Whole genome sequencing
publicité
348 ARTICLE DE REVUE La prochaine révolution en microbiologie clinique «Whole genome sequencing» Dr Dominik Meinel a,b , PhD; Dr Helena M. B. Seth-Smith a,b , PhD; PD Dr méd. Dr phil. Adrian Egli a,b a Klinische Mikrobiologie, Universitätsspital Basel, Basel Applied Microbiology Research, Departement Biomedizin, Universität Basel, Basel v ie we d Peer re a r tic le b Le séquençage et l’analyse du génome entier d’agents pathogènes («whole genome sequencing») en l’espace de quelques jours ouvrent de nouvelles possibilités. L’épidémiologie moléculaire, la détection de tous les facteurs de virulence et mécanismes d’antibiorésistance codés dans le génome, ainsi que la détermination du microbiome sont du plus grand intérêt pour de nombreuses disciplines cliniques. Cet article de revue présente les possibilités et les défis en s’appuyant sur des exemples tirés de la pratique. Introduction et contexte Grâce au développement technique, le savoir et la précision dans la microbiologie clinique et dans la pra- Dominik Meinel Au cours de ces dernières années, la discipline de la tique médicale quotidienne ont déjà fortement pro- ­microbiologie clinique a connu une série de dévelop- gressé [13]. Dans les années 1980, à peine 1000 espèces pements techniques substantiels et de longue portée. bactériennes avec un nom valide publié étaient connues; L’automatisation de la préparation et du traitement des en 2012, ce nombre était déjà de presque 14 000 [14]. Les échantillons [1, 2] ainsi que les analyses par spectromé- mécanismes de résistance et les facteurs de virulence trie de masse au moyen de la technologie MALDI-TOF peuvent être décrits de manière détaillée grâce aux («matrix-assisted laser desorption/ionization time- données génétiques de haute résolution et peuvent être of-flight») pour l’identification rapide de bactéries et associés à l’affection correspondante. Grâce à l’échange champignons [3, 4] ont conduit à une optimisation et avec d’autres disciplines spécialisées, les informations accélération considérables des processus de travail. microbiologiques peuvent être interprétées et appliquées L’identification de bactéries jusqu’au niveau de l’espèce dans un contexte personnalisé. est dans la plupart des cas disponible 24 heures plus tôt Alors qu’il y a encore quelques années, le WGS était qu’avec les méthodes conventionnelles [5], ce qui a sans ­limité par les coûts élevés liés au matériel et aux réactifs, nul doute également des conséquences majeures pour cet obstacle a été surmonté grâce à la disponibilité la prise en charge clinique. Le diagnostic moléculaire a croissante et au développement de la technologie. En lui aussi connu de grandes avancées: grâce à l’explication parallèle, la bioinformatique pour l’analyse des grandes de syndromes cliniques tels que la méningite/l’encépha- quantités de données complexes a accompli d’énormes lite ou les infections respiratoires, les tests de PCR progrès. Bien que pour la plupart des génomes bac­ ­basés sur des panels permettent d’ébaucher un dia- tériens, on compte «seulement» entre deux et neuf gnostic microbiologique en détectant une multitude mégabases, le volume des données à analyser peut être d’agents pathogènes potentiels [6, 7]. Toutefois, avec la démultiplié en raison d’une couverture («coverage») possibilité de séquençage du génome entier («whole multiple lors du séquençage. Des ordinateurs très per- genome sequencing», WGS) de bactéries, virus et cham- formants doivent dès lors être utilisés pour l’analyse pignons, nous assistons probablement à une véritable bioinformatique. La définition de processus analy- révolution [8–12]. La technologie du WGS permet de réa- tiques automatiques («analytical pipelines») au moyen liser des analyses avec une précision jusqu’alors inégalée de logiciels commerciaux permet un traitement rela­ et fournissant une quantité d’informations elle aussi tivement rapide des données en l’espace de quelques inégalée. heures. Afin d’utiliser efficacement ces nouvelles technologies, Sous quelle forme la technologie du WGS trouve-t-elle il est essentiel de discuter avec les collègues cliniciens sa place dans la microbiologie moderne suisse? Parmi des possibilités offertes par les nouvelles avancées tech- les problèmes actuels majeurs auxquels est confrontée nologiques, sans oublier les lacunes et défis associés. la microbiologie clinique figurent le développement SWISS MEDICAL FORUM – FORUM MÉDICAL SUISSE 2017;17(15–16):348–355 349 Article de revue fulgurant de résistances aux antibiotiques [15–17] et la uniquement être utilisée au profit de la santé publique propagation d’agents pathogènes virulents [18–20]. Ces par le biais de banques de données transcantonales in- défis microbiologiques et cliniques peuvent être explo- terconnectées [8, 9, 12, 21]. rés et compris grâce à la technologie du WGS. Toutefois, Dans cet article, nous souhaitons présenter en détails en raison de la propagation rapide d’agents pathogènes la technologie du WGS pour les applications microbio- virulents et multirésistants, il est essentiel, à l’échelle logiques et en montrer les avantages, mais également de la Suisse mais également au niveau mondial, de dis- les défis, au moyen d’exemples tirés de la pratique diag­ poser de banques de données de surveillance inter- nostique de routine. connectées. Même si une interconnexion à l’échelle de toute la Suisse serait déjà techniquement possible à l’heure actuelle, sa mise en place est encore hésitante, car le financement fait défaut et la durabilité de l’inves- Aspects techniques du «whole genome sequencing» (fig. 1) tissement considérable dans une telle infrastructure Sur le plan technologique, le principe du WGS avec la est sous-estimée. La circulation d’agents pathogènes méthode du «séquençage par synthèse» s’inspire du multirésistants ou virulents entre différents hôtes et séquençage de Sanger par électrophorèse capillaire réservoirs, à savoir entre l’être humain, l’animal et [22], méthode connue et utilisée depuis des années. ­l’environnement au sens d’un concept «one health», L’ADN polymérase est responsable de l’incorporation comme c’est par ex. le cas pour les Salmonella spp. ou progressive des composants d’ADN marqués par fluores- les Escherichia coli entéropathogènes, peut finalement cence (désoxyribonucléotide triphosphate, dNTP) dans Figure 1: Déroulement technique du séquençage. Les quatre étapes principales sont (1) constitution d’une librairie de séquençage, (2) génération des clusters, (3) séquençage et (4) analyse des données. dNTP = désoxyribonucléotide triphosphate, SNP = «single nucleotide polymorphisms». SWISS MEDICAL FORUM – FORUM MÉDICAL SUISSE 2017;17(15–16):348–355 350 Article de revue le brin d’ADN synthétisé à l’aide de la matrice d’ADN mesure les protons libérés à l’aide d’altérations haute- (brin modèle, en anglais «DNA template»). La diffé- ment sensibles du pH (grâce au clivage du phosphate rence critique par rapport à la méthode de Sanger, qui dans le séquençage). permet uniquement de mesurer un seul fragment d’ADN, est qu’il est possible d’exécuter et mesurer Analyse des données ­parallèlement des millions de réactions de séquençage L’analyse des fragments d’ADN (avec code-barres) peut au cours d’un seul cycle («massive parallel sequen- s’effectuer de deux façons: assemblage «de novo» des cing»). A cet effet, une micro-puce spéciale dont la taille fragments d’ADN qui se chevauchent («assembly») ou ne dépasse pas 20 mm² (!) est utilisée. Le WGS s’effectue comparaison avec une séquence de référence connue en quatre étapes clés (voir fig. 1). du même pathogène («mapping»). De par la disponi­ bilité croissante de génomes de pathogènes différents, Constitution d’une librairie de séquençage («library preparation») la seconde méthode est moins complexe sur le plan L’ADN d’un pathogène fait l’objet d’une fragmentation construction de l’ensemble du génome et l’analyse des enzymatique ou d’une fragmentation par ultrasons; données qu’il contient permettent de tirer une série de les fragments qui en résultent sont marqués par liga- conclusions essentielles pour des pathogènes indivi- tion au niveau des extrémités 5’ et 3’ de l’ADN avec un duels ou des groupes de pathogènes, ce qui est décrit adaptateur de séquençage («barcoding»). Grâce à ces dans la suite de l’article. bioinformatique et elle est beaucoup plus rapide. La re- code-barres, il est ensuite possible de séquencer plusieurs pathogènes en parallèle, car chaque code-barres est par ex. utilisé pour un pathogène spécifique d’un Typage et épidémiologie moléculaire patient, permettant ainsi une classification des frag- Les transmissions de souches bactériennes entre pa- ments séquencés. tients confrontent souvent les spécialistes de l’hygiène hospitalière à des défis. En cas de Staphylococcus aureus Génération des clusters («cluster generation») résistant à la méticilline (SARM) ou d’entérobactéries La librairie est chargée sur un support solide («flow multirésistantes, il est par exemple nécessaire de déter- cell»), sur lequel les adaptateurs de séquençage peuvent miner dans un premier temps le nombre de patients être hybridés avec des fragments d’ADN supplémen- touchés, puis de procéder à un dépistage des personnes taires. S’ensuit alors ce qu’on appelle l’amplification en en contact. La recherche d’une source n’est pas toujours ponts: il s’agit d’une PCR («polymerase chain reaction») simple, demande du temps et des ressources et elle au cours de laquelle les amorces (oligonucléotides) sont n’est parfois pas entièrement possible. Il en va de même immobilisées à la surface de la «flow cell». Il en résulte pour les transmissions dans l’espace public. Les infec- des groupes/amas («cluster») de fragments d’ADN iden- tions transmises via les aliments peuvent poser de véri- tiques, démultipliés par l’amplification en ponts, qui tables défis, comme l’a montré l’exemple de l’infection sont fixés localement en surface. Dans le séquençage par E. coli productrice de shigatoxines en Allemagne qui s’ensuit, cela sert au renforcement du signal. [23, 24]. En outre, au cours des dernières années, on note une nette augmentation des bactéries multirésistantes Séquençage [15–17]. Le Centre suisse pour le contrôle de l’antibio­ La technologie Illumina® utilise une méthode de ter- résistance Anresis fait état d’une augmentation préoc- minaison cyclique réversible («reversible terminated cupante des entérobactéries productrices de bêta-lacta- chemistry»). Ce faisant, tous les dNTP (A, G, C et T) sont mases à spectre étendu (EBLSE), passant de 1% en 2004 à toujours disponibles simultanément, et l’appariement plus de 10% en 2015 [25]. Toutefois, d’autres germes ré- des bases entraîne l’intégration du dNTP prédéterminé sistants gagnent également du terrain, notamment les par le brin modèle. Le signal fluorescent spécifique à entérobactéries productrices de carbapénèmases (EPC) tout dNTP permet d’identifier chaque dNTP intégré. et les bactéries à Gram négatif non fermentaires ou la Etant donné que le colorant fluorescent bloque l’extré- résistance plasmatique à la colistine chez E. coli [26]. Les mité 3’ de la base intégrée, seule une base peut être germes multirésistants représentent une grande me- ­intégrée lors de chaque étape. Pour séquencer la base nace pour la médecine moderne et leur propagation suivante, le colorant peut faire l’objet d’un clivage doit être empêchée. Différentes méthodes de typage chimique et l’extrémité 3’ peut être libérée pour l’étape sont disponibles pour déterminer les liens entre les dif- de réaction suivante. Ainsi, au cours des cycles de sé- férents isolats et la clonalité. Les données sont ensuite quençage, la séquence de nucléotides est mesurée analysées afin d’établir une phylogénie (arbre de parenté étape par étape. A l’inverse, la technologie Ion Torrent™ entre les pathogènes). SWISS MEDICAL FORUM – FORUM MÉDICAL SUISSE 2017;17(15–16):348–355 351 Article de revue Les méthodes de typage courantes sont l’électrophorèse «Simpson’s Index of Diversity», une valeur de 1,0 repré- sur gel en champ pulsé («pulsed-field gel electrophore- sentant le pouvoir discriminant maximal. sis», PFGE), le typage par séquençage multilocus («mul- En comparant le génome entier de différents patho- tilocus sequence typing», MLST), le «spa-typing» pour gènes, le WGS offre un pouvoir discriminant maximal S. aureus et le ribotypage pour Clostridium difficile. Ces pour déterminer les liens de parenté. Les gènes qui technologies se caractérisent par des pouvoirs discri- sont présents chez toutes les bactéries d’une espèce minants différents et par une charge de travail variable sont assignés au «génome cœur» («core genome») et pour le laboratoire (tab. 1). Le pouvoir discriminant est comparés entre eux. Les gènes qui ne sont pas présents mesuré au moyen d’un index de diversité, par ex. le chez toutes les bactéries de cette espèce, comme par ex. certains gènes de résistance, sont assignés au «gé- Tableau 1: Comparaison de différentes méthodes de typage: PFGE = électrophorèse sur gel en champ pulsé, MLST = «mutilocus sequence typing», WGS = «whole genome sequencing», SI = «Simpsons Index of Diversity» Les coûts sont définis sur la base de la liste des analyses au moyen des positions de PCR pour la mise en évidence d’un gène. Méthode Germes Délai d’exécution Coûts en CHF Pouvoir par échandiscriminant tillon (SI diversity) Références pris en compte dans l’analyse initiale. La comparaison entre les isolats se base généralement sur le génome cœur, comme c’est le cas lors d’une analyse de type MLST, mais cependant avec un centuple des gènes («core genome MLST»). PFGE Multiples 1 semaine 180 0,87–0,99 [27–30] MLST Multiples 1 semaine 180–360 0,9–0,95 [27, 28, 31] 3–4 jours 180 – – Ribotypage Cl. difficile nome accessoire» («accessory genome») et ne sont pas spa-typing S. aureus 3–4 jours 180 0,95 [30] WGS Multiples 3–4 jours 540 0,99 – La comparaison directe d’isolats permet ainsi de détecter des mutations ponctuelles individuelles («single nucleotide polymorphisms», SNP) entre les bactéries. Cette approche est utile pour représenter avec une très grande précision les liens de parenté (cf. exemple dans la fig. 2). Une chaîne de transmission peut être reconstituée de patient à patient et venir compléter les données épidémiologiques. Cette méthode fonctionne déjà très bien pour le SARM [32–37], pour Enterococcus faecium [38], pour les EBLSE [17, 39–41], pour les EPC [42–45], pour Neisseria meningi­ tidis [46], pour Mycobacterium tuberculosis [47–50] et pour beaucoup d’autres agents pathogènes. Etant donné que le taux de mutation spontanée de nombreuses espèces bactériennes est connu, cette ­méthode permet également d’évaluer la dynamique de transmission et la temporalité, ce qui constitue une valeur ajoutée supplémentaire. Ces éléments permettent dans le contexte d’une épidémie de déterminer une source ou un facteur de risque potentiel, en fonction de l’espèce bactérienne détectée, dans un cadre temporel de quelques semaines [51]. Détection de facteurs de virulence Les facteurs de virulence influencent fortement la pathogénicité des bactéries. Ils constituent une modalité essentielle pour garantir la transmission à de nouveaux hôtes, par ex. par le biais de facteurs d’adhésion qui se lient à l’épithélium de l’hôte ou à d’autres surfaces [52]. Les facteurs de virulence peuvent également aider les bactéries à vaincre d’autres espèces concurrentes en ce Figure 2: Typage basé sur le «whole genome sequencing» d’isolats de SARM. Trois ­clusters sont visibles: vert, jaune et rouge. Les chiffres désignent le nombre d’altérations génétiques (SNP ou différences d’allèles). Le SARM a besoin d’env. 8 semaines par SNP. SARM = Staphylococcus aureus résistant à la méticilline; SNP = «single nucleotide ­p olymorphisms». SWISS MEDICAL FORUM – FORUM MÉDICAL SUISSE 2017;17(15–16):348–355 qui concerne l’approvisionnement en nutriments [53]. La pathogénicité dans l’hôte humain est aussi fortement influencée par des facteurs de virulence, comme c’est par ex. le cas de la toxine du syndrome du choc toxique pour S. aureus, de la toxine cholérique (respon- 352 Article de revue sable de diarrhée) pour Vibrio cholerae ou des toxines ­traitement efficace, mais elle confère également une responsables de diphtérie pharyngée pour Coryne­ compréhension épidémiologique face à la propagation bacterium diphtheriae. La diversité des facteurs de actuellement très rapide de bactéries multirésistantes. virulence bactérienne est immense [52–56], mais Différentes méthodes phénotypiques et génotypiques ­l’influence de facteurs individuels sur l’évolution de la sont disponibles à cet effet au laboratoire de micro­ maladie est bien souvent insuffisamment décrite. Fait biologie. La grande diversité de gènes codant pour les particulièrement important pour la pratique clinique, BLSE, l’AmpC et les carbapénémases s’oppose toutefois des tests de PCR sont uniquement disponibles pour un à la disponibilité d’une PCR spécifique pour chaque faible nombre de facteurs de virulence, et ce, la plupart gène. Là aussi, le WGS peut s’avérer très utile et appor- du temps dans des centres de référence. A l’heure ter un éclaircissement définitif. La figure 3 illustre ce ­actuelle, les multiples propriétés des bactéries ne sont cas de figure à l’exemple de la carbapénémase de type également pas encore prises en compte dans le proces- IMI-1, qui a pu être détectée par WGS mais fait défaut sus de décision clinique et, en raison des progrès tech- dans les tests diagnostiques courants. niques accomplis dans la biologie moléculaire et la Le plus grand bénéfice clinique concerne toutefois les ­microbiologie, le nombre de facteurs de virulence ne bactéries à croissance lente, telles que Mycobacterium cessent d’augmenter. En cas de réaction médiée par tuberculosis. Les résultats du test de résistance phéno- une toxine, la durée nécessaire à l’obtention du résul- typique sont uniquement disponibles tardivement, tat de la PCR est bien souvent trop longue pour influen- retardant ainsi l’initiation d’un traitement anti­ cer la décision clinique. Le syndrome de choc toxique biotique optimal précisément pour les isolats de M. tu­ dans le cadre d’une infection à S. aureus en est un bon berculosis multirésistants. La méthode de WGS per- exemple. Dans ce cas de figure, le choix de l’antibio­ mettrait ici d’obtenir des résultats nettement plus thérapie est initialement dicté par les symptômes cli- rapidement par analyses de séquences des gènes de niques et la toxine n’est généralement que déterminée résistance et ce, même directement à partir d’un rétrospectivement. La présence de la toxine du syn- échantillon du patient [57–60]. Cela serait semblable à drome de choc toxique peut toutefois être responsable une méthode déjà utilisée dans les laboratoires d’une réponse immunitaire excessive et de compli­ ­spécialisés pour M. tuberculosis consistant à tester les cations massives. Il en est de même pour d’autres fac- résistances par PCR/hybridation. Le WGS fournit tou- teurs de virulence, comme les facteurs d’adhésion, qui tefois nettement plus d’informations génétiques, car n’ont jusqu’à présent guère d’influence sur le processus il ne se contente pas d’analyser des gènes isolés. Les de décision clinique. Grâce aux données génomiques, chercheurs tentent actuellement de rendre le test de il est déjà possible aujourd’hui pour S. aureus d’identi- résistance génotypique encore plus précis par ce biais fier jusqu’à 60 facteurs de virulence différents, et ce et de déterminer les antibiorésistances par test gé­ sans grands moyens techniques. Cela permet d’évaluer notypique pour les patients présentant des infections précisément le risque individuel d’un patient par ex. mixtes. En outre, les informations fournies par le en ce qui concerne les complications potentielles (for- WGS peuvent être utilisées à des fins épidémiolo- mation de biofilms ou d’abcès, choc et risques de trans- giques. mission, etc.). En ce qui concerne C. diphtheriae, outre Il est également possible de comprendre les méca- la toxine diphtérique, des facteurs d’adhésion majeurs nismes de résistance par le biais de la génétique fonc- pour l’épithélium pharyngé peuvent également être tionnelle. La détection de pertes de porines pour les mis en évidence. Ce sont précisément ces isolats com- entérobactéries et les bactéries à Gram négatif non portant les deux facteurs de virulence qui doivent faire fermentaires, telles que Pseudomonas aeruginosa, ­ l’objet d’une attention particulière. La concertation constituait jusqu’à présent un diagnostic d’exclusion. avec des confrères spécialisés en infectiologie, en hy- Un profil de résistance phénotypique a été comparé giène hospitalière et en médecine intensive occupera ­génotypiquement avec un large spectre de PCR indi­ une place de plus en plus déterminante à l’avenir afin viduelles et finalement, après avoir éliminé tous les que les multiples informations microbiologiques ­résultats négatifs, la possibilité d’une perte de porines puissent être utilisées de manière optimale pour une a été envisagée. Les pertes de porines sont actuelle- prise en charge individuelle des patients. ment plus fréquentes que les résistances aux carba­ pénèmes médiées par un plasmide. L’analyse par WGS Détection de mécanismes de résistance permet d’annoter les mutations par ex. dans le gène oprD de P. aeruginosa et l’influence sur la perméabilité L’élucidation d’un mécanisme de résistance est essen- de la porine pour les carbapénèmes peut être directe- tielle, car elle permet non seulement d’assurer un ment postulée (fig. 4). SWISS MEDICAL FORUM – FORUM MÉDICAL SUISSE 2017;17(15–16):348–355 353 Article de revue Figure 3: Evaluation moléculaire de carbapénémases par «whole genome sequencing» (WGS). Cet exemple illustre un domaine d’application potentiel du WGS dans l’évaluation de carbapénémases. Dans ce cas, une bactérie Enterobacter cloacae a été isolée (1). Le test d’antibiorésistance phénotypique (2) a suggéré une production de carbapénémases. Pour déterminer de quels types de carbapénémases il s’agit, un test génotypique (3) au moyen d’un test de PCR rapide disponible dans le commerce (GeneXpert ®, Cepheid) a été réalisé. Ce test n’est néanmoins pas parvenu à identifier les carbapénémases, car le panel ne contient que les carbapénémases les plus fréquentes. Ensuite, l’isolat a été séquencé au moyen d’un séquenceur Illumina® MiSeq en mode 2 × 300 bp paired-end. Le génome a été assemblé et comparé à une banque de données du NCBI contenant les carbapénémases (5). Cette comparaison de séquences a fourni une concordance avec une carbapénémase de type IMI-1, expliquant ainsi la résistance observée. Défis et limitations du WGS dans la ­microbiologie clinique Des banques de données plus grandes et centrales sont également nécessaires en Suisse, afin de permettre une surveillance des agents pathogènes virulents et résis- Bien que les coûts aient dans l’ensemble nettement tants au-delà des frontières cantonales. Les avantages baissé, le séquençage d’un génome est encore relative- sont évidents: étant donné que les patients vont et ment onéreux. Avec le développement continu de la viennent entre les hôpitaux et les autres institutions technologie, les coûts des réactifs devraient diminuer de santé, ils sont exposés à de possibles agents patho- au cours des prochaines années. S’y ajoutent toutefois gènes et il y a un risque d’échange d’agents pathogènes. des coûts supplémentaires, tels que l’amortissement De même, de nombreux agents pathogènes multiré­ des appareils, la bioinformatique sophistiquée avec ses sistants arrivent en Suisse en raison des déplacements logiciels et ses experts analytiques, ainsi que la charge croissants de la population et des migrations. Une de travail du personnel de laboratoire. La bioinforma- banque de données centralisée permettrait finalement tique représente aujourd’hui incontestablement le plus aussi de faire des économies au niveau du diagnostic grand défi. Les analyses sont extrêmement complexes spécialisé en évitant de réaliser de multiples examens et requièrent une expertise correspondante et une pour un seul et même problème. Grâce à une banque ­formation spécialisée. Le personnel compétent est dif- de données, il est également possible de définir des ficile à trouver. processus d’analyse efficaces et de communiquer de SWISS MEDICAL FORUM – FORUM MÉDICAL SUISSE 2017;17(15–16):348–355 Article de revue 354 Figure 4: Evaluation d’une perte de porines. Au test d’antibiorésistance phénotypique, un isolat de Pseudomonas aeruginosa a montré (A) une résistance au méropénème et à l’imipénème. Cela ­suggère une perte de porines sur le plan phénotypique. En outre, une résistance aux antibiotiques bêtalactamines pipéracilline–tazobactam et ceftazidime a été observée. Etant donné que la bactérie P. aeruginosa est porteuse d’une β-lactamase chromosomique, le gène ampC, qui n’est toutefois pas exprimée, il a été soupçonné que l’expression du gène ampC a été induite («dérépression»). Dans la mesure où aucune méthode phénotypique n’était disponible, l’isolat a été séquencé au moyen d’un séquenceur Illumina® MiSeq en mode 2 × 300 bp paired-end. Cette analyse a révélé une mutation ponctuelle au niveau du gène ampR (B), probablement à l’origine d’un déficit fonctionnel du gène. Le gène ampR code pour le répresseur, qui inhibe la formation de la β-lactamase AmpC. Cela explique directement la résistance aux antibiotiques pipéracilline–tazobactam et ceftazidime. Une mutation supplémentaire a été détectée dans le gène oprD (C). Le gène oprD code pour une porine dans la membrane cellulaire externe de P. aeruginosa, par laquelle non seulement les glucides mais également les carbapénèmes méropénème et imipénème atteignent l’espace membranaire, leur site d’action. Une mutation ponctuelle de C, dans une souche de référence sensible, en T dans une souche résistante, est à l’origine d’un codon-stop et ainsi d’une délétion du feuillet bêta à l’extrémité C-terminale. Comme la porine forme un tonneau bêta (D) [62], qui est intégré dans la membrane, cette délétion entraîne une déstabilisation et une perte de fonction de la protéine. Grâce à la spectrométrie de masse en tandem, nous sommes parvenus à démontrer, en collaboration avec l’équipe de recherche du Prof. Dirk Bumann, du biocentre de l’université de Bâle, que bien que la protéine soit détectable dans des souches sensibles, elle ne peut plus être détectée dans les souches résistantes. L’absence de la porine explique ainsi la résistance au méropénème et à l’imipénème, car les deux anti­ biotiques ne peuvent plus parvenir à leur site d’action. SWISS MEDICAL FORUM – FORUM MÉDICAL SUISSE 2017;17(15–16):348–355 355 Article de revue manière plus efficiente des informations essentielles sibles aux cliniciens. Dans le cas d’une étude épidémio- PD Dr méd. Dr phil. pour la santé publique. logique, il est possible d’établir une phylogénie des Adrian Egli Outre les défis personnels et logistiques, il y a égale- isolats analysés avec interprétation des liens de pa- ment des défis techniques majeurs, comme par ex. les renté, qui est une pratique déjà courante pour d’autres fragments d’ADN courts. Précisément pour l’analyse de méthodes. Pour les analyses des antibiorésistances et plasmides, qui ont des séquences d’ADN nettement plus des facteurs de virulence, il faudra à l’avenir établir un courtes mais présentent un nombre particulièrement rapport interprétable de manière intuitive, qui en- élevé de séquences répétées difficiles à séquencer sur le globe les principaux facteurs de virulence et fournit plan technique, les séquençages de fragments d’ADN une aide aux cliniciens pour l’interprétation. plus longs sont essentiels. A cet effet, des appareils basés Des essais scientifiques tentent déjà actuellement sur les nanopores, tels que PacBio® ou MinIon, entrent d’identifier des agents pathogènes, tels que bactéries, en ligne de compte [61]. virus ou champignons, par WGS à partir de prélève- Un autre aspect essentiel est la manière dont les don- ments du patient, sans mise en culture, et de détermi- nées complexes du WGS peuvent être rendues acces- ner en parallèle les antibiorésistances. Il s’agit d’un do- Correspondance: Abteilung Klinische Mikrobiologie Universitätsspital Basel Petersgraben 4 CH-4031 Basel adrian.egli[at]usb.ch maine en rapide évolution, dont l’utilisation se limite L’essentiel pour la pratique • Le séquençage du génome entier de bactéries permet de représenter leurs modes de transmission avec un pouvoir discriminant très élevé et de tirer des conclusions temporelles quant à leur dynamique de transmission. Ce pouvoir discriminant ne peut pas être atteint avec les méthodes de typage classiques. • En outre, de très nombreuses résistances peuvent être détectées et comprises d’un point de vue fonctionnel à partir des informations génétiques. • Il est également possible de déterminer un vaste nombre de facteurs de virulence et de les associer au tableau clinique, permettant ainsi d’acquérir une meilleure compréhension des maladies. • Au vu des grandes quantités de données qui seront disponibles à l’avenir, la collaboration entre le laboratoire et les médecins traitants deviendra de plus en plus importante afin que les informations supplémentaires disponibles puissent également être utilisées de manière optimale dans le contexte clinique. SWISS MEDICAL FORUM – FORUM MÉDICAL SUISSE 2017;17(15–16):348–355 toutefois encore principalement au cadre scientifique. Il reste des difficultés à résoudre, comme par ex. l’évaluation correcte des agents pathogènes dans les échantillons de patients avec infections mixtes. Dans ce contexte, il est particulièrement intéressant que le WGS fournisse également des données quantitatives qui permettent de quantifier les espèces identifiées, livrant ainsi des informations complémentaires quant à d’éventuels germes dominants. Il sera captivant de suivre l’évolution dans ce domaine. Disclosure statement Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts financier ou personnel en rapport avec cet article. Références La liste complète des références est disponible dans la version en ligne de l’article sur www.medicalforum.ch LITERATUR / RÉFÉRENCES Online-Appendix Références 1 Burnham CA, Dunne WM, Jr., Greub G, Novak SM, Patel R. Automation in the clinical microbiology laboratory. Clinical chemistry. 2013;59(12):1696–702. 2 Croxatto A, Prod’hom G, Faverjon F, Rochais Y, Greub G. Laboratory automation in clinical bacteriology: what system to choose? Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2016;22(3):217–35. 3 Dierig A, Frei R, Egli A. The fast route to microbe identification: matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Pediatr Infect Dis J. 2015;34(1):97–9. 4 Gautier M, Ranque S, Normand AC, et al. MALDI-TOF mass spectrometry: revolutionising clinical laboratory diagnosis of mould infections. Clinical microbiology and infection: the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2014. 5 Egli A, Osthoff M, Goldenberger D, et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF) directly from positive blood culture flasks allows rapid identification of bloodstream infections in immunosuppressed hosts. Transpl Infect Dis. 2015;17(3):481–7. 6 Huh HJ, Park KS, Kim JY, et al. Comparison of the Anyplex(TM) II RV16 and Seeplex((R)) RV12 ACE assays for the detection of respiratory viruses. Diagnostic microbiology and infectious disease. 2014;79(4):419–21. 7 Leber AL, Everhart K, Balada-Llasat JM, et al. Multicenter Evaluation of the BioFire FilmArray Meningitis Encephalitis Panel for the Detection of Bacteria, Viruses and Yeast in Cerebrospinal Fluid Specimens. Journal of clinical microbiology 2016. 8 Deng X, den Bakker HC, Hendriksen RS. Genomic Epidemiology: Whole-Genome-Sequencing-Powered Surveillance and Outbreak Investigation of Foodborne Bacterial Pathogens. Annual review of food science and technology. 2016;7:353–74. 9 Gilchrist CA, Turner SD, Riley MF, Petri WA, Jr., Hewlett EL. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin Microbiol Rev. 2015;28(3):541–63. 10 Knight DR, Elliott B, Chang BJ, Perkins TT, Riley TV. Diversity and Evolution in the Genome of Clostridium difficile. Clin Microbiol Rev. 2015;28(3):721–41. 11 Punina NV, Makridakis NM, Remnev MA, Topunov AF. Whole--genome sequencing targets drug-resistant bacterial infections. Human genomics. 2015;9:19. 12 Takiff HE, Feo O. Clinical value of whole-genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Lancet Infect Dis. 2015;15(9):1077–90. 13 Fournier PE, Drancourt M, Colson P, Rolain JM, La Scola B, Raoult D. Modern clinical microbiology: new challenges and solutions. Nat Rev Microbiol. 2013;11(8):574–85. 14 Janda JM, Abbott SL. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of clinical microbiology. 2007;45(9):2761–4. 15 Albiger B, Glasner C, Struelens MJ, Grundmann H, Monnet DL. European Survey of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae working g. Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Europe: assessment by national experts from 38 countries, May 2015. Euro surveillance : bulletin Europeen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin. 2015;20(45). 16 Babouee B, Widmer AF, Dubuis O, et al. Emergence of four cases of KPC-2 and KPC-3-carrying Klebsiella pneumoniae introduced to Switzerland, 2009-10. Euro surveillance : bulletin Europeen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin. 2011;16(11). 17 Woerther PL, Angebault C, Lescat M, et al. Emergence and dissemination of extended-spectrum beta-lactamaseproducing Escherichia coli in the community: lessons from the study of a remote and controlled population. SWISS MEDICAL FORUM J Infect Dis. 2010;202(4):515–23. 18 Bakour S, Sankar SA, Rathored J, Biagini P, Raoult D, Fournier PE. Identification of virulence factors and antibiotic resistance markers using bacterial genomics. Future microbiology. 2016;11:455–66. 19 Dallman TJ, Byrne L, Ashton PM, et al. Whole-genome sequencing for national surveillance of Shiga toxinproducing Escherichia coli O157. Clin Infect Dis. 2015;61(3):305–12. 20 Shukla SK, Pantrangi M, Stahl B, et al. Comparative wholegenome mapping to determine Staphylococcus aureus genome size, virulence motifs, and clonality. Journal of clinical microbiology 2012;50(11):3526–33. 21 Kwong JC, McCallum N, Sintchenko V, Howden BP. Whole genome sequencing in clinical and public health microbiology. Pathology. 2015;47(3):199–210. 22 Pallen MJ, Loman NJ, Penn CW. High-throughput sequencing and clinical microbiology: progress, opportunities and challenges. Current opinion in microbiology. 2010;13(5):625–31. 23 Frank C, Werber D, Cramer JP, et al. Epidemic profile of Shiga-toxin-producing Escherichia coli O104:H4 outbreak in Germany. N Engl J Med. 2011;365(19):1771–80. 24 Rasko DA, Webster DR, Sahl JW, et al. Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic-uremic syndrome in Germany. N Engl J Med. 2011;365(8):709–17. 25 Anresis.ch. Anresis.ch: Meldungen ausgewählter multireistenter Mikroorganismen in der Schweiz. BAG Bulletin. 2015;27:510–1. 26 Liu YY, Wang Y, Walsh TR, et al. Emergence of plasmidmediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study. Lancet Infect Dis 2015. 27 Peacock SJ, de Silva GD, Justice A, et al. Comparison of multilocus sequence typing and pulsed-field gel electrophoresis as tools for typing Staphylococcus aureus isolates in a microepidemiological setting. Journal of clinical microbiology. 2002;40(10):3764–70. 28 Johnson JK, Arduino SM, Stine OC, Johnson JA, Harris AD. Multilocus sequence typing compared to pulsed-field gel electrophoresis for molecular typing of Pseudomonas aeruginosa. Journal of clinical microbiology. 2007;45(11):3707–12. 29 Ross IL, Heuzenroeder MW. A comparison of two PCRbased typing methods with pulsed-field gel electrophoresis in Salmonella enterica serovar Enteritidis. International journal of medical microbiology: IJMM. 2009;299(6):410–20. 30 Babouee B, Frei R, Schultheiss E, Widmer AF, Goldenberger D. Comparison of the DiversiLab repetitive element PCR system with spa typing and pulsed-field gel electrophoresis for clonal characterization of methicillinresistant Staphylococcus aureus. Journal of clinical microbiology. 2011;49(4):1549–55. 31 Duarte A, Seliwiorstow T, Miller WG, et al. Discriminative power of Campylobacter phenotypic and genotypic typing methods. Journal of microbiological methods. 2016;125: 33–9. 32 Bartels MD, Larner-Svensson H, Meiniche H, et al. Monitoring meticillin resistant Staphylococcus aureus and its spread in Copenhagen, Denmark, 2013, through routine whole genome sequencing. Euro surveillance : bulletin Europeen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin. 2015;20(17). 33 Hamed M, Nitsche-Schmitz DP, Ruffing U, et al. Whole genome sequence typing and microarray profiling of nasal and blood stream methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates: Clues to phylogeny and invasiveness. Infection, genetics and evolution: journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases. 2015;36:475–82. 34 Harris SR, Cartwright EJ, Torok ME, et al. Whole-genome LITERATUR / RÉFÉRENCES Online-Appendix 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 SWISS MEDICAL FORUM sequencing for analysis of an outbreak of meticillinresistant Staphylococcus aureus: a descriptive study. Lancet Infect Dis. 2013;13(2):130–6. Harrison EM, Paterson GK, Holden MT, et al. Whole genome sequencing identifies zoonotic transmission of MRSA isolates with the novel mecA homologue mecC. EMBO Mol Med. 2013;5(4):509–15. Koser CU, Holden MT, Ellington MJ, et al. Rapid wholegenome sequencing for investigation of a neonatal MRSA outbreak. N Engl J Med. 2012;366(24):2267–75. Ugolotti E, Larghero P, Vanni I, et al. Whole-genome sequencing as standard practice for the analysis of clonality in outbreaks of meticillin-resistant Staphylococcus aureus in a paediatric setting. The Journal of hospital infection 2016. Brodrick HJ, Raven KE, Harrison EM, et al. Whole-genome sequencing reveals transmission of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in a healthcare network. Genome medicine. 2016;8(1):4. Haller S, Eller C, Hermes J, et al. What caused the outbreak of ESBL-producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit, Germany 2009 to 2012? Reconstructing transmission with epidemiological analysis and whole-genome sequencing. BMJ open. 2015;5(5):e007397. Schaufler K, Semmler T, Wieler LH, et al. Clonal spread and interspecies transmission of clinically relevant ESBLproducing Escherichia coli of ST410--another successful pandemic clone? FEMS microbiology ecology. 2016;92(1). Valentin L, Sharp H, Hille K, et al. Subgrouping of ESBLproducing Escherichia coli from animal and human sources: an approach to quantify the distribution of ESBL types between different reservoirs. International journal of medical microbiology: IJMM. 2014;304(7):805–16. Marsh JW, Krauland MG, Nelson JS, et al. Genomic Epidemiology of an Endoscope-Associated Outbreak of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)-Producing K. pneumoniae. PLoS One. 2015;10(12):e0144310. Jiang Y, Wei Z, Wang Y, Hua X, Feng Y, Yu Y. Tracking a hospital outbreak of KPC-producing ST11 Klebsiella pneumoniae with whole genome sequencing. Clinical microbiology and infection: the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2015;21(11):1001–7. Khong WX, Xia E, Marimuthu K, et al. Local transmission and global dissemination of New Delhi Metallo-BetaLactamase (NDM): a whole genome analysis. BMC genomics. 2016;17(1):452. Wu W, Feng Y, Carattoli A, Zong Z. Characterization of an Enterobacter cloacae Strain Producing both KPC and NDM Carbapenemases by Whole-Genome Sequencing. Antimicrob Agents Chemother. 2015;59(10):6625–8. Mustapha MM, Marsh JW, Krauland MG, et al. Genomic Epidemiology of Hypervirulent Serogroup W, ST-11 Neisseria meningitidis. EBioMedicine. 2015;2(10):1447–55. Mokrousov I, Chernyaeva E, Vyazovaya A, Sinkov V, Zhuravlev V, Narvskaya O. Next-Generation Sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Emerging infectious diseases. 2016;22(6):1127–9. 48 Nikolayevskyy V, Kranzer K, Niemann S, Drobniewski F. Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis for detection of recent transmission and tracing outbreaks: A systematic review. Tuberculosis. 2016;98:77–85. 49 Pankhurst LJ, Del Ojo Elias C, Votintseva AA, et al. Rapid, comprehensive, and affordable mycobacterial diagnosis with whole-genome sequencing: a prospective study. The Lancet Respiratory medicine. 2016;4(1):49–58. 50 Stucki D, Ballif M, Egger M, et al. Standard Genotyping Over-estimates Transmission of Mycobacterium tuberculosis among Immigrants in a Low-Incidence Country. Journal of clinical microbiology. 2016;54(7): 1862–70. 51 Aandahl RZ, Stadler T, Sisson SA, Tanaka MM. Exact vs. approximate computation: reconciling different estimates of Mycobacterium tuberculosis epidemiological parameters. Genetics. 2014;196(4):1227–30. 52 Brouwer S, Barnett TC, Rivera-Hernandez T, Rohde M, Walker MJ. Streptococcus pyogenes adhesion and colonization. FEBS letters 2016. 53 Basler M. Type VI secretion system: secretion by a contractile nanomachine. Philosophical transactions of the Royal Society of London Series B, Biological sciences. 2015;370(1679). 54 do Vale A, Cabanes D, Sousa S. Bacterial Toxins as Pathogen Weapons Against Phagocytes. Frontiers in microbiology. 2016;7:42. 55 Flores-Diaz M, Monturiol-Gross L, Naylor C, Alape-Giron A, Flieger A. Bacterial Sphingomyelinases and Phospholipases as Virulence Factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 2016;80(3):597–628. 56 Kedzierska B, Hayes F. Emerging Roles of Toxin-Antitoxin Modules in Bacterial Pathogenesis. Molecules. 2016;21(6). 57 Arnold A, Witney AA, Vergnano S, et al. XDR-TB transmission in London: Case management and contact tracing investigation assisted by early whole genome sequencing. J Infect 2016. 58 Datta G, Nieto LM, Davidson RM, et al. Longitudinal whole genome analysis of pre and post drug treatment Mycobacterium tuberculosis isolates reveals progressive steps to drug resistance. Tuberculosis. 2016;98:50–5. 59 Javid B, Torok ME. Whole-genome sequencing for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 2016;16(1):17. 60 Witney AA, Cosgrove CA, Arnold A, Hinds J, Stoker NG, Butcher PD. Clinical use of whole genome sequencing for Mycobacterium tuberculosis. BMC medicine. 2016;14:46. 61 Rhoads A, Au KF. PacBio Sequencing and Its Applications. Genomics, proteomics & bioinformatics. 2015;13(5):278–89. 62 Eren E, Vijayaraghavan J, Liu J, et al. Substrate specificity within a family of outer membrane carboxylate channels. PLoS biology. 2012;10(1):e1001242..
