Richard_Jonathan_2013_these - Papyrus

Université de Montréal
Étude du rôle de la protéine Vpr du VIH-1 dans la modulation de la
réponse immunitaire
par
Jonathan Richard
Département de microbiologie et immunologie
Faculté de médecine
Thèse présentée à la Faculté de Médecine
en vue de l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
en Virologie et Immunologie
Juin, 2013
© Jonathan Richard, 2013
Université de Montréal
Faculté des études supérieures et postdoctorales
Cette thèse intitulée:
Étude du rôle de la protéine Vpr du VIH-1 dans la modulation de la
réponse immunitaire
Présentée par : Jonathan Richard
a été évaluée par un jury composé des personnes suivantes :
Dr Ali Ahmad, Ph.D.
Président-rapporteur
Dr Éric A.Cohen, Ph.D
Directeur de recherche
Dr André Veillette, M.D
Membre du jury
Dr Nicole F.Bernard, Ph.D.
Examinateur externe
Dr Jacques Archambault, Ph.D.
Représentant du doyen
iii
RÉSUMÉ
L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une activation chronique du système
immunitaire et par une réduction graduelle du nombre de lymphocytes T CD4+, qui
contribuent à une détérioration lente du système immunitaire menant à la phase SIDA.
Paradoxalement, ce sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ non infectés qui sont
détruits et la cause de ce phénomène reste encore inconnue. Certaines protéines virales, dont la
protéine accessoire Vpr, sont soupçonnées de jouer un rôle dans ce processus. Synthétisée
tardivement, Vpr est incorporée à l’intérieur des virions, en plus d’être relâchée sous forme
soluble dans le milieu extracellulaire. La principale fonction biologique de Vpr est l’induction
d’un arrêt de cycle en phase G2/M, via le recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase
CUL4A-DDB1VprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par la kinase
ATR. Une étude démontre que l’activation des voies de dommages à l’ADN conduit à
l’expression de ligands du récepteur activateur NKG2D, exprimés par les cellules NK,
déclenchant leurs fonctions cytolytiques. Chose intéressante, plusieurs études suggèrent que le
VIH-1 régule positivement l’expression des ligands de NKG2D à la surface des lymphocytes
T CD4+ infectés. Cependant, le facteur viral impliqué dans ce processus reste encore indéfini.
Le but de cette thèse était d’évaluer le rôle de Vpr dans la modulation des fonctions
cytolytiques des cellules NK et son implication potentielle dans la destruction des
lymphocytes T CD4+. Nos travaux ont permis de démontrer que l’expression de Vpr, seule ou
dans le contexte de l’infection, est suffisante afin d’augmenter spécifiquement l’expression du
ligand de NKG2D, ULBP2, au niveau de lymphocytes T CD4+ primaires. Conséquemment,
Vpr augmente ainsi la susceptibilité de ces cellules à une lyse par des cellules NK autologues.
Nous démontrons que cette régulation positive d’ULBP2 repose sur la capacité de Vpr de
recruter le complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et l’activation de la voie de
dommage à l’ADN ATR. Plus important encore, nous apportons des preuves que Vpr
augmente également l’expression d’ULBP2 au niveau des cellules non infectées lors d’une
infection de lymphocytes T CD4+ par le VIH-1. À cet effet, nous montrons que
l’acheminement de Vpr au niveau de lymphocytes T CD4+ non infectés via des particules
virales défectives est suffisant afin de réguler positivement ULBP2 et d’augmenter leur lyse
par des cellules NK autologues. De plus, nous décrivons pour la première fois que Vpr, sous
iv
forme soluble, a la capacité d’induire des dommages à l’ADN et de réguler positivement
ULBP2 suite à la transduction de différents types cellulaires, incluant des cellules T.
Globalement, nos résultats démontrent que Vpr est un facteur viral clé impliqué dans la
régulation positive des ligands de NKG2D induite par le VIH-1. Cette régulation positive
d’ULBP2 pourrait alors contribuer à la destruction des lymphocytes T CD4+ infectés et non
infectés via l’activation des fonctions cytolytiques des cellules NK. Une meilleure
compréhension de la contribution de cette activité de Vpr dans la pathogenèse du VIH-1 a le
potentiel de permettre le développement de nouvelles cibles ou stratégies thérapeutiques
contre le VIH-1.
Mots-clés : Virus, VIH-1, protéines accessoires, Vpr, ATR, ULBP2, cellules NK, NKG2D,
destruction des lymphocytes T CD4+.
v
ABSTRACT
Chronic immune activation and gradual depletion of CD4+ T cells are hallmarks of
HIV-1 infection, which are thought to contribute to the progressive deterioration of the host’s
immune response that ultimately leads to AIDS. Paradoxically, the majority of CD4+ T cells
that are destroyed are uninfected and causes for this bystander effect of infection on CD4+ T
cells remains unclear. Some HIV-1 proteins, including the accessory protein Vpr, are
suspected to play a role in this process. Vpr, expressed late during HIV-1 infection, is shown
to be incorporated within the budding virions as well as secreted as soluble protein in the
extracellular medium from the infected cells. The main biological function of Vpr is the
induction of a G2/M cell-cycle arrest through the recruitment of the E3 ubiquitin ligase
complex DDB1-CUL4AVprBP and activation of the ATR-mediated DNA damage pathway. One
study showed that activation of DNA damage pathways leads to the expression of specific
ligands for the activating receptor NKG2D expressed on NK cells, thus triggering NK cell
cytolytic function. Interestingly, several evidences suggest that HIV-1 upregulates expression
of specific NKG2D ligands on infected CD4+ T cells. However, the viral factor involved in
this process remains undefined.
The aim of this thesis was to evaluate the role of Vpr in modulating NK cell cytolytic
function and its potential involvement in CD4+ T cells depletion. Our work demonstrated that
the expression of Vpr, alone or in the context of HIV-1 infection, is sufficient to specifically
increase expression of the NKG2D ligand, ULBP2, on primary CD4+ T cells. Consequently,
these CD4 T cells become more susceptible to autologuous NK cell-mediated lysis. Our
studies have shown that this Vpr-mediated ULBP2 upregulation requires the recruitment of the
E3 ubiquitin ligase complex DDB1-CUL4AVprBP and the activation of the ATR-mediated
DNA damage pathway. More importantly, we provide evidence that Vpr augments ULBP2
expression on both infected and uninfected bystander cells during HIV-1 infection of primary
CD4+ T lymphocytes. In that context, we show that delivery of Vpr into uninfected cells via
defective viral particles is sufficient to upregulate ULBP2 and increase their susceptibility to
autologuous NK cell-mediated killing. In addition, we describe for the first time that soluble
vi
Vpr has the ability to induce DNA damages and upregulate ULBP2 upon transducing target
cells, including T cells.
Overall, our results show that Vpr is a key HIV-1 factor involved in the upregulation of
NKG2D ligands induced by HIV-1. This upregulation of UBP2 might contribute to depletion
of infected and uninfected CD4 + T cells through activation of NK cell cytolytic functions. A
better understanding of the contribution of this new activity of Vpr in HIV-1 pathogenesis has
the potential to enable the development of new therapeutic targets or therapeutic strategies
against HIV-1.
Keywords : Virus, HIV-1, accessory proteins, Vpr, ATR, ULBP2, NK cells, NKG2D, CD4+
T cells depletion.
vii
TABLE DES MATIÈRES
ABSTRACT ......................................................................................................................................... vi TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................................. viii LISTE DES FIGURES ......................................................................................................................... xi LISTE DES ABBRÉVIATIONS ........................................................................................................ xii REMERCIEMENTS ......................................................................................................................... xvii INTRODUCTION ................................................................................................................................ 1 1. Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-­‐1) .................................................. 1 1.1. L’incidence du SIDA ......................................................................................................................................... 1 1.2 La classification du virus ................................................................................................................................. 1 1.3 La structure du virus ........................................................................................................................................ 2 1.4 L’organisation génomique du VIH-­‐1 .......................................................................................................... 3 1.5 Le cycle réplicatif du VIH-­‐1. ........................................................................................................................... 5 1.6 La pathogenèse du VIH-­‐1 ................................................................................................................................ 9 1.6.1 Les phases de la pathogenèse. ................................................................................................................................ 9 1.6.2 La destruction des lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés ........................................................ 11 1.6.3 Activation chronique du système immunitaire. ........................................................................................... 13 1.7 Rôle des protéines accessoires dans la réplication et la pathogenèse virale. ........................ 16 1.7.1 Vif ..................................................................................................................................................................................... 16 1.7.1 Nef .................................................................................................................................................................................... 17 1.7.3 Vpu ................................................................................................................................................................................... 19 2. VPR : BIOLOGIE ET FONCTIONS ...................................................................................................... 21 2.1 Biologie et structure ....................................................................................................................................... 21 2.2 Rôle de Vpr dans le cycle réplicatif viral ................................................................................................ 23 2.3 Modulation de la réponse immunitaire .................................................................................................. 28 3. LES CELLULES NK ................................................................................................................................. 30 3.1 Généralités .......................................................................................................................................................... 30 3.2 Profil phénotypique ........................................................................................................................................ 30 3.3 Fonctions et activation des cellules NK .................................................................................................. 32 3.4 Reconnaissance des cellules cibles ........................................................................................................... 33 3.5 La transmission du signal. ............................................................................................................................ 33 3.6 Les récepteurs. .................................................................................................................................................. 34 viii
3.6.1 Les récepteurs inhibiteurs .................................................................................................................................... 36 3.6.1.1 Les récepteurs KIR. ......................................................................................................................................... 36 3.6.1.2 Les récepteurs CD94-­‐NKG2 ......................................................................................................................... 37 3.6.1.3 Les récepteurs LIR ........................................................................................................................................... 38 3.6.2 Les récepteurs activateurs .................................................................................................................................... 38 3.6.2.1 Les récepteurs naturels de cytotoxicités ............................................................................................... 38 3.6.2.2 DNAM-­‐1 ................................................................................................................................................................ 39 3.6.2.3 Les récepteurs SLAM ...................................................................................................................................... 39 3.6.2.4 NKG2D .................................................................................................................................................................. 40 4. LES CELLULES NK DANS LE CONTEXTE DU VIH-­‐1 ..................................................................... 45 4.1 Rôle des cellules NK dans le contrôle de l’infection et la progression de la maladie. ........ 45 4.2 L’impact de l’infection par le VIH-­‐1 sur les cellules NK ................................................................... 47 4.3 Rôle des cellules NK dans la destruction des lymphocytes T CD4+ non infectés ................. 49 4.3 Modulation des fonctions effectrices des cellules NK par les protéines accessoires ......... 50 HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS ....................................................................................................... 52 CHAPITRE 1 : Vpr induit une augmentation de l’expression des ligands du récepteur activateur NKG2D et augmente l’activité cytolytique des cellules NK .... 53 CHAPITRE 2 : Vpr augmente l’expression d’ULBP2 également au niveau des cellules non infectées avoisinantes aux cellules infectées lors de l’infection de lymphocytes T CD4+ par le VIH-­‐1 ............................................................................................. 98 DISCUSSION ................................................................................................................................... 143 1. Le mécanisme .................................................................................................................................... 143 2. Le rôle des voies de dommage à l’ADN dans la modulation des fonctions effectrices des cellules NK ....................................................................................................................................... 145 3. L’effet de cette activité biologique de Vpr sur la réplication et la propagation du virus.
..................................................................................................................................................................... 146 4. La contribution potentielle de cette activité de Vpr dans la pathogenèse du VIH-­‐1. 147 4.1 Rôle dans la destruction des lymphocytes T CD4+ induite par le VIH-­‐1 .............................. 148 4.2 Rôle dans l’activation chronique du système immunitaire et la perte des fonctions des cellules NK et des lymphocytes T CD8+. ..................................................................................................... 152 5. L’utilisation d’un modèle in vivo. ................................................................................................ 154 6. Vpr : cible ou stratégie thérapeutique ? ................................................................................... 156 ix
CONCLUSION ................................................................................................................................. 157 Contributions majeures de la thèse ................................................................................................ 158 RÉFÉRENCES ................................................................................................................................. 160 ANNEXES ........................................................................................................................................ 217 x
LISTE DES FIGURES
Figure 1 Représentation schématique de la particule virale. ................................................ 3 Figure 2 L’organisation génomique du VIH-1. ...................................................................... 4 Figure 3 Le cycle réplicatif viral. ............................................................................................. 8 Figure 4. Progression de la pathogenèse. .............................................................................. 11 Figure 5. Structure atomique de la protéine Vpr obtenu par résonance magnétique
nucléaire (RMN).............................................................................................................. 22 Figure 6. Activation de la voie de dommage à l’ADN ATR par Vpr. ................................ 25 Figure 7. Reconnaissance des cellules cibles par les cellules NK. ....................................... 35 Figure 8. Structure et signalisation du récepteur NKG2D et de ces ligands. .................... 44
Figure annexe 1. L’induction d’un arrêt de cycle en G2/M à l’aide d’un mutant
dominant négatif de Cdc2 n’induit pas de régulation positive d’ULBP2. ............... 217 Figure annexe 2. Les cellules NK réduisent la proportion de lymphocytes T CD4+
infectés par un virus de type sauvage comparativement au virus défectif pour
l’expression de Vpr. ...................................................................................................... 219 Figure annexe 3. La stimulation continue de cellules NK humaines, avec des cellules
CEM.NKR traitées à l’aphidicoline, induit une augmentation de leur activation, une
réduction de l’expression de NKG2D et une diminution de la dégranulation
dépendante de NKG2D. ................................................................................................ 221 xi
LISTE DES ABBRÉVIATIONS
53BP1
9-1-1
ADCC
ADN
ADNc
AICD
AID
AICL
AIP1/Alix
Ala/A
ANT
AP-1
AP-2
APOBEC3F
APOBEC3G
Arg/R
ARN
ARNm
ARNt
ARV
ATM
ATR
β-COP
Bdr4
BST-2
β-TrCP
CBF-β
CCDA
CCR5
CCR7
CD4
CD
« p53 Binding Protein 1 » ou protéine 1 liant p53
« Rad9-Hus1-Rad1 »
« Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity »
Acide désoxyribonucléique
ADN complémentaire
« Actication-induced cell death », Mort induite par activation
« Activation-induced deaminase », Déaminase induite par activation
« Activated-induced C-type Lectin »
Lectine de type C induite par activation
« ASK-interacting protein 1 », Protéine 1 liant ASK
Alanine
« Adenine nucleotide translocator »
Protéine adaptatrice-1
Protéine adaptatrice-2
«Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3F »
Polypeptide 3F d’apolipoprotéine B catalytique à l’activité d’édition de
l’ARNm
«Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G »
Polypeptide 3F d’apolipoprotéine B catalytique à l’activité d’édition de
l’ARNm
Arginine
Acide ribonucléique
ARN messager
ARN de transfert
Antirétroviraux
« Ataxia telangiectasia-mutated », Ataxia telangiectasia muté
« Ataxia telangiectasia-mutated and Rad3-related »
Ataxia telangiectasia muté et relié à Rad3
« Coatomer protein complex subunit beta »
« Bromodomain-containing protein 4 », Protéine contenant un
bromodomaine 4
« Bone marrow stromal antigen 2 »,
Antigène 2 de la moelle épinière stromal
« β-transducing repeat-containing protein »
Protéine contenant des répétitions de la béta transducin
« Core-binding factor subunit beta »
La sous-unité beta du facteur liant le coeur
Cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps
Récepteurs de chimiokine CC de type 5
Récepteurs de chimiokine CC de type 7
Cluster de différenciation 4
Cluster de différenciation
xii
CDK9
Chk1
CMH-I
CMH-II
CMVH
CPI
CRACC
CTLA-4
CTI
CUL4A
CXCR1
CXCR3
CXCR4
DAP10
DAP12
DC
DC-SIGN
DDB1
DNAM-1
EAT-2
Env
ERAD
ESCRT-I
ESCRT-III
GADD45α
Gag
GALT
γ-H2AX
Gln/Q
GM-CSF
gp41
gp120
gp160
« CDK9 cyclin-dependent kinase 9 », Kinase dépendante d’une cycline 9
« Checkpoint kinase 1 », Kinase de point de contrôle 1
Complexe majeur d’histocompatibilité de classe 1
Complexe majeur d’histocompatibilité de classe 2
Cytomégalovirus humain
Complexe de Pré-Intégration
« CD2-like receptor activating cytotoxic cells »
Récepteur activant les cellules cytotoxique comme CD2
« Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 »
Antigène 4 associé au lymphocyte T cytotoxique
Complexe de Transcription Inverse
« Cullin 4A »
Récepteurs de chimiokine CXC de type 1
Récepteurs de chimiokine CXC de type 3
Récepteurs de chimiokine CXC de type 4
« DNAX activation protein of 10 kDa »
Protéine d’activation DNAX de 10kDa
« DNAX activation protein of 12 kDa »
Protéine d’activation DNAX de 10kDa
Cellule Dendritique
« Dendritic Cell–Specific ICAM-3 Grabbing-Nonintegrin »
« DNA Damage-Binding protein 1 »
Protéine 1 liant les dommages à l’ADN
« DNAX accessory molecule-1 », molécule accesoire 1 DNAX
« Ewing’s sarcoma-activated transcript-2 »
Transcrit 2 activé par le sarcome d’Ewing
Enveloppe
« ER-associated protein degradation »
Dégradation de protéine associée au RE
«Endosomal sorting complex I required for transport»
Complexe de triage endosomal I requis pour le transport
«Endosomal sorting complex III required for transport»
Complexe de triage endosomal III requis pour le transport
« Growth Arrest and DNA Damage inducible, alpha »
Inductible aux dommages à l’ADN et à l’arrêt de croissance, alpha
«Group-specific antigen», Antigène spécifique du groupe
«Gut-associated lymphoid tissue » Tissu lymphoide associé à l’intestin
Histone 2A, variant X, phosphorylé
Glutamine
«Granulocyte macrophage colony-stimulating factor »
Facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages
Glycoprotéine de 41kDa
Glycoprotéine de 120kDa
Glycoprotéine de 160kDa
xiii
GPI
H2AX
HLA
IκBα
IN
IFN
Ig
Ile/I
ITAM
ITIM
ITSM
Jak3
KIR
Leu/L
LFA-1
LIR
LTR
LPS
MA
MIP-1α
MIP-1β
NCR
Nef
NF-κB
NK
NKG2
NKT
NRTI
NNRTI
NTB-A
ONUSIDA
p300
PD-1
Glycosylphosphatidilinositol
Histone 2A, variant X
« Human leucocyte antigen », Antigènes humains de leucocyte
Inhibiteur de NF-κB alpha
Intégrase
Interféron
Immunoglobuline
Isoleucine
« Immunoreceptor tyrosine-based activation motif »
Motif d’activation d’immunorécepteur à base de tyrosine « Immunoreceptor
tyrosine-based inhibitory motif »
Motif d’inhibition d’immunorécepteur à base de tyrosine
« Immunoreceptor tyrosine-based switch motif »
Motif de changement d’immunorécepteur à base de tyrosine
« Janus kinase 3 » Kinase Janus 3
« Killer Immunoglobuline-like Receptors »
Récepteur tueur similaire aux immunoglobulines
Leucine
« Lymphocyte function-associated molecule-1 »
Molécule 1 associé aux fonctions des lymphocytes
« Leukocyte Ig-like Receptor »
Récepteur des leucocytes similaire aux immunoglobulines
« Long Terminal Repeats », Longues répétitions terminales
Lipopolysacharride
Matrice
« Macrophage inflammatory protein-1α »
Protéine inflammatoire 1α des macrophages
« Macrophage inflammatory protein-1β »
Protéine inflammatoire 1β des macrophages
« Natural Cytotoxicity Receptors », Récepteur naturels de cytotoxicités
« Negative factor », Facteur négatif
« Nuclear factor kappa B », Facteur nucléaire kappa B
« Natural Killer cell », Cellules tueuses naturelles
« Natural Killer Group 2» , Tueuse naturelle du groupe 2
« Natural Killer T », cellules T tueuses naturelles
«Nucleoside reverse transcriptase inhibitor»
Inhibiteur de la transcription inverse analogue aux nucléosides
«Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor»
Inhibiteur de la transcription inverse non-analogue aux nucléosides
« NK, T and B cell antigen », Antigène des cellules NK, T et B
Programme commun des Nations Unis sur le SIDA
« E1A-binding protein 300 », Protéine 300 liant E1A
« Programmed-death 1 », Mort programmée 1
xiv
Pol
Pr55Gag
Pr160Gag-pol
Pro
P-TEFb
PVR
RANTES
RE
Rev
RPA
RRE
SAP
SCF
SHIP
SHP-1
SIDA
SLAM
SOCS
SP1
TAR
Tat
TCR
TFIIB
Tsg101
TNF
TNF-α
TRAIL
UNAIDS
UNG2
Val/V
VHSK
Vif
VIH-1
VIH-2
VIS
VISmac
VISsm
Vpr
VprBP
Vpu
Polymérase virale
Précurseur de Gag de 55 kDa
Précurseur de Gag-pol de 160 kDa
Protéase virale
« Positive transcription elongation factor b »
Facteur B de l’élongation de la transcription positive
« Polio virus receptor », Récepteur du virus de la Polio
« Regulated And Normal T cell Expressed and Secreted »
Régulé, exprimé et sécrété par les cellules T normales
Réticulum endoplasmique
« Regulator of virion », Régulateur des gènes viraux
« Replication protein a », Protéine de réplication a
« Rev responsible element », Élement répondant à Rev
« SLAM-associated protein », Protéine associée à SLAM
Skp1/Cullin 1/F-box
« SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase »
« SH2-containing protein-tyrosine phosphatase-1 »
Syndrome de l’immunodéficience acquise
« Signaling lymphocytic activation molecule »
Molécule de signalisation d'activation lymphocytaire
« Suppressors of Cytokine Signaling »
Suppresseurs de signalisation des cytokines
« Specificity Protein 1 »
« Transactivation response region », Élément répondant à Tat
« Transcriptional transactivator », Transactivateur transcriptionnel
« T cell receptor », Récepteur des cellules T
« Transcription factor IIB », Facteur de transcription IIB
«Tumour susceptibility gene 101 »
Gène de susceptibilité aux tumeures 101
« Tumor necrosis factor », Facteur de nécrose tumorale
« Tumor necrosis factor alpha», Facteur de nécrose tumorale alpha
« TNF-related apoptosis-inducing ligand »
Ligand induisant l'apoptose lié à TNF
« Joint United Nations Programme on HIV/AIDS »
«Uracil-N-glycosylase »
Valine
Virus de l’herpès associé au sarcome de Kaposi
«Viral infectivity factor », Facteur viral d’infectivité
Virus de l’immunodéficience humaine de type 1
Virus de l’immunodéficience humaine de type 2
Virus de l’immunodéficience simienne
Virus de l’immunodéficience simienne du rhésus macaque
Virus de l’immunodéficience simienne du macaque Sooty mangabey
«Viral protein R », protéine virale R
« Vpr binding protein », protéine liant Vpr
« Viral protein U », protéine virale
xv
À ma famille,
pour votre soutien, vos encouragements, vos
sacrifices et votre amour.
Toute science crée une nouvelle ignorance.
Henri Michaux
Savoir, penser, rêver.Tout est là.
Victor Hugo
xvi
REMERCIEMENTS
J’aimerais tout d’abord remercier mon directeur de thèse, Dr. Éric A.Cohen, pour son
soutien, sa supervision et surtout pour m’avoir donné la chance et les moyens d’accomplir mes
projets et mon doctorat. Mon passage dans votre laboratoire m’aura permis de me développer
et d’acquérir des aptitudes pratiques et théoriques qui me seront utiles pour le reste de ma
carrière scientifique. Je voudrais également remercier l’Institut de recherche en santé du
Canada (IRSC), l’Institut de recherche clinique de Montréal (IRCM) ainsi que la faculté des
études supérieures et postdoctorales (FESP) et le département de microbiologie de l’université
de Montréal pour leur soutien financier tout au long de mon doctorat.
Je veux tout spécialement remercier Jean-Philippe Belzile pour sa patience, sa
disponibilité, son soutien et son savoir encyclopédique ! Tu auras été un modèle pour moi.
Merci à Mathieu Dubé, j’ai apprécié tout particulièrement ton esprit critique, ta franchise, ta
camaraderie et nos longues, très longues, discussions sur le CH, la politique, la science et la
vie. Chose certaine, mes études doctorales n’auraient pas été les mêmes sans votre présence et
vos précieux conseils. Merci à Francine Gérard pour ton soutien, ta bonne humeur et tes
conseils pratiques sur la science et les fonctions parentales ! Mes remerciements à Francine et
Mathieu pour m’avoir fait part de leurs opinions et suggestions sur cette thèse.
Merci à Tram NQ Pham, Sardar Sindhu, Éric Massicotte, Martine Dupuis, Julie Lord,
et Paul-Édouard Neagoe pour votre remarquable travail et votre précieuse collaboration.
Remerciement tout spécial à « Super Tram » pour son aide conceptuelle, pratique et
linguistique ! J’ai apprécié te côtoyer, même si je fus plus souvent qu’à mon tour, le
«punching bag» de service ! Je veux également remercier, Dr Pierre Larochelle, Martine
Gauthier, tout le personnel de la clinique de l’IRCM ainsi que tous les volontaires qui nous ont
généreusement fourni des échantillons de sang pour ces projets. Merci à Nicole Rougeau,
Johanne Mercier et Faddi Hajjar d’avoir fait de notre laboratoire un environnement agréable,
organisé et propice à la recherche. Surtout merci pour votre patience et votre compréhension.
Je veux également remercier tous mes collègues qui ont croisé mon chemin et qui ont
xvii
contribué à mon développement et à mon épanouissement: Vibhuti Dave, David Favre, Julie
Binette, Andrès Finzi, Levon Abrahamyan, Pierre Guiot-Guillain, Yong Xiao, en autre.
L’obtention d’un doctorat nécessite également un grand support de ses proches. Merci
à mes « Chummy » de Sherbrooke, pour tous ces week-ends et soirées inoubliables qui m’ont
permis de décompresser et de lâcher mon fou. J’aimerais remercier mes parents, Monique et
Jacques, pour leur soutien, leurs encouragements et leur amour inconditionnel. Vous avez fait
beaucoups de sacrifices afin de me permettre de me rendre jusque là et je partage avec vous
l’obtention de ce doctorat. Je veux également remercier ma femme Mélie, pour sa présence,
sa compréhension, son support inconditionnel, mais surtout pour son amour. Tu as su me
guider, m’épauler et m’encourager aux moments opportuns. Merci avant tout, d’avoir compris
mes nombreuses absences et d’avoir partager les joies et les angoisses de mes études
doctorales. Finalement, un merci tout spécial à ma fille Annabelle qui me comble de bonheur
et de fierté chaque jour.
xviii
INTRODUCTION
1. Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)
1.1. L’incidence du SIDA
Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l’agent étiologique du
syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA), lequel est caractérisé par une détérioration
progressive du système immunitaire. Depuis son identification en 1983 [1], le VIH-1 a
rapidement atteint des niveaux pandémiques avec un record d’incidence de 5,8 millions de
nouvelles infections en 1997 et un record de 2,3 millions de nouveaux décès dus au VIH/SIDA
en 2005 [2]. On estimait en 2007, à 25 millions, le nombre total de décès causés par le SIDA
depuis le début de l’épidémie [3]. De nos jours, les traitements antirétroviraux (ARV) ont
permis d’augmenter considérablement l’espérance de vie des patients infectés par le VIH-1. À
cet effet, selon les plus récentes estimations fournies par ONUSIDA/UNAIDS 2012, il y aurait
eu environ 1,7 million de décès dus au VIH/SIDA en 2011, ce qui signifie une réduction de
26% comparativement à 2005 [2]. Par ailleurs, on estime à 2,5 millions, le nombre de
nouvelles infections en 2011, soit une diminution de près de 57% comparativement à 1997 [2].
Le traitement actuel implique l’usage d’au moins trois agents antiviraux parmi les trois
principales classes, soit les inhibiteurs de la transcriptase inverse non-analogues aux
nucléosides (NNRTI), les inhibiteurs de la transcriptase inverse analogues aux nucléosides
(NRTI), et les inhibiteurs de la protéase (PI)[4]. Cependant, bien que ces traitements réduisent
la charge virale, ils ne permettent pas de supprimer complètement la réplication virale, en
raison des réservoirs cellulaires [4]. De plus, le coût des antirétroviraux limite leur accès au
niveau des pays en voie de développement. À cet égard, 8 millions de personnes recevaient
des ARV dans le monde en 2011, ce qui repésente 54 % du nombre de gens qui en avaient
besoin [2]. Par ailleurs, environ 34 millions de personnes vivent encore avec le VIH/SIDA
dans le monde, avec une majorité vivant en Afrique subsaharienne (23.5 millions) [2].
1.2 La classification du virus
Le VIH-1 est un virus de la famille des rétrovirus (Retrovidae). Il s’agit principalement
de virus à double acide ribonucléique (ARN) monocaténaires, de polarité positive, infectant
les vertébrés. Ces virus se distinguent des autres virus par l’étape de transcription inverse
transformant leur génome d’ARN monocaténaire en acide désoxyribonucléique (ADN) bi-
caténaire et par l’intégration subséquente de celui-ci au niveau de l’ADN cellulaire. Les
rétrovirus sont divisés en deux catégories - simple ou complexe-, selon leur organisation
génomique. Tous les rétrovirus possèdent trois gènes majeurs : gag (« Group-specific
antigen »), pol (Polymerase) et env (Enveloppe), qui permettent la production de toutes les
protéines structurelles et enzymatiques nécessaires à la réplication virale. Les rétrovirus
simples possèdent seulement ces gènes, tandis que les virus complexes, dont fait partie le
VIH-1, possèdent des gènes supplémentaires codant pour les protéines régulatrices et
accessoires [5-7]. La famille des rétrovirus est aussi divisée en sept genres différents,
comprenant notamment les lentivirus, dont font partie le VIH-1, le virus de
l’immunodéficience humaine de type 2 (VIH-2) et le virus de l’immunodéficience simien
(VIS). Mentionnons que plusieurs études phylogéniques suggèrent que le passage du singe à
l’homme de souches du VIS provenant d’hôtes naturels du virus, le chimpanzé (VIScpz) et le
macaque Sooty mangabey (VISsm), auraient généré respectivement le VIH-1 et le VIH-2 [8].
Les maladies causées par les lentivirus sont principalement caractérisées par de longues
périodes d'incubation, une réplication virale persistante, des manifestations neurologiques
ainsi que par la destruction de certaines cellules hématopoïétiques ou du système immunitaire
[6,9].
Sur la base d’analyses phylogénétiques, le VIH-1 est classé en quatre groupes
d’isolats : M (« main »), N (« non-M, non-O »), O (« outlier ») et P (« pending »). Le groupe
pandémique M serait responsable de la présente épidémie, puisqu’environ 95% des cas de
VIH/SIDA dans le monde seraient causés par celui-ci. Le groupe M est lui-même sous-divisé
en plusieurs sous-types ou clades (A-K) ayant différentes prévalences selon les régions
géographiques. Par exemple, le sous-type B est principalement retrouvé en Occident tandis
que le sous-type C, le plus prévalent à l’échelle du globe, est retrouvé principalement en
Afrique du Sud et en Inde [10-12].
1.3 La structure du virus
La particule virale du VIH-1 mesure entre 80 et 120 nm de diamètre. Celle-ci est
formée d’une membrane lipidique provenant de la cellule infectée, de trimère de la
glycoprotéine de l’enveloppe formé des sous-unités de surface (gp120) et transmembranaires
2
(gp41) ainsi que des protéines structurelles de la matrice (MA, p17), de la capside (CA, p24)
et de la nucléocapside (NC, p7) (Figure 1). La matrice de forme hexagonale est située sous la
membrane virale, tandis que la capside de forme conique protège le génome viral constitué de
deux brins d’ARN monocaténaires complexés aux protéines de la nucléocapside (NC) et de la
transcriptase inverse (TI) (Figure 1A). La particule virale contient également toutes les autres
protéines nécessaires à la réplication du virus, soient la protéase (PR), l’intégrase (IN), en plus
de contenir la protéine Vpr et de faibles quantités des protéines Nef et Vif [5,7,10].
ARN génomique
Membrane virale
Env
gp41
gp120
Vpr, Vif et Nef
intégrase (IN)
matrice (MA)
Gag Capside (CA)
Nucleocapside (NC)
transcriptase inverse (TI)
protéase (PR)
© Jonathan Richard, 2013
Figure 1 Représentation schématique de la particule virale.
Schéma illustrant la structure d’une particule virale mature du VIH-1
1.4 L’organisation génomique du VIH-1
Le génome du VIH-1 de 10 kb, est composé d’un total de neuf gènes utilisant trois
cadres de lectures distincts (Figure 2). Comme tous les autres rétrovirus, le VIH-1 possède les
gènes gag, pol et env ainsi que de longues répétitions terminales (« Long Terminal Repeats,
LTR ») situées aux deux extrémités du génome. Ces gènes codent chacun pour des
polyprotéines, qui après maturation, mènent à la production de chacune des protéines
structurelles et enzymatiques du virus. Notamment, le gène gag code pour le précurseur
Pr55Gag, qui, lorsque clivé par la protéase virale, génère les protéines structurelles MA, CA et
NC. Le précurseur Pr55Gag contient également les domaines p1, p2 et p6, qui jouent un rôle
3
dans la régulation et la fonction de la polyprotéine. Le gène pol code quant à lui pour les
protéines enzymatiques telles la protéase (PR), la transcriptase inverse (TI) et l’intégrase (IN).
Ces protéines sont produites à partir du clivage par PR du précurseur Pr160Gag-Pol, une
polyprotéine qui est produite à la suite d’un changement de cadre de lecture durant la
traduction de Pr55Gag. Enfin, le gène env code pour la polyprotéine gp160, qui permet la
production des glycoprotéines de surface (gp120) et transmembranaires (gp41) de l’enveloppe
virale. Contrairement aux précurseurs Pr55Gag et Pr160Gag-Pol, qui sont clivés par PR, le
précurseur gp160 est plutôt clivé par la furine au niveau de l’appareil de Golgi. Le VIH-1
possède également les gènes tat et rev codant pour des protéines régulatrices Tat et Rev. Ces
protéines sont impliquées dans la transcription des gènes viraux (Tat) et du transport des
ARNm viraux du noyau vers le cytoplasme (Rev). Elles sont donc dites essentielles à la
réplication du virus. Le génome du VIH-1 possède également des gènes additionnels codant
pour les protéines Vpu, Vpr, Vif et Nef. Ces protéines sont dites « accessoires », ainsi
nommées puisqu’elles ne sont pas requises pour la réplication du virus in vitro. Toutefois, ces
petites protéines multifonctionnelles sont reconnues pour manipuler plusieurs facteurs
cellulaires permettant d’établir des conditions favorables à une évasion de la réponse
immunitaire, ainsi qu’à une réplication, une dissémination et une transmission efficace du
virus in vivo [7].
MA
5’ LTR
p17
CA
p24
Vif
NC
p1
Nef
p2
tat
p7 p6
Vpu
Gag
3’ LTR
rev
PR
p51(TI)
p15
p31(IN)
Vpr
gp120
gp41
Env
Pol
© Jonathan Richard, 2013
Figure 2 L’organisation génomique du VIH-1.
Schéma illustrant l’organisation génomique du VIH-1. Le génome du VIH-1 est composé d’un total de neuf
gènes utilisant trois cadres de lectures distincts ainsi que de longues répétitions terminales identiques « Long
Terminal Repeats, LTR » situées aux deux extrémités.
4
1.5 Le cycle réplicatif du VIH-1.
Le cycle réplicatif du VIH-1 présenté à la figure 3, illustre les étapes nécessaires à la
génération de nouvelles particules infectieuses. Tout d’abord, l’attachement du virus à la
surface cellulaire peut se faire de façon non spécifique via l’interaction de l’enveloppe virale
avec certains facteurs cellulaires, tel le protéoglycane de sulfate d’héparane [13], l’intégrine
α4β7 [14] ou bien la lectine DC-SIGN (« dendritic cell–specific ICAM-3 grabbingnonintegrin ») [15]. Dans tous les cas, cet attachement initial à la surface cellulaire apporte
l’enveloppe virale à proximité de son récepteur et de ces corécepteurs. Ceci permet alors une
liaison spécifique entre la glycoprotéine de l’enveloppe, la gp120, et son récepteur primaire, la
protéine CD4 (« cluster de différenciation 4 »). Ceci induit un changement de conformation
permettant la liaison de la boucle V3 de gp120 avec l’un de ces corécepteurs, les récepteurs de
chimiokine CXC de type 4 (CXCR4) ou CC de type 5 (CCR5). L’utilisation de l’un ou l’autre
des corécepteurs détermine le tropisme du virus. En effet, les souches virales utilisant le
corécepteur CCR5, nommées R5 ou à tropisme ¨M¨, infectent majoritairement les cellules
CCR5+ tels les macrophages et les lymphocytes T CD4+ activés, tandis que les souches
utilisant le corécepteur CXCR4, qui sont appelées X4 ou à tropisme ¨T¨, vont
préférentiellement infecter les lymphocytes T CD4+ qui expriment le récepteur CXCR4. Il
existe également des souches à double tropisme, appelées R5X4, qui ont la capacité de lier les
deux corécepteurs [16]. Les souches R5 sont prédominantes lors de la transmission du virus,
tandis que l’émergence des souches X4 et R5X4 se produit seulement dans 50% des cas et ceci
est généralement associé à une progression plus rapide de la maladie. La liaison à l’un ou
l’autre des corécepteurs entraîne un changement de conformation de la sous-unité gp41 de
l’enveloppe, ce qui induit la formation d’une structure à six hélices permettant le
rapprochement des membranes virale et cellulaire. Ce processus favorise alors la fusion des
deux membranes et le relâchement subséquent de la capside virale dans le cytoplasme de la
cellule hôte [17].
Les étapes d’entrée et de fusion sont ensuite suivies par le processus de décapsidation,
qui permet la formation ainsi que la libération du complexe de transcription inverse (CTI). Ce
complexe est notamment constitué des deux brins d’ARN viral (ARNv) et d’une amorce
d’ARN de transfert (ARNt) qui sont associés à certaines protéines virales incluant PR, TI, IN,
5
Vpr, NC et MA [18] . La transcriptase inverse (TI) va alors y initier le processus de
transcription inverse qui permettra de transformer l’ARNv simple brin en ADN
complémentaire double brin contenant à ses extrémités les LTRs. Cette étape serait tout
d’abord initiée à l’intérieur de la particule virale pour ensuite être complétée dans le
cytoplasme de la cellule hôte. De plus, certaines études démontrent que certains aspects du
processus de transcription inverse pourraient influencer l’étape de la décapsidation, suggérant
alors que ces deux étapes du cycle viral pourraient avoir lieu simultanément [19]. La TI, qui ne
possède pas d’activité exonucléase 3’-5’, est incapable de répliquer fidèlement le génome viral
produisant une haute fréquence d’erreurs [20]. Ceci conduit à une diversification importante
des souches virales produites, ce qui contribue grandement à la génération de quasi-espèces
tout au long de la progression de la maladie.
Suite à la transcription inverse, le CTI progresse vers le noyau via le réseau de
microtubules. Durant le transport vers le noyau, la constitution du complexe est modifiée afin
de former le complexe de pré-intégration viral (CPI) [21]. Celui-ci est formé de l’ADN
bicaténaire viral, de la TI, de l’IN, de la MA, de la protéine Vpr ainsi que d’un brin d’ADN
résiduel de la transcription inverse appelé ADN « flap ». Ce complexe permettra ensuite
l’importation du génome viral à l’intérieur du noyau prétendument via les pores nucléaires.
Plusieurs études ont démontré que la protéine Vpr, la TI, l’IN, la MA, ainsi que l’ADN
« flap », pourraient participer activement à l’importation nucléaire du complexe [22].
L’intégrase catalyse ensuite l’intégration de l’ADN viral au niveau d’un chromosome
cellulaire [23]. L’étape d’intégration du VIH-1 permet à celui-ci de rester latent chez certains
types cellulaires, contribuant au réservoir viral [24] . L’ADN intégré, nommé « provirus », se
comporte ensuite essentiellement comme un gène cellulaire. La transcription virale est régulée
par certains éléments transcriptionnels situés au niveau des extrémités LTR du provirus,
notamment la région TAR (« transactivation response region »). Le facteur viral permettant
l’amplification de la transcription virale est la protéine de régulation Tat. Cette protéine
recrute notamment le complexe P-TEFb (« positive transcription elongation factor b ») à la
région TAR, ce qui stimule la transcription virale via la phosphorylation du domaine Cterminal de l’ARN polymérase II [25]. De plus, le recrutement de certaines histones
déacétylases au niveau des LTRs et l’activation du facteur de transcription cellulaire NF-κB
6
(«nuclear factor kappa B ») par Tat, participent également à l’amplification de la transcription
virale [26,27]. Cette transcription à partir des LTRs permet la production d’ARNm viraux non
épissés (Pr55Gag et Pr160Gag-pol), partiellement épissés (Env, Vpr, Vif et Vpu) et multi-épissés
(Tat, Nef et Rev). Puisque la plupart des ARNm cellulaires nécessitent un épissage complet
avant leur transport à l’extérieur du noyau, l’exportation vers le cytoplasme des différents
ARNm non épissés et partiellement épissés du VIH-1 requière la protéine virale régulatrice
Rev via une interaction avec l’élément répondant à Rev (« Rev responsive element (RRE) »)
situé sur les ARNm viraux [25]. La traduction subséquente des protéines virales permet alors
l’expression de toutes les protéines virales nécessaires à l’assemblage des virions.
L’assemblage des virions a ensuite lieu principalement à la membrane plasmique de la
cellule infectée [28,29]. Celle-ci est notamment initiée par le précurseur de Gag Pr55Gag qui
contient toutes les protéines structurales du virus. Tout d’abord le domaine myristylé du
domaine MA de Gag permet une liaison avec à la membrane plasmique via une association
avec le lipide phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate(PI(4,5)P2)[30]. Le précurseur Pr160Gag,
qui est formé suite à un changement de cadre de lecture, est également ciblé à la membrane
plasmique via ce même mécanisme. Le domaine NC de Gag lie l’ARNv, ce qui permet
l’incorporation du génome viral. La multimérisation de Gag, initiée par les domaines CA et
NC de Gag ainsi que la liaison de l’ARNv avec plusieurs protéines de Gag, conduit à la
formation d’une particule sphérique enrobée par la membrane plasmique [25,31,32]. La
glycoprotéine de l’enveloppe quant à elle est synthétisée au niveau du réticulum
endoplasmique (RE) générant le précurseur gp160. Celui-ci est ensuite clivé au niveau de
l’appareil de Golgi, formant les sous-unités gp41 et gp120, une étape nécessaire à la formation
d’hétérodimères gp120/gp41. La liaison entre le domaine MA de Gag et gp41 permet ensuite
l’incorporation de la glycoprotéine de l’enveloppe au virion [25,31,32].
La relâche des virions est ensuite médiée par le domaine p6 de Gag via le recrutement
des complexes ESCRT-I (« endosomal sorting complex 1 required for transport ») et ESCRTIII (« endosomal sorting complex 3 required for transport »). Notamment, les facteurs ESCRT
sont normalement impliqués dans les réactions de fission membranaire impliquées dans la
formation de vésicules endosomales. La partie C-terminal du domaine p6 contient donc des
7
motifs PTAP et YPLTSL qui permettent le recrutement des protéines Tsg101 (« Tumour
susceptibility gene 101 ») et AIP1/Alix (« ASK-interacting protein 1 ») qui représentent des
composantes des complexes ESCRT-I et II. L’utilisation des complexes ESCRT par le VIH-1
mène alors à la fission entre les membranes plasmique et virale, permettant la relâche des
virions dans le milieu extracellulaire [31,32]. Finalement, un processus de maturation débutant
durant et/ou immédiatement après la relâche virale est déclenché par la protéase virale. Celleci clive séquentiellement les composantes individuelles des précurseurs Pr55Gag et Pr160Gag,
produisant ultimement les protéines virales MA, CA, NC, p6, PR, RT et IN. Ce processus de
maturation permet la génération d’une particule virale mature et infectieuse, qui est
caractérisée une forme conique [25,31,32].
12
1
CXCR4 /CCR5
11
BST2
CD4
2
3
Vpu
Vpu
APOBEC3G
Rev
Vif
Nef
5’LTR
4
Vif
Vpr
Tat
10
3’LTR
Gag
AAAA
5
Rev
6
Pol
8
AAAA
Integrase
5’LTR
9
Gag
7
Rev
3’LTR
Tat
Cytoplasme
Noyau
© Jonathan Richard, 2013
Figure 3 Le cycle réplicatif viral.
Schéma illustrant les principales étapes du cycle réplicatif du VIH-1 : 1) l’attachement 2) l’entrée par fusion
membranaire 3) le décapsidation 4) la transcription inverse 5) l’import nucléaire 6) l’intégration 7) la
transcription 8) l’exportation des ARNm 9) la production des protéines virales 10) l’assemblage 11) le
bourgeonnement et 12) la maturation du virus.
8
1.6 La pathogenèse du VIH-1
Le VIH-1 cible préférentiellement les cellules exprimant le récepteur CD4, tels les
lymphocytes T CD4+, les macrophages, les cellules dendritiques (DC) ainsi que les cellules
microgliales du cerveau [33]. L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une réduction
graduelle des niveaux de lymphocytes T CD4+ ainsi que par une activation chronique du
système immunitaire, ce qui contribue à une détérioration lente du système immunitaire
menant à l’apparition d’infections opportunistes dans la phase SIDA [34,35] Pour sa part, le
VIS ne cause généralement aucune maladie au niveau des hôtes naturels du virus tels les
singes verts d’Afriques ( « African green monkey »), mais peut causer une immunodéficience
s’apparentant au SIDA chez les hôtes non naturels du virus comme le macaque Rhésus. La
présence de ces infections dites non pathogéniques et pathogéniques sont le reflet d’une
évolution virus-hôte beaucoup vielle que celle entre le VIH-1 et l’homme [36]. Cette
particularité du VIS permet notamment la réalisation d’études comparatives entre ces modèles
pathogéniques et non-pathogéniques pouvant nous permettre de mieux comprendre comment
le système immunitaire peut contrôler et s’adapter à l’infection. Il existe tout de même chez les
humains des patients pouvant contrôler naturellement la réplication virale (Contrôleur) ou qui
ne progressent pas vers la phase SIDA (asymptomatique à long terme).
1.6.1 Les phases de la pathogenèse.
L’infection par le VIH-1 peut être divisée en trois phases : la phase aigüe ou primoinfection, la phase chronique ou asymptomatique et la phase SIDA (Figure 4).
La primo-infection ou phase aiguë représente les premiers jours ou semaines qui
suivent l’exposition de l’organisme au virus. Les symptômes les plus communs qui s’y
rattachent peuvent ressembler généralement à ceux d’une grippe ou d’une mononucléose
[37,38]. L’infection initiale a lieu au niveau des muqueuses avant d’atteindre les tissus
lymphoïdes [39]. Cette phase de l’infection est notamment caractérisée par une diminution
marquée des niveaux de lymphocytes T CD4+, tout particulièrement ceux des tissus
lymphoïdes associés au tractus gastro-intestinal (GALT; «gut-associated lymphoid tissue »)
[40]. Une destruction moins importante des lymphocytes T CD4+ se produit également au
niveau du sang périphérique. Cette période est aussi caractérisée par une réplication active du
9
virus, avec une charge virale plasmatique pouvant atteindre des niveaux entre 106 et 107 copies
d’ARN viral par ml de sang [41]. Bien que le nombre de cellules B n’est pas affecté, la
réponse immunitaire humorale semble inefficace à ce stade de l’infection et peu d’anticorps
dirigés contre le VIH-1 sont produits [39]. Toutefois, l’activation du système immunitaire
représente une caractéristique majeure de la phase aiguë et celle-ci persiste durant la phase
chronique de l’infection par le VIH-1 [34]. Cette activation du système immunitaire est
accompagnée d’un contrôle partiel de la réplication virale, notamment grâce au travail des
cellules « Natural Killer » (NK) et des lymphocytes T cytotoxiques [42]. Une restauration
incomplète des niveaux de lymphocytes T CD4+ au niveau du sang périphérique est
parallèlement constatée, tandis que les niveaux restent inchangés au niveau du GALT
[40,43,44].
Cette réponse immunitaire est suivie d’une phase chronique ou asymptomatique
pouvant s’étendre de 8 à 12 ans avant l’apparition des symptômes caractérisant la phase SIDA
[45,46]. L’activation du système immunitaire persiste et augmente graduellement durant cette
étape. On constate notamment de fortes réponses du système immunitaire adaptatif et humoral,
démontrant la constante stimulation antigénique [9]. Une réplication lente et graduelle se
produit principalement au niveau des ganglions lymphatiques [10]. La population virale
devient plutôt hétérogène, possiblement reflétant l’émergence d’une multitude de variants
viraux qui sont sélectionnés à la suite de la réponse immunitaire anti-VIH [47]. La
remarquable variation génétique du virus [48,49], l’établissement de réservoirs cellulaires et
anatomiques [41], ainsi que l’évasion de la réponse immunitaire [50], contribue à
l’établissement d’une réplication virale persistante. Parallèlement, les niveaux de lymphocytes
T CD4+ continuent de diminuer graduellement, de 25 à 60 cellules/µl par année [51].
Après une dizaine d’années sans traitement, la disparition graduelle des lymphocytes T
CD4+ mémoires et naïves et l’affaiblissement du système immunitaire dû à l’activation
soutenue de celui-ci, sont accompagnés par un retour d’une charge virale plasmatique élevée.
Cette détérioration du système immunitaire permet alors l’émergence d’infections
opportunistes ainsi que certains cancers qui caractérisent la phase symptomatique du SIDA.
10
Activation du système immunitaire
100%
10
6
10
5
10
4
10
3
10
2
LCD4+ périphérie
50%
Charge virale
Virémie
LCD4+ muqueuse
Aiguë
Chronique
SIDA
JOURS
ANNÉES
MOIS
© Jonathan Richard, 2013
Figure 4. Progression de la pathogenèse.
Schéma illustrant le pourcentage des niveaux de lymphocytes T CD4+ (LTCD4+) du sang périphérique (vert) et
des muqueuses (bleu), du niveau d’activation du système immunitaire (violet) ainsi que la charge virale (rouge)
selon la progression de la maladie.
1.6.2 La destruction des lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés
La destruction des lymphocytes T CD4+ naïfs et mémoires est l’une des
caractéristiques majeures de l’infection par le VIH-1. Puisque les lymphocytes T CD4+ jouent
un rôle important dans l’établissement d’une réponse immunitaire adéquate, leur destruction
contribue grandement à l’apparition d’infections opportunistes et le développement de cancer
qui sont associés à la phase SIDA [35]. En effet, par la production de cytokines, ils jouent un
rôle auxiliaire au niveau des cellules B et des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques, ce qui
contribue à l’établissement d’une réponse immunitaire humorale et adaptative. À cet effet,
l’infection préférentielle des lymphocytes T CD4+ auxiliaires anti-VIH par le virus [52]
contribue à une diminution des fonctions auxiliaires de ceux-ci, ce qui affecte l’établissement
d’une réponse immunitaire des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques anti-VIH [53]. La
destruction des lymphocytes T CD4+, notamment ceux associés au GALT, semble également
contribuer grandement à la pathogenèse du VIH-1 en stimulant l’activation chronique du
11
système immunitaire.
Suite à son entrée dans l’organisme, le virus se réplique et se propage principalement
au niveau des tissus lymphoïdes, particulièrement ceux associés GALT où résident la majorité
des lymphocytes T CD4+ CCR5+ mémoires activés qui constituent des cibles de choix pour le
virus [40,54,55]. À cette étape près de 80% des lymphocytes T CD4+ sont détruits au niveau
du GALT lors des trois premières semaines de l’infection [40,43,44]. Le virus détruit
particulièrement les lymphocytes auxiliaires Th17 [54,56] qui produisent les interleukines 17
et 22 [57]. Cette destruction de lymphocytes Th17 semble jouer un rôle primordial dans la
pathogenèse du VIH/VIS, puisqu’elle survient seulement lors d’une infection par le VIH chez
l’humain ou lors d’une infection pathogénique du VIS chez singe, tandis qu’elle est absente
lors d’infection non pathogénique du VIS chez le singe [54]. En fait, ces cellules jouent un
rôle primordial dans le maintien de l’homéostasie intestinale et la production de défensines
microbiennes, ce qui permet le contrôle de l’intégrité de la barrière gastro-intestinale [58-61].
Leur destruction contribue à la perte de l’intégrité de la barrière gastro-intestinale et provoque
le passage de produits microbiens, notamment du lipopolysacharride (LPS), vers la circulation
sanguine [62]. Cette translocation microbienne contribue alors grandement à l’activation
systémique du système immunitaire qui caractérise la phase chronique [55]. L’activation du
système immunitaire permet par la suite une génération massive de nouveaux lymphocytes T
CD4+CCR5+ mémoires activés au niveau des muqueuses, mais également au niveau des
organes lymphoïdes secondaires. Ceci permet alors une expansion rapide du virus ainsi que sa
dissémination
vers
les
ganglions
lymphatiques
et
la
circulation
sanguine
[63].
Subséquemment, lors de la phase chronique, on observe une persistance de l’activation du
système immunitaire accompagnée d’une destruction graduelle des lymphocytes T CD4+ au
niveau du sang périphérique et des ganglions lymphatiques.
Plusieurs mécanismes de mort directe et indirecte furent proposés afin d’expliquer la
destruction des lymphocytes T CD4+ lors de l’infection par le VIH-1. Tout d’abord, la
destruction des lymphocytes T CD4+ peut être induite directement par le virus, notamment via
la formation de syncytium [64-66], une perturbation/perméabilisation de la membrane
cellulaire lors du bourgeonnement [67,68] et l’induction de l’apoptose [69]. En ce sens, au
12
cours d’infections in vitro de lignées cellulaires T CD4+ immortalisées, c’est la destruction
directe des cellules infectées qui prévaut [69]. En revanche, l’utilisation de systèmes beaucoup
plus physiologiques, comme l’infection ex vivo de tissus lymphoïdes [70] ou l’analyse de
ganglions lymphatiques d’individu VIH+ [71], permet de constater que ce sont
majoritairement les lymphocytes T CD4+ non infectés avoisinants qui sont détruits. Ceci
suggère que la destruction des lymphocytes T CD4+ non infectés pourrait potentiellement
contribuer de façon importante à l'appauvrissement global des lymphocytes T CD4+ lors de
l’infection. Plusieurs mécanismes ont été proposés afin d’expliquer ce phénomène. Tout
d’abord,
l’activation
chronique
du
système
immunitaire
pourrait
participer
à
l’appauvrissement des lymphocytes T CD4 en affectant l’équilibre homéostatique des
populations de lymphocytes T CD4+ au repos, naïves et mémoires, ce qui réduirait le
renouvellement des lymphocytes T CD4+ [72]. L’activation chronique du système
immunitaire pourrait également provoquer la mort des lymphocytes T CD4+ non infectés via
des mécanismes de mort induite par l’activation (« activation-induced cell death :AICD »),
comme avec le ligand Fas [73]. Certaines protéines virales, comme Nef, Tat, Vpr et gp120,
sont relâchées par les cellules infectées et pourraient potentiellement induire l’apoptose de
cellules avoisinantes non infectées [74-76]. En outre, les particules virales défectives ou non
infectieuses, qui représentent la majorité des virions produits in vitro et in vivo [77-79], ont
également été considérées comme pouvant contribuer à la destruction des lymphocytes T
CD4+, en interagissant et/ou transduisant les cellules non infectées [80-84]. Chose certaine, la
destruction des lymphocytes T CD4+ semble jouer un rôle clé dans la pathogenèse du VIH-1
et une meilleure compréhension de ce phénomène important de la maladie pourrait sans aucun
doute permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
1.6.3 Activation chronique du système immunitaire.
L’activation chronique du système immunitaire représente possiblement l’un des
concepts les plus importants de la pathogenèse du VIH-1. Dès les premiers cas de SIDA
rapportés, les chercheurs ont constaté que malgré l'immunodéficience profonde, les cellules
immunitaires démontrent des signes d’activation [85]. Les lymphocytes T, les cellules B, les
cellules NK et les cellules présentatrices d’antigènes démontrent des caractéristiques d’une
évidente activation du système immunitaire [86]. On constate notamment une augmentation de
13
la présence de marqueurs d’activations, tels CD38 et HLA-DR [87,88], au niveau des
lymphocytes T CD8+, ainsi qu’une augmentation importante du renouvellement (« turn
over ») des populations de lymphocytes T CD4+ et CD8+, chez les patients VIH+ [89-92].
Une expansion clonale des cellules B [85] ainsi qu’une augmentation des niveaux de cytokines
pro-inflammatoires et de chimiokines est constatée au niveau de la circulation sanguine [86].
On assiste de même à l’activation du système immunitaire inné, puisqu’on dénote une
activation et une expansion rapide des cellules NK lors de la phase aiguë [93,94].
Indéniablement, cette activation chronique du système immunitaire représente un élément
majeur dans la progression de l’infection par le VIH/VIS. En effet, plusieurs études
démontrent que la présence de ces marqueurs d’activation ainsi que les niveaux plasmatiques
d’IL-6, du récepteur TNF (« Tumor necrosis factor ») et de marqueurs de coagulation,
représentent d’importants indices d’une progression vers la phase SIDA [87,95-97]. De plus,
l’activation systémique du système immunitaire se produit uniquement au niveau de
l’infection pathogénique de singes par le VIS et serait atténuée chez le modèle non
pathogénique [98].
Bien que l’organisme puisse bénéficier de cette activation du système immunitaire à
court terme, notamment par le contrôle partiel de la charge virale et la restauration partielle du
niveau de lymphocytes T CD4+ au niveau du sang périphérique, à long terme celle-ci semble
plutôt néfaste. En effet, cette activation soutenue conduit à une fatigue graduelle de la réponse
immunitaire dirigée contre le virus. On constate notamment une augmentation de l’expression
du marqueur d’épuisement PD-1 (« programmed-death 1 ») [99-101] et du marqueur de
sénescence CD57 [102] au niveau des lymphocytes T CD8+, qui démontrent une capacité
réduite à proliférer [103,104], une inhabilité à sécréter des cytokines suite à une stimulation
antigénique du récepteur des cellules T (« T cell receptor » TCR) [103,105] et une altération
de leur potentiel cytolytique [103,106] lors de la phase chronique de l’infection. Un
épuisement des lymphocytes T CD4+ est également observé comme le démontre l’expression
des marqueurs d’épuisement PDL-1 et CTLA-4 (« cytotoxic T lymphocyte-associated antigen
4 ») [107,108]. Cette diminution de la fonctionnalité des cellules T semble jouer un rôle
critique dans la progression de la maladie. En effet, on dénote une diminution du nombre de
lymphocytes T CD4+ ou CD8+ polyfonctionnelles chez les patients VIH+ progressant vers la
14
phase SIDA, comparativement aux patients ne progressant pas [107-109]. Ces cellules sont
définies comme polyfonctionnelles puisqu’elles ont la capacité de produire plusieurs cytokines
et/ou de dégranuler suite à une stimulation. L’activation chronique du système immunitaire
semble également affecter les fonctions des monocytes qui expriment PD-1 et produisent de
l’IL-10 lors de l’infection [110]. Les fonctions des cellules B semblent également affectées,
comme le démontre la production d’anticorps auto-immuns ainsi la présence d’une
hyperglobulinémie [111]. Finalement, on assiste dans la phase chronique de l’infection, à une
perte des sous-populations fonctionnelles au détriment de l’émergence d’une sous-population
non fonctionnelle de cellules NK [42,112]. Globalement, toutes les cellules immunitaires
semblent être bouleversées par l’activation chronique du système immunitaire
Plusieurs facteurs potentiels ont été avancés afin d’expliquer l’établissement de cette
activation chronique du système immunitaire. Telle que mentionné précédemment, la
destruction rapide des lymphocytes T CD4+ mémoires au niveau du GALT et la translocation
microbienne qui s’ensuit, pourraient grandement contribuer à celle-ci. En effet, la
translocation microbienne conduirait à l’activation du système immunitaire inné par
l’activation de récepteurs immunitaires, incluant les récepteurs de la famille des Toll (TLR ou
« Toll-like receptor »), qui reconnaissent des patrons moléculaires spécifiques qui sont
associés aux pathogènes. L’activation de ces récepteurs favoriserait une inflammation locale,
mais également une activation systémique de la réponse immunitaire [55,62]. Toutefois, la
thérapie antirétrovirale très active (HAART), qui réduit notamment la charge virale, semble
également réduire la présence des marqueurs d’activation, suggérant que la réplication active
du virus pourrait également être impliquée dans l’établissement de l’activation chronique du
système immunitaire [113,114]. À vrai dire, le virus lui-même peut aussi activer le système
immunitaire via l’activation des TLR 7 et 8, par la présence de séquences riches en poly U
dans le génome viral [115,116], mais aussi suite à la reconnaissance des protéines de la
capside ou d’ADN viraux par d’autres récepteurs du système immunitaire inné [117,118]. De
plus, une portion de l’activation des cellules T pourrait être induite par une stimulation
antigénique constance des TCRs par des peptides viraux et/ou de peptides de pathogènes
opportunistes associés à l’infection par le VIH-1 [63,86].
15
1.7 Rôle des protéines accessoires dans la réplication et la pathogenèse virale.
Le VIH-1 utilise plusieurs stratégies afin de permettre l’établissement d’une infection
persistante au niveau de l’organisme. L’une de celles-ci est l’expression de quatre protéines
accessoires : Vif, Nef, Vpu et Vpr, qui collectivement, façonnent l’environnement cellulaire
afin d’établir des conditions favorables permettant la réplication, la dissémination et la
transmission efficace du virus, ainsi qu’une évasion efficace de la réponse immunitaire.
1.7.1 Vif
Vif (Facteur viral d’infectivité) est une protéine cytoplasmique d’environ 23 kDa
exprimée tardivement lors du cycle viral [119]. Cette protéine est incorporée faiblement dans
les virions via une interaction avec l’ARN génomique [120] et/ou les précurseurs de gag et
gag-pol [121]. Depuis longtemps, Vif fut identifiée comme une protéine essentielle à la
production de virus infectieux [122,123]. Cette activité semble étroitement liée à sa capacité à
surmonter le facteur de restriction, APOBEC3G (« apolipoprotein B mRNA-editing enzyme
catalytic polypeptide-like 3G ») [124], une cytidine désaminase agissant au niveau d’ADN
simple brin. En absence de Vif, APOBEC3G est incorporé dans les virions nouvellement
produits [125-127]. Suite à son entrée dans la cellule cible, elle catalyse la désamination de
certains résidus cytidine (C) en uridine (U) au niveau de l’ADN proviral simple brin généré
lors de la transcription inverse [128,129]. Ce processus entraîne la formation d’hypermutations
sur le brin d’ADN opposé, ce qui inactive le virus et réduit de deux fois la réplication virale
[130-132]. De plus, APOBEC3G inhibe la translocation de la transcriptase inverse le long de
l’ARNv, ce qui affecte la synthèse de l’ADNc [133]. APOBEC3F, une autre cytidine
désaminase de la même famille APOBEC, réduit également la réplication du VIH-1 et est
inactivée par Vif [134].
La protéine Vif surmonte APOBEC3G/F en induisant leur
dégradation, prévenant ainsi leur incorporation dans les virions. Pour ce faire, Vif recrute le
complexe d’ubiquitine E3 ligase « Cullin 5 RING » afin d’induire la polyubiquitination et la
dégradation des facteurs de restrictions via le protéasome [125,134-136]. De récentes études
démontrent que le facteur de transcription CBF-β (« Core-binding factor subunit beta ») ainsi
que la protéine NEDD8 seraient impliqués dans la stabilisation et l’activation de ce complexe
[137-139]. Outre cette activité biologique, Vif semble également moduler le cycle cellulaire
16
des cellules infectées par le VIH-1. En effet, Vif accélère la transition de la phase G1 vers la
phase S via le recrutement de deux composantes régulant la progression du cycle cellulaire,
Bdr4 (« Bromodomain-containing protein 4 ») et CDK9 (« Cyclin-dependent kinase 9 »)
[140]. De plus, Vif induit un ralentissement du cycle cellulaire en phase G2 par un mécanisme
qui nécessite le recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase « Cullin 5 RING ». Toutefois,
cette activité de Vif implique l’ubiquitination et la dégradation d’un facteur cellulaire autre
que ceux de la famille APOBEC [141]. Finalement, Vif favorise également la dégradation de
la protéine accessoire Vpr, ce qui réduirait l’arrêt du cycle cellulaire induit par celle-ci [142].
Néanmoins, le rôle de la modulation du cycle cellulaire par Vif dans la réplication et la
pathogenèse virale reste encore indéfini.
1.7.1 Nef
Nef (facteur négatif) est une protéine myristoylée de 27 kDa exprimée précocement
lors du cycle viral [143]. Cette protéine est incorporée très faiblement au niveau des virions,
en plus d’être retrouvée sous forme soluble à l’extérieur des cellules infectées [144-146]. Nef
est fortement conservée au sein de la famille des lentivirus infectant les primates, comprenant
le VIH-1, le VIH-2 et les VISs [147]. Elle représente un facteur important de la pathogenèse
de ces virus, puisqu’on observe une progression plus lente de la maladie au niveau d’humain
ou de singe infectés avec des virus ΔNef [148-151]. Cette protéine virale possède la
particularité de réguler l’expression d’une multitude de protéines cellulaires favorisant ainsi la
réplication virale et l’évasion de la réponse immunitaire. Tout d’abord, Nef, tout comme Vpu,
participe à la régulation négative des niveaux du récepteur CD4 à la surface cellulaire [152].
Pour ce faire, Nef interagit précocement avec la queue cytoplasmique de CD4 et recrute la
protéine adaptatrice-2 (AP-2), ce qui provoque l’endocytose clathrine-dépendante et une
dégradation lysosomale du récepteur [153-155]. Le transport de CD4 vers les lysosomes
nécessite également le recrutement par Nef de la protéine β-COP (« coatomer protein complex
subunit beta ») [156]. En plus du récepteur CD4, Nef diminue aussi les niveaux de surface des
corécepteurs CCR5 et CXCR4, ce qui contribue à prévenir la surinfection de la cellule [157160]. Par ailleurs, l’effet de Nef sur le récepteur CD4 favorise également l’incorporation
efficace de Env au niveau des virions, en plus de prévenir l’interaction entre CD4 et gp120
lors du bourgeonnement, ce qui augmente globalement l’infectivité et la réplication virale
17
[161-163]. Certaines études suggèrent que Nef pourrait augmenter l’infectivité du virus par un
mécanisme qui est indépendant de CD4 [164,165], qui impliquerait une interaction avec la
GTPase cellulaire dynamine 2 [166]. Dans ce même ordre d’idée, Nef augmente l’expression
de DC-SIGN à la surface des DC [167]. Ceci favorise l’attachement et la rétention du virus à
la surface cellulaire des DC et augmente sa transmission vers les lymphocytes T CD4+ [167].
Nef affecte également l’expression de surface des antigènes humains de leucocytes
(HLA) du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH-I) [168] à la surface des
cellules infectées, en recrutant la protéine adaptatrice-1 (AP-1) et β-COP [156,169,170]. Plus
spécifiquement, Nef réduit sélectivement les niveaux de surface de HLA-A et HLA-B, sans
toutefois affecter les niveaux de HLA-C et HLA-E, qui sont reconnus par des récepteurs
inhibiteurs des cellules NK [171]. Ceci permet alors au virus d’échapper à la réponse
immunitaire initiée par les lymphocytes T CD8+ et de diminuer la lyse induite par les cellules
NK [171,172]. De plus, Nef réduit également l’expression de ligands des récepteurs
activateurs NKG2D [173], DNAM-1 [174] et NKp44 [175] des cellules NK, ce qui vient
ajouter à cette protection. Par ailleurs, Nef favorise aussi une protection des cellules infectées
contre une réponse des cellules NKT en réprimant l’expression de surface de la
glycoprotéine CD1d [176,177], qui présente des antigènes lipidiques aux cellules NKT. Outre
ces activités prévenant une réponse des cellules effectrices, Nef affecte également la réponse
immunitaire adaptative en diminuant l’expression de surface des molécules de CMH-II, en
plus d’augmenter les niveaux de la chaine invariante. Ceci réduit considérablement l’efficacité
de la présentation d’antigènes par les cellules infectées aux lymphocytes T CD4+ auxiliaires
[178]. Une régulation négative d’une multitude d’autres protéines cellulaires par Nef est
également observée, notamment des protéines impliquées dans l’activation des cellules T tels
CD8, CD28, CD80 et CD86 [179]. Par ailleurs, Nef, qui est relâchée par les cellules infectées
via les exosomes, peut induire l’apoptose de lymphocytes T CD4+ non-infectés avoisinants
via un mécanisme qui nécessite une interaction avec CXCR4 [180,181]. Enfin, la protéine Nef
peut aussi pénétrer les lymphocytes B, et affecter la commutation isotypique en augmentant
l’expression des protéines IκBα (inhibiteur de NF-κB alpha) et SOCS (« Suppressors of
Cytokine Signaling »), ce qui bloque la signalisation induite par le ligand CD40 et certaines
cytokines, en plus d’inhiber l’expression de la cytidine déaminase AID (« Activation-induced
18
deaminase »)[182]
1.7.3 Vpu
Vpu (Protéine virale U ) est une protéine transmembranaire de type 1 de 16 kD,
produite tardivement durant le cycle viral à partir du même ARNm bicistronique que Env
[183,184]. Cette protéine est unique du VIH-1 et de quelques VIS [185-187]. Il s’agit d’une
protéine amphipathique composée d’un domaine N-terminal transmembranaire hydrophobe et
d’un domaine C-terminal cytoplasmique hydrophile [184,188]. Ce dernier domaine contient
deux résidus sérine phosphorylée (S52 et S56) qui semblent jouer un rôle important dans les
activités biologiques de cette protéine accessoires [189,190]. Parmi les activités biologiques
les plus importantes de Vpu, ont note la dégradation du récepteur CD4 et l’augmentation de la
relâche virale via l’inhibition du facteur de restriction BST-2/tétherine.
Le VIH-1 utilise trois protéines virales afin de réduire les niveaux de surface de son
récepteur primaire CD4 (Nef, Vpu et Env) [191] afin de prévenir une surinfection [192] et
optimiser la relâche virale. Tel que mentionné précédemment, Nef agit précocement sur les
niveaux de surface du récepteur, tandis que Vpu et Env vont plutôt agir plus tardivement sur le
récepteur néo-synthétisé lors de son transport et induire sa dégradation via le protéasome. Tout
d’abord, il y a formation d’un complexe CD4-Env au niveau du RE, ce qui ralentit
mutuellement leur maturation et leur trafic cellulaire [193]. À cet effet, la rétention du
complexe CD4-Env participe à une diminution du niveau d’Env à la surface ou contribue à la
production de virion non infectieux [194]. Vpu aide également à la rétention de CD4 au RE,
via une liaison avec la queue cytoplasmique du récepteur [195]. Vpu recrute ensuite le
complexe d’ubiquitine E3 ligase SCF (Skp1/Cullin 1/F-box) via une interaction avec β-TrCP
(« β-transducing repeat-containing protein »), une composante de ce complexe [196,197].
Cette interaction nécessite notamment la phosphorylation de S52 et S56 du domaine Cterminal de Vpu [196]. Le recrutement de ce complexe permet alors la polyubiquitination de la
queue cytoplasmique de CD4 et un ciblage du récepteur vers le protéasome [198,199] par un
mécanisme
rappelant
le
système
ERAD
(« ER-associated
protein
degradation »)
[195,200,201], un mécanisme cellulaire contrôlant la qualité des protéines synthétisées au
niveau du RE.
19
Vpu augmente considérablement la relâche virale en contrant l’activité antivirale du
facteur de restriction BST-2 (« B cell stromal factor 2 »)/CD317/Tetherin, une protéine induite
par l’IFN-α [202,203]. Cette protéine a la particularité de posséder à la fois un domaine
transmembranaire et une ancre GPI (glycosylphosphatidilinositol), ce qui lui permet d’intégrer
les virions bourgeonnants et de les retenir du même coup à la membrane plasmique [189]. Vpu
semble contrer l’activité antivirale de BST-2 en bloquant son incorporation au niveau des
virions et en diminuant ces niveaux à la surface cellulaire [189]. Plusieurs mécanismes
potentiels ont été avancés afin d’expliquer comment Vpu agit sur BST-2, la plupart basés sur
une séquestration intracellulaire et/ou une dégradation du facteur de restriction. Tout d’abord,
certaine étude suggèrent que Vpu pourrait interférer avec le transport du BST-2 nouvellement
synthétisé vers la surface, en le séquestrant dans le réseau trans-Golgi [204-207]. De plus,
Vpu pourrait également bloquer le recyclage de BST-2 via une séquestration de la protéine au
niveau des endosomes de recyclage, suite à son internalisation à partir de la surface cellulaire
[189,206,208]. D’autre part, il fut suggéré que Vpu pourrait directement causer
l’internalisation de BST-2 vers les lysosome [209-211]. Toutefois, ce dernier mécanisme serait
dépendant du type cellulaire utilisé [207]. Enfin, Vpu recrute β-TRCP et semble induire
l’ubiquitination de BST-2, ce qui pourrait à la fois conduire à sa dégradation protéasomale
[212-214] et/ou lysosomale [208,211,215], mais augmenterait également sa séquestration
intracellulaire [216]. Chose certaine, tous ces mécanismes nécessitent une interaction entre les
deux domaines transmembranaires de Vpu et de BST-2 [209,213,217,218].
Outre ces deux activités biologiques majeures, Vpu participe également à la
pathogenèse virale en diminuant la réponse immunitaire initiée par les cellules NK et NKT et
en prévenant une réponse pro-inflammatoire initiée par BST-2. En effet, Vpu diminue
l’expression de surface de CD1d [219], de ligands de DNAM-1 [174] et de NTB-A [220], un
corécepteur homotypique des cellules NK, ce qui contribue à protéger les cellules infectées
des fonctions effectrices des cellules NKT et NK. De plus, une récente étude suggère que
BST-2 pourrait servir de senseur immunitaire permettant non seulement la rétention des
particules virale à la surface cellulaire, mais induirait également l’expression de gène pro-
20
inflammatoire qui serait dépendante de NFκB. Vpu préviendrait donc cette réponse proinflammatoire en contrant BST-2 [221].
2. VPR : BIOLOGIE ET FONCTIONS
2.1 Biologie et structure
Vpr est une petite protéine amphipathique de 96 acides aminés (14kDa), qui est très
bien conservée parmi les cinq membres de la famille des lentivirus [222]. Pour ce qui est de la
lignée VIH-2/VISmac/VISsm, les fonctions associées à la protéine Vpr sont séparées en deux
protéines soit Vpr et Vpx [223]. Vpr est exprimé tardivement lors du cycle réplicatif [224].
Cette protéine est incorporée en grande quantité au niveau des particules virales [225] via une
interaction avec le domaine p6 de Gag [226-229], ce qui pourrait lui permettre de jouer un rôle
dans les étapes précoces de l’infection. De plus, Vpr est aussi retrouvée sous forme soluble
dans le plasma et le liquide céphalorachidien des patients VIH+ [230,231], ainsi que dans le
milieu extracellulaire de cellules infectées in vitro [232]. Chose intéressante, cette protéine qui
possède des propriétés de transduction, a la capacité de transduire des cellules non infectées,
sous forme soluble [233,234] et via son incorporation au niveau de particules virales non
infectieuses ou défectives [82,83]. Vpr est principalement une protéine nucléaire qui forme des
structures nucléaires mobiles appelées foyer de Vpr, qui jouent un rôle critique dans la
fonction de la protéine [235]. Cependant, cette protéine est également capable de faire la
navette entre le noyau et le cytoplasme, ce qui explique qu’elle possède aussi une localisation
périnucléaire [236] .
La structure moléculaire de Vpr consiste en trois hélices alpha amphipathiques
(résidus 17-33, 38-50 et 56-77) flanquées d’un domaine N-terminal flexible de charge
négative (résidus 1-16) et d’un domaine C-terminal flexible de charge positive (résidus 78-96)
[237] (Figure 5). Les trois hélices alpha sont repliées autour d'un noyau hydrophobe constitué
de Leucines (Leu), d’Isoleucines (Ile), de Valine (Val) et de résidus aromatiques [237]. La
protéine possède une région riche en Arginies (Arg) située en partie dans la troisième hélice
alpha et dans le domaine C-terminal [237]. Cette région comprend six Arg entre les
positions 73 et 96, qui s’apparente à un domaine de transduction de protéine, ce qui pourrait
expliquer les propriétés de transduction de Vpr [233,234,238,239]. Certaines Arg spécifiques
21
de ce domaine [240-249], ainsi que la phosphorylation du résidu Serine 79 par la protéine
kinase A [250,251], semblent jouer des rôles importants dans certaines fonctions de la
protéine. La troisième hélice alpha possède quant à elle, une région hydrophobe riche en Leu
et Ile, formant un motif s’apparentant à un motif glissière à leucine ou « leucine-zipper »
[252,253]. Cette région pourrait jouer un rôle important dans la stabilisation du cœur
hydrophobe [254], dans l’oligomérisation de la protéine [252,255,256] ainsi que dans
l’interaction de Vpr avec plusieurs facteurs cellulaires, tels VprBP (« Vpr binding protein »)
[257] et le récepteur de glucocorticoïde [258]. Vpr possède également deux signaux de
localisation nucléaire non classiques situés sur la première et la troisième hélice [259-262],
ainsi qu’un signal d’exportation nucléaire situé sur la troisième hélice [236]. Ces motifs
seraient impliqués dans l’habileté qu’a Vpr à faire la navette entre le noyau et le cytoplasme
[236]. Enfin, les résidus impliqués dans l’incorporation de Vpr dans la particule virale
semblent se situer principalement au niveau de la première hélice [227,259,261,263].
N-Terminal
Q65
S79
R80
C-Terminal
© Jonathan Richard, 2013
Figure 5. Structure atomique de la protéine Vpr obtenue par résonance magnétique nucléaire (RMN).
Schéma illustrant la structure de Vpr. La première hélice alpha (cyan) (résidu 17-33), la seconde hélice alpha
(rouge) (résidu 38-50) et la troisième hélice (bleu) sont présentés en forme de ruban, tandis que les domaines
flexibles N-terminal et C-terminal sont présentés par des traits noirs. Les résidus Glutamine 65 (Q65), Arginine
80 (R80) et Sérine 79 (S79) sont également indiqués. (Code pdb (Protein Data Bank) : 1M8L.)
22
Plusieurs évidences suggèrent que cette protéine accessoire jouerait un rôle important
dans la pathogenèse du virus. Par exemple, certaines études antérieures démontrent que la
délétion des gènes vpr et vpx au niveau du VIS est associée à une progression plus lente de la
maladie [264,265]. La notion que Vpr puisse contribuer à la pathogenèse virale fut renforcée
par la constatation de la reconversion du gène vpr muté au type sauvage dans le cas de
chimpanzés infectés par le VIS et d’un sujet humain infecté par le VIH-1 [266]. De plus, des
mutations affectant certaines fonctions de la protéine furent également identifiées au niveau de
patients contrôleurs et asymptomatiques à long terme [240,266-269]. Enfin, Vpr est une
protéine multifonctionnelle qui possède une multitude d’activités biologiques impliquées dans
plusieurs étapes du cycle réplicatif viral, de la pathogenèse et dans l’évasion de la réponse
immunitaire.
2.2 Rôle de Vpr dans le cycle réplicatif viral
L’activité biologique la plus connue de Vpr est sans aucun doute son habileté à induire
un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M, lorsqu’exprimée seule ou lors de l’infection par le
VIH-1 [270-272]. Le fait que cette activité de Vpr soit bien conservée chez tous les lentivirus
infectant les primates [273,274] et que les patients VIH+ affichent un nombre anormal de
cellules en phase G2 [275], suggère que cette activité biologique joue possiblement un rôle
critique dans la pathogenèse du virus. Chose intéressante, les formes soluble [233,234] ou
associée aux particules virales défectives de Vpr [82,83], ont également la capacité d’induire
un arrêt de cycle en G2/M, ce qui laisse croire que Vpr pourrait agir également au niveau des
cellules avoisinantes non infectées. Il est maintenant clair que Vpr induit cet arrêt de cycle via
l’activation de la voie de dommage à l’ADN controlée par la kinase ATR (« ataxia
telangiectasia-mutated and Rad3-related ») (voir figure 6) [275-277]. Bien que certaines
études aient démontré que Vpr puisse également induire l’activation d’une voie de dommage à
l’ADN homologue contrôlée par la kinase ATM (« ataxia telangiectasia-mutated ») via la
formation de cassures double-brin [278,279], ceci ne semble pas être impliqué dans
l’induction d’un arrêt de cycle induit par Vpr [277,280,281]. Chose certaine, l’activation
d’ATR par Vpr conduit à la phosphorylation de plusieurs facteurs cellulaires, tels l’histone
H2AX (histone 2A, variant X), la protéine RPA (« replication protein a ») et la kinase Chk1
(« checkpoint kinase 1 »), ainsi que la formation de foyers de réparation à l’ADN constitués de
23
H2AX phosphorylé ( γ-H2AX), de 53BP1 (« p53 Binding Protein 1 »), de Rad17, de BRCA1
(« breast cancer 1, early onset ») et du complexe 9-1-1 (« Rad9-Hus1-Rad1 ») [275277,281,282]. La kinase Chk1 joue un rôle central dans la modulation du cycle cellulaire via
l’activation de Wee1 et l’inactivation de CD25, ce qui favorise l’inactivation du complexe
Cdc2/CyclinB qui constitue une composante majeure de la transition vers la mitose
[270,272,276,283]. À cet effet, l’inhibition d’ATR ou de Chk1 à l’aide d’inhibiteur ou d’ARN
d’interférence prévient l’induction d’un arrêt de cycle induit par Vpr [276]. De récentes
découvertes ont ensuite permis de mieux comprendre les événements permettant l’activation
de cette voie de signalisation. Ces études démontrent que cette activité de Vpr nécessite le
recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVPRBP, ce qui permet d’induire
la polyubiquitination et la dégradation protéasomale d’un substrat cellulaire inconnu situé sur
la chromatine, ce qui résulterait par l’activation d’ATR [241-247,284]. Bien que l’architecture
du complexe entre Vpr et cette ubiquitine E3 ligase ne soit pas encore entièrement défini, des
études de mutagenèse sur Vpr ont mis en évidence l'existence d'au moins deux domaines
fonctionnels permettant à Vpr de lier le complexe d’ubiquitine E3 ligase et de cibler le substrat
cellulaire au niveau de la chromatine. Tout d’abord le motif riche en Leu, 60-LIRILQQLL-68,
situé sur la troisième hélice alpha de Vpr, semble important pour le recrutement du complexe
d’ubiquitine E3 ligase via une interaction avec VprBP [241-247,257]. De son côté, le domaine
C-terminal riche en Arg semble être aussi nécessaire à cette fonction de Vpr, en permettant
l’association de Vpr à la chromatine et la formation de structures nucléaires mobiles, appelées
foyer de Vpr [235,241,242,246,247,281]. Ces structures mobiles pertmettent à Vpr de
parcourir la chromatine afin d’y cibler son substrat et représentent des événements aussi
précoces que critiques pour l’induction d’un arrêt de cycle par Vpr [235]. À cet effet, des
mutants de Vpr, qui sont incapables de lier VprBP (Vpr Q65R) ou la chromatine (Vpr R80A),
sont également incapables d’induire un arrêt de cycle en G2/M [241]. Bien que le domaine Cterminal soit important pour l’association de Vpr à la chromatine, il n’est pas encore clair s’il
s’agit du domaine de Vpr permettant d’interagir avec le substrat. De plus, il est difficile de
savoir pour l’instant si Vpr lie directement son substrat sur la chromatine ou via un cofacteur
cellulaire. Sans aucun doute, la découverte du substrat cellulaire ciblé par Vpr permettra alors
de répondre à toutes ces questions. Bien que l’activation d’ATR et l’induction d’un arrêt de
cycle représentent des caractéristiques majeures de la protéine Vpr, leur rôle dans la
24
pathogenèse virale reste encore plutôt méconnu. Toutefois, celles-ci semblent être à l’origine
d’autres activités de Vpr, telles son effet transactivateur sur les promoteurs viraux, la
régulation de la traduction et l’induction de l’apoptose.
N
N
DD
P
Vpr
B
Cul
4
A
B1
N
C
C
RO
C1
N
P
Foyer de
Vpr
RPA
7
Rad1
ATR
E2
C
1
P
C
H2AX
9
1
P
53BP1
Foyer de
réparation
BRCA1
?
Vpr
P
Chk1
GADD45α
Inhibition de
la traduction
Transactivation
des LTRs
G2
?
Wee1
cd25
P
cdc2
cdc2
cyclin B
Actif
cyclin B
Inactif
M
Bax
Apoptose
© Jonathan Richard, 2013
Figure 6. Activation de la voie de dommage à l’ADN ATR par Vpr.
Le domaine C-terminal de Vpr lui permet de lier la chromatine et de former des structures nucléaires mobiles
(foyers de Vpr), tandis qu’un motif situé sur sa troisième hélice lui permet de recruter le complexe E3 ligase
DDB1-CUL4AVprBP. Ceci permet à Vpr de parcourir la chromatine afin de cibler et d’induire la
polyubiquitination et la dégradation protéasomale d’un substrat cellulaire encore inconnu, ce qui active ATR.
Cette activation d’ATR conduit à la phosphorylation de plusieurs facteurs cellulaires (H2AX, RPA, Chk1,
BRCA1) ainsi qu’à la formation de foyers de réparation à l’ADN (γ-H2AX, 53BP1, Rad17, BRCA1, 9-1-1). La
phosphorylation de Chk1 et de BRCA1 permet notamment l’activation de voies de signalisation induisant
l’induction d’un arrêt de cycle en G2/M ainsi que l’apoptose, respectivement. L’induction d’un arrêt de cycle
permet à Vpr de jouer un rôle transactivateur au niveau des LTRs ainsi que d’inhiber la traduction cellulaire. Les
flèches vertes représentent une action d’activation tandis que les flèches rouges, une action d’inhibition.
Cependant, le lien entre GADD45α et Bax n’est pas encore connu.
25
L’une des premières fonctions attribuée à Vpr fut son effet transactivateur au niveau
des promoteurs viraux (LTR) ainsi que certains promoteurs cellulaires [225,285]. Notamment,
Vpr favoriserait la transcription d’ADN viral non intégré ou préintégré [286,287]. Cette
activité de Vpr serait surtout la conséquence de l’induction d’un arrêt du cycle en G2,
puisqu’une augmentation de l’activité transcriptionnelle des LTRs est observée à cette phase
au niveau de cellules infectées synchronisées ou exprimant Vpr [82,266,288,289]. Toutefois,
certaines études suggèrent que Vpr pourrait également favoriser la transcription des LTRs en
agissant directement au niveau des facteurs de transcription SP1 (« Specificity Protein 1 »)
[290] et TFIIB (« Transcription factor IIB ») [291], ainsi que la protéine coactivatrice
transcriptionnelle p300 (E1A-binding protein 300) [292] et du récepteur de glucocorticoïde
[258,293,294]. En plus de réguler la transcription, une récente étude démontre que le virus
régule négativement la traduction des protéines cellulaires au niveau des lymphocytes T, par
un mécanisme qui est dépendant de l’induction d’un arrêt de cycle en G2/M par Vpr et d’une
diminution des formes actives du facteur d’initiation de la traduction eIF4E [295]. Ceci
favoriserait alors la traduction des protéines virales qui est indépendante de eIF4E [295].
Il est suggéré que Vpr favorise légèrement l’infection des cellules T, mais ce
phénomène semble surtout attribuable à son effet transactivateur au niveau des LTRs
[285,296]. Vpr favorise également l’infection de cellules qui ne se divisent pas, comme les
macrophages. Cette activité pourrait dépendre de la capacité de Vpr associé aux virions, à
promouvoir le transport du CPI vers le noyau [249,261,297,298]. Cette activité, associée à la
fois à Vpr et Vpx, l’analogue de Vpr chez le VIS/VIH-2, fut tout d’abord attribuable aux
signaux de localisation nucléaires que ces deux protéines possèdent [299]. Cependant, des
études suggèrent que ces signaux de localisation nucléaire seraient facultatifs à l’infection de
cellules qui ne se divisent pas, tels les macrophages [300,301]. Récemment, il fut démontré
que Vpx favorise l’infection des macrophages et des DC en contrant le facteur de
restriction SAMHD1 [302,303]. Pour ce faire, Vpx recrute, tout comme Vpr, le
complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVPRBP afin d’induire la polyubiquitination et la
dégradation de SAMHD1. Bien que Vpr soit incapable de contrer SAMHD1, il est maintenant
concevable de croire que Vpr pourrait toutefois favoriser l’infection des cellules qui ne se
divisent pas, par la destruction d’un autre facteur de restriction via un mécanisme similaire.
26
Vpr est aussi connu pour induire l’apoptose des cellules lorsqu’exprimée seule ou lors
de l’infection. À vrai dire, cette activité de Vpr semble être une conséquence du prolongement
de l’induction d’un arrêt de cycle induit par Vpr [82,282,304-309]. Vpr favorise l’apoptose via
l’activation d’ATR et la phosphorylation de l’un de ces substrats BRCA1[282,304]. Ceci
conduit ensuite à une régulation positive de GADD45α (« Growth Arrest and DNA Damage
inducible, alpha ») et à l’induction de l’apoptose via une perméabilisation de la membrane
mitochondriale médiée par la protéine proapoptotique Bax [282,304] (figure 6). Néanmoins,
le lien entre GADD45α et Bax reste inconnu. Les macrophages seraient réfractaires à
l’apoptose induite par Vpr, puisqu’il n’exprime pas ATR [275]. Cependant, certaines études
tendent à démontrer que Vpr pourrait aussi promouvoir l’apoptose indépendamment de son
habileté à induire un arrêt de cycle en G2/M [256,310-312]. Il est donc suggéré que Vpr
pourrait induire l’apoptose via une interaction avec la protéine mitochondriale ANT (« adenine
nucleotide translocator »), ce qui conduirait à la perméabilisation de la membrane
mitochondriale et la libération de protéine proapoptotique tel le cytochrome C [256,312].
Chose importante, Vpr, sous forme soluble ou associée aux virions, est également capable
d’induire l’apoptose des cellules, ce qui suggère que Vpr pourrait participer à la mort de
lymphocytes T CD4+ non infectés [82,233,313]
Outre ces activités, Vpr augmente également l’efficacité de l’étape de transcription
inverse via une interaction spécifique avec l’enzyme uracile glycosylase UNG2 (« uracil-Nglycosylase ») [314]. UNG2 est une enzyme de réparation de l’ADN cellulaire qui retire
spécifiquement les uraciles de l’ADN cellulaire [315]. Il a été suggéré que Vpr recrute UNG2
au niveau de la particule virale afin de protéger l’ADN viral de mauvaise incorporation
d’uracile lors de la transcription inverse, ce qui augmenterait la fidélité du processus de
transcription inverse et l’infectivité du virus [316-318]. À cet effet, le taux de mutation au
niveau du génome viral est grandement augmenté en absence de Vpr [316-318]. Toutefois,
cette activité de Vpr reste controversée puisque d’autres études suggèrent que Vpr pourrait, au
contraire, augmenter la dégradation d’UNG2 et de SMUG1, une autre uracile glycosylase, et
ainsi prévenir leur incorporation au niveau des virions [319-321]. Ceci augmenterait
l’infectivité du virus, puisque ces uraciles gycosylases semblent augmenter l’activité antivirale
d’APOBEC3G [320] en plus de réguler négativement la transcription des LTRs [322]. Pour ce
27
faire, Vpr semble principalement augmenter l’interaction entre UNG2/SMUG1 et le
complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVPRBP , ce qui augmente la polyubiquitination
et la dégradation de ces facteurs cellulaires [321]. Cependant l’interaction entre Vpr et UNG2
n’est aucunement impliquée dans l’induction d’un arrêt de cycle induit par Vpr [323].
2.3 Modulation de la réponse immunitaire
En plus d’agir sur différentes étapes du cycle réplicatif, il devient de plus en plus
évident que Vpr participe également à la modulation de la réponse immunitaire. La preuve
tangible de la participation de Vpr dans l’évasion de la réponse immunitaire découle d’études
démontrant que Vpr réduit l’efficacité de vaccination in vivo, en affectant la réponse
immunitaire médiée par les lymphocytes T CD8+ [324,325]. À vrai dire, Vpr semble
promouvoir une réponse cellulaire des lymphocytes T auxiliaires de type 2, qui favorise une
réponse humorale, au détriment d’une réponse de type 1, qui favorise une réponse cellulaire
notamment via une régulation négative de la production d’IFN-γ [324] . Dans ce même ordre
d’idée, des études in vitro confirment que Vpr supprime sélectivement la production de
cytokines de type 1, comme l’IL-12 et augmente plutôt la production d’IL-6, une cytokine
favorisant une réponse de type 2 [326,327]. Par ailleurs, plusieurs évidences suggèrent que
Vpr réduit la réponse cellulaire en affectant l’activation des cellules T initiée par la
présentation d’antigènes. Pour ce faire, Vpr semble agir tant au niveau des cellules T que les
cellules présentatrice d’antigènes. Tout d’abord, Vpr affecte l’activation des cellules T via une
régulation négative de CD28 et une régulation positive de CTLA-4 [328]. De plus, il
semblerait que Vpr diminue l’activation et la maturation des macrophages ainsi que des DC,
en inhibant l’expression de plusieurs molécules costimulatrices clés telles CD40, CD80, CD83
et CD86 [326,329]. Vpr pourrait également réduire la réponse cellulaire en induisant
l’apoptose des cellules T infectées et non infectées via ses formes solubles et associées à des
virions non infectieux [330]. Enfin, il est suggéré que Vpr puisse induire l’apoptose des
lymphocytes T CD8+ en augmentant la production de TNF-α par les DC [331].
De nombreuses études suggèrent qu’une partie de la modulation de la réponse
immunitaire par Vpr serait dépendante de l’inhibition de la voie de signalisation NFκ-B par un
28
mécanisme impliquant le récepteur de glucocorticoïde. Ces études démontrent notamment que
Vpr diminue la production de plusieurs cytokines qui sont dépendantes NFκ-B telles IL-2, IL12, IL-4 ainsi que certaines chimiokines telles MIP-1α (« macrophage inflammatory protein1α »), MIP- 1β, RANTES (« regulated and normal T cell expressed and secreted »), ce qui
participe à une augmentation de la réplication virale [332-334].
En outre, Vpr module
également l’activité du système immunitaire inné. En effet, Vpr semble diminuer les fonctions
effectrices des cellules NK à long terme, notamment en augmentant la production de TGF-β et
en réduisant la production d’IL-12 par les macrophages infectés [335]. De plus, Vpr sous
forme soluble semble altérer la production d’IFN de type 1 par les DC plasmacytoïdes, ce qui
perturbe l’interaction entre celle-ci et les cellules NK et participe à la réduction de la
production d’IFN-γ par les cellules NK [336].
Tel que décrit dans la section précédente, Vpr induit un arrêt de cycle en G2/M via
l’activation de la voie de dommage à l’ADN médiée par la kinase ATR. Les voies de
dommage à l’ADN son normalement impliquées dans la régulation du cycle cellulaire et de
mécanismes de réparation de l’ADN. Toutefois, une récente étude démontre qu’elles stimulent
également une réponse du système immunitaire via une activation des fonctions effectrices des
cellules NK. En effet, cette étude démontre que, dans le contexte d’une accumulation de
dommages à l’ADN suite à des traitements avec des agents génotoxiques, l’activation des
voies de dommages à l’ADN contrôlées par les kinases ATR et ATM conduit à l’expression, à
la surface cellulaire, de ligands spécifiques du récepteur activateur NKG2D, exprimés par les
cellules NK [337]. La reconnaissance de ces ligands par le récepteur NKG2D déclenche alors
les fonctions cytolytiques des cellules NK et subséquemment la lyse de la cellule cible [337].
Il s’agit d’une découverte majeure qui identifie un nouveau mécanisme par lequel ces voies de
dommages à l’ADN permettent d’alerter le système immunitaire de la présence de cellules
potentiellement dangereuses arborant des dommages à l’ADN. Puisque Vpr active la voie de
dommage à l’ADN ATR, il est concevable que cette protéine virale puisse alors moduler
l’activité des cellules NK de la même façon lors de l’infection par le VIH-1.
29
3. LES CELLULES NK
3.1 Généralités
Les cellules NK sont de grands lymphocytes granuleux appartenant au système
immunitaire inné au même titre que les mastocytes, éosinophiles et basophiles. Tout comme
les autres cellules hématopoïétiques, ces lymphocytes sont issus de cellules progénitrices de la
moelle osseuse. Ces cellules se développent et se différencient majoritairement au niveau de
la moelle osseuse, bien qu’un certain nombre de cellules NK puissent le faire également au
niveau du thymus, de la rate, des amygdales et des ganglions lymphatiques, avant d’entrer
dans la circulation sanguine [340]. Le processus de maturation nécessite notamment la
présentation par les cellules stromales, d’IL-15, ce qui permet la transition vers une
différenciation en cellules NK, puis la présentation de HLA, permettant à la cellule d’acquérir
son potentiel cytolytique [341]. Les cellules NK se distinguent des cellules T et B par
l’absence de récepteur nécessitant une recombinaison somatique tels le TCR ou le récepteur
des cellules B (BCR) [342]. Toutefois, de récentes évidences suggèrent que tout comme les
cellules B et T, les cellules NK reçoivent une éducation spécifique lors de leur développement,
possèdent des récepteurs spécifiques à certains antigènes, subissent une expansion clonale au
cours d’infections et génèrent des cellules mémoire à long terme. [338] Les cellules NK
représentent la première ligne de défense contre les infections virales et jouent un rôle
important dans l’immunosurveillance contre les cancers. Ces cellules produisent une multitude
de cytokines pro-inflammatoires et possèdent des fonctions effectrices qui s’apparentent à
celle des lymphocytes T CD8+. L’importance des cellules NK dans la réponse immunitaire
contre les infections virales fut révélée par le cas d’une jeune patiente atteinte d’une rare
maladie qui est caractérisé par une absence complète des cellules NK. Celle-ci souffrait alors
d’une infection chronique aux virus de l’herpès [343].
3.2 Profil phénotypique
Phénotypiquement,
les
cellules
NK
sont
définies
comme
des
cellules CD3-
CD56+CD16+CD14-CD19-NKp46+ [344]. Bien qu’elles partagent plusieurs marqueurs de
surface, les cellules NK diffèrent alors des cellules NKT qui expriment la molécule CD3 ainsi
qu’un TCR. Les cellules NK représentent 5 à 15 % des cellules de la circulation sanguine et
30
peuvent être divisées en deux sous-populations basées sur le niveau d’expression des
marqueurs CD56 et CD16 [345]. La première population CD56hautCD16- exprime faiblement
les récepteurs KIR, mais exprime des niveaux élevés de plusieurs récepteurs de cytokines tels
IL-1, IL-2, IL-15 et IL-18. Ces cellules sont très peu cytolytiques, mais elles ont la capacité de
produire une grande quantité de cytokine pro-inflammatoires suite à leur activation. La
seconde sous-population, les cellules NK CD56basCD16+ produisent très peu de cytokine,
mais expriment constitutivement les récepteurs KIR en plus de contenir de grande quantité de
granzymes et de perforines, ce qui leur permet d’avoir un plus grand potentiel cytolytique
[346,347]. Une autre particularité de ces cellules est l’expression de la molécule CD16, qui
représente un récepteur de faible affinité pour la région constante Fc de la molécule d'IgG
[348], ce qui leur permet d’avoir une activité de cytotoxicité cellulaire dépendante des
anticorps (CCDA) [349-351]. Les cellules CD56hautCD16- expriment les récepteurs de
chimiokines CCR7 (CC de type 5), CXCR3 (CXC de type 3) et la L-selectine (CD62L), ce qui
permet une migration vers les organes lymphoïdes secondaires, tandis que les cellules
NK CD56basCD16+ expriment plutôt le récepteur de chimiokine CXCR1 (CXC de type 1), ce
qui leur permet de migrer vers les tissus inflammés [352,353]. À cet effet, les cellules
NK CD56basCD16+ représentent la grande majorité des cellules NK de la circulation sanguine,
tandis que les cellules NK CD56hautCD16- sont plutôt majoritaires au niveau des organes
lymphoïdes
secondaires
[354].
Certaines
études
tendent
à
démontrer
que
les
cellules CD56hautCD16- représentent une forme immature des cellules NK CD56basCD16+. À
cet effet, les cellules NK CD56hautCD16- possèdent de plus grands télomères et une
différenciation de cellules NK CD56hautCD16- en CD56basCD16+ est possible in vitro
[355,356]. De plus, une étude de Juelke et ses collaborateurs, semble démontrer qu’une
population de cellules NK définie comme CD56basCD16+CD62L+ pourrait alors représenter
une population intermédiaire entre ces deux populations [357]. Ces cellules NK
polyfonctionnelles combineraient alors les fonctions cytolytiques et de production de
cytokines des deux sous-populations, en plus de pouvoir migrer vers les ganglions
lymphatiques [357].
31
3.3 Fonctions et activation des cellules NK
Les cellules NK furent originalement décrites comme des cellules effectrices
cytotoxiques capables de tuer des cellules tumorales ou infectées sans aucune immunisation.
Elles induisent la mort de la cellule cible majoritairement via le relargage de granules
contenant des molécules cytolytiques (perforines et granzymes), un processus appelé
dégranulation. Ces molécules sont libérées à l’intérieur de la synapse immunologique à la
surface de la cellule cible. Les perforines forment des pores dans la membrane plasmique,
tandis que les granzymes, des protéines de la famille des sérines protéases, induisent ensuite
l’apoptose de la cellule via l’activation de la voie des caspases [358]. La dégranulation est
induite suite à la reconnaissance de cellules cibles exprimant des ligands de récepteurs
activateurs (cytotoxicité cellulaire naturelle) ou recouverte d’anticorps (CCDA). De plus, les
cellules NK peuvent également induire l’apoptose des cellules cibles via l’expression de
ligands associés à des récepteurs cytotoxiques comme le ligand Fas, la cytokine TRAIL
(« TNF-related apoptosis-inducing ligand ») ou bien du TNF-α membranaire [359-361]. Elles
agissent également comme d’importantes cellules immunorégulatrices via la production d’une
multitude de cytokines et chimiokines, tels TNF-α, GM-CSF (« granulocyte macrophage
colony-stimulating factor »), IL-5, IL-13, IL-10, TGF-β, MIP-1α, MIP-1β, RANTES et IFN-γ
[362]. Notamment, cette production variée de cytokines et chimiokines permet aux cellules
NK de promouvoir une réponse cellulaire de type-1, la différentiation et l’activation des
macrophages et des DC ainsi que l’induction de mécanismes antiviraux au niveau des cellules
de l’hôte [344,363]. Notamment, les cellules NK peuvent promouvoir le développement d’une
réponse immunitaire adaptative grâce à une interaction bidirectionnelle avec les DC. Celle-ci
produisent de l’IL-15 et de l’IFN-α, ce qui active les cellules NK, qui sécrètent ensuite des
cytokines (IFN-γ et TNF-α) induisant l’activation et la maturation de DC chargées
d’antigènes, ce qui participe à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative [364]. Par
ailleurs, les cellules NK ont également la capacité de stimuler la présentation antigénique via
la destruction de cellules cibles, mais également en éliminant les DC immatures via le
récepteur NKp30 [363]. Les cellules NK peuvent être stimulées de plusieurs façons. Plusieurs
cytokines produites par les macrophages et les DC comme IFN-α/β, IL-2, IL-15 et IL-21
32
peuvent induire leur activation. De plus, les cellules NK expriment également plusieurs TLRs
(TLR2-9) ce qui leur permet d’être activées via la reconnaissance de certaine protéines virales
et acides nucléiques viraux [365-368]. Finalement, les fonctions effectrices des cellules NK
sont principalement régulées par une multitude de récepteurs activateurs et inhibiteurs qui
reconnaissent différentes protéines lors de la reconnaissance de cellules cibles.
3.4 Reconnaissance des cellules cibles
Initialement, le mécanisme régulant la reconnaissance des cellules cibles fut tout d’abord
décrite comme dépendant principalement de la présence ou l’absence des molécules du CMHI. Selon la théorie initiale appelée « missing-selft », les cellules NK assuraient une surveillance
et une destruction des cellules qui présentaient une perte de l’expression des molécules du
CMH I, un phénomène souvent observé dans un contexte de transformation cellulaire ou au
cours d’infections virales ou bactériennes [369,370]. Toutefois, cette théorie fut revisitée à
travers les années. Maintenant, il semble clair que les fonctions effectrices des cellules NK
sont finement régulées par une grande variété de récepteurs inhibiteurs et activateurs [349].
Ces récepteurs reconnaissent alors différents déterminants à la surface des cellules cibles et
transmettent des signaux d’inhibition et d’activation à la cellule NK. Les récepteurs inhibiteurs
reconnaissent majoritairement les molécules de CMH-I, tandis que les récepteurs activateurs, à
l’exception de CD16, vont reconnaître des molécules de surfaces qui sont induites à la suite
d’une infection virale, d’un stress cellulaire ou d’une transformation néoplasique. C’est
justement la balance entre ces signaux d’inhibition et d’activation transmis par ces récepteurs
qui dicte l’activité de la cellule NK et détermine si la cellule cible sera ou non détruite
(figure 7).
Les cellules NK patrouillent à la recherche de cellules anormales exprimant
faiblement les molécules de CMH-I et/ou fortement les ligands de récepteurs activateurs.
Contrairement à l’hypothèse initiale, les récepteurs inhibiteurs servent alors de rhéostat en
amortissant les signaux transmis par les récepteurs activateurs.
3.5 La transmission du signal.
La transmission des signaux d’activation et d’inhibition est médiée par des séquences
conservées à l’intérieur des domaines cytoplasmiques de ces récepteurs ou de leurs protéines
adaptatrices associées [344,349,371,372]. Les récepteurs inhibiteurs possèdent donc une à
33
deux copies d’une séquence consensus Ile/Val/Ser-x-Tyr-x-x-Leu/Val au niveau de leur queue
cytoplasmique. Il s’agit d’un motif appelé ITIM (« immunoreceptor tyrosine-based inhibitory
motif ») qui fut décrit pour la première fois au niveau du récepteur Fc des cellules B et qui est
responsable de transmettre un signal d’inhibition suite à une liaison avec des
immunoglobulines [373]. À la suite d’une liaison avec son ligand, le résidu Tyr de ce motif est
alors phosphorylé par une kinase de la famille Src, ce qui permet le recrutement de différentes
phosphatases via leur domaine SH2. Selon le récepteur, les phosphatases SHP-1 (« SH2containing protein-tyrosine phosphatase-1 »), SHP-2 ou SHIP (« SH2-containing inositol
polyphosphate 5-phosphatase ») sont alors recrutées. Le déplacement de ces phosphatases au
niveau de la membrane entraîne une diminution de la phosphorylation de nombreux
médiateurs intracellulaires comme Zap70, Syk, PLCγ1, PLCγ2, Shc, LAT, SLP76 et Vav-1,
Lck, ainsi qu’une inhibition de l’afflux calcique, ce qui prévient une activation des fonctions
effectrices de cellules NK[344,349,371,372] . Les récepteurs activateurs s’associent plutôt
avec des protéines adaptatrices intracellulaires possédant un motif d’activation ITAM
(« immunoreceptor tyrosine-based activation motif ») afin de transmettre leur signal
d’activation. Ce motif est défini par la séquence consensus Asp/Glu-x-x-Leu/Ile-x6-8Tyr-x-xLeu/Ile [374]. Les protéines adaptatrices contenant ce motif et retrouvées chez les cellules NK
humaines sont DAP12 (« DNAX activation protein of 12 kDa »), CD3ζ et FcεRIγ [375-377].
À la suite de la liaison avec le ligand, il y a phosphorylation des résidus Tyr du motif ITAM,
ce qui permet le recrutement des tyrosines kinases Syk et Zap70 via leur domaine SH2. Ces
tyrosines kinases sont ensuite à l’origine de voie de signalisation menant à la production d’un
influx calcique, à la dégranulation ainsi qu’à la transcription des gènes de cytokines et de
chimiokines [344,349,371,372].
3.6 Les récepteurs.
Voici une description des récepteurs majeurs régulant les fonctions effectrices des cellules
NK humaines et/ou nécessaires à la compréhension de ma thèse.
34
Cellules NK
Cellules cibles
Récepteur
inhibiteur
ITIM
Y
Y
Pas de CMH-1
Pas de ligands
d’activation
Y Y
Y Y
ITAM
Protéine
adaptatrice
PAS DE LYSE
Récepteur
activateur
ITIM
Y
Y
SHP-1
SHP-2
SHIP
P
P
CMH-1
-
Pas de ligands
d’activation
PAS DE LYSE
Y Y
Y Y
ITAM
Perforines et
granzymes
ITIM
Y
Y
Pas de CMH-1
ligands
d’activation
Syk
Zap70
+
P
LYSE
P
Y Y
Y Y
ITAM
ITIM
Y
Y
SHP-1
SHP-2
SHIP
P
P
+
CMH-1
Syk
Zap70
P
ligands
d’activation
SELON LA
BALANCE DES
SIGNAUX
P
Y Y
Y Y
ITAM
© Jonathan Richard, 2013
Figure 7. Reconnaissance des cellules cibles par les cellules NK.
Les fonctions effectrices des cellules NK sont finement régulées par un arsenal de récepteurs activateurs et
inhibiteurs. Les récepteurs inhibiteurs reconnaissent majoritairement les molécules de CMH-I, tandis que les
récepteurs activateurs vont majoritairement reconnaître des molécules de surfaces qui sont induites suite à une
infection virale, un stress cellulaire ou une transformation néoplasique. Les signaux transmis par ces récepteurs
sont médiés par des séquences conservées à l'intérieur des domaines cytoplasmiques de ces récepteurs ou de leurs
protéines adaptatrices associées. C’est la balance entre ces signaux d’inhibition et d’activation transmis par ces
récepteurs qui dicte l’activité de la cellule NK et détermine si la cellule cible sera ou non détruite.
35
3.6.1 Les récepteurs inhibiteurs
3.6.1.1 Les récepteurs KIR.
La famille des récepteurs KIR (« Killer Immunoglobuline-like Receptors »), qui
appartiennent à la superfamille des Immunoglobulines, est formée de 14 récepteurs
déclenchant des signaux d’inhibition (3DL1-3, 2DL1-3 et 2DL5), d’activation (3DS1, 2DS15) ou les deux (2DL4). Il s’agit de glycoprotéines transmembranaires de type 1, possédant
deux ou trois domaines immunoglubulines (Ig) extracellulaires [378], ainsi qu’une partie
cytoplasmique variant en longueur qui détermine leur fonction. En effet, les récepteurs KIR
inhibiteurs possèdent une queue cytoplasmique longue contenant un à deux motifs ITIM
[379,380], tandis que les récepteurs KIR activateurs possèdent plutôt une queue cytoplasmique
courte qui s’associe avec la protéine adaptatrice DAP12 possédant des motifs ITAM [381].
Seul le récepteur KIR2DL4 s’associe avec la chaine FcεRIγ, en plus de contenir un motif
ITIM. Le nom de chacun de ces récepteurs dépend du nombre de domaines Ig extracellulaires
(2D ou 3D), de la longueur de leur queue cytoplasmique (L :longue ou S :courte) et du nombre
de gènes codant pour un récepteur ayant cette structure. La distribution et le nombre de gènes
KIR diffèrent pour chaque individu. Il existe pas moins d’une trentaine d’haplotypes
caractérisés et classés en deux groupes d’haplotypes (A et B) [382]. De plus, chaque gène KIR
démontre un polymorphisme allélique considérable. À cet effet, les récepteurs inhibiteurs
démontrent un plus grand polymorphisme que les récepteurs activateurs [383]. Les récepteurs
KIR lient spécifiquement les molécules HLA-A, B, C et G, en plus de reconnaître le
polymorphisme de ces molécules. Toutefois, le groupe HLA-C représente le groupe dominant
fournissant le plus grand nombre de ligands pour les récepteurs KIR [383]. L’affinité du
récepteur pour son ligand varie selon les différents récepteurs KIR. Notamment, les KIR
activateurs possèdent une affinité beaucoup plus faible que leurs correspondants inhibiteurs.
Ceci pourrait résulter d’une évolution des récepteurs visant à diminuer les risques d’autoimmunité. Outre les fonctions de récepteur inhibiteur, plusieurs études démontrent que les
récepteurs KIR jouent un rôle critique dans le développement et la maturation des cellules NK
[384-387]. En effet, selon ces études, l’expression des récepteurs inhibiteurs KIR et
l’interaction avec les HLA semble être nécessaire à l’acquisition du potentiel cytolytique des
cellules NK via un processus appelé « licence » (« licensing ») ou « éducation ». Selon ces
36
modèles, l’interaction entre les récepteurs KIR inhibiteurs et les HLA durant le
développement, transmet un signal positif nécessaire à l’acquisition du potentiel cytolytique et
qui permet à la cellule NK de distinguer entre les cellules du soi et les cellules qui présentent
une perte de l’expression des HLA [385,387]. Les cellules NK qui n’expriment pas de
récepteurs inhibiteurs demeurent alors immatures ou inertes puisqu’elles n’ont pas reçu ce
signal [387]. Selon d’autres modèles appelés « armement » (« arming ») ou « réglage »
(« tuning »), un signal inhibiteur dominant lors du développement permet « l’armement » des
cellules NK, tandis l’absence de ce signal et/ou une activation soutenue des cellules NK
amènent au « désarmement » ou l’atténuation des fonctions de celle-ci [384,388].
3.6.1.2 Les récepteurs CD94-NKG2
Les récepteurs de la famille CD94-NKG2 (« Natural Killer Group 2 ») sont des
protéines transmembranaires de type II de la famille des lectines de type C. Ils sont exprimés à
la surface cellulaire en hétérodimère avec la protéine CD94 [349,371]. Celle-ci ne possède pas
de queue cytoplasmique permettant une transmission de signal, mais semble toutefois
nécessaire à l’expression de surface des récepteurs CD94-NKG2. Cette famille contient les
récepteurs
activateurs CD94-NKG2C
et
CD94-NKG2E
ainsi
que
le
récepteur
inhibiteur CD94-NKG2A. Le récepteur CD94-NKG2C s’associe avec la protéine adaptatrice
DAP12 [389] tandis que CD94-NKG2A possède deux motifs ITIM afin de transmettre son
signal d’inhibition [390,391]. CD94-NKG2E est également considéré comme récepteur
activateur, mais il ne s’associe pas avec DAP12 [349]. Comparativement au KIR, ces
récepteurs affichent très peu de polymorphisme et les variations alléliques n’affectent que très
peu leur fonction [392].
Les récepteurs CD94-NKG2 reconnaissent les molécules non
classiques HLA-E [393], qui ont la particularité de lier un peptide qui dérive de la séquence
signal des autres HLA [394,395]. Alors, le peptide présenté par HLA-E reflète l’expression
des autres HLA. Cette reconnaissance de HLA-E permet donc aux cellules NK de contrôler les
niveaux de tous les HLA présent sur la cellule cible. Comme c’est le cas avec les récepteurs
KIR, le récepteur inhibiteur CD94-NKG2A semble lié avec plus d’affinité HLA-E que CD94NKG2C [396].
37
3.6.1.3 Les récepteurs LIR
La famille de récepteurs LIR (« Leukocyte Ig-like Receptor ») aussi connus sous les
termes LILR, ITL ou CD85, est constituée de récepteurs possédant différent domaines Ig
extracellulaires ainsi qu’une partie cytoplasmique pouvant contenir ou pas des motifs ITIM
[397]. Ces récepteurs sont majoritairement exprimés par les monocytes, les macrophages, les
DC et certains types de cellules B et T. Seul le récepteur ILT-2 est exprimé par les cellules
NK. Il s’agit d’une glycoprotéine avec 4 domaines Ig extracellulaires et une partie
cytoplasmique contenant 4 motifs ITIM [398]. Il lie avec une faible affinité une région
conservée du domaine α3 de tous les HLA (HLA-A, B, C, E, F, G) [398,399]. Bien que ILT2
puisse inhiber certaines fonctions effectrices des cellules NK suite à la liaison avec son ligand
[400], son rôle semble plutôt accessoire comparativement aux récepteurs KIR et
CD94/NKG2A qui assurent le rôle dominant dans le contrôle de la réponse des cellules NK.
Outre ces trois récepteurs inhibiteurs liant les HLA, il existe également des récepteurs
possédant des motifs ITIM et liant d’autres protéines cellulaires, comme les récepteurs de la
famille des lectines KLR1 et NKR-P1 liant les membres de la famille des cadhérines et la
molécule LLT-1 (Lectin Like Transcript-1), respectivement [401]. De plus, certaines cellules
NK expriment des récepteurs inhibiteurs liant l’acide sialique tel Siglec-7 et Siglec-9 [401].
3.6.2 Les récepteurs activateurs
3.6.2.1 Les récepteurs naturels de cytotoxicités
La famille des récepteurs naturels de cytotoxicités (NCR : « Natural Cytotoxicity
Receptors ») comprend les récepteurs NKp30, NKp44, NKp46 et NKp80 [402]. Ces
récepteurs sont reconnus pour induire les fonctions cytolytiques et la production d’IFN-γ par
les cellules NK. À l’origine, NKp30, NKp44 et NKp46 furent identifiés basés sur leur rôle
dans l’activité anti-tumorale des cellules NK [403]. Il s’agit de protéines appartenant à la
superfamille des Immunoglobulines qui ont une très faible homologie entre elles. Les
récepteurs NKp30, NKp46 et NKp80 sont exprimés constitutivement, tandis que NKp44 est
exprimé au niveau de cellules NK stimulées à l’IL-2 [404,405]. Ces récepteurs s’associent
avec différentes protéines adaptatrices afin de transmettre un signal d’activation, tels un
homodimère CD3ζ/CD3ζ
(NKp30)[406],
DAP12
38
(NKp44)
[404]
ou
un
hétérodimère CD3ζ/FcεRIγ (NKp46) [404]. Pour sa part, NKp80 forme plutôt un homodimère
transmettant un signal d’activation via un motif ITAM atypique [407]. Les ligands de ces
récepteurs restent encore plutôt méconnus. Certaines protéines virales comme les molécules
d’hémagglutinine
et
d’hémagglutinine-neuraminidase
des
virus
de
l’influenza,
du
parainfluenza et de Sendai, serviraient de ligand à NKp46 et NKp44 [408,409]. De plus,
certaines protéines cellulaires comme le sulfate d’héparane (NKp30 et NKp46) et la lectine
AICL (« activated-induced C-type Lectin »)(NKp80), représentent aussi de possibles ligands
[410,411]. Chose certaine, ces récepteurs semblent jouer un rôle critique dans la réponse
immunitaire antivirale, comme le démontrent les différentes stratégies d’évasion utilisées par
les virus. En effet, les protéines Nef du VIH-1 et K5 du virus de l’herpes associé au sarcome
de Kaposi (VHSK) diminuent respectivement les niveaux de surface de ligand de NKp44 et
NKp80, tandis que la protéine pp65 du cytomégalovirus humain (CMVH) induit la
dissociation du complexe NKp30/CD3ζ [175,412,413].
3.6.2.2 DNAM-1
Le récepteur activateur DNAM-1 (« DNAX accessory molecule-1 ») est un membre de
la superfamille des Immunoglobulines, qui est exprimé constitutivement par environ 50 % des
cellules NK [414]. Les ligands de ce récepteur incluent PVR (« Polio virus receptor ») et
Nectin-2, deux protéines surexprimées par certaines cellules tumorales, ce qui implique
DNAM-1 dans l’activité anti-tumorale des cellules NK [415-417]. L’interaction entre DNAM1 et ces ligands participe à l’activation des fonctions cytolytiques et la production de cytokine
par les cellules NK. DNAM-1 s’associe aussi avec la molécule d’adhésion LFA-1
(« lymphocyte function-associated molecule-1 ») à la surface des cellules NK et cette
association est nécessaire pour son activité fonctionnelle. Cette liaison favorise la
phosphorylation des résidus Tyr de la queue cytoplasmique de DNAM-1 lors de la liaison avec
ces ligands et permet la transmission d’un signal d’activation [418,419]. Cette association avec
LFA-1 pourrait participer également à stabiliser l’interaction entre la cellule NK et la cellule
cible [420].
3.6.2.3 Les récepteurs SLAM
Les cellules NK expriment trois récepteurs de la famille SLAM (« signaling
39
lymphocytic activation molecule ») : CRACC (« CD2-like receptor activating cytotoxic
cells »), NTB-A (« NK, T and B cell antigen ») et 2B4 [421-423]. À l’exception de 2B4 qui lie
la molécule CD48, les autres récepteurs de cette famille transmettent plutôt leur signal par des
interactions homotypiques. Ces récepteurs possèdent des séquences consensus Thr-x-Tyr-x-xLeu/Ile dans leur partie cytoplasmique, appelé ITSM (« immunoreceptor tyrosine-based
switch motif »). Suite à la liaison avec le ligand, les résidus Tyr du motif ITSM sont
phosphorylés, ce qui permet le recrutement des protéines de la famille SAP (« SLAMassociated protein ») qui comprend SAP et EAT-2 (« Ewing’s sarcoma-activated transcript2 ») [424-428]. Ces protéines adaptatrices permettent alors la transmission d’un signal
d’activation. Dans le cas de SAP, celle-ci recrute la kinase Fyn, ce qui permet la
phosphorylation subséquente de plusieurs protéines en aval, comme la phospholipase C-γ et
Vav-1 [421,423,429]. Dans le cas de EAT-2 les protéines impliquées dans la transmission du
signal restent plutôt méconnues, mais une étude suggère le possible recrutement de la
phospholipase C-γ par EAT-2[430]. Tandis que 2B4 et NTB-A s’associent avec ces deux
protéines, CRACC ne s’associe qu’avec EAT-2 [431,432]. L’utilisation de cellules humaines
[433-436] ou de modèle de souris [437,438] déficiente pour ces protéines adaptatrice, a permis
de démontrer l’importance de celle-ci dans l’activité des récepteurs SLAM. En effet, bien que
ces récepteurs démontrent normalement des fonctions activatrices, en absence de SAP ou de
SAP et EAT-2, ils inhibent plutôt les fonctions effectrices des cellules NK. Chez l’homme, les
récepteurs NTB-A et 2B4 semblent agir comme corécepteurs au niveau des cellules NK
naïves. En effet, des expériences de lyse et/ou de dégranulation redirigée démontrent que
l’activation seule, de l’un ou l’autre de ces récepteurs, semble insuffisante afin induire
efficacement les fonctions des cellules NK. Toutefois, une stimulation conjointe avec d’autres
récepteurs, tels NKp46(2B4) ou NKG2D(2B4 ou NTB-A), permet une activation efficace des
cellules NK [220,439].
3.6.2.4 NKG2D
Le récepteur activateur NKG2D est une protéine transmembranaire de type II de la
famille des lectines de type C. Il est exprimé constitutivement par la plupart des cellules
effectrices incluant les cellules NK, les cellules T TCRγδ, les lymphocytes T CD8+ et une
grande partie des cellules NKT [440,441]. Son expression peut être stimulée par certaines
40
cytokines comme l’IL-2, IL-15 ou TNF-α, mais est diminuée en présence de TGF-β [442445]. Contrairement aux autres récepteurs NKG2, il ne forme pas d’hétérodimère avec CD94.
Celui-ci forme plutôt un homodimère s’associant avec un dimère de la protéine
adaptatrice DAP10 chez l’homme, grâce à des charges opposées situées sur le domaine
transmembranaire des deux protéines [446,447]. Comparativement aux autres protéines
adaptatrices, DAP10 ne contient pas de motif ITAM, mais possède plutôt un motif YxxM, tout
comme la protéine costimulatrice du TCR CD28. Suite à une liaison avec un ligand, les
résidus Tyr de ce motif deviennent phosphorylés par des kinases de la famille Src, ce qui
permet alors le recrutement de la sous-unité p85 de PI3-K et de Grb2-Vav1. Le recrutement de
ces protéines permet ensuite l’induction d’un flux calcique, la survie, la prolifération ainsi que
l’activation des fonctions effectrices des cellules NK, via l’activation et la phosphorylation de
plusieurs protéines en aval tel PLC-γ2, SPL-76, Akt, MEK1/2 et ERK1/2 [448-450] (figure 8).
Une stimulation à l’IL-15 semble amplifier la transduction du signal émis par le
complexe NKG2D/DAP10 [451,452]. En effet, suite à une stimulation, le récepteur d’IL-15
(IL-15R) s’associe avec DAP10 en plus d’induire une phosphorylation du motif YxxM via le
recrutement de la kinase Jak3 (« janus kinase 3 ») [452]. L’engagement du récepteur NKG2D
induit donc la production de cytokines ainsi qu’une dégranulation des cellules NK. Des études
démontrent que l’expression des ligands de NKG2D est suffisante afin d’induire la destruction
de cellules saines par les cellules NK, tel que testé in vitro et in vivo [453,454]. Toutefois, des
expériences de lyse ou de dégranulation redirigée in vitro suggèrent que l’engagement de
NKG2D seul est insuffisant afin d’induire les fonctions effectrices de cellules NK naïves et
nécessiterait l’apport synergétique de corécepteurs tel 2B4 ou NTB-A [220,439]. Cependant,
les ligands de ces corécepteurs sont largement exprimés au niveau des cellules
hématopoïétiques. Dans le cas des lymphocytes T CD8+, NKG2D semble plutôt servir de
costimulation au TCR. Néanmoins, en présence d’IL-15, une réponse peut être initiée par le
récepteur NKG2D indépendamment d’une activation du TCR [442,451]. En revanche,
NKG2D peut à la foi induire directement les fonctions effectrices des cellules NKT et servir
de costimulation au niveau de leurs TCR [455].
Le récepteur NKG2D reconnaît deux classes de ligands partageant une homologie
structurelle avec les molécules du CMH-I, soit MIC-A/B (MHC classs I-chain-related protein
41
A/B) et ULBP1-6 (UL16 binding protein 1-6). Tout comme les molécules du CMH-I, MIC-A
et MIC-B sont des protéines transmembranaires de type 1 composées de trois domaines Ig (α1,
α2 et α3) et d’une petite queue cytoplasmique. Cependant, contrairement aux molécules du
CMH-I, elles ne s’associent pas avec la microglobuline-β2 et ne lient aucun peptide [456]. Les
protéines ULBPs furent découvertes grâce à leurs habiletés à lier la protéine virale UL16
(Unique long 16) [457]. Celles-ci possèdent deux domaines Ig (α1 et α2) et diffèrent entre
elles par leur façon de s’associer à la membrane cellulaire. Tandis que ULBP1, 2, 3 et 6 sont
insérées dans la membrane cellulaire grâce à une ancre GPI, ULBP4 et 5 possèdent plutôt un
domaine transmembranaire (figure 8). Les ligands de NKG2D sont très polymorphiques,
particulièrement les gènes MICA et MICB, pour lesquels 70 et 31 allèles sont présentement
décrits, respectivement [458]. Cependant, le récepteur NKG2D semble reconnaître tous ces
différents allèles, mais avec une affinité variable [459]. Ce polymorphisme, ainsi que
l’existence de plusieurs ligands pour le récepteur NKG2D pourraient permettre aux cellules
NK de reconnaître une grande variété de cellules dangereuses (infectées ou tumorales), en plus
de conférer un avantage contre de possibles moyens d’évasion des pathogènes [460].
L’expression des ligands NKG2D est finement régulée, puisque ceux-ci sont généralement très
peu exprimés au niveau des cellules saines du système immunitaire. Par ailleurs, deux
microARN cellulaires semblent réprimer la traduction de MICA et MICB [461,462].
Cependant, l’expression de ces ligands est observée suite à certains stress cellulaires, au
niveau des cellules tumorales et lors d’infection par des pathogènes, ce qui permet aux cellules
NK de détecter la présence de cellules potentiellement dangereuses [460]. Par exemple, les
chocs thermiques, les stress oxydatifs ainsi que les stress génotoxiques induisant des
dommages d’ADN, sont reconnus pour induire une augmentation de l’expression des ligands
de NKG2D et par conséquent les fonctions effectrices des cellules NK [460]. Tel que décrit
précédemment, l’activation des voies de dommage à l’ADN contrôlée par les kinases ATR et
ATM permet aux cellules NK de détecter les cellules arborant des dommages à l’ADN via
l’induction de l’expression des ligands de NKG2D [337]. De plus, il est démontré que ces
voies sont constitutivement actives au niveau de plusieurs cellules tumorales humaines [463465]. En ce sens, une expression de MICA et de MICB est détectée au niveau de plusieurs
cellules tumorales épithéliales, tandis que les ULBPs sont préférentiellement retrouvés au
niveau d’une grande variété de cellules tumorales T [466]. Par ailleurs, l’expression des
42
ligands du NKG2D peut être facilement détectable au niveau de cellules infectées par des
bactéries ou des virus [467]. Enfin l’expression de ces ligands peut également être induite
suite à l’activation de cellules immunitaires, comme lors de traitement de cellules B avec du
lipopolysaccharide (LPS), lors de la stimulation antigénique de cellules T et lors d’une
stimulation de cellules DC et de macrophages via les TLRs [468-472].
Plusieurs virus, incluant le CMVH, le VHSK et le VIH-1, ont développé des
mécanismes afin d’échapper à une réponse NKG2D-dépendante des cellules NK [458]. Le
meilleur exemple est le CMVH, qui dédie deux protéines virales et un microARN viral à cette
tâche. En effet, les protéines UL16 (ULBP1,2,6 et MICB) [473-476] et UL142
(MICA)[477,478], interagissent et retiennent certain des ligands de NKG2D au niveau
intracellulaire, tandis le microARN viral, hcmv-miR-UL112, réprime la traduction de MICA
et MICB [479]. Les cellules tumorales utilisent également différentes stratégies afin
d’échapper aux fonctions effectrices NKG2D-dépendante des cellules NK. Tout d’abord,
plusieurs études démontrent que les cellules tumorales relâchent des formes solubles de
MICA[480,481], MICB [482] et ULBP2 [483], via un clivage dépendant de différentes
métalloprotéases et/ou phospholipase C [482-484]. Ceci permet une réduction de l’expression
de surface de ces ligands et limite une reconnaissance NKG2D-dependante des cellules
tumorales par les cellules NK. De plus, ces ligands solubles en interagissant avec le récepteur
NKG2D, semblent induire une l’internalisation du récepteur [480,485-488]. Les
tumeurs/cellules tumorales produisent également du TGF-β, ce qui participe à la diminution
des niveaux de surface du récepteur [489,490]. D’autre part, des études in vitro et in vivo
démontrent qu’une stimulation chronique du récepteur NKG2D avec des cellules tumorales
exprimant les ligands de NKG2D semble affecter gravement les fonctions effectrices
NKG2D-dépendantes des cellules NK [453,491,492]. Cette stimulation soutenue du récepteur
NKG2D semble encore plus dommageable sur les fonctions du récepteur, puisqu’on observe
une abolition complète de l’activité cytolytique NKG2D-dépendante des cellules NK [492].
De plus, certaines fonctions NKG2D-indépendante seraient également affectées, qui
pourraient dépendre de la perte des protéines adaptatrice DAP12, DAP10 et CD3ζ
[453,492,493]. Bref, ces données illustrent l’importance du récepteur NKG2D dans les
fonctions antivirale et anti-tumorale des cellules NK.
43
RÉCEPTEUR
LIGANDS
NKG2D
-
+
-
-
P
Src
P
SPL-76
Akt
Prolifération
P
MEK1/2
ERK1/2
P Grb2
P
Vav1
P
P
ULBP4-5
GPI
+
YxxM
P
p85
p110
YxxM
P
YxxM
Jak3
YxxM
-
YxxM
Récepteur
IL-15
ULBP1-3,6
DAP10
YxxM
DAP10
IL-15
DAP10
MICA/B
Flux
calcique
P
PLC-γ2
P
Virus, Bactéries, choc thermique, stress oxydatif,
stress génotoxique (ATR/ATM)
Survie
CELLULE NK
Fonctions
effectrices
CELLULE CIBLE
Figure 8. Structure et signalisation du récepteur NKG2D et de ces ligands.
Le récepteur NKG2D forme un homodimère s’associant avec un dimère la protéine adaptatrice DAP10, grâce à
des charges opposées situées sur le domaine transmembranaire des deux protéines. Lors de la liaison avec un
ligand, le motif YxxM situé sur la partie cytoplasmique de DAP10 est phosphorylé par des kinases de la famille
Src, ce qui permet alors le recrutement de la sous-unité p85 de PI3-K et de Grb2-Vav1. Ces protéines permettent
l’induction d’un flux calcique, la survie, la prolifération ainsi que l’activation des fonctions effectrices des
cellules NK, via l’activation et la phosphorylation de plusieurs protéines en aval tel PLC-γ2, SPL-76, Akt,
MEK1/2 et ERK1/2. Le récepteur d’IL-15 amplifie ce signal, en liant DAP10, en plus d’induire une
phosphorylation du motif YxxM via le recrutement de la kinase Jak3. B) MIC-A et MIC-B sont des protéines
transmembranaires de type 1 composées de trois domaines Ig (α1, α2 et α3) et d’une petite queue cytoplasmique.
Les ULBPs possèdent deux domaines Ig (α1 et α2) et s’associent avec la membrane cellulaire grâce a un domaine
transmembranaire ou une ancre GPI. L’expression de ces ligands est induite lors d’infection virale ou
bactériennes, lors de chocs thermiques, et lors de stress oxydatifs ou génotoxiques.
44
4. LES CELLULES NK DANS LE CONTEXTE DU VIH-1
4.1 Rôle des cellules NK dans le contrôle de l’infection et la progression de la maladie.
Comme dans le cas de la plupart des infections virales, les cellules NK semblent jouer
un rôle critique dans l’établissement d’une réponse immunitaire contre l’infection par le VIH1. La production massive d’IFN-α et d’IL-15 qui caractérise la phase aiguë de l’infection par
le VIH-1 [494], joue un rôle central dans l’activation et l’armement des cellules NK en
réponse à l’infection. En effet, on dénote une activation et une expansion rapide des cellules
NK durant la phase aiguë, spécialement avant la séroconversion, avec une expansion
préférentielle de la sous-population cytolytique de cellules NK (CD56basCD16+) [42,94] . Par
ailleurs, une activation similaire des cellules NK est observée chez les singes, suite à une
infection par le VIS [495]. Les cellules NK représentent alors la population de cellules
effectrices dominantes lors de cette phase de l’infection, puisque l’expansion des cellules NK
précède l’établissement d’une réponse adaptative des lymphocytes T CD8+ [94]. Elles
contribuent alors au contrôle de la réplication virale et favorise le déclenchement d’une
réponse immunitaire adaptative médiée par les lymphocytes T CD8+ par la production de
plusieurs chimiokines et cytokines, notamment de l’IFN-γ et TNF-α [42,112]. Les cellules NK
peuvent contrôler l’infection en détruisant directement les cellules infectées via leur activité
cytolytique naturelle ou indirectement via leur activité cytolytique dépendante des anticorps
(CCDA). En effet, plusieurs études in vitro démontrent que les cellules NK naïves ou activées
ont la capacité de tuer directement les cellules infectées autologues [220,496-498], bien que la
destruction de celle-ci semble limitée comparativement aux cellules tumorales [220,499,500].
Cette protection partielle des cellules autologues est dépendante du travail de certaines des
protéines accessoires, tel que discuté dans la section 4.4. De plus, plusieurs études démontrent
que certains anticorps dirigés contre le VIH-1, notamment contre gp120 et gp41, ont la
capacité d’induire l’activité CCDA des cellules NK [501-504]. Mentionnons que ces anticorps
apparaissent durant la phase aiguë de l’infection [505], ce qui semble contribuer au déclin de
la charge virale [501] et corrèle avec une progression plus lente de la maladie [506]. Ces
45
anticorps sont également enrichis au niveau des patients contrôlant l’infection par le VIH-1 et
les cellules NK démontrent alors une activité CCDA plus agressive [507]. En plus de détruire
les cellules infectées, les cellules NK produisent de grandes quantités de chimiokines-β (MIP1α/β et RANTES), qui représentent des ligands pour le corécepteur viral CCR5, ce qui réprime
la réplication virale en inhibant l’entrée du virus [508-510].
Puisque les cellules NK peuvent détruire les cellules infectées avant même le
déclenchement d’une réponse adaptative, celle-ci joue un rôle critique dans la protection
contre l’infection et la progression de la maladie. En ce sens, des études démontrent que les
cellules NK d’individus exposés au VIH-1, mais non infectés, démontrent une plus grande
activité cytolytique ainsi qu’une meilleure production des chimiokines-β et des cytokines IFNγ et TNF-α, que les cellules NK provenant d’individus non infectés ou infectés par le VIH
[511,512]. Cette activité accrue de leurs cellules NK pourrait expliquer, en partie, leur
résistance à l’infection par le VIH-1. Par ailleurs, plusieurs études épidémiologiques
démontrant l’importance de combinaison récepteurs KIR/ ligands HLA dans la protection et la
progression de la maladie, viennent confirmer le rôle critique des cellules NK dans le contrôle
de l’infection. En effet, les individus qui co-expriment une copie du récepteur
activateur KIR3DS1 et son prétendu ligand, l’allèle de la molécule HLA-Bw480I, progressent
plus lentement vers la phase SIDA que les individus qui n’expriment aucun ou un seul de ces
allèles [513]. Bien qu’aucune interaction physique n’aie été démontrée entre les deux
protéines, les cellules NK KIR3DS1+ dégranulent plus promptement et répriment plus
efficacement la réplication virale au niveau de lymphocytes T CD4+ HLA-Bw480I+ [514].
Par ailleurs, une augmentation des transcrits de KIR3DS1 est détectée chez les individus
exposés mais non infectés par le VIH [511]. En plus, de KIR3DS1, le récepteur
inhibiteur KIR3DL1 semble également conférer une protection contre l’infection par le VIH
[515]. En effet, la présence d’allèles de KIR3DL1 qui codent pour un récepteur exprimé à des
niveaux plus élevés est associée avec une progression plus lente de la maladie en présence de
HLA-Bw480I [515]. Ceci suggère que les cellules NK exprimant KIR3DL1 pourraient
posséder un plus grand potentiel cytolytique contre les cellules infectées, possiblement suite à
la régulation négative de ses ligands par la protéine Nef ou bien il est possible que ce récepteur
joue un rôle critique dans l’acquisition du potentiel cytolytique des cellules NK lors du
46
processus d’éducation [42,516]. Par ailleurs, une expansion préférentielle des cellules NK
KIR3DS1+ et dans une moindre mesure, des cellules NK KIR3DL1+, est observée durant la
phase aiguë de l’infection chez les patients HLA-Bw480I+ [517]. Finalement, une récente
étude démontre que le virus échappe à la pression immunologie induite par les cellules NK par
la sélection de virus polymorphes capables de moduler la reconnaissance des cellules infectées
par les récepteurs KIR [518]. Ces virus possèdent des séquences polymorphes de régions
ciblées par les récepteurs KIR, qui semblent augmenter la liaison entre les récepteurs
inhibiteurs KIR et les lymphocytes T CD4+ infectés. Ceci confirme que les cellules NK
contribuent au contrôle de la réplication et à l’évolution du virus in vivo. Bref, toutes ces
données illustrent le rôle critique de ces cellules effectrices dans le contrôle de l’infection et
dans la progression de la maladie.
4.2 L’impact de l’infection par le VIH-1 sur les cellules NK
Bien que les cellules NK semblent plutôt actives durant les étapes précoces de
l’infection, la phase chronique de l’infection est associée avec de grands changements
phénotypiques et fonctionnels au niveau de la population de cellules NK. Ces changements
semblent en grande partie attribuables à la diminution dramatique de la sous-population de
cellule NK cytolytique CD56basCD16+ préférentiellement retrouvée en phase aiguë [519-522]
et de l’émergence d’une sous-population de cellules NK très rarement retrouvée chez les
individus sains, les cellules NK CD56-CD16+ [523-526]. Comparativement aux deux autres
sous-populations, ces cellules NK CD56-CD16+ pathologiques, semblent être défectives pour
la majorité des fonctions effectrices des cellules NK [523,525,526]. En effet, la progression de
l’infection vers la phase chronique est notamment associée une diminution de l’activité
cytolytique directe [523-526] ou indirecte (CCDA)[502,504,506,527,528] des cellules NK, à
une réduction de la production de cytokines et de chimiokines [523,526,529,530], ainsi qu’à
altération de leur habileté à interagir avec les DC [530,531]. Plusieurs études démontrent que
le niveau de la plupart des récepteurs inhibiteurs des cellules NK semble être conservé ou
même augmenté chez les patients infectés par le VIH-1 [525,526,532,533]. Ceci favorise alors
une inhibition des fonctions cytolytiques des cellules NK [525,526]. Parallèlement, la
diminution de l’activité cytolytique semble être associée avec une diminution de l’expression
47
de plusieurs des récepteurs naturels de cytotoxicités, tels NKp44, NKp46 et NKp30, au niveau
d’individus virémiques comparativement à des individus non infectés [525,526,534]. La perte
du récepteur NKp30, intimement impliqué dans l’élimination des DC immatures par les
cellules NK, est alors associée avec une accumulation de DC immatures, ce qui affecte
l’interaction bidirectionnelle entre ces deux types cellulaires [530,531]. D’autre part, de
récentes études démontrent que la phase chronique de l’infection est également associée avec
une réduction de l’activité NKG2D dépendante des cellules NK, due à une diminution de la
transcription et de l’expression du récepteur NKG2D [535,536]. La diminution de l’expression
de
tous
ces
récepteurs
activateurs
pourrait
alors
favoriser
une
diminution
de
l’immunosurveillance des cellules NK contre les infections opportunistes et les cancers, qui
sont caractéristiques des étapes tardives de la maladie. Fait intéressant, le contrôle de la
virémie suite aux traitements ARV semble être associé avec une normalisation de l’expression
de ces récepteurs (inhibiteurs et activateurs), ce qui suggère que la régulation de ces récepteurs
serait dépendante de la réplication active du virus [525,535] Récemment, le récepteur siglec-7
fut identifié comme un marqueur sensible et précoce permettant d’identifier et de suivre ces
changements phénotypiques et la perte de fonctions des cellules NK lors des différents stages
de l’infection [537]. En effet, la perte précoce de siglec-7 semble se produire avant la perte de
CD56 qui se produit à la phase chronique de l’infection. La combinaison de ces deux
marqueurs permet alors d’identifier une population Siglec-7-CD56+ démontrant des pertes de
fonction préférentiellement lors du stade précoce de l’infection, tandis que la
population Siglec-7-CD56- est plutôt retrouvée dans la phase chronique de l’infection de
patients virémiques. Toutefois, la perte de fonction semble être maximale au niveau de la
population Siglec-7-CD56- [537]. Il est important de mentionner que plusieurs études
démontrent que ces changements phénotypiques et fonctionnels des cellules NK ne sont pas
observés chez les individus présentant une charge virale basse ou indétectable et/ou ne
progressant pas vers la phase SIDA. Il est donc suggéré que ces changements phénotypiques et
fonctionnels des cellules NK sont induits par une réplication active et chronique du virus
[526,537-539].
Le ou les mécanismes exacts impliqués dans ces changements phénotypiques et
fonctionnels des cellules NK lors de l’infection par le VIH-1 restent encore plutôt méconnus.
48
Bien que les cellules NK expriment CCR5 et CXCR4 [525,540], la plupart des cellules NK du
sang périphérique d’individus sains ou infectés n’expriment pas CD4 et par conséquent ne
contiennent pas d’ADN proviral [525]. A priori, les cellules NK ne sont pas susceptibles à
l’infection et il est donc peu probable qu’une infection directe des cellules NK par le VIH-1
soit en cause, bien que ceci soit encore controversé [541-544]. Notamment, certaines études
ont permis d’identifier une sous-population de cellules NK exprimant CD4 et qui semble être
susceptible à l’infection in vitro [543,544]. Cette population représente seulement 7 % des
cellules NK de la circulation sanguine, mais pourrait servir de réservoir pour le virus. En effet,
ces cellules semblent rester infectées même au niveau de patient ayant une charge virale
indétectable après des années de traitements ARV [544]. Toutefois, indépendamment d’une
infection des cellules NK, il a été démontré que l’enveloppe virale (gp120) est capable de
réprimer les fonctions effectrices ainsi que la prolifération des cellules NK via une interaction
avec l’intégrine α4β7 [14,545]. Il est également possible que l’activation chronique du
système immunitaire ainsi qu’une activation soutenue des cellules NK par des cellules cibles,
puisse participer aux changements phénotypiques et fonctionnels des cellules NK. Chose
certaine, une meilleure compréhension des mécanismes régulant cette perte de fonctions des
cellules NK lors d’une infection chronique par le VIH-1 pourra sans aucun doute contribuer au
développement de nouvelles stratégies prophylactiques ou thérapeutiques contre le VIH-1.
4.3 Rôle des cellules NK dans la destruction des lymphocytes T CD4+ non infectés
Bien que les cellules NK semblent jouer un rôle critique dans le contrôle de l’infection
et la progression de la maladie, certaines études suggèrent qu’elle pourrait cependant
contribuer à la pathogenèse du VIH-1. En effet, certaines évidences in vivo et in vitro
suggèrent que les cellules NK seraient impliquées dans la destruction des lymphocytes
T CD4+ lors de l’infection par le VIH-1[546]. Cette destruction serait en partie dépendante de
l’expression d’un ligand cellulaire du récepteur activateur NKp44 des cellules NK (NKp44L),
au niveau d’une grande proportion des lymphocytes T CD4+ lors de l’infection par le VIH-1
[546] . Cette expression du NKp44L est induite par un motif conservé (3S) de la protéine de
l’enveloppe gp41 et semble corréler avec une destruction progressive des lymphocytes T
49
CD4+ ainsi qu’une augmentation de la charge virale chez les patients VIH+ [546]. Fait
important, la thérapie ARV semble réduire cette expression de NKp44L au niveau des
lymphocytes T CD4+. Le motif 3S de gp41 semble induire l’expression de NKp44L via une
liaison spécifiquement avec le récepteur du complément gC1qR, ce qui induit une cascade de
signalisation induisant une production de H2O2 et l’exocytose du NKp44L par la cellule [547].
L’utilisation du modèle d’infection de singe avec le virus d’immunodéficience simien-humain
(VISH) a ensuite permis de confirmer l’implication de NKp44L dans la destruction des
lymphocytes T CD4+ in vivo et de déterminer que ces effets biologiques semblent
préférentiellement induits par les souches virales R5 [548]. Par ailleurs, seules les cellules
avoisinantes non infectées semblent exprimer NKp44L, puisque la protéine virale Nef induit
une rétention intracellulaire de NKp44L au niveau des cellules infectées.[175,498]. Ceci
permet alors aux cellules infectées d’échapper à une reconnaissance NKp44 dépendante des
cellules NK et de les rediriger vers les cellules non infectées. L’expression de NKp44L
pourrait être induite au niveau des cellules avoisinantes non infectées via des formes solubles
de gp41 et/ou la fusion de particules virales défectives. Il a été démontré qu’environ 30 % des
patients infectés produisent précocement un anticorps ciblé contre ce motif 3S de gp41, qui
disparaît ensuite lors de la progression de l’infection [549]. Celui-ci est tout de même associé
avec une préservation à court terme du nombre de lymphocytes T CD4+, d’une diminution de
l’expression de NKp44L sur les lymphocytes T CD4+ et d’un ralentissement de la progression
de la maladie [549,550]. À cet effet, l’immunisation de singes avec un peptide comportant le
motif 3S, prévient l’expression de NKp44L et la réduction du nombre de lymphocytes T
CD4+ lors d’une infection avec VISH [551]. En définitive, ces études suggèrent que le virus
pourrait utiliser les cellules NK afin de désarmer le système immunitaire en favorisant une
destruction sélective des lymphocytes T CD4+ non infectés.
4.3 Modulation des fonctions effectrices des cellules NK par les protéines accessoires
Puisque les fonctions cytolytiques des cellules NK sont finement régulées par leurs
récepteurs inhibiteurs et activateurs, le VIH-1 utilise différentes stratégies afin de réguler
l’expression des ligands de ces récepteurs, afin de réduire plus que possible la susceptibilité
des cellules infectées à l’activité cytolytique des cellules NK. Les protéines accessoires du
50
VIH-1 semblent tout particulièrement dédiées à cette tâche. À cet effet, la protéine Nef réduit
spécifiquement l’expression des molécules du CMH-1, HLA-A et HLA-B, sans toutefois
affecter les niveaux de HLA-C et HLA-E [171]. Puisque ces deux dernières molécules
représentent des ligands pour des récepteurs inhibiteurs des cellules NK, on pensait alors que
cette régulation sélective était suffisante afin d’échapper à une réponse des cellules NK.
Cependant, comme l’expression des récepteurs inhibiteurs est variée au niveau des cellules
NK, bon nombre d’entre elles n’expriment pas de récepteurs de HLA-C et HLA-E et présente
un plus grand potentiel cytolytique contre les cellules infectées [500]. De plus, le virus régule
également l’expression de certains ligands de récepteurs activateurs. En effet, des études in
vitro et in vivo démontrent que l’infection de lymphocytes T CD4+ par le VIH-1 induit une
augmentation de l’expression de certains ligands du récepteur activateur NKG2D, plus
spécifiquement ULBP1,2 et 3, ce qui augmente considérablement leur susceptibilité à la lyse
par les cellules NK [173,496,498]. À cet effet, l’utilisation d’anticorps bloquant contre
NKG2D semble profondément réduire la lyse des cellules infectées, ce qui suggère un rôle
majeur de ce récepteur dans la reconnaissance des cellules infectées [498]. Chose certaine, le
virus semble avoir développé plusieurs stratégies afin de réduire la réponse NKG2Ddépendante des cellules NK. Tout d’abord, il a été démontré que la protéine Nef réduit
l’expression de certains des ligands NKG2D à la surface des cellules infectées [173]. De plus,
le virus réduit également l’expression de CD48 et de NTB-A au niveau des cellules infectées,
des ligands des récepteurs 2B4 et NTB-A, qui représentent des corécepteurs de NKG2D [498].
Une récente étude a permis identifié Vpu comme la protéine virale impliquée dans la
régulation négative de NTB-A, ce qui prévient une dégranulation optimale des cellules NK et
réduit partiellement la destruction des cellules infectées [220]. Outre les ligands de NKG2D,
les protéines Nef et Vpu travaillent conjointement afin de réduire également l’expression de
PVR au niveau des cellules infectées, un ligand spécifique du récepteur activateur DNAM-1,
ce qui permet aussi de réduire partiellement la lyse induite par les cellules NK [174]. Malgré
tous ces mécanismes utilisés par le virus, la régulation positive des ligands NKG2D induite
par le virus semble suffisante afin d’activer les fonctions effectrices des cellules NK [498].
Enfin, le déterminant viral impliqué dans cette régulation positive des ligands de NKG2D ainsi
que le rôle de cette activité biologique du virus dans la pathogenèse virale restent encore à être
déterminé.
51
HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS
Il semble clair que l’infection de lymphocytes T CD4+ par le VIH-1 in vitro et in vivo
induit une régulation positive des ligands du récepteur activateur NKG2D, plus
spécifiquement ULBP1, 2 et 3. Bien que le virus ait développé différentes stratégies afin
d’atténuer cet effet, cette régulation positive des ligands de NKG2D augmente néanmoins
considérablement la susceptibilité des cellules infectées à la lyse par les cellules NK.
Cependant, le facteur viral impliqué dans ce processus ainsi que le rôle de cette activité
biologique du virus dans la pathogenèse virale restent encore à être déterminés. À cet effet, la
protéine accessoire Vpr induit un arrêt de cycle en phase G2/M via l’activation de la voie de
dommage à l’ADN contrôlée par la kinase ATR, des conditions connues pour induire une
régulation positive des ligands de NKG2D.
Dans ce contexte, nous avons donc émis l'hypothèse que l’activation de la voie ATR
induite par Vpr pourrait permettre au virus de moduler l’activité cytolytique des cellules NK
via une régulation positive des ligands de NKG2D. Lors de l’infection, Vpr serait à l’origine
d’une augmentation de la susceptibilité des cellules infectées à l’activité cytolytique NKG2Ddépendante des cellules NK. Sous forme soluble ou incorporée dans des particules virales
défectives, Vpr pourrait alors contribuer à la destruction des lymphocytes T CD4+ non
infectés, tel qu’observé durant l’infection par le VIH-1.
L’objectif général de mon projet de thèse était donc d’étudier l’effet de Vpr sur la
modulation de l’activité cytolytique des cellules NK et son implication potentielle dans la
destruction des lymphocytes T CD4+. Plus spécifiquement, le premier objectif était d’évaluer
l’implication de Vpr dans la régulation positive des ligands de NKG2D et l’activation des
fonctions cytolytiques des cellules NK induites par le VIH-1 ainsi que de caractériser le(s)
mécanisme(s) sous-jacent(s). Par la suite, le second objectif était d’évaluer la possibilité que
Vpr puisse agir au-delà des cellules infectées dans le contexte d’une infection de lymphocytes
T CD4+ et d’établir le rôle potentiel de Vpr, sous forme soluble ou associé aux virions, dans
ce processus.
CHAPITRE 1 : Vpr induit une augmentation de l’expression des
ligands du récepteur activateur NKG2D et augmente l’activité
cytolytique des cellules NK
L’objectif général de ce premier chapitre était donc de déterminer l’implication de la
protéine virale Vpr dans la régulation positive des ligands de NKG2D induite par le VIH-1.
Plus spécifiquement, nous voulions déterminer si l’expression de Vpr était suffisante afin
d’induire une régulation positive des ligands de NKG2D et d’activer les fonctions cytolytiques
des cellules NK. Enfin, nous voulions également évaluer la contribution du complexe
d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par
ATR dans ce phénomène.
Ce chapitre fut l’objet d’un article paru en 2010 dans le journal Blood [552], un journal
couvrant différents sujets de recherche en hématologie. Sardar Sindhu PhD, a contribué à la
caractérisation de l’effet de Vpr et de ses mutants au niveau des cellules CEM.NKR
(Figure 3B et 5A), en plus de réaliser les expériences de lyse avec les cellules CEM.NKR
(Figure 6A-C). Tram NQ Pham, Ph.D, a réalisé les expériences de PCR en temps réel
(Figure 4). Jean-Philippe Belzile a participé à la caractérisation des mutants de Vpr au niveau
des cellules Hela (Figure S1). Jonathan Richard a exécuté les expériences des Figures 1-3, 5,
6D, 7, S1 et S2 . Jonathan Richard, Jean-Philippe Belzile et Éric Cohen, Ph.D ont participé à
l’écriture du manuscrit.
Résumé
Le VIH régule positivement l’expression de ligands spécifiques du récepteur
activateur NKG2D, à la surface de lymphocytes T CD4+ in vitro et in vivo, notamment ULBP1, -2, -3, mais pas MICA et MICB. Cependant, le facteur viral impliqué dans cette régulation
positive des ligands de NKG2D reste encore indéfini. Vpr active la voie de dommage à l’ADN
contrôlée par la kinase ATR et induit un arrêt de cycle en phase G2/M, des conditions connues
pour induire l’expression des ligands de NKG2D. Nous démontrons dans cette étude que le
VIH-1 induit sélectivement l’expression d’ULBP-2, à la surface de lymphocytes T CD4+
primaires, par un processus qui est dépendant de Vpr. Conséquemment, Vpr augmente la
susceptibilité des cellules infectées à l’activité cytolytique de cellules NK autologues.
Étonnamment, l’expression seule de Vpr est suffisante afin de réguler positivement tous les
ligands de NKG2D et d’induire une lyse NKG2D-dépendante de cellules T par les cellules
NK. De plus, l’acheminement de Vpr au niveau de cellules non infectées via des particules
virales défectives induit des effets biologiques similaires, ce qui suggère que Vpr pourrait agir
au-delà des cellules infectées. Toutes ces activités reposent sur la capacité de Vpr de recruter
le complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et d’activer la voie de dommage à
l’ADN contrôlée par la kinase ATR. Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que Vpr est un
déterminant viral clé impliqué dans la régulation positive des ligands de NKG2D et suggèrent
que Vpr pourrait non seulement contribuer à la destruction des lymphocytes T CD4+, mais
également participer à la perte des fonctions effectrices des cellules NK induite par le VIH-1.
54
HIV-1 VPR UPREGULATES EXPRESSION OF LIGANDS FOR THE ACTIVATING
NKG2D RECEPTOR AND PROMOTES NK CELL-MEDIATED KILLING
Jonathan Richard1, 2, Sardar Sindhu1, Tram NQ Pham1 Jean-Philippe Belzile1, 2
and Éric A. Cohen1, 2*
Institution: 1Institut de Recherches Cliniques de Montréal and 2Department of Microbiology
and Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, Montreal, Québec, Canada.
*Correspondence: Laboratory of Human Retrovirology, Institut de recherches cliniques de
Montréal, 110, Avenue des Pins Ouest, Montreal, Quebec, Canada H2W 1R7. Phone: (514)
987-5804; Fax: (514) 987-5691
Running Title: HIV-1 VPR UPREGULATES NKG2D LIGANDS
Section designation: IMMUNOBIOLOGY
Manuscript information: 31 pages, 7 figures and 50 references.
Word counts: abstract = 199/200 words; text = 4999/5000 words.
55
ABSTRACT
HIV upregulates cell-surface expression of specific ligands for the activating NKG2D
receptor, including ULBP-1, -2, -3, but not MICA or MICB, in infected cells both in vitro and
in vivo. However, the viral factor(s) involved in NKG2D ligand expression still remains
undefined. HIV-1 Vpr activates the DNA damage/stress-sensing ATR kinase and promotes G2
cell-cycle arrest, conditions known to upregulate NKG2D ligands. We report here that HIV-1
selectively induces cell-surface expression of ULBP-2 in primary CD4+ T-lymphocytes by a
process that is Vpr-dependent. Importantly, Vpr enhanced the susceptibility of HIV-1-infected
cells to NK cell-mediated killing. Strikingly, Vpr alone was sufficient to upregulate expression
of all NKG2D ligands and thus promoted efficient NKG2D-dependent NK cell-mediated
killing. Delivery of virion-associated Vpr via defective HIV-1 particles induced analogous
biological effects in non-infected target cells, suggesting that Vpr may act similarly beyond
infected cells. All these activities relied on Vpr ability to activate the ATR-mediated DNA
damage/stress checkpoint. Overall, these results indicate that Vpr is a key determinant
responsible for HIV-1-induced upregulation of NKG2D ligands and further suggest an
immunomodulatory role for Vpr that may not only contribute to HIV-1-induced CD4+ Tlymphocyte depletion but may also take part in HIV-1-induced NK cell dysfunction.
56
INTRODUCTION
HIV-1 has evolved multiple strategies to induce a persistent infection in hosts. Several
of these strategies rely on an array of virally encoded accessory proteins, including Vif, Vpr,
Vpu and Nef, which collectively appear to manipulate host cell biology as a mean to ensure a
favorable cellular state for viral replication, transmission, dissemination and immune evasion
1
. Vpr (Viral protein R), one of these accessory proteins, is a 96-amino acid protein that is
expressed at the late stage of the virus life cycle but is present during the early steps of
infection since it is packaged into viral particles via an interaction with the p6 domain of Gag
2,3
. The protein also exists in an extracellular form since it can be detected in the serum and
cerebrospinal fluid of HIV-1-infected individuals 4. One of the main biological activities of
Vpr is the induction of a G2 cell-cycle arrest
5-7
Vpr molecules also display cytostatic activities
. Interestingly, soluble and virion-associated
8-10
, raising the possibility that Vpr may exert
this biological activity beyond infected cells. The observations that Vpr-mediated G2 cellcycle arrest is well conserved among the primate lentiviruses
11,12
and that HIV-1-infected
individuals display an abnormal number of cells accumulating in the G2 phase 13 suggest that
this activity is likely to play an important role in HIV-1 pathogenesis. Although its functional
significance is still not well understood, its mechanism has recently been in part elucidated.
Vpr appears to induce a G2 cell-cycle arrest by mimicking a DNA stress/damage checkpoint
arrest initiated by the DNA damage-sensing protein kinase ATR (ataxia telangiectasia-mutated
and Rad3-related) 14. The proximal events that trigger G2 cell-cycle arrest were recently found
to rely on the engagement by Vpr of a cullin-RING E3 ubiquitin (Ub) ligase complex, DDB1CUL4A (VprBP). The recruitment of the complex would lead to polyubiquitination and
proteasomal degradation of a yet-unknown cellular protein(s) resulting ultimately in activation
of ATR signaling pathway 15-21.
DNA stress/damage checkpoint pathways initiated by ATM (ataxia telangiectasiamutated) or ATR protein kinases are essential to the maintenance of genomic integrity and
stability, but interestingly, recent findings suggest that they are also involved in innate
immune surveillance. Indeed, it has recently been demonstrated that genotoxic agents
upregulate expression of ligands of the activating natural-killer group 2, member D (NKG2D)
57
receptor through the activation of ATM and ATR and enhance destruction of treated cells by
natural killer (NK) cells 22. NKG2D is a potent activating receptor expressed not only on NK
cells, but also on γδ T-cells, CD8+ T-cells and a small subset of CD4+ T-cells
23,24
. Human
NKG2D ligands consist of two classes of MHC-I-like molecules: MHC-1-related chains
(MIC) and human cytomegalovirus UL16 binding proteins (ULBP), which are generally
poorly expressed by normal cells and upregulated on virus-infected, tumor, and stressed cells
23,24
. Activating signals delivered through the NKG2D receptor expressed by NK and T-cells
induce the killing of pathogen-infected cells as well as cancer cells both in vitro and in vivo
23,24
.
Since HIV-1 infection of primary CD4+ T-lymphocytes was recently reported to
increase cell-surface expression of specific NKG2D ligands both in vitro and in vivo
25-27
, we
investigated in the present study whether the HIV-1 Vpr accessory protein could regulate the
expression of ligands for the activating NKG2D receptor and modulate NK cell cytotoxic
responses. Herein, we provide evidence that Vpr, in the absence of any other viral gene
products, is sufficient to upregulate cell-surface expression of MICA, MICB, ULBP-1, -2, -3,
with the strongest effect observed with ULBP-2. We also show that Vpr-mediated
upregulation of ULBP-2 is dependent on the ability of Vpr to engage the DDB1-CUL4A
(VprBP) E3 Ub ligase and to activate the ATR-mediated DNA damage/stress checkpoint.
Importantly, we show that upregulation of ULBP-2 can be induced by intracellular as well as
virion-associated Vpr leading to an enhanced susceptibility of cells to NK cell-mediated
killing. These data indicate that Vpr is a key determinant responsible for HIV-1-induced
upregulation of cell-surface NKG2D ligands and further suggest an immunomodulatory role
for Vpr.
MATERIALS AND METHODS
Antibodies and reagents
Mouse anti-human ULBP-1,-2, -3, MIC-A or -B monoclonal antibodies (mAbs), soluble
NKG2D-IgG Fc fusion proteins and matched IgG Fc fusion molecules, interfering Abs to
NKG2D and matched-IgG control Abs were obtained from R&D Systems and the
58
fluorochrome-conjugated secondary Abs from Invitrogen. The anti-p24 (HB-9725) and antiHA (12CA5) mAbs were isolated from supernatants of cultured hybridoma cells obtained
from the American Type Culture Collection (ATCC). The anti-Vpr mouse mAb, 8D1, was a
kind gift of Dr. Y Ishizaka (Research Institute, International Medical Center of Japan, Tokyo)
4
. The Chk2-phospho(Thr68) Abs were obtained from Cell Signaling while the H2AX-
phospho(Ser139) Abs were from Upstate. Phytohemagglutinin-L, aphidicolin, caffeine and
indinavir were purchased from Sigma-Aldrich, KU55933 from Calbiochem and the human
rIL-2 (recombinant interleukin-2) from the NIH AIDS Research and Reference Reagent
Program 28.
Cell lines and isolation of primary cells
HEK 293T and HeLa TZM cells were cultured as described previously 29. CEM.NKR T-cells
were cultured in RPMI 1640 complete medium (20% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml
streptomycin). Peripheral blood samples were obtained from healthy, HIV-1 seronegative
adult donors who gave written informed consent under research protocols approved by the
research ethics review board of the Institut de recherches cliniques de Montréal. PBMCs
(peripheral blood mononuclear cells) were isolated by Ficoll–Paque centrifugation as
recommended by the manufacturer (Amersham). NK cells and CD4+ T-lymphocytes were
purified from freshly isolated PBMCs by negative selection using immunomagnetic beads
according to the manufacturer’s instructions (Stem Cell). NK cells were cultured overnight in
RPMI 1640 complete medium prior to use. CD4+ T-lymphocytes were activated with
Phytohemagglutinin-L (5 µg/ml) for 48h and then maintained in RPMI 1640 complete
medium supplemented with rIL-2 (100 U/ml).
Plasmids and proviral DNA constructs
The plasmids pSVCMV-VprWT, pSVCMV-HA-VprWT, pSVCM-Vpr-R80A, and pSVCMVIN-VSVg were described previously
15,30
. The plasmids pSVCMV-VprQ65R and pSVCMV-
HA-VprQ65R were generated by site-directed mutagenesis. The lentiviral vectors pWPI as
well as the packaging plasmid psPAX2 were kindly provided by D. Trono (School of Life
Sciences, Swiss Federal Institute of Technology, Lausanne, Switzerland). The lentiviral vector
pWPI-VprWT was described previously 15, while pWPI-VprR80A and pWPI-VprQ65R were
59
generated using a similar strategy. The Vpr-, reverse transcriptase-, and integrase-defective
provirus construct HxBruΔVprΔRTΔIN was described previously
31
. The pNL4.3 infectious
molecular clone was obtained from the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program
32
and pNL4.3ΔVpr was generated by insertion of a frameshift mutation in a unique AflII site.
The infectious isogenic CCR5-tropic HxBru.ADA.GFP and HxBru(Vpr-).ADA.GFP
proviruses co-express Nef and GFP from an IRES-containing open reading frame. The Vprdefective HxB89LF-PS-R- proviral construct that contains point mutations in the P6 domain
of Gag, which prevent incorporation of Vpr, was a kind gift from Dr. H Göttlinger (University
of Massachussetts Medical School, Worcester, MA) 33.
Production of lentiviral vectors and HIV-1 viruses.
Lentiviral vectors and HIV-1 infectious viruses were produced and titrated as described
previously
15,29
. Non-infectious HIV-1 defective viruses trans-packaged with VprWT or
VprQ65R were produced by transient transfection of 40 µg of provirus construct (NL4.3ΔVpr
or HxBruΔVprΔRTΔIN), 30 µg of pSVCMV-VprWT or pSVCMV-VprQ65R and 12 µg of
pSVCMV-IN-VSV-G, in 5x106 HEK293Tcells using the standard calcium phosphate method.
To produce defective particles, 100 nM of indinavir was added to the medium 24h posttranfection. Defective viruses were titrated by p24 ELISA as recommended by the
manufacturer (AIDS and Cancer virus program National Cancer Institute-Frederick). To
evaluate the packaging efficiency of VprWT and VprQ65R, virus particles were produced
similarly using NL4.3ΔVpr or HxBR89LF-PS-R- provirus construct and pSVCMV-HAVprWT or pSVCMV-HA-VprQ65R plasmids.
Lentiviral vector transduction and viral infection.
Infection of activated primary CD4+ T-lymphocytes was performed as previously described 29.
CEM.NKR T-cells and primary CD4+ T-lymphocytes were transduced with lentiviral vectors
by spinoculation (1200xg for 2h at 25°C with 8µg/ml of polybrene) at a multiplicity of
infection of 1.0. Exposure of primary CD4+ T-lymphocytes to non-infectious HIV-1 particles
was also performed by spinoculation, using equivalent amounts of viral particles.
60
Cytotoxicity assay
Infected primary CD4+ T-cell targets were prepared by sorting infected GFP-expressing
primary CD4+ T-cells using an Influx cell sorter (BD Biosciences). The whole cell population
was used as targets in case of CEM.NKR T-cells transduced with lentiviral vectors or primary
CD4+ T-cells exposed to non-infectious defective particles. NK cells obtained from the same
donors who provided CD4+ T-cells were used for cytotoxicity assay. For some experiments,
saturating concentrations (10 µg/mL) of NKG2D Abs or matched-IgG control Abs were added
to NK cells or soluble NKG2D-IgG Fc fusion proteins (3 µg/mL) and matched IgG Fc fusion
molecules were added to target-cells for 30 min at 4°C before cytotoxic assay and were
maintained throughout the assay. Determination of NK cell killing of target-cells was done
using a standard 4h-51Cr release assay, as described elsewhere 34.
RESULTS
HIV-1 upregulates cell-surface expression of NKG2D ligand ULBP-2 in primary CD4+
T-cells in a Vpr-dependent manner
HIV-1 was recently shown to upregulate the cell-surface expression of NKG2D
ligands, ULBP-1, -2, -3, but not MICA or MICB in infected primary CD4+ T-cells
25
. To
determine whether the Vpr accessory protein encoded by HIV-1 was playing a role in this
upregulation, human primary CD4+ T-cells were infected with Vpr+ or Vpr-defective isogenic
CCR5-tropic GFP (green fluorescent protein)-expressing HIV-1 virus and cell-surface
expression of the NKG2D ligands were analyzed by flow cytometry 5 days post-infection.
Basal expression of NKG2D ligands at the cell-surface of mock-infected CD4+ Tlymphocytes was at the limit of detection except for ULBP2 (Fig. 1 and data not shown for
MICA and MICB) even though these ligands could be specifically detected in various
transformed cell lines and upon treatment of cells with aphidicolin, an inhibitor of cellular
DNA polymerase and a known inducer of NKG2D ligands
22
(Fig. S1 and see below Fig. 3).
HIV-1 infection consistently induced an increased expression of ULBP-2 on infected cells
61
(mean fluorescence intensity (MFI)=40.65 vs 23.91 for mock), yet this upregulation of ULBP2 was completely abrogated when cells where infected with Vpr-defective viruses
(MFI=23.84) (Fig. 1). In contrast, infection of primary CD4+ T-cells with Vpr+ or Vprdefective virus did not lead to any significant change in the expression levels of ULBP-1,
ULBP-3, MICA or MICB (Fig. 1 and data not shown) as compared to mock-infected cells.
Thus, HIV-1 selectively induces cell-surface expression of the NKG2D ligand ULBP-2 by a
process that is dependent on Vpr.
Vpr enhances the susceptibility of HIV-1-infected CD4+ T-lymphocytes to NK cellmediated killing
Since HIV-1 upregulates cell-surface expression of ULBP-2 in a Vpr-dependent
manner, we next determined whether the presence of Vpr triggers NK cells to kill infected
cells. For this purpose, we evaluated the ability of non-activated human primary NK cells to
kill autologous CD4+ T-lymphocytes infected with Vpr+ or Vpr-defective GFP-expressing
HIV-1 virus in a 4h-51Cr release assay. As expected, cells infected with WT HIV-1 virus
displayed a marked increase in their susceptibility to NK cell killing relative to cells infected
with Vpr-defective virus and mock-infected cells (Fig. 2A). The extent of killing of Vprdefective HIV-1-infected cells by NK cells was very similar to that of the mock-infected cells
(Fig. 2A). Importantly, the increased susceptibility to NK cell killing was significantly
reduced when the ability of the NKG2D receptor to bind its ligands was blocked using
NKG2D Abs (Fig. 2B), thus indicating that the effect of Vpr in triggering NK cell killing was
mediated in a large part through the NKG2D receptor. Thus, expression of Vpr during HIV-1
infection of primary CD4+ T-lymphocytes promotes NK cell-mediated killing at least in part
through the NKG2D receptor.
Expression of Vpr alone is sufficient to increase the expression of NKG2D ligands
Having shown that HIV-1 upregulated ULBP-2 expression in a Vpr-dependent
manner, we then evaluated whether the expression of Vpr, in the absence of any other HIV-1
gene products, was sufficient to mediate a similar increase in the expression of ULBP-2. To
this end, human primary CD4+ T-lymphocytes were transduced with lentiviral vectors that co-
62
expressed Vpr and GFP (WPI-VprWT) or GFP alone (WPI) and GFP-expressing cells were
analyzed for ULBP-2 expression 48h post-transduction. Figure 3A reveals that CD4+ Tlymphocytes transduced with the Vpr-expressing lentiviral vector displayed an increased
expression of ULBP-2 at the cell-surface (MFI= 126.9) relative to control vector-transduced
cells (MFI=45.4). To further analyze the effect of Vpr on the expression of NKG2D ligands
and on NK cell cytotoxic responses in a more sensitive system, we took advantage of a natural
subclone of a transformed human NK cell-resistant CD4+ T lymphoblastoid cell line CEM,
designated CEM.NKR.
Transduction of CEM.NKR T-cells with WPI-VprWT led to a
detectable increase of all tested NKG2D ligands at the cell-surface of GFP+ cells relative to
the WPI control (Fig. 3B). Consistent with the results obtained with infected primary CD4+
T-cells, ULBP-2 showed the strongest upregulation in the presence of Vpr (MFI=315.8 vs
82.8 for the control). This effect of Vpr on cell-surface expression of the NKG2D ligands
correlated with an upregulation of the ligands at the mRNA level (Fig. 4). Similarly,
CEM.NKR T-cells treated with aphidicolin expressed higher levels of the NKG2D ligands at
the cell-surface and at the mRNA level. (Fig. 3B and 4). Overall, these results indicate that
Vpr alone is sufficient to upregulate expression of NKG2D ligands.
Upregulation of NKG2D ligands is dependent on HIV-1 Vpr-mediated activation of the
ATR DNA damage/stress pathway.
We and others have recently shown that HIV-1 Vpr engages the DDB1-CUL4A
(VprBP) E3 Ub ligase through a direct association with the substrate specificity receptor
VprBP to induce a cell-cycle arrest in the G2 phase 15-21. In that context, Vpr mutants that lost
the ability to interact efficiently with the E3 ligase (VprQ65R) or were presumably unable to
associate with putative host-cell substrate(s) (VprR80A) were found to have a reduced
capability to induce a G2 cell-cycle arrest 15. To assess whether Vpr-mediated upregulation of
NKG2D ligands depended on the ability of the protein to recruit the DDB1-CUL4A (VprBP)
E3 Ub ligase and to promote a G2 cell-cycle arrest, we analyzed the effect of VprR80A and
VprQ65R on cell-surface expression of ULBP-2, since the expression of this specific NKG2D
ligand was found to be consistently upregulated by Vpr in all tested cell types. For this
purpose, CEM.NKR T-cells were transduced with lentiviral vectors expressing GFP alone
(WPI) or co-expressing GFP and VprWT (WPI-VprWT) or Vpr mutants (WPI-VprR80A or
63
WPI-VprQ65R). Figure 5A (upper panel) reveals that while VprWT induced an upregulation
of ULBP-2 expression as compared to the WPI control (MFI=358.1 vs 118.7), VprR80A and
VprQ65R were drastically attenuated in their ability to induce G2 arrest (Fig. S2A) and to
increase expression of this ligand (MFI =126.2 and 200.1, respectively), even though their
expression levels were very similar to that of VprWT (Fig. 5A, lower panel). Similar results
were also obtained with the VprR80A mutant in HeLa cells (Fig. S1).
Given that the upregulation of NKG2D ligands was found to be dependent on the
activation of DNA damage/stress checkpoint pathway initiated by ATM or ATR
22
, we next
sought to test whether Vpr-mediated upregulation of NKG2D ligands relied on its ability to
activate the ATR DNA damage/stress pathway. To this end, CEM.NKR T-cells were
transduced with WPI or WPI-VprWT lentiviral vectors in the presence or absence of caffeine,
an inhibitor of ATR and ATM previously reported to prevent Vpr-mediated G2 cell-cycle
arrest
14
. Results from these experiments revealed that caffeine treatment not only inhibited
Vpr-mediated G2 cell-cycle arrest (Fig. S2B) but also significantly reduced cell-surface
upregulation of ULBP-2 (Fig. 5B). Similarly, induction of ULBP-2 by aphidicolin, a known
activator of DNA damage checkpoints
22
, was drastically diminished in the presence of
caffeine (Fig. 5B). Equivalent results were obtained in HeLa cells (data not shown). In order to
exclude the involvement of ATM, we evaluated the effect of the specific ATM inhibitor
KU55933
35
on Vpr-induced upregulation of ULBP-2. We found that treatment of transduced
cells with KU55933 had no effect on Vpr-mediated G2 cell-cycle arrest (Fig. S2C) and
upregulation of ULBP-2 (Fig. 5C). Comparable results were also obtained in HeLa cells (data
not shown). In contrast, KU55933 affected aphidicolin-induced ULBP-2 upregulation (Fig.
5C) and prevented phosphorylation of two known targets of ATM, Chk2 and H2AX, upon
gamma irradiation (Fig. 5D). Taken together, these results suggest that Vpr upregulates cellsurface expression of NKG2D ligands by a process that depends on the recruitment of the
DDB1-CUL4A (VprBP) E3 ligase and on the activation of the ATR-mediated DNA
damage/stress checkpoint.
64
Vpr-mediated upregulation of NKG2D ligands triggers NK cell-mediated killing
Given that expression of Vpr alone is sufficient to upregulate expression of NKG2D
ligands in CEM.NKR T-cells, we next determined whether Vpr-expressing cells are more
sensitive to NK cell-mediated killing. To this end, we analyzed the susceptibility of the entire
population of lentiviral vector-transduced CEM.NKR T-cells to NK cell-mediated killing, 48h
post-transduction, in a 4h-51Cr release assay. Figure 6A shows that CEM.NKR T-cells
transduced with Vpr-expressing lentiviral vectors displayed a remarkable sensitivity to NK
cell-mediated killing as compared to the control vector-transduced cells. Importantly, the
enhanced NK cell-mediated lysis of Vpr-expressing cells was completely abrogated when
binding of NKG2D ligands to the NKG2D receptor was blocked using soluble NKG2D-IgG
Fc fusion proteins, providing additional evidence that the NK cell cytotoxic response triggered
by Vpr occurred via expression of NKG2D ligands. Furthermore, as expected, the G2 arrestdefective mutant, VprR80A, which fails to efficiently upregulate NKG2D ligands, was unable
to trigger NK cell-mediated killing at levels comparable to those induced by VprWT (Fig. 6B).
Interestingly, although we obtained a transduction efficiency of approximately 30% (data not
shown), the extent of NK cell-mediated killing induced by Vpr was very similar to that
observed upon aphidicolin treatment when using NK cells from the same donor. (compare Fig.
6A and Fig. 6C). These results raised the possibility that Vpr may be acting beyond transduced
cells in this experimental setting. Indeed, an analysis of GFP-positive and GFP-negative cells
within the WPI-VprWT-treated cell population revealed that ULBP-2 cell-surface expression
was upregulated in both cell populations relative to the WPI control lentiviral vector (Fig. 6D).
However, although Vpr-mediated upregulation of ULBP-2 was stable in GFP-positive cells
over a 96h-period post-tranduction, it occurred in a transient manner in GFP-negative cells,
thus suggesting that the effect in GFP-negative cells may be mediated by delivery of virionassociated Vpr rather than expression of the transgene (data not shown). Taken together, these
results indicate that expression of Vpr is sufficient to trigger NK cell-mediated killing through
an increased expression of NKG2D ligands.
65
Delivery of virion-associated Vpr via defective HIV-1 particles upregulates ULBP-2
expression and triggers NK cell-mediated killing
We and others have previously shown that virion-associated Vpr could trigger G2 cellcycle arrest in transformed or primary T-cells by a process that was insensitive to antiretroviral
agents
9,10
. Therefore, we next examined whether delivery of virion-associated Vpr by
defective HIV-1 particles could upregulate NKG2D ligands. In order to mimic infection by
defective viruses, we infected primary CD4+ T-lymphocytes with HIV-1 particles that are
unable to express any HIV-1 proteins de novo but contain virion-associated Vpr. First, HIV-1
particles trans-packaged with VprWT or VprQ65R were produced in presence of the protease
inhibitor indinavir to make them defective for infection. In this context, indinavir-treated
viruses were found to be non-infectious, but still able to deliver virion-associated Vpr
9,10
.
These indinavir-treated viruses were unable to establish productive infection as evaluated by
infection of HeLa TZM (data not shown). Nevertheless, non-infectious HIV-1 particles transpackaged with VprWT were still capable of inducing an upregulation of ULBP-2 cell-surface
expression in primary CD4+ T-lymphocytes when compared to isogenic non-infectious virus
trans-packaged with VprQ65R (Fig. 7A). Notably, the VprQ65R mutant was found to be
packaged into viral particles in quantities comparable to VprWT (Fig.7B), thus excluding the
possibility that the lack of ULBP-2 upregulation observed with this mutant was due to
inefficient packaging. As a negative control, we used a proviral construct (LF/PS) containing
mutations in the P6 domain of Gag, which prevent the incorporation of Vpr (Fig.7B). Similar
results were also obtained with naturally non-infectious viral particles produced from a wellcharacterized
reverse
(HxBru∆Vpr∆RT∆IN)
31
transcriptase
and
integrase-defective
that was trans-packaged
proviral
construct
with VprWT or VprQ65R (Fig. 7C).
Importantly, primary CD4+ T-lymphocytes exposed to indinavir-treated VprWT-containing
HIV-1 defective particles were more susceptible to autologous NK cell-mediated killing than
cells exposed to HIV-1 defective particles containing the VprQ65R mutant (Fig. 7D). Overall,
these results suggest that delivery of virion-associated Vpr protein through HIV-1 defective
particles can upregulate cell-surface expression of NKG2D ligands in non-infected cells and as
a result can trigger NK cell cytotoxic responses.
66
DISCUSSION
HIV-1 infection of primary CD4+ T-cells upregulates cell-surface expression of
specific ligands for the activating NKG2D receptor, including ULBP-1, -2, -3, but not MICA
or MICB
25,26
. This upregulation was also found to occur in vivo since NKG2D ligands were
expressed at high levels on endogenously HIV-1-infected CD4+ T-cells
27
. In particular,
ULBP molecules (especially ULBP-2) were clearly expressed on p24+ cells while the levels
of MICA and MICB were almost undetectable. However, the identity of the viral factor(s)
involved in NKG2D ligands expression has remained undefined. We demonstrated in this
study that the HIV-1 Vpr accessory protein is responsible for increasing expression of these
ligands, which are important in triggering NK cell responses on infected cells. In particular,
we observed that primary CD4+ T-cells responded to HIV-1 infection by selectively
augmenting cell-surface expression of ULBP-2 in a Vpr-dependent manner (Fig. 1).
Furthermore, expression of Vpr alone was sufficient to enhance ULBP-2 expression in human
CD4+ T-lymphocytes (Fig. 3A). Our results showing a lack of MICA and MICB cell-surface
upregulation by HIV-1 concur with recent reports
25-27
. However, in contrast to the study of
25
Ward et al. , we did not detect any significant upregulation of ULBP-1 and ULBP-3 in HIVinfected cells relative to uninfected cells. Interestingly, CEM.NKR T-cells expressing solely
Vpr showed an upregulation of all tested NKG2D ligands, with the strongest effect observed
with ULBP-2 (Fig. 3B). Aside from the implication that HIV replication and expression of
other virus proteins are not required for this activity of Vpr, this latter finding suggests that
perhaps in the context of a replicating virus, another viral function may limit the cell-surface
expression of some NKG2D ligands. In this regard, recent evidence suggests that the HIV-1
Nef accessory protein downregulates the cell-surface expression of NKG2D ligands as a mean
to evade NK-cell recognition
26
. This activity of Nef may explain why Vpr-mediated
upregulation of NKG2D ligands is selective in the context of HIV-1 infection where Nef is
expressed as compared to cells that only express Vpr. Additionally, it may also account for the
discrepancies observed between our results and those of Ward et al.
25
, since different Nef
variants were found to downregulate NKG2D ligands selectively and with different
efficiencies 26. However, we cannot exclude the possibility that differences in viral strain and
multiplicity of infection may explain these discrepancies. Importantly, despite the presence of
67
Nef, HIV infection, in a Vpr-dependent manner, increased the cell-surface expression of
ULBP-2 in infected primary cells and triggered NK cell-mediated killing at least in part via
the NKG2D receptor (Fig. 2). Studying the regulation of NKG2D ligand expression by Vpr
and other viral products, including Nef, should help understand how these ligands are
modulated during HIV-1 infection.
Our results suggest that Vpr increases NKG2D ligand expression by a process that
relies on the engagement of the DDB1-CUL4A (VprBP) E3 Ub ligase complex and on the
activation of the ATR-mediated DNA damage checkpoint (Fig. 5). Specifically, mutants of
Vpr that were unable to induce a G2 cell-cycle arrest, either because they lost the ability to
interact efficiently with the E3 ligase or were presumably unable to target putative host-cell
substrate(s) for polyubiquitination and degradation 15, were found to have a reduced capability
in upregulating NKG2D ligand expression (Fig. 5A). A role of ATR in this activity of Vpr
was supported by experiments, which demonstrated that Vpr-mediated ULBP-2 upregulation
was efficiently blocked by caffeine, an inhibitor of ATR and ATM, but not by the ATM
inhibitor KU55933 (Fig. 5B and 5C). In contrast, ligand augmentation in response to
aphidicolin, a known activator of DNA damage pathways 22, was inhibited by both inhibitors
(Fig. 5B and 5C). Our findings are consistent with earlier evidence showing that expression of
NKG2D ligands is upregulated by activation of the DNA damage/stress pathways initiated by
ATR or ATM 22 and that Vpr activates specifically the ATR-mediated DNA damage pathway
14
.
Our results support a model where virion-associated Vpr could also upregulate
NKG2D ligands following its delivery into target-cells and as a result would trigger NK cell
cytotoxic responses (Fig. 7). Studies have revealed that the ratio of defective to infectious viral
particles may be relatively high. These defective viral particles, which are estimated to be in
the range of 8-20 to 1, still contain packaged Vpr and therefore, could induce expression of
NKG2D ligands at the cell-surface of non-infected CD4+T-cells and promote their killing by
NK cells via NKG2D. These Vpr-containing defective particles may explain some of the
bystander killing observed in acute HIV-1 and simian immunodeficiency virus infections,
68
when for instance more than 50% of CD4+ T-cells in the gastrointestinal lamina propria are
depleted36-38, and yet only 7% of gastrointestinal CD4+ T-cells are found to be infected 37.
HIV-1 appears to have developed several strategies to offset the capability of
activating NK cells efficiently. The selective preservation of cell-surface expression of HLA-C
and –E molecules 39, the down-modulation of NKG2D ligands
26
and ligands for the NTB-A
(NK-T-B cell antigen) and 2B4 (CD244) activating co-receptors 25 by Nef represent strategies
used by HIV-1 virus to blunt NK cell recognition. Nevertheless, HIV-1, through Vpr, still
enhances the expression of some NKG2D ligands and triggers non-activated NK cells to kill
HIV-1-infected cells.
A role of Vpr in increasing expression of NKG2D ligands and
promoting NK cell cytotoxic responses would seem at first counterproductive to the virus
since it would make the infected cells more potent targets for NK cells. However, Vpr
provides the virus with a selective replication and propagation advantage since it promotes
infection of monocyte-derived macrophages
activation by Vpr
13
40,41
, a cell type that is refractory to ATR
and consequently, would not be expected to express ligands for the
activating NKG2D receptor during infection. Furthermore, this activity of Vpr on modulating
NKG2D ligand expression may not only contribute to HIV-1-induced CD4+ T-cell depletion
but may also play a role in the perturbation of NK cell functions observed during HIV
infection. Increasing evidence indicates that NK cell function as a whole is compromised
during HIV infection through poorly understood mechanisms. HIV infection is associated
with significant changes in NK cell subset distribution in the peripheral circulation that are
partially attributable to the emergence of a novel subset of NK cells that is rare in healthy
individuals, the CD3neg CD56neg CD16pos NK cells. These cells not only lack the majority of
NK cell effector functions, including killing, cytokine secretion, and antibody-dependentcellular cytotoxicity but also exhibit aberrant dendritic cell editing
42-44
. The observation that
the redistribution of NK cells towards this anergic subset of cells is directly correlated with
viral load suggests that the presence of viral antigens has a role in NK cell dysfunction.
Indeed, in viraemic patients, NK cells display several phenotypic and functional alterations 27,
including a slightly decreased expression of the NKG2D receptor
43
alteration in the percentage of NKG2D-positive cells was observed
, although no significant
27
. Interestingly, down-
regulation of NKG2D also occurs in some cancer patients as a consequence of a soluble form
69
of MICA released by tumor cells upon proteolytic cleavage
45,46
. Furthermore, sustained
localized expression of ligands for the activating NKG2D receptor was reported to downregulate NKG2D and to impair NK cell cytotoxic activity in vitro and in mouse models, thus,
reducing tumor immunosurveillance
47,48
. Hence, chronic exposure to NKG2D ligand-
expressing tumor cells or to soluble NKG2D ligands shedded by tumor cells induces alteration
of NKG2D function in NK cells
48,49
. By analogy, the activity of Vpr on NKG2D ligands
could contribute to NK cell dysfunction due to sustained effector activation, thus effectively
promoting viral immune evasion. A role of Vpr in HIV-1-induced NK cell dysfunction is
consistent with recent data, which showed that NK cells derived from human PBMCs infected
in vitro with HIV-1 Vpr+ virus or exposed to recombinant Vpr protein exhibited reduced
target-cell killing and reduced production of gamma-interferon as compared to their Vprnegative counterparts
50
. This NK cell defect was not due to direct infection of NK cells but
rather resulted in part from the presence of membrane-associated factors on infected or
recombinant Vpr-exposed non-myeloid target-cells. Hence, assessing whether the activity of
Vpr on NKG2D ligands desensitizes the NKG2D receptor and evades NKG2D-mediated
immune surveillance will further improve our understanding of the immune evasive strategies
employed by HIV to disarm innate immune responses and will help in the development of
immunotherapeutic options for HIV-1-infected individuals.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Didier Trono, Yukihito Ishizaka and Heinrich Göttlinger for kindly providing
reagents as well as Éric Massicotte, Martine Dupuis and Andrea Kessous for technical
assistance. We would also like to thank Andrew Makrigiannis and David Favre for helpful
discussions and Dr. Pierre Larochelle, the IRCM clinic staff and all donors for providing us
with blood samples. The following reagents were obtained through the AIDS Research and
Reference Reagent Program, Division of AIDS: pNL4-3 from Dr. Malcolm Martin and human
rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann-La Roche Inc.
70
JR is recipient of a Frederick Banting and Charles Best scholarship from the Canadian
Institutes of Health Research (CIHR) while JPB is recipient of a CIHR studentship. EAC
holds the Canada Research Chair in Human Retrovirology. This work was supported by
grants from CIHR and the Fonds de recherche en santé du Québec AIDS network to EAC.
AUTHORSHIP
Contribution: JR, TNQP and EAC conceived, designed the experiments and analyzed the
data. JR, SS, TNQP and JPB performed the experiments. JR, JPB, and EAC wrote the paper.
Conflict-of-interest disclosure: The authors declare no competing financial interests.
Correspondence: Éric A. Cohen: Laboratory of Human Retrovirology, Institut de recherches
cliniques de Montréal, 110, Avenue des Pins Ouest, Montreal, Quebec, Canada H2W 1R7.
Phone: (514) 987-5804; Fax: (514) 987-5691
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77
FIGURES
Figure 1. CD4+ T-lymphocytes infected with HIV-1 express ULBP-2 in a Vpr- dependent
manner. Human primary CD4+ T-lymphocytes were mock-infected or infected with
infectious CCR5-tropic HxBru.ADA.GFP or HxBru(Vpr-)ADA.GFP
at a multiplicity of
infection (MOI) of 0.5. After 5 days, mock-infected or GFP-expressing infected CD4+ Tlymphocytes were monitored for expression of NKG2D ligands by flow cytometry using
specific mAbs directed against ULBP-1, -2, -3, and appropriate fluorochrome-conjugated
secondary reagents. The histogram with the dashed line represents cells stained with the
isotype control Abs, the filled histogram represents mock-infected cells while the histograms
with the bold and dotted lines depict respectively, Vpr+ (HIV WT) and Vpr-defective
(HIVΔVpr) HIV-infected cells, as indicated. MFI
values
were calculated by subtracting the
corresponding isotype control values. Results shown are representative of the data obtained
from five different donors.
78
79
Figure 2. HIV-1 Vpr enhances the killing of HIV-1-infected CD4+ T-lymphocytes by
autologous NK cells. Human primary CD4+ T-lymphocytes were mock-infected or infected
with infectious CCR5-tropic HxBru.ADA.GFP or HxBru(Vpr-)ADA.GFP at a MOI of 0.5.
After 5 days, mock-infected or GFP-expressing infected primary CD4+ T-lymphocytes were
sorted and subsequently exposed to autologous primary NK cells in a 4h-51Cr release assay in
the absence (A) or presence (B) of interfering Abs to NKG2D (α-NKG2D) or matched-IgG
control Abs (IgG), as indicated. Error bars represent standard deviation of the mean. Results
shown are representative of the data obtained with three different donors.
80
81
Figure 3. Upregulation of cell-surface NKG2D ligands in cells expressing HIV-1 Vpr.
(A) Human primary CD4+ T-lymphocytes were transduced with lentiviral vectors expressing
GFP alone (WPI) or co-expressing GFP and VprWT (WPI-VprWT). GFP-expressing cells
were monitored for ULBP-2 cell-surface expression by flow cytometry, 48h post-transduction,
using specific mAbs directed against ULBP-2 and appropriate fluorochrome-conjugated
secondary reagents. (B) CEM.NKR T-cells were transduced with WPI-VprWT or WPI
lentiviral vectors or treated with aphidicolin (4 µM) as indicated. Cell-surface expression of
NKG2D ligands was monitored on
the
GFP-expressing cells, 48h post-transduction or after a
24h-treatment with aphidicolin (APC), using specific mAbs directed against ULBP-1, -2, -3,
MICA and B and appropriate fluorochrome-conjugated secondary reagents. MFI values were
calculated by subtracting the corresponding isotype control values (dashed line). Results shown
are representative of the data obtained from at least two independent experiments.
82
83
Figure 4. Augmentation of NKG2D ligand mRNA expression in CEM.NKR T cells
expressing HIV-1 Vpr. CEM.NKR T-cells were transduced with lentiviral vectors expressing
GFP alone (WPI) or co-expressing GFP and VprWT (WPI-VprWT). GFP+ cells were sorted
for analysis, 48h post-transduction. Alternatively, transduced cells were treated (or not) with 4
µM aphidicolin (APC) for 24 h. DNase-treated RNA was analyzed for NKG2D ligands
expression by real-time RT-PCR. Target gene expression in Vpr-transduced and APC-treated
CEM.NKR T cells was normalized for Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)
and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) expression and the data were
subsequently expressed as a fold increase relative to untreated or WPI-transduced cells,
respectively. Results shown represent a mean fold increase. Error bars represent standard
deviations of the mean. Results are representative of the data obtained from four independent
experiments.
84
85
Figure 5. Vpr-mediated upregulation of ULBP2 requires the recruitment of the DDB1CUL4A (VprBP) E3 ligase complex and activation of the DNA damage/stress checkpoint
arrest initiated by ATR. (A) CEM.NKR T-cells were transduced with lentiviral vectors
expressing GFP alone (WPI) or co-expressing GFP and VprWT (WPI-VprWT) or Vpr
mutants (WPI-VprR80A or WPI-VprQ65R), as indicated.
At 48h
post-transduction, GFP-
expressing cells were monitored for ULBP-2 cell-surface expression by flow cytometry using
specific mAbs directed against ULBP-2 and appropriate fluorochrome-conjugated secondary
reagents (upper panel). Expression of VprWT and Vpr mutants (VprR80A and VprQ65R) was
evaluated by intracellular staining by flow cytometry using anti-Vpr mAbs and appropriate
fluorochrome-conjugated secondary reagents (lower panel). (B-C) CEM.NKR T-cells were
transduced with lentiviral vectors WPI or WPI-VprWT or treated with aphidicolin (APC) (4
µM), in the presence
or absence of
caffeine (2.5 mM) (B) and in the presence of DMSO or
KU55933 (10µM) (C) as indicated. Cell-surface expression of ULBP-2 was monitored on
GFP-expressing cells 48h post-transduction or on the total cell population after a 24htreatment with aphidicolin (APC). MFI values were calculated by subtracting the
corresponding isotype control values (dashed line). Results shown are representative of the
data obtained from at least two independent experiments. (D) Hela cells were irradiated with
gamma rays (10Gy from a Cs137 source) in the presence of DMSO or KU55933 (10 µM). Cells
were then lysed and sonicated 1h after irradiation and phosphorylation of Chk2 and H2AX
was monitored by western blotting using specific Abs.
86
87
Figure 6. Vpr-mediated upregulation of NKG2D ligands in target-cells promotes NK
cell-mediated killing. (A) CEM.NKR T-cells were transduced with lentiviral vectors WPI or
WPI-VprWT and then exposed to primary NK cells in a 4h-51Cr release assay 48h posttransduction, in the presence of soluble NKG2D-IgG Fc fusion proteins or matched-IgG Fc
fusion molecules, as indicated. (B) CEM.NKR T-cells were transduced with lentiviral vectors
WPI-VprWT or WPI-VprR80A and then assessed for cell lysis by primary NK cells in a 51Cr
release assay, 48h post-transduction. (C) CEM.NKR T-cells were treated or not with
aphidicolin (APC) (4µM) and analyzed, as in (A), 24h post-treatment. Primary NK cells used
in (A) and (C) were isolated from the same donor. Error bars represent standard deviation of
the mean. (D) Cell-surface expression of ULBP-2 was monitored on GFP-positive and GFPnegative CEM.NKR T-cells, 48h after transduction with lentiviral vectors expressing GFP
alone (WPI) or co-expressing GFP and VprWT (WPI-VprWT) as indicated. MFI
values
were
calculated by subtracting the corresponding isotype control values (dashed line). Results
shown are representative of the data obtained from at least two independent experiments.
88
89
Figure 7. Virion-associated Vpr upregulates ULBP-2 expression in non-infected targetcells and triggers NK cell-mediated killing. (A) Human primary CD4+ T-lymphocytes were
exposed to indinavir-treated non-infectious viral particles that were trans-packaged with
VprWT or the VprQ65R mutant, as indicated, and cell-surface expression of ULBP-2 was
monitored 24h post-exposure using specific mAbs directed against ULBP-2 and appropriate
fluorochrome-conjugated secondary reagents. (B) HIV-1ΔVpr and HIV-1ΔVpr LF/PS viruses
(P6-mutated Gag-encoding virus that does not incorporate Vpr) trans-packaged with HAtagged VprWT or VprQ65R were produced as described in Materials and Methods. Virionassociated HA-tagged VprWT and VprQ65R were detected by Western blotting using anti-HA
mAbs. (C) Primary CD4+ T-lymphocytes were exposed to reverse transcriptase- and
integrase-defective (HIV∆Vpr∆RT∆IN) viral particles that were trans-packaged with VprWT
or the VprQ65R mutant as indicated, and cell-surface expression of ULBP-2 was monitored
24h post-exposure. MFI values were calculated by subtracting the corresponding isotypecontrol values (dashed line). (D) Primary CD4+ T-lymphocytes exposed to indinavir-treated
non-infectious viral particles containing VprWT or VprQ65R were added, 24h post-exposure,
to autologous primary NK cells in a 4h-51Cr release assay, as indicated. Error bars represent
standard deviation of the mean. Results shown are representative of the data obtained from
two independent donors.
90
91
SUPPLEMENTAL METHODS AND FIGURES
Detection of cell-surface antigens by flow cytometry
Cells were washed in PBS and re-suspended in flow buffer (PBS with 2% FBS and 0.1%
NaN3). Cells were then stained with specific mAbs for 45 min at 4°C. After the incubation,
cells were washed in PBS, re-suspended in flow buffer and stained with appropriate
fluorochrome-conjugated secondary mAbs for 30 min at 4°C. Cells were washed, fixed with
2% paraformaldehyde, washed again and finally re-suspended in flow buffer for flow
cytometry analysis. Fluorescence intensities were acquired using a FACScalibur flow
cytometer (BD Biosciences) and data were analyzed using FlowJo software v. 7.25 (Treestar).
Quantification of NKG2D ligands by real-time RT-PCR
CEM.NKR T cells were treated (or not) with 4 µM aphidicolin for 24 h or transduced with
pWPI-Vpr WT (or WPI) at a multiplicity of infection of 1 for 48 h. Total RNA was extracted
using TriZol (Invitrogen), treated with DNase (Invitrogen) and reversely transcribed with
Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen). The resulting cDNA (0.05 ng RNA
equivalent) was evaluated for NKG2D ligands (ULBP-1, -2, -3, MIC-A and -B) by real-time
PCR using Quantabio SYBR Green SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD) and
gene-specific primers as follows: ULBP-1 (sense: TGCAGGCCAGGATGTCTTGT;
antisense:
CATCCCTGTTCTTCTCCCACTTC);
ULBP-2
(sense:
CCCTGGGGAAGAAACTAAATGTC; antisense: ACTGAACTGCCAAGATCCACTGCT);
ULBP-3
(sense:
AGATGCCTGGGGAAAACAACTG;
antisense:
GTATCCATCGGCTTCACACTCACA); MIC-A (sense: ACAATGCCCCAGTCCTCCAGA;
antisense:
ACAATGCCCCAGTCCTCCAGA);
TGAGCCCCACAGTCTTCGTTAC;
GAPDH
(sense:
TTGACGGTGCCATGGAATTT);
antisense:
MIC-B
TGCCCTGCGTTTCTGCCTGTCATA);
GCCATCAATGACCCCTTCATT;
HPRT
(sense:
(sense:
antisense:
TGACACTGGCAAAACAATGCA;
antisense: GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT). A sample containing water instead of test
cDNA and a mock extraction were routinely included as contamination controls. The
92
amplification specificity was confirmed by melting curve analysis and gel electrophoresis of
PCR amplicons. Expression of target genes was normalized against that of housekeeping
genes GAPDH and HPRT. A fold change in expression was calculated using the 2−ΔΔCt
formula of the delta-delta Ct method.
93
Figure S1. Vpr upregulates cell-surface expression of NKG2D ligands in HeLa cells.
HeLa cells were transfected with vectors expressing GFP alone (WPI) or co-expressing GFP
and VprWT (WPI-VprWT) or VprR80A (WPI-VprR80A), using lipofectamine 2000
(Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. (A) Cell-cycle profiles of GFPexpressing cells were analysed by Hoechst 33342 staining (10 µg/ml) 48h post-transfection.
Flow cytometry acquisition was performed on a LSR flow cytometer (BD Biosciences). The
mathematical model MODFIT was used to calculate the proportions of cells in the G2/M and
G1 phases. (B) Cell-surface expression of NKG2D ligands was monitored by flow cytometry
48h post-transfection or after a 24h-treatment with aphidicolin (APC) (4 µM) using specific
mAbs directed to ULBP-1, -2, -3, MICA and B and appropriate fluorochrome-conjugated
secondary reagents. MFI values were calculated by subtracting the corresponding isotype
control values (dashed line). Results shown are representative of the data obtained from two
independent experiments.
94
95
Figure S2. Cell-cycle profiles of CEM.NKR T cells expressing Vpr mutants or treated
with caffeine or KU55933. (A) CEM.NKR T cells were transduced with lentiviral vectors
expressing GFP alone (WPI) or co-expressing GFP and VprWT (WPI-VprWT) or Vpr
mutants (WPI-VprR80A or WPI-VprQ65R). (B) CEM.NKR T cells were transduced with
lentiviral vectors WPI or WPI-VprWT in the presence or absence of caffeine (2.5 mM). (C)
CEM.NKR T cells were transduced with lentiviral vectors WPI or WPI-VprWT in the
presence of DMSO or KU55933 (10µM). (A-C) At 48h post-transduction, GFP-expressing
cells were sorted into modified Krishan buffer (0.1% sodium citrate, 0.3% NP-40, 0.05 mg/ml
propidium iodide and 0.02 mg/ml RNase) using an Influx cell sorter (BD Biosciences) and the
cell-cycle profile of sorted cells was analyzed by flow cytometry. Acquisition was performed
on a FACScalibur flow cytometer. The mathematical model MODFIT was used to calculate
the proportions of cells in the G2/M and G1 phases.
96
97
CHAPITRE 2 : Vpr augmente l’expression d’ULBP2 également
au niveau des cellules non infectées avoisinantes aux cellules
infectées lors de l’infection de lymphocytes T CD4+ par le VIH-1
Le premier chapitre nous a permis de déterminer que Vpr est le facteur viral impliqué
dans la régulation positive des ligands de NKG2D par le VIH-1, particulièrement le ligand
ULBP2. Plus spécifiquement, nous avons démontré que l’expression de Vpr, en absence de
toutes autres protéines virales, est suffisante afin de réguler positivement l’expression de
ligands de NKG2D à la surface cellulaire et au niveau de l’ARNm, ce qui augmente
considérablement la susceptibilité des cellules T à l’activité cytolytique des cellules NK. Nous
avons également établit que ces activités nécessitent le recrutement par Vpr du complexe
d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et l’activation de la voie ATR. Fait intéressant,
nous avons démontré que ces activités de Vpr peuvent être induites suite à l’expression de Vpr
dans le contexte d’une infection, mais également suite à son acheminement au niveau de la
cellule via des particules virales défectives. À la lumière de ces constatations et sachant que
Vpr a la capacité de transduire des cellules cibles via des formes soluble ou associée à des
particules défectives, l’objectif du second chapitre était donc d’évaluer la possibilité que Vpr
puisse agir également au niveau des cellules non infectées avoisinantes aux cellules infectées
lors d’une infection de lymphocytes T CD4+. Plus spécifiquement, nous voulions établir la
contribution possible de Vpr, sous formes soluble ou associée aux virions, dans ce phénomène.
Ce chapitre sera publié dans le journal Virology 2013 (sous presse), un journal
couvrant différents sujets de recherche en virologie. Tram NQ Pham PhD, a contribué à la
figure 1B, en plus de participer à la génération et la caractérisation du mutant Vpr L23F
(figure S2). Jonathan Richard a exécuté ou contribué aux expériences pour toutes les figures
de cette étude. Jonathan Richard, Tram NQ Pham PhD et Éric A. Cohen PhD ont participé à la
rédaction du manuscrit.
98
Résumé
Vpr favorise la lyse des lymphocytes T CD4+ infectés par une régulation positive
d’ULBP2, un ligand du récepteur NKG2D, grâce à l’activation de la voie de dommage à
l’ADN contrôlée par la kinase ATR. Dans cette étude, nous démontrons que Vpr augmente
l’expression d’ULBP2, non seulement au niveau des cellules infectées, mais également au
niveau des cellules non infectées avoisinantes, lors d’une infection de lymphocytes T CD4+
primaires par le VIH-1. En effet, la fréquence des cellules non infectées avoisinantes arborant
des niveaux élevés d’ULBP2 est augmentée par un processus qui est dépendant de
l’expression de Vpr. L’introduction d’une mutation sur Vpr qui empêche son incorporation au
niveau des virions, annule cette augmentation d’ULBP2, ce qui suggère l’implication du Vpr
associée aux virions dans ce processus. En outre, nous montrons que Vpr, sous forme soluble,
a également la capacité d’induire des dommages à l’ADN et d’induire une régulation positive
d’ULBP2, suite à la transduction de différentes cellules, incluant des cellules T, ce qui
représente des conditions favorables à une destruction par les cellules NK. Dans l’ensemble,
ces résultats suggèrent que Vpr pourrait contribuer à la destruction des lymphocytes T CD4 +
en rendant les cellules non infectées avoisinantes sensibles à l’activité cytolytique des cellules
NK.
99
VIRAL PROTEIN R UPREGULATES EXPRESSION OF ULBP2 ON UNINFECTED
BYSTANDER CELLS DURING HIV-1 INFECTION OF PRIMARY CD4+ T
LYMPHOCYTES
Jonathan Richard1, Tram N.Q. Pham1, Yukihito Ishizaka2 and Éric A. Cohen1, 3*
1
Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), Montréal, Québec, Canada; 2National
Center for Global Health and Medicine, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan;
3
Department of
Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, Montreal,
Québec, Canada.
*Corresponding author: Éric A. Cohen: Laboratory of Human Retrovirology, Institut de
Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 110, Pine avenue, west, Montreal, Quebec,
Canada H2W 1R7. Phone: (514) 987-5804; Fax: (514) 987-5691
ABSTRACT
HIV-1 Vpr triggers NK cell-mediated lysis of infected cells by upregulating ULBP2, a ligand
of the NKG2D receptor, through activation of the ATR-mediated DNA damage response.
Herein, we demonstrate that Vpr augments ULBP2 expression on both infected and uninfected
bystander cells during HIV-1 infection of primary CD4+ T lymphocytes. Indeed, the
frequency of uninfected bystander cells expressing high levels of ULBP2 was elevated in a
Vpr-dependent manner. Nevertheless, the same does not hold true for a Vpr mutant that is not
packaged into virions, suggesting the involvement of virion-associated Vpr in this process.
Additionally, we show that soluble Vpr has the ability to induce a DNA damage response and
to augment cell-surface ULBP2 upon transducing target cells, including T cells, conditions
known to promote NK cell-mediated killing. Overall, these findings suggest that Vpr could
contribute to CD4+ T cell loss by rendering uninfected bystander cells susceptible to NK cellmediated killing.
Keywords
HIV-1 Vpr, DNA damage response, ULBP2, NKG2D ligand, Natural killer cell, CD4+ T cell
depletion
101
Introduction
Chronic immune activation and gradual depletion of CD4+ T cells are hallmarks of
human immunodeficiency virus (HIV-1) infection, which are thought to contribute to the
progressive deterioration of the host’s immune response that ultimately leads to acquired
immune deficiency syndrome (AIDS). However, despite extensive research efforts that
spanned almost three decades, the precise mechanisms underlying the progressive depletion of
CD4+ T cells continues to be one of the most fundamental and debated issues of AIDS
research.
Both direct and indirect mechanisms of cell killing have been proposed. For
instance, during in vitro infection of immortalized T cell lines, it is direct killing of CD4+ T
cells that prevails. In contrast, in more physiological systems, such as ex vivo HIV-1 infection
of lymphoid tissues or lymph nodes from HIV-1 infected individuals, it is primarily uninfected
bystander CD4+ T cells that are killed (Finkel et al., 1995; Jekle et al., 2003), underscoring the
potentially important contribution of this loss to the overall depletion of CD4+ T cells. Over
the years, several indirect mechanisms have been proposed to contribute to the killing of
uninfected bystander CD4+ T cells, including those mediated by HIV-1-encoded proteins Tat,
Nef, gp120 or viral protein R (Vpr), since these viral proteins can induce apoptosis of
neighbouring uninfected cells upon their release from infected cells (Varbanov et al., 2006).
Moreover, HIV-1 defective virus particles, which represent the majority of virions that are
released during productive infection (Dimitrov et al., 1993; Piatak et al., 1993), have also been
suggested to play a part in CD4+ T cell loss either by interacting with uninfected bystander
cells or/and by transducing these cells (Esser et al., 2001; Herbeuval et al., 2005; Richard et
al., 2010). More recently, abortive HIV infections, such as those occurring in nonpermissive
resting CD4+ T cells, were shown to activate proapoptotic and inflammatory responses as a
102
result of the sensing of incomplete reverse transcripts that are accumulating in these
conditions, thus contributing to the killing of bystander cells (Doitsh et al., 2010).
The HIV-1 Vpr accessory protein can be found in vivo not only as an intracellular or
intravirion protein but also in an extracellular soluble form. Indeed, Vpr is efficiently
packaged into viral particles via an interaction with the p6 domain of Gag (Bachand et al.,
1999; Lu et al., 1995) and can be detected as a soluble protein in the serum and cerebrospinal
fluid of HIV-1–infected individuals (Hoshino et al., 2007; Levy et al., 1994) as well as in the
extracellular medium of virus-producing cells in vitro (Xiao et al., 2008). Importantly, the fact
that recombinant soluble Vpr displays natural-transducing properties on multiple cell types
(Sherman et al., 2002), suggests that Vpr could transduce uninfected bystander cells not only
as a defective virion-associated protein but also as a secreted protein.
One of the most studied biological activities of Vpr is its ability to promote a cell cycle
arrest at the G2 phase when expressed alone or in the context of HIV-1 infection (He et al.,
1995; Jowett et al., 1995; Re et al., 1995). Interestingly, soluble and virion-associated Vpr
molecules were also found to have the ability to induce a cell cycle arrest (Hrimech et al.,
1999; Poon et al., 1998; Sherman et al., 2002), suggesting that Vpr could exert this biological
activity on uninfected bystander cells. Accumulating evidence indicates that Vpr-mediated cell
cycle arrest relies on the recruitment of a cullin-ring E3 ubiquitin ligase, namely DDB1CUL4A (VprBP also designated DCAF1) by Vpr, and on the activation of a cellular DNA
damage response (DDR) initiated by the ataxia telangiectasia-mutated and Rad3-mutated
(ATR) kinase (review in (Romani and Cohen, 2012)). Indeed, expression of Vpr induces the
phosphorylation of several effector molecules regulated by ATR, including the checkpoint
kinase 1 (Chk1) and the histone 2A variant X (H2AX), and the formation of DNA repair foci
103
containing phosphorylated H2AX (γ-H2AX) and p53 binding protein 1 (53BP1) through a
process that is dependent on the engagement of DDB1-CUL4A (VprBP) (Belzile et al., 2010a;
Lai et al., 2005; Zimmerman et al., 2004).
Recently, we and others reported that activation of ATR by Vpr leads to the
augmentation of specific ligands of the activating natural killer group 2, member D (NKG2D)
receptor, which is constitutively expressed on Natural Killer (NK) cells (Richard et al., 2010;
Ward et al., 2009). Indeed, ULBP2, a member of the human cytomegalovirus UL16 binding
protein (ULBP) family, was the most predominantly upregulated NKG2D ligand (NKG2DL)
during infection of primary CD4+ T cells with Vpr-proficient virus. Paradoxically, increased
expression of ULBP2 at the surface of infected cells enhanced their recognition and killing by
NK cells in a NKG2D-dependent manner (Richard et al., 2010; Ward et al., 2009).
Importantly, laboratory-adapted as well as primary Vpr variants from all HIV-1 groups were
found to be sufficient to enhance ULBP2 expression and promote killing by NK cells (Pham et
al., 2011; Richard et al., 2010; Ward et al., 2009). Mechanistically, this upregulation of
ULBP2 at the surface of Vpr-expressing cells correlated with an increased detection of
ULBP2 transcripts, suggesting that Vpr-mediated DDR was increasing ULBP2 expression at
the transcriptional level (Richard et al., 2010; Ward et al., 2009).
In light of the aforementioned findings and the fact that Vpr could transduce target
cells as a secreted protein or in association with defective particles, we investigated in the
present study whether Vpr could mediate a similar biological activity on uninfected bystander
cells as it does on infected ones. Herein, we provide evidence that Vpr, as a secreted or virion-
104
associated form, contributes to the enhancement of ULBP2 expression on uninfected cells - a
condition known to promote NK cell-mediated killing - suggesting that it may participate in
the depletion of CD4+ T cells during HIV-1 infection.
Results
HIV-1 upregulates ULBP2 in uninfected bystander cells in a Vpr-dependent manner.
To evaluate whether Vpr could upregulate ULBP2 in uninfected bystander cells, we
established a sensitive system to examine ULBP2 expression in both infected and uninfected
cells following exposure of primary CD4+ T cells to HIV-1 lacking (ΔVpr) or expressing Vpr
(WT). For this purpose, activated primary CD4+ T cells were infected with CCR5-tropic GFPmarked HIV-1 WT or ΔVpr virus and the infected pool was separated from the uninfected one
by flow cytometry on the basis of GFP expression (Fig. 1A). Sorting efficiency was routinely
confirmed, immediately after by flow cytometry, and also, following a 10-day co-culture of
the sorted GFP- cells with HIV-1 susceptible SupT1.CCR5.DCSIGN cells. This co-culture
assay ensured that the sorted GFP- pool contained mostly, if not all, truly uninfected CD4+ T
cells (Fig.1A and Fig. S1). In all cases, immediately after sorting, HIV-1-infected GFP+ cells
and virally treated but non-productively infected bystander GFP- cells (hereafter referred to as
uninfected bystander cells or GFP- cells) were analyzed for ULBP2 mRNA levels by real-time
RT-PCR (Fig. 1A). First, consistent with previous observations (Ward et al., 2009), we found
that ULBP2 mRNA levels in GFP+ HIV-1 WT-infected CD4+ T cells were markedly higher
(~4.9 ± 1.00 -fold increase) than those in cells infected with Vpr-deficient virus. In parallel, a
similar analysis of GFP- cells revealed a ~2.0 ± 0.17 -fold increase in ULBP2 mRNA
abundance in uninfected bystander CD4+ T cells from cultures infected with HIV-1 WT as
compared to their ΔVpr virus exposed counterparts (Fig. 1B). Similarly, spin-infection of
105
activated primary CD4+ T cells with GFP-marked HIV-1 viruses (WT or ΔVpr) pseudotyped
with vesicular stomatitis virus G glycoprotein (VSV-G) revealed an enhanced detection of
ULBP2 proteins at the surface of both infected and uninfected bystander cells, which was Vprdependent (Fig.1C). Thus, these results suggest that HIV-1 Vpr mediates an upregulation of
ULBP2 mRNA and protein levels in infected as well as in uninfected bystander cells during ex
vivo infection of primary CD4+ T cells.
To further characterize the features of Vpr-induced ULBP2 upregulation on uninfected
cells, we made use of the Image Stream system, a novel tool that allows simultaneous
detection of protein expression by flow cytometry and fluorescence microscopy. Of note, only
cells that display high levels of ULBP2 as detected by flow cytometry could be visualized by
the fluorescence microscopic feature of the Image Stream (data not shown). Using this
technology we observed the presence of cells harbouring high level of ULBP2 in both infected
GFP+ and uninfected GFP- populations (Fig. 2A). Importantly, we found that the proportion
of ULBP2-high cell in the uninfected GFP- population was increased (average 1.6 fold) in the
context of HIV-1 WT infection as compared to that of HIV-1-ΔVpr infection (Fig. 2B and C).
This observation was, in essence, consistent with our earlier flow cytometric data (Fig.1C),
revealing an upregulation of ULBP2 at the cell surface of uninfected bystander cells that was
Vpr-dependent. As expected, we observed that the GFP+ HIV-1 WT-infected cell population
displayed ~3.6-time more ULBP2-high cells than the corresponding HIV-1-ΔVpr-infected cell
population, underscoring once again the positive effect of Vpr on ULBP2 expression (Fig. 2B
and C). Collectively, these results indicate that the frequency of uninfected bystander cells
106
expressing high levels of ULBP2 is increased upon HIV-1 infection in a Vpr-dependent
manner.
HIV-1-induced upregulation of ULBP2 in uninfected bystander cells involves virionassociated Vpr.
To investigate the involvement of virion-associated Vpr in the observed augmentation
of ULBP2 in uninfected bystander cells, we next used a previously described virus that
expresses a Vpr mutant (i.e., leucine substitution for phenylalanine at position 23) that is not
incorporated into viral particles, and hereafter, referred to as HIV-1 Vpr L23F (Yao et al.,
1995) (Fig. S2). To this end, we found that the ~2-fold increase in ULBP2 mRNA levels
typically observed in uninfected GFP- cells following HIV-1 WT infection (Fig. 1B and Fig.
3A) was essentially abrogated when cells were infected with HIV-1 Vpr L23F virus (Fig. 3A).
Nevertheless, the Vpr-induced upregulation of ULBP2 expression in the GFP+ population was
comparable between infections with WT and Vpr L23F viruses (~3.6 ± 0.90 and 3.6 ± 0.82fold, respectively). Of significance, Vpr L23F is expressed at levels similar to those of Vpr
WT in infected primary CD4+ T cells (Fig. 3B). Similarly, while no significant upregulation
of cell-surface ULBP2 was observed in uninfected GFP- cells during HIV-1 Vpr L23F spininfection (MFI, 18.8 versus 17.3 for HIV-1 ∆Vpr or 18.9 for mock-infected), the levels of
ULBP2 at the cell surface of the GFP+ population were comparable between infections with
HIV-1 WT and Vpr L23F viruses (MFI, 57.9 versus. 47.2) (Fig. 3C). Importantly, the
selective ULBP2 upregulation displayed by the HIV-1 Vpr L23F mutant in GFP+ infected
cells provides evidence that the cell sorting system used to separate infected and uninfected
cells is efficient and that potential cross contaminations do not represent a significant
107
confounding factor. Overall, these results suggest that virion-associated Vpr, through defective
particles or/and abortive infections, plays an important role in the augmentation of ULBP2 in
uninfected bystander cells during HIV-1 infection of primary CD4+ T cells.
Soluble Vpr induces a DNA damage response.
Aside from the two known virion- and cell-associated forms, Vpr also exists as a
soluble molecule that displays natural protein-transducing properties, raising the possibility
that Vpr, in this capacity, may also transduce uninfected bystander cells. Activation of ATR
by Vpr leads to the formation of DNA repair foci containing γ-H2AX and 53BP1, which
represent early markers of ATR-mediated DDR (Lai et al., 2005; Zimmerman et al., 2004). To
evaluate whether soluble Vpr possesses a similar ability to induce a DDR, we first examined
by confocal microscopy the presence of γ-H2AX- and 53BP1-containing foci in HeLa cells
exposed to synthetic Vpr or a control hemagglutinin (HA) peptide. Cells with more than 10 γH2AX- and/or 53BP1-containing foci were considered positive. As shown in figure 4A,
detection of Vpr-transduced cells was observed down to concentrations as low as 100 ng/ml of
soluble Vpr. In that context, soluble Vpr displayed a nuclear and a perinuclear localization as
described previously for de novo expressed Vpr (Fig. 4A, Fig. S3). While some Vpr was also
observed in the cytoplasm, this localization was more pronounced at a higher concentration of
soluble Vpr (1 µg/ml) (Fig. S3). In that regard, it should be mentioned that Vpr is a nuclear
protein that is capable of shuttling between the nucleus and the cytoplasm (Sherman et al.,
2001), and that its nuclear and perinuclear localization have been reported to be important for
its G2/M cell cycle arrest-inducing activity (Belzile et al., 2010a; Sorgel et al., 2012). As
quantified in figure 4B, treatment of cells with soluble Vpr led to an increased detection of
108
cells containing γ-H2AX (52.2% versus 23.5% for control HA peptide) or 53BP1 foci (45.4%
versus 17.7% for control peptide). Similar observations were made when primary CD4+ T
cells were exposed to soluble Vpr and γ-H2AX expression was evaluated in Vpr-transduced
cells by flow cytometry (Fig. 4C). Importantly, pre-treatment of soluble Vpr with anti-Vpr
antibodies abrogated the ability of the protein to localize in the nucleus and to induce DDR, as
revealed by the marked reduction in the percentage of cells positive for γ-H2AX (25.2%
versus 45.7% with control Abs) (Fig. S3). The fact that such treatment did not affect
significantly the percentage of cells positive for γ-H2AX in cultures exposed to the control HA
peptide (17.2% versus 21.4% with control Abs), further demonstrates that the effect of soluble
Vpr on DDR is specific.
Overall, these results provide evidence that soluble Vpr can induce a DDR, as revealed by
the formation of γ-H2AX and 53BP1-containing DNA repair foci, upon transducing target
cells.
Soluble Vpr promotes cell cycle arrest and enhances cell-surface expression of ULBP2 in
T cells.
Having shown that soluble Vpr induces a DDR, we next asked whether this form of
Vpr could trigger a cell cycle arrest and increase cell-surface ULBP2 expression in T cells. As
evidenced in figure 5A, treatment of primary CD4+ T cells with soluble Vpr induced a marked
increase in the proportion of cells at the G2/M phase as compared to similar cell populations
treated with control HA peptide (G2/M:G1=0.74 versus 0.06, respectively). Interestingly, this
G2 cell cycle arrest mediated by soluble Vpr was linked to an augmentation of ULBP2 at the
cell surface of treated T cells (MFI=42.9 versus 13.4 for HA peptide) (Fig. 5B).
109
Since similar findings were obtained in CEM.NKR T cells treated with soluble Vpr
(Fig. 5C and D), we next sought to test in this cellular system whether the observed cell cycle
arrest and up-regulation of ULBP2 induced by soluble Vpr relied on its ability to activate a
DDR. To this end, CEM.NKR T cells were pre-treated with caffeine, an inhibitor of the ATR
and ATM kinases (Sarkaria et al., 1999), prior to treatment with soluble Vpr or control HA
peptide. Results from these experiments revealed that the caffeine treatment not only inhibited
the cell cycle arrest induced by soluble Vpr (Fig. 5C) but also markedly reduced the
upregulation of ULBP2 at the surface of treated cells (Fig. 5D). Overall, these results suggest
that soluble Vpr can upregulate expression of ULBP2 via the activation of a DDR when
exposed to target T cells.
Discussion
HIV-1 Vpr triggers NK cell mediated lysis of infected cells by upregulating specific
ligands of the NK receptor, NKG2D, through activation of the ATR-mediated DDR (Richard
et al., 2010; Ward et al., 2009). Since Vpr is capable of transducing target cells as a soluble
protein or as a virion-associated protein, it was conceivable that Vpr could act similarly on
uninfected bystander cells during HIV-1 infection. Herein, we demonstrate, for the first time,
that Vpr augments ULBP2 expression not only on infected cells but also on uninfected
bystander cells during ex vivo HIV-1 infection of primary CD4+ T lymphocytes (Fig. 1).
Indeed, HIV-1 was found to increase the frequency of uninfected bystander cells expressing
high levels of ULBP2 in a Vpr-dependent manner (Fig. 2) Given that these analyses were
110
performed on the total uninfected cell population and that Vpr is likely to transduce only part
of uninfected cells, we are most probably underestimating the extent of Vpr-mediated ULBP2
upregulation in bystander cells in the context of our model system. Unfortunately, flow
cytometry detection of Vpr in the uninfected pool was not sufficiently sensitive to allow the
isolation of Vpr-positive cells, most likely as a result of the low amounts of transduced
proteins in these cells.
Our analysis of whether this enhancement of ULBP2 on uninfected bystander cells
would be sufficient to drive their lysis by NK cells revealed no Vpr-dependent killing of
uninfected GFP- cells (data not shown). However, as expected we observed Vpr-mediated
lysis of sorted GFP+ cells, but not of unsorted total population even though the latter
contained more than 25% of GFP+ cells (data not shown). These results underscore the
importance of cell sorting to precisely evaluate the effect of Vpr in promoting cell lysis. On
this note, given that only part of GFP- cells contain Vpr, this issue of sorting for Vpr-positive
GFP- cells becomes even more essential in this type of analysis.
Given that a large body of evidence has already clearly demonstrated that induced
expression of NKG2DL triggers lysis of target T cells by NK cells (Cerboni et al., 2007; Fogli
et al., 2008; Norman et al., 2011; Pham et al., 2011; Richard et al., 2010; Shah et al., 2010;
Ward et al., 2007; Ward et al., 2009), it is conceivable that Vpr-induced upregulation of
ULBP2 on uninfected cells, would render these cells highly susceptible to NK cell killing. In
that regard, HIV-1 encodes three accessory proteins that all impact the capacity of infected
cells to escape NKG2D-dependent NK cell recognition. Indeed, Nef was previously shown to
downmodulate cell-surface NKG2DL, including ULBP2 (Cerboni et al., 2007), while Vif-
111
mediated degradation of APOBEC3G was reported to prevent an optimal Vpr-mediated
upregulation of NKG2DL (Norman et al., 2011). An additional strategy to avoid NK cell
recognition is exerted by Vpu, which downregulates NTB-A, the ligand of the NTB-A coactivation receptor whose engagement is required for NK cells to degranulate when the
activation receptor NKG2D is activated (Shah et al., 2010). In that context, it is therefore
expected that Vpr-transduced uninfected bystander cells would display higher level of
NKG2D ligands and superior susceptibility to NK cell-mediated lysis than infected cells. This
might perhaps explain our detection of an upregulation of ULBP2 in uninfected bystander
cells despite the likely transduction of a limited number of GFP- cells.
This bystander effect of Vpr was found to be entirely abrogated when infection was
performed with virus encoding a mutant of Vpr that is not packaged into viral particles (Vpr
L23F), suggesting that virion-associated Vpr is entirely responsible for this biological activity
in this infection model system (Fig. 3). This effect of virion-associated Vpr could be related to
the presence of defective viral particles and/or to abortive infection by WT virus. Indeed, the
ratio of defective to infectious viral particles was reported to be relatively high during HIV-1infection in vitro and in vivo (Bourinbaiar, 1994; Dimitrov et al., 1993; Piatak et al., 1993) and
defective particles still package Vpr (Hrimech et al., 1999; Poon et al., 1998; Richard et al.,
2010). In that context, virion-associated Vpr would be efficiently delivered into uninfected
bystander cells by defective particles or during a non-productive infection, leading to an
upregulation of ULBP2. These results are consistent with previous findings showing that Vpr
associated with non-infectious or defective particles could mediate several biological
activities, including cell cycle arrest, apoptosis and induction of cell-surface ULBP2
expression, upon transduction of target cells (Hrimech et al., 1999; Poon et al., 1998; Richard
112
et al., 2010).
Although, the data obtained with the HIV-1-Vpr L23F mutant suggests that virionassociated Vpr is responsible for most of the ULBP2 upregulation detected in uninfected
bystander cells during ex vivo infection of primary CD4+ T cells, we cannot exclude the
possibility that extracellular Vpr could also contribute to this effect in vivo. Hence, to evaluate
whether soluble Vpr could act similarly on uninfected cells, we tested the effect of synthetic
Vpr on different target cell types. We provide evidence that soluble Vpr could also mediate the
formation of DNA repair foci containing DNA damage markers γ-H2AX and 53BP1 upon
transduction into target cells (Fig. 4 and Fig. S3), indicating that this form of Vpr also has the
ability to induce a DDR. Furthermore, we show that treatment of T cells with synthetic Vpr is
sufficient to promote a cell cycle arrest and to upregulate cell-surface ULBP2 - characteristics
that are known to favour NK cell-mediated T cell lysis (Fig. 5). Moreover, consistent with
previous findings with de novo expressed Vpr (Richard et al., 2010; Ward et al., 2009), we
provide evidence that the upregulation of ULBP2 mediated by soluble Vpr is dependent on the
activation of a DDR since this process is inhibited by caffeine, an inhibitor of ATR and ATM
kinases (Fig.5). It was previously reported (Hoshino et al., 2007) that Vpr concentration in
patient plasma was about 10 ng/ml, which represents an amount that is at least one order of
magnitude lower than that used in the present study. Nevertheless, if one was to take into
consideration the dynamic of HIV replication during the early stages of infection, the minimal
concentration used in the present study may not appear unrealistically high. Indeed, at early
stages of HIV-1 infection in vivo, viral replication occurs preferentially in tissues, including
the gastrointestinal tract and secondary lymphoid organs such as lymph nodes, which indeed
display the most rapid and significant CD4+ T cell loss (Brenchley et al., 2004; Mattapallil et
113
al., 2005; Pantaleo et al., 1991). In that regard, the frequency of HIV-1-infected mononuclear
cells isolated from lymphoid tissues was reported to be significantly higher (0.5-1 log10 unit)
than that found in the periphery (Pantaleo et al., 1991). In that context, it is plausible that the
concentration of soluble Vpr could be significantly higher than the 10 ng/ml detected in the
plasma. In any case, it is important to mention that at 100 ng/ml, synthetic Vpr was sufficient
to induce DNA repair foci, as detected by immunofluorescence (Fig. 4A). In contrast, a higher
concentration of synthetic Vpr was used to evaluate the ability of soluble Vpr to promote a cell
cycle arrest and to enhance cell-surface ULBP2 in T cells (Fig. 5). In fact, this increased
amount of synthetic Vpr was necessary to allow the detection of Vpr-positive cells by flow
cytometry, and was not unique to our study, as others have also utilized similar doses of Vpr
to investigate the protein biological activities in T cells and macrophages (Sherman et al.,
2002). Given the sensitivity threshold at which our assays are detecting Vpr-expressing cells,
we cannot rule out the possibility that lower concentrations of synthetic Vpr would be
sufficient to induce similar biological activity in T cells. However, even though soluble Vpr
can induce a DDR and upregulate ULBP2 when added to T cells, its role in the enhancement
of ULBP2 on uninfected bystander cells under natural infection conditions in vitro appears to
be minimal compared to that of virion-associated Vpr (Figures 3A and C). These results could
be explained by the fact that host’s cell regulates the levels of biologically active soluble Vpr.
Indeed, we have previously reported that Vpr undergoes proteolytic processing at a very well
conserved proprotein convertase (PC) cleavage site, located within the functionally important
C-terminal arginine-rich domain of the protein (Xiao et al., 2008). Since Vpr processing
occurs extracellularly upon close contact to cells and most likely involved a cell surfaceassociated PC, it is the soluble Vpr and not its virion-associated counterpart that is affected by
114
this process (Xiao et al., 2008).
Our findings support a model where Vpr would represent an additional weapon in the
virus’ arsenal used to modulate the host’s immune responses. Indeed, Vpr was reported to
modulate different aspects of the host’s immune response, including NK cell functions,
dendritic cell maturation, T cell activation as well as cytokine and chemokine production
(review in (Majumder et al., 2009)). Our results suggest that Vpr may participate in the killing
of healthy CD4+ T cells, which represent an important arm of the adaptive immune system, by
manipulating the effector killing function of NK cells during the early phase of the infection
when an expansion and activation of NK cells is observed (Alter et al., 2007). Hence, our data
are in agreement with other recent findings that suggest that NK cells would play a role in the
killing of uninfected bystander CD4+ T cells. Indeed, Veillard and colleagues reported that
HIV-1 gp41-triggered expression of specific ligands for the activating receptor NKp44 on
uninfected bystander cells, rendered these cells susceptible targets for NK cell-mediated lysis
(Fausther-Bovendo et al., 2009; Vieillard et al., 2005).
Conclusion
Taken together, our results reveal that HIV-1 Vpr upregulates ULBP2 on uninfected
bystander T cells, a condition known to promote NK cell-mediated killing, highlighting a
possible involvement of Vpr in the loss of healthy uninfected CD4+ T cells during HIV-1
infection. These findings outline an additional mechanism whereby HIV-1 infection could
deplete CD4+ T cells through chronic activation of NK cells.
115
Materials and Methods
Antibodies and reagents
Phytohemagglutinin-L, caffeine and DAPI (49,6-diamidino-2-phenylindole) were purchased
from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) while human rIL-2 (recombinant interleukin-2)
was obtained from the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (Lahm and Stein,
1985). The anti-p24 (HB-9725) monoclonal antibodies (mAbs) were isolated from
supernatants of cultured hybridoma cells obtained from the American Type Culture Collection
(ATCC). The anti-Vpr mouse mAb (8D1) and the rabbit polyclonal antibodies (pAbs) directed
against a pNL4-3 (GenBank : AAK08485.1) Vpr-derived N-terminal peptide (N-terminal) or
the full Vpr protein (Full) were described previously (Hoshino et al., 2007; Lavallee et al.,
1994). The following commercially available antibodies were used: rabbit anti-53BP1
(Abcam, Cambridge, MA, USA), mouse anti-phosphoS139-H2AX (clone JBW301) (Upstate,
Millipore, Billerica, MA, USA) mouse Pacific Blue-conjugated anti-CD3 mAbs (Clone
UCHT1) (Biolegend, San Diego, CA, USA) and mouse anti-ULBP2 mAbs (R&D Systems,
Minneapolis, MN, USA). All fluorochrome-conjugated secondary antibodies were obtained
from Molecular Probes (Invitrogen, San Diego, CA, USA). The Vpr synthetic peptide was
produced by AnaSpec (Fremont, USA) from the sequence of HIV-1 pNL4-3 Vpr while the
HA synthetic peptide (YPYDVPDYAK) was produced by the Sheldon Biothechnology Center
(McGill University, Montréal, Québec, Canada). In both cases, the purity that was achieved
exceeded 90%.
116
Cell lines and isolation of primary cells
HEK 293T, HeLa TZM cells and CEM.NKR T cells were cultured as described previously
(Levesque et al., 2003; Richard et al., 2010). SupT1.CCR5.DCSIGN cells were a kind gift
from Dr. R.W. Doms (Department of Microbiology, University of Pennsylvania School of
Medicine, Philadelphia, USA) (Laakso et al., 2007). Blood samples were obtained from
consenting HIV-1 and Hepatitis C Virus seronegative adult donors in accordance with a
protocol approved by the IRCM research ethics review board. Primary CD4+ T lymphocytes
were purified and activated as previously described (Richard et al., 2010).
Plasmids, proviral DNA constructs and production of HIV-1 viruses.
The infectious isogenic CCR5-tropic GFP-marked HIV-1 HxBru.ADA.GFP (HIV-1WT) and
HxBru(Vpr-).ADA.GFP (HIV-1ΔVpr), as well as the pSVCMV-IN-VSV-G plasmids were
previously described (Belzile et al., 2007; Richard et al., 2010). The CCR5-tropic GFPmarked HIV-1 HxBru(VprL23F).ADA.GFP (HIV-1VprL23F) proviral construct was
generated by site-directed mutagenesis. HIV-1 infectious viruses were produced in HEK 293T
cells and titrated in HeLa TZM as described previously (Belzile et al., 2007; Levesque et al.,
2003).
Viral infection and sorting of infected/uninfected CD4+ T cells
Infection/spin-infection of activated primary CD4+ T lymphocytes was performed as
previously described (Levesque et al., 2003; Richard et al., 2010). For real-time RT-PCR
analysis, HIV-1-infected and uninfected cells were sorted based upon GFP expression at 7
days post-infection. Sorting efficiency was subsequently confirmed by assessing GFP
117
expression on sorted cells by flow cytometry immediately after sorting and after a 10-day coculture with HIV-1 susceptible SupT1.CCR5.DCSIGN cells at ratio of 1:1. Co-cultures were
stained with Pacific Blue-conjugated anti-CD3 mAb to distinguish SupT1.CCR5.DCSIGN
(CD3 low) from sorted CD4+ T cells (CD3 high) and the percentage of GFP-positive
SupT1.CCR5.DCSIGN cells was evaluated by flow cytometry.
Detection of cell-surface ULBP2 by flow cytometry and Image stream
Cell surface staining of ULBP2 was performed as previously described (Richard et al., 2010).
For flow cytometry analysis, fluorescence intensities were acquired using a CyAn™ ADP
Analyzer (Beckman Coulter, Mississauga, Ontario, Canada) and data were analyzed using
FlowJo software v. 7.25 (Treestar, Ashland, OR, USA). For image stream analysis,
fluorescence intensities and confocal microscopy images of cells were acquired using an
Image Stream cytometer (Amnis, Seattle, USA) while data was analyzed using the Ideas
software (Amnis, Seattle, USA).
Intracellular staining and cell cycle analysis by flow cytometry
Cells were fixed for 15 min with 1% PFA and permeabilized for 15 min with cold methanol
and 5 min with 0.1% NP40. Cell samples were then stained for Vpr and/or γ-H2AX using the
anti-Vpr (8D1) mAb or an anti-phosphoS139-H2AX mAb and the appropriate fluorescenceconjugated secondary mAbs. The DNA content was then analyzed as previously described
(Yao et al., 1998) on Vpr-positive cells using a Cyan cytometer (Beckman Coulter). The
118
mathematical model MODFIT was used to calculate the proportions of cells in the G2/M
versus G1 phase of the cell cycle.
Quantification of ULBP2 by real-time RT-PCR
Primary CD4+ T cells were infected with CCR5-tropic GFP-marked HIV-1WT, HIV-1ΔVpr
or HIV-1VprL23F viruses at a multiplicity of infection (MOI) of 1. Infected cells were then
sorted based upon GFP expression as described above. ULBP2 expression was then evaluated
by real-time RT-PCR as previously described (Richard et al., 2010) on sorted GFP+ and GFPpopulations. ULBP2 levels were normalized against those of the housekeeping gene,
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). A fold change in expression was
calculated using the 2−ΔΔCt formula of the delta-delta Ct method.
Western blot
HEK293T cells were mock-transfected or transfected with proviral constructs encoding HIV1WT, HIV-1ΔVpr or HIV-1VprL23F using a standard calcium phosphate method. Vpr and
p24-Gag were detected in lysates from cells and pelleted virus particles by western blotting as
described previously using mouse anti-p24 mAb and rabbit anti-Vpr pAb (full) (Belzile et al.,
2010b).
Confocal microscopy
Twenty five thousand HeLa cells were seeded on cover slips in 24-well plates. Cell were then
exposed to 100 ng/ml of synthetic Vpr or a control HA peptide. For blocking experiments,
synthetic Vpr or control HA peptide were pre-treated for 1h at 4°C with a cocktail of anti-Vpr
119
Abs, including mouse anti-Vpr mAb (IgG2A) (8D1) and rabbit pAbs (N-terminal and Full), or
with corresponding control Abs, before addition to HeLa cells (at 1 µg/ml). Twenty-four hours
later, cells were fixed, permeabilized as previously described (Belzile et al., 2010a), and
stained with mouse anti-Vpr mAb (8D1) and mouse anti-γ-H2AX mAb (IgG1). Cells were
then washed and stained with appropriate anti-mouse secondary antibodies, while DAPI was
used to highlight the nuclei. Images were acquired and analyzed as previously described
(Belzile et al., 2010a).
Competing interests
The author(s) declare that they have no competing interests.
Authors' contributions
JR, TNQP and EAC conceived and designed the experiments and analyzed the data. JR and
TNQP performed the experiments. JR, TNQP EAC wrote the paper.
Acknowledgements
The authors thank Robert W. Doms for providing the SupT1.CCR5.DCSIGN cell line; PaulEduard Neagoe, Fadi Hajjar, Éric Massicotte and Julie Lord for technical assistance; Vibhuti
Dave for helpful discussions and Dr. Pierre Larochelle, the IRCM clinic staff and all donors
for providing us with blood samples. The rIL-2 was obtained through the AIDS Research and
Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH from Dr. Maurice Gately,
Hoffmann-La Roche Inc.
120
JR is a recipient of a studentship from the Canadian Institute of Health Research (CIHR). EAC
is recipient of the Canada Research Chair in Human Retrovirology. This work was supported
by grants from CIHR (MOP 12381) and the Fonds de recherche du Québec-Santé AIDS
network to EAC.
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126
Figures
Figure 1. HIV-1 infection augments ULBP2 in both infected and uninfected bystander
cells in a Vpr-dependent manner. (A-B) Primary CD4+ T cells were infected with CCR5tropic GFP-marked HIV-1 WT or ΔVpr viruses. Infected (GFP+) and uninfected (GFP-) cells
were sorted for analysis 7 days post-infection and the sorting efficiency of GFP- cells was
evaluated immediately after by flow cytometry as well as by co-culture with highly permissive
SupT1.CCR5.DCSIGN cells as described in Fig. S1. Total RNA was extracted from sorted
cells and ULBP2 expression was evaluated by real-time RT-PCR. The data were expressed as
fold-increase in ULBP2 expression during HIV-1 WT infection as compared to HIV-1 ΔVpr
infection. * P < 0.05, ** P < 0.01 and *** P < 0.005 as determined by unpaired nonparametric
Mann-Whitney test. (C) Primary CD4+ T cells were spin-infected with CCR5-tropic GFPmarked HIV-1 WT or ΔVpr virus pseudotyped with VSV-G and cell-surface ULBP2 was
evaluated by flow cytometry on infected GFP+ and uninfected GFP- cells 4 days postinfection. Mean fluorescence intensity (MFI) values were calculated by subtracting the
corresponding isotype control values. Results shown are representative of data obtained in at
least two independent experiments.
127
FIGURE 1
A
B
Sorting 7 days
post-infection
GFP+HIV+
4.9 ***
Mean
2.0 ***
Fold increase in ULBP2 mRNA
relative to HIV-1 ΔVpr infection
Infection of primary CD4+ T cells with
GFP-marked HIV WT or ΔVpr virus
GFP-HIV-
C
Isotype
Mock
HIVΔVpr
Relative cell number
GFP+
RNA extraction
Detection of ULBP2 mRNA by real-time RT-PCR
GFP-
Mock : 28.3
HIVΔVpr : 37.1
HIV WT : 94.4
ULBP2
128
HIV WT
Mock : 28.3
HIVΔVpr : 27.9
HIV WT : 44.1
Figure 2. Vpr increases the proportion of uninfected bystander cells expressing high
levels of ULBP2. Primary CD4+ T cells were spin-infected with CCR5-tropic GFP-marked
HIV-1 WT or ΔVpr virus pseudotyped with VSV-G. Four days post-infection, ULBP2 cellsurface levels were evaluated by Image Stream. (A) Microscopic detection of ULBP2-high
GFP+ and ULBP2-high GFP- cells in the context of HIV-1 WT infected cultures using an
Image Stream cytometer. (B) Histograms represent the percentage of ULBP-2-high GFP+ and
ULBP2-high GFP- cells in HIV-1WT or HIV-ΔVpr virus-infected cultures. Results shown are
representative of data obtained in two independent experiments. (C) Histograms represent fold
increase of ULBP2-high cells in HIV-1 WT infected-cultures relative to HIV-1 ΔVpr-infected
cultures. Shown is the average (± standard deviation) of two independent experiments.
129
% of ULBP2-high cells
B
10.3
4.2
2.6
2.7
2.9
Fold increase of % of ULBP2-high cells
relative HIV-1 ΔVpr infection
FIGURE 2
A
C
130
3.6
1.6
Figure 3. HIV-1 Vpr L23F fails to upregulate ULBP2 in uninfected bystander cells. (A
and B) Primary CD4+ T cells were infected with CCR5-tropic GFP-marked HIV-1 WT, ΔVpr
or VprL23F virus. (A) Infected GFP+ cells and uninfected GFP- cells were sorted and
analyzed for ULBP2 expression by real-time RT-PCR as described in the legend of Figure 1.
Shown is fold increase in ULBP2 mRNA levels following infection with HIV-1WT or
VprL23F virus relative to that obtained following infection with HIV-1ΔVpr virus. * P <
0.05, **P < 0.01 ***P < 0.005 and N.S, not significant, as determined by unpaired
nonparametric Mann-Whitney test. (B) At 4 days post-infection, GFP-expressing cells were
monitored for intracellular expression of Vpr by flow cytometry. (C) Primary CD4+ T cells
were spin-infected with CCR5-tropic GFP-marked HIV-1WT, ΔVpr or VprL23F virus
pseudotyped with VSV-G and cell-surface ULBP2 levels were evaluated by flow cytometry
on infected GFP+ cells and uninfected GFP- cells, 4 days post-infection. MFI values were
calculated by subtracting the corresponding isotype control values. Results shown are
representative of the data obtained in at least two independent experiments.
131
FIGURE 3
A
B
3.6
2.2
3.6
C
0.8
Isotype
Mock
GFP-
GFP+
*
100
Relative cell number
Fold increase in ULBP2 mRNA
relative to HIV-1 ΔVpr infection
N.S
HIVΔVpr
HIV WT
HIV VprL23F
Mock : 6.4
HIVΔVpr : 6.1
HIV WT : 15.2
80
HIV VprL23F: 15.9
60
40
20
0
100
101
102
Vpr
132
103
Relative cell number
Mean
Mock : 18.9
HIVΔVpr : 25.0
HIV WT : 57.9
Mock : 18.9
HIVΔVpr : 17.3
HIV WT : 33.4
HIV VprL23F: 47.2
HIV VprL23F: 18.8
104
ULBP2
Figure 4. Synthetic Vpr induces the formation of DNA repair foci. (A) HeLa cells were
treated for 24h with 100 ng/ml of synthetic Vpr (sVpr) or control HA peptide. Cells were then
fixed, permeabilized, and stained with antibodies against Vpr (red), γ-H2AX (green) and
53BP1 (cyan). DAPI was used to highlight the nuclei (blue). Images were acquired by
confocal microscopy and are representative of multiple fields. White bars = 10 µm (B)
Histograms represent mean percentage of cells having >10 DNA damage foci (± standard
deviation) from two independent experiments. (C) Primary CD4+ T cells were treated with
10ug/ml of synthetic Vpr or a control HA synthetic peptide. After 48h, expression of γ-H2AX
was detected in Vpr-transduced cells by intracellular staining with Abs against Vpr and γH2AX followed by flow cytometry.
133
Vpr
53BP1
DAPI + Vpr
sVpr
HA
A
B
C
52.2
45.4
17.7
30
18.1
1000
.5
20
10
500
0
0
10
134
sVpr
# Cells
23.5
1500
# Cells
Relative cell number
HA
0
1
2
10
10
10
FL 8 Log: ULBP2/NTBA
3
10
4
10
0
1
2
10
10
10
FL 8 Log: ULBP2/NTBA
3
10
4
Figure 5. Synthetic Vpr promotes cell cycle arrest and increases cell-surface ULBP2
expression in T cells. (A-B) Primary CD4+ T cells were treated with 10 µg/ml of synthetic
Vpr (sVpr) or a control HA peptide. (C-D) CEM.NKR T cells were pre-treated with or without
2.5mM of Caffeine for 1h prior to treatment with 5 µg/mL of synthetic Vpr (sVpr) or a control
HA peptide. At 48h (A-C) DNA content and (B-D) ULBP-2 cell-surface expression was
evaluated on Vpr-transduced cells by flow cytometry. MFI values were calculated by
subtracting the corresponding isotype control values. Results shown are representative of the
data obtained in at least two independent experiments.
135
FIGURE 5
C
A
No treatment
HA
sVpr
G2/M:G1=0.74
sVpr
HA
sVpr
G2/M:G1=0.13
G2/M:G1=2.14
G2/M:G1=0.09
G2/M:G1=0.47
cell number
cell number
G2/M:G1=0.06
+ Caffeine
HA
DNA content
B
HA
sVpr
DNA content
D
HA
HA : 13.4
sVpr : 42.9
Relative cell number
Relative cell number
No treatment
+ Caffeine
HA : 21.7
sVpr : 36.4
HA : 14.6
sVpr : 16.0
ULBP2
ULBP2
136
sVpr
Supplementary figures
Figure S1. Evaluation of the sorting efficiency. Primary CD4+ T cells were infected with
GFP-marked HIV-1 WT or HIV-1 ΔVpr viruses. GFP+ and GFP- cells were sorted for
analysis, 7 days post-infection. Sorted primary CD4+ T cells (GFP+ or GFP-) or mockinfected T cells were co-cultured with HIV-1 susceptible indicator SupT1.CCR5.DCSIGN
cells at a ratio of 1:1. (A) Each co-culture was stained with Pacific blue-conjugated anti-CD3
mAbs to distinguish SupT1.CCR5.DCSIGN cells (CD3 low) from sorted primary CD4+ T
cells
(CD3
high)
by
flow
cytometry.
(B)
The
percentage
of
infected
GFP+
SupT1.CCR5.DCSIGN cells was evaluated by flow cytometry after 10 days of co-culture. The
results are representative of a quality control experiment that was considered acceptable for
further real-time RT-PCR analysis. The apparent background levels of GFP-positive cells in
SupT1.CCR5.DCSIGN indicator cells (% of 0.23-0.27 for infected co-cultures versus a % of
0.03 for the mock-co-culture) may reflect the presence of very few HIV-1+ cells in the sorted
uninfected CD4+ T cell pool. Nevertheless, we assert that such a presence cannot explain the
~2-fold increase in ULBP2 expression detected in the latter pool owing to the consistent ~4fold augmentation of ULPB2 in the HIV-1-infected CD4+ T cell pool (GFP+).
137
FIGURE S1
A
B
Mock
0.03
CCR5 DCSIGN
HIV WT
0.27
CD4+T cells
0.23
GFP-
24.2
GFP+
CD3
GFP
138
Figure S2. Vpr L23F is not incorporated into HIV-1 viral particles. HEK 293T cells were
mock-transfected (lane 1) or transfected with HIV-1 WT (lane 2), HIV-1 ΔVpr (lane 3) or
HIV-1 Vpr L23F proviral constructs (lane 4). Vpr and p24-Gag were detected in lysates from
cells and pelleted virus particles by western blot using specific antibodies. Results shown are
representative of data obtained from at least two independent experiments.
139
FIGURE S2
Mock
HIV
WT
Vpr L23F
anti-p24
Cell lysate
anti-Vpr
anti-p24
Virus particle
anti-Vpr
1
140
2
3
4
Figure S3. Blocking antibodies against Vpr prevent the induction of DNA damage
response by soluble Vpr. (A-B) Synthetic Vpr (sVpr) or control HA peptide were pre-treated
for 1h at 4°C with a cocktail of anti-Vpr Abs, including mouse anti-Vpr mAb (IgG2A) (8D1)
and rabbit pAbs (N-terminal and Full) or with corresponding control Abs prior to exposure to
HeLa cells (at 1µg/ml). Twenty-four hours later, cells were washed, fixed, permeabilized and
stained with mouse anti-Vpr mAbs (IgG2A) (8D1) (red) and mouse anti-γ-H2AX mAbs
(IgG1) (green). Cells were stained with appropriate mouse secondary mAbs and DAPI was
used to highlight the nuclei (blue). Images were acquired by confocal microscopy. Note that
cells exposed to soluble Vpr plus blocking anti-Vpr Abs display a Vpr intracellular staining
that was essentially excluded from the nucleus and partially at the cell periphery while cells
exposed to soluble Vpr plus control Abs display an intracellular/nuclear Vpr staining. Images
shown are representative of multiple fields. White bars = 10 µm. (B) Histograms represent
mean percentage of cells having >10 DNA damage foci (± standard deviation) in two
independent experiments.
141
FIGURE S3
A
Vpr
DAPI + Vpr
Control Abs
Brightfield
% cells with greater than 10 DNA damage foci
B
45.7
21.4
25.2
17.2
Control Abs
142
Brightfield + Vpr
DISCUSSION
1. Le mécanisme
Les résultats présentés dans cette thèse ont permis de décrire une nouvelle activité
biologique de Vpr qui consiste à augmenter l’expression de ligand du récepteur NKG2D,
notamment ULBP2, à la surface des cellules infectées et non infectées. Fait important,
l’implication de Vpr dans la régulation positive des ligands de NKG2D induite par le VIH-1 a
été corroborée par d’autres études indépendantes [553-555]. Nous avons démontré que cette
activité de Vpr nécessite le recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase
DDB1-
CUL4AVprBP et de l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par la kinase ATR.
Nos résultats concordent avec une série d’études démontrant que l’induction d’un arrêt de
cycle en G2/M par Vpr dépend non seulement de l’activation de la voie de dommage à l’ADN
ATR, mais également du recrutement par Vpr du complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1CUL4AVprBP. Selon le plus récent modèle, le recrutement de ce complexe E3 ligase permettrait
la polyubiquitination et la dégradation d’un substrat cellulaire situé sur la chromatine, qui
résulterait par l’activation de la voie ATR. À cet effet, les mutants de Vpr qui sont incapables
de lier le complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP (Vpr Q65R) ou la chromatine
(Vpr R80A), semblent inefficaces à induire l’une ou l’autre des activités de Vpr (Chapitre 1,
figure 5) [555]. De plus, ces deux activités biologiques de Vpr semblent sensibles à une
inhibition de la kinase ATR, mais insensibles à l’inhibition de la kinase ATM (chapitre 1,
figure 5) [555]. Par ailleurs, notre laboratoire a récemment établi que la plupart des protéines
Vpr provenant d’isolats primaires du VIH-1 (groupe M ,N, O et P) possèdent également la
capacité d’induire une augmentation de l’expression d’ULBP2 et d’induire l’activité
cytolytique NKG2D dépendante des cellules NK [554]. Seul un variant de Vpr appartenant au
clade D du groupe M, démontrant un défaut de localisation et une inefficacité à induire des
dommages à l’ADN, semble incapable d’induire un arrêt de cycle et de réguler positivement
ULBP2. Parallèlement, l’habileté d’induire un arrêt de cycle en G2/M semble être conservée
au niveau de tous les variants de Vpr capables de réguler positivement ULBP2, ce qui renforce
le rôle central de la voie de signalisation ATR dans ces deux activités biologiques de Vpr.
Bien qu’il existe une certaine corrélation entre ces deux activités biologiques, il est peu
143
probable que l’induction d’un arrêt de cycle par Vpr puisse être à l’origine de la régulation
positive des ligands de NKG2D. En effet, il fut démontré que le traitement de cellules avec de
la Roscovitine, un inhibiteur des protéines kinases cycline-dépendantes (cdk) capable
d’induire un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et G2/M [556], n’induit pas d’augmentation
de l’expression des ligands de NKG2D [337]. Plus spécifiquement, l’induction d’un arrêt de
cycle en G2/M en aval de la kinase ATR, en inhibant particulièrement le complexe Cdc2Cycline B comme le fait Vpr, n’affecte pas les niveaux de surface d’ULBP2. En effet, tel que
présenté à la figure de l’annexe 1, l’induction d’un arrêt de cycle en G2/M, à l’aide d’un
plasmide exprimant un mutant dominant négatif de Cdc2, semble n’avoir aucun effet sur
l’expression d’ULBP2, contrairement à l’utilisation d’un activateur connu d’ATR
(l’aphidicoline) qui augmente l’expression d’ULBP2. Ces résultats suggèrent que ces deux
activités nécessitent l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par ATR, mais
utilisent probablement deux voies de signalisation distinctes en aval d’ATR. À cet effet, une
perspective intéressante de notre étude serait d’identifier et caractériser la voie de signalisation
précise en aval de la kinase ATR, permettant la régulation positive des ligands de NKG2D
induite par Vpr. L’identification de cette voie pourrait alors représenter un outil utile afin
d’inhiber la régulation positive des ligands de NKG2D sans affecter l’induction d’un arrêt de
cycle induit par Vpr et vice-versa, ce qui permettrait de distinguer le rôle de ces deux activités
de Vpr dans la réplication et la pathogenèse du virus. Chose certaine, ces résultats illustrent
encore une fois le rôle central de la voie de dommage à l’ADN ATR et de surcroit le
recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase dans les activités biologiques de Vpr. En
effet, en plus de ces deux activités de Vpr, ceux-ci sont à l’origine de l’induction de
l’apoptose, de la transactivation des LTRs, de la dégradation d’UNG2 ainsi que de l’inhibition
de la traduction des protéines cellulaires induites par Vpr.
Bien que nos résultats démontrent que cette activité de Vpr dépend de l’activation
spécifique de la voie ATR, une récente étude suggère que Vpr pourrait également utiliser la
voie de dommage à l’ADN contrôlée par la kinase ATM afin d’induire une régulation positive
optimale des ligands de NKG2D [553]. En absence de la protéine Vif, qui dégrade
normalement le facteur de restriction APOBEC3G, cette enzyme catalyse la désamination de
certains résidus cytidine en uridine au niveau de l’ADN proviral [128,129]. L’étude de
144
Norman et ses collaborateurs suggère que le recrutement par Vpr de l’uracil glycosylase
UNG2, qui permet une déglycosylation de ces uridines au niveau de l’ADN proviral, induit
des dommages à l’ADN permettant l’activation de la voie de signalisation ATM, ce qui
cumulé à l’activation de la voie ATR, permet une régulation positive plus importante des
ligands de NKG2D. Les auteurs de cette étude observent alors une régulation positive plus
importante des ligands de NKG2D induite par Vpr en absence de Vif et qui corrèle avec une
augmentation de l’expression d’APOBEC3G au niveau de la cellule [553]. Ces résultats
restent tout de même quelque peu controversés puisqu’une autre étude suggère plutôt que
l’absence de Vif lors de l’infection n’aurait aucun effet sur cette activité de Vpr [555], tandis
que d’autres études suggèrent que Vpr favorise plutôt la dégradation d’UNG2 [319-321].
Chose certaine, ce phénomène ne se produit pas dans le contexte d’un virus complet et même
en absence de Vif, il semble tout de même claire que l’activation de la voie de dommage à
l’ADN contrôlée par ATR reste le mécanisme majeur impliqué dans la régulation positive des
ligands NKG2D [553].
2. Le rôle des voies de dommage à l’ADN dans la modulation des fonctions effectrices des
cellules NK
Un nombre croissant d’évidences indique que les voies de dommage à l’ADN
contôlées par les kinases ATR et ATM pourraient représenter un mécanisme commun afin de
réguler l’expression de ligands des récepteurs activateurs des cellules NK. En effet,
l’activation de ces voies de dommage à l’ADN, en réponse à des stress génotoxiques, des
stress oxydatifs ou une stimulation antigénique, induit non seulement une régulation positive
de ligands de NKG2D, mais également de ligands du récepteur activateur DNAM-1 exprimé
par les cellules NK [557,558]. Notamment, il fut démontré que la stimulation antigénique de
lymphocytes T induit une régulation positive du ligand de DNAM-1, PVR. L’expression de
PVR est alors principalement observée au niveau de cellules se retrouvant dans les phases S et
G2/M du cycle cellulaire et exprimant le marqueur de dommage à l’ADN, γ-H2AX [558]. À
cet effet, de récents résultats obtenus par l’une de nos collaboratrice, Dr Margherita Doria,
suggèrent que l’activation de la voie ATR par Vpr permettrait également la régulation positive
145
de PVR au niveau d’une lignée cellulaire T CD4+ immortalisée (Vanessa et al., non publié).
Tout comme dans le cas d’ULBP2, cette activité de Vpr nécessiterait le recrutement du
complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et l’activation de la voie de dommage à
l’ADN contrôlée par ATR. Bien que PVR soit négativement régulé par Nef et Vpu, ce ligand
est tout de même détecté au niveau des lymphocytes T CD4+ primaires infectés par le VIH-1
[174]. De plus, lorsque le récepteur NKG2D est inhibé à l’aide d’anticorps bloquants,
l’utilisation d’anticorps bloquants supplémentaires contre DNAM-1
réduit davantage la
capacité des cellules NK à détruire les cellules infectées, ce qui confirme l’implication de ces
deux récepteurs dans la lyse des cellules infectées [174]. Ces résultats pourraient expliqués
pourquoi l’utilisation d’anticorps bloquants contre NKG2D ne réduit pas completement la lyse
de cellules T par les cellules NK induite par Vpr. Plus important encore, il est envisageable
que Vpr puisse également réguler positivement PVR au niveau des cellules avoisinantes non
infectées via des formes solubles ou associées à des particules défectives, ce qui pourrait alors
contribuer, avec ULBP2, à augmenter la susceptibilité des lymphocytes T CD4+ non infectés à
l’activité cytolytique des cellules NK.
3. L’effet de cette activité biologique de Vpr sur la réplication et la propagation du virus.
Nos travaux démontrent que cette régulation positive d’ULBP2 induite par Vpr
augmente considérablement l’activité cytolytique des cellules NK (Chapitre 1). Parallèlement,
le VIH-1 semble avoir développé différentes stratégies afin de réduire la susceptibilité des
cellules infectées à l’activité cytolytique des cellules NK qui est dépendante du récepteur
NKG2D. En effet, la protéine Nef réduit l’expression des ligands de NKG2D, notamment
ULBP2 [173], tandis que la dégradation d’APOBEC3G par Vif prévient une régulation
positive optimale des ligands de NKG2D par Vpr [553]. De plus, Vpu diminue l’expression de
NTBA, le ligand du récepteur coactivateur NTBA dont l’engagement est requis afin d’induire
la dégranulation NKG2D-dépendante des cellules NK [220]. Cependant, même en présence de
toutes ces protéines accessoires, l’expression de Vpr lors de l’infection semble être suffisante
afin d’augmenter la susceptibilité des lymphocytes T CD4+ infectés à la lyse par des cellules
NK autologues (Figure 2, chapitre 1) [555]. A priori, cette activité biologique de Vpr pourrait
donc sembler défavorable pour la réplication et la propagation du virus. À cet effet, dans le
contexte d’une infection de lymphocytes T CD4+ primaire purifiés, nous constatons une plus
146
grande proportion de lymphocytes T CD4+ infectés dans le contexte d’une infection avec un
virus de type sauvage comparativement à un virus qui n’exprime pas Vpr, possiblement dû à
l’effet transactivateur de Vpr au niveau des LTRs. Cependant, cet avantage semble être perdu
lors de l’infection de l’ensemble des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP)
(Figure de l’annexe 2). Cette réduction de la propagation de virus exprimant Vpr au niveau des
lymphocytes T CD4+ dans le contexte d’une infection des CMSP semble dépendre de la
présence des cellules NK, puisque leur retrait du système permet de rétablir la proportion de
cellules infectées observé au niveau de l’infection de lymphocytes T CD4+ purifiés (Figure de
l’annexe 2). Ces résultats suggèrent alors que les cellules NK ont le potentiel de réduire la
réplication et la propagation de virus exprimant Vpr possiblement via l’activation de leur
activité cytolytique. Conséquemment, ceci suggère que l’expression de Vpr pourrait
représenter un désavantage pour le virus à court terme. À cet égard, tout comme le VIH-1, le
cytomégalovirus murin (CMVM) produit des protéines virales pouvant réguler négativement
l’expression des ligands du récepteur NKG2D. Chose intéressante, il fut suggéré que des
mutants de CMVM dépourvus de ces gènes, en dépit d’une atténuation précoce de leur
réplication, semble finalement induire une infection persistante plus durable que le virus de
type sauvage au niveau de modèle murin [559]. En ce sens, il ne faut pas écarter la possibilité
que cette régulation positive d’ULBP2 par Vpr puisse être dans un premier temps
désavantageuse, mais que par la suite, qu’elle puisse contribuer à la pathogenèse virale et
représenter un avantage pour le virus à long terme in vivo. Il est également possible que le
virus ait évolué ainsi afin de contrôler sa propre réplication pour éviter d’être trop nuisible
pour son hôte trop rapidement.
4. La contribution potentielle de cette activité de Vpr dans la pathogenèse du VIH-1.
Le fait que cette activité soit conservée au niveau de la plupart des allèles de Vpr
provenant d’isolats primaires du VIH-1 [554] et que les lymphocytes T CD4+ infectés de
patients VIH+ présentent des niveaux élevés des ligands de NKG2D [496], suggère que cette
activité de Vpr joue possiblement un rôle important dans la pathogenèse du virus. Plus
spécifiquement, c’est ULBP2 qui semble être le ligand le plus exprimé in vivo au niveau des
147
cellules infectées et son expression semble corréler avec une augmentation de la susceptibilité
des lymphocytes T CD4+ infectés à la lyse par les cellules NK autologues [496]. Puisque nos
travaux démontrent que Vpr est le facteur viral clé impliqué dans la régulation positive des
ligands de NKG2D et tout particulièrement ce ligand (chapitre 1, figure 1 et 3), il est donc
envisageable que Vpr puisse contribuer à cette régulation positive d’ULBP2 in vivo. Il est tout
de même possible que cette régulation positive des ligands de NKG2D soit simplement une
conséquence indirecte d’une autre activité biologique de Vpr reliée à l’activation de la voie
ATR, qui elle, offre un avantage sélectif déterminant au virus. Cependant, le rôle de
l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par ATR par Vpr dans la réplication ou
la pathogenèse du VIH-1 reste encore méconnu. D’une part, l’augmentation légère de la
transcription des LTRs en G2/M (de 2 à 5 fois) [82,266,288,289,296] pourrait représenter un
avantage, quoique cet effet semble plutôt minimal comparativement à l’effet de la protéine
régulatrice Tat qui augmente de plus de 100 fois la transcription des LTRs [560]. En revanche,
cette légère augmentation de la transcription des LTRs pourrait compenser pour la diminution
de la réplication et de la propagation du virus en présence de cellules effectrices comme les
cellules NK (Figure de l’annexe 1). Par ailleurs, il est possible que cette régulation positive
d’ULBP2 au niveau des lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés induite par Vpr puisse
contribuer à long terme à la pathogenèse virale, non seulement en favorisant la destruction des
lymphocytes T CD4+, mais également en participant à l’activation chronique du système
immunitaire menant à une perte progressive des fonctions effectrice des cellules NK et des
lymphocytes T CD8+ qui sont dépendants de NKG2D.
4.1 Rôle dans la destruction des lymphocytes T CD4+ induite par le VIH-1
Une expression inappropriée des ligands du récepteur NKG2D au niveau de cellules
saines et l’activation du récepteur NKG2D ont le potentiel de briser la délicate balance entre
l’activation et la tolérance du système immunitaire et ainsi induire une réponse immunitaire
auto-immune. Plusieurs maladies auto-immunes sont associées à une expression des ligands de
NKG2D et d’une activation de ce récepteur, incluant la maladie de Crohn [561], le diabète de
type 1[562-564], l’arthrite rhumatoïde [565,566] et la maladie de Celiac [451,567]. Dans la
148
plupart de ces maladies auto-immunes, la production d’IL-15 semble induire ou exacerber une
réponse immunitaire qui est dépendante du récepteur NKG2D. Rappelons qu’une stimulation
des cellules NK ou des lymphocytes T CD8+ avec de l’IL-15 favorise une régulation positive
du récepteur NKG2D ainsi qu’une amplification du signal d’activation transmit par celui-ci
[442,451,452]. Notamment, la production d’IL-15 semble contribuer à une augmentation de
l’expression et l’activation du récepteur NKG2D au niveau des lymphocytes T CD8+ dans le
contexte de la maladie de Celiac, ce qui favorise leur activité cytolytique indépendamment
d’une stimulation du TCR [451]. L’interaction entre NKG2D et ses ligands semble également
contribuer à la pathogenèse d’autres virus, tel le virus de l’hépatite B (VHB). En effet,
l’induction de l’expression de ligands de NKG2D par le VHB au niveau des hépatocytes
semble être à l’origine de dommages hépatiques importants en réponse à l’induction d’une
réponse immunitaire initiée par les cellules NK et NKT [568-570]. Par ailleurs, l’inhibition de
l’interaction entre le récepteur NKG2D et ses ligands prévient l’établissement d’une hépatite
aiguë et de lésions hépatiques induites par le VHB et les cellules NKT [568]. En ce sens, nos
travaux démontrent que Vpr à la capacité d’induire une régulation positive d’ULBP2, non
seulement au niveau de lymphocytes T CD4+ infectés, mais également au niveau de
lymphocytes T CD4+ sains non infectés, ce qui pourrait contribuer à la destruction globale des
lymphocytes T CD4+ qui caractérise la pathogenèse du VIH-1. À cet effet, il est possible que
la production massive d’IL-15, qui caractérise la phase aigüe de l’infection par le VIH-1 [494],
puisse non seulement contribuer à l’expansion et l’activation des cellules NK, mais également
augmenter l’expression du récepteur NKG2D et favoriser une activation des fonctions
effectrices des cellules NK qui sont dépendantes de NKG2D. De plus, il est également
possible que cette régulation positive d’ULBP2 puisse également induire une réponse
immunitaire des cellules NKT, puisque qu’une stimulation de leurs fonctions cytolytiques est
possible via le récepteur NKG2D indépendamment d’une stimulation de leur TCR [455]. Par
ailleurs, la production d’IL-15 lors de l’infection pourrait également favoriser l’activation des
fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+ qui sont dépendantes du récepteur NKG2D
sans stimulation du TCR, tel que décrit pour la maladie Celiac [451]. Une perspective
intéressante de notre étude serait donc d’établir si cette activité biologique de Vpr a le
potentiel de réguler également les fonctions effectrices d’autres cellules du système
149
immunitaire comme les cellules NKT ou les lymphocytes T CD8+, notamment en présence
d’IL-15.
Nos résultats concordent avec plusieurs études suggérant que le virus pourrait utiliser
les cellules NK afin de désarmer le système immunitaire en favorisant la destruction des
lymphocytes T CD4+ sains non infectées. En effet, une série d’études démontrent que
l’expression de ligand du récepteur activateur NKp44 (NKp44L) induit au niveau des
lymphocytes T CD4+ par le motif 3S de gp41 pourrait contribuer à la destruction des
lymphocytes T CD4+ [546,551]. Puisque NKp44L est régulé négativement par Nef au niveau
des cellules infectées, c’est principalement les lymphocytes T CD4+ non infectés qui seraient
détruits par les cellules NK [175]. De plus, il fut suggéré que les cellules NK pourraient
également détruire les cellules non infectées via leur activité CCDA. En effet, il semblerait
que les cellules non infectées ont la capacité de lier des formes solubles des protéines Tat, Nef
et gp120 lors de l’infection. En présence d’anticorps contre ces protéines stimulant l’activité
CCDA, ces cellules non infectées deviennent alors susceptibles à l’activité CCDA des
différentes cellules du système immunitaire incluant les cellules NK [571-574]. Dans le même
ordre d’idée, nos travaux démontrent que Vpr, sous forme soluble ou incorporée au niveau de
particules défectives, a le potentiel d’augmenter la susceptibilité des lymphocytes T CD4+ non
infectés à l’activité cytolytique des cellules NK via une régulation positive d’ULBP2. Tout
comme dans le cas de gp41 et de NKp44L, les cellules non infectées exprimant Vpr pourraient
alors être plus susceptibles à l’activité cytolytique des cellules NK que ne le sont les cellules
infectées. Notamment, le travail conjoint des autres protéines accessoires (Vif, Nef et Vpu)
[173,174,220,553], permet de réduire la reconnaissance des cellules infectées par le récepteur
NKG2D et DNAM-1 des cellules NK. De plus, puisque Vpr est incorporé au niveau des
particules virales via une interaction avec la protéine Gag, il est également possible que
l’interaction entre Gag et Vpr lors des étapes tardives du cycle viral, puisse réduire cette
activité de Vpr au niveau de la cellule infectée. En effet, notre laboratoire a observé que la coexpression de Vpr et Gag au niveau de cellules immortalisées semble induire une
séquestration cytoplasmique de Vpr, ce qui réduit notamment l’induction d’un arrêt de cycle
en G2/M par Vpr [235]. Il est donc envisageable que les lymphocytes T CD4+ non infectés
transduits par Vpr, en absence d’expression de Vpu, Nef, Vif et Gag, puissent exprimer des
150
niveaux plus importants d’ULBP2 et de PVR et qu’ils démontrent une plus grande
susceptibilité à une lyse par les cellules NK.
Bien que les formes soluble et associée aux virions de Vpr puissent toutes deux réguler
positivement ULBP2 au niveau de lymphocytes T CD4+, il est concevable que la contribution
du Vpr associée aux particules défectives puisse être plus importante que le Vpr soluble dans
le contexte d’une infection in vitro (Chapitre 2, figure 3), mais également in vivo. En effet, la
protéine Vpr soluble qui est sécrétée dans le milieu extracellulaire peut être la cible de
protéases cellulaires ainsi que d’une réponse immunitaire humorale pouvant réduire son effet
biologique au niveau des cellules non infectées. Tout d’abord, notre laboratoire a démontré
qu’une proportion de Vpr sécrétée subit un clivage à la surface des cellules infectées par des
proprotéines converstases [232]. Ce clivage se produit spécifiquement au niveau d’un site de
clivage conservé situé dans le domaine fonctionnel riche en arginine de la partie C-terminal de
la protéine. Ce processus, conduit à la production de formes tronqués de Vpr soluble qui sont
incapable d’induire un arrêt de cycle en G2/M ou d’apoptose, lorsqu’exprimé au niveau de
cellules humaines. Puisque ces deux activités de Vpr nécessitent l’activation de la voie ATR, il
est possible que ce clivage puisse aussi affecter la régulation positive d’ULBP2 induite par
Vpr. Ces résultats suggèrent que le travail de ces proprotéines convertases pourrait alors
permettre de réguler les niveaux de Vpr soluble active dans le milieu extracellulaire. De plus,
des anticorps dirigés contre la protéine Vpr sont retrouvés dans une proportion importante des
personnes séropositives [575,576] et certains d’entre eux ont démontré une habilité à bloquer
certaine activité de Vpr, notamment l’augmentation de la réplication virale induite par Vpr
[230]. Il est donc envisageable que les proprotéines convertases ainsi que les anticorps antiVpr puissent amoindrir la capacité du Vpr soluble à réguler positivement ULBP2 au niveau
des cellules non infectées. En revanche, l’incorporation de Vpr au niveau des particules virales
défectives pourrait alors protéger Vpr du travail de ces protéases et des anticorps anti-Vpr. À
cet effet, aucun clivage du Vpr incorporé au niveau de la particule virale n’est observé [232].
De plus, comparativement au Vpr soluble qui a le potentiel de transduire n’importe quelle
cellule, les particules défectives ont l’avantage de spécifiquement acheminer Vpr au niveau de
cellules qui sont normalement susceptibles à l’infection, c’est-à-dire les lymphocytes T CD4+
151
et les macrophages. Puisque les macrophages sont réfractaires à une activation de la voie ATR
[275], il est donc probable que le Vpr incorporé aux particules virales puisse réguler
positivement l’expression d’ULBP2 préférentiellement au niveau des lymphocytes T CD4+,
les cellules immunitaires préférenciellement détruites lors de l’infection par le VIH-1. Bref, il
est probable que le Vpr incorporé au niveau des particules virales défectives puisse contribuer
davantage à la destruction des lymphocytes T CD4+ non infectés. Cependant, seule
l’utilisation d’un modèle in vivo pourrait permettre de déterminer la contribution exacte de
chacune des formes de Vpr dans cet aspect de la pathogenèse du VIH-1.
4.2 Rôle dans l’activation chronique du système immunitaire et la perte des fonctions
des cellules NK et des lymphocytes T CD8+.
L’infection par le VIH-1 est caractérisée non seulement par une perte du nombre de
lymphocytes T CD4+, mais également par l’établissement d’une activation chronique du
système immunitaire, ce qui participe à la détérioration progressive du système immunitaire.
En plus de contribuer à la perte progressive du nombre de lymphocytes T CD4+, la régulation
positive d’ULBP2 induite par Vpr a aussi le potentiel de contribuer à l’établissement d’une
activation chronique du système immunitaire via l’activation des cellules NK, mais également
des cellules NKT et des lymphocytes T CD8+ qui expriment le récepteur NKG2D. Cette
activation soutenue pourrait progressivement participer à l’épuisement et l’altération profonde
des fonctions des cellules NK et lymphocytes T CD8+ qui est constatée lors de la phase
chronique de l’infection. Plus précisément, de récentes études démontrent que cette phase de
l’infection est associée avec une réduction de l’activité NKG2D dépendante des cellules NK,
qui serait attribuable à une diminution de la transcription et de l’expression du
récepteur NKG2D [535,536]. Ce phénomène semble dépendre d’une réplication active du
virus puisque cette diminution de l’activité et de l’expression du récepteur NKG2D n’est pas
observée au niveau de patients contrôleurs ou traités aux ARV [535,536]. Cette perte de
fonction du récepteur NKG2D serait associée avec une augmentation des formes solubles des
ligands de NKG2D, MICA et ULBP2, dans le sérum des patients infectés, probablement
libérées par les cellules infectées [535,536]. En ce sens, l’infection in vitro de lymphocytes
T CD4+ primaires par le VIH-1 induit une augmentation de la sécrétion de forme soluble de
MICA et ULBP2 [536]. Rationnellement, il est possible que la régulation positive d’ULBP2
152
induite par Vpr puisse contribuer à l’augmentation de la sécrétion de formes solubles
d’ULBP2 au niveau du sérum et conséquemment participer à la diminution de l’activité et de
l’expression du récepteur au niveau des cellules NK in vivo. Ainsi, tout comme les tumeurs, le
VIH-1 pourraient indirectement supprimer la reconnaissance des cellules infectées par les
cellules NK, en augmentant la sécrétion de ligands solubles de NKG2D dans le sérum et ainsi
entraîner une altération profonde des fonctions effectrices des cellules NK. Cependant, il ne
faut pas exclure la possibilité qu’une stimulation soutenue des cellules NK avec des
lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés exprimant des niveaux élevés d’ULBP2 puisse
également contribuer à réduire l’expression et l’activité du récepteur NKG2D. Rappelons-nous
que plusieurs études in vitro et in vivo ont clairement démontré qu’une stimulation chronique
du récepteur NKG2D avec des cellules exprimant les ligands de NKG2D semble gravement
altérer les fonctions effectrices des cellules NK qui sont dépendantes du récepteur NKG2D
[453,491,492]. Bien que ces études aient utilisées des modèles murins ou des cellules NK de
souris, nos résultats présentés à la figure de l’annexe 3 suggèrent qu’une stimulation soutenue
du récepteur NKG2D au niveau de cellules NK humaines primaires semble induire des effets
biologiques similaires. En effet, des cellules NK humaines primaires, stimulées avec des
cellules CEM.NKR exprimant des niveaux élévés des ligands de NKG2D suite à un traitement
à l’aphidicoline (Chapitre 1, Figure 3B), démontrent une augmentation de l’expression du
marqueur d’activation CD69 (Figure annexe 3A) et une réduction de l’expression du récepteur
NKG2D (Figure annexe 3B). De plus, ces cellules démontrent également une réduction de leur
habileté à dégranuler suite à une activation de NKG2D, tel qu’évalué par des expériences de
dégranulations redirigées dans laquelle seul le récepteur NKG2D est activé en utilisant des
anticorps agonistes à NKG2D et des cellules cibles exprimant le récepteur Fc. (Figure annexe
3C). Il est important de mentionner que bien que le virus puisse réduire la destruction des
cellules infectées par les cellules NK, il ne prévient pas l’activation de celle-ci. En effet, il fut
démontré que la régulation négative de NTBA par Vpu au niveau des cellules infectées, réduit
la dégranulation NKG2D dépendante des cellules NK sans toutefois prévenir l’activation des
cellules NK via le récepteur NKG2D [220]. Il est donc possible que le virus puisse utiliser une
double stratégie afin d’interférer avec les fonctions des cellules NK [577]. Dans un premier
temps, le virus pourrait réduire la dégranulation des cellules NK par l'action de Vpu, ce qui
permettrait de protéger partiellement les cellules infectées de l’activité cytolytique des cellules
153
NK. Dans un deuxième temps, l'activation soutenue des cellules NK déclenchée par Vpr, via
une régulation positive d’ULBP2 au niveau des cellules infectées et non infectées, pourrait
alors mener à une perte progressive des fonctions des cellules NK qui sont dépendantes de
NKG2D.
Parallèlement, cette activité de Vpr pourrait également induire des effets biologiques
similaires au niveau des lymphocytes T CD8+. À cet effet, une diminution de l’expression du
récepteur NKG2D au niveau des lymphocytes T CD8+ totaux et spécifiques au VIH-1 est
également observée [536,578]. Le défaut de costimulation encouru pourrait alors contribuer à
l’altération de la réponse immunitaire des lymphocytes T CD8+ spécifique au VIH-1. En
revanche, l’expression du récepteur est maintenue au niveau des lymphocytes T CD8+ totaux
et spécifique au VIH-1 chez les patients contrôleurs [578]. Une activation des lymphocytes
T CD8+ pourrait être à l’origine de ce phénomène, puisque l’expression du récepteur semble
inversement corréler avec la présence de marqueur d’activation tel CD38 [578]. Au même titre
que les cellules NK, il est démontré qu’une stimulation soutenue des lymphocytes T CD8+
avec des ligands de NKG2D exprimés par des cellules [453,579] et/ou sous formes solubles
[480,580], peut induire une réduction de l’expression de NKG2D et altérer la réponse des
lymphocytes T CD8+. En définitive, l’augmentation de l’expression d’ULBP2 au niveau des
lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés induites par Vpr et la sécrétion possible de
formes solubles d’ULBP2 pourrait alors contribuer à une perte progressive des fonctions
effectrices des cellules NK et des lymphocytes T CD8+ qui sont dépendants de NKG2D.
Encore une fois, ce phénomène pourrait être exacerbé par la production massive d’IL-15 par le
système immunitaire en réponse à l’infection, en favorisant une activation NKG2Ddépendante de ces cellules effectrices.
5. L’utilisation d’un modèle in vivo.
Tel que mentionné ci-haut, l’identification et la caractérisation de cette nouvelle
activité biologique de Vpr nous amènent à spéculer sur le rôle possible de celle-ci dans la
pathogenèse du VIH-1. Cependant, seule l’utilisation de modèles in vivo pourrait nous
permettre d’établir la contribution réelle de cette activité de Vpr dans la destruction des
154
lymphocytes T CD4+ ainsi que la perte des foncions des lymphocytes T CD8+ et des cellules
NK induites par le VIH-1. À cet égard, plusieurs modèles murins humanisés pouvant prendre
en charge l’infection et récapituler la pathogenèse du VIH-1, ont été générés durant les
dernières années [581]. Il s’agit principalement de souris immunodéficientes irradiées, puis
greffée avec des cellules souches humaines et/ou des tissus humains. Les souris humanisées
s’avèrent un modèle de plus en plus utilisé afin étudier la réplication et la pathogenèse du
VIH-1, mais également la réponse immunitaire anti-VIH-1 in vivo. Plus spécifiquement le
modèle murin humanisé BLT (« Bone marrow, Liver, Thymus ») représente un outil
intéressant puisqu’il permet la reconstitution d’un système immunitaire adaptatif humain au
niveau de la souris [582,583]. Ces souris sont générées suite à une greffe de moelle osseuse
réalisée par l’injection de cellules souches humaines au niveau de souris immunodéficientes
préalablement greffées avec des fragments de foie fœtal et de tissus thymiques autologues. Ce
modèle murin permet notamment la formation bona fide d’un thymus humain rendant possible
la maturation et l’éducation des cellules T humaines, mais permet également la reconstitution
de plusieurs cellules humaines tels les macrophages, les DC et les cellules B [581-583].
Plusieurs études ont utilisé ce modèle afin d’étudier la réponse immunitaire cellulaire et
humorale anti-VIH-1 ainsi que la destruction des lymphocytes T CD4+ induite par le VIH-1 in
vivo [584-586]. Ce modèle pourrait alors être utile afin de déterminer la capacité de Vpr
d’induire une régulation positive d’ULBP2 in vivo au niveau des lymphocytes T CD4+
infectés et non infectés, sa contribution dans la destruction des lymphocytes T CD4+ induite
par les lymphocytes T CD8+ ou les cellules NKT ainsi que sa contribution dans la perte
progressive des fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+. Aucune étude sur les fonctions
des cellules NK lors de l’infection par le VIH-1 n’a toutefois encore été faite au niveau des
modèles murins humanisés. Cependant, il est démontré que l’administration ou l’expression
d’IL-15 ou de complexe IL-15/récepteur d’IL-15 humain au niveau de souris humanisées
permet le développement et la maturation de cellules NK humaines KIR+ NKG2D+
possédants un potentiel cytolytique [587-590]. Par conséquent, les modèles murins humanisés
pourraient également représenter des modèles de choix afin d’évaluer la contribution de Vpr
dans la destruction des lymphocytes T CD4+ induite par les cellules NK et la perte des
fonctions effectrice des cellules NK induites par le VIH-1 in vivo. En revanche, il reste à
établir si les cellules NK humaines dans le contexte des souris humanisées subissent une
155
éducation adéquate au niveau de la moelle osseuse et si l’expression transgénique de HLA
humain chez la souris est nécessaire. En plus des souris humanisées, le singe reste un modèle
in vivo largement utilisé dans la recherche sur le VIH-1 et pourrait représenter une solution
alternative, quoique plus dispendieuse. L’utilisation du modèle d’infection de singe avec le
virus de l’immunodéficience simien-humain (VISH), plus spécifiquement le macaque
cynomolgus (Macaca fascicularis), a notamment permis de confirmer l’implication des
cellules NK et du peptide 3S de gp41 dans la destruction des lymphocytes T CD4+ in vivo
[551]. À cet effet, ce macaque pourrait particulièrement représenter un modèle de choix,
puisque l’infection de celui-ci avec le VISH semble induire une réduction de l’expression de
NKG2D au niveau des cellules NK [591]. Cependant, puisque ces macaques sont seulement
susceptibles à une infection par le VIS ou le VIHS et que le gène Vpr de ces virus est d’origine
simienne, la confirmation de la capacité du Vpr du VIS à réguler positivement ULBP2 est un
prérequis avant l’utilisation de ce modèle.
6. Vpr : cible ou stratégie thérapeutique ?
L’utilisation de modèles in vivo permettra d’établir la contribution réelle de cette
régulation positive d’ULBP2 induite par Vpr dans la pathogenèse du VIH-1. Dans le cas d’une
contribution importante, cette interaction entre le virus et le système immunitaire pourrait
représenter une cible thérapeutique potentielle. Plus spécifiquement, l’interaction entre Vpr et
le complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP via VprBP représenterait une cible
idéale pour le développement de molécule inhibitrice. L’inhibition de cette interaction
permettrait non seulement d’inhiber la régulation positive d’ULBP2 induite par Vpr, mais
également plusieurs autres activités de Vpr. Cependant, dans le cas d’une contribution mineure
de cette activité de Vpr dans la pathogenèse virale, celle-ci pourrait alternativement être
exploitée comme une stratégie thérapeutique afin de contrôler l’infection. Plus précisément,
une diminution de l’activité protectrice des autres protéines accessoires pourrait alors
augmenter la susceptibilité des cellules infectées à une lyse par les cellules effectrices induite
par Vpr et ainsi permettre une meilleure reconnaissance des cellules infectées par les cellules
effectrices et par conséquant, un contrôle plus efficace de la réplication virale. À cet effet, il
serait intéressant de déterminer si cette activité de Vpr ainsi que les activités protectrices des
156
autres protéines accessoires (Vpu, Nef et Vif) sont conservées au niveau des différents
lentivirus infectant les primates. Plus précisément, il serait intéressant d’établir quels sont les
niveaux d’expression des ligands de NKG2D induits par ces différents virus et déterminer s’il
existe une corrélation entre le niveau d’expression des ligands NKG2D induits par ces virus et
leur pathogénicité.
Cette nouvelle activité biologique fait de Vpr un candidat intéressant pour le
développement de nouvelle thérapie génique anticancéreuse. En effet, l’acheminement ou
l’expression de Vpr au niveau de cellules cancéreuses à le potentiel d’augmenter leur
susceptibilité à une réponse du système immunitaire, incluant les cellules NK. À cet égard,
l’utilisation de vecteur lentiviraux exprimant Vpr a déjà démontré une activité anticancéreuse
in vivo au niveau de modèle murin [592]. Fait intéressant, l’activité anticancéreuse de ces
vecteurs lentiviraux s’est avérée plutôt inefficace au niveau de souris immunodéficiences,
suggérant l’implication d’une réponse immunitaire dans l’activité anticancéreuse de Vpr [592]
.
CONCLUSION
Nos travaux ont permis identifié Vpr comme le facteur viral clé impliqué dans la
régulation positive des ligands du récepteur activateur NKG2D induite par le VIH-1. Nous
démontrons que Vpr augmente spécifiquement ULBP2 et active l’activité cytolytique des
cellules NK via un mécanisme qui nécessite le recrutement du complexe d’ubiquitine E3
ligase DDB1-CUL4AVprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par la
kinase ATR. Plus important encore nous démontrons que Vpr augmente également
l’expression d’ULBP2 au niveau des cellules non infectées, ce qui suggère que Vpr pourrait
également favoriser la destruction des cellules non infectées via l’activation des fonctions
effectrices des cellules NK. À cet effet, nous démontrons que le Vpr associé à des particules
virales défectives a le potentiel d’augmenter l’expression d’ULBP2 au niveau de cellules non
infectées, en plus augmenter leur susceptibilité à la lyse par des cellules NK autologues. De
plus, nous décrivons pour la première fois que Vpr, sous forme soluble, a la capacité d’induire
157
des dommages à l’ADN et de réguler positivement ULBP2 suite à la transduction de différents
types cellulaires, incluant des cellules T. Nous proposons donc que cette régulation positive
d’UBP2 induites par Vpr pourrait contribuer à la destruction des lymphocytes T CD4+
infectés et non infectés induite par le VIH-1 via l’activation des fonctions cytolytiques des
cellules NK.
Cependant beaucoup de travail reste à faire afin d’établir la contribution de cette
nouvelle activité biologique de Vpr dans la pathogenèse du VIH-1. Notamment, il serait
important d’établir si cette activité biologique de Vpr a le potentiel de réguler les fonctions
d’autres cellules effectrices, notamment les cellules NKT et les lymphocytes T CD8+. De plus,
l’utilisation de modèles in vivo pourrait permettre d’établir la contribution réelle de cette
activité de Vpr dans la destruction de lymphocytes T CD4+, l’activation chronique du système
immunitaire et la perte des fonctions effectrices des cellules NK et des lymphocytes T CD8+
induite par le VIH-1. En parallèle, la caractérisation de la voie de signalisation précise
permettant cette régulation positive d’ULBP2 induite par Vpr permettra de distinguer le rôle
de cette activité de Vpr dans la pathogenèse du VIH-1, des autres activités de Vpr nécessitant
l’activation de la voie ATR. Finalement, une meilleure compréhension de la contribution de
cette activité de Vpr dans la pathogenèse du VIH a le potentiel de permettre le développement
de nouvelles cibles ou stratégies thérapeutiques contre l’infection par le VIH-1.
Contributions majeures de la thèse
1. Première évidence que Vpr est le facteur viral clé impliqué dans la régulation
positive des ligands NKG2D, notamment ULBP2, induite par le VIH-1.
2. Première évidence que l’expression de Vpr, seule ou dans le contexte de l’infection
par le VIH-1, est suffisantes afin d’augmenter la susceptibilité des lymphocytes T
CD4+ à l’activité cytolytique de cellules NK autologues.
158
3. Démonstration que la régulation positive d’ULBP2 induite par Vpr nécessite le
recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP
et
l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par la kinase ATR.
4. Première évidence que Vpr augmente également l’expression d’ULBP2 au niveau
des cellules non infectées lors de l’infection de lymphocytes T CD4+ primaires.
5. Démonstration que le Vpr associé à des particules virales défectives a le potentiel
d’induire la destruction de lymphocytes T non infectée par les cellules NK via une
régulation positive d’ULBP2.
6. Première évidence que Vpr, sous forme soluble, a la capacité d’induire des
dommages à l’ADN et une régulation positive d’ULBP2.
7. Proposition d’un modèle par lequel Vpr pourrait contribuer à la destruction des
lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés induite par le VIH-1 via l’induction
des fonctions cytolytiques des cellules NK.
159
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216
ANNEXES
Figure annexe 1. L’induction d’un arrêt de cycle en G2/M à l’aide d’un mutant dominant
négatif de Cdc2 n’induit pas de régulation positive d’ULBP2.
Des cellules HEK293T furent co-transfectées avec un plasmide exprimant la GFP (« Green
fluorescent protein ») et un plasmide exprimant le mutant dominant négatif Cdc2 D146N ou
un plasmide contrôle, tel qu’indiqué. Parallèlement des cellules HEK293T furent traitées 16h
avec 4µM d’aphidicoline. A) Nous avons ensuite évalué le profil du cycle cellulaire des
cellules GFP+ par cytométrie en flux, 48h post-transfection, à l’aide d’un marquage à l'iodure
de propidium. B) Parallèlement, nous avons également évalué l’expression d’ULBP2 au
niveau des cellules GFP+ 48h post-transfection ou au niveau de la population totale des
cellules traitées ou non avec de l’aphidicoline par cytométrie en flux, à l’aide d’anticorps
spécifique dirigés contre ULBP2 et d’anticorps secondaire appropriée conjugué à un
fluorochrome. Les moyennes de fluorescences indiquées ont été calculées en soustrayant les
valeurs correspondantes au contrôle isotypique (ligne pointillée). Les résultats présentés sont
représentatifs des données obtenues à partir de deux expériences indépendantes.
217
Figure annexe 1
A
B
Control
Cdc2 D146N
G2/M:G1=0,85
G2/M:G1=1,65
-APC: 93.6
+APC: 254.6
100
100
80
80
60
% of Max
% of Max
Control: 110.0
Cdc2 D146N: 129.3
60
40
40
20
20
0
0
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
ULBP2
218
0
10
1
10
2
10
3
10
4
Figure annexe 2. Les cellules NK réduisent la proportion de lymphocytes T CD4+
infectés par un virus de type sauvage comparativement au virus défectif pour
l’expression de Vpr.
Des lymphocytes T CD4+ primaires (CD4), des cellules mononucléaires du sang périphérique
(CMSP) et des cellules mononucléaire du sang périphérique dont les cellules NK furent
délaités (CMSP-NK), provenant de même donneur, ont été infectés avec des virus exprimant
la GFP de type sauvage (TS) (NL4.3.ADA.GFP) ou défectif pour l’expression de Vpr (ΔVpr)
(NL4.3.ADA.GFP.ΔVpr). Au pic d’infection, le pourcentage de lymphocytes T CD4+ infectés
vivant (cellules AquabasCD3+CD8-) a été évalué par cytométrie en flux multiparamétrique à
l’aide d’anticorps dirigés contre CD3, CD8 et du colorant de viabilité Aqua. Le Graphique
représente le ratio du pourcentage de lymphocytes T CD4+ vivant infectés avec le virus de
type sauvage comparativement au virus défectif pour Vpr. Chaque couleur représente un
même donneur. NS : non significatif, * : p<0.005 tel qu’évalué par le test t de Student par
séries appariées.
219
C
M
220
K
SP
-N
M
D
4
*
SP
C
C
Ratio du % de cellules CD3+CD8- infectées
dans le contexte d’un virus TS vs Vpr
Figure annexe 2
NS
*
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Figure annexe 3. La stimulation continue de cellules NK humaines, avec des cellules
CEM.NKR traitées à l’aphidicoline, induit une augmentation de leur activation, une
réduction de l’expression de NKG2D et une diminution de la dégranulation dépendante
de NKG2D.
Des cellules CEM.NKR furent traitées 16h avec de l’aphidicoline (4µM) afin d’augmenter
l’expression des ligands de NKG2D (voir figure 3, chapitre 1). Des cellules CEM.NKR non
traitées ou traitées à l’aphidicoline furent ensuite irradiées avec 10Gy de Cs137 avant d’être
ajoutées à des cellules NK primaires humaines d’un même donneur en présence d’IL2(100U/ml) à un ratio de 1 :1, une fois par jour pendant trois jours. Les cellules NK furent
ensuite séparées des cellules cibles en triant les cellules CD4-CD56+ par cytométrie en flux.
A) Le niveau d’activation des cellules NK viables fut évalué par cytométrie en flux à l’aide
d’anticorps dirigé contre le marqueur d’activation CD69, CD3, CD56 et du colorant de
viabilité Aqua. Les histogrammes résprésentent les moyennes de fluorescence de CD69 au
niveau de cellules NK viables (CD3-CD56+Aquabas). B) Le niveau de surface du récepteur
NKG2D fut évalué par cytométrie en flux à l’aide d’anticorps dirigés contre NKG2D, CD3,
CD56 et du colorant de viabilité Aqua. Les histogrammes résprésentent les moyennes de
fluorescence de NKG2D au niveau de cellules NK viables (CD3-CD56+Aquabas). C)
L’habileté des cellules NK à dégranuler suite à l’activation du récepteur NKG2D fut évaluée
par des expériences de dégranulation redirigées. Pour ce faire, les cellules NK furent incubées
4h avec des cellules P815 en présence d’anticorps de souris dirigés contre le récepteur
NKG2D humain ou d’IgG de souris. Puisque les cellules murines P815 expriment le récepteur
Fc, en présence d’anticorps dirigés contre NKG2D, ces cellules permettrent d’induire
spécifiquement une dégranulation dépendante du récepteur NKG2D. Le pourcentage de
cellules NK viables ayant dégranulés fut ensuite évalué par cytométrie en flux à l’aide
d’anticorps dirigés contre le marqueur de dégranulation CD107a, CD3, CD56 et du colorant
de viabilité Aqua. Les grapiques représentent le pourcentage de cellules NK viables (CD3CD56+Aquabas) positive pour CD107a. Les résultats présentés sont représentatifs des données
obtenues à partir de trois expériences indépendantes. Cellules NK/CEM.NKR : les cellules
NK humaines stimulées avec des cellules CEM.NKR non traitées à l’aphidicoline. Cellules
221
NK/CEM.NKR.APC : les cellules NK humaines stimulées avec des des cellules CEM.NKR
traitées à l’aphidicoline.
Figure annexe 3
A
B
Cellules NK/CEM.NKR.APC: 83.0
Cellules NK/CEM.NKR: 52.7
Cellules NK/CEM.NKR.APC: 9.7
Cellules NK/CEM.NKR: 21.0
80
80
% of Max
100
% of Max
100
60
40
60
40
20
20
0
101
0
10 2
0
103
1
0
10
CD69
2
10
3
10
NKG2D
C
P815+IgG
P815+anti-NKG2D
8.2
3
10
3
Cellules NK
/CEM.NKR
2
2
10
1
10
10
1
10
0
0
CD56
33.4
10
0
1
10
2
10
3
12.8
3
10
0
10
2
1
10
2
10
3
3
10
17.5
10
2
10
10
1
1
10
10
0
0
0
1
10
2
10
3
10
0
1
10
2
10
CD107a
222
3
10
Cellules NK
/CEM.NKR.APC