Whole genome sequencing

ARTICLE DE REVUE 348
La prochaine révolution en microbiologie clinique
«Whole genome sequencing»
Dr Dominik Meinela,b, PhD; Dr Helena M. B. Seth-Smitha,b, PhD; PD Dr méd. Dr phil. Adrian Eglia,b
aKlinische Mikrobiologie, Universitätsspital Basel, Basel
bApplied Microbiology Research, Departement Biomedizin, Universität Basel, Basel
Le séquençage et l’analyse du génome entier d’agents pathogènes («whole genome
sequencing») en l’espace de quelques jours ouvrent de nouvelles possibilités. L’épi-
démiologie moléculaire, la détection de tous les facteurs de virulence et mécanismes
d’antibiorésistance codés dans le génome, ainsi que la détermination du micro-
biome sont du plus grand intérêt pour de nombreuses disciplines cliniques. Cet article
de revue présente les possibilités et les dés en s’appuyant sur des exemples tirés
de la pratique.
Introduction et contexte
Au cours de ces dernières années, la discipline de la
microbiologie clinique a connu une série de dévelop-
pements techniques substantiels et de longue portée.
L’automatisation de la préparation et du traitement des
échantillons [,] ainsi que les analyses par spectromé-
trie de masse au moyen de la technologie MALDI-TOF
(«matrix-assisted laser desorption/ionization time-
of-ight») pour l’identication rapide de bactéries et
champignons [,] ont conduit à une optimisation et
accélération considérables des processus de travail.
L’identication de bactéries jusqu’au niveau de l’espèce
est dans la plupart des cas disponible  heures plus tôt
qu’avec les méthodes conventionnelles [], ce qui a sans
nul doute également des conséquences majeures pour
la prise en charge clinique. Le diagnostic moléculaire a
lui aussi connu de grandes avancées: grâce à l’explication
de syndromes cliniques tels que la méningite/l’encépha-
lite ou les infections respiratoires, les tests de PCR
basés sur des panels permettent d’ébaucher un dia-
gnostic microbiologique en détectant une multitude
d’agents pathogènes potentiels [,]. Toutefois, avec la
possibilité de séquençage du génome entier («whole
genome sequencing», WGS) de bactéries, virus et cham-
pignons, nous assistons probablement à une véritable
révolution [–]. La technologie du WGS permet de réa-
liser des analyses avec une précision jusqu’alors inégalée
et fournissant une quantité d’informations elle aussi
inégalée.
An d’utiliser ecacement ces nouvelles technologies,
il est essentiel de discuter avec les collègues cliniciens
des possibilités oertes par les nouvelles avancées tech-
nologiques, sans oublier les lacunes et dés associés.
Grâce au développement technique, le savoir et lapré-
cision dans la microbiologie clinique et dans la pra-
tique médicale quotidienne ont déjà fortement pro-
gressé []. Dans les années , à peine espèces
bactériennes avec un nom valide publié étaient connues;
en , ce nombre était déjà de presque   []. Les
mécanismes de résistance et les facteurs de virulence
peuvent être décrits de manière détaillée grâce aux
données génétiques de haute résolution et peuvent être
associés à l’aection correspondante. Grâce à l’échange
avec d’autres disciplines spécialisées, les informations
microbiologiques peuvent être interprétées et appliquées
dans un contexte personnalisé.
Alors qu’il y a encore quelques années, le WGS était
limité par les coûts élevés liés au matériel et aux réactifs,
cet obstacle a été surmonté grâce à la disponibilité
croissante et au développement de la technologie. En
parallèle, la bioinformatique pour l’analyse des grandes
quantités de données complexes a accompli d’énormes
progrès. Bien que pour la plupart des génomes bac-
tériens, on compte «seulement» entre deux et neuf
mégabases, le volume des données à analyser peut être
démultiplié en raison d’une couverture («coverage»)
multiple lors du séquençage. Des ordinateurs très per-
formants doivent dès lors être utilisés pour l’analyse
bioinformatique. La dénition de processus analy-
tiques automatiques («analytical pipelines») au moyen
de logiciels commerciaux permet un traitement rela-
tivement rapide des données en l’espace de quelques
heures.
Sous quelle forme la technologie du WGS trouve-t-elle
sa place dans la microbiologie moderne suisse? Parmi
les problèmes actuels majeurs auxquels est confrontée
la microbiologie clinique gurent le développement
Dominik Meinel
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fulgurant de résistances aux antibiotiques [–] et la
propagation d’agents pathogènes virulents [–]. Ces
dés microbiologiques et cliniques peuvent être explo-
rés et compris grâce à la technologie du WGS. Toutefois,
en raison de la propagation rapide d’agents pathogènes
virulents et multirésistants, il est essentiel, à l’échelle
de la Suisse mais également au niveau mondial, de dis-
poser de banques de données de surveillance inter-
connectées. Même si une interconnexion à l’échelle de
toute la Suisse serait déjà techniquement possible à
l’heure actuelle, sa mise en place est encore hésitante,
car le nancement fait défaut et la durabilité de l’inves-
tissement considérable dans une telle infrastructure
est sous-estimée. La circulation d’agents pathogènes
multirésistants ou virulents entre diérents hôtes et
réservoirs, à savoir entre l’être humain, l’animal et
l’environnement au sens d’un concept «one health»,
comme c’est par ex. le cas pour les Salmonella spp. ou
les Escherichia coli entéropathogènes, peut nalement
uniquement être utilisée au prot de la santé publique
par le biais de banques de données transcantonales in-
terconnectées [, , , ].
Dans cet article, nous souhaitons présenter en détails
la technologie du WGS pour les applications microbio-
logiques et en montrer les avantages, mais également
les dés, au moyen d’exemples tirés de la pratique diag-
nostique de routine.
Aspects techniques du «whole genome
sequencing» (g. 1)
Sur le plan technologique, le principe du WGS avec la
méthode du «séquençage par synthèse» s’inspire du
séquençage de Sanger par électrophorèse capillaire
[], méthode connue et utilisée depuis des années.
L’ADN polymérase est responsable de l’incorporation
progressive des composants d’ADN marqués par uores-
cence (désoxyribonucléotide triphosphate, dNTP) dans
Figure 1: Déroulement technique du séquençage.
Les quatre étapes principales sont (1) constitution d’une librairie de séquençage, (2) génération des clusters, (3) séquençage
et(4)analyse des données. dNTP = désoxyribonucléotide triphosphate, SNP = «single nucleotide polymorphisms».
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le brin d’ADN synthétisé à l’aide de la matrice d’ADN
(brin modèle, en anglais «DNA template»). La dié-
rence critique par rapport à la méthode de Sanger, qui
permet uniquement de mesurer un seul fragment
d’ADN, est qu’il est possible d’exécuter et mesurer
parallèlement des millions de réactions de séquençage
au cours d’un seul cycle («massive parallel sequen-
cing»). A cet eet, une micro-puce spéciale dont la taille
ne dépasse pas  mm² (!) est utilisée. Le WGS s’eectue
en quatre étapes clés (voir g. ).
Constitution d’une librairie de séquençage
(«library preparation»)
L’ADN d’un pathogène fait l’objet d’une fragmentation
enzymatique ou d’une fragmentation par ultrasons;
les fragments qui en résultent sont marqués par liga-
tion au niveau des extrémités ’ et ’ de l’ADN avec un
adaptateur de séquençage («barcoding»). Grâce à ces
code-barres, il est ensuite possible de séquencer plu-
sieurs pathogènes en parallèle, car chaque code-barres
est par ex. utilisé pour un pathogène spécique d’un
patient, permettant ainsi une classication des frag-
ments séquencés.
Génération des clusters («cluster generation»)
La librairie est chargée sur un support solide («ow
cell»), sur lequel les adaptateurs de séquençage peuvent
être hybridés avec des fragments d’ADN supplémen-
taires. S’ensuit alors ce qu’on appelle l’amplication en
ponts: il s’agit d’une PCR («polymerase chain reaction»)
au cours de laquelle les amorces (oligonucléotides) sont
immobilisées à la surface de la «ow cell». Il en résulte
des groupes/amas («cluster») de fragments d’ADN iden-
tiques, démultipliés par l’amplication en ponts, qui
sont xés localement en surface. Dans le séquençage
qui s’ensuit, cela sert au renforcement du signal.
Séquençage
La technologie Illumina® utilise une méthode de ter-
minaison cyclique réversible («reversible terminated
chemistry»). Ce faisant, tous les dNTP (A, G, C et T) sont
toujours disponibles simultanément, et l’appariement
des bases entraîne l’intégration du dNTP prédéterminé
par le brin modèle. Le signal uorescent spécique à
tout dNTP permet d’identier chaque dNTP intégré.
Etant donné que le colorant uorescent bloque l’extré-
mité ’ de la base intégrée, seule une base peut être
intégrée lors de chaque étape. Pour séquencer la base
suivante, le colorant peut faire l’objet d’un clivage
chimique et l’extrémité ’ peut être libérée pour l’étape
de réaction suivante. Ainsi, au cours des cycles de sé-
quençage, la séquence de nucléotides est mesurée
étape par étape. A l’inverse, la technologie IonTorrent™
mesure les protons libérés à l’aide d’altérations haute-
ment sensibles du pH (grâce au clivage du phosphate
dans le séquençage).
Analyse des données
L’analyse des fragments d’ADN (avec code-barres) peut
s’eectuer de deux façons: assemblage «de novo» des
fragments d’ADN qui se chevauchent («assembly») ou
comparaison avec une séquence de référence connue
du même pathogène («mapping»). De par la disponi-
bilité croissante de génomes de pathogènes diérents,
la seconde méthode est moins complexe sur le plan
bioinformatique et elle est beaucoup plus rapide. La re-
construction de l’ensemble du génome et l’analyse des
données qu’il contient permettent de tirer une série de
conclusions essentielles pour des pathogènes indivi-
duels ou des groupes de pathogènes, ce qui est décrit
dans la suite de l’article.
Typage et épidémiologie moléculaire
Les transmissions de souches bactériennes entre pa-
tients confrontent souvent les spécialistes de l’hygiène
hospitalière à des dés. En cas de Staphylococcus aureus
résistant à la méticilline (SARM) ou d’entérobactéries
multirésistantes, il est par exemple nécessaire de déter-
miner dans un premier temps le nombre de patients
touchés, puis de procéder à un dépistage des personnes
en contact. La recherche d’une source n’est pas toujours
simple, demande du temps et des ressources et elle
n’est parfois pas entièrement possible. Il en va de même
pour les transmissions dans l’espace public. Les infec-
tions transmises via les aliments peuvent poser de véri-
tables dés, comme l’a montré l’exemple de l’infection
par E. coli productrice de shigatoxines en Allemagne
[, ]. En outre, au cours des dernières années, on note
une nette augmentation des bactéries multirésistantes
[–]. Le Centre suisse pour le contrôle de l’antibio-
résistance Anresis fait état d’une augmentation préoc-
cupante des entérobactéries productrices de bêta-lacta-
mases à spectre étendu (EBLSE), passant de % en  à
plus de % en  []. Toutefois, d’autres germes ré-
sistants gagnent également du terrain, notamment les
entérobactéries productrices de carbapénèmases (EPC)
et les bactéries à Gram négatif non fermentaires ou la
résistance plasmatique à la colistine chez
E. coli []. Les
germes multirésistants représentent une grande me-
nace pour la médecine moderne et leur propagation
doit être empêchée. Diérentes méthodes de typage
sont disponibles pour déterminer les liens entre les dif-
férents isolats et la clonalité. Les données sont ensuite
analysées an d’établir une phylogénie (arbre de parenté
entre les pathogènes).
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Les méthodes de typage courantes sont l’électrophorèse
sur gel en champ pulsé («pulsed-eld gel electrophore-
sis», PFGE), le typage par séquençage multilocus («mul-
tilocus sequence typing», MLST), le «spa-typing» pour
S. aureus et le ribotypage pour Clostridium dicile. Ces
technologies se caractérisent par des pouvoirs discri-
minants diérents et par une charge de travail variable
pour le laboratoire (tab.). Le pouvoir discriminant est
mesuré au moyen d’un index de diversité, par ex. le
«Simpson’s Index of Diversity», une valeur de , repré-
sentant le pouvoir discriminant maximal.
En comparant le génome entier de diérents patho-
gènes, le WGS ore un pouvoir discriminant maximal
pour déterminer les liens de parenté. Les gènes qui
sont présents chez toutes les bactéries d’une espèce
sont assignés au «génome cœur» («core genome») et
comparés entre eux. Les gènes qui ne sont pas présents
chez toutes les bactéries de cette espèce, comme par
ex. certains gènes de résistance, sont assignés au «gé-
nome accessoire» («accessory genome») et ne sont pas
pris en compte dans l’analyse initiale. La comparaison
entre les isolats se base généralement sur le génome
cœur, comme c’est le cas lors d’une analyse de type
MLST, mais cependant avec un centuple des gènes
(«core genome MLST»).
La comparaison directe d’isolats permet ainsi de détec-
ter des mutations ponctuelles individuelles («single
nucleotide polymorphisms», SNP) entre les bactéries.
Cette approche est utile pour représenter avec une très
grande précision les liens de parenté (cf. exemple dans
la g. ). Une chaîne de transmission peut être reconsti-
tuée de patient à patient et venir compléter les données
épidémiologiques.
Cette méthode fonctionne déjà très bien pour le SARM
[–], pour
Enterococcus faecium [], pour les EBLSE
[, –], pour les EPC [–], pour
Neisseria meningi-
tidis [], pour Mycobacterium tuberculosis [–] et
pour beaucoup d’autres agents pathogènes.
Etant donné que le taux de mutation spontanée de
nombreuses espèces bactériennes est connu, cette
méthode permet également d’évaluer la dynamique de
transmission et la temporalité, ce qui constitue une va-
leur ajoutée supplémentaire. Ces éléments permettent
dans le contexte d’une épidémie de déterminer une
source ou un facteur de risque potentiel, en fonction
de l’espèce bactérienne détectée, dans un cadre tempo-
rel de quelques semaines [].
Détection de facteurs de virulence
Les facteurs de virulence inuencent fortement la pa-
thogénicité des bactéries. Ils constituent une modalité
essentielle pour garantir la transmission à de nouveaux
hôtes, par ex. par le biais de facteurs d’adhésion qui se
lient à l’épithélium de l’hôte ou à d’autres surfaces [].
Les facteurs de virulence peuvent également aider les
bactéries à vaincre d’autres espèces concurrentes en ce
qui concerne l’approvisionnement en nutriments [].
La pathogénicité dans l’hôte humain est aussi forte-
ment inuencée par des facteurs de virulence, comme
c’est par ex. le cas de la toxine du syndrome du choc
toxique pour
S.aureus , de la toxine cholérique (respon-
Tableau 1: Comparaison de différentes méthodes de typage: PFGE = électrophorèse sur
gel en champ pulsé, MLST = «mutilocus sequence typing», WGS = «whole genome
sequencing», SI = «Simpsons Index of Diversity» Les coûts sont définis sur la base de la
liste des analyses au moyen des positions de PCR pour la mise en évidence d’un gène.
Méthode Germes Délai d’exécution Coûts en CHF
par échan-
tillon
Pouvoir
discriminant
(SI diversity)
Références
PFGE Multiples 1 semaine 180 0,87–0,99 [27–30]
MLST Multiples 1 semaine 180–360 0,9–0,95 [27, 28, 31]
Ribotypage Cl. difficile 3–4 jours 180 – –
spa-typing S. aureus 3–4 jours 180 0,95 [30]
WGS Multiples 3–4 jours 540 0,99 –
Figure 2: Typage basé sur le «whole genome sequencing» d’isolats de SARM. Trois
clusters sont visibles: vert, jaune et rouge. Les chiffres désignent le nombre d’altérations
génétiques (SNP ou différences d’allèles). Le SARM a besoin d’env. 8 semaines par SNP.
SARM = Staphylococcus aureus résistant à la méticilline; SNP = «single nucleotide
polymorphisms».
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sable de diarrhée) pour Vibrio cholerae ou des toxines
responsables de diphtérie pharyngée pour
Coryne-
bacterium diphtheriae
. La diversité des facteurs de
virulence bactérienne est immense [–], mais
l’inuence de facteurs individuels sur l’évolution de la
maladie est bien souvent insusamment décrite. Fait
particulièrement important pour la pratique clinique,
des tests de PCR sont uniquement disponibles pour un
faible nombre de facteurs de virulence, et ce, la plupart
du temps dans des centres de référence. A l’heure
actuelle, les multiples propriétés des bactéries ne sont
également pas encore prises en compte dans le proces-
sus de décision clinique et, en raison des progrès tech-
niques accomplis dans la biologie moléculaire et la
microbiologie, le nombre de facteurs de virulence ne
cessent d’augmenter. En cas de réaction médiée par
une toxine, la durée nécessaire à l’obtention du résul-
tat de la PCR est bien souvent trop longue pour inuen-
cer la décision clinique. Le syndrome de choc toxique
dans le cadre d’une infection à
S. aureus en est un bon
exemple. Dans ce cas de gure, le choix de l’antibio-
thérapie est initialement dicté par les symptômes cli-
niques et la toxine n’est généralement que déterminée
rétrospectivement. La présence de la toxine du syn-
drome de choc toxique peut toutefois être responsable
d’une réponse immunitaire excessive et de compli-
cations massives. Il en est de même pour d’autres fac-
teurs de virulence, comme les facteurs d’adhésion, qui
n’ont jusqu’à présent guère d’inuence sur le processus
de décision clinique. Grâce aux données génomiques,
il est déjà possible aujourd’hui pour
S. aureus d’identi-
er jusqu’à  facteurs de virulence diérents, et ce
sans grands moyens techniques. Cela permet d’évaluer
précisément le risque individuel d’un patient par ex.
en ce qui concerne les complications potentielles (for-
mation de biolms ou d’abcès, choc et risques de trans-
mission, etc.). En ce qui concerne
C. diphtheriae, outre
la toxine diphtérique, des facteurs d’adhésion majeurs
pour l’épithélium pharyngé peuvent également être
mis en évidence. Ce sont précisément ces isolats com-
portant les deux facteurs de virulence qui doivent faire
l’objet d’une attention particulière. La concertation
avec des confrères spécialisés en infectiologie, en hy-
giène hospitalière et en médecine intensive occupera
une place de plus en plus déterminante à l’avenir an
que les multiples informations microbiologiques
puissent être utilisées de manière optimale pour une
prise en charge individuelle des patients.
Détection de mécanismes de résistance
L’élucidation d’un mécanisme de résistance est essen-
tielle, car elle permet non seulement d’assurer un
traitement ecace, mais elle conère également une
compréhension épidémiologique face à la propagation
actuellement très rapide de bactéries multirésistantes.
Diérentes méthodes phénotypiques et génotypiques
sont disponibles à cet eet au laboratoire de micro-
biologie. La grande diversité de gènes codant pour les
BLSE, l’AmpC et les carbapénémases s’oppose toutefois
à la disponibilité d’une PCR spécique pour chaque
gène. Là aussi, le WGS peut s’avérer très utile et appor-
ter un éclaircissement dénitif. La gure  illustre ce
cas de gure à l’exemple de la carbapénémase de type
IMI-, qui a pu être détectée par WGS mais fait défaut
dans les tests diagnostiques courants.
Le plus grand bénéce clinique concerne toutefois les
bactéries à croissance lente, telles que
Mycobacterium
tuberculosis
. Les résultats du test de résistance phéno-
typique sont uniquement disponibles tardivement,
retardant ainsi l’initiation d’un traitement anti-
biotique optimal précisément pour les isolats de
M.tu-
berculosis multirésistants. La méthode de WGS per-
mettrait ici d’obtenir des résultats nettement plus
rapidement par analyses de séquences des gènes de
résistance et ce, même directement à partir d’un
échantillon du patient [–]. Cela serait semblable à
une méthode déjà utilisée dans les laboratoires
spécialisés pour
M.tuberculosis consistant à tester les
résistances par PCR/hybridation. Le WGS fournit tou-
tefois nettement plus d’informations génétiques, car
il ne se contente pas d’analyser des gènes isolés. Les
chercheurs tentent actuellement de rendre le test de
résistance génotypique encore plus précis par ce biais
et de déterminer les antibiorésistances par test gé-
notypique pour les patients présentant des infections
mixtes. En outre, les informations fournies par le
WGS peuvent être utilisées à des ns épidémiolo-
giques.
Il est également possible de comprendre les méca-
nismes de résistance par le biais de la génétique fonc-
tionnelle. La détection de pertes de porines pour les
entérobactéries et les bactéries à Gram négatif non
fermentaires, telles que
Pseudomonas aeruginosa,
constituait jusqu’à présent un diagnostic d’exclusion.
Un prol de résistance phénotypique a été comparé
génotypiquement avec un large spectre de PCR indi-
viduelles et nalement, après avoir éliminé tous les
résultats négatifs, la possibilité d’une perte de porines
a été envisagée. Les pertes de porines sont actuelle-
ment plus fréquentes que les résistances aux carba-
pénèmes médiées par un plasmide. L’analyse par WGS
permet d’annoter les mutations par ex. dans le gène
oprD de P.aeruginosa et l’inuence sur la perméabilité
de la porine pour les carbapénèmes peut être directe-
ment postulée (g. ).
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