Empreinte de l`ADN pour l`identification des variétés

Le coton organique est cultivé au Nicaragua depuis 4 ans sur la
base expérimentale. Le coût comparatif de quatre opérations
importantes de coton organique versus la production convention-
nelle est donné dans le tableau ci-dessus.
Au Nicaragua, le coton est généralement pulvérisé en moyenne
13 fois, d’où une réduction significative dans l’utilisation d’in-
secticides ces 5 dernières années. Dans le cadre de la production
organique, les opérations de lutte contre les insectes consistaient
notamment à appliquer un extrait d’une plante locale ayant un
effet insecticide outre les produits chimiques autorisés par une
organisation de certication. Les coûts des visites fréquentes pour
conseiller les planteurs, comparé aux conseils quasi-gratuits du
secteur public, font partie de l’assistance technique. Il semble que
la production organique soit moins chère au Nicaragua mais son
économie dépend du niveau de rendement et du surprix reçu. Vu
que les insecticides chimiques sont les méthodes de lutte les plus
efficaces contre les insectes, une pression d’insectes élevée pour-
rait grandement affecter le rendement.
Dans le cadre de la culture classique, la plupart des données sur
la production de coton organique appartiennent aux propriétaires
et sont difficiles à obtenir.
Effet sur la qualité
La littérature montre que, si de l’azote n’est pas appliqué au coton
lorsque c’est nécessaire, le micronaire est renforcé et la longueur
de la soie est diminuée. L’élimination d’insecticides dans le
système de production augmentera l’apparition de taches jaunes.
Aux Etats-Unis, un grand nombre de laboratoires de technologie
de la fibre, dont l’International Textile Center à Lubbock et
l’Institute of Textile Technology à Charlottesville, ont testé le
coton organique. Mais aucune donnée n’est disponible pour
déterminer l’effet qu’entraîne la suppression des insecticides et
des engrais. Des communications personnelles avec certains
laboratoires ont indiqué que le grade du coton est généralement
plus faible dans le cadre de la production organique. Swezey et
Goldman (1996) ont également étudié l’effet des conditions de
culture organique sur la qualité de la fibre et ils n’ont trouvé
aucune différence au niveau de la longueur de la résistance de la
fibre et du micronaire. Toutefois, le coton organique avait un
pourcentage plus élevé de coton taché.
Surprix pour le coton organique
Normalement, les planteurs de coton organique s’attendent à un
prix plus élevé pour leur coton organique pour compenser les
pertes de rendement et les coûts supplémentaires de la production.
Les informations disponibles montrent que ces majorations vont
de zéro à 100 %. Klonsky et al (1996) ont analysé la performance
économique du coton organique dans la vallée au Nord de San
Joaquin et ont conclu que la production organique devait obtenir
un prix plus élevé pour rester viable du point de vue économique.
Les références se trouvent à la page cinq.
Empreinte de l’ADN pour l’identification de variétés
La sélection au sein de la population existante est une méthode
reconnue pour le développement des variétés. Les mutations
spontanées, les croisements ou une combinaison pourraient abou-
tir à des variations au sein d’une variété génétique pure. Le
problème principal concerne toujours l’identification de telles
variétés en fonction des différences morphologiques. Même si la
variété a été développée par le biais de l’hybridation entre culti-
vars avec une base génétique étroite, l’identification devient
difficile à moins que le nouveau génotype ait un gène marqueur.
Mais, premièrement, les gènes marqueurs avec des différences
morphologiques proéminentes ne sont pas facilement disponibles
et, deuxièmement, ils risquent d’entraîner des caractères peu
souhaitables. Il n’est pas recommandé, suite au temps nécessaire
que cela demanderait, de faire des travaux de sélection pour
l’induction d’un caractère morphologique proéminent ou pour
éviter le caractère indésirable du gène marqueur. Toutefois, aux
fins de maintenir la pureté d’une nouvelle variété dans le proces-
sus de production de semences, il faut trouver des différences
morphologiques proéminentes entre les variétés. Les traits mor-
phologiques sont indicatifs de la structure génétique de la plante
et, généralement, il n’est pas difficile pour les sélectionneurs
d’identifier leurs propres variétés même dans le cas de différences
mineures par rapport à d’autres variétés. Les systèmes de produc-
tion de semences dans le monde entier se fondent encore sur les
différences visuelles. Les types marginaux —s’écartant de la
norme de la variété— sont éliminés et le reste de la population
est supposé être pure.
Identification de la diversité
génétique
L’information génétique codée dans l’acide désoxyribonucléique
ou ADN —produit chimique complexe qui est le code de l’infor-
mation génétique de tous les organismes vivants comprend quatre
bases dont les abréviations sont les suivantes : A (adénine), C
(cytosine), G (guanine) et T (thiamine). La séquence de l’arrange-
ment de ces bases détermine le comportement interne et externe
d’un génotype. Il n’existe pas de manières faciles de déterminer
la pureté génétique au sein d’une population. La diversité
Coût de production au Nicaragua
Opération Production Production
conventionnelle organique
Engrais 60,70 9,2
Lutte contre les plantes adventices 31,18 73,3
Ravageur 340.95 28.9
Assistance technique 27.4
Total 432,83 138,8
18 ICAC RECORDER

génétique résultant de l’introgression intra ou interespèces peut
être évaluée avec des caractères morphologiques, des protéines
des graines, des iso-enzymes et des marqueurs (ADN). L’analyse
des iso-enzymes est limitée par le faible nombre des loci des
marqueurs, un manque général de polymorphisme dans ces loci
et des risques de variabilité dans le mode des bandes suite au
développement de la plante (Tanksley et al 1989). Un grand
nombre de marqueurs polymorphes sont nécessaires pour me-
surer la diversité génétique de façon fiable qui limite l’utilisation
de caractères morphologiques et des iso-enzymes qui seront
utilisés pour mesurer la diversité génétique. Le polymorphisme
de longueur restrictive de fragments (RFLP) peut être utilisé mais
cela prend beaucoup de temps et revient cher. Toutefois, les
empreintes de l’ADN représentent un mode fort utile pour iden-
tifier l’ampleur des analogies et des différences entre génotypes.
L’utilisation de l’ADN aléatoire, amplifié et polymorphe (RAPD)
présente un nombre illimité de marqueurs à diverses fins. La
technique RAPD est simple et suffisamment rapide pour mesurer
la relation entre les génotypes avec une bonne mesure de fiabilité.
La technique RAPD a su fournir la quantité de variation ou a su
confirmer la relation entre génotypes. En outre, Tatineni et al
(1996) ont comparé les différences génétiques obtenues des
marqueurs RAPD de seize variétés des Etats-Unis avec des
différentiations morphologiques visuelles des mêmes variétés et
ont conclu que l’analyse des marqueurs RAPD confirmait les
différences taxinomiques entre les variétés.
Quantification de la diversité
génétique
Peu de travaux ont été faits sur la quantification de la diversité
génétique entre espèces et variétés et au sein des variétés. Toute-
fois, certains des travaux les plus récents faits en Australie, au
Pakistan et aux Etats-Unis ont montré que les différences intere-
spèces du polymorphisme ne sont pas importantes. L’empreinte
génétique de G. hirsutum, G. barbadense et G. arboreum avec
des marqueurs RAPD a montré que les espèces G. barbadense et
G. arboreum étaient analogues à raison de 50 % au moins à G.
hirsutum. Multani et Lyon (1995) ont utilisé des marqueurs
RAPD générés par trente amorces aléatoires de dix polymères et
une coloration argentée pour marquer trente cotons upland et une
variété de G. barbadense. Trente variétés de G. hirsutum com-
prenaient onze génotypes australiens développés localement, la
variété Deltapine DP 90 et la variété S 295 de la France. Les
graines ont été stérilisées dans une solution avec 20% d’un agent
de blanchiment style eau de javel pendant vingt minutes et
cultivées artificiellement dans des conditions de laboratoire. Pour
l’extraction de l’ADN, les feuilles cotylédonaires de deux à cinq
cotonniers ont été mélangées pour arriver à une masse de 1,5
grammes. Trente amorces de dix polymères de quatre ensemble
différents ont été utilisées pour l’amplification de l’ADN. Les
échantillons d’ADN amplifiés ont été analysés par électrophorèse
et une amplification par une amorce donnée a été marquée comme
présente ou absente de tous les cultivars.
Selon Multani et Lyon, quatorze cultivars de coton et trente
amorces ont abouti à la formation de 453 fragments d’ADN
amplifiés ou marqueurs RAPD. 15 % du total des marqueurs
étaient spécifiques à la variété G. barbadense S-7 et ils étaient
absents dans toute autre variété faisant partie de l’essai. 33 % du
total des marqueurs étaient uniques aux variétés G. hirsutum. Pour
les types hirsutum, DP 90 était différent génétiquement à raison
de 60 % des variétés australiennes et pourtant était semblable à
80 % au CS 50. La variété française S 295 supposée avoir une
origine diverse (peut-être a-t-elle été développée dans un pays
africain) était analogue à raison d’environ 90 % au type australien
CS 50.
Toutes les variétés ne pouvaient pas être distinguées par un certain
nombre de marqueurs. Certains cultivars upland pouvaient être
distingués uniquement avec 10, 12, 15 et 19 marqueurs RAPD
alors que Pima S-7 variait par rapport aux types upland de 104
marqueurs (69 uniques et 35 marqueurs absents). Il a été possible
en fonction des marqueurs moléculaires de regrouper les variétés
en divers groupes par rapport à leurs analogies ou différences
génétiques. Multani et Lyon sont partis de l’hypothèse selon
laquelle il serait possible, sur la base des marqueurs polymorphes,
de comprendre les relations génétiques entre génotypes d’origine
inconnue.
Des travaux analogues ont été effectués au Pakistan sur 22
cultivars upland de l’Australie, du Pakistan et des Etats-Unis et
la variété pakistanaise cultivée commercialement G. arboreum.
Ravi Iqbal et al (1996) ont également utilisé la technique RAPD
de Williams et al (1990) pour estimer l’homologie génétique entre
des variétés de coton d’origine diverses. Cinquante amorces
appartenant à divers groupes d’Operon ont été utilisées pour
l’amplification PCR.
Iqbal et son groupe, en plus des différences génétiques entre
variétés, ont également étudié les différences entre cotonniers au
sein d’une même variété. A cette fin, deux variétés, S 12 et la
variété candidate Krishma ont été cultivées au-delà du stade du
jeune plant. Vingt cotonniers au sein de la variété S 12 ont montré
des profils d’amplification constants pour treize amorces mon-
trant ainsi un niveau très élevé d’analogie entre les cotonniers. Il
a été prouvé que la variété représente une authentique sélection
très homozygote dans sa structure génétique. Quinze cotonniers
de la variété Krishma ont été étudiés par rapport à neuf amorces
et le caractère polymorphe n’a été constaté que pour deux amor-
ces. Les études sur le polymorphisme de Krishma ont montré que
la variété n’est pas homozygote et que certains caractères sont
encore en train de subir une ségrégation. Selon Iqbal et al (1996),
les différences morphologiques entre cotonniers Krishma et leur
réponse différente à la frisolée dans le champ confirmaient égale-
ment l’hétérogénéité de la population.
Aucune amorce unique n’a été capable de déclencher des effets
polymorphes dans toutes les 23 variétés, de sorte à pouvoir les
différencier entre elles. Quarante des cinquante amorces ont
amplifié un total de 349 fragments d’ADN dans 22 variétés. Une
SEPTEMBRE 1996 19

des amorces n’était pas polymorphe pour aucune des 23 variétés.
Mais l’incapacité d’une seule amorce à produire des marqueurs
polymorphes dans toutes les variétés étudiées a indiqué une
relation génétique plus étroite entre les variétés.
A l’instar des travaux australiens, les différences intervariétés
pour un certain nombre de fragments amplifiés étaient très évi-
dentes et la dimension des fragments amplifiés avec des amorces
différentes variait également selon les variétés.
Iqbal et al (1996) ont également confirmé des différences intere-
spèces concernant les marqueurs polymorphes. Ils ont constaté
que la variété G. arboreum avait le moins d’analogie avec d’autres
variétés. Ravi a montré une analogie de 55 % avec la variété CIM
1100, supérieure à la proportion pour toutes les autres variétés.
Les cotons diploïdes seraient tolérants à la frisolée et les essais
sur le terrain ont prouvé que CIM 1100 (G. Hirsutum) a égale-
ment une tolérance élevée à cette maladie, une des raisons de
l’analogie entre ces deux variétés. Les données RAPD ont égale-
ment montré que dix-sept sur les 22 variétés avaient une analogie
de 82 % à plus de 94 % dans leur amplification de l’ADN.
L’analogie est plus grande, d’après certaines indications, entre
variétés développées dans la même station. Iqbal et al (1996) ont
rapproché cette analogie de la base génétique étroite utilisée lors
de l’hybridation de nouveaux génotypes.
Tatineni et al (1996) ont étudié l’effet de 80 amorces sur l’ampli-
fication des génomes de ADN de 19 génotypes de coton dont les
génotypes G. hirsutum et G. barbadense. Les génotypes utilisés
avaient une origine très diversifiée et ont montré une grande
variation dans les données morphologiques telles que la longueur
des sympodes, la longueur de la feuille, la profondeur de la
coupure dans la feuille, la couleur des pétales, la couleur du pollen
ainsi que la forme et la surface de la capsule, etc. A la place des
feuilles cotylédonaires, Tatineni et al ont utilisé des feuilles
arrivées à maturité de dix cotonniers différents et les ont
mélangées avant d’extraire l’ADN génomique. Vingt-sept des 80
amorces ont donné soit des produits amplifiés monomorphes ou
aucun morphisme n’a été constaté dans une variété quelconque.
Cinquante-trois amorces ont été en mesure d’amplifier 135 frag-
ments à l’évidence polymorphes montrant ainsi une moyenne de
1,7 RAPD par amorce. Tel qu’on pouvait s’y attendre, les deux
génotypes barbadense avaient entre eux une faible distance
génétique de 0,42. Il a été possible sur la base du RAPD de
regrouper toutes les variétés en deux grands groupes de G.
hirsutum et G. barbadense.
Ce développement récent dans l’étude de l’ADN a créé de
nouvelles possibilités de comprendre les analogies et différences.
Cela a également permis d’établir des relations entre génotypes
d’origine inconnue. Les études susmentionnées sont parmi les
premières études faites dans ces pays en vue de quantifier la
diversité génétique concernant une vaste gamme de génotypes
appartenant à trois espèces cultivées différentes de coton. Les
génotypes choisis comprenaient des génotypes plus ou moins
reliés et une variété d’amorces a été essayée. Les détails sur les
amorces peuvent être obtenus dans les laboratoires respectifs
mais les résultats des trois études sont comparés dans le tableau
ci-dessus.
Les caractéristiques ou paramètres classiques qui distinguent les
variétés ou les génotypes sont très influencés par l’environnement
et les conditions de végétation. Les codages des loci des gènes
pour les iso-enzymes et les protéines sont conservés dans la nature
et partant ne sont pas assez polymorphes pour faciliter la différen-
tiation de variétés avec des différences génétiques étroites.
L’identification d’autres systèmes de marqueurs capables de
distinguer des matériaux étroitement reliés entre eux est néces-
saire. Avec la découverte de l’empreinte de l’ADN en 1985,
l’attention s’est concentrée sur l’ADN comme source de poly-
morphisme informatif. La séquence de l’ADN est unique chez
chaque personne et n’est pas influencée par l’environnement ou
les conditions de développement. La séquence de l’ADN est
stable et ne change pas avec la croissance fournissant ainsi un
excellent moyen d’étudier l’identification des génotypes dans le
coton et dans d’autres organismes vivants. Outre l’étude de la
diversité génétique dans une population donnée, l’empreinte de
l’ADN marque également les gènes d’importance économique et
leur utilisation efficace dans les programmes de sélection. Le
marquage des gènes donnera non seulement un sens de la direc-
tion mais aussi une précision nettement plus grande dans la
sélection en vue d’objectifs spécifiés.
L’empreinte de l’ADN pourrait être un outil très utile pour
l’établissement des droits de propriété intellectuelle dans divers
pays. Elle pourrait aider à résoudre les questions controversées
se rapportant à l’utilisation de gènes spécifiques brevetés ainsi
qu’à l’introduction et à la multiplication de semences pour les
plantations commerciales. En Inde, le Centre national de recher-
che sur les empreintes de l’ADN a été créé récemment pour
effectuer des recherches dans le domaine de la mise au point de
sondes pour les différentes espèces, techniques et technologies
pour l’utilisation de l’information codée sur l’ADN.
Contributions des parents dans les
hybrides F1
Un système génétique qui pourrait directement mesurer l’impor-
tance du caractère hétérozygote dans les hybrides du coton com-
mercial ou même les hybrides ordinaires est très important. La
mesure de l’ampleur de l’hybridité peut refléter dans une grande
mesure la performance. Gwyn et al (1995) utilisant l’analyse
RFLP ont étudié dix lignes parentales de capacité de liaison
Etudes sur le polymorphisme dans certains pays
Elément Australie Pakistan Etats-Unis
No. de variétés 14 23 19
No. d’amorces 30 50 80
Pas de polymorphisme 0 1 27
No. total de polymorphisme 453 349 135
Moyenne RAPD/amorce 15,1 7,0 1,7
20 ICAC RECORDER

connue, leurs huit combinaisons F1 et la population F2 de deux
combinaisons parentales. Des deux, on a analysé, aux fins d’in-
tégrité génétique, les combinaisons F1 comprenant les sous-popu-
lations hybrides à 100 % et à 50 % et les deux populations F2
produites des cotonniers F1 purs à 100 %. Les techniques de
bandes de l’ADN de la population F1 reflétaient précisément la
contribution à100 % ou à 50 % du parent mâle. La population F2
a également démontré clairement le ratio génétique espéré. Gwyn
et al (1995) ont prouvé que le RFLP pouvait être utilisé avec
succès pour déterminer la contribution génétique des parents et
pouvait peut-être servir à maximiser le caractère hétérozygote et
partant l’hétérosis des hybrides de coton.
Des progrès ont déjà été faits pour trouver l’homologie chro-
mosomique et pour localiser l’existence de caractères sur les
divers chromosomes utilisant une carte des différentes sondes de
l’ADN et de l’analyse RFLP. Il semble que, grâce à l’empreinte
ADN, il sera possible sous peu d’identifier l’importance de
l’expression d’un caractère particulier avant les tests sur le terrain.
Une meilleure compréhension de l’emplacement de gènes spéci-
fiques facilitera la prévision de la performance des hybrides.
Les références se trouvent à la page huit.
Résistance à la toxine Bt dans le coton
La campagne du coton 1996/97 entre dans les annales de l’histoire
de la production cotonnière avec la plantation commerciale du
coton Bt résistant aux lépidoptères. Les planteurs de coton aux
Etats-Unis et les chercheurs dans le domaine du coton dans le
monde entier entendent parler du coton Bt depuis 10 ans. L’in-
dustrie cotonnière était impatiente de voir le coton Bt cultivé dans
les champs, utilisant à large échelle la technologie d’ingénierie
génétique. Depuis l’acceptation des chromosomes comme
porteurs de matériel héréditaire, des progrès ont été faits pas à pas
pour comprendre le mécanisme du contrôle génétique et l’utili-
sation d’unités plus petites que le chromosome entier. La
génétique biochimique a donné naissance au concept selon lequel
un gène est l’unité la plus petite de l’hérédité et qu’un gène est
responsable pour la production d’une enzyme. Ce sont la recon-
naissance et la compréhension du modèle Watson et Crick de la
structure de la double hélice de l’ADN (acide désoxyribonu-
cléique) qui ont inspiré le développement significatif suivant. Une
fois que les chercheurs avaient pris connaissance de la structure
de l’ADN, ils ont commencé à explorer les possibilités de trans-
former et de régénérer les plants. La régénération d’un plant à
partir d’une seule cellule était établie depuis longtemps pour
d’autres produits avant d’être essayée avec succès pour le coton.
Une fois un plant régénéré à partir de ses tissus cellulaires, l’essai
suivant était d’inclure le matériel génétique dans les tissus soma-
tiques et d’obtenir une expression génétique d’un trait par le biais
d’une culture somatique menant effectivement au développement
de plants transgénétiques dans les cultures, surtout pour le coton.
Premier coton Bt résistant aux
insectes
Les chercheurs ont identifié un gène dans la bactérie du sol
Bacillus thuringiensis (Bt) qui a le code d’une protéine insecti-
cide. Ils ont été en mesure d’isoler et de transférer ce gène au coton
pour stimuler la production d’une toxine à l’intérieur du cotonnier.
Le coton transformé avec un gène Bt résistant aux lépidoptères
est appelé BollgardTM aux Etats-Unis et IngardTM en Australie.
Les deux cotons Bt sont capables de produire CryIA, protéine
toxique pour la plupart des chenilles de la capsule et des boutons
floraux. En octobre 1995, la société Monsanto a reçu l’approba-
tion réglementaire finale de l’Agence des Etats-Unis pour la
protection environnementale (US Environmental Protection
Agency) pour planter le coton Bt à échelle commerciale aux
Etats-Unis. Seules deux variétés de coton résistantes au ver des
boutons floraux et à la chenille de la capsule, dont H. armigera,
au ver du tabac et au ver rose, étaient disponibles pour la culture
commerciale en 1996/97. Les variétés Bt sont nommées Nu-
COTN 33B et NuCOTN 35B et ont été développées à partir de
leurs variétés isogéniques cultivées commercialement, Delta et
Pine Land DPL 5415 et DPL 5690, respectivement. Un grand
nombre d’autres variétés avec un gène Bt sont sur le point d’être
mises sur le marché mais seules NuCOTN 33 et NuCOTN 35
étaient offertes à la vente en 1996/97. L’on estime qu’en 1996/97,
le coton Bollgard Bt était cultivé sur environ 700 000 hectares
aux Etats-Unis. Selon le CCIC, le coton était planté sur une
superficie d’environ 5,53 millions d’hectares aux Etats-Unis
pendant 1996/97. Le NuCOTN 33 à lui seul était cultivé sur
environ 10 % de la superficie totale et est devenu la variété la plus
importante aux Etats-Unis. NuCOTN 35 couvrait environ 2 % de
la superficie américaine totale. L’on suppose que des variétés
analogues de coton Bt pourront être cultivées sur plus de deux
millions d’hectares dans des régions affectées par le ver du tabac
et la chenille de la capsule.
Certains futurs cotons Bt
La campagne 1996/97 s’avérera une année d’importance capitale
pour le coton Bt. La technologie a fait ses preuves dans le cadre
d’essais à petite échelle mais 1996/97 montrera les réactions des
agriculteurs. Les premiers comptes rendus pendant la campagne
1996/97 aux Etats-Unis ont montré que le coton Bt n’était pas
complètement à l’abri de la chenille de la capsule et les
agriculteurs ont commencé à douter de la technologie. Ou alors
les promesses faites par les promoteurs du coton Bt n’étaient pas
tenues ou alors les agriculteurs ne comprenaient pas vraiment que
le gène Bt ne conférait pas une protection à 100 % contre tous les
types de chenilles de la capsule et qu’il n’éliminerait pas l’utili-
sation d’insecticides. Toutefois, la technologie diminuera cer-
SEPTEMBRE 1996 21