La voie de signalisation RAS/MAPK
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38 Cancéro dig. Vol. 2 N° 1 - 2010 - 38-42 DOI 10.4267/2042/30747 MISe au PoInt La voie de signalisation RAS/MAPK RAS/MAPK signaling pathway Astrid Lièvre (1), Pierre Laurent-Puig (1) Hôpital Ambroise Paré, 9, avenue Charles de Gaulle, F-92100 Boulogne-Billancourt [email protected] ❚ Résumé La voie RAS/MAPK est une voie de signalisation intracellulaire qui joue un rôle important dans la régulation de la prolifération, de la survie, de la différenciation et de la migration cellulaire, ainsi que de l’angiogenèse. Elle est anormalement activée dans de nombreux cancers dont le cancer colorectal. Les mécanismes d’activation de cette voie sont principalement l’activation de récepteurs membranaires tels que l’EGFR, mais aussi la survenue de mutations somatiques, notamment au niveau des gènes codant pour la protéine RAS ou la protéine RAF. Une meilleure connaissance de cette voie de signalisation et des altérations oncogéniques en son sein ont permis l’identification de cibles thérapeutiques anticancéreuses potentiellement intéressantes, mais aussi de facteurs prédictifs de résistance à certaines thérapies anti-EGFR. Mots-clés RAS, MAPK, EGFR, Mutation, KRAS, BRAF ❚ Abstract The RAS/MAPK pathway is a cell signaling pathway that plays a key role in regulation of cellular proliferation, apoptosis, cellular differenciation and migration and angiogenesis. This pathway is often disregulated and activated in human cancers, including colorectal cancer. This pathway may be activated by several mechanisms, mainly including the activation of membrane receptors, such as EGFR, but also including somatic mutations of genes encoding RAS and RAF proteins. A better knowledge of this signaling pathway and of its oncogenic alterations allowed the identification of potential anti-cancer targets, but also of predictive markers of resistance to anti-EGFR therapies. Keywords RAS, MAPK, EGFR, Mutation, KRAS, BRAF ❚ Introduction La voie RAS/MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) est, en général, activée par le biais d’un récepteur membranaire, luimême stimulé par un facteur de croissance ou une cytokine qui, sans entrer dans la cellule, va transmettre le signal extracellulaire © aln.editions à l’intérieur de la cellule. Les récepteurs membranaires de ces facteurs de croissance ont la particularité d’avoir une activité enzymatique de phosphorylation de résidus tyrosine, appelée « activité tyrosine-kinase » permettant l’activation du récepteur par autophosphorylation, et ainsi l’activation d’une cascade de phosphorylations de nombreuses protéines intracytoplasmiques 39 Cancéro dig. Vol. 2 N° 1 - 2010 qui sont généralement d’autres kinases. La voie RAS/MAPK constitue, avec la voie PI3K (Phosphatidyl Inositol 3-Kinase) /AKT, une des voies de transmission du signal les mieux connues aboutissant, après une cascade de phosphorylations successives, à la mise en jeu de facteurs de transcription capables d’activer la transcription de gènes impliqués dans la prolifération cellulaire, mais aussi dans l’invasion et la migration cellulaires, l’angiogenèse et la survie cellulaire. Parmi les récepteurs de facteurs de croissance capables d’activer la voie RAS/MAPK, les principaux sont l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) et les autres membres de la famille HER, le FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor), l’IGFR (Insulin-like Growth Factor Receptor) et le PDGFR (Platelet Derived Growth Factor Receptor). La voie RAS/MAPK est anormalement activée dans de nombreux cancers dont le cancer colorectal. Les mécanismes d’activation de cette voie sont principalement l’activation de récepteurs membranaires tels que l’EGFR, mais aussi la survenue de mutations somatiques, notamment au niveau des proto-oncogènes codant pour la protéine RAS ou la protéine RAF, qui constituent des cibles thérapeutiques potentiellement intéressantes. ❚ Le récepteur de l’Epidermal Growth Factor (EGFR) Famille des récepteurs de l’EGF ou famille HER (Human EGF Receptor) L’EGFR ou HER1, principal récepteur membranaire capable d’activer la voie RAS/MAPK, est une glycoprotéine transmembranaire appartenant à la famille HER ou ErbB. Cette famille appartient à la famille des récepteurs de facteurs de croissance à activité tyrosine-kinase et comporte, en plus de l’EGFR, 3 autres récepteurs : HER2 ou C-erbB2, HER3 et HER4 (Fig. 1). L’EGFR est composé d’un domaine extracellulaire assurant la fixation EGF TGFα Epiréguline Ligands spécifiques Amphiréguline HB-EGF β-celluline neurégulines HB-EGF β-celluline neurégulines Milieu extracellulaire Membrane Milieu intracellulaire Domaine tyrosine kinase TK TK HER1 = REGF HER2 TK TK HER3 HER4 EGF TGFα Epiréguline Amphiréguline HB-EGF β-celluline ligand Dimérisation Membrane Cellule tumorale EGFR TK TK TK P P Voie Ras/Raf/MAPK Angiogenèse Voie PI3K/Akt Prolifération Invasion/migration tumorale Phosphorylation => Activation Voie STAT3 Résistance à l’apoptose Diffusion métastatique Figure 1 Activation du récepteur de l’EGF et des voies de signalisation intracellulaire en aval avec le ligand d’un domaine transmembranaire et d’un domaine effecteur tyrosine-kinase intracellulaire. L’EGFR possède plusieurs ligands que sont l’EGF et le TGFa (Transforming Growth Factor a) principalement, mais aussi l’amphiréguline, l’épiréguline, la β-celluline, le facteur de croissance lié à l’héparine ou HB-EGF (Heparin-Binding Epidermal Growth Factor) et les neurégulines [1]. La fixation du ligand sur le récepteur entraîne, après homo- et/ou hétérodimérisation de ce récepteur avec d’autres récepteurs de la famille ErbB tels que HER2, l’activation de ce dernier par phosphorylation au niveau de résidus tyrosine spécifiques situés sur son domaine intracellulaire (Fig. 2). Ces résidus phosphorylés servent de site d’amarrage pour un certain nombre de protéines intracellulaires contenant un domaine Src homology-2 (SH2) capable de reconnaître ces tyrosines phosphorylées. Ces protéines à domaine SH2 jouent donc un rôle central dans la transmission des signaux intracellulaires, raison pour laquelle on les retrouve dans la plupart des voies de signalisation : il s’agit du complexe Grb2/hSos qui active la protéine RAS dans la voie des RAS/MAPK et de la protéine PI3K qui phosphoryle certains lipides membranaires, ce qui aboutit au recrutement de la kinase AKT dans la voie PI3K/AKT. Ainsi, l’activation de l’EGFR, suite à la fixation de ses ligands, est responsable de l’activation de voies de signalisation intracellulaires situées en aval que sont essentiellement la voie RAS/MAPK et la voie PI3K/AKT, toutes deux impliquées dans la prolifération, la migration, l’adhésion et la différenciation cellulaire, ainsi que dans la résistance à l’apoptose et l’angiogenèse. Activation anormale de l’EGFR dans les cancers Famille des récepteurs de l’EGF EGF : Epidermal Growth Factor HB-EGF : Heparin-Binding Epidermal Growth Factor HER : Human Epidermal Growth Receptor TGFa : Transforming Growth Factor a Il a été démontré que l’EGFR jouait un rôle important dans la genèse de nombreux cancers épithéliaux dont les cancers colorectaux où ce récepteur est surexprimé dans 30 à 85 % des cas [2]. Ce constat a pu être fait après plusieurs observations. 40 Tout d’abord, la mise en évidence d’une élévation du niveau d’expression en ARNm de l’EGFR dans des lignées cellulaires de cancer colorectal ou des tumeurs colorectales par rapport à celui observé dans des lignées de cellules intestinales non tumorales ou au niveau de tissu colique normaux. Par ailleurs, l’administration de promoteurs du cancer colorectal (azoxyméthane) dans des modèles animaux entraîne une augmentation de l’autophosphorylation de l’EGFR ainsi que de son activité tyrosine-kinase, et le transfert d’un allèle déficient en EGFR chez une souris APCmin (modèle murin de polypose adénomateuse familiale) entraîne une diminution de plus de 90 % du nombre de polypes intestinaux, ce qui suggère une implication de l’EGFR à un stade précoce de la carcinogenèse colorectale. L’activation oncogénique de l’EGFR dans les cancers peut se faire par plusieurs mécanismes : – augmentation de son expression liée à une augmentation du nombre de récepteurs à la surface de la cellule. Ce mécanisme peut résulter d’une augmentation de la transcription ou d’une stabilité accrue de la protéine ; – mutations du gène de l’EGFR au niveau du domaine extracellulaire, responsables de la synthèse d’un récepteur anormal ayant perdu ce domaine et activé de manière constitutive (variant REGFvIII, par exemple) ou mutations du domaine tyrosine-kinase intracellulaire. Ces dernières sont fréquemment observées dans les cancers broncho-pulmonaires mais sont un événement rare dans les cancers colorectaux ; – augmentation de la quantité de ligands de l’EGFR, en particulier le TGFa, responsable d’une boucle autocrine d’activation continue de l’EGFR ; – amplification du gène de l’EGFR, fréquemment retrouvée dans les cancers broncho-pulmonaires, ORL et colorectaux. ❚ La voie RAS/MAPK Protéines RAS et RAF La famille des proto-oncogènes RAS comprend trois gènes bien caractérisés HRAS, NRAS et KRAS. Les protéines issues de ces gènes ont un poids moléculaire de 21 000 daltons, d’où leurs noms p21. Elles sont localisées à la face interne de la membrane cytoplasmique, ancrées dans la couche phospholipidique membranaire par leur extrémité C terminale. Les protéines RAS font partie de la famille des GTPases, et jouent un rôle important dans la transmission de signaux extracellulaires provenant des récepteurs membranaires vers le noyau, aboutissant à la régulation de la prolifération, de la survie, de la différenciation et de la migration cellulaire, ainsi que de l’angiogenèse. Leur activation est déclenchée par l’intermédiaire de récepteurs membranaires dont l’EGFR. Les protéines RAS jouent un rôle « d’interrupteur » au sein des voies de signalisation et oscillent entre deux états : un état actif où elles sont liées au GTP (Guanosine Tri-Phosphate), ce qui permet transitoirement l’interaction de RAS avec d’autres molécules intracellulaires effectrices et l’activation de différentes voies de signalisation (RAS/MAPK, mais aussi PI3K/AKT) et un Cancéro dig. Vol. 2 N° 1 - 2010 GDP GTP GTP exchange factors (GEF) Forme active RAS RAS GTP • AcFvité GTPasique intrinsèque de RAS Forme inactive GDP P • GTPase acFvaFng proteins (GAP) Activation des voies de signalisation intracellulaire (RAS/MAPK, PI3K/AKT) Figure 2 Forme active et inactive de la protéine RAS état inactif où elles sont liées au GDP (Fig. 3). L’activation des protéines RAS survient lors du remplacement du GDP par le GTP et, inversement, leur inactivation est provoquée par l’hydrolyse du GTP en GDP par des protéines de régulation telles que les GAP (GTPase-Activating Proteins), ainsi que par l’activité GTPase intrinsèque de la protéine RAS elle-même. Les protéines RAS activent les protéines de la famille RAF1, constituée des sérine-thréonine-kinases ARAF, BRAF et CRAF. Kinases intracellulaires effectrices de la voie des MAPK L’activation de la voie des MAPK, également appelée « ERK » (Extracellular signal-Regulated Kinase), débute par l’activation et le recrutement à la membrane par RAS de la protéine RAF-1 (Fig. 4). Cette première protéine kinase est responsable de l’activation par phosphorylation de la MAPK-kinase ou MEK (MAPK-ERK-Kinase). À son tour, MEK active de manière hautement spécifique, par double phosphorylation, ERK, ce qui entraîne sa translocation au niveau du noyau et l’expression de membrane EGFR TK Raf P hSos Ras TK P Grb GTP P P MEK MEK ERK P ERK transcriBCon cycline D1, cdk6 Initiation du cycle cellulaire en phase G1 c‐jun c‐fos Figure 3 Schéma simplifié de la voie RAS/MAPK c‐fos ERK P P noyau 41 Cancéro dig. Vol. 2 N° 1 - 2010 gènes précoces codant pour des facteurs de transcription (c-FOS) et autres (c-MYC, c-JUN ou JUNB) qui, à leur tour, stimulent l’expression d’un grand nombre de gènes, en particulier ceux de la cycline D1 et de cdk6 ayant un rôle majeur dans l’initiation du cycle cellulaire en G1. ❙ Activation anormale de la voie RAS/MAPK dans les cancers Concernant les protéines RAS, KRAS est un des oncogènes les plus fréquemment activés dans les cancers puisqu’environ 20 % des tumeurs humaines ont une mutation activatrice de ce gène. Les cancers ayant une prévalence élevée de mutations de KRAS sont les cancers du pancréas (> 60 %), colorectaux (35-40 %), des voies biliaires (33 %), les cancers broncho-pulmonaires (18 %, essentiellement adénocarcinomes et patients fumeurs) et les adénocarcinomes de l’endomètre et des ovaires (14 %). L’activation de la protéine RAS se fait par la présence d’une mutation fauxsens de KRAS qui leur confèrent un pouvoir oncogénique en étant responsable d’une accumulation de la forme active en rapport avec GTP liée à l’altération de l’activité intrinsèque GTPase [3]. Ces mutations touchent, dans plus de 90 % des cas, l’acide aminé glycine des codons 12 et 13 et, plus rarement, l’acide aminé glutamine du codon 61 (Tableau 1). La présence de telles mutations au niveau tumoral est responsable d’une activation acquise de la voie RAS/MAPK en aval de l’EGFR, et totalement indépendante de la fixation du ligand à ce dernier, ce qui confère aux cellules tumorales une résistance aux anticorps antiEGFR dans les cancers colorectaux [4]. Les gènes NRAS et HRAS sont beaucoup moins souvent mutés, et le type de cancers mutés est différent de celui des cancers mutés pour KRAS (peau et thyroïde surtout). tableau 1. Mutations du gène KRaS les plus fréquentes sur les codons 12 et 13 Codon Base Mutation Substitution d’acide aminé 12 1 GGT CGT G12R 12 1 GGT TGT G12C 12 1 GGT AGT G12S 12 2 GGT GCT G12A 12 2 GGT GTT G12V l’activité kinase de la protéine BRAF, et il a été montré qu’elle avait des capacités oncogéniques dans des modèles cellulaires [5]. Les tumeurs les plus fréquemment mutées sont les cancers de la thyroïde et les mélanomes (40 %) et les cancers colorectaux (5-10 %). Ces mutations sont exclusives des mutations du gène KRAS. Dans les cancers colorectaux, elles surviennent plus fréquemment dans les cancers de type microsatellite instables (MSI) que dans les cancers avec perte d’hétérozygotie (LOH). La voie de transduction de signal passant par les protéines RAS/ RAF apparaît donc activée de manière constitutive dans 60 % des cancers colorectaux, quel que soit le phénotype du cancer. Interconnexion avec la voie PI3K/AKT L’autre grande voie de signalisation intracellulaire pouvant être activée par l’EGFR est la voie PI3K/AKT qui joue un rôle important dans un certain nombre de fonctions cellulaires, notamment la régulation de la glycogenèse, la régulation de la taille de la cellule, la migration, l’apoptose et la prolifération. Cette voie peut être activée, soit directement par activation du récepteur à activité tyrosine-kinase EGFR (ou autre), soit par l’intermédiaire de la protéine RAS. Il existe donc un lien étroit entre la voie de signalisation RAS/MAPK et la voie PI3K/AKT, par l’intermédiaire de RAS. Les connexions qui existent entre ces deux voies sont, en fait, probablement plus complexes encore et font aussi intervenir d’autres voies de signalisation intracellulaire comme la voie de la phospholipase C (PLCg), la voie STAT et la voie Src/FAK (Fig. 5). Thérapeutiques anticancéreuses visant à inhiber la voie RAS/MAPK Une meilleure connaissance des différents partenaires de la voie RAS/MAPK et des altérations oncogéniques au sein de cette voie ont conduit à identifier des cibles privilégiées pour le traitement Ligand (EGF, TGFα, amphiréguline, épiréguline…) EGFR membrane Voie Ras/ MAPK PIP2 P P Grb PIP3 PTEN PI3K hSOS PDK1/2 Ras mTOR Raf p21 p27 MEK1 12 2 GGT GAT G12D 13 2 GGC GAC G13D A : alanine, C : cystéine, D : aspartate, G : glycine, R : arginine, S : sérine, V : valine Concernant les protéines de la famille RAF-1, seul BRAF a été décrit comme muté. Une mutation quasiment unique est observée au niveau de ce gène, conduisant à une substitution d’une valine en un acide glutamique au niveau du codon 600 (V600E). Cette mutation activatrice est responsable d’une augmentation de Voie PI3K/AKT AKT1/2 4EBP1 GSK3 VEGF MEK2 BAD p70S6K eIF4E ERK1/2 Survie cellulaire Survie cellulaire Proliferation Angiogenèse Migration transcription Angiogenèse Survie cellulaire Traduction Synthèse protéique Facteurs de transcription ADN Figure 4 Schéma général simplifié des voies RAS/MAPK et PI3K/AKT quoi sont intimement interconnectées 42 des cancers et au développement de différentes classes de thérapies « ciblées » visant à inhiber cette voie, dont les 3 principales sont : – les molécules ciblant l’interaction ligand/EGFR : il s’agit des anticorps monoclonaux dirigés contre l’EGFR que sont le cetuximab (Erbitux ®) et le panitumumab (Vectibix ®) dont l’efficacité est désormais bien démontrée dans le traitement du cancer colorectal métastatique non muté pour le gène KRAS [6-9] mais aussi pour ce qui concerne le cetuximab, dans les cancers ORL. Ces molécules s’administrent par voie intraveineuse, et ont pour principal effet secondaire une toxicité cutanée se manifestant par un rash acnéiforme, une paronychie, un périonyxis, des fissures, et une sécheresse cutanée. Le cetuximab, anticorps chimérique murin, peut également être responsable de réactions immuno-allergiques potentiellement graves, contrairement au panitumumab qui est un anticorps totalement humain ; – les molécules ciblant de façon sélective le domaine tyrosinekinase de l’EGFR : l’erlotinib (Tarceva®) et le gefitinib (Iressa®) s’administrent par voie orale et sont indiqués dans les cancers pulmonaires non à petites cellules avancés, et l’erlotinib (Tarceva®) a démontré son efficacité dans le traitement du cancer du pancréas, mais ils sont également en cours d’évaluation dans d’autres localisations tumorales. Paradoxalement, ces molécules n’ont, à ce jour, montré aucune efficacité dans les cancers colorectaux, contrairement aux anticorps monoclonaux anti-EGFR. Leurs principaux effets secondaires sont la diarrhée et le rash cutané ; – les molécules ciblant des effecteurs intracellulaires de la voie RAS/MAPK : les inhibiteurs de RAS jusqu’ici développés sont en fait des inhibiteurs de la RAS farnésyl transférase (enzyme intervenant dans le processus d’ancrage de RAS à la membrane cellulaire) (R-115777 ou Zarnestra®, le SCH-66336 ou Serasar®, le L-778,123 et le BMS-214662). Ils sont en cours d’évaluation mais aucun à ce jour n’a montré des résultats assez significatifs pour obtenir une AMM dans le traitement des cancers. Parmi les inhibiteurs de BRAF, le sorafenib (Nexavar®) Cancéro dig. Vol. 2 N° 1 - 2010 qui est un inhibiteur de récepteur tyrosine-kinase multicible (ciblant également VEGFR, PDGFR, Ftl-3 et c-KIT) est en cours d’évaluation dans le traitement du cancer colorectal métastatique muté pour le gène KRAS (essai de phase I/II NEXIRI), mais son efficacité est, en revanche, bien démontré dans le traitement du carcinome hépatocellulaire avancé, essentiellement en raison de son effet antiangiogénique. Enfin, des inhibiteurs spécifiques de MEK (ARRY-142886, PD0325901) existent mais ont démontré leur efficacité essentiellement in vitro, notamment dans des cellules avec mutation de BRAF et sont évalués dans des essais cliniques. ❚ Références 1. Yarden Y. The EGFR family and its ligands in human cancer. Signalling mechanisms and therapeutic opportunities. Eur J Cancer 2001;37 Suppl 4:S3-8. 2. Cohen SJ, Cohen RB and Meropol NJ. Targeting signal transduction pathways in colorectal cancer--more than skin deep. J Clin Oncol 2005;23:5374-85. 3. Bos JL. 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