et al., 1996). Les cellules cibles de l’HHV-6 étant les CD4, il arrive à s’échapper parfois à la réaction immunitaire en réduisant leur nombre. 1.3.7 PATHOLOGIES DUES A L’INFECTION AU HHV-6 La primo infection à HHV6 est responsable de l'exanthème subit ou Roséole infantile du jeune enfant appelé également sixième maladie éruptive de l'enfance, une des principales causes de fièvre chez le jeune enfant. Elle se manifeste par une fièvre atteignant rapidement 39 ou 40°C et durant classiquement trois jours des éruptions cutanées, des taches superficielles roses pâles apparaissent sur le tronc et les membres durant environ 24 heures. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 24 L’HHV-6 variant B a été identifié comme l’agent responsable de l’exanthème subit (Yamanishi et al., 1988). Le virus est aussi responsable des véritables méningites des angines sans toux, des adénopathies cervicales et des hépatites, l'œdème des paupières chez 30% des enfants. On observe aussi des papules de la muqueuse du palais. (De Bolle et al., 2005). Chez les sujets immunodéprimés après une greffe de moelle en pédiatrie, HHV6 est associée à des leucémies aigues lymphoblastiques ou non lymphoblastiques et la pneumopathie interstitielle à HHV6 est comparable à celle induite par le CMV. L’infection à HHV6 s’aggrave lorsque le receveur d’organe est séronégatif. Dans ce cas, les pneumopathies, les insuffisances médullaires, les encéphalites, les hépatites fulminantes ou syndrome d’activation macrophagique peuvent être mortels. La réactivation de HHV-6B due aux traitements immunosuppressifs afin d’éviter un éventuel rejet de la greffe, est une source importante de morbidité et de mortalité (Yoshikawa et al., 2003). Selon Lusso et al. l’HHV-6 et le VIH-1 agiraient de concert en infectant et lysant les cellules T CD4+, accentuant ainsi l’immunosuppression et la progression vers le SIDA (Lusso et al., 1989). HHV-6 est également associé à certains cancers comme le lymphome T cutané, le lymphome immunoblastique, la leucémie lymphoïde aigüe (Salahuddin et al., 1986), le lymphome de Hodgkin (Torelli et al., 1991). Récemment HHV-6 a été décrit comme étant associé aux syndromes d’hypersensibilité médicamenteuse ou DRESS (Drug Rash with Eosinophilia and Systemic Symptoms) (Descamps et al., 2001) 1.3.8 DIAGNOSTIC La mise en évidence de l’HHV-6 par culture cellulaire date de sa découverte en 1986 (Salahuddin et al, 1986). Le HHV-6 peut être isolé sur les lymphocytes ou les cellules mononuclées de sang de cordon (Yamanishi et al., 1988). L’infection peut être détectée également dans le sang ou dans différents tissus soit par immunofluorescence, soit par ELISA (Parker et Weber, 1993; Elisabetta Caselli et al., 2002) ou soit par des sondes d'Hybridation In Situ. De nos jours la PCR quantitative est devenue la technique diagnostique de choix, appliquée à tout type de prélèvement (sang, LCR, biopsies) car elle bénéficie de bonnes sensibilité et reproductibilité. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 25 1.3.9 THERAPIE ET PROPHYLAXIE L'infection à HHV-6 est généralement asymptomatique, donc le traitement est rarement nécessaire. En cas de nécessité les principales molécules antivirales utilisées actuellement pour le traitement des infections par l’HHV-6 sont des inhibiteurs de l’ADN polymérase virale, la ganciclovir, la valganciclovir, l’acyclovir, la valacyclovir, la cidofovir et le foscarnet. Ce traitement est indiqué dans les convulsions fébriles et les suspicions d'encéphalite ou en cas d'infection chez le greffé de moelle. Les infections généralisées à HHV6 sont rares mais mortelles avec ou sans traitement d'où l'utilité d'une recherche préventive qui est prise désormais en compte dans les protocoles actuels. Il est donc important de suivre la séroépidémiologie d’HHV6. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 26 2. OBJECTIFS DE L’ETUDE 2.1 OBJECTIF GENERAL Contribuer à améliorer la sécurité transfusionnelle des produits sanguins labiles dans les différents centres régionaux de transfusion sanguine du Burkina Faso. 2.2 OBJECTIFS SPECIFIQUES Diagnostiquer par PCR en Temps Réel le CMV, l’EBV et le HHV-6 chez les donneurs de sang à Ouagadougou. Déterminer les prévalences du CMV, d’EBV et du HHV-6 chez les donneurs de sang positif à l’hépatite B. Evaluer l’impact de la PCR dans le diagnostic du CMV, de l’EBV et du HHV-6. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 27 3. PROBLÉMATIQUE : ENONCE DU PROBLEME ET CONTEXTE JUSTIFICATIF DE L’ETUDE. Au Burkina Faso, en transfusion sanguine, l’examen des poches de sang collecté porte généralement sur le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA), le virus de l’hépatite B (VHB), le virus de l’hépatite C et Treponema pallidum responsable de la syphilis (Ouedraogo et al., 2012). Malgré la présence de plusieurs autres pathogènes fréquemment constatés dans le sang, les germes en cause ne sont pas rechercher en routine. Le cytomégalovirus, le virus d’Epstein Barr et l’Herpes virus 6 font partie de ces germes non recherchés en routine, en transfusion sanguine au Burkina Faso. Or les infections au CMV, EBV et HHV-6 dues à la transfusion sanguine restent une cause significative de mortalité et de morbidité, particulièrement chez les immunodéprimés (Adjei et al., 2008). Ces trois virus sont responsables d'infections passant le plus souvent inaperçues. Mais ils causent des pathologies surtout chez les patients dont les défenses immunitaires ont été affaiblies, tels ceux traités par des immunosuppresseurs, ceux atteints par le VIH, les fœtus et les femmes enceintes. L’EBV, le CMV et le HHV-6 sont aussi responsables de nombreux cancers, notamment le lymphome de Burkit observé de façon endémique chez les enfants Africains (Epstein M. A., 1964), le lymphome du nasopharynx, le lymphome des cellules B et T (Mascween and Crawford 2003 ; Gandhi et al., 2004). Ces types de cancers dits de types non Hodgkinien (néoplasies développées à partir des tissus lymphoïdes ; 5% des nouveau cas de cancer par an) représentent le troisième type de cancer après le cancer du col de l’utérus (12% des nouveau cas de cancer par an) et celui du sein (10% des nouveaux cas de cancer par an) en Afrique subsaharienne et en Algérie (Dangou et al., 2009). Selon l’étude de Zongo et al., en 2010 le lymphome de Burkitt représente 33,33% de l’ensemble des lymphomes malins (LM) et 38,68% des lymphomes malins non Hodgkinien (LMNH). Selon la même étude les LB histologiquement confirmés, connaissaient une croissance régulière de 1995 à 2004 dans la ville de Ouagadougou. EBV et CMV infectent plus de 90% de la population mondiale avec 7% qui manifeste le syndrome de la mononucléose (Wang et al…2010). La prévalence du CMV est de 30 à 70 % dans les pays d’Europe de l'ouest et d’Amérique du nord, et de 80 à 100 % dans les pays en voie de développement. Le virus d’Epstein Barr infecte 80-90 % des adultes dans le monde et 95 % des adultes entre 35 et 40 ans Aux Etats-Unis. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 28 Au regard des pathologies dues aux infections à CMV, EBV et au HHV-6, de la croissance de leur prévalence et du risque très élevé de leur transmission à travers la transfusion sanguine, une sécurisation de la transfusion sanguine via le diagnostic du CMV, du EBV et du HHV-6 s’avère donc nécessaire. En plus il existe peu de données sur la prévalence ces virus au Burkina Faso. Les études déjà menées ont utilisé des techniques sérologiques (Ouédraogo et al., 2012). Le CMV, l’EBV et le HHV-6 ne sont pas non plus recherchés en transfusion sanguine. Ainsi, nous avons jugé qu’il serait nécessaire de mener une étude sur ces trois virus, chez les donneurs de sang. Cette étude nous permettra d’avoir une idée générale sur la prévalence de ces virus chez les donneurs de sang de la villes de Ouagadougou. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 29 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 4.1 SITE DE L’ETUDE Notre étude a été réalisée au Burkina Faso, à Ouagadougou (figure 7) dans le laboratoire de Biologie et de Génétique (LABIOGENE) en collaboration avec le Centre Médicale Saint Camille (CMSC), le Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) et le Centre National de Transfusion Sanguine (CNTS). Figure 7 : Carte du Burkina 4.2 ECHANTILLONS D’ETUDE L’étude a concerné 198 donneurs de sang du centre National de transfusion sanguine diagnostiqués positifs à l’hépatite B. Le critère d’inclusion était le fait que le donneur soit positif à l’hépatite B. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 30 4.3 DIAGOSTIC MOLECULAIRE PAR LA REAL TIME PCR DU CMV, D’EBV ET DU HHV-6 4.3.1 EXTRACTION DE L’ADN (kit d’extraction DNA-Sorb-B) Pour l’extraction de l’ADN, nous avons utilisé le kit d’extraction DNA-Sorb-B de la maison Sacace en suivant le protocole du fabriquant, comme suit (Figure 8): chauffer La solution de lyse et la solution de lavage entre 60 et 65°C pour faire disparaitre les cristaux ; Mettre 300µL de la solution de lyse dans des tubes de polypropylène y compris celui du contrôle négatif de l’extraction (fournit avec le Kit d’amplification) ; Ajouter 100 μl d’échantillon aux tubes appropriés ; Préparer les contrôles comme suit : Ajouter 100 μl de contrôle négatif au tube C_ ; Vortexer les tubes et les incuber à 65°C pendant 5 mn puis centrifuger à 5000g pendant 30 secondes ; Vortexer vigoureusement le sorbent et ajouter 20 μl à chaque tube ; Vortexer 5 à 7 secondes et incuber les tubes à température ambiante pendant 3 mn puis répéter cette étape une fois ; Centrifuger tous les tubes pendants 30 secondes à 1000g et à l’aide de micropipette prélever et jeter le surnageant en changeant de cône par tube ; Ajouter 300 μl de la solution de lavage 1 à chaque tube. Vortexer vigoureusement et centrifuger pendant 30 secondes à 8000g. Prélever et jeter le surnageant de chaque tube en changeant de cône par tube ; Ajouter 500 μl de la solution de lavage 2 à chaque tube. Vortexer vigoureusement et centrifuger pendant 30 secondes à 8000g. Prélever et jeter le surnageant de chaque tube en changeant de cône par tube. Répéter cette étape ; Incuber tous les tubes à 65oC pendant 5 mn, en les gardant ouvert ; Ajouter 50 μl d’éluant au culot, incuber à 65°C pendant 5 mn en vortexant périodiquement ; Centrifuger à 12000g pendant 1mn ; Le surnageant contient de l’ADN. Si l’amplification ne se fait pas immédiatement, l’ADN doit être conservé entre – 20°C et – 80°C ; Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 31 Figure 8 : Extraction de l'ADN au CMSC et au CERBA (Photos Lassina) 4.3.2 PROTOCOLE D’AMPLIFICATION DE L’ADN (kit : CMV/EBV/HHV-6 Quant Real-TM) Pour l’amplification, nous avons utilisé l’appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de “Sacace Biotechnologie”, en suivant également le protocole de PCR en Temps Réel déjà installé par le fabricant (Figure 9) - Préparation du PCR Mix : la composition du Master Mix utilisé pour l’amplification était : 10 µl du PCR Mix 1 5 µl du PCR Mix 2 0,5 µl de la Taq polymérase Ces volumes étaient multipliés par le nombre d’échantillons à tester en prenant en compte deux standards, un contrôle positif et un control négatif. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 32 - Mélange réactionnel : Après la préparation du PCR Mix, 15 µl de celui-ci était ajouté à 10 µl d’ADN extrait pour l’amplification (soit un volume réactionnel total de 25 µl) - Programme d’amplification (Tableau 5) Tableau 5 : Programme d'amplification Etapes Température en °C Temps 1 95 15 min -- 95 5s -- 60 20 s -- 72 15 s -- 95 5s -- 60 30 s FAM, JOE/HEX/Cy3, 2 3 Détection de la florescence Cycles ROX/TexasRed, Cy5 72 15 s 1 5 40 -- Figure 9 : Appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de “Sacace Biotechnologie” (Photos Lassina au CERBA) Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 33 4.3.3 ANALYSE ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS L’analyse et l’interprétation des résultats se fait directement par le logiciel de PCR de la machine et la lecture se fait comme suit (Tableau 6). Pour validé les résultats, on se rassure que tous les contrôles ont bien fonctionné. Tableau 6 : Exemple d'analyse qualitative des résultats C+ : contrôle positif, C- : contrôle négatif 4.3.4 - PERFORMANCE sensibilité : Le Kit CMV/EBV/HHV-6 Quant Real-TM est capable de détecter les cas d’infection à partir de 5 copies de DNA par 105 cellules dans le sang total, dans les globules blancs et les dans les biopsies de viscères. Dans les produits biologiques fluides elle est de 400 copies/ml - spécificité : Le Kit CMV/EBV/HHV-6 Quant Real-TM est utilisé pour la détection de l’ADN d’EBV, du HHV-6 et du CMV. La spécificité du Kit a été confirmée par analyse de souche de référence du CMV AD 169, QCMD pour l’EBV. - Région cible : le Kit CMV/EBV/HHV-6 Quant Real-TM cible le gène MIE du CMV, le gène LMP d’EBV et le gène Pol de HHV-6. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 34 5. RESULTATS ET DISCUSSION 5.1 RESULTATS 5.1.1 CARACTERISTIQUES SOCIODEMOGRAPHIQUES Notre étude a porté sur 198 échantillons de sang collectés en milieu rural (43, soit 21,7%) et en milieu urbain (155, soit 78,3%). Notre population d’étude était constituée de 35 femmes (17,68%) et de 163 hommes (82,32%). L’âge des donneurs variait de 18 ans à 56 ans avec un âge moyen de 24,24 ± 6,69 ans. Parmi les 198 échantillons, tous positifs au Virus de l’hépatite B (VHB), 190 étaient négatifs au VIH et 8 positifs, soit respectivement 95,96% et 4,04%. 5.1.2 PREVALENCE D’EBV, CMV ET HHV-6 Dans cette étude nous avons diagnostiqué les trois Herpès virus EBV, CMV et HHV-6 chez les donneurs de sang. Sur les 198 échantillons analysés 18 (9,09%) étaient positifs à au moins un des trois virus, 10 (5,10%) étaient positifs au EBV, 10 (5,10%) positifs au CMV et 12 (6,10%) positifs au HHV-6 (Tableau 7). Tableau 7 : Prévalence d’EBV, CMV et HHV-6 chez les donneurs de sang VHB positif EBV CMV HHV-6 Nombre Pourcentage Nombre (%) Pourcentage (%) Nombre Pourcentage (%) NEG 188 94,9 188 94,9 186 93,9 POS 10 5,10 10 5,10 12 6,10 TOTAL 198 100,0 198 100,0 198 100,0 Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 35 Pour les cas de coïnfections, nous n’avons pas trouvé de coïnfection EBV/CMV, ni de coïnfection EBV/HHV-6, ni de coïnfection CMV/HHV-6. Par contre les cas de coïnfection enregistrés étaient tous des coïnfections EBV/CMV/HHV-6. Sur les 18 échantillons positifs à au moins un des trois virus, 7 étaient co-infectés au EBV/CMV/HHV-6, soit 38,89%. 5.1.3 INFECTION A L’EBV, CMV, HHV-6 EN FONCTION DE L’AGE, DU SEXE ET DU STATUT VIH Les âges de notre population d’étude étaient beaucoup dispersés. Pour faciliter l’analyse nous avons regroupés les âges en trois groupes. Ceux qui ont au moins 30 ans (≤ 30 ans) étaient au nombre de 169 soit 85,35%. Ceux qui ont un âge compris entre 31 et 40 ans (30 à 40 ans) étaient au nombre de 22 soit 11,11%. Et ceux qui ont un âge supérieur ou égal à 41 ans (≥ 41 ans) étaient au nombre de 7 soit 3,54%. En analysant l’infection aux trois virus en fonction de ces classes d’âge, on remarque que seuls ceux qui avaient un âge inferieur ou égal à 30 ans étaient infectés. Nous n’avons enregistré qu’un seul cas d’infection parmi ceux qui avait un âge supérieur à 30 ans (Tableau 8). L’analyse de nos résultats en fonction du sexe montre que parmi les femmes l’infection à EBV, CMV et HHV-6 représentaient respectivement 8,57%, 8,57% et 11,43%. Par contre chez les hommes, les taux d’infection étaient faibles soient 4,29%, 3,68% et 4,91% respectivement pour EBV, CMV et HHV-6 (Tableau 8). En fonction du statut VIH nous constatons que les séropositifs sont plus infectés que les séronégatifs. Ceux les séropositifs nous avons enregistrés 12,50% de cas d’infection pour chacun des trois virus contre 4,74%, 4,74% et 5,79% respectivement pour EBV, CMV et HHV-6 chez les séronégatifs (Tableau 8). En fonction du lieu de collecte des poches de sang, nous avons enregistré pour l’EBV des prévalences de 2,33% et de 5,81% respectivement chez les donneurs en milieu rural et en ville. Pour les prévalences de l’infection à CMV, elles étaient de 4,65% ; chez les donneur de sang en milieu rural et de 5,16% en milieu urbain. L’HHV-6 avaient des prévalences de 6,98% et 5,81% respectivement en milieu rural et en milieu urbain (Tableau 8). Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 36 Tableau 8 : Infection à CMV, EBV et HHV-6 en fonction de l'âge, du sexe, du statut VIH et du lieu EBV CMV HHV-6 Total ≤ 30 10 (5,92) 10 (5 ,92) 11 (6,51) 169 30 à 40 0 (0,00) 0 (0,00) 1 (4,55) 22 ≥ 41 0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00) 7 Femmes 3 (8,57) 3 (8,57) 4 (11,43) 35 Hommes 7 (4,29) 6 (3,68) 8 (4,91) 163 VIH - 9 (4,74) 9 (4,74) 11 (5,79) 190 VIH + 1 (12,50) 1 (12,50) 1 (12,50) 8 Rural 1 (2,33) 2 (4,65) 3 (6,98) 43 Urbain 9 (5,81) 8 (5,16) 9 (5,81) 155 Caractéristiques Age (ans) Sexe Statut VIH Lieu Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 37 5.2 DISCUSION Nous avons utilisé la PCR en temps réel pour le dépistage d’EBV, CMV et HHV-6 chez les donneurs de sang à Ougadougou. La littérature rapporte que cette technique est plus sensible que les techniques immunologiques (Enan et al., 2011) et aussi plus sensible et plus spécifique que les autres techniques PCR (Drago et al., 2004). Lors de notre étude nous avons obtenu des prévalences de 5,10% ; 5,10% et 6,10% respectivement pour l’infection à EBV, CMV et HHV-6. Cette étude présente un grand intérêt du fait qu’elle est la première au Burkina Faso mais aussi en Afrique de l’ouest. Les études antérieures dans la sous région ont utilisé des techniques sérologiques (Maïga et al., en 2003 au Mali, Adjei et al., en 2006 puis en 2008 au Ghana, Ouedraogo et al., en 2012 au Burkina Faso). La taille de notre échantillon étant faible (198 donneurs de sang), nous ne pouvons pas généraliser les conclusions ni à la population de Ouagadougou ni à celle du Burkina Faso. Aussi, notre étude concerne une population qui n’a pas pris en compte les enfants et les adolescents (l’âge minimal de l’échantillon était de 18 ans). Selon les âges nous avons trouvé que tous les cas d’infection se trouvaient dans la tranche d’âge la plus jeune. Ces résultats concordent avec les données rapportées par la littérature, car l’infection à EBV, CMV et HHV-6 s’observe plus dans la tranche d’âge jeune ( Kabyemera et al., 2013). Les prévalences des herpes virus varient en fonction de la technique (Enan et al., 2011) ou du produit biologique (Géraudie et al., 2012) utilisé. Dans la présente étude nous avons utilisé le plasma comme produit biologique. Les prévalences d’EBV lors de notre étude étaient de 5,10% dans population générale ; 8,75% chez les femmes ; 4,29% chez les hommes ; 4,74% chez les donneurs VIH négatif et 12,50% chez les donneurs VIH positifs. Ces prévalences sont inferieures par rapport à celles rapportées par la littérature, soient plus de 90% dans la population mondiale (Macsween et al., 2003). Cette estimation de la prévalence mondiale d’EBV se rapporte à la séroprévalence. Ainsi, au Ghana, Adjei et al., en 2008 ont trouvé une séroprévalence IgG anti EBV de 20,0% et 87,2% respectivement chez les donneurs de sang VIH négatif et chez les patients souffrant du SIDA. Dans notre étude nous avons aussi trouvé que la prévalence de l’infection à EBV chez les donneurs de sang VIH positif était supérieure à celle des donneurs VIH négatif. Ceci montre que le VIH pourrait favoriser la primo infection ou les réactivations d’EBV (Van et al., 2001). Aux Pays Bas en 2000, l’étude de Van et al., à Amsterdam a rapporté une prévalence de 39%, 6% de EBV respectivement chez les homosexuels et chez les hétérosexuels. La prévalence de l’infection à EBV chez les hétérosexuelles est similaire à Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 38 celle obtenus par la présente étude. La prévalence élevée chez les homosexuels montre que l’homosexualité est un facteur qui favorise l’infection à EBV. En Afrique du Sud Janse et al., en utilisant la PCR nichée, ont montré par leur étude réalisé en 2000, que chez les patients souffrants du carcinome du nasopharynx, la prévalence d’EBV était très élevée, soit 82%. En Tanzanie, en 2013 Kabyemera et al., utilisant une PCR Multiplex en Temps réel ont montré également par leur étude portant sur les enfants souffrant de lymphome de type non Hodgkinien que la prévalence de l’infection à EBV était de 60% . Chez les enfants qui ne souffraient pas de cancer, la prévalence était faible soit 30%. Cette prévalence de 30% chez les enfants, est supérieure à celle trouvés par la présente étude. Cela pourrait s’expliqué par le faite que l’étude concernait surtout les enfants (âge compris entre 3 et 14 ans). Par contre, cette haute prévalence observé chez les enfants Tanzaniens montre que l’infection à EBV touche surtout la tranche d’âge jeune comme rapporté par la présente étude (les 5,10% de cas d’infection avaient tous moins de 30 ans). L’infection au CMV comme celle d’EBV est aussi très répandue dans le monde. Dans notre étude nous avons trouvé que les prévalences du CMV étaient de 5,10% ; 11,4% ; 3,7% ; 4,7% ; 12,50% respectivement dans la population générale, chez les femmes, chez les hommes, chez les donneurs de sang VIH négatifs et chez les donneurs VIH positif. Comme l’infection à EBV nous constatons que la prévalence de l’infection du CMV dans la population générale de notre étude est faible par rapport à celle rapportée par la littérature. Ouédraogo et al., en 2008 au Burkina Faso ont trouvé une séroprévalence de 92,2% et 12,2% respectivement pour les IgG et IgM. La séroprévalence IgG trouvée par Ouédraogo et al., concorde avec celle trouvée par Adjei et al., en 2006 chez les donneurs de sang au Ghana (93,2%). Quant au taux d’infection à CMV par rapport au statut VIH nous avons trouvé que les donneurs de sang VIH positif étaient plus infectés par rapport au donneur VIH négatif. Ces résultats concordent avec ceux rapportés par l’étude de Maïga et al., en 2003 au Mali. Ils ont trouvé que la séroprévalence IgG de l’infection à CMV chez les donneurs de sang VIH positifs (71% et 89% respectivement chez les VIH positifs et chez ceux en phase SIDA) était plus élevé par rapport à celle des donneurs VIH négatifs (58%). Les taux de séroprévalence élevées, rapportés par la littérature montrent qu’une estimation de la prévalence de l’infection à CMV par la recherche d’IgG anti CMV aboutit à la surestimation de la prévalence réelle et que l’estimation de la prévalence par la recherche IgM anti CMV aboutit à la sous-estimation de la prévalence réelle. Par exemple Adjei et al., en 2006 au Ghana ont trouvé des prévalences Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 39 de 92,2% et 0% respectivement pour les IgG et les IgM. Cette idée est soutenue par Enan et al., en 2011, au travers de leurs études portant sur les transplantés de rein. Au soudan, l’étude menée par Enan et al., chez les transplantés de rein (Enan et al., 2011) a trouvé que la séroprévalence IgM et IgG anti CMV était respectivement de 6,1% et 100% . La même étude a trouvé une prévalence de 32,7% en utilisant la PCR en Temps Réel. Cette prévalence est supérieure à celle trouvée par la présente étude ceci pourrait s’expliquer par la nature des échantillons d’étude. La littérature rapporte que les cas d’infection ou de réactivation à CMV s’observe plus chez les transplantés d’organes, parmi lesquels, elles causent des maladies sévères. Les prévalences de l’herpès virus 6 trouvées lors de notre étude étaient supérieures à celle d’EBV et du CMV. Ainsi, dans la population générale, nous avons obtenu une prévalence de 6,1%. Chez les femmes, les hommes, les donneurs de sang VIH négatifs et les donneurs VIH positifs, les prévalences obtenues étaient respectivement 11,4% ; 4,9% ; 5,8% et 12,5%. Comme celles d’EBV et CMV, les prévalences les plus élevées de HHV-6 s’observent chez les femmes et les donneurs de sang VIH négatifs. En Allemagne, l’étude de Pischke et al., en 2012 chez les transplantés de foie a trouvé une prévalence de 58%. Cette prévalence est supérieure par rapport à celle que nous avons obtenue. Ceci pourrait s’expliqué par la nature de l’échantillon. Par leur étude Pischke S et al., ont pu montrer que ce serait HHV-6 et non EBV et CMV, qui serait à l’origine de la dégradation de la santé des transplantés de foie. En 1995 Cleghorn et al., comparant le titre Anticorps en Afrique de l’Est et au Caraïbe, ont trouvé que ce titre était très élevé dans ces deux régions, soient 98%. En Afrique subsaharienne, Bate et al., en 2009 utilisant la PCR en temps réel ont trouvé par leur étude que la prévalence de HHV-6 chez les enfants de six mois nés de mère VIH positifs était de 11%. Cette prévalence est légèrement inférieure par rapport à celle que nous avons trouvés chez les donneurs de sang VIH positif, soit 12,5%. En Argentine Biganzoli et al., en 2010 ont trouvé une prévalence de 15% chez les personnes bien portantes, en utilisant la technique de la PCR nichée et la salive comme produit biologique. La même étude a trouvée une prévalence nulle de HHV-6 en utilisant le plasma comme produit biologique. Par notre étude nous en prenant le plasma comme produit biologique nous avons trouvés une prévalence de 11,4% dans la population générale. Au Brésil, Magalhães et al., en 2010 ont trouvé une prévalence de 9,8% chez les personnes bien portantes, après avoir utilisé la PCR multiplex comme technique et la salive comme produit biologique. En France, Géraudie et al., en 2012 Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 40 ont trouvés des prévalences de l’HHV-6B de 8%, 16,5% et de 10,5% respectivement dans le sang total, les mononucléaires et les polynucléaires chez les donneurs de sang. Par contre ils ont trouvés que la prévalence de l’HHV-6A était nulle. Ils conclurent que la prévalence de l’HHV-6 intégré était de 0,5%. Les prévalences de HHV-6 que nous avons trouvées sont proches de celles rapportées par la littérature. Dans notre étude nous avons aussi trouvés un taux de coïnfection très élevé. Sur les 18 échantillons positif à au moins un des trois virus, 7 échantillons avaient la coïnfection EBV/CMV/HHV-6 soient 38,89%. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 41 6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES CONCLUSION Les prévalences d’EBV (5,10%), CMV (5,10%) et HHV-6 (6,10) que nous avons trouvées à travers la recherche de l’ADN viral comme marqueur de l’infection sont faibles par rapport à celles trouvées par les études antérieures par l’usage des technique sérologiques. Malgré la taille très faible de notre échantillon cette étude nous a permis d’avoir une idée de la prévalence de ces trois virus chez les donneurs de sang de Ouagadougou. Première du genre en Afrique de l’ouest, cette étude met à la disposition des acteurs de la santé de nos populations des données utiles quant à la situation réelle de l’EBV, du CMV et du HHV-6 à Ouagadougou. La technique que nous avons utilisé permet de faire un diagnostic simultané d’EBV, CMV et HHV-6. De telles techniques PCR ont un coût faible par rapport aux techniques qui permettent le diagnostic d’un seul virus par la PCR et sont plus spécifiques et plus sensibles par rapport aux techniques sérologiques. Ainsi, ces techniques présentent une grande utilité dans le domaine de la recherche et également pour le diagnostic de nombreuses pathologies. Elles pourraient servir également pour le diagnostic de ces virus chez les donneurs de sang, en vu d’une amélioration de la sécurité transfusionnelle au Burkina Faso et également dans d’autres pays en voie de développement. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 42 PERSPECTIVES L’étude que nous avons initiée sur les herpes virus, révèle d’une grande importance dans la prévention contre les pathologies dont ils sont responsables. Les pathologies dues aux herpes virus émergent ces derniers temps. Ils sont de plus en plus cités dans diverses formes de cancers et restent la troisième cause de cancer viral. Pour une amélioration de la sécurité transfusionnelle nous pourrions étendre cette étude sur les poches de sang retenues pour la transfusion sanguine, c'est-à-dire les poches de sang diagnostiquées négatifs au VIH, aux virus de l’hépatite B et C et à la syphilis. Nous pourrions aussi faire des études comparatives des prix des tests utilisés pour le diagnostic de EBV, CMV et HHV-6 en vue d’une intégration d’un test sensible, spécifique et à coût faible dans les tests en routine, en transfusion sanguine. Pour vaincre les cancers viraux nous pourrions également étendre cette étude sur la population générale du Burkina en vue d’obtenir des valeurs plus objective de l’épidémiologie de ces virus, puis de celle des pathologies dont ils sont responsables. Mémoire/Master II / BioGeMA / 2011-2012 / TRAORE Lassina Page 43 7. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ABLASHI, D. V., SALAHUDDIN, S. Z., JOSEPHS, S. F., IMAM, F., LUSSO, P., GALLO, R. C., HUNG, C., LEMP, J. & MARKHAM, P. D. 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