Les Avantages des RabMAbs

Les Avantages
des RabMAbs®
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#4
Haute affinité
#5
Haute spécificité
#6
Epitopes nouveaux
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Les
RabMAbs® (Rabbit Monoclonal Antibodies)
Anticorps monoclonaux de lapin
Anticorps de qualité supérieure
Table des matières
A propos de la technologie RabMAb
3
Intérêts des RabMAbs
4
Avantages pour les utilisateurs
4
Comparaison entre RabMAbs et anticorps de souris
5
Les avantages des RabMAbs
2
1. Réduction du bruit de fond
6
2. Détection des modifications post-traductionnelles
7
3. Excellents produits pour l’immunohistochimie (IHC)
8
4. Haute affinité
9
5. Haute spécificité
10
6. Reconnaissance d’épitopes nouveaux et variés
11
7. Nombreuses applications validées
12
8. Compatibilité avec les échantillons de souris
13
Exemples de RabMAbs
14
Avantages des RabMAbs
A propos de la technologie RabMAb
Les RabMAbs (Rabbit Monoclonal Antibodies) sont issus
d’une technologie unique et exclusive permettant de
développer des anticorps monoclonaux chez le lapin, au lieu
de la méthode conventionelle utilisant la souris.
Cette technique, similaire à celle développée pour les anticorps monoclonaux de souris, utilise un partenaire de fusion
breveté (lignée cellulaire immortelle) pouvant fusionner avec
les cellules B, formant ainsi des hybridomes de lapin. Ces
hybridomes sont alors criblés pour sélectionner des clones
reconnaissant, de manière spécifique et avec une grande
sensibilité, l’antigène de choix. Les anticorps sont ensuite
caractérisés pour déterminer leur efficacité dans plusieurs
applications (Fig. 1).
Les anticorps produits par la technologie RabMAb permettent une meilleure reconnaissance antigénique en comparaison avec des anticorps traditionnels de souris. En effet,
le système immunitaire du lapin génère une grande diversité
d’anticorps et optimise l’affinité par des mécanismes plus efficaces que ceux présents chez la souris ou autres rongeurs,
améliorant ainsi la probabilité d’isoler des anticorps fonctionnels pour une plus grande gamme d’applications (1, 2).
Contrairement à la souris, la réponse immunitaire du lapin
induite par des molécules organiques ou des peptides est
supérieure. C’est souvent pour cette raison que les anticorps
polyclonaux sont développés chez le lapin pour la recherche
et les applications de diagnostics, allant du dépistage de
drogues au diagnostic clinique.
Fig. 1 - Protocole de
production des RabMAbs
Lapins
immunisés
Cellules B isolées
Partenaires de fusion
(240E-W2, US patent 742987)
Hybridomes
Hybridomes criblés par ELISA pour une
reconnaissance spécifique de l’antigène
Caractérisation de l’anticorps
(Western, IHC, ICC, Flow, IP, test de neutralisation, etc.)
1. Rabbit monoclonal antibodies: a comparative study between a novel category of
immunoreagents and the corresponding mouse monoclonal antibodies.
Rossi S, [Am J Clin Pathol. 2005 Aug;124(2):295-302]
RabMAbs
2. Rabbit monoclonal antibodies show higher sensitivity than mouse monoclonals for estrogen
and progesterone receptor evaluation in breast cancer by immunohistochemistry. Rocha R,
[Pathol Res Pract, 2008;204(9):655-62. Epub 2008 Jun 18]
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3
Intérêts des RabMAbs
Les anticorps monoclonaux de lapin RabMAbs associent les avantages d’une meilleure
reconnaissance antigénique due au système immunitaire du lapin avec la spécificité et la
consistance d’un monoclonal, générant ainsi des anticorps d’une qualité exceptionnelle.
Les résultats publiés par des laboratoires indépendants comparant les anticorps monoclonaux de lapin aux monoclonaux de souris ont démontré que les RabMAbs permettent
d’augmenter la sensibilité avec une spécificité similaire sinon meilleure.
Principaux avantages des RabMAbs:
•
•
•
•
Reconnaissance diversifiée des épitopes
Meilleure réponse immunitaire aux épitopes de petites tailles
Haute spécificité et affinité
Meilleure réponse aux antigènes de souris
Avantages pour les utilisateurs
Anticorps de haute qualité pour une large gamme d’applications.
Le système immunitaire du lapin génère une diversité d’anticorps et optimise l’affinité par
des mécanismes plus efficaces que ceux présents chez la souris ou autres rongeurs. La
probabilité de récupérer des anticorps fonctionnant dans une large gamme d’applications
est donc accrue. Les anticorps RabMAbs sont souvent les outils idéaux pour des applications exigeantes telles que l’immunohistochimie (IHC) sur tissus fixés au formol et inclus
dans la paraffine.
De nouveaux anticorps pour les cibles dites « difficiles ».
Grâce à la reconnaissance d’un large éventail d’épitopes et une meilleure réponse immunitaire pour les cibles peu immunogènes (telles que les antigènes de souris, ou les
épitopes de petites tailles comme les peptides ou molécules organiques), le développement d’anticorps hautement fonctionnels pour ces cibles particulières devient donc
possible grâce à la technique RabMAb. Par exemple, des anticorps de qualité ont été
développés pour la reconnaissance de sites présentant une double phosphorylation.
Des anticorps hautement caractérisés.
En plus des nombreux avantages que présente la technologie des monoclonaux de
lapin, chaque RabMAb est testé dans de nombreuses applications (ELISA, WB, IHC, ICC/
IF, IP et FACS) et espèces (Humain, Souris et Rat). Ces étapes de validation sont indispensables et permettent de sélectionner des anticorps de haute qualité.
4
Avantages des RabMAbs
Comparaison entre RabMAbs (Monoclonaux de
Lapin) et Monoclonaux de Souris
Comparaison
RECONNAISSANCE DE
L’ANTIGÉNE
RabMAbs
• Bonne réponse immunitaire
contre les peptides, petites
molécules et protéines de
rongeurs
• Reconnaissance diversifiée des
épitopes
Monoclonal de Souris
• Réponse immunitaire
limitée pour les protéines de
rongeurs
• Peptides et molécules
organiques sont souvent de
faibles immunogènes
• Reconnaissance épitopique
limitée (immunodominance)
AFFINITÉ
de l’ordre du picomolaire
(KD =10-12 M)
de l’ordre du nanomolaire
(KD =10-9M)
SPÉCIFICITÉ
Elevée
Moyenne
APPLICATIONS
WB, ELISA, Cytométrie en Flux,
IP, ICC, excellents
résultats en IHC
WB, ELISA, Cytométrie en
Flux, IP, pas toujours adapté
en IHC ou ICC.
CDX2
Coupe en paraffine d’un carcinome
de colon humain avec le RabMAb
anti-CDX2 (ab76541) en comparaison
avec un monoclonal de souris
(dilution 1/1000)
RabMAb
Monoclonal de souris
RabMAb
Monoclonal de souris
RabMAb
Monoclonal de souris
E-CADHÉRINE
Coupe en paraffine d’un carcinome de
sein (humain) avec le RabMAb antiE-Cadhérine (ab40772) en comparaison avec un monoclonal de souris
(dilution 1/50)
HER2 / ErbB2
Coupe en paraffine d’un carcinome
de sein (humain) avec le RabMAb
anti Her2 / ErbB2 (ab134182) en
comparaison avec un monoclonal de
souris (dilution 1/500)
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5
1. Réduction du bruit de fond
Les RabMAbs en tant que monoclonaux, détectent un épitope unique limitant ainsi les
réactions croisées avec les autres protéines présentes dans l’échantillon. Il a été
également observé que les RabMAbs se lient à leur cible avec une plus grande affinité,
permettant d’obtenir un meilleur rapport réponse/bruit de fond qu’avec les anticorps
monoclonaux de souris à concentrations égales. Par conséquent, les RabMAbs peuvent
détecter une protéine d’intérêt avec plus de spécificité et présentent une plus grande
sensibilité tout en maintenant un bruit de fond minimal.
c-Myc
IHC sur coupe en paraffine d’un adénocarcinome de côlon humain utilisant un
RabMAb anti-c-Myc (ab32072).
Histone H3 (pS10)
IF sur cellules HeLa utilisant un
RabMAb anti-Histone H3 (pS10)
(ab32107)
6
AMPK alpha 1 (phospho S496)
IF sur cellules HeLa utilisant un RabMAb
anti-Phospho-AMPK alpha 1 (pS496)
(ab92701).
CD38
FACS sur cellules HuT-78 utilisant
un RabMAb anti-CD38 (ab108403)
(rouge) et une IgG de lapin (négatif)
(vert).
WB sur lysats cellulaires MCF-7 (1),
Ramos (2), SW480 (3), Molt-4 (4),
Jurkat (5), HeLa (6) utilisant un
RabMAb anti-MCM2 (ab108935).
Ki67 (Alexa Fluor® 488)
IF sur cellules HeLa utilisant un
RabMAb anti-Ki67 (ab154201).
Avantages des RabMAbs
2. Détection des modifications posttraductionnelles
Le système immunitaire du lapin peut fabriquer des anticorps qui reconnaissent des épitopes de
petites tailles. La détection de modifications post-traductionnelles est également rendue possible
(phosphorylation, méthylation, acétylation, sumoylation). Chez la souris, les molécules organiques
ou les peptides génèrent une réaction immunitaire beaucoup plus faible que chez le lapin.
Exemples de détection par les RabMAbs des modifications sur l’Histone H3:
Méthylation
Acétylation
1
2
1
WB sur lysat de cellules C6 utilisant
un RabMAb anti-Histone H3 (Acetyl
K56) (ab76307). Colonne 1: non traité,
Colonne 2: traité avec TSA
Phosphorylation
2
1
2
WB utilisant un RabMAb antiHistone H3 (diméthyl K4) (ab32356).
Colonne 1: Lysat de cellules Hela,
Colonne 2: Histone H3 recombinant
(non-méthylé)
Exemples de détection par les RabMAbs des modifications sites phosphorylés:
Phosphotyrosine (pY)
1
Phosphoserine (pS)
Phosphothréonine (pT)
Double Phospho (pT/pS)
1
2
1 2 3 4
WB sur lysat de cellules NIH
3T3 utilisant un RabMAb
anti-c-Jun (pS63) (ab32385).
Colonne 1 et 3: non traité,
Colonne 2 et 4: traité avec
UV ou Anisomycine
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1
2
2
WB sur lysat cellulaire
Jurkat utilisant RabMAb antieIF4EBP1 (pT37) (ab75767).
Colonne 1: non traité, Colonne 2: traité à l’insuline
WB sur lysat de cellules 293T
utilisant un RabMAb anti-S6K
(pT421/pS424) (ab32525).
Colonne 1: non traité, colonne 2: traité avec EGF
7
3. Excellents produits pour l’immunohistochimie (IHC)
La haute spécificité et sensibilité des RabMAbs font de ces produits de parfaits outils
biologiques pour l’immunomarquage, en particulier pour I’IHC sur tissus fixés au formol et
inclus dans la paraffine. Les RabMAbs permettent également de travailler à des dilutions plus
élevées (5 à 10 fois environ) et peuvent être utilisés dans différentes méthodes de fixation de
tissus avec un minimum de prétraitements. De plus, il est possible d’utiliser en parallèle un
anticorps monoclonal de souris avec un anticorps RabMAb pour effectuer un double marquage
sur une même coupe de tissu.
RabMAb HER2 / ErbB2
Anticorps Polyclonal
de lapin
20 ng / mL
3 ng / mL
Anticorps Monoclonal
de souris
30 ng / mL
Comparaison du RabMAb anti-Her2/ErbB2 avec un anticorps polyclonal de lapin et un anticorps monoclonal de souris sur coupe
en paraffine d’un carcinome de sein.
Double marquage utilisant les RabMAbs:
CK8 et Ki-67
IHC sur tissus humain cancéreux de
vessie utilisant un RabMAb anti-CK8
(ab53280) avec Fast Red et un monoclonal de souris anti-Ki-67 avec du DAB
8
Her2/ErbB2 et ER Alfa
AIF et Ki-67
IHC sur coupe d’un carcinome humain
du col de l’utérus utilisant un RabMAb
anti-AIF (ab32516) avec Fast Red et un
monoclonal de souris anti- Ki-67 avec
du DAB.
Avantages des RabMAbs
4. Haute affinité
L’affinité d’un anticorps est caractérisée par la constante de dissociation à l’équilibre KD
déterminée par le rapport des constantes de vitesse cinétique (koff/kon) ou le rapport des
concentrations des constituants à l’équilibre. Un faible KD se traduit par une plus grande affinité
de l’anticorps pour son ligand et une meilleure sensibilité de détection. Alors que la plupart
des anticorps monoclonaux thérapeutiques ont un KD à l’échelle du nanomolaire (10-9 M), les
RabMAbs ont des KD pouvant souvent atteindre le picomolaire (10-12 M) démontrant de façon
consistante leur plus grande affinité. Les étapes de sélection peuvent ainsi être évitées. (2)
Comparaison des valeurs KD des RabMAbs avec les anticorps thérapeutiques couramment
utilisés:
Anticorps monoclonaux
thérapeutiques
KD (M)
ER
1.28 x 10-12
Herceptine
5.0 x 10-9
ID1
2.82 x 10-12
Rituxan
8.0 x 10-9
C29
9.57 x 10
Synagis
1.0 x 10-9
Remicade
2.0 x 10-10
Avastine
5.0 x 10-10
-11
TNF-α
1.25 x 10-11
IL-1-β
1.99 x 10
-10
Echelle d’affinité
Comparaison de l’affinité par les valeurs KD des RabMAbs et anticorps monoclonaux de souris traditionnels.
Mesures de KD effectuées sur 850 RabMAbs.
1. Applications And Engineering Of Monoclonal Antibodies. David J. King, 2007.
2. Anti-peptide antibody screening: Selection of high affinity monoclonal reagents by a refined surface plasmon resonance technique. Pope ME,
[J Immunol Methods. 2009 Feb 28;341(1-2):86-96. doi: 10.1016/j.jim.2008.11.004. Epub 2008 Nov 28]
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9
5. Haute Spécificité
Identité
% Réactivité
Progestérone
100
17-aHydroxyprogestérone
0.901
Cortisol
0.035
Desoxycorticostérone
1.59
20a Dihydroprogestérone
0.016
20b Dihydroprogestérone
0.02
Pregnenolone
0.764
Pregnenolone-3-SO4
0.426
La haute spécificité des RabMAbs permet de générer des anticorps d’une grande qualité,
reconnaissant des changements épitopiques subtiles induits par le clivage protéique ou
des épitopes très similaires.
Comparaison de plusieurs RabMAbs anti-PARP-1
Site de clivage
PARP-1 entière
Chaque RabMAb anti-PARP-1 reconnait spécifiquement différents sites de clivage sans réaction croisée avec les sites
de clivages non spécifiques.
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Avantages des RabMAbs
6. Reconnaissance d’épitopes nouveaux
et variés
Le système immunitaire du lapin est différent de celui de la souris. Ces différences sont largement attribuées à la faible immunodominance du lapin et un large répertoire de cellules B.
Lors du développement des anticorps, la reconnaissance épitopique sera élevée chez le lapin.
L’étude ci-dessous compare, par Western Blot, les réponses immunitaires entre le lapin et la
souris. Notre expérience dans le développement d’anticorps monoclonaux suggère que le
système immunitaire de lapin peut développer une plus grande diversité d’anticorps contre
gamme plus large d’épitopes.
Comparaison de la réponse immunitaire: RabMAb & Monoclonal de Souris
5 souris et 3 lapins
SOURIS
1 2 3
LAPIN
1 2 3
Le lapin reconnait plus d’épitopes
1. Marqueur de poids moléculaire
2. Fibronectine
3. Fibronectine traitée par une protéase
Immunisation par la fibronectine humaine
Sérum polyclonal
Analyse Western Blot
Comparaison en Western Blot des réponses immunitaires de lapin et de souris montrant ainsi que le sérum de lapin reconnait
plus d’épitopes que celui de souris.
La majorité des protéines humaines sont très conservées entre la souris et l’humain. Par
conséquent, ces protéines ont tendance à être moins immunogènes lorsque que la souris est
utilisée en tant qu’animal hôte.
En utilisant le lapin comme animal hôte, avec son mécanisme unique de diversification immunitaire et de maturation de l’affinité, les RabMAbs peuvent être produits pour une large gamme
d’épitopes permettant la découverte de nouvelles cibles antigéniques.
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7. Nombreuses applications validées
Nos anticorps RabMAbs sont tous validés dans plusieurs applications (Western Blot, IHC, ICC/
IF et FACS) ainsi qu’avec des échantillons provenant de différentes espèces (humain, souris et
rat). En IHC, les RabMAbs ont été testés sur coupes en paraffine (FFPE) de tissus humains
afin de valider leur sensibilité et leur spécificité de localisation.
Résultats de validation du RabMAb Caspase-3 (Pro)
Résultats de validation du RabMAb Caspase-3 (Pro) A) WB sur lysat de cellules HeLa, B) IHC sur coupe en
paraffine de carcinome de col de l’utérus, C) FACS sur cellules Jurkat et D) ICC sur cellules HeLa
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Avantages des RabMAbs
8. Compatibilité avec les échantillons de souris
Les RabMAbs sont des outils idéaux pour nos clients travaillant sur des échantillons de souris.
L’utilisation d’anticorps monoclonaux de souris sur des tissus de souris peut être problématique et implique un protocole complexe. Les RabMAbs permettent d’éviter les problèmes de
réactions croisées et le bruit de fond qui sont généralement observés lors de l’utilisation d’un
anticorps secondaire de souris.
La technologie RabMAb, utilisant le lapin comme hôte, va produire avec plus de succès des
anticorps monoclonaux contre des antigènes de souris. Avec les RabMAbs, il est ainsi possible
d’utiliser un anticorps monoclonal avec des échantillons de souris en évitant les problèmes de
signaux non-spécifiques liés aux réactions croisées avec les immunoglobulines natives de souris.
Pour chaque RabMAb, les réactions croisées entre les espèces ont été testées en Western
Blot sur des échantillons de souris et d’humain.
RabMAbs validés en IHC sur tissus de souris
EGFR (pY1092)
Cytokeratine 8
IHC sur coupe en paraffine d’intestin de
souris utilisant un RabMAb anti-EGFR
(pY1068) (ab40815)
GFAP
IHC sur coupe en paraffine de cerveaux
de souris utilisant un RabMAb anti-GFAP
(ab68428)
MCM2
IHC sur coupe en paraffine d’intestin de
souris utilisant un RabMAb anti-MCM2
(ab108935)
CD3 γ
IHC sur coupe en paraffine de rate de
souris utilisant un RabMAb anti-CD3
gamma (ab134096)
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p120 Caténine
IHC sur coupe en paraffine du gros
intestin de souris utilisant un RabMAb
anti-Caténine (p120) (ab92514)
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Exemples de RabMAbs
Anticorps anti-AIF [E20] (ab32516)
WB sur cellules K562
Réactivité:
Humain,
Souris, Rat
Applications:
WB, IHC-F,
IHC-P, ICC/IF,
IP, Cytométrie
en Flux
IF sur des cellules HeLa
Anticorps anti-ATM (pS1981) [EP1890Y] (ab81292)
WB sur lysat de cellules HEK293.
Colonne 1: non traité, colonne 2: traité
au doxorubicine
Réactivité:
Humain
Applications:
WB, IHC-P,
ICC/IF, IP
IHC sur coupe en paraffine d’un carcinome humain d’endomètre
Anticorps anti-Caténine beta [E247] (ab32572)
WB sur lysat entier de cellules U2OS
14
Réactivité:
Humain,
Souris, Rat,
Hamster,
Macaque
Applications:
WB, IHC-F,
IHC-P,
ICC/IF, IP
IHC sur coupe en paraffine d’un carcinome humain du col de l’utérus
Avantages des RabMAbs
Anticorps anti-c-Myc [Y69] (ab32072)
IF sur cellules HeLa
Réactivité:
Humain,
Souris, Rat
Applications:
WB, IHC-P,
ICC/IF, IP
Réactivité:
Humain,
Souris
Applications:
WB, IHC-F,
IHC-P, ICC/IF
Réactivité:
Humain,
Souris, Rat
Applications:
WB, IHC-F,
IHC-P, ICC/IF,
IP, Cytométrie
en Flux
IHC sur coupe en paraffine d’un adénocarcinome de côlon humain
Anticorps anti-EGFR (pY1092) [EP774Y] (ab40815)
WB sur lysat de cellules A431. Colonne
1: EGF non traité, Colonne 2: EGF traité
IHC sur coupe en paraffine d’un
carcinome humain du col de l’utérus
Anticorps anti-Tubuline Alpha [EP1332Y] (ab52866)
WB sur lysat de cellules HeLa à 10 μg
IF sur cellules embryoniques
humaines de rein
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