Université du Maine Faculté des Sciences et Techniques. BCH 144EN006 PRAG D Bruant [email protected] Technicienne des TP : Mme BARTHE Coef examen : 1 TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE Consignes de sécurité Avant de commencer à travailler dans le laboratoire de Biochimie, il est important de localiser l’issue de secours et l’emplacement des extincteurs. En cas de déclenchement d’alarme, suivre les instructions de l’enseignant. Les produits chimiques sont potentiellement dangereux (intoxication, brûlures, irritation, incendie...), et ils doivent être manipulés avec soin et en prenant les précautions suivantes : 1 2 3 4 5 porter les lunettes de sécurité disponibles dans le laboratoire si besoin porter une blouse en coton Blouse OBLIGATOIRE ne pas pipeter avec la bouche ne jamais goûter un produit chimique et éviter son contact avec la peau se laver les mains en entrant et en sortant du laboratoire Nettoyage Rincer pipettes et burettes à l’eau distillée puis avec le minimum de solution avant de prélever ou de doser. Rincer pipettes et burettes à l’eau distillée après usage. Compte-rendu Un compte-rendu sur copie double (1 seule copie) est remis à l’enseignant à la fin de la séance Préciser le but du TP en début de CR Indiquer le principe du TP ensuite Les résultats numériques sont présentés sous forme de tableau en précisant les unités (les tableaux doivent être complets) Les calculs sont à faire avec l’équation aux grandeurs et l’équation aux valeurs numériques Les courbes sont tracées sur papier millimétré (feuille avec titre. relation, échelle, nom des axes et unités) TP : 1 : chromatographie échange d’ions + dosage de substrat par méthode cinétique+ colorimétrie 2 : détermination de la composition d’un glucide d’un jus de fruit (CCM, colorimétrie au DNS, dosage du glucose par iodométrie, polarimétrie) 3 : chromatographie d’exclusion stérique + colorimétrie + détermination d’une activité enzymatique par méthode deux points 4 : Electrophorèse sur gel polyacrylamide 1 Utilisation du petit matériel Les gestes techniques doivent être corrects pour espérer avoir des résultats satisfaisant. Voici un résumé : I) - - Pipettes a. Jaugées Aucun pipetage à la bouche (utilisation propipette) Mise en milieu (sauf lors du premier prélèvement : pipette sèche) Pipette droite sur le bord du récipient lors du prélèvement Ajustage à hauteur des yeux Essuyage du bout de la pipette par du papier Joseph (sans toucher le liquide contenu dans la pipette) Pipette droite sur le bord du bécher lors du transvasement b. Automatiques Premier cran lors du prélèvement Premier et deuxième crans lors de l’expulsion du liquide Pipette droite sur le bord du récipient lors du prélèvement Ajustage à hauteur des yeux Essuyage du bout de la pipette par du papier Joseph (sans toucher le liquide contenu dans la pipette) Pipette droite sur le bord du bécher lors du transvasement II) Burettes et fioles jaugées - Mise en milieu (sauf lors du premier prélèvement : matériel sec) - Essuyage col burette ou fiole jaugé par du papier Joseph (sans toucher le liquide) - Ajustage par une pipette (burette) ou pissette eau distillée (fioles jaugées) III) Béchers - Mise en milieu (sauf lors du premier prélèvement : matériel sec) - Entre deux produits, rincer avec de l’eau distillée - Utiliser un bécher pour introduire la solution (ne jamais prélever directement dans la solution initiale) IV) Cuves à spectrophotomètre - Cuve à quartz si UV et cuve plastique si visible - Mélanger devant le spectrophotomètre si analyse enzymatique - Papier film sur la cuve du spectrophotomètre pour le transport - Essuyer les bords de la cuve avec du papier Joseph avant intégration de la cuve dans le spectrophotomètre 2 Mise en application des normes de métrologie : pour lʼacceptabilité des résultats d’essais pour lʼexpression du résultat final accompagné de son incertitude - Acceptabilité des résultats Démarche On donnera l’écart-type de répétabilité sr (« r » minuscule) de la méthode aux alentours des valeurs mesurées. Mathématiquement, on peut établir l’intervalle de confiance entre les résultats d’essais : • Pour une probabilité d’environ 0,95, l’écart entre deux valeurs de résultats obtenus en condition de répétabilité est inférieur à 2,8 . sr environ ; • Pour une probabilité d’environ 0,95 l’écart entre la plus petite et le plus grande valeur pour trois résultats obtenus en condition de répétabilité est inférieure à 3,3 . sr environ. Les élèves utiliseront donc l’écart-type de répétabilité pour contrôler l’acceptabilité de leurs résultats en regardant si les écarts entre résultats sont acceptables selon le logigramme suivant : Utilisation du logigramme : • Si trois essais sont possibles, l’ensemble du logigramme sera utilisé ; • Si pour des raisons matérielles, il n’est pas possible de réaliser un troisième essai alors qu’il est nécessaire, la moyenne ne sera pas effectuée et un résultat sera rendu pour l’un des essais 3 TP1 Chromatographie par échange d'ions I Principe Un échangeur d’ions est constitué d’une matrice (ou support) insoluble sur laquelle sont fixés par des liaisons covalentes des groupes ionisables. Ces groupes chargés sont associés avec des ions de signe opposé apportés par la phase mobile. Ces ions peuvent être réversiblement échangés avec d’autres ions de même signe provenant d'une solution. m a trice ou support groupe m ent fonctionne l de l' échangeur G X+ contre-ion éc hangea ble = c ation rés ine cationique groupe m ent fonctionne l de l' échangeur m a trice ou support G+ Y contre-ion éc hangea ble = a nion résine anionique 1.1 Description des échangeurs d’ions La matrice est constituée soit de polymères synthétiques (réseau de polystyrène), soit de polymères naturels (dextrane -Séphadex, cellulose -Séphacel). La nature de la matrice détermine ses propriétés physiques (résistance mécanique, vitesse d’écoulement, porosité). Le degré de réticulation du réseau intervient dans la perméabilité de la matrice. Ainsi, les résines synthétiques ne sont utilisées que pour séparer de petites molécules comme les acides aminés et les nucléotides alors que les polymères naturels plus lâches sont utilisés pour la séparation de grosses molécules comme les protéines et les acides nucléiques. Exemples d'échangeurs d'ions : Echangeurs d’anions AE-polyoside (aminoethyl) DEAE-polyoside (diéthylaminoéthyl) QAE-polyoside (quarternaire aminoéhyl) Echangeurs de cations CM-polyoside (carboyméthyl) matrice-O-CH2CH2NH3+ matrice-O-CH CH N+H(C2H5) 2 2 2 + matrice-O-CH2CH2N (C2H5)2CH2CH(OH)CH3 P-polyoside (Phospho) matrice-O-CH2CH2COO matrice-O-PO32- SP-polyoside (sulphopropyl) matrice-O-CH2CH2CH2SO3- 4 1.2 Principe de l’échange d’ions _ _ _ _ O O+ O + + _+ O _ +_ _ _ _ _ _ +_ +_ _ _ _ _ _ _ +_ _ _ +_ +_ _ _ _ _ _ +_ _ _ _ _ _ +_ +_ _ _ _ _ _+__ _ +_ +_ +_ _ _ _ _ +_ +_ _ _ _ _ _ +_ _ _ +_ +_ _ B A C _ _ O _ + _O O _ O O_ + _ + + _ _ +_ _ _ _ _ _ +_ +_ _ _ _ _ _ _ +_ _ _ +_ +_ _ _ + + + + + D _ __ _ _ E _ + charge de l'échangeur _ contre-ion de l'échangeur _+ O échantillon ion de l' éluant A : résine équilibrée Les contre-ions sont liés par des liaisons ioniques aux charges fixées sur la matrice B - C : application de l’échantillon et adsorption Les anions de l’échantillon déplacent les contre-ions de la résine. Les molécules neutres et les ions de même charge que la résine sont élués. D : élution Les anions de l’échantillon sont déplacés par les ions du tampon d’élution E : Régénération La résine est régénérée en échangeant les ions du tampon d’élution par les contre-ions d’origine. 1.3 Application à l’étude de la séparation de deux protéines, l’albumine et le cytochrome C, sur DEAE Séphacel. La matrice DEAE Séphacel est constituée d’un réseau de cellulose sur laquelle sont fixés, par des liaisons éther, les groupes ioniques diéthylaminoéthyle (DEAE). A pH 7, les groupements ionisables du DEAE Séphacel sont tous chargés positivement. A ce pH d’utilisation, l’albumine dont le pHi est de 4,9 est chargée négativement, et le cytochrome dont le pHi est de 10,75 est chargée positivement. L’albumine (-) sera donc retenue par l’échangeur. Le cytochrome (+) traversera la colonne sans être fixé. 5 Pour éluer l’albumine de l’échangeur, on augmentera la force ionique du tampon d’élution (0,2 mol.L-1 en NaCl). La forte concentration en ions Cl- déplace par compétition l’albumine des sites positifs. L’albumine est éluée. II Matériel et réactifs Colonne de chromatographie (L = 2 cm) contenant la résine en suspension dans le tampon. DEAE Sephacel équilibré dans le tampon Tris-HCl 0,01 mol.L-1 pH 7. Tampon I : Tris-HCl 0,01 mol.L-1 pH 7 Tampon II : Tris-HCl 0,01 mol.L-1, NaCl 0,2 mol.L-1 pH 7 Tampon III : Tris-HCl 0,01 mol.L-1, NaCl 2 mol.L-1 pH 7 Solution étalon d’albumine à 400 g.mL-1 Solution A d'albumine de concentration inconnue Solution étalon de cytochrome c à 0,5 mg.mL-1 Solution C de cytochrome c de concentration inconnue Solution de Bleu de Coomassie III Echantillon L’échantillon (1 mL) est constitué de 0,5 mL de solution A et de 0,5 mL de solution C. IV Mode opératoire Ouvrir le robinet de la colonne de manière à éliminer le tampon au-dessus du gel. Fermer quand le liquide est au niveau de la résine. Numéroter 10 tubes à hémolyse (1-10) de façon à pouvoir recueillir 10 fractions de 1 mL. 4.1 Dépôt de l’échantillon et élution A l’aide d’une pipette Pasteur, déposer l’échantillon sur la résine en le laissant couler lentement sur les parois de la colonne. Ouvrir la colonne et recueillir un premier millilitre dans le tube 1. Rincer le tube ayant contenu l'échantillon, deux fois, avec 0,5 mL de tampon I. Déposer les deux volumes de rinçage sur la colonne et recueillir un deuxième mL dans le tube 2. Introduire ensuite sur la colonne, trois fois, 1 mL de tampon I et recueillir, trois fois, 1 mL d'éluat dans les tubes 3, 4 et 5. Pour éluer l’albumine restée fixée sur la résine, déposer, 5 fois, 1 mL de tampon II et recueillir 5 fractions de 1 mL dans les tubes 6 -10. 4.2 Régénération de la colonne Quand l’élution est terminée, faire passer : 2 mL de tampon III (Tris-HCl 0,01 mol.L-1, pH 7, NaCl 2 mol.L-1) 5 mL de tampon I (Tris-HCl 0,01 mol.L-1, pH 7). Déposer 2 mL de tampon I au-dessus de la résine. La colonne est prête à l’emploi. 6 V Résultats Q1 : Indiquer le type de résine utilisée pour le remplissage de la colonne. Q2 : Préciser le volume et la composition du mélange à séparer. Q3 : Tracer le diagramme de prépondérance de l’albumine et du cytochrome en fonction du pH. 5.1 Résultats relatifs au cytochrome c Le cytochrome c est une protéine qui absorbe dans le visible, (maxi d'absorption à 550 nm). 5.1.1 Profil d’élution Lire l'absorbance à 550 nm pour chacune des fractions 1-5. Après chaque lecture, reverser chaque fraction dans son tube d'origine. Q4 : Représenter graphiquement la variation de l'absorbance en fonction du volume d’élution. 5.1.2 Dosage quantitatif de la fraction déposée Colorimètre (Spectronic 20 D) utilisé en mode absorbance à 550 nm. Référence: tampon I Dans un tube à hémolyse (tube C), prélever 0,3 mL de la solution C. Compléter le volume à 2 mL avec le tampon I. Préparer un autre tube avec la solution étalon de cytochrome C à 0.5 mg.mL -1 Agiter et lire les absorbances des 2 tubes par rapport à la cuve de référence. Q5 : Calculer la concentration de la solution C. Q6 : Calculer la quantité (mg) de cytochrome c déposé sur la colonne. 5.1.3 Dosage quantitatif de la fraction récupérée Référence: tampon I Etalon: solution de cytochrome à 0,5 mg.mL-1. Dans une fiole jaugée de 10 mL, rassembler les éluats des tubes 1-5 contenant le cytochrome. Rincer les tubes avec quelques gouttes de tampon I et joindre les volumes de rinçage à l’éluat. Ajuster le volume à 10 mL avec le tampon I. Agiter et lire l’absorbance, à 550 nm, de la solution dans la fiole jaugée / cuve de référence. Q7 : En déduire la quantité (mg) de cytochrome c récupéré Q8 : Calculer le rendement de l’opération. 5.2 Résultats relatifs à l’albumine L’albumine n’absorbe pas dans le visible. Le réactif de Coomassie, en présence d'albumine, donne une coloration bleue (absorption maximale à 595 nm) d’intensité proportionnelle à la quantité de protéine. Numéroter 17 tubes à hémolyse (tubes 0’-16’). 7 Préparer les tubes sans ajouter le bleu de Coomassie. Ajouter le réactif de Coomassie quand les 17 tubes sont prêts (étalons et essais dans les mêmes conditions) et mesurer immédiatement après l’ajout du bleu. Agiter les tubes et lire les absorbances à 595 nm. 5.2.1 Gamme-étalon Réaliser une gamme-étalon d’albumine entre 0 (tube témoin) et 20 g par tube à partir de la solution de référence à 400 g.mL-1. Apporter la solution d’albumine (albumine + eau) sous un volume de 0,1 mL. tube (6 tubes) 0’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 0 10 20 30 40 50 100 90 80 70 60 50 Vol réactif de Coomassie (mL) 2 2 2 2 2 2 Q (albumine (g par tube)) 0 4 8 12 16 20 Vol sol. albumine à 400 g.mL-1 (L) Vol eau (L) Lire les absorbances à 595 nm. Q9 : Tracer la courbe d’étalonnage (absorbance en fonction de la quantité d'albumine en g). 5.2.2. Profil d’élution Prélever, dans cinq tubes à hémolyse (numérotés 6’à 10’), mettre 0,1 mL des tubes 6-10. Ajouter 2 mL de bleu de Coomassie. Lire l'absorbance à 595 nm contre le tube 0’ de la gamme d'étalonnage. Q10 : Tracer le profil d’élution de l’albumine sur papier millimétré 5.2.3 Dosage quantitatif de la fraction déposée Dans une fiole jaugée de 10 mL, prélever 0,4 mL de solution A. Ajuster le volume à 10 mL avec le tampon II. Agiter, puis effectuer 3 prises d’essai de 0,1 mL dans des tubes à hémolyse (tubes 11’ à 13’) Ajouter 2 mL de bleu de Coomassie puis lire l'absorbance à 595 nm contre le tube 0’ Q11 : Déterminer la quantité d’albumine, en g, dans les tubes 11’-13’. Q12 : Calculer la quantité d’albumine, en mg, dans la fiole jaugée. (Sr = 0.05 mg/mL) Q13 : Calculer la concentration de la solution A. En déduire la quantité d'albumine déposée. 5.2.4 Dosage quantitatif de la fraction récupérée Dans une fiole jaugée de 10 mL, rassembler les éluats des tubes 6-10 contenant l’albumine. Bien rincer les tubes avec quelques gouttes de tampon II et joindre le rinçage à l’éluat. Ajuster le volume à 10 mL avec le tampon II. Agiter puis effectuer 3 prises d’essai de 0,1 mL dans les tubes à hémolyse (tubes 14’-16’) Ajouter 2 mL de bleu de Coomassie puis lire l'absorbance à 595 nm. Q14 : Déterminer la quantité d’albumine, en g, dans les tubes 14’-16’ puis dans la fiole jaugée. (Sr = 0.05 mg/mL) (Attention : la moyenne s’effectue sur les concentrations obtenues) Q15 : Calculer la quantité d'albumine récupérée puis calculer le rendement de l’opération. 8 TP2 Détermination de la composition en glucides d’un jus de fruit Les fruits contiennent du saccharose et un mélange équimoléculaire de glucose et de fructose provenant de l'hydrolyse du saccharose. Ces glucides sont analysés par différentes techniques. I Extraction du jus d'orange 1.1 Mode opératoire - Presser l’orange et mesurer à l'éprouvette le volume de jus recueilli. Centrifuger ce jus pendant 3 minutes à 5000 rpm. - Prélever 25 mL de surnageant, ajouter 25 mL d'eau distillée. Centrifuger de nouveau. - Recueillir le surnageant dans une fiole jaugée et ajuster à 100 mL avec de l’eau distillée. La solution ainsi obtenue est appelée solution J et est conservée dans un flacon bouché. 1.2 Résultats Q1 : Si on appelle C Glc ; C Fru et C S a c les concentrations respectives du glucose, du fructose et du saccharose dans le jus d’orange ; C'Glc ; C'Fru et C'Sac les concentrations respectives du glucose, du fructose et du saccharose dans la solution J, quelle relation existe-t-il entre C Glc et C'Glc ? II Hydrolyse du saccharose 2.1 Mode opératoire - Dans un erlen, à 20 mL de sol J, ajouter 5,0 mL de solution d‘acide chlorhydrique à 2 mol/L. - Incuber 20 minutes au bain-marie bouillant. - Faire refroidir le milieu réactionnel sous un filet d’eau froide et ramener son pH à 6 (utiliser du papier pH) en ajoutant goutte à goutte de la soude à 2,5 mol/L. - Transvaser dans une fiole jaugée de 100 mL et compléter avec de l’eau distillée. La solution ainsi obtenue est appelée solution H et est conservée dans un flacon bouché. Les solutions H et J sont à conserver pour l'ensemble de l'étude. 2.2 Résultats Q2 : Donner l’équation chimique de l’hydrolyse du saccharose. Q3 : Quelle relation existe t-il entre C’’glc (concentration du glucose dans H) et C glc? III Chromatographie sur couche mince 3.1 Principe de la CCM La chromatographie d'adsorption est basée sur le partage des solutés entre l'adsorbant fixe et la phase liquide mobile. Chacun des solutés est soumis à une force de rétention par adsorption et une force d'entraînement par la phase mobile. L'équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation. L'identification des composés du mélange peut se faire : - en utilisant des témoins et en comparant la migration des témoins à celle des constituants de l'échantillon à analyser. - en caractérisant la migration d'un soluté par son Rf (rapport au front) à une température donnée, pour un système chromatographique défini (support, solvant de développement), le Rf est caractéristique d'un soluté. 9 Rf d D Distance par cour ue par le soluté = Distance par cour ue par l' éluant Dans le cas où on chromatographie des substances incolores, il est nécessaire de visualiser les spots par une réaction chimique colorée appelée révélation. 3.2 Mode opératoire - Verser le solvant (butanol : 5 vol., acétone : 4 vol., eau : 1 vol.) dans la cuve, poser le couvercle et attendre la saturation (environ 1 heure). - Sur la plaque tracer une droite parallèle au bord inférieur, marquer par un trait l'emplacement des dépôts. - Réactiver la plaque 30 min à 105°C. - Déposer à l'aide de micro pipettes, les témoins (solutions à 1 % de glucose, fructose, saccharose, maltose, mannose et arabinose) et les solutions J et H. Le diamètre de la tache doit être d’environ 2 mm. Refaire les dépôts une deuxième fois. - Sécher les échantillons et introduire la plaque dans la cuve. Remettre le couvercle. - Laisser migrer le solvant par capillarité. Retirer la plaque lorsque le front du solvant est à environ 1 à 2 cm du bord supérieur de la plaque. - Sortir la plaque, noter le front du solvant au crayon à papier et la sécher au sèche-cheveux. - Préparer la solution de révélation (mélanger les deux produits au dernier moment) : * 20 mL de solution de permanganate de potassium à 1 %, * 20 mL de carbonate de sodium à 4 %. - Plonger la plaque dans le révélateur jusqu’à apparition des taches jaunes correspondant à la réduction du permanganate par les fonctions alcool des sucres. 3.3 Résultats - Joindre le chromatogramme au compte rendu. Q4 : Préciser les conditions opératoires (référence de la chromato-plaque, solvant, révélateur, température, durée…) Q5 : Calculer les Rf (regrouper tous les résultats dans un tableau). Conclure. IV Dosage des glucides réducteurs 4.1 Principe En milieu alcalin et à chaud, les glucides réducteurs réduisent l'acide 3,5-dinitro-salicylique en acide 3-amino-5-nitrosalicylique de coloration rouge orangé. -OOC -OOC OH OH + NO2 O2N Jaune Glucide réducteur 6 H+ + 6 e- + 2 H2O NH2 O2N Orange-rouge P roduits d'oxydation + n- e La chimie de la réaction est complexe et la réaction d’oxydoréduction avec les glucides n’est pas stœchiométrique et les différents sucres donnent des colorations variables. Cette 10 technique n’est pas applicable pour un mélange complexe de sucres réducteurs et la gamme d’étalonnage doit être de même composition que la solution à doser. 4.2 Rappels sur l’absorption moléculaire visible Lorsqu'un faisceau lumineux traverse une substance, trois cas peuvent se produire : - Le faisceau n'est pas affaibli : son flux n'est pas modifié. On dit que le milieu est totalement transparent (exemple de l'eau avec une radiation jaune). - Le faisceau est complètement absorbé : son flux est nul à la sortie de la substance. On dit que le milieu est opaque (exemple du noir de fumée). - Le faisceau est partiellement affaibli : le flux transmis est inférieur au flux incident. C'est sur cette absorption partielle que reposent toutes les techniques d'analyse absorptiométriques. On peut distinguer deux types de milieux partiellement absorbants : - Les milieux neutres qui affaiblissent de manière équivalente toutes les radiations d'un faisceau polychromatique ; - Les milieux sélectifs qui n'absorbent que certaines radiations d'un faisceau polychromatique. S'ils n'absorbent qu'une bande étroite de longueurs d'ondes, ils présentent une couleur, complémentaire de celle qui a été absorbée. Par exemple, une substance absorbant une radiation bleue (voisine de 460 nm) sera orange. Considérons un faisceau lumineux monochromatique, de flux 0, traversant une substance en solution, à la concentration molaire volumique C, dans un solvant non absorbant. Sur une épaisseur dl, la diminution du flux du faisceau est proportionnelle : - au flux du faisceau en ce point, - à l'épaisseur dl du trajet absorbant, - à la concentration C de la solution en substance absorbante. d = -.dl.C. ou d/ = -.dl.C (1) En intégrant l’équation (1) sur toute la longueur traversée, l, on obtient : ln-ln0 = -.lC Le coefficient est le coefficient d'absorption. Il dépend de la substance absorbante, de la température et de la longueur d'onde (λ) du faisceau incident. On définit : La transmission : T = 0 T = 100 % pour un milieu transparent T = 0 % pour un milieu opaque. L’absorbance : A = log (0) L’absorption d’un rayonnement monochromatique suit la loi de Beer-Lambert. L’absorbance d'une solution d'une substance absorbante, à une longueur d’onde donnée, est proportionnelle à l'épaisseur de solution traversée et à la concentration de la solution. A=.L.C A : absorbance (pas d’unité) : coefficient d’extinction molaire de la substance, à λ faisceau incident considérée (L.mol-1.cm-1) faisceau transmis -1 C : concentration (en mol.L ) de la solution dl L : longueur du trajet optique en cm (épaisseur de la cuve l contenant la solution) La loi de Beer-Lambert n'est vérifiée que si les conditions suivantes sont respectées : - La lumière doit être monochromatique. - Les solutions doivent être très diluées car le coefficient d'extinction molaire ne reste constant que pour des solutions très diluées. - Il ne doit pas y avoir de réflexion, diffusion ou fluorescence du faisceau incident. 11 4.3 Test de spécificité de la méthode - Dans des tubes à essai, réaliser les tests indiqués dans le tableau suivant : Tube n° 0 1 2 3 4 5 6 Solution de glucose à 0,5 g/L (mL) 0 1,0 2,0 0 0 0 1,0 Solution de fructose à 0,5 g/L (mL) 0 0 0 1,0 2,0 0 1,0 Solution de saccharose à 0,5 g/L (mL) 0 0 0 0 0 2,0 0 Eau distillée (mL) 2,0 1,0 0 1,0 0 0 0 Acide 3,5-dinitrosalicylique DNS (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Placer au Bain-marie bouillant pendant 5 minutes (DNS sensible à la température) Laisser refroidir jusqu’à température ambiante (l’absorbance varie avec la température) Eau distillée (mL) 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 - Mesurer les absorbances de chaque tube à 530 nm contre le tube 0 et les noter dans un tableau. 4.4 Courbe d’étalonnage : - Préparer 10 mL de solution étalon mère contenant 5 mL de solution de glucose à 0,5 g/L et 5 mL de solution de fructose à 0,5 g/L. A l'aide de cette solution étalon mère préparer la gamme d’étalonnage suivante : Tube n° T 7 8 9 10 11 Solution étalon mère (mL) 0 2,0 1,5 1,3 1,0 0,7 Eau distillée (mL) 2,0 0 0,5 0,7 1,0 1,3 Acide 3,5-dinitrosalicylique (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Placer au Bain-marie bouillant pendant 5 minutes Laisser refroidir jusqu’à température ambiante (l’absorbance varie avec la température) Eau distillée (mL) 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 - Mesurer l’absorbance de chaque tube à 530 nm contre le tube T. Les noter dans un tableau où figure la quantité de sucres réducteurs en mg présents dans le tube. 4.5 Dosage des glucides réducteurs du jus d’orange - Préparer les tubes suivants : Tube n° 12 13 14 Solution J diluée au 1/20 (mL) 0,5 1,0 0 Solution H diluée au 1/20 (mL) 0 0 1,0 Eau distillée (mL) 1,5 1 1,0 Acide 3,5 dinitro-salicylique (mL) 2,0 2,0 2,0 Placer au Bain-marie bouillant pendant 5 minutes. Laisser refroidir jusqu’à température ambiante Eau distillée (mL) 6,0 6,0 6,0 15 0 2,0 0 2,0 6,0 - Mesurer les absorbances de chaque tube à 530 nm contre le tube T de la gamme étalon. Noter ces valeurs. 4.6 Résultats Q6 : Qu’est-ce qu’un sucre réducteur ? 12 Q7 : Que peut-on conclure des résultats obtenus lors du test de spécificité ? Q8 : Tracer la courbe d’étalonnage (Absorbance en fonction de la quantité de sucres en mg) Q9 : Déterminer la quantité en mg de glucides réducteurs dans les tubes 12, 13,14 et 15. Q10 : Calculer les concentrations massiques et molaires du glucose, fructose et saccharose dans les solutions J et H. V Dosage du glucose par iodométrie 5.1 Principe Les aldoses sont oxydés en acides adoniques par un excès de solution alcaline de diiode. Le diiode en excès est dosé par une solution de thiosulfate de sodium préalablement étalonnée. En milieu fortement basique, une solution de diiode se décolore car le diiode se transforme en ions iodure (réaction de réduction : demi équation (1)) et en ions iodate (réaction d’oxydation : demiéquation (2)). On dit que le diiode se dismute (réaction de dismutation : équation (3)). (1) : I 2 + 2 e2 I(2) : I 2 + 6 H2 0 2 IO3- + 12 H+ + 10 eEquation bilan : 5 x éq.(1) + éq (2) puis simplification par 2 : 3 I 2 + 3 H2 0 5 I- + IO3- + 6 H+ La réaction a lieu en milieu basique : les ions H+ sont neutralisés par les ions OH - d’où l’équation de dismutation : (3) : 3 I2 + 6 OH5 I- + IO3- + 3 H20 Les ions iodates formés lors de cette réaction de dismutation se réduisent en ions iodure (demi-équation (4)) et oxydent le glucose en acide gluconique (demi-équation (5)). (4) : IO3- + 6H+ + 6 eI- +3 H2O (5) : RCHO + H2O RCOOH + 2 H+ + 2 eL’équation (6) de la réaction d’oxydation du glucose par les ions iodate est la somme des deux demi-équations (4) et (5) : (6) : 3 RCHO + IO33 RCOOH + ISoit en milieu basique : (7) : 3 RCHO + IO3- + 3 OH3 RCOO- + I- + 3 H2O Lorsque le milieu est acidifié les ions iodures et iodates présents dans le milieu redonnent du diiode (médiamutation) selon l ‘équation (8) (8) : 5 I- + IO3- + 6 H+ 3 I 2 + 3 H2 O Le diiode ainsi formé est dosé par le thiosulfate de sodium : I2 + 2 S2O322 I- + S4O825.2 Dosage du jus d’orange - Dans des erlenmeyers, introduire : Erlenmeyer n° Solution J (mL) Solution H (mL) Eau distillée (mL) Solution de diiode à environ 0,05 mol/L (mL) Solution de soude 2,5 mol/L (mL) 1 0 0 10 15,0 5 2 5 0 5 15,0 5 3 0 10 0 15,0 5 - Boucher, laisser 30 minutes à l'obscurité. - Ajouter 8,0 mL d'acide chlorhydrique 2 mol/L. - Doser chaque solution par la solution de thiosulfate de sodium 0,1 mol/L 13 5.3 Résultats Q11 : Quel est le nombre de moles de diiode mis au départ dans chaque tube ? Q12 : Calculer les concentrations molaires et massiques du glucose dans les solutions J et H. Q13 : En déduire la concentration du saccharose dans la solution J et dans le jus d’orange. VI Mesure du pouvoir rotatoire 6.1 Principe L'activité optique des substances chirales s'observe et s'apprécie avec un polarimètre. La rotation du plan de polarisation de la lumière est détectée par l'analyseur que l'expérimentateur fait tourner d'un angle pour retourner à la position initiale : - rotation à droite (> 0), la substance est dextrogyre - rotation à gauche (< 0), la substance est lévogyre La polarimétrie repose sur la loi de Biot: = []D t.L.C : rotation lue (optique) en degré, []D: Pouvoir rotatoire spécifique (= 20°C, = 589 nm pour la raie D du sodium) en degré.dm-1.mL.g-1, L: longueur du tube polarimétrique en dm, C: concentration de la solution en g.mL-1 ; le solvant doit être précisé. 6.2 Mode opératoire - A l'aide d'un polarimètre, mesurer l'angle de rotation du plan de polarisation de la lumière. par : - les solutions étalons de glucose, fructose et saccharose à 100 g/L - la solution H*. 6.3 Résultats Q14 : Calculer les pouvoirs rotatoires spécifiques du glucose, du fructose et du saccharose. (attention aux unités) Q15 : En déduire la concentration en glucose et fructose de la solution H* du jus d'orange. * La solution H est trouble et contient de nombreuses particules de petite taille en suspension or, pour être analysées par polarimétrie, la solution ne doit pas absorber la lumière polarisée. La solution H* a été traitée pour pouvoir être analysées par polarimétrie. Elle est issue d’une autre orange. 14 TP3 Chromatographie par filtration sur gel I Principe La chromatographie par filtration sur gel (ou chromatographie d'exclusion stérique ou tamisage moléculaire) est une technique qui permet de séparer des molécules en fonction de leur taille en les fractionnant sur une colonne remplie de particules de gel poreux. Le mélange à séparer est déposé au sommet de la colonne. Les grosses molécules dont le diamètre est supérieur à celui des plus gros pores sont exclues du gel et sont éluées les premières. Les petites et moyennes molécules diffusent (totalement ou partiellement) dans le gel, leur migration est freinée, elles sont éluées plus tardivement. La diffusion est inversement proportionnelle à la masse moléculaire. Vt volume total de la colonne de gel V0 volume vide (ou mort), volume d'eau à l'extérieur des granules, volume d'élution des particules totalement exclues du gel Vi volume d'eau interne, volume d'eau contenu dans les particules de gel Vg volume du gel Ve volume d'élution d'un composé Vt = V0+Vi+Vg Les laboratoires fournissent des gels réticulés de dextranes (Séphadex), d'agarose (Sépharose, Bio-gel A), d'acrylamide (Bio-gel P), de verre poreux (Bio-glas) et de polystyrène (Bio-beads). Le degré de réticulation est minutieusement contrôlé pour donner des gels permettant de fractionner les molécules dans une gamme de masse moléculaire donnée. 1.1 Les gels de Séphadex Les Séphadex sont des dextranes, polymères du glucose, formés par des bactéries et pontés par réaction avec l'épichlorhydrine. Les séphadex différents par leur degré de réticulation, (indiqué par les chiffres qui suivent la lettre G) correspondent à leur capacité de fixation d'eau. Les Séphadex sont fournis sous forme de poudre et gonflent beaucoup par hydratation. type de Séphadex G25 G50 G75 G100 gamme de fractionnement des mases moléculaires (en Daltons) 1 000- 5 000 Da 1 500-30 000 Da 3 000 – 70 000 Da 4 000 – 100 000 Da 15 1.2 Principe de l’exclusion stérique A B O O Petites molécules O O O OO O O O O Moyennes molécules Grosses molécules A: représentation schématique d’une colonne de chromatographie d’exclusion stérique B: mécanisme de la chromatographie par filtration sur gel Les grosses molécules ne pénètrent pas dans les pores du support, elles sont exclues du gel (volume d’élution Ve = V0 ). Les molécules de taille moyenne pénètrent partiellement dans les pores du support, elles sont partiellement retardées (volume d’élution Ve : V0<Ve<Vt ) Les petites molécules pénètrent dans les pores, elles sont retardées (volume d’élution V e =Vt ). 1.3 Application à l’étude de la séparation de deux protéines (trypsinogène et galactosidase) et un nucléotide (adénosine monophosphate : AMP). Le gel de séphadex G-75 exclut toutes les molécules de masse moléculaire supérieure à 70 000 Da et laisse entièrement diffuser les molécules de masse moléculaire inférieure à 3 000 Da. II Réactifs Colonne de chromatographie (1,5 x 50) contenant le gel équilibré dans le tampon et réservoir de solvant. La colonne est prête à l’emploi. Séphadex G-75, mis en suspension dans le tampon phosphate et coulé en colonne. Tampon phosphate 0,05 mol.L-1 Solution à déposer contenant: AMP, -galactosidase, trypsinogène Solution d'o-nitrophényl-galactoside dans le tampon: ONPG 1 mg mL-1 Na2CO3 1 mol.L-1 Na2CO3 0,1 mol.L-1 -1 ONP 100 mol.L-1 dans Na2CO3 (0,1 mol.L ) 16 III Mode opératoire La colonne ne doit jamais sécher. Amener le tampon dans la colonne au niveau du gel en surveillant attentivement. Numéroter 30 tubes à hémolyse (1-30) pour recueillir 30 fractions de 3 mL. Dépôt de l’échantillon et élution A l’aide d’une pipette Pasteur, déposer l’échantillon contenant les 3 substances à séparer. Ouvrir la colonne pour faire pénétrer l'échantillon. Rincer alors le tube ayant contenu l'échantillon, deux fois, avec 1 mL de tampon. Déposer les deux volumes de rinçage sur la colonne. Remplir la colonne et le réservoir avec le tampon. Recueillir 30 fractions de 3 mL dans les tubes numérotés. Laisser l’éluant s’écouler pendant 15 mn après avoir recueilli la dernière fraction. IV Résultats 4.1 Profils d'élution Lire l'absorbance à 254 et 280 nm (domaine de l'UV, cuves en quartz : pour UV) pour chacune des fractions 1-30. Après chaque lecture, reverser chaque fraction dans son tube d'origine. Q1 : Tracer le graphe A = f(Ve) (profil d'élution) pour 254 nm et 280 nm. Q2 : Comparer les profils d'élution et conclure. 4.2 Identification des pics 4.2.1 Spectre d'absorption Prendre le tube d'éluat correspondant au sommet de chaque pic du profil d'élution (ce tube contient le maximum de substance) et réaliser un spectre d’absorption entre 240 et 300 nm. (= 5 nm entre 2 mesures, utiliser des cuves à quartz) Récupérer les fractions Q3 : Tracer le spectre d'absorption A = f() de 240 à 300 nm avec 3 couleurs distinctes. Q4 : Comparer ces spectres entre eux et conclure. 4.2.2 Identification des pics protéiques La -galactosidase hydrolyse les -D-galactosides. L'hydrolyse enzymatique de l'onitrophényl--D-galactoside (ONPG), substrat synthétique incolore en solution, libère l'onitrophénol (ONP), produit jaune, mesurable en spectrophotométrie à 420 nm. Prendre les tubes d'éluat correspondant aux sommets des pics protéiques. Prélever dans chaque tube 2 gouttes d'éluat et le transférer dans un autre tube. Ajouter 2 gouttes de la solution d'ONPG (1 mg.mL-1) Mélanger et observer. 17 Q5 : Attribuer à chacun des pics du profil d'élution la substance qui lui correspond. Q6 : Justifier l'ordre d'apparition des pics: - β-galactosidase (MM=595 000 Da) - trypsinogène (MM=30 000 Da) - AMP (MM=347,2 Da) 4.3 Dosage de la -galactosidase 4.3.1 Etalonnage du colorimètre (gamme étalon) Réaliser une gamme-étalon d’ONP (solution fille de 0 à 100 mol.L-1) à partir de la solution étalon mère d’ONP 100 mol.L-1. Effectuer les dilutions dans Na2CO3 0,1 mol.L-1 (sur un volume final de 2 mL). Lire les absorbances à 420 nm dans des cuves en plastique (visible). 4.3.2 Dosage (essai) Dans un tube à essais, introduire : Enzyme (tube devenu jaune au 4.2.2) 0,1 mL ONPG (mis à 37 °C durant 10 min avant de prélever) 1,5 mL Incuber 5 mn exactement à 37°C. Pour arrêter la réaction, additionner : Na2CO3 à 1 mol.L-1 2,4 mL Mesurer l’absorbance du tube essai par rapport au témoin à 420 nm Préparer, simultanément un tube témoin sans enzyme (remplacer l’enzyme par le tampon). 4.3.3 Résultats Q7 : Présenter le calcul (formule littérale et application numérique) pour la réalisation du tube 2 de la gamme étalon (volume d’ONP et volume de carbonate de sodium prélevés). Q8 : Présenter la gamme-étalon sous forme de tableau complet (nombre de tubes 5 ou 6). Q9 : Tracer la courbe d’étalonnage (absorbance en fonction de la concentration d’ONP en mol/L). Q10 : Evaluer la concentration d’ONP dans l’essai. Q11 : Calculer la pente de votre droite étalon qui correspond au coefficient d’extinction molaire (nécessaire pour la question 12) en L/mol/cm. Q12 : Calculer la concentration d’'activité catalytique de la -galactosidase en UI par mL de solution d'enzyme (UI mL-1). L'unité internationale (UI) est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une micromole de substrat par minute, au pHo de l'enzyme à 37°C. Q13 : Transformer la concentration d’activité catalytique en nanokatal/mL (nmol/sec/mL) (1 katal = 1 mol/sec) 18 TP4 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide I Principe Cette technique permet de séparer les fractions protéiques de charges électriques différentes. Les protéines en solution dans un tampon migrent sous l'action d'un champ électrique créé par un générateur de courant continu. La migration se fait au sein d'une phase liquide imprégnant un gel. Une révélation spécifique permet la localisation des fractions protéiques sous forme de zones distinctes. =O Gel de polyacrylamide : support d'électrophorèse Le gel de polyacrylamide est préparé extemporanément et coulé sur plaque. C'est un copolymère d'acrylamide et de méthylène bis-acrylamide qui assure le pontage entre les chaînes de polyacrylamide. La polymérisation radicalaire utilise le persulfate d'ammonium comme initiateur et la tétraméthyléthylène diamine (TEMED) comme catalyseur. ac ryl ami de =O 2 =O CH2 = CH - C - NH CH2 = CH - C - NH - CH S 2O 82- 2 - NH -C - CH = CH 2 pe rs ul fa te 2 SO 4- . - CONH 2 - - CONH 2 methyl en e bi sac ryl ami de (bi s) - - CH2 - CH - CH 2 - CH - CH 2 - CH - - CONH po ly acry lamide - CH2 - CONH - - - CH2 - CH - CH 2 - CH - CH 2 - CH CONH 2 CONH 2 Migration L'électrophorèse est réalisée dans une cuve. Le tampon utilisé est du tris-glycine pH 8,6. A ce pH les protéines étudiées sont chargées négativement, soumises à un champ électrique, elles migrent vers le pôle positif. Le front de migration est matérialisé par le bleu de bromophénol. Révélation Toutes les solutions de révélation sont préparées au moment de l'emploi. LDH (lactate déshydrogénase) NAD + NADH +H+ Lactate pyruvate LDH 19 Le NADH produit est révélé à l'aide d'un sel de tétrazolium (MTT). La réduction du MTT fait intervenir le PMS (phénazine méthosulfate); il se forme alors un complexe bleu qui apparaît au niveau de la localisation de l'enzyme. Amylase (Amy) Amidon oligholosides Amy Une solution iodo-iodurée (I2 + IK) colore l'amidon en brun. La digestion de l'amidon par l'amylase se traduit dans ces conditions par l'apparition de zones non colorées au niveau de l'activité enzymatique. Estérase (Est) - naphtyl acétate - naphtol + acide acétique Est - naphtol + fast blue BB zone colorée brun noir Les estérases sont révélées par combinaison de l' - naphtol et d'un colorant (fast blue BB). Une zone colorée apparaît au niveau de l'enzyme. II Technique 1 matériel d’électrophorèse 1- séparateur 2- plaque d’alumine et plaque de verre 3- peigne 4- réservoir inférieur 5- réservoir supérieur 2 2.1 6- couvercle et câbles 7- joint tubulaire 8- pince 9- support de coulage du gel Préparation du gel de séparation Assembler le sandwich, en empilant successivement : - la plaque d'alumine échancrée - deux séparateurs de 1,5 mm d'épaisseur (bavures vers l'extérieur) 20 - la plaque de verre. Maintenir le sandwich avec du scotch. 2.2 Placer les sandwiches sur le support de coulage, la plaque d'alumine vers l’arrière, l'échancrure vers le haut. Fermer le support. 2.3 Préparer la solution du monomère, au moment de l'emploi, en introduisant dans un bécher, successivement : TEMED : acrylamide + bis-acrylamide : eau distillée : persulfate d'ammonium : 08,0 mL 16,2 mL 7.8 mL 32,0 mL gants chirurgicaux indispensables : acrylamide Mélanger (agitation magnétique) et couler immédiatement à la seringue. Placer les peignes. Laisser polymériser (environ 30 à 45 min). Séparer et nettoyer les « sandwichs » (éliminer les excès de gel). Oter les peignes, délicatement pour ne pas déformer les puits. Remplir les puits de tampon Tris-glycine pH 8,6 (seringue). Installer les « sandwichs » dans la cuve à électrophorèse. 2.4 Entretien Retirer le barreau aimanté de la solution du monomère aussitôt après le coulage du gel. Laisser l’excès de gel polymériser avant de laver le bécher. Laver avec le détergent, brosser si nécessaire. Rincer à l'eau du robinet, puis à l'eau distillée. Ne jamais utiliser d'acide, de base, ni de solvants organiques. 3 Préparation du tampon Tris-Glycine pH 8,6 (pendant la polymérisation) 1- Peser 0,75 g de Tris, et dissoudre dans environ 50 mL d’eau dans un bécher. Chauffer légèrement et agiter. 2- Peser 3,6 g de Glycine, dissoudre dans environ 170 mL d’eau en chauffant légèrement et en agitant. 3- Verser Tris dans Glycine en ajustant le pH entre 8,3 et 8,6. 4- Compléter à 250 mL dans une fiole jaugée. 4 Préparation des échantillons Broyer une moule à l’aide d’un mortier et de son pilon. Diluer la lactate déshydrogénase fournie (20 µL) avec du tampon Tris-Gly (20 µL). Imbiber des languettes de papier pour déposer les échantillons dans les puits. 5 Dépôt des échantillons et migration Vider les puits. Déposer une goutte (micro-seringue) de bleu de bromophénol au fond des puits non numérotés. (voir feuille suivante) 21 Déposer les échantillons dans les puits numérotés: bleu 1 bleu 2 bleu 3 …. 1 2 3 4 5 languette de salive → test amylase languette de moule → test amylase languette de moule → test LDH languettes de LDH → test LDH languette de moule → test estérase Compléter les puits avec du tampon Tris-Gly. Remplir de tampon Tris-Gly les compartiments des électrodes. Fermer la cuve. Brancher le circuit de refroidissement. Mettre le générateur sous tension. Durée de l'électrophorèse environ 1/2 H. Surveiller la migration. Mettre le générateur sur Off. Débrancher les électrodes. Jeter le tampon. Démouler le gel et le découper en bandes correspondant aux différentes enzymes. 6 Révélation Faire les pesées pendant la migration. Utiliser une verrerie propre et sèche. 6.1 Amylase Réactifs : - solution d'empois d'amidon 1 % Peser 1 g d'amidon, ajouter 10 mL d’eau distillée. Faire bouillir 90 mL d’eau distillée. Verser l'eau distillée bouillante sur l'amidon et porter à ébullition. Refroidir (bain froid) et mettre au réfrigérateur. - Solution de NaCl 0,5 % Mettre la solution dans une boîte à l'étuve à 37°C (sous la hotte). Révélation de l'enzyme Mettre le gel, 5 mn, dans la solution d'empois d'amidon, au frigo, le tourner de temps en temps Retirer le gel et le placer 30 mn dans la solution de NaCl, à l'étuve à 37° C (sous la hotte). Dans une boîte, verser 25 mL de solution iodo-iodurée. Surveiller la modification de l'aspect du gel, en plaçant la boîte sur un fond blanc (qq mn) 6.2 Estérase Solution de révélation Peser et introduire dans un erlen 20 mg de fast blue BB Au moment de l'utilisation*(au moment de retirer le gel de la solution d'acide borique), ajouter : Tampon phosphate 0,1 mol.L-1 pH 6,5: 30 mL Solution d'-naphtyl acétate: 1 mL 22 Mélanger rapidement et utiliser immédiatement. Révélation de l'enzyme : Mettre le gel, au frigo, dans une boîte contenant 30 mL d'acide borique (30 mn). Au moment de retirer le gel, terminer la solution de révélation*. Jeter l'acide borique, recouvrir le gel de la solution de révélation. Mettre à incuber à l'étuve à 37°C (sous la hotte). Après 15 mn, observer. 6.3 LDH Solution de révélation de LDH Peser et introduire dans un erlen : NAD: 30 mg PMS: 6 mg MTT: 30 mg Au moment de l'utilisation, ajouter : Tampon phosphate 0,1 mol.L-1 pH 6,5: 30 mL DL - Lactate de sodium: 2 mL Agiter rapidement et utiliser immédiatement. Révélation de l'enzyme : Placer le gel dans une boîte de Pétri. Verser sur le gel la solution de révélation. Mettre à incuber à l'étuve à 37°C pendant 5-10 mn. Observer. 7 Résultats Q1 : Définir le terme électrophorèse. Q2 : Dans la formule de structure du polymère, encercler l'acrylamide et encadrer le méthylène bisacrylamide. Q3 : Calculer en g% la concentration du gel: 200 mL de solution d'acrylamide (120 g) et de bisacrylamide (0,8 g) ont été utilisés pour la préparation du gel. Q4 : Schématiser le principe général d’une électrophorèse bidimensionnelle qui est couramment utilisée en analyse du protéome cellulaire. Q5 : Définir le protéome. Q6 : Rechercher la définition du terme isoenzyme. Q7 : Schématiser le taux et la localisation des isoenzymes de la LDH du muscle du squelette. Q8 : Ecrire la réaction qui a lieu entre le MTT et le PMS (pages 19 et 20). Q9 et 10 : Le tampon phosphate est couramment utilisé en biochimie, calculer : - le pH de la solution tampon NaH2PO4 (0,05 mol.L-1) + Na2HPO4 (0,1 mol.L-1). - le pH de la solution tampon préparée, dans une fiole jaugée de 250 mL, en dissolvant 3,0 g de NaH2PO4 et 1,775 g de Na2HPO4, dans l’eau. (Donnée : pKa=7,2 pour le couple H2PO4-/HPO42-) Q 11 et 12 : Schématiser votre gel et interpréter le gel d’électrophorèse après révélation. Q13 : Conclure sur ce gel. 23