TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE - umtice

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Université du Maine
Faculté des Sciences et Techniques.
BCH 144EN006
Technicienne des TP : Mme BARTHE
Coef examen : 1 TRAVAUX PRATIQUES
DE BIOCHIMIE
Consignes de sécurité
Avant de commencer à travailler dans le laboratoire de Biochimie, il est important de
localiser l’issue de secours et l’emplacement des extincteurs. En cas de déclenchement d’alarme,
suivre les instructions de l’enseignant.
Les produits chimiques sont potentiellement dangereux (intoxication, brûlures, irritation,
incendie...), et ils doivent être manipulés avec soin et en prenant les précautions suivantes :
1 porter les lunettes de sécurité disponibles dans le laboratoire si besoin
2 porter une blouse en coton Blouse OBLIGATOIRE
3 ne pas pipeter avec la bouche
4 ne jamais goûter un produit chimique et éviter son contact avec la peau
5 se laver les mains en entrant et en sortant du laboratoire
Nettoyage
Rincer pipettes et burettes à l’eau distillée puis avec le minimum de solution avant de prélever ou
de doser. Rincer pipettes et burettes à l’eau distillée après usage.
Compte-rendu
Un compte-rendu sur copie double (1 seule copie) est remis à l’enseignant à la fin de la séance
Préciser le but du TP en début de CR
Indiquer le principe du TP ensuite
Les résultats numériques sont présentés sous forme de tableau en précisant les unités (les tableaux
doivent être complets)
Les calculs sont à faire avec l’équation aux grandeurs et l’équation aux valeurs numériques
Les courbes sont tracées sur papier millimétré (feuille avec titre. relation, échelle, nom des axes et
unités)
TP :
1 : chromatographie échange d’ions + dosage de substrat par méthode cinétique+ colorimétrie
2 : détermination de la composition d’un glucide d’un jus de fruit (CCM, colorimétrie au DNS,
dosage du glucose par iodométrie, polarimétrie)
3 : chromatographie d’exclusion stérique + colorimétrie + détermination d’une activité enzymatique
par méthode deux points
4 : Electrophorèse sur gel polyacrylamide
PRAG D Bruant
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Utilisation du petit matériel
Les gestes techniques doivent être corrects pour espérer avoir des résultats satisfaisant.
Voici un résumé :
I) Pipettes
a. Jaugées
- Aucun pipetage à la bouche (utilisation propipette)
- Mise en milieu (sauf lors du premier prélèvement : pipette sèche)
- Pipette droite sur le bord du récipient lors du prélèvement
- Ajustage à hauteur des yeux
- Essuyage du bout de la pipette par du papier Joseph (sans
toucher le liquide contenu dans la pipette)
- Pipette droite sur le bord du bécher lors du transvasement
b. Automatiques
- Premier cran lors du prélèvement
- Premier et deuxième crans lors de l’expulsion du liquide
- Pipette droite sur le bord du récipient lors du prélèvement
- Ajustage à hauteur des yeux
- Essuyage du bout de la pipette par du papier Joseph (sans
toucher le liquide contenu dans la pipette)
- Pipette droite sur le bord du bécher lors du transvasement
II) Burettes et fioles jaugées
- Mise en milieu (sauf lors du premier prélèvement : matériel sec)
- Essuyage col burette ou fiole jaugé par du papier Joseph (sans toucher le liquide)
- Ajustage par une pipette (burette) ou pissette eau distillée (fioles jaugées)
III) Béchers
- Mise en milieu (sauf lors du premier prélèvement : matériel sec)
- Entre deux produits, rincer avec de l’eau distillée
- Utiliser un bécher pour introduire la solution (ne jamais prélever directement dans la
solution initiale)
IV) Cuves à spectrophotomètre
- Cuve à quartz si UV et cuve plastique si visible
- Mélanger devant le spectrophotomètre si analyse enzymatique
- Papier film sur la cuve du spectrophotomètre pour le transport
- Essuyer les bords de la cuve avec du papier Joseph avant intégration de la cuve dans le
spectrophotomètre

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Mise en application des normes de métrologie :
pour lʼacceptabilité des résultats d’essais
pour lʼexpression du résultat final accompagné de son incertitude
- Acceptabilité des résultats
Démarche
On donnera l’écart-type de répétabilité sr (« r » minuscule) de la méthode aux alentours des
valeurs mesurées.
Mathématiquement, on peut établir l’intervalle de confiance entre les résultats d’essais :
• Pour une probabilité d’environ 0,95, l’écart entre deux valeurs de résultats obtenus en condition
de répétabilité est inférieur à 2,8 . sr environ ;
• Pour une probabilité d’environ 0,95 l’écart entre la plus petite et le plus grande valeur pour trois
résultats obtenus en condition de répétabilité est inférieure à 3,3 . sr environ.
Les élèves utiliseront donc l’écart-type de répétabilité pour contrôler l’acceptabilité de leurs
résultats en regardant si les écarts entre résultats sont acceptables selon le logigramme suivant :
Utilisation du logigramme :
• Si trois essais sont possibles, l’ensemble du logigramme sera utilisé ;
• Si pour des raisons matérielles, il n’est pas possible de réaliser un troisième essai alors qu’il est
nécessaire, la moyenne ne sera pas effectuée et un résultat sera rendu pour l’un des essais

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TP1
Chromatographie par échange d'ions
I Principe
Un échangeur d’ions est constitué d’une matrice (ou support) insoluble sur laquelle sont
fixés par des liaisons covalentes des groupes ionisables. Ces groupes chargés sont associés avec des
ions de signe opposé apportés par la phase mobile. Ces ions peuvent être réversiblement échangés
avec d’autres ions de même signe provenant d'une solution.
groupement fonctionnel
de l'échangeur
contre-ion échangeable
= anion
matrice
ou
support YG ++
G X
matrice
ou
support contre-ion échangeable
= cation
résine cationique résine anionique
groupement fonctionnel
de l'échangeur
1.1 Description des échangeurs d’ions
La matrice est constituée soit de polymères synthétiques (réseau de polystyrène), soit de
polymères naturels (dextrane -Séphadex, cellulose -Séphacel). La nature de la matrice détermine ses
propriétés physiques (résistance mécanique, vitesse d’écoulement, porosité). Le degré de
réticulation du réseau intervient dans la perméabilité de la matrice. Ainsi, les résines synthétiques
ne sont utilisées que pour séparer de petites molécules comme les acides aminés et les nucléotides
alors que les polymères naturels plus lâches sont utilisés pour la séparation de grosses molécules
comme les protéines et les acides nucléiques.
Exemples d'échangeurs d'ions :
Echangeurs d’anions
AE-polyoside (aminoethyl) matrice-O-CH2CH2NH3+
DEAE-polyoside (diéthylaminoéthyl) matrice-O-CH2CH2N+H(C2H5)2
QAE-polyoside (quarternaire aminoéhyl) matrice-O-CH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
Echangeurs de cations
CM-polyoside (carboyméthyl) matrice-O-CH2CH2COO -
P-polyoside (Phospho) matrice-O-PO32-
SP-polyoside (sulphopropyl) matrice-O-CH2CH2CH2SO3-

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1.2 Principe de l’échange d’ions
+
__
_
+
__
_
+
__
_
_
+
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+
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+
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+
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+
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+
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+
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+
++
+
OOO
O
+
+
+
+
+
+
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OO
O
O
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_
O
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ABC+
++
+
+
+
+
+
+
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+
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+
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+
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+
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_
+
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_
+
__
_
_
_
DE
_
+
_+
O
charge de l'échangeur
contre-ion de l'échangeur
échantillon
ion de l' éluant
A : résine équilibrée
Les contre-ions sont liés par des liaisons ioniques aux charges fixées sur la matrice
B - C : application de l’échantillon et adsorption
Les anions de l’échantillon déplacent les contre-ions de la résine. Les molécules neutres et les ions
de même charge que la résine sont élués.
D : élution
Les anions de l’échantillon sont déplacés par les ions du tampon d’élution
E : Régénération
La résine est régénérée en échangeant les ions du tampon d’élution par les contre-ions d’origine.
1.3 Application à l’étude de la séparation de deux protéines, l’albumine et le cytochrome
C, sur DEAE Séphacel.
La matrice DEAE Séphacel est constituée d’un réseau de cellulose sur laquelle sont fixés,
par des liaisons éther, les groupes ioniques diéthylaminoéthyle (DEAE).
A pH 7, les groupements ionisables du DEAE Séphacel sont tous chargés positivement.
A ce pH d’utilisation, l’albumine dont le pHi est de 4,9 est chargée négativement, et le cytochrome
dont le pHi est de 10,75 est chargée positivement. L’albumine (-) sera donc retenue par
l’échangeur. Le cytochrome (+) traversera la colonne sans être fixé.