La NADPH oxydase
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La NADPH oxydase Présentation générale et exemple d’étude Biochimie des flavoprotéines Laura Baciou, Tania Bizouarn Florence Lederer Leila Lamanuzzi (Post Doc) Biochimie sous rayonnement ionisant C. Houée Levin Magali Gelinotte (Post Doc) Photobiologie Marie Erard Fabienne Merola Luis Alvarez (Doctorant) Le Stress oxydant Production de «Réactiv Oxygen Species» 1O , 2 OH•, O2•-, H2O2 ou R.O.S. Stress Oxydant Capacités de défense anti-oxydante Enzymes de protection Enzymes de réparation Capteurs (vitamines,…) Désordres cellulaires graves (cibles: protéines, lipides, ADN, …) - Cancer, Maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, Inflammation - Défense contre les agents infectieux / Granulomatose septique chronique La phagocytose Cellule: modèle de neutrophiles (cellules du système immunitaire) Objet phagocyté: levures marquées avec une sonde fluorescente sensible aux ROS pipette La phagocytose Membrane de la cellule 2) Englobement 1) Reconnaissance La phagocytose Membrane de la cellule 3) Les granules contenant les protéines nécessaires à la production des radicaux fusionnent avec le phagosome. La phagocytose Membrane de la cellule ROS 4) Destruction - ROS (OH•, O2•-, H2O2, , ClO–) - acidification, - enzyme de dégradation - … La phagocytose Membrane de la cellule ROS ROS 5) Diffusion des ROS hors du phagosome Destruction des neutrophiles eux-mêmes (kamikaze!) La NADPH oxydase est à l’origine de la production des ROS : production de O2•►O •- conduit à OH•, H O , ClO 2 2 2 La NADPH oxydase : les composants Membrane de la cellule p22 gp91 hèmes FAD Membrane Cytoplasme p67 p40 p47 GDI Rac GDP La NADPH oxydase : les composants p22 gp91 Membrane de la cellule hèmes FAD Membrane Cytoplasme p67 p40 GDI Rac GDP p47 O2 NADPH O2●- O2 O2●- Activation p22 gp91 NADP+ + H+ hèmes Rac FAD GTP p47 p67 NADPH NADP+ + H+ La NADPH oxydase : le bilan de la réaction Réduction à 1électron Le substrat: NADPH + 2 O2 → 2 O2 •- + NADP+ + H+ oxydation O2 O2●- p22 gp91 hèmes Rac FAD GTP p47 p67 NADPH NADP+ + H+ P P NADPH NADP+ nicotinamide adénine dinucléotide phosphate La NADPH oxydase : le bilan de la réaction Réduction à 1électron La chaîne de transfert d’électrons: NADPH + 2 O2 → 2 O2 •- + NADP+ + H+ oxydation O2 E O2●- O2 O2 •- (Fe 3+) (Fe 2+) FAD FADH2 NADP+ NADPH p22 gp91 hèmes Rac FAD GTP p47 p67 NADPH NADP+ + H+ Tania Bizouarn : Site de fixation de NADPH Flavoprotéine! La NADPH oxydase : les outils AU REPOS: p22 gp91 hèmes FAD p67 In vitro En cellule Membrane de neutrophiles de bœuf Granules ou membrane cellulaire Recombinantes humaines ou bovines Dans le cytoplasme des cellules p40 p47 GDI Rac GDP La NADPH oxydase : in vitro O2 p22 gp91 p22 gp91 hèmes Rac FAD GTP p47 p67 + Amphiphile p67 p47 Rac GTP O2●- Mime une partie des modifications dues à la signalisation NADPH NADP+ + H+ La NADPH oxydase : en cellule O2 p22 gp91 p22 gp91 1) Signalisation membranaire via les phospholipides hèmes Rac FAD GTP P p47 p67 P NADPH 2) Phosphorylation de p47 p67 p40 p40 p47 GDI Rac GDP O2●- 3) Echange GDP –GTP / activation de Rac NADP+ + H+ GDI La NADPH oxydase : en cellule Outils: Videomicroscopie Imagerie de durée de vie de fluorescence pour l’analyse du FRET. Sonde fluo pour ROS ROS p22 gp91 Coll Pr. Oliver Nüsse (U757 INSERM, Orsay) hèmes FAD p47 p67 Rac GTP CFP Citrine FRET ? - Observation de la production des ROS dans le phagosome - Localisation de l’assemblage et étude cinétique - Mesure de constantes d’association entre sous unités cytosoliques La NADPH oxydase : in vitro Outils: biologie moléculaire, biochimie, spectro UV-Vis et fluorescence stationnaire, stopped flow, radiolyse p22 gp91 p47 Rac GTP O2●- p22 gp91 + Amphiphile p67 O2 NADPH hèmes Rac FAD GTP p47 p67 NADP+ + H+ Objectifs: - Etablir les constantes d’association entre les sous unités - Cinétique et séquence d’association et de dissociation des sous unités Acquisition du Stopped Flow La NADPH oxydase : in vitro O2 O2●- p22 gp91 hèmes Rac FAD GTP p47 p67 NADPH NADP+ + H+ - Quel est l’effet des radicaux libres sur le fonctionnement de l’enzyme lui même? Post Doc EDF La NADPH oxydase : in vitro p22 gp91 hèmes FAD - Exprimer et purifier les sous unités membranaires recombinantes pour les études fonctionnelles et structurales in vitro. Post Doc ANR Jeunes Chercheurs
