tutorat physique

FACULTE
de
PHARMACIE
TUTORAT UE spécifiques 2010-2011
Méthodes d’étude et d’analyse du génome
Eric Badia, Bernard Carcy
Séance préparée par Alexandre Leboucher (ATM²), Astrid Robert (ATP)
QCM n°1: Synthèse d’une protéine recombinante
Après insertion de l’ADNc d’une protéine d’intérêt thérapeutique
dans des plasmides, on les introduit dans des bactéries par
électroporation, puis on cultive ces bactéries sur une boîte de
Pétri contenant de l'ampicilline à dose bactéricide, et en
présence des molécules X-Gal et IPTG.
Après 24h, les résultats sont les suivants (figure ci-contre).
Colonies
bleues
(= 80%)
Colonies
blanches
(= 20%)
Quelle(s) est (sont) la (les) propositions(s) exactes(s) ?
A.
B.
C.
D.
E.
F.
L’ensemble des populations bactériennes présentes a intégré un plasmide.
Les bactéries ayant intégré le plasmide recombinant sont présentes dans les colonies bleues.
La quantité de bactéries ayant intégré le plasmide recombinant est insuffisante.
Le rôle de l’X-Gal est d’empêcher la fixation du répresseur LacI sur le site opérateur.
L'électroporation est la seule méthode utilisée pour effectuer la transformation bactérienne.
Toutes les propositions précédentes sont fausses.
QCM n°2 : Le profil de migration électrophorétique des fragments d’un plasmide de 3000
pb après digestion par une enzyme de restriction A (A), une enzyme de restriction B (B) ou
une combinaison de ces deux enzymes (A+B) est représenté ci-dessous.
A
B
A+B
3000 pb
1000 pb
500 pb
Quelle(s) est (sont) la (les) propositions(s) exactes(s) ?
A. La séparation électrophorétique des fragments de restriction sur gel d’agarose est
obligatoirement effectuée en champ pulsé.
B. L’enzyme A est inactive sur ce plasmide.
C. L’enzyme B reconnait trois sites équidistants.
D. L’enzyme A reconnait un site diamétralement opposé à un des sites reconnus par l’enzyme B.
E. La digestion par A et B génère un fragment de 1000 pb et quatre fragments de 500 pb.
F. Toutes les propositions précédentes sont fausses.
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QCM n°3 : Soient les enzymes de restriction de type II suivantes dont le site de coupure
est représenté par une barre oblique.
NopI : G/TCGAC
AbrI : C/TCGAG
PvuI : TT/CGAA
MxaI : GAG/CTC
SmaI : CCC/GGG
Un plasmide peut être coupé par ces 5 enzymes de restriction dont la position des sites de restriction est
indiquée sur le schéma ci-contre.
GAGCTC
On souhaite à partir de ce plasmide reconstituer un
nouveau plasmide ne comprenant pas le fragment
représenté en noir et comprenant obligatoirement le
fragment grisé.
Pour ce faire, on choisit de couper le plasmide par un
couple d’enzymes puis de réaliser une ligation par une
ADN ligase.
CTCGAG
CCCGGG
GTCGAC
TTCGAA
CCCGGG
Parmi les couples d’enzymes suivantes, quel(s) est (sont) celui (ceux) qui vous parait
(paraissent) être un choix judicieux pour réaliser une telle manipulation ?
A. MxaI + SmaI
B. SmaI seulement
C. AbrI + NopI
D. AbrI + PvuI
E. NopI + MxaI
F. Toutes les propositions
précédentes sont fausses.
QCM n°4 : On souhaite amplifier par réaction de polymérisation en chaine (PCR) le
fragment d’ADN de 50 pb compris entre les deux séquences de 10 pb révélées. L’ensemble
de la molécule d’ADN double brin, présente en un seul exemplaire, mesure 100 paires de
bases.
5’
3’
ATCGGGATTC
TTTGGATCGC
50 pb
25 pb
25 pb
Quelle(s) est (sont) la (les) propositions(s) exactes(s) ?
A.
B.
C.
D.
E.
F.
La température de l’étape d’hybridation des amorces sera choisie proche de 45°C.
La température d'élongation par l'ADN polymérase est choisie proche de 37°C.
La taille du fragment d'ADN amplifié sera de 50 pb.
5’-TAGCCCTAAG-3’ et 5’-GCGATCCAAA-3’ est un choix judicieux de couple d’amorces.
5’-ATCGGGATTC-3’ et 5’-CGCTAGGTTT-3’ est un choix judicieux de couple d’amorces.
Toutes les propositions précédentes sont fausses.
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3’
5’
Les QCMs n°5, 6, 7 et 8 sont liés :
Soit le fragment d'ADN double brin de 10kpb représenté ci-dessous (échelle non respectée), issu
d’un ADN humain après clivage par deux enzymes de restriction non citées. On dévoile 2 parties
de séquences qu’on notera A et B. La position de ces deux séquences par rapport à une base de
référence (0 pb) est indiquée.
5’
3’
0 pb
AGGCCT
TCCGGA
AGGCCT
TCCGGA
Séquence A
Séquence B
+3 kpb
3’
5’
+5 kpb
Dans cet exercice, on étudiera notamment comment il est envisageable de caractériser par
plusieurs techniques la mutation suivante affectant la séquence B :
5’
3’
AGGCCT
TCCGGA
TGGCCT
ACCGGA
3’
5’
On donne à présent les 2 enzymes de restrictions de type II suivantes (la barre oblique
correspond au site de coupure).
AatI : AGG/CCT
Hae III : GG/CC
On considérera qu’il n’existe pas d’autres sites de restriction pour ces enzymes que ceux qui sont
indiqués dans la représentation précédente.
QCM n°5 : Concernant les enzymes de restriction de type II
A. La spécificité de reconnaissance d’une séquence d’ADN double brin est toujours absolue.
B. Les sites de restriction sont des séquences généralement palindromiques.
C. Une enzyme de restriction de type II clive toujours une vingtaine de bases en amont ou en aval
de la séquence reconnue.
D. Dans la forme non mutée, HaeIII et AatI produisent les mêmes fragments de restriction.
E. L’utilisation de AatI est plus judicieuse que l’utilisation de HaeIII pour la mise en évidence de la
mutation de la séquence B.
F. Toutes les propositions précédentes sont fausses.
QCM n°6 : Détection de la mutation par Southern blot.
On décide d'effectuer une étude du fragment d'ADN double brin précédent dans le génome
humain diploïde par la méthode du Southern Blot. Pour ce faire, l'ADN génomique humain est
extrait de cellules diploïdes, digéré par l'enzyme AatI puis hybridé par une sonde radioactive
(marquée au 32P) complémentaire de la région +2000 pb à +4000 pb.
Après hybridation de la sonde sur sa séquence complémentaire, quel(s) est (sont) le (les)
profil(s) d'autoradiographie possible(s) dans le cas d’un sujet homozygote ou hétérozygote
pour cette mutation ? Répondre F. si aucune des propositions ne vous parait satisfaisante.
A.
B.
C.
D.
E.
7 kb
5 kb
3 kb
2 kb
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QCM n°7 : Détection de la mutation par PCR-restriction.
Soient 3 sites O1, O2 et O3 d’appariement pour des amorces de PCR, dont l’emplacement sur
l’ADN double brin considéré est indiqué sur le schéma suivant.
B
A
O1
O2
O3
10 kb
4 kb
2 kb
1 kb
Dans la perspective de détecter la mutation par PCR-restriction, on pourra utiliser un couple
d’amorces soit complémentaires de O1 et O2 soit de O1 et O3. On supposera que la taille des
fragments amplifiés correspond aux distances O1-O2 ou O1-O3 indiquées sur le schéma
précédent.
Après amplification génique par PCR puis digestion des fragments amplifiés par AatI,
quelle(s) est (sont) la (les) propositions(s) exacte(s) ?
A. Le but de la PCR restriction est de quantifier le nombre de copie d'ADN double brin amplifié.
B. Pour un sujet homozygote non muté : si les sites d’appariement O1 et O2 sont choisis, on
visualise une seule bande après révélation par le bromure d’éthidium.
C. Pour un sujet homozygote pour la mutation : si les sites d’appariement O1 et O2 sont choisis,
on visualise une seule bande après révélation par le bromure d’ éthidium.
D. Pour un sujet homozygote non muté : si les sites d’appariement O1 et O3 sont choisis, on
visualise une seule bande après révélation par le bromure d’ éthidium.
E. Pour un sujet homozygote pour la mutation : si les sites d’appariement O1 et O3 sont choisis,
on visualise deux bandes distinctes après révélation par le bromure d’ éthidium.
F. Toutes les propositions précédentes sont fausses.
QCM n°8 : Caractérisation de la nature de la mutation par séquençage.
On réalise, selon la méthode de Sanger et Coulson, le séquençage du brin d'ADN porteur
de la séquence B mutée 5'-TGGCCT-3'.
A quel profil électrophorétique vous attendez-vous ?
N.B. : la flèche indique le sens de migration sur gel.
A C G T
A C G T
A C G T
A.
B.
C.
A C G T
A C G T
D.
E.
Répondre F. si aucune des propositions précédentes ne vous parait satisfaisante.
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QCM n°9 : Soit une expérience d’analyse de courbes de fusion (HRM) dans le cadre d’un
diagnostic de maladie génétique liée à la délétion d’une partie de séquence (perte d’un
triplet CGC).
Quelle(s) est (sont) la (ou les) propositions(s) exactes(s) ?
L’expérience commence par une amplification préalable par PCR.
Cette technique tombe actuellement en désuétude.
Cette technique utilise un agent intercalant fluorescent.
Cette technique s’appuie sur la mesure de l’absorbance à 260 nm des bases azotées.
A une température fixée T=Tm de la séquence non mutée, la fluorescence émise par les
duplexes porteurs de la mutation sera probablement plus forte que celle des duplexes non mutés.
F. Toutes les propositions précédentes sont fausses.
A.
B.
C.
D.
E.
QCM n°10 : Les puces à ADN : Quelle(s) est (sont) la (ou les) propositions(s) exactes(s) ?
A. Les puces d’expression et les puces de type « CGH Array » nécessitent l’utilisation de marqueurs
fluorescents.
B. Les puces d’expression permettent une analyse du transcriptome d’un tissu.
C. Les puces d’expression sont porteuses de polynucléotides simple brin.
D. Les puces de type « CGH Array » permettent la caractérisation de pertes ou de gain de
séquences ADN.
E. La puce Mammaprint analyse l’expression de plusieurs milliers de gènes.
F. Toutes les propositions précédentes sont fausses.
QCM n°11 : Concernant le pyroséquençage : Quelle(s) est (sont) la (ou les)
propositions(s) exactes(s) ?
A.
B.
C.
D.
E.
F.
Il requiert une étape d’analyse par électrophorèse.
Il fait intervenir 4 tubes différents.
Il fait intervenir 1 seul tube contenant les 4 dNTP mélangés.
Chaque dNTP incorporé provoque indirectement un flash lumineux capté par une caméra CCD.
L’apyrase est une enzyme utilisée pour dégrader les nucléotides.
Toutes les propositions précédentes sont fausses.
QCM n°12 et 13 liés :
QCM n°12 : Soit la séquence suivante possédant un motif CpG éventuellement méthylé :
ATATGCCGTCT
On souhaite mettre en évidence sur l’ADN d’un patient l’absence ou le caractère
homozygote/hétérozygote de cette méthylation. Quelle(s) est (sont) la (ou les)
propositions(s) exactes(s) ?
A. On réalise la conversion au bisulfite après une première étape de dénaturation.
Me
B. Après traitement au bisulfite de sodium, la séquence étudiée est convertie en ATATGUUGTUT.
C. Après traitement au bisulfite de sodium, on réalisera une PCR à l’aide de deux amorces, l’une
d’elle complémentaire d’une région de l’un des brins, et l’autre complémentaire d’une région de
l’autre brin.
D. A la fin de la procédure de PCR, on pourrait obtenir des duplexes porteurs de la séquence
ATATGTCGTTT si le patient est homozygote et porteur de la méthylation.
E. A la fin de la procédure de PCR, on pourrait obtenir des duplexes porteurs de la séquence
ATATGTTGTTT si le patient n’est pas porteur de la méthylation.
F. Toutes les propositions précédentes sont fausses.
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QCM n°13 : Vous choisissez de réaliser une analyse par chromatographie DHPLC des
brins courts obtenus. On représente sur le graphe suivant en abscisse le volume d’élution,
en ordonnée le niveau d’absorbance à 260 nm (présence d’un capteur à la sortie de la
colonne). On met en évidence 4 pics distincts notés A, B, C et D.
DO
A
B
C
D
Ve
Quelle(s) est (sont) la (ou les) propositions(s) exactes(s) ?
A.
B.
C.
D.
E.
F.
Vous concluez que le sujet est hétérozygote pour la méthylation de cette séquence.
En analyse DHPLC, la colonne est porteuse d’une résine constituée de billes hydrophobes.
Les hétéroduplexes correspondent aux pics A et C.
Les hétéroduplexes correspondent aux pics B et D.
Une analyse par HRM des produits de PCR aurait pu être envisageable.
Toutes les propositions précédentes sont fausses.
QCM n°14 : Parmi les propositions suivantes concernant le transfert de gène, quelle(s)
est (sont) la (ou les) propositions(s) exactes(s) ?
A. On définit la transgénèse comme le fait d’introduire un ou plusieurs gènes dans un organisme
vivant.
B. Pour être exprimé dans un organisme, un transgène doit obligatoirement être intégré dans le
génome de cet organisme.
C. Il n’existe qu’une seule méthode de transfert de gène.
D. Dans les approches de traitement des maladies génétiques humaines, le transfert de gène dans
les cellules germinales est autorisé.
E. Lors de la production d’une protéine recombinante dans un système procaryote, il est primordial
que le transgène soit fusionné à un tag pour purifier aisément la protéine recombinante.
F. Toutes les propositions précédentes sont fausses.
QCM n°15 : Parmi les propositions suivantes concernant le transfert de gène via un
rétrovirus en thérapie génique humaine, quelle(s) est (sont) la (ou les) propositions(s)
exactes(s) ?
A. Les rétrovirus thérapeutiques ne peuvent être utilisés que dans les approches de thérapie
génique in vivo.
B. La séquence ψ est nécessaire à l’encapsidation du génome viral ARN simple brin des rétrovirus.
C. L’utilisation d’une cellule vecteur dans laquelle est intégré un ADN proviral auxiliaire défectif
ψ- vir+ est indispensable à la production de rétrovirus thérapeutiques ψ+vir-.
D. Les virions thérapeutiques ne contiennent pas la transcriptase reverse codée par le gène pol des
rétrovirus.
E. L’ARN thérapeutique étant ψ+, il pourra être transmis et donc infecter plusieurs cellules cibles.
F. Toutes les propositions précédentes sont fausses.
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