analyse par lc-ms/ms haute résolution du complexe de la caspase 8

ANALYSEPARLC‐MS/MSHAUTERÉSOLUTIONDUCOMPLEXEDELACASPASE8
LORSDELARÉPONSEIMMUNITAIREANTIBACTÉRIENNECHEZLADROSOPHILE
YannVerdier1,HidehiroFukuyama2,ImanHaddad1,JeanRossier3,JulesHoffmann2,JoëlleVinh1
1‐ESPCI‐ParisTech,SpectrométriedeMasseBiologiqueetProtéomique,USR3149CNRSParisTech,10rueVauquelin75231Paris,France
2‐CentreNationaldeLaRechercheScientifique,InstitutdeBiologieMoléculaireetCellulaire,15rueRenéDescartes,67084Strasbourg
3‐ESPCI‐ParisTech,NeurobiologieetDiversitéCellulaire,10rueVauquelin,75231Paris,France
Ladrosophileestunmodèleintéressantpourl’étudedelaréponseimmunitaireinnée.Lestravaux,
essentiellementgénétiques,menéssurcemodèleontmontrésquedeuxvoiesdesignalisation
intracellulairescontrôlentl’expressiondesgènesaprèsuneinfectionbactérienne:(1)lavoieToll,
activéeaprèsinfectionpardeschampignonsoudesbactériesGram‐négatives,et(2)lavoieImd,en
réponseauxinfectionspardesbactériesnégativesàlacolorationdeGram[1].Seuleunedouzainede
protéinesontétédécritescommeétantimpliquéesdanscettevoie,dontlaprotéineDredd,
orthologuedelacaspase‐8.Cetravailvisetoutd’abordàdécrirelecomplexemoléculaireassociéà
Dredd.
Ladescriptiond’uncomplexemoléculairenécessitesapurificationdansunétatphysiologique
reflétantlaréalité,puisl’identificationdesesdifférentscomposants.Lesméthodesdepurification
d’affinitéavecdessystèmesstreptavidine‐biotinesontfréquemmentutiliséesdanscebut.Cependant,
enraisondel’extraordinairestabilitédel’interactionentrelastreptavidineetlabiotine,l’élutionde
protéinesmarquéesàlabiotinerestedélicat.Lescritèresdevalidationdesprotéinesidentifiéessont
égalementimportants.
Danscetravail,nousavonstransfectédescellulesdedrosophileavecunvecteurd’ADNcontenantla
protéineDreddmarquéeàlabiotine.Aprèspurificationd’affinité,différentesstratégiesontété
testées,etlesprotéinesidentifiéesparLC‐MS/MS.Unprotocoledeprotéolyseréaliséedirectement
surbillesapermisl’identificationduplusgrandnombredeprotéinesassociéesàDredd,comparéà
desprotocolesd’élutionstandards.
Unessaifonctionnelamontréqu’unelargeproportiondesprotéinesspécifiquementidentifiéesdans
l’échantillonDreddestimpliquéedansl’activationdelavoieImd.Cesprotéinesontdéjàétédécrites
commeayantdesfonctionsdanslaréponseimmunitaire(BG4,Q9VP57),stress(HSP7C,Q9VXQ5),
fonctionstructurale(TBB1,CP190),biosynthèse(Q9W1B9)etfonctionredox(SODC)[2].
PourobtenirunedescriptionplusprécisedelavoieImd,lesdixautresacteurscanoniquesdecette
voieontétéclonés,etleursprotéinesassociéesaprèsunchallengebactérienidentifiésparlamême
stratégie.Defaçonglobale,l’analysedescomposantsdecescomplexespermetunedescription
beaucoupplusfinedecettecascadedesignalisationetsuggèredenouveauxmécanismes
moléculairesd’activationdecettevoiedesignalisation.
1LemaitreB,HoffmannJ.ThehostdefenseofDrosophilamelanogaster.AnnuRevImmunol2007;25:697–743.
2FukuyamaH,NdiayeS,HoffmannJ,RossierJ,LiuuS,VinhJ,VerdierY.On‐beadtrypticproteolysis:AnattractiveprocedureforLC‐MS/MS
analysisoftheDrosophilacaspase8proteincomplexduringimmuneresponseagainstbacteria.JProteomics.2012Mar17.