Le cycle infectieux du VHC est dépendant de la voie de synthèse

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brèves
S. Pillet
Laboratoire
de bactériologie-virologie
Faculté de médecine
Jacques Lisfranc
CHU de Saint-Etienne
souches d’HEV-C (CV-A13 et CV-A17) et une souche d’HEV-D (EV70). Ils
ont également retrouvé des virus récemment identifiés : un EV76 (HEV-A),
un EV77 (HEV-B) et un EV81 (HEV-B). Pour cinq souches, isolées chez des
enfants âgés de 2 à 13 ans, la région codant VP1 possédait une homologie
de séquence nucléotidique inférieure à 70 %, comparée aux souches connues faisant
suspecter qu’il s’agissait de nouveaux entérovirus. Deux d’entre elles étaient proches
des HEV-D et constituent deux isolats d’un nouvel entérovirus, EV94. Les trois
autres appartiennent à l’espèce HEV-B et constituent trois isolats du nouvel entérovirus EV93. À noter que ces trois souches ont été isolées chez des patients vivant
dans des régions géographiques distantes, faisant suspecter une large répartition de
ce nouvel HEV.
Le PV de type 1 reste une cause importante de paralysie flasque aiguë, notamment
lorsque la vaccination n’est pas assurée, comme ce fut le cas en 2000 en République
démocratique du Congo. D’autres entérovirus, l’E11 et le CV-A24 dans cette étude,
mais aussi l’EV71 (non retrouvé dans cette étude) et/ou des adénovirus, peuvent
également être isolés chez ces patients souffrant de paralysie flasque aiguë. Les coinfections pourraient être associées à des formes cliniques plus sévères. L’analyse des
souches circulantes d’HEV par des méthodes moléculaires a permis, encore une fois,
de mettre en évidence de nouveaux variants, enrichissant encore le genre Entérovirus.
Enfin, ce travail a, pour la première fois depuis 30 ans, identifié une nouvelle souche
de l’espèce HEV-D.
Référence
1. Junttila N, Leveque N, Kabue JP, et al. New enteroviruses, EV-93 and EV-94, associated with acute
flaccid paralysis in the Democratic Republic of the Congo. J Med Virol 2007, 79 : 393-400.
Le cycle infectieux du VHC est dépendant de la voie
de synthèse des VLDL dans l’hépatocyte humain
Mots clés :
virus de l’hépatite C, VLDL,
hépatocyte humain
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Le VHC se réplique, dans le cytoplasme des hépatocytes qu’il infecte, au sein de
structures membranaires associées au réticulum endoplasmique (RE). Ces structures, contenant le complexe de réplication du virus, ont pu être observées dans la
lignée hépatocytaire Huh7 transfectées avec un réplicon subgénomique du VHC.
Le réplicon est un ARN, construit à partir du génome du VHC, ne permettant la
synthèse que des protéines non structurales du VHC nécessaires à la réplication de
l’ARN, il n’y a donc pas de formation de particules virales. Les auteurs de ce travail
remarquable ont tout d’abord utilisé des cellules Huh7 contenant un réplicon particulier permettant l’expression d’une protéine non structurale NS5A marquée par la
GFP. Cette particularité va leur permettre de réaliser une immunocapture, à l’aide
d’anticorps anti-GFP couplés à des billes magnétiques, des vésicules de réplication présents dans des homogénats de cellules contenant le réplicon. L’analyse par
western-blot des protéines localisées dans les vésicules de réplication immunocaptés
a permis de confirmer la présence des protéines non structurales du VHC (NS5A,
NS3, NS4B et NS5B). L’utilisation d’anticorps contre les marqueurs spécifiques de
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la membrane plasmique (cadherine), du RE (calnexine), du Golgi (Copi), des endosomes (EEA1) et des mitochondries (prohibitine) a permis de confirmer la spécificité
et la qualité de l’immunocapture. L’ARN-VHC a aussi été amplifié et dosé par RTPCR quantitative à partir des fractions libres et immunocaptées. C’est ainsi que la
part d’ARN-VHC associé aux structures vésiculaires correspond à 40 % de l’ARNVHC cellulaire total, contre seulement 2 % pour deux ARN cellulaires (36B4 et Bip)
amplifiés parallèlement en contrôle. Ces points établis, une analyse par spectrométrie
de masse en tandem des protéines cellulaires présentes dans ces vésicules contenant
le complexe de réplication du VHC a ensuite été réalisée. Plus de 30 % des protéines
identifiées dans ces structures sont impliquées dans le métabolisme des lipides. La
microsomal triglycerides transfert protein (MTP) et l’apolipoprotéine E (apoE)
sont deux des protéines parmi celles identifiées, qui ont été retenues pour la suite de
l’étude pour l’importance de leur rôle au cours de la synthèse des VLDL. Curieusement, l’apolipoprotéine B (apoB), qui est aussi un constituant majeur des VLDL, n’a
pu être identifiée par cette technique, peut-être à cause de son haut poids moléculaire
(540 kDa) et/ou de son hydrophobicité. La présence d’apoB et sa colocalisation avec
NS5A dans les vésicules de réplication des cellules Huh7 ont été mises en évidence
par immunofluorescence.
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Afin de déterminer l’origine (réticulum ou appareil de Golgi) des vésicules renfermant
le complexe de réplication du VHC, les auteurs ont analysé leur susceptibilité à un
traitement par l’endoglycosidase H (endo H), qui ne sera capable de couper les sucres
que des protéines localisées dans le RE à l’exclusion de celles des compartiments
post-Golgi et à la peptide-N-glycosidase F (PNGase F) qui ne fait aucune distinction
de localisation subcellulaire dans sa capacité à digérer les carbohydrates. Cette analyse
a permis de conclure que les vésicules permettant la réplication du VHC se forment à
partir du réticulum et n’atteignent pas l’appareil de Golgi.
Le fait de retrouver l’apoB, l’apoE et la MTP colocalisées dans le complexe de réplication du virus suggère une compartimentalisation commune avec celle assurant la
maturation des VLDL. Pour vérifier cette hypothèse, les auteurs ont utilisé le BMS2101038, un inhibiteur chimique de la MTP qui provoque la dégradation accélérée
de l’apoB en inhibant le transfert MTP-dépendant des lipides vers l’apoB. Le traitement des cellules réplicon avec 10 nM d’inhibiteur bloque complètement la sécrétion
d’apoB alors que la réplication de l’ARN-VHC demeure inchangée. La sécrétion des
VLDL est donc indépendante de la réplication de l’ARN-VHC. Le modèle réplicon
ne permettant pas la production de particules virales, les auteurs ont utilisé pour la
suite de l’étude la cellule Huh7-GL, dérivée de la lignée Huh7, qui possède l’ADNc
complet du VHC intégré dans son génome ce qui conduit à la production constitutive
de particules virales infectieuses. En présence d’inhibiteur de la MTP, la sécrétion
d’apoB par ces cellules a été bloquée et dans le même temps le titre de virus libéré
dans le surnageant de culture a lui aussi chuté de 80 % (la production d’ARN intracellulaire demeurant comparable en présence et en l’absence d’inhibiteur de MTP).
L’inhibiteur de la MTP provoque donc un effet négatif important sur la production
du virus.
Afin de confirmer que l’effet observé sur la production du VHC était bien dû à une
inhibition de la MTP, une expérience de silencing utilisant des siRNA visant l’apoB
a été réalisée qui conduit bien à une inhibition de la sécrétion d’apoB et, parallèlement, à une chute de 50 à 70 % de la production de virus, dépendant de la méthode
de quantification.
De nombreuses données expérimentales aussi bien que cliniques permettaient jusqu’à
présent de discerner une étroite relation entre le cycle réplicatif du virus de l’hépatite
C (VHC) et le métabolisme des lipides sans qu’il soit possible d’en définir clairement
l’origine. Lors les tentatives d’isolement du VHC à partir de plasmas de sujets infectés,
le virus sédimente à des densités faisant apparaître clairement son association à des
lipides. De plus, ce sont les particules virales retrouvées à des densités correspondant
aux VLDL qui sont les plus infectieuses pour le seul modèle animal qu’est le chimpanzé, mais le virus est aussi retrouvé associé aux LDL et, dans une moindre mesure,
aux HDL.
Ce travail apporte la réponse sur l’origine de cette relation, permettant de mieux
comprendre les observations faites à ce jour ; il ouvre aussi de nouvelles perspectives
dans les approches thérapeutiques envisageables pour lutter contre l’infection par le
VHC. En particulier, l’administration d’inhibiteurs de la MTP a déjà fait l’objet d’essais cliniques et il sera important de voir l’impact que peuvent avoir ces molécules
dans le cadre d’un traitement antiviral.
P. Maillard
Laboratoire d’épidémiologie
moléculaire des entérovirus
Institut Pasteur, Paris
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Référence
1. Huang H, Sun F, Owen DM, Li W, Chen Y, Gale M, Ye J. Hepatitis C virus production by human hepatocytes dependant on assembly and secretion of very low-density lipoproteins. PNAS 2007 ; 104 ; 5848-53.
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