15/01/17 DFGSP3 – 2016/2017 Les entérobactéries ou famille des Enterobacteriaceae Pr Hélène MARCHANDIN Habitat, mode de vie Commensales / mutualistes de l’homme +/- des animaux Tube digestif +++ nom Rôle utile : effet de barrière Bactéries isolées dans l’environnement plantes, sol, eau Pathogènes : • opportunistes mutualistes • spécifiques (jamais mutualistes) : ex : agents de la peste, de la typhoïde, … 2 1 15/01/17 Pouvoir pathogène Infections intestinales Infections urinaires Infections nosocomiales Infections respiratoires, de plaies, ... Infections chroniques Bioterrorisme Résistance aux antibiotiques multirésistance 3 Caractères définissant les entérobactéries Bacilles à Gram négatif, non sporulés Mobiles (flagelles péritriches), + rarement immobiles Aérobies-anaérobies facultatifs Culture sur milieu ordinaire 4 2 15/01/17 Dépourvus d’oxydase (-) Possèdent une catalase (+) Nitrate réductase + : nitrates nitrites Fermentent le glucose (avec ou sans production de gaz) 5 Les principaux représentants Genres Escherichia Salmonella Shigella Yersinia K Klebsiella E Enterobacter S Serratia Proteus Espèces principales E. coli S. enterica S. dysenteriae Y. pestis, Y. enterocolitica K. pneumoniae E. aerogenes, E. cloacae S. marcescens P. mirabilis > 80% des infections humaines Autres genres: Citrobacter, Morganella, Providencia, … (au total > 40 genres et 200 espèces) 6 3 15/01/17 Caractères différenciant les espèces • Fermentation des sucres Acidification du milieu et virage de l’indicateur coloré de pH • Production de métabolites particuliers Indole (IND), H2S, acétoïne (VP), ... • Contenu enzymatique β-galactosidase (ONPG), décarboxylases (LDC,ODC), gélatinase (GEL), … Identification par détermination du profil métabolique Ex : API 20E 7 ou détermination du profil protéique Identification des bactéries par analyse de leurs protéines totales Spectrométrie de masse Technique MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of flight IDENTIFICATION D’ESPECE 8 4 15/01/17 Définition de sérotypes au sein d’une espèce Basée sur structure antigénique des entérobactéries • Ag les + utilisés : O : Ag de paroi toujours présents (LPS) H : Ag flagellaires Ag O LPS 9 K : Ag de capsule • Nombreux variants sur chaque Ag • Chaque variant Ag est reconnu par un antisérum spécifique IDENTIFICATION DE SÉROTYPE ou SÉROVAR Ex : E. coli sérotype 0157:H7 10 5 15/01/17 Le chef de file des entérobactéries 11 I- Généralités Habitat TD (Homme et Animaux) 106 à 108/g de selles Pathogène potentiel – Acquisition de facteurs de virulence (localisation : plasmides, ilôts de pathogénicité, …) – Agent d’infections opportunistes sur terrain affaibli Témoin de la contamination fécale de l’environnement « Rat de laboratoire » en microbiologie, génétique et biologie moléculaire (Génie génétique, Biotechnologie) 12 6 15/01/17 II- Pouvoir pathogène et facteurs de virulence Infections intestinales Infections extraintestinales • Tractus urinaire • Méningites néonatales • Bactériémies • Autres Syndromes diarrhéiques 13 A- Les infections intestinales Mutualiste Facteurs de virulence codés par plasmides Pathogène Selon les facteurs de virulence présents, on définit plusieurs PATHOVARS (variétés pathogènes) 14 7 15/01/17 1- Le pathovar ECEP = E. coli entéro-pathogène : 12 sérotypes O 2 principaux facteurs de virulence : • Facteur d’adhésion = pili BFP formation de piédestaux • Facteur d’attachement-effacement (microvillosités bordure en brosse) Diarrhées aqueuses sans invasion de la muqueuse Enfants, PVD +++ 15 2- Le pathovar ECET = E. coli entéro-toxinogène : nombreux sérotypes • Facteur d’adhésion = CFA (Colonization Factor Ag) Après adhésion • Production de toxine(s) cytotonique(s) = entérotoxine ST et/ou LT Diarrhées aqueuses sans invasion de la muqueuse Enfants, PVD, « Turista » 16 8 15/01/17 3- Le pathovar ECEH = E. coli entéro-hémorragique (O157:H7, autres sérotypes) • Facteur d’attachement-effacement Après adhésion • Production de vérotoxines = Shiga-like toxines (SLT ou Stx 1 et/ou 2) Shiga-toxines Très proches de la toxine de Shigella dysenteriae Diarrhées sanglantes sans invasion de la muqueuse Complication : syndrome hémolytique et urémique (SHU) Pays industrialisés, cas épidémiques ou sporadiques, viande de bœuf, ... 17 4- Le pathovar ECEI = E. coli entéro-invasif • Facteurs d’invasion de la muqueuse Diarrhées sanglantes avec invasion de la muqueuse Syndrome dysentérique PVD, proche de la Shigellose 18 9 15/01/17 5- Le pathovar ECEAg = E. coli entéro-agrégatif • Facteur d’adhésion : AAF (Aggregative adherence fimbriae) fagots de fimbriae / surface des entérocytes EAST-1 • Production entérotoxine thermostable EAST-1 Diarrhée aqueuse aiguë ou persistante (sans invasion muqueuse) PVD PD (ID) 19 Allongement des microvillosités 6- Le pathovar ECAD = E. coli à adhésion diffuse propriété d’adhésion aux cellules épithéliales Individualisé en 1991 • Facteurs d’adhésion diffuse : Plusieurs adhésines Diarrhée chez les enfants 20 10 15/01/17 7- Le pathovar ECEAH Combinaison unique de caractéristiques des ECEAg et ECEH Emergence d’un nouveau pathotype / entéropathovar Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC ou ECEAH) ≈ 4000 cas 2011 ≈ 900 SHU ≈ 50 décès Une des plus grandes épidémies (sérotype O104:H4) 21 Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC) Une bactérie « chimère » ... =ECEAg Brzuszkiewicz E. et al., Arch Microbiol. 2011.193:883-91 =ECEH 22 11 15/01/17 II- Pouvoir pathogène et facteurs de virulence (suite) Infections intestinales Infections extraintestinales Syndromes diarrhéiques • Tractus urinaires • Méningites néonatales • Bactériémies • Autres 23 B- Les infections du tractus urinaire (ITU) E. coli = principale cause d’ITU 90% des ITU en ville, 50% des ITU nosocomiales Les souches en cause sont dites uropathogènes 24 12 15/01/17 Acquisition de facteurs d’adhésion Glycolipides du tissu rénal • Fimbriae ou pili de type P ou Pap (pyelonephritis associated pili) 90% des infections urinaires graves Codés par opéron pap • Adhésines S, M, ... • Pili de type 1 25 Production de substances cytotoxiques ex : hémolysine Production de substances captant le fer (ou sidérophores) ex : aérobactine 26 13 15/01/17 C- Les méningites du nouveau-né E. coli sérotype K1 (80%) • Facteur de virulence : capsule polysaccharidique de type K1 Activité antiphagocytaire Facilite le passage de la barrière hémato-méningée (phase bactériémique) • Autres facteurs de pathogénicité : Protéases, hémolysines, toxines, sidérophores de type aérobactine 27 D- Les infections nosocomiales à E. coli Souches sans facteur de virulence particulier Terrain affaibli Souches résistantes aux ATB (β-lactamases +++) Toutes les localisations possibles mais surtout : - ITU - Surinfection de plaies chirurgicales - Infections intra-abdominales - Pneumopathies - Bactériémies 28 14 15/01/17 E- Les bactériémies Présence de bactéries viables dans le sang circulant Passage et multiplication dans le sang A partir d’un site infectieux primaire Surtout infections nosocomiales Mais aussi après ITU (pyélonéphrite) Choc septique ou endotoxinique ( Endotoxine : lipide A du LPS) 29 III- Identification d’E. coli Colonies Lactose + Gram - (jaunes sur milieu sélectif de Drigalski, roses sur MacConkey) ou spectrométrie de masse Oxydase β-galactosidase + URE TDA + - + + - + - + VP Indole 30 15 15/01/17 Orientation : Culture sur milieu spécifique MacConkey Sorbitol E. coli O157:H7 : fermentation du sorbitol Recherche de sérotypes associés à des pathovars par technique immunologique : ECEP (12 sérotypes) ECEH O157:H7 E. coli K1 Particules de latex sensibilisées 31 Recherche par amplification (PCR) des gènes codant les facteurs de virulence - 7 entéropathovars : Ex : ECEP : gènes bfp, eae ECEH : eae, stx1, stx2 - E. coli uropathogènes : opéron pap Recherche effet des toxines ou phénotype d’adhésion sur cultures cellulaires (laboratoires spécialisés) 32 16 15/01/17 Sensibilité naturelle à tous les antibiotiques / bacilles à Gram négatif MAIS nombreux mécanismes de R acquise (β-lactamases +++) Antibiogramme OBLIGATOIRE Approche du mécanisme de R aux différentes familles d’ATB Ex : antibiogramme / méthodes des disques (diffusion) Traitement adapté / localisation et ATBgramme 33 En cas d’infections nosocomiales et/ou épidémies Méthodes génotypiques : Ex : Electrophorèse en champ pulsé Ex : E. coli O104:H4 ECEAH 34 17 15/01/17 Des entérobactéries pathogènes opportunistes agents d’infections nosocomiales 35 Font partie du microbiote normal du TD Souvent impliquées dans des infections nosocomiales - Patients hospitalisés = terrain affaibli - R acquise aux ATB Parfois impliquées dans des infections communautaires 36 18 15/01/17 P. mirabilis P. vulgaris… I- Le genre Proteus Milieu de Drigalski Lactose Tryptophane désaminase TDA+ Très mobiles ONPG- - Uréase+ - Gélatinase + ou spectrométrie de masse 37 2/3 des infections à P. mirabilis sont nosocomiales ITU +++ (sondes) 5% des ITU communautaires 2ème agent causal après E. coli Forte uréase Alcalinisation des urines Formation de cristaux et de calculs LITHIASE 38 19 15/01/17 Autres infections nosocomiales à Proteus Bactériémies Surinfections de plaies chirurgicales Sensibilité naturelle aux ATB R aquise en : souches R β-lactamines et multiR 39 II- Le groupe KES Klebsiella / Enterobacter /Serratia Klebsiella pneumoniae Serratia marcescens (réaction de Voges-Proskauer) = production d’acétoïne ou spectrométrie de masse 40 20 15/01/17 Infections nosocomiales +++ ITU Pneumopathies Bactériémies Infections communautaires Pneumopathies à K. pneumoniae R importante aux ATB naturelle et acquise 41 Des entérobactéries pathogènes spécifiques 42 21 15/01/17 I- Le genre Salmonella 2 espèces décrites. 1 habituelle = Salmonella enterica 6 sous-espèces Sous-espèce enterica (Homme et animaux à sang chaud) >1500 sérotypes (ser.) Nomenclature: Officielle = S. enterica subsp.enterica ser. Typhi S. enterica subsp.enterica ser. Enteritidis ... Diminutifs d’usage = Salmonella ser. Typhi Salmonella ser. Enteritidis … 43 A- Habitat Certains sérotypes présents dans le TD de nombreux animaux Pas dans le microbiote normal humain Présence chez l’homme = Pathologique 44 22 15/01/17 B- Pouvoir pathogène Salmonella enterica subsp. enterica Sérotypes strictement humains Sérotypes strictement animaux Salmonella ser. Typhi Salmonella ser. Paratyphi A, B, C Sérotypes ubiquistes Fièvre typhoïde Fièvres paratyphoïdes Salmonella ser. Typhimurium Salmonella ser. Enteritidis Gastroentérites Porte d’entrée : tube digestif 45 1- Les gastroentérites Animaux (réservoir) Alimentation Œuf, poisson, lait, poulet Charcuterie…(PI & PVD) Dose infectante ≈ 105 bactéries Homme : Gastroentérites (ou portage) Péril fécal PVD+++ 46 23 15/01/17 Facteurs de pathogénicité • Adhésion : fimbriae • Invasion de la muqueuse ++ : Gènes nécessaires sur ilôt de pathogénicité Système de sécrétion de type III (« seringue moléculaire ») Transfert de protéines de virulence cellule eucaryote Invasion bactérienne favorisée • Entérotoxine 47 « Ruffles » (pseudopodes, actine polymérisée) Cellules épithéliales Persistance et x dans le phagosome Arrêt au niveau macrophages de la sous-muqueuse Bactériémie transitoire éventuelle 48 24 15/01/17 Ruffles 49 2- La fièvre typhoïde et les fièvres paratyphoïdes (= fièvres bactériémiques) Sérotypes de Salmonella strictement humains Homme (malade, porteur sain) Homme 100-250 cas/an en France (importés +++) MDO Péril fécal PVD+++ Eau, aliments, coquillages, … PVD > 20 millions cas/an > 200 000 décès 50 25 15/01/17 51 Invasion et traversée de la muqueuse via les cellules M Circulation sanguine : bactériémie Libération d’endotoxine Salmonella ser.Typhi, Paratyphi A, B et C (Yersinia enterocolitica) + SRE : foie, rate, ... Phagocytose par les macrophages Survie et x dans les macrophages 52 26 15/01/17 Clinique • Incubation : 1-2 semaines • Fièvre continue élevée (40°C) avec : céphalées, insomnie, anorexie, asthénie, tuphos, douleurs abdominales avec diarrhée ou constipation +/- hépatosplénomégalie +/- taches rosées lenticulaires (flanc, thorax) • +/- Complications digestives (hémorragies, perforations), myocardiques ou neurologiques mortalité 10% sans traitement • Possibilité de portage chronique (1 an ou +) (1-5%) Vésicule biliaire réinfection continue de l’intestin 53 C- Diagnostic bactériologique Hémocultures (fièvres bactériémiques ++) + Coproculture (tous les cas) salmonelles/shigelles bactéries à Gram négatif - Ex : Hektoen Lactose -, H2S + 54 27 15/01/17 - + + + - - - - β-galactosidase -, Uréase -, Indole-, TDA-, acétoïne - H2S + (ser. Typhi : traces) LDC + (sauf ser. Paratyphi A) Citrate de Simmons + (sauf ser. Typhi et Paratyphi A) ou spectrométrie de masse (identification d’espèce) 55 • Ag K : Ag Vi (+ pour ser. Typhi, Dublin et Paratyphi C) • Ag O de paroi : 1 ou plusieurs Sérotypage • Ag H flagellaire : 1 ou 2 Combinaison des résultats identification Salmonella ser. Enteritidis Ag Vi Ag O Ag H - 1, 9, 12 g, m Salmonella ser. Typhi Vi 9, 12 d Ag polyosidique capsulaire Vi Vaccination contre la fièvre typhoïde 56 28 15/01/17 Vaccins contre fièvre typhoïde : Typherix®, Typhim Vi® (> 2 ans) Vaccin combiné (fièvre typhoïde et hépatite A) : Tyavax® (>16 ans) Calendrier vaccinal 2016 57 Recommandations sanitaires pour les voyageurs, 2016 + militaires +++ (+ lutte contre le péril fécal) 58 29 15/01/17 Sérodiagnostic de Widal et Félix Recherche des Anticorps dirigés contre : les AgO les AgH Positif à partir de la 2ème semaine : Apparition AC anti-AgO disparition en 2-3 mois puis AC anti-AgH persistance pendant des années Perturbé par traitement ATB Réactions croisées Peu contributif (utilité porteurs) 59 II- Le genre Shigella 4 espèces: S. dysenteriae S. flexneri S. sonnei S. boydii 80% souches France 32 sérotypes Strictement humaines Pas dans le microbiote normal humain Présence chez l’homme = Pathologique 60 30 15/01/17 Transmission inter-humaine Homme (malade, porteur) Péril fécal PVD+++ Homme Eau, aliments contaminés, coquillages, ... + Mains sales Dose infectante très faible : 10-100 bactéries 61 Facteurs de pathogénicité • Facteurs d’invasion de la muqueuse : - gènes d’invasion situés sur ilôt de pathogénicité porté par un plasmide de virulence : Inv. (proche ECEI) - système de sécrétion de type III (« seringue moléculaire ») 62 31 15/01/17 Adhésion Fimbriae Cellule épithéliale Invasion latérale (polymérisation de l’actine ) Cellule M Invasion par le pôle basal (Ruffles) Traversée de la muqueuse Macrophage x et apoptose Phagocytose 63 Invasion par polymérisation de l’actine cellulaire « Comète » d’actine polymérisée Propulsion des bactéries 64 32 15/01/17 • Toxine dysentérique : Shiga-toxine S. dysenteriae sérotype 1 : Taux élevé dysentérie bacillaire (MDO) Autres shigelles Syndromes dysentériformes Diarrhées muco-sanglantes avec invasion et destruction de la muqueuse 65 Diagnostic Identification Selles Milieu d’isolement sélectif SS ou BGN Pas de milieu d’enrichissement Caractères des entérobactéries sauf : Immobiles (pas d’Ag H) Pas de gaz glucose Colonies Lactose -, H2S - (Drigalski) Galerie API 20E 66 33 15/01/17 β-galactosidase (ONPG) -, Uréase -, TDA-, indole -, acétoïne – H2S-, LDC-, CIT - ou spectrométrie de masse Identification des sérotypes Ag O uniquement 67 Autres (peu utilisés en bactériologie médicale) : - Recherche par PCR des gènes codant les facteurs de virulence portés par le plasmide Inv. - Recherche de la toxine dysentérique par : amplification génique (PCR) ELISA Sérodiagnostic : peu de valeur + Réalisation d’un antibiogramme 68 34