Molécules antibactériennes issues d`huiles essentielles

UNIVERSITE DE CORSE-PASQUALE PAOLI
ECOLE DOCTORALE ENVIRONNEMENT ET SOCIETE
UMR CNRS 6134 SPE
Faculté des Sciences et Techniques
Thèse présentée pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE CORSE
Mention : Biochimie - Biologie moléculaire
Soutenue publiquement par
Elodie Guinoiseau
le 06 décembre 2010
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Molécules antibactériennes issues d’huiles essentielles :
séparation, identification et mode d’action
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Jury
Rapporteurs :
Mme Foglino Maryline, Dr-HDR, Université de la Méditerranée
M. Alziari Serge, Professeur, Université de Clermont
Examinateurs :
M. Bolla Jean-Michel, Dr-HDR, Inserm, Marseille
M. Casanova Joseph, Professeur, Université de Corse
Mme Berti Liliane, Professeur, Université de Corse
Directrices :
Mme Berti Liliane, Professeur, Université de Corse
Mme Luciani Anne, Dr, Université de Corse
tel-00595051, version 1 - 23 May 2011

SOMMAIRE
AVANT-PROPOS ................................................................................................................ 1
INTRODUCTION
1- LES ANTIBIOTIQUES ...................................................................................................... 5
1-1 LES ANTIBIOTIQUES NATURELS ET SYNTHETIQUES ..................................................................................................... 5
1-2 LES CIBLES BACTERIENNES DES ANTIBIOTIQUES ......................................................................................................... 7
2- LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES ............................................................................. 9
2-1 LA RESISTANCE NATURELLE ................................................................................................................................. 9
2-2 LA RESISTANCE ACQUISE ...................................................................................................................................... 9
2-3 EPIDEMIOLOGIE DE LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES ........................................................................................... 11
2-4 LES MECANISMES DE RESISTANCE ........................................................................................................................ 11
2-4-1 Diminution de la concentration intracellulaire en antibiotiques ........................................................ 12
2-4-1-1 Modification de la perméabilité membranaire ............................................................................................ 13
2-4-1-2 Les systèmes d’efflux bactériens .................................................................................................................. 14
2-4-2 Dégradation et modification enzymatique des antibiotiques ............................................................ 16
2-4-3 Altération des cibles cellulaires des antibiotiques .............................................................................. 18
3- STRATEGIES MOLECULAIRES DE LUTTE CONTRE LA RESISTANCE BACTERIENNE ............ 19
3-1 LES NOUVELLES CIBLES BACTERIENNES .................................................................................................................. 20
3-1-1 Les β-lactamases ................................................................................................................................ 20
3-1-2 Les pompes d’efflux ............................................................................................................................ 22
3-1-3 Les facteurs de virulence .................................................................................................................... 26
3-1-3-1 Les toxines.................................................................................................................................................... 26
3-1-3-2 Les adhésines et les biofilms ........................................................................................................................ 28
3-1-3-3 Le quorum sensing ....................................................................................................................................... 29
3-1-3-3-1 Le quorum sensing chez les bactéries Gram négatives ....................................................................... 29
3-1-3-3-2 Le quorum sensing chez les bactéries Gram positives ......................................................................... 31
3-1-3-4 Les inhibiteurs des facteurs de virulence ..................................................................................................... 32
3-1-3-4-1 Les inhibiteurs des toxines .................................................................................................................. 33
3-1-3-4-2 Les inhibiteurs des adhésines .............................................................................................................. 33
3-1-3-4-3 Les inhibiteurs du quorum sensing ...................................................................................................... 34
3-2 LES NOUVEAUX ANTIBIOTIQUES .......................................................................................................................... 36
3-2-1 Les bactériophages ............................................................................................................................. 36
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3-2-1-1 Les propriétés fonctionnelles des bactériophages ....................................................................................... 36
3-2-1-2 L’avenir de la phagothérapie ....................................................................................................................... 37
3-2-2 Les peptides antimicrobiens ............................................................................................................... 38
3-2-2-1 Les peptides cationiques antimicrobiens (PCAs) .......................................................................................... 38
3-2-2-1-1 Aspects structuraux ............................................................................................................................. 38
3-2-2-1-2 Mode d’action des PCAs ...................................................................................................................... 40
3-2-2-2 Les peptides anioniques antimicrobiens ...................................................................................................... 43
3-2-2-3 Les peptides antimicrobiens en développement clinique ............................................................................ 43
3-2-3 Les plantes .......................................................................................................................................... 44
3-2-3-1 Les plantes, source naturelle d’antimicrobiens ........................................................................................... 45
3-2-3-2 Les plantes, source naturelle d’inhibiteurs de l’efflux bactérien ................................................................. 46
3-2-3-3 Les plantes, productrices d’analogues des N-acylhomosérine-lactones (AHLs) ........................................... 48
3-2-4 Les huiles essentielles ......................................................................................................................... 48
3-2-4-1 Définition ..................................................................................................................................................... 49
3-2-4-2 Les activités biologiques des huiles essentielles .......................................................................................... 49
3-2-4-3 Les activités antibactériennes des huiles essentielles.................................................................................. 50
3-2-4-4 La composition des huiles essentielles......................................................................................................... 51
3-2-4-4-1 La composition chimique des huiles essentielles ................................................................................ 51
3-2-4-4-2 Les constituants des huiles essentielles .............................................................................................. 53
3-2-4-5 Mode d’action des huiles essentielles et de leurs principaux constituants ................................................. 56
MATERIEL ET METHODES
1- MATERIEL ................................................................................................................... 63
1-1 LES SOUCHES BACTERIENNES .............................................................................................................................. 63
1-2 LES HUILES ESSENTIELLES ................................................................................................................................... 63
1-3 LES ANTIBIOTIQUES .......................................................................................................................................... 63
2- METHODES ................................................................................................................. 64
2-1 METHODES MICROBIOLOGIQUES ........................................................................................................................ 64
2-1-1 Activité antibactérienne ..................................................................................................................... 64
2-1-1-1 Evaluation de l’activité antibactérienne par la méthode de diffusion par disque ....................................... 64
2-1-1-2 Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) .................................................................. 65
2-1-1-2-1 Technique de macrodilution en milieu liquide .................................................................................... 66
2-1-1-2-2 Technique de microdilution en milieu liquide ..................................................................................... 67
2-1-1-2-3 Technique de macrodilution en milieu solide...................................................................................... 67
2-1-1-3 Détermination de la Concentration Minimale Bactéricide (CMB) en milieu solide ..................................... 68
2-1-2 Dynamique d’action des huiles essentielles par mesure de la décroissance bactérienne (Time-kill
assay) ........................................................................................................................................................... 69
2-1-3 Expérience de lyse cellulaire ............................................................................................................... 70
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2-1-4 Microscopie Electronique à Transmission (MET) ................................................................................ 71
2-2 METHODES CHIMIQUES .................................................................................................................................... 72
2-2-1 Chromatographie sur colonne de silice (CC) ....................................................................................... 72
2-2-2 Chromatographie en phase gazeuse (CPG) ........................................................................................ 72
2-2-3 Résonance magnétique nucléaire (13C RMN) ..................................................................................... 72
2-2-4 Identification des composés ............................................................................................................... 73
RESULTATS ET DISCUSSION
CHAPITRE 1 : ETUDE DU MODE DACTION DHUILES ESSENTIELLES A ACTIVITE
ANTIBACTERIENNE .......................................................................................................... 71
1- RESULTATS.................................................................................................................. 76
1-1 CRIBLAGE DE L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DES HUILES ESSENTIELLES SUR STAPHYLOCOCCUS AUREUS ............................... 76
1-2 CARACTERISATION DU MODE D’ACTION DES HUILES ESSENTIELLES D’INULA GRAVEOLENS ET DE SANTOLINA CORSICA SUR
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ...................................................................................................................................... 78
1-2-1 Détermination des Concentrations Minimales Inhibitrice (CMI) et Bactéricide (CMB) des huiles
essentielles d’Inula graveolens et de Santolina corsica ............................................................................... 78
1-2-2 Dynamique d’action des huiles essentielles d’Inula graveolens et de Santolina corsica : expérience de
mort cellulaire .............................................................................................................................................. 79
1-2-3 Détermination de l’action lytique des huiles essentielles d’Inula graveolens et de Santolina corsica 81
1-2-4 Observation des effets cellulaires générés par les huiles essentielles d’Inula graveolens et de
Santolina corsica en Microscopie Electronique à Transmission (MET) ........................................................ 83
2- DISCUSSION ................................................................................................................ 86
2-1 ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DES HUILES ESSENTIELLES D’INULA GRAVEOLENS ET DE SANTOLINA CORSICA ........................... 86
2-2 CARACTERISATION DU MODE D’ACTION DES HUILES ESSENTIELLES D’INULA GRAVEOLENS ET DE SANTOLINA CORSICA ............ 87
CHAPITRE 2 : MOLECULES IMPLIQUEES DANS LACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE LHUILE
ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS ............................................................................. 86
1- RESULTATS.................................................................................................................. 92
1-1 ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS .............................................................. 92
1-1-1 Analyses microbiologiques de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus .............................................. 92
1-1-1-1 Criblage de l’activité antibactérienne de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus par la méthode de
diffusion par disque .................................................................................................................................................. 92
1-1-1-2 Tests de détermination de la CMI de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus ............................................ 94
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1-1-2 Analyses chimiques de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus ......................................................... 96
1-2 MOLECULES IMPLIQUEES DANS L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS .................. 98
1-2-1 Chromatographie sur colonne de silice de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus ........................... 98
1-2-1-1 Analyses chimiques des fractions chromatographiques FH et FO de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus
.................................................................................................................................................................................. 99
1-2-1-2 Détermination de la CMI des fractions chromatographiques FH et FO de l’huile essentielle de Cistus
ladaniferus .............................................................................................................................................................. 101
1-2-2 Chromatographie sur colonne de silice de la fraction oxygénée de l’huile essentielle de Cistus
ladaniferus ................................................................................................................................................. 102
1-2-2-1 Analyses chimiques des fractions chromatographiques FOA et FOB, isolées de la fraction oxygénée FO .. 103
1-2-2-2 Détermination de la CMI des fractions chromatographiques FOA et FOB de la fraction oxygénée FO ...... 105
1-2-3 Bilan ................................................................................................................................................. 106
1-2-3-1 Protocole de fractionnement ..................................................................................................................... 106
1-2-3-2 Activité antibactérienne de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus et de ses fractions chromatographiques
................................................................................................................................................................................ 107
1-2-4 Observation en MET des effets cellulaires induits par l’huile essentielle de Cistus ladaniferus et sa
fraction oxygénée FOB sur E. aerogenes EA 289 ........................................................................................ 108
2- DISCUSSION ............................................................................................................... 112
2-1 ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS ............................................................ 112
2-2 MOLECULES IMPLIQUEES DANS L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS ................ 113
2-3 EFFETS CELLULAIRES INDUITS PAR LES ALCOOLS TERPENIQUES DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS SUR LA BACTERIE
MULTI-RESISTANTE ENTEROBACTER AEROGENES EA289 ............................................................................................. 114
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ..................................................................... 111
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................... 114
ANNEXE : PUBLICATIONS
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