TD 8 : Traduction
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TD TRADUCTION Exercice 1 Des chercheurs ont caractérisé dans l'ovocyte de xénope, un ADNc qu'ils ont nommé RSK. La séquence en nucléotides et la traduction en acides aminés de ce dernier sont données dans la figure 1. Une carte de restriction sommaire de l'ADN correspondant est schématisée sur la figure 2. Figure 1 : Séquence nucléotidique de l'ADNc RSK et composition en acides aminés de la partie codante. HincII, 807 BamHI, 824 NcoI, 95 HindIII, 289 KpnI, 849 DraI,,1159 1774 Figure 2 : Carte de restriction sommaire de l'ADNc RSK correspondant 1. Entourer les codons d'initiation et de terminaison de la traduction. 2. Quelles sont les longueurs en nucléotides des séquences 5' UTR (non traduites ) et 3' UTR? 3. Donner la taille du cadre de lecture ouvert en nucléotides et en acides aminés. 4. Quelle est, en Dalton, la masse moléculaire apparente de la protéine RSK, sachant que le PM d'un acide aminé est de 110 Daltons? Il a été isolé à partir d'une banque ADNc, 5 ADNc RSK. Ces ADNc ont une séquence parfaitement identique et ne diffèrent que par leur longueur. 5. Expliquer pourquoi il a été obtenu plusieurs ADN RSK sachant que la synthèse de ces ADNc a été initiée par de l'oligo d(T). Un de ces ADNc (RSK1) a été cloné au niveau du site EcoRI du vecteur d'expression pGEX. Il existe trois exemplaires du vecteur pGEX qui sont schématisés sur la figure 3. Pour réaliser ce clonage il a été nécessaire de rajouter, à chacune des extrémités de RSK1, des adaptateurs possédant un site de restriction EcoRI (GGAATTCC). La séquence des extrémités de RSK1 après coupure par l'enzyme EcoRI est la suivante : 5' aattcccccgccatggagaattt........................................................ttaaaagg 3' Figure 3 : Vecteurs d'expression de la série pGEX 6. Quel est l'intérêt du vecteur pGEX ? Que permet-il d'obtenir? 7. Qu'est ce qui différencie les 3 vecteurs les uns des autres? 8. Quel est l'intérêt d'avoir positionné des codons stops en 3' des sites de clonage? 9. Quel vecteur pGEX a été utilisé pour cloner l'ADNc RSK1 au niveau du site EcoRI? 10. Quel codon stop sera utilisé dans ce cas par le ribosome? 11. Quelle est la taille en acides aminés de la protéine obtenue sachant que la protéine GST fait 306 acides aminés dans le cas des vecteurs pGEX-1λT et 2T et 307 acides aminés pour le vecteur pGEX-3X (non compris les acides aminés de la thrombine ou du facteur X du site multiple de clonage)? 12. La construction finale a été vérifiée par séquençage en utilisant pour la réaction une amorce en 3' de l'ADNc GST. Ecrire la séquence nucléotidique obtenue. 13. Quel(s) autre(s) test(s) que le séquençage aurait permis de vérifier l'efficacité du clonage ? Décrire sommairement des protocoles. Exercice 2 Il est possible de synthétiser des ARNm à partir de nucléotides diP. Par exemple à partir d'UDP et de CDP on peut obtenir du poly(UC). nUDP + mCDP poly UC + (n+m) Pi enzyme 1. Quel est le nom de l'enzyme utilisée? Pourquoi n'est-il pas nécessaire d'utiliser une matrice? 2. Quels seront les acides aminés incorporés si le copolymère poly(UC) est obtenu à partir d'un rapport molaire de 4 UDP pour 1 CDP? Rappel des codons UUU Phényl alanine UUC UCU Sérine UCC CUU Leucine CCU Proline CUC CCC Exercice 3 L'utilisation de certains antibiotiques qui inhibent la synthèse protéique en se liant au ribosome a permis de préciser l'organisation fonctionnelle du ribosome. La puromycine est une molécule qui a une forte homologie avec l'extrémité d'un ARNt chargé par la tyrosine. Ceci lui permet de rentrer dans le site A du ribosome. Une liaison peut alors se faire entre le peptide porté par l'ARN situé dans le site P et la puromycine. Le peptide associé à l'antibiotique est alors libéré ce qui entraîne un arrêt prématuré de la synthèse protéique Afin de préciser dans quels sites du ribosome passent l'ARNt porteur de la formylméthionine qui initie la traduction ou l'ARNt porteur de la méthionne qui intervient dans la phase d'élongation, Bretscher et Marcker ont réalisé l'expérience décrite cidessous. - Interpréter ces résultats
