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PACES
CAHIER D'EXERCICES de B I O C H I M I E 2 0 1 3 -­‐ 2 0 1 4 Protéines -­‐ Biologie moléculaire Structure des glucides et des lipides Bioénergétique -­‐ Métabolisme Edité par le Département de Biologie
http://aristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/
Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013
2
CAHIER D'EXERCICES POUR PACES
BIOCHIMIE
SOMMAIRE
Page
Préambule : devenir des QCMs et annales de concours
3
I. Protéines
1. Techniques d'étude des protéines
................................
2. Structure des protéines
........................................
3. Fonction des protéines
........................................
4. Enzymologie
................................................
4.1 Généralités
............................................
4.2 Enzyme Michaëlien
.......................................
4.3 Enzyme Allostérique
......................................
5. Problèmes de révision
........................................
4
6
8
10
10
11
13
13
II. Biologie moléculaire : l'étude des acides nucléiques
1. Transcription
.................................................
2. Traduction
...................................................
3. Réplication
...................................................
4. Problème de révision
..........................................
ANNEXES
I • Code génétique
...........................................
II • Codes des acides aminés
..................................
19
20
22
24
27
27
III. Structure des glucides et des lipides
1. Glucides
2. Lipides
.....................................................
......................................................
28
29
IV. Métabolisme énergétique
1. Glycolyse
...................................................
2. Cycle de Krebs
...............................................
3. Chaîne respiratoire mitochondriale
................................
4. Exercices de synthèse
.........................................
32
33
34
36
V. Métabolisme glucido-lipidique
1. Métabolisme du glycogène
......................................
2. Néoglucogenèse
..............................................
3. Métabolisme des lipides
.........................................
4. Régulations du métabolisme des glucides et des lipides en physiopathologie . .
Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013
3
Préambule Devenir des QCMs et annales de concours Les cahiers d’exercices de biochimie des années passées contenaient des QCMs, qui pour la plupart étaient issues de sujets de concours des années passées. Depuis 3 ans, ces QCMs ont été mis en ligne sur MonUPMC, l’espace numérique de travail de la Faculté. Vous pouvez ainsi tester directement vos connaissances et surtout accéder aux corrections qui sont enrichies de commentaires justifiants les réponses. A l’issue du 1er trimestre, environ 15 jours avant les épreuves du concours, les sujets des 2 années précédentes seront proposés comme concours blanc en se mettant dans les conditions du concours, c'est-­‐à-­‐dire avec un temps de réponse limité. Cette année, vous ne trouverez plus ces QCMs dans le cahier d’exercices, le département d’enseignement ayant choisi de ne mettre ces QCMs à disposition que sur MonUPMC, accessible à tous. Pour y accéder : • Connectez-­‐vous sur votre espace personnel du Site MonUPMC : http://mon.upmc.fr • Rubrique cours : plateforme SAKAI • Rubrique PACES QCM • Cliquez dans le menu de gauche sur Test & Quiz • Choisissez le test que vous souhaitez faire. • Une fois que l'évaluation est terminée et enregistrée, vous pouvez alors accéder aux corrigés en cliquant sur l'évaluation dans les "Evaluations remises" (en 1ère page). Chaque évaluation peut être réalisée 3 fois. Une note indicative est enregistrée dans votre « carnet de notes ». Ceci peut servir de repère pour la progression personnelle mais n’a, bien sûr, aucun impact sur les épreuves et résultats du concours. Un tutoriel est disponible dans le module ePartage de PACES, qui contient l’ensemble des documents de cours et ED. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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I . P R O T E I N ES Image de couverture :
Structure d'un cristal de BRCA2, une protéine déficiente dans des formes héréditaires de
cancer du sein (Science-13sep2002 : www.sciencemag.org)
1. TECHNIQUES D’ETUDE DES PROTEINES 1.1
Filtration sur gel En chromatographiant des protéines de poids moléculaires connus sur une colonne de gel filtration, on peut déterminer leur volume d’élution (Ve) et tracer une courbe d’étalonnage qui permet d’évaluer le poids moléculaire d’une protéine inconnue. Les données ci-­‐contre sont utilisées pour tracer la courbe d’étalonnage ci-­‐dessous. (* le bleu dextran est un polymère de haut PM) 210
bleu dextran*
uréase
aldolase
sérum albumine
ovalbumine
chymotrypsinogène
lysozyme
PM
( kDa )
1000
500
150
65
45
25
Ve
( mL )
80
90
115
150
170
190
14
200
Volume d’élution
190
170
150
130
110
90
70
10
20
30
50
70
100
200
300
500
700
1000
PM (kDa)
Une protéine X, chromatographiée dans les mêmes conditions expérimentales, est éluée à un volume d’élution de 130 ml. a. Justifier l’ordre d’élution des protéines de PM connus. b. Evaluer le PM de la protéine X. Cette protéine X est ensuite analysée par électrophorèse SDS-­‐PAGE, et on détecte une seule bande correspondant à un PM apparent de 25 kDa. Après traitement de la protéine X par un excès de β-­‐mercaptoéthanol, la même analyse par électrophorèse ne donne toujours qu’une seule bande à 25 kDa. c. Sur quel principe est basée la détermination du PM apparent mesuré par électrophorèse SDS-­‐
PAGE ? En quoi diffère-­‐t-­‐il de la chromatographie par gel filtration ? d. Proposer une structure schématique pour la protéine X Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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e. La protéine X est un enzyme dont le substrat est le glucose. Quel serait l’intérêt d’une colonne d’affinité glucose pour étudier un mélange de protéines contenant la protéine X ? f. La protéine X est associé à deux protéines Y et Z. Quelle stratégie pouvez vous proposer pour isoler le complexe protéique et les liaisons et intéractions éventuelles dans le complexe XYZ 1.2 Soit une protéine (A) oligomérique d’un poids moléculaire (PM) de 240 000 Daltons. Sa structure quaternaire est étudiée par la détermination des poids moléculaires à l’issue de divers traitements: a. Traitement par le β -­‐mercaptoéthanol 0,1M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de 120 000 Da. b. Traitement par l’urée 8M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de 80 000 Da. c. Traitement par le β-­‐mercaptoéthanol 0,1M et l’urée 8M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de 40 000 Da. •
•
•
•
•
Quels sont les effets de ces différents traitements ? Ces résultats ont-­‐ils été obtenus par gel-­‐filtration ou SDS-­‐PAGE ? Proposer un volume d’élution en gel filtration sur la colonne de l’exercice 1.1 de la protéine (A) dans un tampon 0,1M β -­‐mercaptoéthanol. Proposer un schéma de migration de la protéine (A) en SDS-­‐PAGE. Quelle est la structure quaternaire de cette protéine ? 1.3 Expliquer et commenter ces affirmations. a. Pour une valeur de pH supérieure à son pI, une protéine porte toujours une charge négative et pour une valeur de pH inférieure à son pI, une protéine porte toujours une charge positive. Une solution contenant de l’albumine (pI= 4,6), de la β-­‐lactoglobuline (pI = 5,2) et du chymotrypsinogène (pI= 9,5) est chargée sur une colonne de DEAE cellulose à pH 5,4. (Le DEAE est une molécule chargée positivement) La colonne est éluée par un gradient de NaCl de concentration croissante. b. Proposer un ordre d’élution de la colonne pour ces protéines. 1.4 Influence du pH sur la conformation d’un peptide. Le squelette peptidique est flexible. Il se replie de manière adéquate pour associer les résidus chargés par des liaisons ioniques (dans cet exemple). Ce peptide possède des conformations variables en fonction du pH. A l’aide des valeurs de pKa des acides aminés données dans le tableau ci-­‐dessous, attribuer une des conformations proposées pour le peptide étudié, aux pH suivants : pH 2 -­‐ pH 5,5 -­‐ pH 7 -­‐ pH 11 -­‐ A
pH 13 AA
Asp
chaîne
latérale
3,9
Glu
4,1
His
6,0
Lys
10,5
Arg
11,5
pKa
extrémité
terminale
B
C
C-terminal
4,2
N-terminal
10,6
D
E
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2. STRUCTURE DES PROTEINES 2.1 Citez le ou les acide(s) aminé(s) correspondant à chacune des propriétés suivantes : a. sa chaîne latérale possède un atome de soufre, mais pas de groupement thiol. b. possède un groupement α aminé substitué
c. sa chaîne latérale est aromatique et phosphorylable. d. joue un rôle important dans le maintien de la structure des protéines par la capacité de sa chaîne latérale à établir des liaisons covalentes réversibles par oxydoréduction. e. est capable de former des liaisons H par l’intermédiaire de sa chaîne latérale. f. est capable de former des liaisons ioniques par l’intermédiaire de sa chaîne latérale. g. possède une chaîne latérale à fonction basique majoritairement non chargée à pH7. h. sa chaîne latérale contient une fonction amide. i. possède à pH7 un très fort excédent de charges (+). 2.2 Soient les peptides suivants : ( 1 ) V a l -­‐ L e u -­‐ M e t -­‐ T y r -­‐ P h e -­‐ G l y -­‐ L e u -­‐ A l a -­‐ T r p -­‐ G l y ( 2 ) A l a -­‐ V a l -­‐ G l u -­‐ A l a -­‐ L e u -­‐ A r g -­‐ I l e -­‐ V a l -­‐ G l u -­‐ S e r a. Lequel de ces deux peptides présente la plus forte probabilité d’adopter une conformation en hélice a? b. Dans le peptide (2), l’acide aminé numéro 6 est muté en proline : Quelles sont les conséquences pour la structure du peptide? c. Quelles sont les conséquences du traitement à l’urée de ces deux peptides ? d. Pourquoi les protéines transmembranaires ont-­‐elles une proportion importante de structure en hélice ? e. Le peptide (2) possède des propriétés amphiphiles. Pourquoi ? f. Ces peptides sont ils phosphorylables ? Justifiez votre réponse ? 2.3 Dans une protéine globulaire hydrosoluble, quels acides aminés dans la liste suivante : méthionine, histidine, arginine, phénylalanine, valine, glutamine, acide glutamique, tyrosine pensez vous trouver : a. à la surface de la protéine ? b. à l’intérieur de la protéine ? 2.4 Le déroulement d'une hélice a s'accompagne d'une diminution de son pouvoir rotatoire. L'acide polyglutamique (Glu)n est en conformation d'hélice a à pH3. Quand le pH augmente, le pouvoir rotatoire diminue. De la même façon la polylysine (Lys)n est hélicoïdale à pH 10, mais son pouvoir rotatoire décroît à pH acide. Expliquez l'effet du pH sur la conformation de (Lys)n et (Glu)n. 2.5 On dispose de 3 tripeptides de séquences connues : 1 : Leu-­‐Asp-­‐Leu a
b
c
2 : Leu-­‐Lys-­‐Leu 3 : Asp-­‐Leu-­‐Lys. a-­‐ On dépose un mélange de ces 3 peptides sur un gel dépôt
d’électrophorèse à pH 7 (sans SDS) et, après migration et révélation, on observe le schéma ci-­‐contre : Compte tenu de la polarité indiquée, à quels peptides correspondent les taches notées a, b et c ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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b-­‐ Le même mélange est analysé sur un gradient allant de pH 3 à pH10. En utilisant une représentation similaire à la question précédente, indiquer la position relative de ces 3 peptides après migration, selon que le mélange est déposé aux extrémités droite ou gauche, ou bien au milieu du gel. (Préciser sur le schéma les zones acide et basique ainsi que la polarité des électrodes). 2.6 L’hydrolyse totale d’un octapeptide P8 permet d’identifier les acides amines suivants : Ala , Asp , Arg , 2 Gly , Phe , Ser et Val Il est possible, par action d’une aminopeptidase sur un peptide, d’identifier l’acide aminé qui est en position N-­‐terminale ; de même, une carboxypeptidase permet d’identifier l’acide aminé en position C-­‐terminale. L’action de la trypsine sur P8 fournit un tripeptide TP3 et un pentapeptide TP5 ; le traitement de P8 par la chymotrypsine fournit un tripeptide CP3 et un pentapeptide CP5. Tous ces peptides sont isolées et traités indépendamment par l’aminopeptidase et par la carboxypeptidase et les acides aminés ainsi mis en évidence sont indiqués dans le tableau suivant : Trypsine
Chymotrypsine
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
P8
Ala
Val
TP3
Ser
Val
TP5
(non précisé)
(non précisé)
CP3
(non précisé)
(non précisé)
CP5
Asp
Val
A partir de ces indications, déduire la séquence du peptide P8. 2.7 Les mutations pathologiques de la protéine α 1-­‐antitrypsine par les méthodes de la protéomique. La protéine α 1-­‐antitrypsine est importante pour la régulation par inhibition de l’activité de plusieurs « sérine-­‐protéases ». En particulier lorsque l’α1-­‐anti-­‐trypsine est déficiente, la limitation dans le poumon de l’activité enzymatique de l’élastase n’est pas assurée et le développement d’un emphysème pulmonaire est accéléré. La détection de l’anomalie moléculaire devient alors nécessaire. On donne ci-­‐dessous la séquence primaire des 394 acides aminés de l’α1-­‐antitrypsine de type « sauvage » (Wt) : 1
31
61
91
121
151
181
211
241
271
301
331
361
391
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On peut isoler chez des patients emphysémateux des protéines α1-­‐anti-­‐trypsine anormales présentant des mutations faux-­‐sens (substitution d’un aminoacide par un autre) : -­‐ mutation S : E (Glu) 264 → V (Val) -­‐ mutation Z : E Glu) 342 → K (Lys) -­‐ mutation JD : V (Val) 213 → A (Ala) Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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On connaît également une mutation Sarrebruck (Sarr) où les 19 aminoacides C-­‐terminaux sont tronqués (soulignement simple dans la séquence sauvage). a. Donner le nom de la technique de séparation classiquement utilisée dans le cadre de l’analyse protéomique, en indiquant succinctement son principe (technique I). b. Par quelle technique analytique complète-­‐t-­‐on habituellement cette technique de séparation ? c. Compléter le tableau suivant, de façon à prévoir comment vont se comporter les 4 protéines α1-­‐
anti-­‐trypsine anormales mentionnées par rapport à la protéine sauvage lorsque l’on appliquera la technique I et proposer un schéma des résultats attendus si on soumet un mélange composé de la protéine sauvage et des 4 protéines anormales à cette technique. aa Wt
aa Mutant
Conséquence
sur la charge
Conséquence
sur la masse
Mutant S
Mutant Z
Mutant JD
Mutant Sarr
d. On s’aperçoit que, avec cette technique I, deux de ces protéines migrent au même endroit et ne peuvent être distinguées. De quelles protéines s’agit-­‐il ? Quelle autre technique chromatographique peut-­‐on envisager pour les séparer et les isoler ? e. Le peptide 192-­‐217 (double souligné dans la séquence) est obtenu par hydrolyse ménagée de la protéine sauvage. Ce peptide est-­‐il phosphorylable ? Justifier. En cas de phosphorylation exhaustive, indiquer les modifications de masse et de charge électrique attendues et prévoir schématiquement comment ce peptide se comportera par rapport au peptide non phosphorylé si on lui applique la technique I (on précise que l’addition d’un groupement phosphate augmente le PM de 78 Da). (Rappel : H = 1 ; C = 12 ; N = 14 ; O = 16 ; P = 31 – Il est précisé que, dans les conditions expérimentales utilisées ici, le pouvoir de résolution de l’électrophorèse SDS-­‐PAGE est d’environ 300 Da : 2 peptides ou protéines ne conduiront à une migration significativement différente que si leur poids moléculaire diffère au moins de 300 Da) 3. FONCTIONS DES PROTEINES 3.1 Transport d'O2 Lorsque vous courrez, votre organisme réagit pour bien oxygéner vos muscles. a. Quelles protéines sont mises en jeu et dans quel compartiment de l’organisme ? b. Comment expliquez le transfert d’O2 des poumons vers les muscles ? c. Selon les différentes classifications des protéines (transformation , métabolisme,transport, stockage, réserve …), comment ces protéines seront-­‐elles définies ? d. Pourquoi les chaînes α et β de l’hémoglobine sont-­‐elles capables de s’associer alors que les chaînes de myoglobine ne le font pas ? e. Les acides aminés de ces protéines sont-­‐ils mis directement en jeu pour fixer l’O2 ? Comment ? f. La constante d’affinité de l’O2 pour les sites de fixation de l’O2 sur l’hémoglobine varie en fonction de la concentration d’O2. Comment nomme-­‐t-­‐on ce phénomène ? Comment l’explique-­‐t-­‐on au niveau moléculaire ? g. A haute altitude, la concentration en DPG (2,3-­‐diphospho glycérate) augmente de 50% (après 2 jours à 4000 m). Pourquoi ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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h. Par quel mécanisme l’oxyhémoglobine est elle capable de libérer plus de dioxygène dans les tissus à métabolisme rapide ? i. Du CO dégagé par un poêle mal réglé peut-­‐vous asphyxier en privant toutes vos cellules de l’apport d’O2. Pourquoi ? 3.2 Comparaison de l’hémoglobine fœtale et maternelle. a. Soient les courbes ci-­‐contre de saturation en O2 de l’hémoglobine fœtale et maternelle. Dans les conditions physiologiques, quelle est l’hémoglobine qui a la plus forte affinité pour O2 ? b. Quelle est la signification physiologique de ces différences d’affinité pour l’O2? c. Quand on supprime tout le 2,3 diphosphoglycérate (DPG) lié, les courbes se déplacent vers la gauche, supprimant la différence entre les 2 hémoglobines. • Quel est l’effet du DPG sur l’affinité des Hb pour l’O2 ? • Comment expliquer l’effet plus important sur l’HbA ? 3.3 Contraction musculaire Identifier sur le schéma ci-­‐dessous les protéines qui participent à ce mécanisme. a. Préciser la nature des interactions entre ces protéines. b. Classer ces protéines en protéines structurales et en protéines de régulation. Justifier votre réponse en décrivant brièvement le rôle de ces protéines. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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3.4 Régulation de la contraction musculaire. Après un accident de ski, un patient suit une rééducation comprenant des séances de stimulation musculaire électrique externe : des électrodes parcourues par des pulsions régulières de courant très faible sont placées sur un muscle, ce qui conduit à des contractions musculaires successives. a. Décrire l’effet de cette stimulation musculaire électrique externe sur la contraction musculaire. b. Quelles protéines interagissent directement lors du raccourcissement du sarcomère ? Quel est le rôle de l’ATP dans ce phénomène ? c. La myasthénie est une maladie neuromusculaire chronique liée à un défaut de transmission entre le nerf et le muscle. La faiblesse musculaire augmente à l'effort et peut aboutir à une paralysie partielle du muscle concerné. Le repos améliore la force musculaire. -­‐ La myasthénie est-­‐elle une maladie auto-­‐immune ? Pourquoi ? -­‐ Quels anticorps faut-­‐il rechercher pour en faire le diagnostic ? 4. ENZYMOLOGIE 4.1 Généralités 4.1.1
4.1.2
Caractéristiques des enzymes. • Quelle est la fonction d’un enzyme ? • Quelle partie d'un enzyme est responsable de son activité ? de sa spécificité ? de son action de catalyseur? Expliquer. • Décrire les effets de la température ; de l’urée ; du β-­‐mercaptoéthanol ; des pH extrêmes sur l’activité d’un enzyme. L’absorption de la lumière (quantifiée par l’absorbance A) par un composé chromogène est proportionnelle à sa concentration et est maximale pour une longueur d’onde propre à ce chromogène. A
Les spectres d’absorption de deux chromogènes, le NAD+ et le NADH,H+ sont donnés dans la figure ci-­‐contre. Donner les longueurs d’onde maximales d’absorption de ces deux chromogènes. Application : sachant que le lactate déshydrogénase catalyse la réaction : +
+
Pyruvate + NADH + H  Lactate + NAD Proposer, compte tenu de ces résultats, une méthode de suivi de cette réaction. 4.1.3
Interprétez les différents effets immédiats du pH sur l’activité des 3 enzymes suivantes : papaïne, pepsine et trypsine. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
1
0,8
NAD
0,6
+
NADH,H
+
0,4
0,2
220
260
300
340
longueur d’onde (nm)
380
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4.1.4 Qu'appelle-­‐t-­‐on protéolyse ménagée ? Donner un exemple en donnant les substrats et produits de la réaction : a. d'un enzyme pancréatique, b. d'une hormone peptidique 4.2 Enzyme Michaëlien 4.2.1 On étudie la variation de la vitesse d'une réaction en fonction de la concentration x d'enzyme. Tracer sur le même graphique : a. La courbe obtenue en présence d'une concentration 2x d'enzyme. b. La courbe obtenue en présence d'une même concentration x d'un enzyme qui aurait plus d'affinité pour le substrat. c. La courbe obtenue lorsque la réaction est effectuée à pH 1 à chaud (70°C). S
4.2.2 La constante de Michaelis de l’hexokinase pour le glucose est de 0,15 mM tandis quelle est de 1,5 mM pour le fructose avec des vitesses maximales pratiquement égales. a. Calculer pour chacun des deux oses les vitesses de réactions, exprimées en pourcentage de la vitesse maximale Vm, pour des concentrations initiales (c.à.d. au temps 0) de substrats égales à 0,15mM et 1,5mM. b. Lequel de ces deux oses présente l’affinité la plus grande pour l’hexokinase? c. Dessiner (en choisissant arbitrairement la vitesse maximale) les droites de Lineweaver-­‐Burke correspondant à chacun des deux oses. 4.2.3 L'addition d'un composé X dans une réaction enzymatique entraîne des modifications cinétiques responsables d'un déplacement de la courbe Vi = f(S ) selon le profil ci-­‐dessous (la flèche indique l'effet obtenu sous l'action de concentrations croissantes du composé X) Quelle est parmi les courbes présentées ci-­‐dessous (représentation de Lineweaver-­‐Burk) celle qui correspond à cette situation? Justifier votre réponse. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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4.2.4 La succino-­‐déshydrogénase catalyse la réaction : -­‐
OOC-­‐CH2-­‐CH2-­‐COO-­‐ + FAD  -­‐OOC-­‐CH=CH-­‐COO-­‐ + FADH2 succinate fumarate Pour étudier cette enzyme, on incube, à concentration constante d’enzyme, différentes concentrations de succinate et on mesure les vitesses initiales (exprimées en fumarate formé par unité de temps) en absence puis en présence de 2 effecteurs X1 et X2. Les résultats sont reportés dans le tableau et le graphique suivants : Succinate
a.
b.
c.
d.
Vo ( µmol/l/min de fumarate)
mmol/l
sans effecteur
effecteur X1
effecteur X2
1
3,3
1,75
2,0
2
5,0
3,00
3,0
4
6,6
4,5
4,0
8
8,0
6,30
4,75
Comment passe-­‐t-­‐on des valeurs du tableau à la représentation graphique ci-­‐dessus ? Déterminer graphiquement la valeur de Km et de Vmax en absence d’effecteur. A quel type d’effecteurs correspondent X1 et X2 ? Sachant que l’un des 2 effecteurs ajoutés est le malonate (qui diffère du succinate par un groupement CH2 : -­‐OOC-­‐CH2-­‐COO-­‐ ), indiquer lequel des 2 effecteurs X1 ou X2 peut correspondre au malonate. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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13
4.3 Enzyme Allostérique 4.3.1
La phosphofructokinase (PFK) catalyse la réaction : Fructose 6P + ATP 
Fructose 1-­‐6 bisP + ADP L'activité de la PFK varie en fonction de la concentration en fructose 6P et en ATP de la manière suivante : •
Quelle est la régulation par le fructose-­‐6P pour une concentration donnée d'ATP ? •
Quel paramètre permet de caractériser la variation d'activité en fonction de la concentration en ATP ? •
Quels sont les 2 rôles de l'ATP pour la PFK ? Vi
Vm
ATP faible
ATP fort
Fructose 6P
4.3.2 Soient trois enzymes différents E1, E2 et E3, qui sont activables dans certaines conditions : a. l’activation de E1 s’accompagne d’un changement de configuration quaternaire, sans changement de poids moléculaire ; b. l’activation de E2 s’accompagne d’une diminution de poids moléculaire de l’enzyme; c. l’activation de E3 est contrariée par l’addition d’une phosphatase. • Indiquer les modèles d’activation rendant compte de chacune de ces trois situations. • Donner un exemple de chacun des modèles. 5. 5.1 Problèmes de révision Purification d’une protéine On se propose de purifier, à partir de sérum humain, la protéine de transport plasmatique des hormones sexuelles, dénommée TEBG (testosterone estradiol binding globulin) » ou encore SBP (sex steroid binding protein). La TEBG présente la propriété de lier de façon non covalente et avec une forte affinité la testostérone et l’œstradiol. Cette propriété est mise à profit pour suivre les différentes étapes de la purification de la TEBG : après incubation du sérum avec de la testostérone radioactive qui joue le rôle de traceur, on suit le complexe TEBG-­‐testostérone radioactive en mesurant la radioactivité. Ces étapes sont résumées ci-­‐dessous : a. Traitement du sérum par du sulfate d’ammonium à 50% de saturation, ce qui provoque la précipitation de certaines protéines, tandis que d’autres restent solubles ; les protéines solubles et précipitées sont séparées par centrifugation. Quel est l’intérêt de ce traitement ? La radioactivité est mesurée dans le culot et dans le surnageant et on constate que seul le culot est radioactif : sur laquelle des fractions (culot ou surnageant) faut-­‐il poursuivre la purification ? b. La fraction choisie en (a) est placée dans du tampon phosphate 20 mM, pH 6, NaCl 50 mM. La solution ainsi obtenue est chromatographiée sur une résine échangeuse d’anions ; diverses protéines, dont une fraction radioactive, sont éluées par diminution progressive du pH jusqu’à 5. b.1 Sur quelle propriété des protéines est basée la chromatographie sur résine échangeuse d’ions ? b.2 Que peut-­‐on dire du pI de la TEBG ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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14
c. La fraction radioactive isolée en (b) est déposée sur une colonne de chromatographie par gel filtration (Sephadex G100) et éluée par un tampon phosphate 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7. Le profil d’élution est représenté sur le schéma ci-­‐dessous (DO = densité optique). La colonne de Sephadex G100 a été préalablement calibrée avec 4 protéines de masses moléculaires connues dont les volumes d’élution respectifs sont indiqués sur ce même schéma (flèches). DO 280 nm
Radioactivité
94 kDA
(10 ml)
10
68 kDA
(30 ml)
20
30
43 kDA
60 ml)
40
50
60
30 kDA
(80ml)
70
80
90
Ve (ml)
c.1 Sur quelle propriété des protéines repose la filtration sur gel ? c.2 A quoi correspond la DO mesurée à 280 nm et que permet-­‐elle de suivre ? c.3 Peut-­‐on dire que la fraction radioactive isolée en (b) et chromatographiée ici était très pure ? c.4 Proposer une valeur de volume d’élution pour la TEBG. c.5 En utilisant la grille semi-­‐log ci-­‐dessous, donner une estimation du poids moléculaire de la TEBG. 100
PM (kDa)
70
50
30
20
10
0
10
20
30
40
50
Ve (ml)
60
70
80
90
d. Une aliquote de la fraction radioactive obtenue en (c) est analysée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantes (absence de SDS), à pH 7. Le gel ainsi obtenu est traité par le bleu de Coomassie (coloration spécifique des protéines) puis scanné dans un détecteur de radioactivité, ce qui permet de voir à quelle bande de l’électrophorèse est associée la radioactivité. Les résultats sont schématisés dans la figure ci-­‐dessous, A. d.1 Sur quelle propriété est basée l’électrophorèse utilisée ici ? Quelle est la différence avec l’électrophorèse pratiquée en présence de SDS ? d.2 Que peut-­‐on dire de la pureté de la fraction radioactive obtenue en (c) ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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15
e. Compte tenu des propriétés biologiques de liaison de la TEBG, proposer une technique de purification de cette protéine. f. On utilise la technique mentionnée en (e) et on obtient une nouvelle fraction radioactive que l’on analyse comme en (d) (figure ci-­‐dessous, B). Que peut-­‐on dire de cette dernière fraction obtenue, en terme de pureté ? A
B
Sens de migration
dépôt
+
radioactivité
Etape (d)
+
radioactivité
Etape (f)
g. Sur la fraction purifiée obtenue en (f) on étudie la structure quaternaire de la TEBG en utilisant la technique de filtration sur gel comme en (c), dans différentes conditions expérimentales : 1. dépôt dans des conditions natives. 2. dépôt après traitement par l’urée 8M. 3. dépôt après traitement par l’urée 8M et le mercaptoéthanol en excès. Les résultats sont résumés dans les figures suivantes : Proposer une interprétation de ces derniers résultats. 5.2 Caractérisation d’une enzyme. On s’intéresse à une enzyme E, ubiquitaire, dont on souhaite préciser les principales caractéristiques biochimiques. 5.2.1 On utilise comme source biologique du tissu musculaire obtenu par biopsie. Dans un premier temps l’échantillon est broyé et l’on obtient un lysat cellulaire. a. Ce lysat est centrifugé à basse vitesse (1000 x g). Le surnageant de cette première centrifugation est à nouveau centrifugé à 20000 x g. Que contient le culot de cette seconde centrifugation ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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16
b. On veut savoir si au moins l’un des organites ci-­‐dessus contient l’enzyme E. Pour cela, on détermine l’activité enzymatique du culot mentionné en (a) en présence d’un substrat spécifique de l’enzyme E. Les résultats des mesures sont représentés dans les 3 graphiques ci-­‐dessous : • Quelle est l’information apportée par chaque graphique ? c. Compte tenu de l’ensemble de vos connaissances et des données expérimentales, quel est, à votre avis, l’organite qui contient l’enzyme E ? 5.2.2. On répète la même expérience que celle réalisée dans le graphique B ci-­‐dessus en changeant quelques conditions : a. on diminue de moitié la quantité d’enzyme E. b. on réalise l’incubation après avoir chauffé le lysat cellulaire à 100°C pendant 30 minutes. c. on réalise l’incubation en présence d’un inhibiteur compétitif. Représenter les résultats attendus dans les 3 conditions sur les graphiques suivants : 0
10
20
30
40
Concentration du substrat
Vitesse initiale
Condition c
Vitesse initiale
Condition b
Vitesse initiale
Condition a
0
10
20
30
Concentration du substrat
40
0
10
20
30
40
Concentration du substrat
NB : la courbe obtenue précédemment dans le graphique B (question 1) a été reproduite pour servir de comparaison. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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17
5.2.3. On veut isoler la protéine responsable de cette activité enzymatique. Dans ce but on réalise une analyse biochimique de la fraction résultant de la centrifugation à moyenne vitesse. Le résultat est présenté dans la figure ci-­‐contre : pH3
pH10
a. Comment s’appelle cette analyse ? b. Sur quel critère sont séparées les protéines dans le sens horizontal ? c. Sur quel critère sont séparées les protéines dans le sens a
b
c
vertical ? d. On découpe les spots notés de « a » à « g » et l’on mesure actin
l’activité enzymatique spécifique de ces spots. Les résultats e
d
sont présentés sur le graphique suivant : f
e
• D’après ces résultats, quel est le spot qui contient l’enzyme E ? • Comment expliquer les résultats observés pour le spot g
d ? 5.2.4. Pour vérifier l’hypothèse formulée ci-­‐dessus pour le spot « d », on réalise une expérience dans laquelle, la protéine contenue dans le spot « d » est soumise à plusieurs traitements dans des conditions standard de mesure de l’activité enzymatique : Traitement Résultat mesure de l’activité à pH 8 baisse d’activité incubation préalable avec une enzyme protéolytique forte augmentation d’activité incubation préalable avec de l’aspirine aucun effet Quelles conclusions pouvez-­‐vous en tirer ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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18
5.3 Transport d’O2. Des globules rouges (hématies) sont isolés à partir de sang de lapin et la fixation de l’oxygène à l’hémoglobine est mesurée à pH 7,2 en fonction de la pression partielle en oxygène. On obtient une courbe de saturation et on mesure une valeur de P50 égale à 26 mm Hg. Les hématies sont ensuite homogénéisées et la protéine hémoglobine est isolée et purifiée par différentes chromatographies. On étudie la fixation de l’oxygène sur la protéine purifiée et on observe une modification de la forme de la courbe de saturation sur les hématies intactes. a. Décrire cette modification. b. Quelle en est la cause ? c. La P50 est elle modifiée et si oui dans quel sens ? d. Les hématies intactes sont incubées à pH 7,6 et on mesure dans cette condition la courbe de saturation pour l’oxygène. Pour une pression partielle en oxygène de 26 mm Hg, le taux de saturation est-­‐t-­‐il supérieur ou inférieur à 50% ? e. A pH 7,2, on ajoute aux hématies du monoxyde de carbone de manière à obtenir une pression partielle en CO de 2,6 mm Hg. Quel est dans ces conditions le taux de saturation en oxygène pour une pression partielle en oxygène de 26 mm Hg ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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19
I I . B i o l o g i e m o l é c u l a i r e : é t u d e d e s a c i d e s n u c l é i q u e s Photographie en microscopie électronique d'une fourche de réplication déficiente chez un
mutant de levure. Une anomalie lors de la réplication d'ADN serait l'un des mécanismes
contribuant à l'instabilité génomique
(Science-26 juil 2002 www.sciencemag.org)
1. TRANSCRIPTION 1.1
Déroulement de la transcription d’un gène. L’ADN génomique présenté ci-­‐dessous contient la totalité de la séquence d’un gène codant une protéine. Les segments nucléotidiques soulignés correspondent aux séquences d’ADN de ce gène retrouvées dans l’ARNm. 1
5’............................... CCTAGAGAAC TGTTCCTGGG GTCTGGGACC TTTGCGAAGG
3’............................... GGATCTCTTG ACAAGGACCC CAGACCCTGG AAACGCTTCC
41
CAAGGAAGGG GTAACAGGAT TTCGGGCAGT TGCCCCTGCA GGGCCAATCT AGGCAAGTCC CCTGCGCCAT
GTTCCTTCCC CATTGTCCTA AAGCCCGTCA ACGGGGACGT CCCGGTTAGA TCCGTTCAGG GGACGCGGTA
111
GTCCCTTCGT CTCCTTCTTC CTATATACAG GCCTCCCTCC ACCTGTCTTC TCAGAGCAGG TATAGGCAAG
CAGGGAAGCA GAGGAAGAAG GATATATGTC CGGAGGGAGG TGGACAGAAG AGTCTCTTCC ATATCCGTTC
181
CAGTGCTGCC GTGCTCACCT GGGCTATGGC TCTTCTTTCA GGTGGGTCTC CGACCCTGAC TTCAACGTGG
GTCACGACGG CACGAGTGGA CCCGATACCG AGAAGAAAGT CCACCCAGAG GCTGGGACTG AAGTTGCACC
251
GGGTGTGGGT GGAGGCTGGC CAGAGGGCCC TGTCCACCCT GGGGGAGGAG AGCCCAGGCC CTGATTACCT
CCCACACCCA CCTCCGACCG GTCTCCCGGG ACAGGTGGGA CCCCCTCCTC TCGGGTCCGG GACTAATGGA
321
AGTCCCTCTC CACAGCGTTT TCGGCCACCC AGGCACGGAA GGGCTTCTGG GACTACTTCA GCCAGACCAG
TCAGGGAGAG GTGTCGCAAA AGCCGGTGGG TCCGTGCCTT CCCGAAGACC CTGATGAAGT CGGTCTGGTC
391
CGGGGACAAA GGCAGGGTTG AGCAGATCCA TCAGCAGAAG ATGGCTCGCG AGCCCGCGTG AGTGCCCAGG
GCCCCTGTTT CCGTCCCAAC TAGTCTAGGT AGTCGTCTTC TACCGAGCGC TCGGGCGCAC TCACGGGTAA
461
GGAAGGGGTG TAGGCGAAGG GAGGAGACAG CTGGGCCATG CCATGATGAC CTGCCTCTGC TGCCTCAACC
CCTTCCCCAC ATCCGCTTCC CTCCTCTGTC GACCCGGTAC GGTACTACTG GACGGAGACG ACGGAGTTGG
531
GAGGATCAGT GCGCGATGAC TTGGGGACAA AGGAGATGAT GGAGGCTAGC AGTCTGACGG CCTGGATATC
CTCCTAGTCA CGCGCTACTG AACCCCTGTT TCCTCTACTA CCTCCGATCG TCAGACTGCC GGACCTATAG
601
TGTCCCCTTC TCCAGGACCC TGAAAGACAG GCTGCAGGCC CGTCTGGATG ACCTGTGGGA AGACATCACT
ACAGGGGAAG AGGTCCTGGG ACTTTCTGTC CGACGTCCGG GCAGACCTAC TGGACACCCT TCTGTAGTGA
671
CACAGCCTTC ATGACCAGGG CCACAGCCAT CTGGGGGACC CCTGAGGATC TACCTGCCCA GGCCCATTCC
GTGTCGGAAG TACTGGTCCC GGTGTCGGTA GACCCCCTGG GGACTCCTAG ATGGACGGGT CCGGGTAAGG
741
TCTGGGGAGC ATACTGTGTG CTCTCCCCAT CTCCAGCCCC TCCCTCTGGG TTCCCAAGTT GAAGCCTAGA
AGACCCCTCG TATGACACAC GAGAGGGGTA GAGGTCGGGG AGGGAGACCC AAGGGTTCAA CTTCGGATCA
811
CTTCTGGAAT AAATGAAATA GATGTTTATG GCCTGGCGTG AGTATGTTTG ACTCTCATTT GGACCATGTC
GAAGACCTTA TTTACTTTAT CTACAAATAC CGGACCGCAC TCATACAAAC TGAGAGTAAA CCTGGTACAG
881
TGAAAGCAGT GGCCTCACCA CTATCCCCAA AGCACACCCA TCACCCACTC CATTCCCTTG CTGCTCTTTC
ACTTTCGTCA CCGGAGTGGT GATAGGGGTT TCGTGTGGGT AGTGGGTGAG GTAAGGGAAC GACGAGAAAG
951
GGTTAGAGCA CCACGCTCCC TGCTATGTGA CTGAGGTAGC ..............................3’
CCAATCTCGT GGTGCGAGGG ACGATACACT GACTCCATCG ..............................5’
a.
b.
c.
d.
Quelle est la définition d’un gène ? Quels sont les composants moléculaires nécessaires à la transcription ? Comment se fait l’initiation de la transcription ? Quelle partie de cette séquence peut participer à la régulation de l’expression d’un gène, notamment par un signal hormonal. ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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20
e. Parmi les « motifs » de cette séquence marqués en gras ( ggccaatct / tatata / gt / ag / aataaa / tatgtttg ) : -­‐ Quels sont ceux qui définissent l’orientation de la transcription ? En quoi définissent-­‐ils le brin sens, le brin matrice ? -­‐ Quels sont ceux qui définissent le début et la fin de la transcription ? -­‐ Quels sont ceux qui interviennent lors de la maturation du transcrit primaire ? -­‐ A quoi correspondent les segments soulignés dans cette séquence ? Quels « motifs » interviennent dans le processus qui permet de les réunir ? -­‐ Quel processus permet de retarder la dégradation en 3’ de l’ARN ? 1.2
1.3
La maturation des transcrits primaires d’ARN chez les Eucaryotes comporte un autre événement non évoqué dans l’exercice précédent : a. En quoi consiste-­‐t-­‐il ? b. Quelle est la particularité de la liaison ainsi établie ? c. Citez la ou les fonctions associées à cette modification. Un épissage alternatif à partir du site donneur de l’intron 2 d’un transcrit primaire contenant 7 exons (schématisé ci-­‐dessous) peut aboutir à plusieurs ARN messagers. exon
1
exon GU
2
A
AG exon
3
exon
4
exon
5
exon
6
exon
7
. Quelles sont les différents ARNm qui peuvent être produits à partir de ce transcrit ? . Quelle est leur mode de formation ? . De façon générale, que permet l’épissage alternatif d’un gène pluri-­‐exoniques ? Au cours de l’excision-­‐épissage, une liaison phosphodiester se crée dans les introns libérés. . Précisez les caractéristiques de cette liaison : nucléotides et fonctions impliqués. 2. TRADUCTION 2.1
1
81
161
241
321
401
481
561
641
721
801
881
961
1041
1121
1201
1281
Expression du gène de l’apolipoprotéine E Séquence du gène codant pour l’Apolipoprotéine E humaine(allèle Epsilon 4). (Genbank : HUMAPOE4) GGAACTTGAT
CAATTTGACT
GGGAGGTGCT
AAAACCCAGG
CCAGCCGCCT
ATCTCGGCTC
CGCCCGCCAC
TCCTGACCTT
CCATCCCACT
TTACATTCAT
CTTGGCCCCC
AAAGACCTCT
GGGCTGCCCA
AGTCCTACTC
AGCTCAGGGG
GGCTTGGGGA
GACCCGCTAG
GCTCAGAGAG
CCAGAATCCT
GGAATCTCAT
TCCCATTTGC
AGCCCCACTT
ACTGTAACCT
CACGCCTGGC
AAGTGATTCG
TCTGTCCAGC
CCAGGCACAG
AGAATGGAGG
ATGCCCCACC
GCCCGCCCTA
AGCCCCAGCG
CCTCTAGAAA
GAGGAGGAGC
AAGGTGGGGT
GACAAGTCAT
AACCTTAACC
TTCACATGTG
AAAGCCTCGA
TCTTTTTTTT
CCGCCTCCCG
TAACTTTTGT
CCCACTGTGG
CCCCTAGCCC
GAAAGGACAG
AGGGTGTCTG
TCCTTCCTCC
TCCCTGGGGG
GAGGTGAAGG
GAGCTGGGAC
GGGGGTGAGG
GGGGAGAGCA
Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
TTGCCCAAGG
CAGAAGCACG
GGGAGGGGGC
CTTTTAGCAG
CTTTTTTTGA
GGTTCAAGCG
ATTTTTAGTA
CCTCCCAAAG
TACTTTCTTT
GGTCAGGAAA
TATTACTGGG
CTCTGCCCTG
AGGGGGCGGG
ACGTCCTTCC
CCTGGGAAGC
CAAGCAGCAG
GCTGGACTGG
TCACACAGCT
GCTTCAAGCC
TCCTGTGCTC
GTGCATCATA
GACAGTCTCC
ATTCTCCTGC
GAGATGGGGT
TGCTGGGATT
CTGGGATCCA
GGAGGACTCT
CGAGGTGTCC
CTGTGCCTGG
ACAGGGGGAG
CCAGGAGCCG
CCTGGCCTCC
GGGACTGGAC
GATGTAAGCC
GGCAACTGGC
CTGGAAACCA
AAGGTCACAA
CTGTTCCCAC
CTCTTGCTGA
CTCAGCCTCC
TTCACCATGT
ACAGGCGTGA
GGAGTCCAGA
GGGCGGCAGC
TCCCTTCCTG
GGCAGGGGGA
CCCTATAATT
GTGAGAAGCG
AGGTAGTCTC
CTGGGAAGGG
ATAGCAGGAC
AGACGAGATT
CAATACCTGT
CCAAAGAGGA
CCCTCCCATC
GGCTGGAGTG
CAAGTAGCTA
TGGCCAGGCT
GCTACCGCCC
TCCCCAGCCC
CTCCACATTC
GGGACTGTGG
GAACAGCCCA
GGACAAGTCT
CAGTCGGGGG
AGGAGAGCTA
CTGGGCAGCA
TCCACGAGTT
CACGCCCTGG
GGCAGCCAGG
AGCTGTGATT
CCACTTCTGT
CAGTGGCGAG
GGATTACAGG
GGTCTCAAAC
CCAGCCCCTC
CCTCTCCAGA
CCCTTCCACG
GGGGTGGTCA
CCTCGTGACT
GGGATCCTTG
CACGGGGATG
CTCGGGGTCG
GAGACGACCC
GTCACTATCA
80
160
240
320
400
480
560
640
720
800
880
960
1040
1120
1200
1280
1360
Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013
1361
1441
1521
1601
1681
1761
1841
1921
2001
2081
2161
2241
2321
2401
2481
2561
2641
2721
2801
2881
2961
3041
3121
3201
3281
3361
3441
3521
3601
3681
3761
3841
3921
4001
4081
4161
4241
4321
4401
4481
4561
4641
4721
4801
4881
4961
5041
5121
5201
5281
5361
5441
TTATCGAGCA
CCGTCGATTG
AGAATGTGAA
TTGAACCCCG
TTAAATAGGG
GGCTAACCTG
TCCCCAGACT
GGCGGGGCTT
GGCCCCCTCT
TCCTTGAGAT
CTGTCGCCCA
CTCAGCCTCC
GTTTCACCAT
TTACAGGCGT
GGGCAGCTGT
CGCTGGGCCG
ACACCAGCCT
GCTCTCAGCT
CGCTGCACTC
CCCTCACCCT
CGGGGTCAGA
AGAGCCGGAG
ATTACCTGCG
TGAGTGTCCC
GCTAAGTCTT
ATTCTCTCTC
CCCTAGCTCT
GATCCTCCCG
TCTGCCTCTG
TCTTGGGTCT
TCCCGCCCTC
ACTGACCCCG
TGGAGGACGT
GTGCGCCTCG
GTACCAGGCC
GCCGCGTGCG
CGCGCGCGGA
CAAGCTGGAG
TGGTGGAAGA
CCCAGCGACA
GCAGCGGGAG
ATCTGCTGGC
CAGCCCCCTC
CACCCAGGCT
GTAGCTGGGA
CCAGGCAGGT
TGCCCGGCCT
GCCTCCACCT
CTAGGATTAA
CTCAAGCGAT
TTTGTAGAGA
CAAAGTGCTG
CCTACTGGGT
GAGAACTTTA
GGGAGAATGA
GGAGAGGAAG
AATGGGTTGG
GGGTGAGGCC
GGCCAATCAC
GCTCGGTTCC
TCTGAGGCTT
AGGAGTTAGA
GGCTGGAGTG
CAAGTAGCTG
GTTGGCCAGG
GAGCCACCGC
GATCTTTATT
GTGGCTCACC
GGGCAACATA
ACTCAGGAGG
CAGCCTGGGT
GCCCACCATG
AGGACCCTGA
CCCGAGCTGC
CTGGGTGCAG
CATCCTGGCC
GGGGGGCCTG
TCAGCTTTGT
TTTATATAGA
CCTCGGCCTC
CCCTCTGCAT
CTCTGGCTCA
TCGGCCGCAG
GTGGCGGAGG
GCGCGGCCGC
CCTCCCACCT
GGGGCCCGCG
GGCCGCCACT
TGGAGGAGAT
GAGCAGGCCC
CATGCAGCGC
ATCACTGAAC
ACCCTGTCCC
CTCCCCCTGT
CTCTCCATCT
AGAGTGCAGT
TTACAGGCTC
CTCAAACTCC
CTGCCCCTCT
CCTGGACTCA
TTTGGGGGGG
ACTCCCACCT
CAAGGTCTCA
GGATTCCAGG
GTCCCCAGTG
AAATGAGGAC
GGAATGCGAG
ATGGAATTTT
GGGCGGCTTG
GGGTTGGGGG
AGGCAGGAAG
CCCCGCTCCT
CTGTGCTGCT
AGTTGTTTTG
CAGTGGCGGG
GGACTACAGG
CTGGTCTGGA
ACCTGGCTGG
CTCCATCACC
CCTGTAATCC
GTGAGACCCT
CTGAGGCAGG
GACAGAGCAA
GCTCCAAAGA
CCCGACCTTG
GCCAGCAGAC
ACACTGTCTG
CTTGACCCTC
GGTCTCTGCT
CTCTCTCTCT
GACAGAGAGA
CCAAAGTGCT
CTGCTCTCTG
TCCCCATCTC
GGCGCTGATG
AGACGCGGGC
CTGGTGCAGT
GCGCAAGCTG
AGGGCGCCGA
GTGGGCTCCC
GGGCAGCCGG
AGCAGATACG
CAGTGGGCCG
GCCGAAGCCT
CGCCCCAGCC
GATTTCCTCT
GTGTCTGTGT
GGCACGATCT
ACACCACCAC
TGACCAAGTG
TTCTTTTTTA
AGTGATAAGT
GGTGGTGTGT
TGGCCTCCTG
ATATGTTGCC
CATGGGCTCC
21
TCCTCAGATC
TGAATTAGCT
ACTGGGACTG
CTATGGAGGC
GTAAATGTGC
CGCTGGGGGT
ATGAAGGTTC
CCCCCTCTCA
TCCTGGCTCT
TTGTTGTTGT
ATCTCGGCTC
CACATGCCAC
ACTCCTGACC
GAGTTAGAGG
CCCACACAGC
CAGCACTTTG
GTCTCTACTA
AGGATCGCTT
GACCCTGTTT
AGCATTTGTG
AACTTGTTCC
CGAGTGGCAG
AGCAGGTGCA
CTGGTGGGCG
GGTTCTAGCT
TCCCTTCTGA
TGGGGTCTCA
GGGATTAGAG
CATCTGTCTC
GCCCGCCCCA
GACGAGACCA
ACGGCTGTCC
ACCGCGGCGA
CGTAAGCGGC
GCGCGGCCTC
TGGCCGGCCA
ACCCGCGACC
CCTGCAGGCC
GGCTGGTGGA
GCAGCCATGC
GTCCTCCTGG
AAGCCCCAGC
GTATCTTTCT
TGGCTCACTG
ACCCGGCTAA
ATCCACCCGC
GGGGGCAGGG
GATCCTCCCG
GTGGAGATGG
AGTAGCTGAG
CAGGCTAGTC
GAGCGGCCTG
TCCATAACTG
CATAAATGGA
AGATGGAACC
CGACCTGGGG
TGGGATTAGG
GGGAGGAGTC
TGTGGGCTGC
TCCTCACCTC
GAACAGCGAT
TTGTTGTTGT
ACTGCAAGCT
CACACCCGAC
TCAGGTGATC
TTTCTAATGC
CCTGCCTGGG
GGAGGCCAAG
AAAATACAAA
GAGCCCAGAA
ATAAATACAT
GAGCACCTTC
ACACAGGATG
AGCGGCCAGC
GGAGGAGCTG
GCTATACCTC
TCCTCTTCCC
CTCAGTCTCT
CTGTGTTGCC
GCATGAGCAC
TGTCTCCTTC
TCCCAGCCCT
TGAAGGAGTT
AAGGAGCTGC
GGTGCAGGCC
TCCTCCGCGA
AGCGCCATCC
GCCGCTACAG
GCCTGGACGA
GAGGCCTTCC
GAAGGTGCAG
GACCCCACGC
GGTGGACCCT
CTCAGTTTCT
CTCTGCCCTT
CAACCTCTGC
TTTTTGTATT
CGGCCTCCCA
AAAGGTCTCA
CCTCAGCCTT
GGTCTGGCTT
ACTACTGGCT
TCAAACCCCT
CCCAACTTAA
GGGAGCCAGG
ACACGGCGCT
GGCGGTGGGG
ATGGGGAGAT
CTGTTGCAGA
CTCACTGGCG
GTTGCTGGTC
AACCTCCTGG
TTGACGCTCT
TGTTTTGTTT
CCGCCTCCCA
TAACTTTTTT
TGCCCGTTTC
ATTGCAGGCA
GCACACAAGG
GTGGGAGGAT
AATTAGCCAG
GGTCAAGGTT
AATGCTTTCC
TGTGTGCCCC
CCAGGCCAAG
GCTGGGAACT
CTCAGCTCCC
CCCAGGTCCA
ATTTCTGACT
CACACTCGTC
CAGGCTGGTC
CTTGCCCGGC
TCTCGGCCTC
TCTCCCCCGC
GAAGGCCTAC
AGGCGGCGCA
ATGCTCGGCC
TGCCGATGAC
GCGAGCGCCT
GAGCGGGCCC
GGTGAAGGAG
AGGCCCGCCT
GCTGCCGTGG
CACCCCGTGC
AGTTTAATAA
CTTTCTGCCC
TTTTTTTTTT
CTCTTGGGTT
TTTAGTAGAG
AAGTGCTGAG
CCCTGTCACC
TCCAGTAGCT
TGTTGGCCAG
AGCACCACCA
GGCTCAAGAG
TAATATTGTT
GGCAGCGACA
TAACTGTGAG
AGGGGGTGGG
AAGAGAAGAC
TAATGCAACA
GTTGATTGAC
ACATTCCTGG
CCCCATTCAG
CTGGGCCTCG
TTTTGAGATG
GGTCCACGCC
GTATTTTCAG
GATCTCCCAA
GATAGTGAAT
ACACTCAATA
CACTTGAGCC
GCATGGTGCC
GCAGTGAACC
AAGTGATTAA
TAGGTAGCTA
GTGGAGCAAG
GGCACTGGGT
AGGTCACCCA
GGTTTCATTC
CCTGGCTTTA
CTGGCTCTGT
TTGAACTTCT
CTCCTAGCTC
TGCCCCGTTC
CTCCCCACTG
AAATCGGAAC
GGCCCGGCTG
AGAGCACCGA
CTGCAGAAGC
GGGGCCCCTG
AGGCCTGGGG
CAGGTGGCGG
CAAGAGCTGG
GCACCAGCGC
CTCCTGCCTC
AGATTCACCA
ACATACTGCC
TAGACGGAGT
CAAGCGATTC
ACGAGCTTTC
ATTACAGGCC
CGCCATCACA
GAGACTACAG
GCTGATGTGG
CACCCAGCTT
ATCCTCCGCC
CCTAGAGTTG
CGGTAGCTAG
GTTGGAGCTT
GGGATGGAAT
CAGGAGGGAG
AGGCTTGGAA
AGTTTCTCCT
CAGGTATGGG
ACAGACCCTG
GTTTCCCCCA
AAGTCTCGCT
ATTCTCCTGC
TAGAGACGGG
AGTGCTGGGA
ACCAGACACG
CATGCTTTTC
CAGGAGTTCA
ACACACCTGT
ATGTTCAGGC
ACCGACTCCC
GATGCCTGGA
CGGTGGAGAC
CGCTTTTGGG
GGAACTGAGG
TGCCCCTGTC
GCTCTCTGGA
CTCTGTCCTT
GGGCTCAAGC
CTTCTTCGTC
CTTCTCTCCC
TGCGACACCC
TGGAGGAACA
GGCGCGGACA
GGAGCTGCGG
GCCTGGCAGT
GTGGAACAGG
CGAGCGGCTG
AGGTGCGCGC
TTCGAGCCCC
CGCCCCTGTG
CGCGCAGCCT
AGTTTCACGC
ACACAATTCT
CTGGCTCTGT
TGCTGCCTCA
ACCATGTTGG
TGAGCCACCA
GCTCACTGCA
GCGCATACCA
AATTCCTGGG
TTTATTATTA
ATCGGCCTCC
CACTC
1440
1520
1600
1680
1760
1840
1920
2000
2080
2160
2240
2320
2400
2480
2560
2640
2720
2800
2880
2960
3040
3120
3200
3280
3360
3440
3520
3600
3680
3760
3840
3920
4000
4080
4160
4240
4320
4400
4480
4560
4640
4720
4800
4880
4960
5040
5120
5200
5280
5360
5440
5515
La séquence ci-­‐jointe est celle du brin sens du gène de l'apolipoprotéine E humaine, allèle e4. Le dernier nucléotide de chaque ligne est numéroté sur la droite (n° de position). 2.1.1 Certaines parties de cette séquence ont été soulignées d'un trait simple; examinez avec soin le début et la fin des séquences qui sont situées entre ces séquences soulignées : à quoi correspondent les séquences soulignées ? 2.1.2 Quelles sont les fonctions (rôles) des protéines qui se fixent en premier sur ce gène dans la région allant du nucléotide 975 au nucléotide 1046 ? 2.1.3 Quel est le rôle du triplet de nucléotides en 1871-­‐1873 ? 2.1.4 Quelle est la traduction de la séquence 1847-­‐1913 de ce gène ? 2.1.5 Le nucléotide en position 1913 est un G qui fait partie de la séquence traduite : quelle est sa position dans le cadre de lecture : N1, N2 ou N3 ? 2.1.6 Le nucléotide en position 3007 est un G qui fait partie de la séquence traduite : quelle est a position dans le cadre de lecture : N1, N2 ou N3 ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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22
2.1.7 Quelle sera la longueur après transcription et maturation (comprenant l'addition de 1000 AMP du côté 3'-­‐OH) de l'ARN messager de l'apolipoprotéine E ? 2.1.8 Quel est le rôle du codon (souligné deux fois) TGA en 4496 ? 2.1.9 Quels sont les numéros des nucléotides de la boîte de polyadénylation ? 2.1.10 La sécrétion de la protéine hors des cellules nécessite l'hydrolyse d'un peptide de 18 acides aminés du côté N-­‐terminal. Quel est le rôle de ce peptide ? 2.1.11 De combien d'acides aminés se compose l'apolipoprotéine E mature ? 3ʼ
Soit le schéma ci-­‐contre représentant un ARNt (avec son anticodon). 2.2 a. Quel est le nom de l'acide aminé transporté par cet ARNt ? b. Quel est le nom du nucléotide situé à l'extrémité 3' de cet ARNt ? c. Par quel type de liaison l'acide aminé sera-­‐t-­‐il lié à cet ARNt ? 5ʼ
U A C
2.3 TRADUCTION Au cours de l’élongation du début de la protéine, un ribosome se trouve successivement dans les deux états ci-­‐dessous : -­‐ A gauche avant la synthèse de la liaison peptidique, le site P porte un ARNt lié au peptide Met-­‐Ala-­‐
Val. Le ribosome vient de recruter un ARNt chargé. -­‐ A droite, après la synthèse de la liaison peptidique, les 2 ARNt sont encore fixés aux sites P et A. Précisez les éléments présents aux sites P et A à ce stade du processus. 2.4 Combien de liaisons phosphates riches en énergie sont consommées dans la synthèse d'une protéine de 75 résidus d’acide aminé ? Justifiez votre réponse. 3. REPLICATION 3.1 La réplication La figure ci-­‐contre schématise la mise en place du processus de réplication d’un chromosome : en a est représenté une portion d’ADN bicaténaire et en b ce même ADN au tout début de la réplication. 1. A quoi correspondent les 2 flèches indiquées en a ? 2. A quoi correspondent les structures semi-­‐circulaires représentées en b ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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3. Quelles protéines enzymatiques interviennent pour générer ces structures semi-­‐circulaires et comment agissent-­‐elles ? 4. Quel est l’avantage pour la cellule de générer plusieurs de ces structures semi-­‐circulaires sur un même chromosome ? La progression de la réplication est schématisée en c et d : 5. Repérer en c les brins parentaux et les brins néo synthétisés d’ADN. 6. Dans cette représentation, avez-­‐vous un argument pour assigner une orientation 5’-­‐>3’ à l’un des brins parentaux ? 7. Proposer en e une représentation schématique du stade suivant de la réplication. 8. Nommer la partie encadrée de la figure c ? Cette partie encadrée est agrandie dans la figure ci-­‐dessous. 3’
1
2
7
5
6
4
3
8
5’
9. Sur Identifier dans la liste suivante les éléments de légende 1 à 8 : -­‐ Amorce -­‐ ADN polymérase δ -­‐ Brin direct (ou avancé) -­‐ Brin retardé -­‐ Fragment d’Okazaki -­‐ Primase + ADN polymérase α -­‐ Protéine SSB -­‐ Topoisomérase + hélicase 5’
3
10. Sur ce schéma, dans quelle direction progresse la réplication ? 11. Quels sont les substrats de la primase ? de l’ADN polymérase α ? 12. Y a-­‐t-­‐il nécessité d’amorcer la synthèse d’ADN sur le brin direct ? 13. Pourquoi faut-­‐il plusieurs amorces pour la synthèse du brin retardé ? 14. Quelles sont les réactions catalysées par l’ADN polymérase δ ? 15. Le sens de lecture du brin parental par l’ADN polymérase δ est-­‐il le même sur les 2 brins de l’ADN à répliquer ? 16. Le brin direct est-­‐il toujours le même sur toute la longueur du chromosome ? Sur la figure, on a représenté 2 petits encadrés : ils délimitent 2 zones du brin néo synthétisé qui ont été le siège de réactions très précises ne laissant aucune de trace sur l’ADN final : 17. De quelles réactions s’agit-­‐il ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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3.2 Quel problème se pose lors de la réplication de l’extrémité des chromosomes ? Quelle activité enzymatique spécifique permet d’y répondre ? Quelle particularité structurale présente cette enzyme ? 4. PROBLEME DE REVISION: SEQUENCE, TRANSCRIPTION ET TRADUCTION DU GENE SPO II G. Cet exercice est organisé autour de l’exploitation d’une séquence nucléotidique. On se propose d’analyser cette séquence en vue d’étudier successivement : - le sens de transcription, - le cadre de lecture - l’enchaînement des acides aminés - une propriété biologique de la protéine, La séquence d’ADN représentée ci-­‐dessous est celle d’un fragment de 120 paires de bases entièrement contenu dans la partie traduite du gène spo II G de la bactérie Bacillus subtilis. 5’P
1
11
21
31
GAAAAAACTG
AAATTACGGT TGACGCACCT CTGGTATAAG
41
51
CTGCTGATGA
AACTTGGGCT GAAAAGTGAT GAAGTCTATT
81
91
ACATAGGCGG
G A G T G A A G C C C T G C C G C C T CC A T T A T C T A A
61
71
101
111
3’
OH
1. Le sens de transcription a. Sachant que la séquence donnée est celle du brin sens, indiquer par une flèche sur la séquence ci-­‐dessous le sens de progression de la transcription. Justifier. G A A A A A A C T G A A A T T A C G G T...............G C C C T G C C G C C T C C A T T A T C T A A 1 11 101 111 2. Le cadre de lecture a. Théoriquement l’information génétique portée par l’ARNm peut être traduite de trois façons différentes. Pourquoi ? b. Donner dans le tableau I ci-­‐dessous les différentes séquences prises par les trois codons stop au niveau des trois brins d’acide nucléique. TABLEAU I 5’ P ➜ 3’ OH
Séquences des codons non-sens
1er type
ARNm
brin d’ADN sens
brin d’ADN transcrit
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2ème type
3ème type
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c. Avec des barres verticales, définir les trois cadres de lecture potentiels de la séquence étudiée. Dans chaque cas encadrer les codons stop.
1er CADRE DE LECTURE POTENTIEL 1
11
21
31
GAAAAAACTG
AAATTACGGT TGACGCACCT CTGGTATAAG
41
51
CTGCTGATGA
AACTTGGGCT GAAAAGTGAT GAAGTCTATT
81
91
ACATAGGCGG
GAGTGAAGCC CTGCCGCCTC CATTATCTAA
61
71
101
111
2ème CADRE DE LECTURE POTENTIEL 1
11
21
31
GAAAAAACTG
AAATTACGGT TGACGCACCT CTGGTATAAG
41
51
CTGCTGATGA
AACTTGGGCT GAAAAGTGAT GAAGTCTATT
81
91
ACATAGGCGG
GAGTGAAGCC CTGCCGCCTC CATTATCTAA
61
71
101
111
3ème CADRE DE LECTURE POTENTIEL 1
11
21
31
GAAAAAACTG
AAATTACGGT TGACGCACCT CTGGTATAAG
41
51
CTGCTGATGA
AACTTGGGCT GAAAAGTGAT GAAGTCTATT
81
91
ACATAGGCGG
G A G T G A A G C C C T G C C G C C T CC A T T A T C T A A
61
71
101
111
d. Quel est le cadre de lecture effectivement utilisé pour la synthèse de la protéine ? e. Si au cours d’une expérience préliminaire on établit la séquence d’un seul brin d’un fragment d’ADN que l’on sait être interne à un gène, il est possible, au moins en théorie de déterminer le sens de la transcription. Comment ? 3. L’enchaînement des acides aminés Identifier sur la séquence ci-­‐dessous l’extrémité qui code pour la région N-­‐terminale du fragment protéique. Justifier. 1 11 111 GAAAAAACTG AAAT ................................CCTC CATTATCTAA Une propriété biologique de la protéine Le tableau II présente la composition en acides aminés du fragment protéique analysé. TABLEAU II Acide
Ala
Arg
Asp
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
1
1
1
2
3
1
1
10
6
1
3
3
1
1
3
1
aminé
Nombre
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La protéine codée par le gène spo II G interagit avec l’ADN. Ce fait est-­‐il compatible avec la composition en acides aminés du fragment analysé ? Pourquoi ? 5. SOIT UNE SEQUENCE CODANTE DE 18 NUCLEOTIDES ADN
...
CAT
...
ATA
DOUBLE
-BRIN
...
ARNm
...
ANTICODON
...
GAA
...
GUC
CAG
des ARNt
ACIDE
lys
trp
AMINE
a. Déterminer le sens de transcription. Justifier. b. Orienter l’ARNm, les deux brins de la molécule d’ADN et compléter le tableau. c. Orienter la chaîne polypeptidique en précisant les extrémités NH2 et COOH-­‐terminales. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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ANNEXE I.
CODE GENETIQUE
1er Nucléotide
U
C
A
G
2ème Nucléotide
C
A
U
G
3ème Nucléotide
Phe
Ser
Tyr
Cys
U
Phe
Ser
Tyr
Cys
C
Leu
Ser
Stop
Stop
A
Leu
Ser
Stop
Trp
G
Leu
Pro
His
Arg
U
Leu
Pro
His
Arg
C
Leu
Pro
Gln
Arg
A
Leu
Pro
Gln
Arg
G
Ileu
Thr
Asn
Ser
U
Ileu
Thr
Asn
Ser
C
Ileu
Thr
Lys
Arg
A
Met
Thr
Lys
Arg
G
Val
Ala
Asp
Gly
U
Val
Ala
Asp
Gly
C
Val
Ala
Glu
Gly
A
Val
Ala
Glu
Gly
G
ANNEXE II.
-­‐ Codes des acides aminés A : ala
F : phe
K : lys
P : pro
T : thr
C : cys
G : gly
L : leu
Q : gln
V : val
D : asp
H : his
M : met
R : arg
W : trp
E : glu
I : ile
N : asn
S : ser
Y : tyr
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I I I . S t r u c t u r e d e s g l u c i d e s e t d e s l i p i d e s 1. GLUCIDES Structure 3D du β-D-Glucose 1.1 Soit l’α-­‐D-­‐Glucose : a. Citer un énantiomère, un de ses épimères et un cétose correspondant à ce glucide. b. Quand cet ose est mis en solution dans l’eau, le pouvoir rotatoire est modifié, ce qui traduit l’existence d’une seconde forme du glucose. Expliquer. c. Comment peut-­‐on bloquer l’apparition du phénomène précédemment observé ? d. Est-­‐il capable de former des polymères ? Donner un exemple. e. L’oxydation du glucose peut conduire à différents acides. Indiquer leurs noms et leurs formules. f.
Comment peut-­‐on mesurer la concentration de glucose dans le sang (glycémie) ? 1.2 Soient les glucides suivants : D-­‐glucose, L-­‐glucose, D-­‐glucosamine, D-­‐galactose, L-­‐mannose et D-­‐fructose. On demande à leur propos : a. le nom de ceux qui sont isomères optiques, b. le nom de ceux qui sont épimères , c. le nom de celui (ceux) qui possède(nt) un pouvoir réducteur 1.3 Les disaccharides les plus abondants sont le saccharose, le lactose et le maltose. a. Quelle est la composition en oses de ces sucres ? b. Comment appelle-­‐t-­‐on la liaison qui permet la formation d’un disaccharide et en quoi consiste-­‐t-­‐
elle ? c. Quelles osidases spécifiques permettent leur hydrolyse ? 1.4 Soit le β -­‐D-­‐fructofuranosyl(2-­‐1)α-­‐D-­‐glucopyranoside a. Ecrire sa formule développée. b. Par quelle enzyme ce sucre est-­‐il hydrolysé ? c. Comment peut-­‐on mesurer la concentration d’aldose obtenue après action de cette enzyme ? 1.5 Glycogène : a. Quelle est la nature du (ou des) ose(s) constitutifs ? b. Décrire les différents types de liaisons osidiques rencontrées dans cette molécule. c. Donner le nom et les caractéristiques spécifiques des enzymes digestives capables de dégrader le glycogène chez l’homme. d. Dans quels tissus ou organes du corps humain trouve-­‐t-­‐on des quantités importantes de glycogène ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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29
1.6 Décrire les analogies et les différences existant entre la structure de l'amidon et de la cellulose. a. Quelles enzymes spécifiques peuvent hydrolyser ces composés ? b. Quels sont les produits de digestion de l’amidon ? c. Pourquoi la cellulose n’est-­‐elle pas dégradée dans le tube digestif de l’homme ? 1.7 Soit le composé suivant (polymère où n = 1500) : a. De quels oses ou dérivés d’oses est-­‐elle constituée ? COO-
b. A quelle classe de molécules appartient-­‐elle ? c. Citer les propriétés physicochimiques et biologiques de cette molécule. CH2OH
O
O
O
O
OH
d. Quel est le nom de l’enzyme qui hydrolyse cette molécule au niveau de la flèche ? HO
NH
OH
CO-CH3
1.8 Soit le composé ci-­‐contre : a. Donner son nom. b. Pourquoi peut-­‐on parler de vitamine à son propos ? c. Donner son rôle physiologique. e. Quelle réaction réversible peut-­‐il subir dans l'organisme, réaction qui intervient dans son mécanisme d'action? CH2OH
CHOH
O
O
OH
OH
B. LIPIDES Structure 3D d’un exemple de triglycéride 2.1 Qu’est-­‐ce qu’une molécule amphipathique (amphiphile)? a. Pourquoi le pH a-­‐t-­‐il un influence sur l’hydrophilie des acides gras libres ? b. Cette influence est-­‐elle la même si l’acide gras estérifie du glycérol ? 2.2 Soient les acides gras suivants : C16 : 0 , C18 : 0, C18 : 1 (ω9) , C18 : 2 (ω6), C20 : 4 (ω6) et les points de fusion : -­‐ 43,5°C, -­‐ 5°C, 13°C, 63°C, 70°C a. Donner le nom des différents acides gras. Nos cellules peuvent-­‐elles tous les synthétiser ? b. Apparier acides gras et points de fusion. c. Quel aspect structural de ces acides gras peut-­‐être corrélé aux variations des points de fusion ? 2.3 Soit le 1-­‐palmitoyl-­‐2 linoléyl-­‐3 stéaroyl-­‐glycérol : a. Ecrire sa formule complète. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
n
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30
b. A quelle classe de composés appartient-­‐il ? c. Est-­‐il un lipide de réserve ou de structure ? d. Quelle enzyme digestive est capable de l'hydrolyser ? e. Quels sont les produits finaux de cette dégradation ? 2.4 A quels types de lipides complexes appartiennent les deux composés ci-­‐dessous ? a. Expliquer leurs fonctions et comparer leurs propriétés. b. Quels constituants obtient-­‐on après actions enzymatiques spécifiques ? c. Quels éléments structuraux de ces lipides peut-­‐on retrouver dans les gangliosides ? 2.5 Donner la structure d'un glycérophospholipide estérifié en 1 par l’acide stéarique, en 2 par l’acide arachidonique et dont le composé en position 3 est un phosphoryl-­‐inositol. Citer les trois enzymes capables de l'hydrolyser et dont les produits d'hydrolyse sont à l'origine de "médiateurs" à activité biologique essentielle pour la cellule. 2.6 Soit le composé suivant : O
OH
CH2OH
CH2OH
HO
CH2OH
O
OH
NH
OH
O
O
OH
O-CH2 -CH- CH-CH=CH-(CH2)12-CH 3
CO- (CH 2)22-CH3
O
OH
3
a. A quelle classe appartient-­‐il NH-CO-CH
? OH
b. Quelle est la nature de la liaison entre l’oligosaccharide et le reste de la molécule ? c. Comment ce composé est-­‐il orienté dans la membrane plasmique ? d. Quelles propriétés physico-­‐chimiques et biologiques peut-­‐on attribuer à la partie glucidique de ce composé ? e. Citer les produits obtenus à partir de ce composé par l’action d’une β glucosidase ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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31
2.7 Stérols a. Parmi les composés suivants, identifier : •
le cholestérol •
le 7-­‐dehydrocholestérol •
la vitamine D3 b. Donner quelques caractéristiques de la structure du cholestérol en signalant les parties polaires et apolaires. 2.8 Soit le 1,25 dihydroxycholécalciférol. a. Ecrire sa formule (à partir d’une des molécules représentées dans l’exercice 2.7 b. Quel est son stérol précurseur dans la peau ? c. Comment ce précurseur se transforme-­‐t-­‐il en 1,25 dihydroxycholécalciférol ? d. Donner un autre nom du 1,25 dihydroxycholécalciférol. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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I V . M é t a b o l i s m e é n e r g é t i q u e Image de couverture:
Schéma fonctionnel de l'ATP synthase (Prix Nobel de chimie 1997: schéma tiré de
http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1997/illpres )
1. GLYCOLYSE 1.1 Au cours de la glycolyse, le glucose (C6) est transformé en pyruvate (C3). a. Quelle enzyme est responsable de la scission de la molécule à 6 carbones en molécules à 3 carbones ? b. Quelles sont les caractéristiques de ces molécules à 3 carbones ? c. Cette préparation pour l'hydrolyse a nécessité quel(s) type(s) de modification du glucose ? d. Une seule de ces molécules à 3C poursuit directement sa transformation dans la voie métabolique pour être convertie en pyruvate. •
Laquelle ? •
Quel est le devenir de la deuxième ? e. Quel est le bilan énergétique de cette première phase de la glycolyse, dite phase préparatoire ? 1.2 a. Quelles sont les étapes irréversibles de la glycolyse ? b. Quelles sont les transformations métaboliques possibles du pyruvate produit lors de la glycolyse en conditions aérobie et anaérobie ? Comment varie la consommation de glucose dans l'un et l’autre cas ? c. Pourquoi pour mesurer le glucose sanguin (glycémie) ajoute t-­‐on du fluorure de sodium dans les tubes de prélèvement ? 1.3 On considère la voie métabolique partielle suivante : Donner le nom du composé (a). Compléter la formule de l’intermédiaire (d) et donner son nom Compléter les cadres (b), (c), (e) et (f) Donner le nom des enzymes Enz1 et Enz2 et préciser si l’ensemble de cette voie partielle est réversible ou non. e. Où et comment le composé du cadre (c) peut-­‐il fournir de l’énergie ? a.
b.
c.
d.
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33
1.4 On se propose de synthétiser in vivo de l’ATP radioactif marqué en position γ par du 32[P], isotope radioactif du phosphore. A cette fin, on dispose de phosphate de sodium marqué par du 32[P] et d’ADP non radioactif. a. Ecrire la formule simplifiée du produit radiomarqué. b. Quelle(s) réaction(s) de la glycolyse peuvent être choisie(s) pour obtenir de l’ATP radiomarqué ? c. Pour chaque réaction choisie préciser les substrats et coenzymes nécessaires 1.5 Soient les réactions suivantes : Sachant que les enzymes catalysant les réactions a et b ne sont pas identiques, •
Ecrire la formule de X •
Donner les noms des coenzymes intervenant dans les réactions a et b. •
Donnez le nom et la localisation cellulaire des enzymes catalysant les réactions a et b. Que permettent ces réactions dans le métabolisme énergétique ? 2. CYCLE DE KREBS 2.1 Des acides α cétoniques peuvent subir une décarboxylation oxydative catalysée par des complexes multienzymatiques. Donner le nom du complexe O
multienzymatique correspondant à la (a)
CH
-C-COOH
CO2
3
voie métabolique représentée ci-­‐
OH
contre. CH3 -C-H
a. Donner les noms des composés (a) E
TPP
E
TPP
1
1
et (b) b. Donner les noms des métabolites O
attendus dans les cases S
CH3 -C ~ S
rectangulaires S
H-S
Préciser sur ce schéma : E2
E2
-­‐ les composés qui sont consommés. HSCoA
E3 FADH2
NAD+
H-S
O
-­‐ le composées qui sont produits. H-S
(b)
E3 FAD
CH3 - C ~S CoA
NADH2
-­‐ les composés qui sont régénérés. E2
2.2 Le cycle de Krebs utilise 8 enzymes pour cataboliser l'acétyl CoA. a. Citez, sans les décrire, les 5 enzymes importantes pour la production d'énergie dans l'ordre de leur mise en jeu au cours de ce cycle. Citez aussi les substrats, les produits et le type de réaction catalysée (décarboxylation, oxydation, ...) par chacune de ces 5 enzymes. b. Ecrire une réaction nette équilibrée pour le catabolisme de l'acétyl-­‐CoA en CO2. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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3. CHAINE RESPIRATOIRE MITOCHONDRIALE 3.1 Une préparation mitochondriale est incubée en présence de NADH, d'oxygène, d'ADP et de phosphate en concentrations non limitantes. On suit la consommation d'oxygène et la formation d'ATP, dans différentes conditions expérimentales. a. Ecrire la réaction globale d’oxydation du NADH, H+ par l’oxygène. i. Entre les 2 couples conjugués d'oxydo-­‐réduction, lequel à la tendance la plus grande à perdre ses électrons ? Pourquoi ? ii. Calculer la valeur de la variation du potentiel standard d'oxydo-­‐réduction ∆Eo' pour cette réaction de transfert d'électrons mitochondrial. iii. Calculer la variation d'énergie libre standard ∆Go' associée à cette réaction. iv. Combien de molécules d'ATP pourraient en théorie être formées par molécule de NADH oxydée au cours de cette réaction, si l'on prend l'énergie libre standard de synthèse d'ATP à partir d’ADP, égale à 30,5 kJ/mole ? v. Combien de molécules d'ATP sont synthétisées dans les cellules en temps ordinaire ? Quel est donc le rendement de conservation d'énergie au cours de ces réactions ? On donne : T = température absolue = 273°K + valeur °C ; R = 8,31 Joules/mole ; E°’ du couple NAD +/NADH+H+= -­‐ 0,32 volt ; E°’ du couple 1/2 O2 / H2O= + 0,81 volt • ∆Go' = -­‐nF ∆Eo' avec n = nombre d’électrons, F = constante de Faraday (96 KJ/volt/mole) b. Citer les 3 complexes d’oxydo-­‐réduction et les 2 transporteurs mobiles intervenant dans cette réaction. c. La chaîne des transporteurs d’électrons comprend un quatrième complexe qui n’intervient pas dans la séquence envisagée ici. Quel est ce complexe et pourquoi n’intervient-­‐il pas ? d. Etablir le bilan en moles d'ATP synthétisé et en oxygène consommé résultant de l'oxydation d'une mole de NADH. On incube cette même préparation en absence soit de NADH, soit d'oxygène, soit d'ADP, les autres constituants restant en concentrations non limitantes. e. En absence de NADH, H+ ou d'oxygène, indiquer dans quel état (oxydé ou réduit) vont se trouver les transporteurs d'électrons. f. Que se passe-­‐t-­‐il en absence d'ADP ? On répète cette incubation avec tous les substrats en concentrations non limitantes et en ajoutant l'un ou l'autre des effecteurs suivants : 1-­‐ amytal 2-­‐ antimycine 3-­‐ cyanure 4-­‐ atractyloside g. Préciser l'effet de ces effecteurs h. Etablir, comme dans la question d, le bilan en ATP et en oxygène. L'incubation est réalisée avec tous les substrats en concentrations non limitantes et en présence d'oligomycine. i. Quel est l'effet de l'oligomicyne et que devient alors le bilan en ATP et en oxygène. j. Que se passe-­‐t-­‐il si, en présence d'oligomycine, on ajoute du dinitrophénol dans le milieu d'incubation ? k. Localiser sur le schéma ci-­‐dessous de la chaîne respiratoire les différents éléments mentionnés tout au long de cet exercice Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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3.2 Quelle va être la destinée finale des hydrogènes provenant de l’oxydation du phosphoglycéraldéhyde par la phosphoglycéraldéhyde deshydrogénase: a. dans des conditions d’anaérobiose. b. dans des conditions d’aérobiose. 3.3 Au cours d'un tour de cycle de Krebs, la mise en jeu de certaines enzymes permet la production de 12 molécules d'ATP. Justifiez ce bilan en expliquant brièvement pour chacune des étapes le mécanisme de production d'ATP et la quantité de molécules d'ATP produite. 3.4 Le fonctionnement du Cycle de Krebs est dépendant d'un bon fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale. • Quelles sont les molécules solubles impliquées dans cette dépendance ? • Quelles sont les réactions du Cycle qui produisent ces intermédiaires ? • Si la chaîne respiratoire était inhibée, quelle serait la production de liaisons dites riches en énergie par le Cycle de Krebs ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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4. EXERCICES DE SYNTHESE 4.1 Au cours de la glycolyse intervient une étape d’oxydo-­‐réduction impliquant le NAD+/NADH,H+. a. Quelle est l’enzyme qui catalyse cette réaction d’oxydo réduction ? b. Indiquer dans la case (a), du schéma ci-­‐dessous, les substrats de cette réaction. Le NADH,H+ formé à cette étape peut être réoxydé selon 3 processus, qui dépendent des tissus concernés et des conditions physiologiques ; ils sont schématisés ci-­‐dessous, sous les accolades A, B et C. c. Pourquoi la réoxydation du NADH,H+ est-­‐elle indispensable ? d. Préciser les noms des compartiments cellulaires 1, 2 et 3. Répondre aux questions suivantes concernant chaque processus : e. Processus A - Comment appelle-­‐t-­‐on cette modalité de réoxydation du NADH,H+ ? - Indiquer les composés attendus dans les cases (b) et (c). - Une transformation enzymatique, non décrite ici, conduit à un intermédiaire dans les cases (d) : préciser le nom de cet intermédiaire. f. Processus B - Comment appelle-­‐t-­‐on cette modalité de réoxydation du NADH,H+ ? - Donner le nom et la formule du composé case (e) g. Processus C - Indiquer dans quels tissus et dans quel contexte physiologique intervient cette voie. - Donner le nom de l’enzyme qui catalyse cette réaction. h. Quel est le devenir de composé (c) et du FADH2 ? i. Comparer, sur le plan énergétique (en termes d’ATP formé) ces 3 processus de réoxydation. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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4.2 Indiquer sur le tableau suivant les effets de l'absence d'oxygène, de la présence de dinitrophénol (DNP), de l'ajout d'amytal ou du déficit en isocitrate déshydrogénase sur la vitesse de la glycolyse, du cycle de Krebs, de la chaîne respiratoire, sur la consommation d'oxygène et sur la concentration sanguine de lactate Cycle de
Krebs
Glycolyse
Chaîne
respiratoire
Consommation
d'O2
[lactate]
- O2
+ DNP
+ amytal
- isocitrate
déshydrogénase
4.3 Chez un jeune enfant présentant des troubles neurologiques importants, on trouve une quantité abondante de fumarate dans les urines. Le dosage de certains enzymes du tissu hépatique donne les résultats suivants activité enzymatique
en nmol/min/mg de protéines
patient
sujet normal
fumarase
0.12
70- 90
citrate synthase
125
100- 150
succinate déshydrogénase
33
20-60
1300
900-1600
lactate déshydrogénase
1-­‐ Quelle activité enzymatique hépatique est déficiente chez ce patient? 2-­‐ Ces résultats permettent-­‐ils d'expliquer l'augmentation de fumarate dans les urines ? 3-­‐ Dans quelle voie métabolique est formé le fumarate? 4-­‐ Quel est le nom de l'enzyme qui synthétise le fumarate? 5-­‐ Quel(s) type (s) de réaction catalyse cet enzyme? (entourer la ou les bonne(s) réponse(s) a-­‐ une décarboxylation b-­‐ une déshydrogénation c-­‐ une oxydoréduction d-­‐ une isomérisation e-­‐ une phosphorylation 6-­‐ Dans quel compartiment cellulaire se trouve cet enzyme? 7-­‐ Quel est le coenzyme nécessaire à cet enzyme? 8-­‐ On mesure une quantité importante de lactate dans le sang de ce patient. On considère que cette augmentation de lactate est due à la déficience enzymatique constatée chez ce patient. Donner les conséquences de cette déficience sur le fonctionnement : ralentissement
accélération
- du cycle de Krebs
- de la chaine respiratoire
- de la glycolyse
•
•
Quel enzyme est responsable de la production de lactate ? Pourquoi le taux de lactate augmente-­‐ t-­‐il chez ce patient ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
inchangé
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V . M é t a b ol i s m e g l u c i do -­‐ l i pi d i q u e 1. METABOLISME DU GLYCOGENE 1.1
Le glucose présent dans la lumière intestinale après un repas va être en grande partie stocké dans les cellules hépatiques et musculaires (sous forme de glycogène). a. Indiquer les protéines membranaires que vous connaissez qui sont directement mises en jeu dans le transport du glucose en précisant pour chacune d’elle sa localisation tissulaire et éventuellement cellulaire et les caractéristiques du transport. b. L’élévation de la glycémie résultant de cette absorption digestive de glucose va favoriser indirectement son stockage sous forme de glycogène : • indiquez par quels mécanismes 1.2 a. Décrire les étapes enzymatiques de la dégradation d’une unité glucose engagée dans une liaison α 1-­‐4 du glycogène en acide lactique. b. Quel est le bilan énergétique de cette dégradation ? c. Mêmes questions pour une unité glucose liée en α 1-­‐6. 1.3 Un patient présente une fatigue musculaire lors d’exercices intenses. L’activité de la glycogène-­‐
phosphorylase en réponse aux ions calcium est mesurée dans un extrait cellulaire de muscle et les résultats figurent ci-­‐dessous : Expliquez brièvement au vu de ces résultats les signes cliniques observés chez ce patient. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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2. NEOGLUCOGENESE 2.1
Néoglucogenèse à partir du pyruvate. a. Compléter le schéma ci-­‐dessous au niveau des substrats et des enzymes manquants. b. Quelles sont les étapes spécifiques de la néoglucogenèse permettant de transformer le PEP en glucose ? c. Quels sont les autres substrats de la néoglucogenèse? d. Cette voie est fortement régulée par l’état nutritionnel, notamment pour l’expression de l’enzyme catalysant la formation de phosphoénol-­‐pyruvate. Quelles sont les hormones concernées et les conséquences sur le métabolisme glucidique ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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2.2
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Régulation de la Glycolyse et de la Néoglucogenèse. La concentration de fructose-­‐6P est régulée principalement par l’action de la phosphofructokinase-­‐1 (PFK-­‐1) et de la fructose 1,6 bisphosphatase (FBPase), par les réactions suivantes : Fructose-­‐6P + ATP  Fructose-­‐1,6 bisphosphate + ADP Fructose-­‐1,6 bisphosphate + H2O  Fructose-­‐6P + Pi L’effet du Fructose 2,6 bisphosphate est testée sur l’activité de ces deux enzymes : a. Interpréter les résultats obtenus. Que pouvez-­‐vous en conclure ? b. Quelles sont les autres constituants moléculaires pouvant intervenir dans la régulation de l’activité de ces 2 enzymes ? c. Quelle est la régulation de la synthèse du Fructose 2,6 bisphosphate dans le foie ? d. Indiquer la signification métabolique de chacun des ligands allostériques de la PhosphoFructoKinase 1. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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Lactate (mM)
2.3 Variation du lactate sanguin lors d’un exercice intense. Les concentrations de lactate dans le plasma sanguin avant, pendant, et après un sprint de 400 m sont représentées sur le graphe ci-­‐contre : a. Pourquoi existe-­‐t-­‐il une augmentation rapide de la concentration de lactate dans le sang ? Quelle est son origine ? b. Quelle est la cause de la chute de la concentration de lactate après la fin de la course ? Que devient-­‐il ? c. Pourquoi la concentration de lactate sanguin n’est-­‐elle pas nulle en dehors des périodes d’exercice musculaire intense ? 3
2
1
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3. METABOLISME DES LIPIDES 3.1 Destinée des triglycérides alimentaires. Compléter le schéma ci-­‐dessous au niveau du texte et des réactions des voies métaboliques empruntées. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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Synthèse et destinée des triglycérides dans le foie et dans le tissu adipeux 3.2
a. La synthèse des triglycérides nécessite l’activation des acides gras R-­‐COOH : écrire cette réaction d’activation, en indiquant tous les substrats et produits impliqués ainsi que le nom de l’enzyme qui catalyse la réaction. b. Les acides gras ainsi activés réagissent avec le glycérol phosphate. - Dans le foie, deux substrats peuvent conduire au glycérol phosphate : quels sont ces substrats, d’où proviennent-­‐ils et comment donnent-­‐ils du glycérol phosphate ? - Dans le tissu adipeux la formation de glycérol phosphate est-­‐elle identique à celle qui a lieu dans le foie ? Commenter. c. Préciser la destinée des triglycérides -­‐ dans le foie ; -­‐ dans le tissu adipeux. 3.3
Quelle est l’origine principale des acides gras utilisés comme source d’énergie par les muscles ? • Quel(s) enzyme(s) est impliqué ? • Ce(s) enzyme(s) sont-­‐ils régulés ? 3.4
3.5
Quel est le rôle de la carnitine dans le métabolisme des acides gras ? La β oxydation des acides gras : a. Indiquez sa localisation dans la cellule. b. Compléter le schéma ci-­‐contre: c. Quelles sont les autres sources d’acétyl-­‐
CoA pour une cellule en fonction des conditions nutritionnelles ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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3.6
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La dégradation complète du radical palmityl du palmitoyl-­‐CoA est effectuée avec des mitochondries de cœur dans un milieu tamponné approprié. a. Combien de tours sont-­‐ils nécessaires pour l’oxydation complète ? b. Quel sera le rendement théorique maximum en liaisons « riches en énergie » en l’absence et en présence de dinitrophénol (chiffre rapporté à 1 mole de palmitoyl-­‐CoA) ? c. Que se passe t-­‐il en absence d’oxygène ? Justifier brièvement votre réponse. 3.7
Synthèse des acides gras a. Quel est le substrat de la lipogenèse? b. D’où provient-­‐il? c. Remplir les cases du schéma ci-­‐dessous : • Donner le nom des enzymes 1, 2 et 3. Citer leur(s) coenzyme(s) d. Quelle la régulation de l’enzyme 2 ? e. Quel est le devenir du produit de l’enzyme 2? f. Si la sérine de l’acétyl-­‐CoA carboxylase qui est la cible de la phosphorylation par la protéine kinase A (PKA), est mutée en alanine, quelles sont les conséquences attendues sur le métabolisme des acides gras ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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4. REGULATION DU METABOLISME DES GLUCIDES ET DES LIPIDES EN PHYSIOPATHOLOGIE 4.1 Interrelations des voies métaboliques dans le foie Renseigner dans le schéma ci-­‐dessous les noms des voies métaboliques (dans les ellipses) et les noms des enzymes impliquées (dans les rectangles). 4.2 Quelles sont les voies métaboliques mises en jeu au moment de la néoglucogenèse ? • Dans quels tissus sont-­‐elles localisées ? • Quels sont les substrats et les produits de ces voies ? 4.3 Quelle est l’origine des acides gras utilisés comme substrats énergétiques par la cellule musculaire ? • Quel type de muscle est concerné ? • Dans quelles conditions physiologiques la cellule musculaire utilise-­‐t-­‐elle des acides gras ? • Ce muscle a-­‐t-­‐il d’autres sources énergétiques : lesquelles ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
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4.4 45
Les individus ayant des problèmes de surcharge pondérale, doivent faire attention non seulement à leur alimentation lipidique (TG) mais aussi à leur alimentation glucidique. Bien que le glucose soit stocké sous forme de glycogène, seules 5 % des réserves énergétiques le sont sous cette forme. Que se passe-­‐t-­‐il quand l’alimentation contient un excédent glucidique ? 4.5 Que se passe-­‐t-­‐il en l’absence de carnityl palmitoyl transférase (CPT 1) ? Justifier votre réponse. • Existe-­‐t-­‐il dans la cellule un inhibiteur physiologique de la CPT 1 ? Si oui, citer le et dire dans quelle circonstance physiologique ses effets seront sensibles. 4.6 β -­‐hydroxybutyrate a. Dans quel(s) organe(s), compartiment cellulaire et circonstance a lieu sa synthèse ? b. Compléter les cases vides du schéma c. Dans quels tissus et dans quel compartiment de la cellule a lieu cette série de réactions ? d. Quelle est l’origine métabolique du co-­‐substrat de la réaction 2 ? ! Hydroxybutyrate
Enz.1 : déshydrogénase
1
Enz.2 : CoA transférase
2
Enz.3 :
3
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Coenzyme A
2 Acétyl-CoA