sur la cancérogenèse colorectale chez le rat
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THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Spécialité : Pathologie, Toxicologie, Génétique & Nutrition Présentée et soutenue par Raphaelle SANTARELLI Le 22 février 2010 Charcuteries et cancérogenèse colorectale. Additifs alimentaires et procédés de fabrication inhibant la promotion chez le rat. JURY : Pr Roland BUGAT Professeur de Médecine, pôle Cancer-Bio-Santé, Toulouse Président Dr Karine MAHEO Maître de Conférences, INSERM, Tours Rapporteur Dr Jean MENANTEAU Chargé de Recherche, INSERM, Nantes Rapporteur M Jean-Luc VENDEUVRE Chargé de Mission, IFIP, Paris Membre invité Pr Denis E. CORPET Professeur, ENVT, Toulouse Directeur de thèse Ecole Doctorale : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB) Unité de Recherche : UMR 1089-Xénobiotiques INRA-ENVT Directeur de thèse : Pr Denis E. Corpet A ma grand-mère A mes parents, mon frère et mes soeurs A Matthieu A Juliette 1 Remerciements Les travaux effectués lors de cette thèse ont été réalisés dans l’UMR-1089 Xénobiotiques de l’Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) de Toulouse et l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT). Ma thèse a été financée par l’IFIP (Institut du Porc) à Paris ainsi que par l’Association Nationale de la Recherche et de la Technologie (ANRT). Je tiens tout d’abord à remercier Karine Mahéo et Jean Menanteau qui m’ont fait l’honneur d’être rapporteurs de mon travail. Je remercie également Roland Bugat et Olivier Cuvillier pour avoir accepté d’être membres de mon jury de thèse. Un grand merci aussi à Paule Martel qui a toujours suivi mon travail. Je tiens à remercier le Professeur Corpet, responsable de l’équipe Aliment, Peroxydation et Cancer, pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire. Je le remercie particulièrement pour sa disponibilité et son écoute mais aussi pour ses conseils et son aide qu’il m’a donnés tout au long de mon stage. Je tiens à remercier tout particulièrement Fabrice Pierre pour m’avoir encadrée tout au long de ma thèse. Je le remercie à la fois pour son savoir, son dynamisme, sa disponibilité, son sérieux, son écoute, ses conseils judicieux, mais aussi pour sa gentillesse, son humour et surtout son « humilité »… !!! Ce sera avec une sincère tristesse que je quitterai son bureau et ce sera toujours avec une réelle nostalgie que je repenserai à ces trois années de dur labeur que j’ai passées en sa compagnie. Fini le tandem (je ne me souviens plus qui est Laurel, qui est Hardy, mais je crois que je m’étais fait avoir… !). Néanmoins, il ne sera plus dérangé pas mes questions scientifiques et …. Informatiques. Allez, ce n’est pas le « tou tou »… Je vous laisse finir la phrase mythique ! Merci à Sylviane Taché et Nathalie Naud, pour leur aide, leurs conseils techniques, mais surtout pour leur bonne humeur et leur serviabilité. Merci à toutes les deux d’avoir toujours été présentes pour moi, que ce soit au laboratoire ou en dehors du travail. Elles m’ont toujours soutenue dans mon travail et dans ma vie personnelle. Un grand merci aussi à Françoise, Maryse et Marc pour leurs précieux conseils, leur soutien et leur aide. Je tiens à remercier sincèrement toute l’équipe pour m’avoir intégrée au sein du laboratoire, et surtout pour la confiance qu’ils m’ont accordée. Toute l’équipe m’a marquée par leurs qualités humaines, ce qui m’a permis de travailler dans de très bonnes conditions. Merci à Jean-Luc Vendeuvre pour avoir orienté ma thèse avec ses conseils utiles, pertinents et constructifs. Merci aussi à Maysaloun, Adriana, Julie, Céline mais aussi à Florence et Nadia, JeanChristophe, Sophie, Caroline, Linda, Dalila, Armelle, Sabrina, Maxime, Cynthia, Yannick… pour m’avoir changé les idées dans les moments difficiles, et pour avoir été présents, malgré parfois la distance, tout au long de ma thèse. Enfin, comment ne pas remercier ma famille, mes parents et mes sœurs, ainsi que Matthieu et n’oublions pas ma Juliette ! Merci notamment à mon père et à Emmanuelle pour avoir relu ma thèse, et pour leurs conseils ! Et enfin, je remercie tout particulièrement Matthieu pour m’avoir donné la force d’avancer tous les jours, pour m’avoir supportée aussi (car ca n’a pas toujours été facile) et pour avoir été à mes côtés durant déjà trois années et demi ! 2 Sommaire Abréviations .......................................................................................................................... 5 Liste des tableaux et des schémas ....................................................................................... 6 Préambule ............................................................................................................................. 7 I- Le cancer colorectal.............................................................................................................. 8 1- Fréquence du cancer colorectal .............................................................................................. 8 2- Répartition géographique ....................................................................................................... 8 3- Etudes des populations migrantes : rôle de l’alimentation .................................................. 10 II- Alimentation et Cancer .................................................................................................... 11 1- Les rapports WCRF/AICR ............................................................................................... 11 2- Les recommandations alimentaires par le WCRF ............................................................... 12 III- Prévention du cancer colorectal par des changements des habitudes alimentaires .. 14 1- Facteurs associés à une augmentation du risque du cancer colorectal ................................. 14 2- Facteurs associés à une diminution du risque du cancer colorectal ..................................... 16 IV- Interaction Aliment et Cancer ........................................................................................ 19 1- Les effets épigénétiques ....................................................................................................... 19 2- L’inflammation .................................................................................................................... 20 3- L’insulino-résistance ............................................................................................................ 20 4- Les anti-oxydants et le système de détoxification ............................................................... 21 5- Polymorphisme génétique .................................................................................................... 22 V- Réaction de nitrosation et nitrosylation .......................................................................... 22 1- Définition ......................................................................................................................... 22 2- Réaction de nitrosation et de nitrosylation dans la charcuterie ........................................ 23 3- Réaction de nitrosation et de nitrosylation dans l’estomac .............................................. 24 4- Réaction de nitrosation et de nitrosylation dans le côlon ................................................. 24 VI- Le cancer colorectal et la consommation de viandes .................................................... 24 VII- Rôle de l’hème dans la cancérogenèse colique ............................................................ 40 1- La peroxydation lipidique .................................................................................................... 40 2- Heme et composés nitrosés .................................................................................................. 42 3- Etude in vitro sur l’effet de l’hème ...................................................................................... 43 4- Etude in vivo sur la relation hème/cancer colorectal ........................................................... 43 VIII- Modèle expérimental de cancérogenèse colorectale .................................................. 44 1- Les modèles de cancérogenèse colorectale .......................................................................... 44 2- Etude des lésions pré-cancéreuses ....................................................................................... 47 IX- Rôle du gène Apc dans la cancérogenèse colorectale .................................................... 50 1- Structure de la protéine APC ............................................................................................... 50 2- Fonction de la protéine APC ................................................................................................ 51 X- Objectifs et enjeux de la thèse .......................................................................................... 56 Etude 1 : Effet de viandes saumurées (charcuteries modèles) sur la cancérogenèse colorectale chez le rat ......................................................................................................... 59 Introduction .............................................................................................................................. 59 Résumé de l’article A1 ............................................................................................................. 61 Bilan de l’article A1 ................................................................................................................. 84 Etude 2 : Effet de charcuteries du commerce sur la cancérogenèse colorectale chez le rat ......................................................................................................................................... 85 Introduction .............................................................................................................................. 85 Résumé de l’article A2 ............................................................................................................. 85 Bilan de l’article A2 ............................................................................................................... 102 3 Etude 3 : Agents potentiellement antagonistes de l’effet promoteur d’une viande saumurée sur la cancérogenèse colorectale chez le rat ................................................. 104 Introduction ............................................................................................................................ 104 Résumé de l’article A3 ........................................................................................................... 105 Bilan de l’article A3 ............................................................................................................... 119 Etude 4 : Effet des aldéhydes terminaux de l’oxydation lipidiques des acides gras polyinsaturés sur des cellules épithéliales coliques saines ou précancéreuses, mutées sur le gène Apc .................................................................................................................. 122 Introduction ............................................................................................................................ 122 Résumé de l’article A4 ........................................................................................................... 123 Bilan de l’article A4 ............................................................................................................... 138 Discussion générale de la thèse ........................................................................................ 139 1- Les modèles d’études ......................................................................................................... 139 2- La démarche expérimentale ............................................................................................... 141 3- Quels sont les composés des viandes et charcuteries qui favorisent le cancer colorectal ? 142 4- Pertinence de l’utilisation des biomarqueurs utilisés lors des études in vivo .................... 148 5- Les moyens de prévention ................................................................................................. 149 Perspectives ....................................................................................................................... 154 1- Effet promoteur de viandes saumurées sur les tumeurs colorectales et stratégie préventive chez le rat ............................................................................................................................... 154 2- Effet du taux de nitrosylation du fer héminique sur la promotion de la cancérogenèse colorectale .............................................................................................................................. 155 3- Identification des ATNC promoteurs de la cancérogenèse colorectale et identification de biomarqueurs corrélés à la promotion par les ATNC ............................................................ 156 4- Etude de la consommation de charcuteries et de polyphénols ........................................... 157 5- Intervenion nutritionnelle chez l’Homme et étude épidémiologique ................................ 157 6- Relation entre la consommation de charcuteries et la cancérogenèse d’autres organes .... 159 7- Effet de la consommation d’huile riches en AGPIs n-3 et des AGPIs n-6 sur la cancérogenèse colorectale ...................................................................................................... 159 8- Test de tumorigénécité avec les aldéhydes issus de la lipoperoxydation des AGPIs n-3 et des AGPIs n-6 et caractérisation du système enzymatique .................................................... 160 Conclusion générale ......................................................................................................... 161 Références bibliographiques ........................................................................................... 164 Annexes ............................................................................................................................. 183 4 Abréviations AGPIs : acides gras polyinsaturés AHCs : amines hétérocycliques AICR : American Institute for Cancer Research AOM : azoxyméthane Apc : Adenomatous Polyposis Coli ATNC : apparent total N-nitroso compounds DHN-MA : 1,4-dihydroxynonene mercapturic acid DMH : dimethylhydrazine FCA : foyer de cryptes aberrantes FDM : foyer déplété en mucine HIDAB : high-iron diamine alcian blue HHE : 4-hydroxy-héxénal HNE : 4-hydroxy-2-nonénal MDA : malondialdéhyde Min : Multiple Intestinal Neoplasia NOCs : composés N-nitrosés PNNS : Programme National Nutrition-Santé PhIP : 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine TBARs : substances réactives à l’acide thiobarbiturique WCRF : World Cancer Research Fund 5 Liste des tableaux et des schémas Introduction Figure 1 : incidence des cancers en France en 2000 p.9 Figure 2 : incidence du cancer colorectal dans le monde chez l’Homme p.10 Figure 3 : lien entre la consommation de charcuteries ou de viandes rouges et le cancer colorectal selon le WCRF p.13 Figure 4 : la recommandation n°5 du WCRF concerne la relation entre la consommation de viandes rouges et de charcuteries et le cancer colorectal p.13 Figure 5 : réaction avec l’acide nitreux p.23 Figure 6 : schéma de l’hème (A), formule chimique des nitrosamines (B) et exemples d’amines hétérocycliques (C) p.26 Figure 7 : schéma de l’hème nitrosylé p.39 Figure 8 : schéma des étapes de peroxydation lipidique des AGPIs p.41 Figure 9 : 4-hydroxy-2-nonenal p.42 Figure 10 : protocole expérimental lors des études de moyen terme (100 j) avec initiation à la diméthylhydrazine (DMH) p.45 Figure 11 : schéma de cryptes du côlon p.48 Figure 12 : photo d’un foyer de cryptes aberrantes p.49 Figure 13 : transformation d’une crypte normale en un adénocarcinome en passant par le stade de foyer de cryptes aberrantes p.49 Figure 14 : photo d’un foyer déplété en mucine p.50 Figure 15 : Protéine APC et ses différents domaines p.51 Figure 16 : Rôle d’APC dans une cellule normale sans activation de la voie Wnt-1 p.53 Figure 17 : Activation par la voie Wnt-1 dans une cellule normale p.54 Figure 18 : Implication de la mutation sur le gène Apc dans une cellule initiée p.55 Figure 19 : les principaux agents favorisant le cancer colorectal par la consommation de charcuteries p.143 Figure 20 : les principaux agents favorisant le cancer colorectal par la consommation de viandes rouges p.146 6 Préambule Ma thèse a été construite autour d’un article publié et de quatre manuscrits destinés à être publiés sous forme d’articles scientifiques en anglais dans des revues à comité de lecture (seul le premier a été soumis à Cancer Prevention Research. Il a été accepté sous réserve de modifications). Pour chaque article, une introduction, un résumé de l’article ainsi qu’une brève discussion ont été rédigés en français. L’introduction annonce l’article et permet de comprendre son originalité, son intérêt et à partir de quels outils il a été rédigé. Le résumé est la traduction en français de l’abstract de l’article. Puis le bilan en français de l’article reprend les principaux éléments de la discussion. Les cinq articles ou manuscrits de la thèse sont les suivants : - A0 : Viande transformée et cancer colorectal : Revue des données épidémiologiques et expérimentales - A1 : Effet de viandes saumurées (charcuteries modèles) sur la cancérogenèse colorectale chez le rat - A2 : Effet de charcuteries du commerce sur la cancérogenèse colorectale chez le rat - A3 : Agents potentiellement antagonistes de l’effet promoteur d’une viande saumurée sur la cancérogenèse colorectale chez le rat - A4 : Effet des aldéhydes terminaux issus de l’oxydation lipidique des acides gras polyinsaturés sur des cellules épithéliales coliques saines ou précancéreuses, mutées sur le gène Apc. Enfin, le document se termine par la discussion générale, la conclusion et les perspectives. Parallèlement à ces travaux directement intégrés à ma thèse, mon travail de Master II Recherche sur la recherche des biomarqueurs de l’effet promoteur de la viande rouge a été valorisé dans le British Journal of Nutrition (en 2ème auteur). Cet article est largement cité dans ma thèse car il est à l’origine de mon hypothèse initiale. Enfin, j’ai aussi participé à l’étude sur l’importance de la forme de l’hème dans l’effet promoteur du jambon de Paris lyophilisé. Ce travail vient d’être publié dans la revue Nutrition & Cancer (en 2ème auteur). 7 I- Le cancer colorectal 1- Fréquence du cancer colorectal La cancérogenèse colorectale est caractérisée par une croissance cellulaire incontrôlée au niveau du côlon et du rectum. Elle désigne ainsi la transition de la situation saine d’un tissu vers les adénomes et adéno-carcinomes. Cette transition est complexe, multigénétique, multiétape et peut s’étaler sur plusieurs décennies. Au niveau du côlon, la majorité des cancers sont dits sporadiques (sans historique familial) et seulement 5 à 10% sont de forme génétique. En termes d’incidence et de mortalité, le cancer colorectal se situe au 3ème rang des cancers après le cancer de la prostate et des poumons pour les hommes ; et au 3ème rang des cancers après le cancer du sein et des poumons pour les femmes aux Etats-Unis (1). Aux Etats-Unis, en 2009, 147.000 nouveaux cas de cancer colorectal ont été estimés pour les deux sexes, et le nombre de décès est estimé à 50.000 (1). En France, en terme d’incidence et de mortalité, ce cancer se situe au 3ème rang des cancers après le cancer de la prostate et des poumons pour les hommes, et au 2ème rang après le cancer du sein pour les femmes (2) (figure 1). Près de 36.000 nouveaux cas de cancers colorectaux sont décelés en France, et on estime que 16.000 personnes par an décèdent suite à ce cancer (3). Il s’agit en outre du cancer qui cause le plus de décès sur l’ensemble de la population, après le cancer des poumons. Toujours en France, l’incidence du cancer colorectal a augmenté régulièrement durant ces 20 dernières années. Cette augmentation est due principalement au vieillissement de la population et à un meilleur dépistage. Néanmoins, le nombre de décès tend à diminuer du fait d’un diagnostic plus précoce, de traitements plus efficaces et d’une recherche plus approfondie dans ce domaine (4). 2- Répartition géographique Il existe une grande disparité géographique entre les pays industrialisés et les pays en voie de développement (5) (figure 2). La France est un pays à risque élevé, comme le sont les Etats-Unis, le Japon et l’Australie. Ce cancer est quasiment inexistant en Amérique du Sud (sauf au Chili et en Argentine), en Afrique et en Asie. L’incidence de ce cancer augmente avec l’industrialisation et l’urbanisation (2). 8 A sein Côlon-rectum 13% 2% utérus 2% poumon 3% 38% 3% lymphome malin non hodgkinien ovaire 3% peau 4% col de l'utérus 4% rein 4% thyroïde 4% sang 5% 15% estomac autres B prostate poumon 16% côlon-rectum 2% 26% 2% lèvre, bouche, pharynx vessie 2% lymphome malin non hodgkinien 3% rein foie 3% estomac 3% 14% 3% œsophage larynx 6% sang 8% 12% autres Figure 1 : incidence des cancers en France en 2000 pour A : les Femmes et pour B : les Hommes (d’après le WCRF, 2007 (2)). 9 Figure 2 : incidence du cancer colorectal dans le monde chez l’Homme (d’après Parkin, 2004 (5)). 3- Etudes des populations migrantes : rôle de l’alimentation Les études des populations émigrant d’une zone à faible incidence vers une zone à forte incidence révèlent qu’avec le temps, l’incidence du cancer colorectal chez les migrants devient comparable (voire supérieure) à celle des pays hôtes. Burkitt et al. ont ainsi constaté que des africains émigrants aux Etats-Unis d’Amérique ont une incidence du cancer colorectal plus élevée que des africains vivant en Afrique (6). Ils avaient alors proposé que la forte consommation de fibres alimentaires en Afrique fût protectrice du cancer colorectal, ce qui expliquait la différence observée entre les migrants et les non migrants. Des études similaires ont été réalisées plus récemment, avec le même constat que des africains vivant aux EtatsUnis d’Amérique ont plus de cancers colorectaux que les africains vivants en Afrique (7, 8). Les migrants ont une incidence plus élevée que celle des personnes vivant dans leur pays d’origine. Ces études démontrent que les facteurs génétiques ne peuvent expliquer à eux seuls l’incidence du cancer colorectal. Les facteurs environnementaux, au sens large, ont donc une grande importance sur l’incidence de ce cancer : l’alimentation (nature et quantité), la consommation d’alcool et de tabac, l’activité physique et le travail de bureau sont des éléments qui peuvent modifier le risque de cancer colorectal (9, 10). Les changements d’habitudes alimentaires expliqueraient en grande partie pourquoi les migrants voient leur incidence de cancer colorectal augmenter quand ils émigrent dans un pays comme les EtatsUnis d’Amérique. 10 II- Alimentation et Cancer 1- Les rapports WCRF/AICR Le WCRF (World Cancer Research Fund) et l’AICR (American Institute for Cancer Research) sont des associations qui collectent des fonds auprès du public pour lutter contre les cancers par différents moyens, notamment le financement de programmes de recherche. Dans les années 1990, elles ont décidé de financer une synthèse scientifique globale de tous les résultats publiés sur les liens entre l’alimentation et le cancer, qui fasse autorité, et de la communiquer au public. Elles ont ainsi « recruté » des médecins et des chercheurs du monde entier afin de réaliser cette synthèse, et d’établir des recommandations alimentaires, au niveau mondial. Un premier rapport d’experts sur la relation entre l’alimentation et les cancers a donc été publié en 1997 (intitulé : Food, Nutrition and the Prevention of Cancer: a Global Perspective). Mais les connaissances évoluant vite, le WCRF et l’AICR ont financé un second rapport, publié en 2007, intitulé : Food, Nutrition, Physical Activity, and the Prevention of Cancer: a Global Perspective. Pour élaborer ce dernier rapport, un groupe d'une vingtaine d’experts s’est, en premier lieu, réuni afin d’élaborer une méthode d’analyse des études sur le lien entre l’alimentation et les cancers. Puis des groupes d'experts localisés dans des villes de différents pays ont utilisé cette méthode pour analyser la littérature sur un point précis (par exemple un certain type de cancer, ou un groupe d'aliments). Enfin, un panel d'experts de 21 scientifiques a évalué les preuves recueillies lors de l’étape précédente, en a tiré des conclusions et a élaboré des recommandations pour les individus et les populations: l'ensemble a été rédigé sous la forme d'un livre (Food, Nutrition, Physical Activity, and the Prevention of Cancer: a Global Perspective) largement diffusé dans le monde entier. En France, le Programme National Nutrition-Santé (PNNS) a été crée afin d’améliorer l’état de santé de l’ensemble de la population. Il élabore lui aussi des recommandations, notamment concernant la nutrition dans le but de mieux prévenir les maladies (11). Le PNNS a des objectifs nutritionnels afin de diminuer les maladies telles que les cancers, les maladies cardio-vasculaires, l’ostéoporose, l’obésité… 11 Par ailleurs, le réseau NACRe (Réseau National Alimentation Cancer Recherche) a été créé en 2000 afin d’appronfondir les recherches dans le domaine de la nutrition et cancer, d’élaborer des recommandations nutritionnelles et d’informer le public sur les recommandations proposées. Il s’appuie pour cela sur une trentaine d’équipes de chercheurs. 2- Les recommandations alimentaires par le WCRF Le panel d'experts du WCRF/AICR a résumé l'ensemble des données scientifiques sous la forme de dix recommandations simples, qui devraient d'après eux diminuer nettement le risque de cancer chez ceux qui les appliquent (2) : 1. Soyez aussi mince que possible tout en évitant l’insuffisance pondérale. 2. Pratiquez une activité physique au moins trente minutes par jour. 3. Évitez les boissons sucrées. Limitez la consommation d’aliments à forte densité calorique (en particulier les produits à teneur élevée en sucres ajoutés, ou faibles en fibre, ou riches en matières grasses). 4. Augmentez et variez la consommation de légumes, fruits, céréales complètes et légumes secs. 5. Limitez la consommation de viande rouge (comme le boeuf, le porc ou l’agneau) et évitez de consommer la charcuterie (figure 3 ; 4). 6. En cas de consommation d’alcool, se limiter à une boisson par jour pour les femmes et à deux pour les hommes. 7. Limitez la consommation d’aliments salés et de produits contenant du sel ajouté. 8. Ne prenez pas de compléments alimentaires pour vous protéger du cancer. Les deux recommandations qui suivent sont spécifiques et ne s’appliquent pas à tout le monde. Si elles vous concernent, leur adoption peut contribuer à réduire votre risque de cancer. 9. De préférence, les mères devraient exclusivement allaiter pendant les six premiers mois puis introduire d’autres liquides et aliments. 10. Après le traitement, les personnes diagnostiquées d’un cancer devraient suivre l’ensemble des recommandations pour la prévention du cancer. 12 Figure 3 : lien entre la consommation de charcuteries ou de viandes rouges et le cancer colorectal selon le WCRF (2). Il qualifie le lien entre consommation de charcuterie et le cancer colorectal comme « convaincant » (d’après le WCRF, 2007 (2)) Figure 4 : la recommandation n°5 du WCRF concerne la relation entre la consommation de viandes rouges et de charcuteries et le cancer colorectal (d’après le WCRF, 2007 (2)). 13 Ainsi, le WCRF a pour objectif de prévenir les risques de cancer par des changements dans les habitudes alimentaires. L’une des recommandations concerne la consommation de charcuteries (recommandation n°5) car elle est associée au risque du cancer colorectal. Nous allons donc nous intéresser dans un premier temps à la prévention du risque de ce cancer par des changements d’habitudes alimentaires, puis nous étudierons la relation entre la consommation de viande rouge ou de charcuteries et le risque de cancer colorectal. III- Prévention du cancer colorectal par des changements des habitudes alimentaires 1- Facteurs associés à une augmentation du risque du cancer colorectal a- Rôle des graisses L’hypothèse que les graisses sont impliquées dans le cancer colorectal a été l’une des premières émises. Le WCRF estime que les études sur la relation entre la consommation de graisses et le risque du cancer colorectal ne prouvent pas que les graisses soient une cause du risque du cancer colorectal (2). Il semblerait que ce soit principalement la consommation de matières grasses ajoutées à l’alimentation (beurre, crème et saindoux) qui soit associée au risque du cancer colorectal (12). Le PNNS préconise de réduire la contribution moyenne des apports lipidiques totaux à moins de 35 % des apports énergétiques journaliers, les acides gras saturés notamment (11). Les matières grasses ajoutées (beurre, crème et saindoux) sont particulièrement riches en acides gras saturés. Ces lipides stimulent le relargage des acides biliaires et 95% de ces acides biliaires sont réabsorbés (13, 14). Les 5% restants sont métabolisés par la flore intestinale, qui intervient dans la toxicité des acides biliaires en transformant les acides biliaires primaires en acides biliaires secondaires souvent toxiques via la 7 α-déhydroxylase (13, 15). Les acides biliaires sont des composés cytotoxiques et pourraient donc être impliqués dans le risque du cancer colorectal via cette cytotoxicité (16). De même, les acides biliaires peuvent provoquer des dommages à l’ADN, et pourraient induire des mutations sur le gène K-ras impliqué dans la cancérogenèse colorectale (17, 18). Par ailleurs, certains acides biliaires, les secondaires en particulier, sont des promoteurs du cancer colorectal (19, 20). Néanmoins, ce rôle promoteur des acides biliaires est controversé car d’autres études montrent qu’ils ne seraient ni des initiateurs ni des promoteurs du cancer colorectal (21, 22). 14 b- Rôle des sucres et des hydrates de carbone Les sucres désignent généralement le saccharose, le maltose, le lactose, le glucose et le fructose contenus dans les aliments. Les études épidémiologiques restent controversées sur la relation entre la consommation de sucres et le risque du cancer colorectal (2, 23). La plupart des études, mais pas toutes, montrent une association positive entre leur consommation et le risque de ce cancer. Les mécanismes pouvant expliquer l’effet des sucres sur le risque du cancer colorectal sont liés principalement à l’hyperinsulinisme (24, 25). L’insuline est un facteur de croissance des cellules de la muqueuses coliques et il est mitogène de cellules de carcinome colique in vitro (24, 26, 27). Les récepteurs à l’insuline et à l'IGF-1 (hormone dont la structure est proche de celle de l’insuline) sont fortement exprimés par les cellules coliques cancéreuses. L’insuline peut donc se lier à ces récepteurs et favoriser leur croissance. Par ailleurs, la consommation de glucose ou de fructose augmente la prolifération cellulaire dans le côlon, et le nombre de lésions précancéreuses (28). c- L’alcool La consommation d’alcool est associée à divers risques de cancers du tube digestif : bouche, pharynx, larynx, œsophage, côlon et rectum (29). Des études de cohortes montrent une association positive entre la consommation d’alcool et le risque de cancer colorectal, avec un effet dose-dépendant (2). La consommation de plus de 30g/j d’éthanol est un facteur de risque du cancer colorectal convainquant pour l’homme, et probable pour la femme. En France, le PNNS recommande de réduire la consommation d’alcool afin de passer en dessous de 8,5 L/an/habitant (11). Les mécanismes d’action de l’alcool semblent être liés à ses métabolites, principalement l’acétaldéhyde, un composé mutagène, produit dans la muqueuse rectale et par la flore intestinale (30, 31). Par ailleurs, l’effet de l’alcool peut être lié aux prostaglandines, à l’oxydation des lipides et à la génération de radicaux libres (2). Enfin, l’alcool agit comme un solvant, il favorise donc la diffusion d'autres cancérigènes dans les cellules, comme par exemple ceux qu'apporte la fumée de cigarette. L’alcool peut aussi induire une carence en folate dans le côlon et le rectum, en diminuant son absorption ou en inhibant des enzymes. Enfin, les consommateurs d’alcool ont généralement une alimentation déficiente en certains nutriments et ils ont souvent des carences en éléments protecteurs (30). 15 d- Obésité et activité physique L’obésité (mesurée par l’indice de masse corporelle) augmente le risque du cancer colorectal de façon dose-dépendante (2). Les études montrent en plus un risque élevé de tumeurs avec une obésité de type abdominal. De même, la sédentarité joue un rôle défavorable sur le risque de ce cancer. Des études montrent un effet protecteur de l’activité physique (32). Le PNNS accorde deux recommandations sur l’obésité et l’activité physique : réduire de 20 % la prévalence du surpoids et de l'obésité et augmenter l'activité physique (11). Les mécanismes invoqués sont liés au fait que l’obésité augmente la réponse inflammatoire et la résistance à l’insuline (33). Cela induit la prolifération des cellules du côlon et diminue l’apoptose. Par ailleurs, l’inflammation entraîne la formation de cytokines, de facteurs de croissance et de substances réactives à l’oxygène. Ces molécules favorisent en général la prolifération des cellules, inhibent l’apoptose et sont des angiogènes (2). Enfin, l’obésité favorise la circulation des oestrogènes et diminue la sensibilité à l’insuline (2). Tous ces paramètres peuvent influencer la cancérogenèse colorectale. 2- Facteurs associés à une diminution du risque du cancer colorectal a- Les fibres alimentaires L’intérêt pour les fibres alimentaires est né au début des années 1970, lorsqu’il a été constaté qu’une alimentation riche en fibres diminue les risques de cancers et de maladies cardio-vasculaires (6). Les fibres sont des composés naturellement présents dans les végétaux. On les retrouve en grande quantité dans les légumes, les fruits et les céréales non raffinées. Il s’agit d’un groupe complexe dont la définition peut suivre deux variantes : chimiques et physiologiques (2). L’aspect chimique inclut tous les composés issus des parois de cellules de végétaux (les polysaccharides comme l'amidon sont donc exclus). L’aspect physiologique inclut tous les hydrates de carbone ayant échappé à la digestion des enzymes au niveau de l’intestin et entrant ainsi dans le côlon. L’organisation mondiale de la santé (World Health Organization) et l’organisation pour l’alimentation et l’agriculture (Food and Agriculture Organization) privilégient la première définition. La consommation de fibres est associée à une diminution du risque du cancer colorectal. En 1992, Howe et al. montrent que le risque relatif chez les personnes consommant plus de 27g/j de fibres est environ 0,5 (34). Plus récemment, une méta-analyse de 13 études de cohortes montre une diminution du risque du cancer colorectal chez les consommateurs de fibres pour le modèle ajusté pour l’âge seulement (35). 16 Plusieurs mécanismes peuvent expliquer cette association négative entre la consommation de fibres et le risque de ce cancer. D’une part, la consommation de fibres alimentaires augmente la masse fécale (36). Ceci serait protecteur en accélérant le transit digestif, en diluant le contenu colique et en diminuant ainsi le temps de contact des produits mutagènes avec la muqueuse colique (37). D’autre part, les fibres alimentaires non digestibles servent de substrats à la flore colique. La dégradation de ces substrats produit une acidification du milieu, ce qui module l’activité de certaines enzymes, comme par exemple la β-glucuronidase, qui transforme des composés pro-cancérigènes en composés cancérigènes (38). La dégradation des fibres alimentaires produit enfin des acides gras volatiles (acétate, propionate, butyrate). Le butyrate serait un agent protecteur (39, 40). De nombreuses études dans des modèles animaux montrent un effet protecteur des fibres butyrogènes contre la cancérogenèse colorectale (41). En effet, il diminue l’inflammation, nourrit les cellules non cancéreuses, empêche la croissance de cellules cancéreuses en inhibant l'ornithine décarboxylase, réduit les métastases, favorise la différenciation cellulaire et protège contre la génotoxicité de certains composés en activant l’expression d’enzymes impliquées dans leurs détoxifications (2, 42-44). Même si l’effet protecteur des fibres a été largement soutenu et étudié, il a récemment été pondéré par les études de cohortes sur les infirmières américaines (Nurses' Health Study) et les personnels hospitaliers américains (Health Professionals Follow-up Study) qui ne montrent pas un lien clair entre la consommation de fibres et la diminution du risque du cancer (45). Le butyrate, qui a longtemps été considéré comme un acide gras volatile protecteur de la cancérogenèse colorectale, a été caractérisé récemment comme un acide gras ayant un effet pro ou anti néoplasique selon son exposition, sa disponibilité, la présence d’autres substrats et le milieu intracellulaire (46). b- Les fruits et légumes Les fruits et légumes sont des aliments riches en vitamines, minéraux et composés bioactifs, tels que les composés phytochimiques (phytochemicals). Il semblerait que les légumes verts crus aient un effet protecteur plus net que les légumes cuits (47). De nombreuses études épidémiologiques ont été réalisées sur la relation entre la consommation de fruits et légumes et le risque du cancer colorectal. Elles montrent en général que les légumes non amidonnés, en particulier les crucifères, sont protecteurs (2). De même, l’ail protège contre le risque du cancer colorectal, probablement en raison de ses composés 17 sulfurés (48, 49). Les études restent néanmoins peu claires quant aux modes d’action et aux composés protecteurs. Il pourrait en effet s’agir de fibres, de caroténoïdes, de flavonoïdes, d’anti-oxydants, de polyphénols ou d'autres composés mineurs ou même encore inconnus. c- Les folates Le PNNS a pour objectif d’améliorer le statut en folates, notamment chez les femmes en âge de procréer (11). La plupart des études de cohortes effectuées montre un effet protecteur des folates, de façon dose-dépendante (2). Néanmoins, les études sont réalisées avec des aliments riches en folates (épinards, pois, haricots…) et non avec des suppléments. De ce fait, il est difficile d’attribuer l’effet protecteur aux folates seuls, d'autant plus que l'étude d'intervention de Cole montre que la prise de suppléments d'acide folique a augmenté la récurrence des polypes chez les volontaires de cet essai clinique randomisé en double aveugle (50). Les folates interviennent au niveau de la synthèse et de la réparation de l’ADN. A noter que la consommation de folates est fortement corrélée à la consommation de fibres alimentaires, qui sont aussi protectrices. d- Le sélénium Une méta-analyse montre que la consommation de sélénium est associée à un moindre risque du cancer colorectal (51). L’effet serait dose-dépendant (2). Une déficience en sélénium diminue l’expression des protéines à sélénium (sélénoprotéines). Ces protéines interviennent notamment lors de la réponse inflammatoire et ont des propriétés anti-oxydantes (52). 35 protéines à sélénium ont été identifiées chez les animaux, et quatre d’entre elles sont des gluthation-péroxydases, qui protègent contre les dommages liés à l’oxydation notamment au niveau de l’ADN (2). e- Le calcium De nombreuses études épidémiologiques, cliniques et expérimentales suggèrent que la consommation de calcium protège contre le risque du cancer colorectal (2, 53). Une métaanalyse de 10 cohortes montre une diminution de ce cancer de 22% chez les groupes ayant la plus forte dose de calcium, sous forme d’aliment ou de suppléments (2). Des études expérimentales montrent aussi un effet protecteur du calcium chez des rats initiés à la diméthylhydrazine (54, 55). Les produits laitiers sont aussi des aliments protecteurs : la consommation de yaourt est associée à une diminution du risque d’apparition d’adénomes, et le lait protège aussi probablement contre le risque du cancer colorectal (2, 56, 57). Le PNNS 18 recommande d’augmenter la consommation de calcium afin de réduire de 25 % la population des sujets ayant des apports calciques en dessous des apports nutritionnels conseillés (11). Le calcium agit au niveau de l’organisme comme un second messager lors de la croissance cellulaire. Par ailleurs, le calcium agit au niveau de l’apoptose de la muqueuse colique et de la différenciation cellulaire (58). Enfin, le calcium peut aussi piéger les acides biliaires et les acides gras, limitant ainsi certains dommages à l’ADN liés à ces molécules. IV- Interaction Aliment et Cancer 1- Les effets épigénétiques L’épigénétique se réfère aux modifications transmissibles et réversibles de l’expression des gènes ne pouvant pas être expliquer par des changements de la séquence ADN (sans mutations). Elle concerne notamment les modifications de l’ADN ou des protéines liées à l’ADN (histones) telles que l’hyper- ou hypo-méthylation (59). Une méthylation de la base cytosine (5-méthyl-cytosine) peut entraîner sa desamination, formant ainsi de la thymine. Cette mutation peut engendrer l’initiation lors de la cancérogenèse. Dans une cellule normale, le phénomène d’hyper-méthylation de l’ADN a lieu, principalement dans les régions riches en cytosine et guanine (région appelée CpG) présentes dans les promoteurs de gènes. Ceci permet une condensation de l’ADN et une baisse, voire un arrêt, de la transcription des gènes. Une hyper-méthylation de l’ADN tend donc à diminuer la transcription des gènes comme des gènes impliqués dans la réparation de l’ADN, la régulation du cycle cellulaire, l’apoptose, et l’adhérence cellulaire (59). Certains nutriments, tels que le zinc, les folates, la méthionine et les vitamines B6 et B12 peuvent interférer sur les processus de méthylation. Une déficience en folate, en zinc et en sélénium induit une hypo-méthylation de l’ADN. L’alcool peut moduler le métabolisme des folates, et ainsi altérer les méthylations de l’ADN par les folates (59). Une déficience en vitamine C est associée à une hyper-méthylation de l’ADN de cellules cancéreuses de poumon. Enfin, une acétylation des histones sont des évènements épigénétiques qui peut être modulée par des nutriments, tels que le zinc, le butyrate et les acides gras à chaîne courte (60). 19 2- L’inflammation La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse sont deux exemples de maladies inflammatoires chroniques du tube digestif. Les patients atteints de ces maladies ont un risque élevé d’avoir un cancer du colon (61). L’âge, l’obésité et l’alcool sont des facteurs associés à une augmentation du risque de l’inflammation du tube digestif, alors que l’activité physique, la consommation de fibre le sélénium, les fruits et légumes sont associés à une diminution (2, 62). Les foyers déplétés en mucine (FDM, lésions pré-cancéreuses prédictives du cancer du côlon, de rats initiés à la diméthylhydrazine) présentent un plus fort niveau de marqueurs d’inflammation, tels que la cyclo-oxygénase ou l’infiltration de macrophages (63). Les tumeurs coliques présentent aussi tous ces marqueurs. Dans cette étude, le dextrane sulphate de sodium, un inducteur de l’inflammation, est promoteur des FDM de façon dosedépendante. L’inflammation pourrait donc être impliquée dans la cancérogenèse colorectale. Les mécanismes induisant la réponse inflammatoire peuvent être liés à l’hyperinsulinisme ou au nombre élevé d’adipocytes qui sont une source de cytokines proinflammatoires. Par ailleurs, la fermentation des fibres modifie la flore intestinale. Les fibres joueraient un rôle protecteur face à l’inflammation en favorisant la croissance des bactéries protectrices et bénéfiques pour l’épithélium colique (62). De même, le curcumin, le resveratrol et les AGPIs n-3 sont des inhibiteurs de la cyclo-oxygénase 2 impliquée dans la formation des prostaglandines lors de la réponse inflammatoire (64). Enfin, le sélénium est un nutriment qui diminue la réponse inflammatoire (52). 3- L’insulino-résistance Le syndrome d'insulino-résistance se traduit par une augmentation du taux d'insuline dans le sang, de l'hyper-tension et par la présence d'un haut niveau de triglycérides dans le sang. Ce syndrome correspond à l'insensibilisation des récepteurs à l'insuline. L’insulino-résistance est associée à une augmentation du risque du cancer colorectal. La consommation de graisse et de sucres, l’obésité, l’inactivité physique, un nombre de calories trop élevé, l’âge, l’inflammation ainsi que les substances réactives à l’oxygène favorisent l’apparition de ce syndrome (65). Une restriction calorique diminue la résistance à l’insuline, l’augmentation du taux de lipides dans le sang et la masse graisseuse chez le rat (65). Cette restriction calorique diminue aussi le nombre de lésions précancéreuses. 20 En revanche, les céréales, les légumes, une activité physique quotidienne (30 min/j), un régime pauvre en calories, les antioxydants et les médicaments anti-inflammatoires nonstéroïdiens sont associés à une diminution du risque de ces maladies (65). L’injection de dose d’insuline chez le rat initié à l’azoxyméthane augmente l’incidence tumorale (66). L’hyper-insulinisme augmente le taux de l’insulin-like growth factor-1 (IGF1). IGF-1 induit une prolifération cellulaire au niveau du côlon (67). Par ailleurs, l’inflammation favorise la résistance à l’insuline via la protéine kinase kappa β (65). Comme l’IGF-1, cette kinase favorise la prolifération cellulaire au niveau du côlon et inhibe l’apoptose ainsi que la différenciation cellulaire. 4- Les anti-oxydants et le système de détoxification Les corps étrangers (xénobiotique) non reconnus par l’organisme sont éliminés via différents processus biochimiques, dont le système de détoxification enzymatique. Ce système enzymatique convertit des molécules lipophiles en molécules hydrophiles, plus faciles à éliminer. Ce système fait intervenir deux phases, avec des enzymes distinctes (68): - Les enzymes de phase I : les enzymes de cette phase permet l’hydroxylation aromatique, l’époxidation, l’hydroxylation aliphatique, les réactions de déalkylation, l’oxydation de nitrogène et souffre, la désamination oxydative… Les enzymes sont principalement les cytochromes P450 (classiquement la famille des CYP) et NAD(P)H-quinone oxidoreductase. Après cette phase, les métabolites obtenus ne sont pas moins nocifs : il n’est pas rare d’obtenir un composé plus toxique que la molécule mère. Ce composé formé doit alors être pris en charge par les enzymes de phase II pour éviter les dommages à ADN ou protéines. Par exemple, l’effet cancérigène de l’azoxyméthane au niveau du côlon est lié à la métabolisation de l’AOM par les enzymes de phases I (69). - Les enzymes de phase II : il s’agit d’enzymes permettant des réactions de conjugaison : glucuronidation, sulfation, et conjugaison au glutathion ou aux amino-acides (glucuronyl transférase, sulfotransférase, glutathione S- transférase...). Cette phase conduit à un composé inactif éliminé par l’organisme. La consommation de vitamines, de composés sulfurés et de polyphénols est associée à une diminution du risque du cancer colorectal (2). Cette protection pourrait être liée à la modulation d’enzymes anti-oxydantes. Par exemple, la consommation de S-allyl cystéine diminue le nombre de lésions précancéreuses chez le rat (70). Ceci est corrélé à une 21 augmentation de l’activité de la glutathione S-transférase, enzyme impliquée dans le système de détoxification de la cellule. Par ailleurs, les polyphénols du thé augmentent l’activité des enzymes de détoxification : glutathion peroxidase, catalase, quinone reductase et enzyme de phase II (71). Les polyphénols sont des composés qui inhibent l’induction de la cancérogenèse colique chez des rats initiés à l’azoxyméthane (72) 5- Polymorphisme génétique Le polymorphisme génétique peut avoir des conséquences dans la cancérogenèse colorectale, comme c’est le cas des amines hétérocycliques. Ce sont des composés formés lors de la cuisson de poissons ou de viandes grillés. Elles sont produites au cours de la pyrolyse des acides aminés et des protéines à de hautes températures (73). De même, les amines hétérocycliques comprennent les molécules ayant une moitié imadazo-quinoline, imidazoquinoxaline ou imidazo-pyridine. Ces molécules sont normalement métabolisées par les mono-oxygénases à cytochrome P450. Néanmoins, leur métabolisation peut engendrer la formation de métabolites réactifs susceptibles d’induire des lésions à l’ADN (74). Les amines hétérocycliques induisent la formation de lésions précancéreuses dysplasiques, avec accumulation de β-caténine (75). Plusieurs enzymes interviennent dans le métabolisme des amines hétérocycliques, telles que les N-acetyltransferases (NAT). Il existe un polymorphisme chez ces enzymes, avec principalement deux gènes distincts NAT1 et NAT2 (76). Des études cas-contrôle ont montré que des phénotypes rapides de NAT2 (acétyleurs rapides) en conjonction avec des niveaux d’exposition élevés aux amines hétérocycliques sont des facteurs de risque du cancer colorectal (77). Des amines hétérocycliques données à des rats Fisher 344 « acétylateurs rapides » induisent plus de lésions précancéreuses chez ces rats que chez des rats WistarKyoto « acétylateurs lents » (78). V- Réaction de nitrosation et nitrosylation 1- Définition La présence de nitrites dans la charcuterie peut favoriser les réactions de nitrosylation (79). Elles correspondent à l’ajout d’un ion nitrosyl NO- sur des métaux M (réaction de Mnitrosylation : exemple du fer donnant dur fer nitrosylé) ou des groupements thiols (réaction de S-nitrosylation donnant des composés S-nitrosothiol). 22 La présence de nitrites peut aussi favoriser les réactions de nitrosation, correspondant à l’ajout d’ions nitrosonium NO+ sur une amine ou une amide, formant des nitrosamines ou nitrosamides respectivement. L’ion nitrosonium peut réagir avec les amines Iaires et IIaires, mais seules les dernières forment des nitrosamines stables. Plusieurs facteurs interviennent dans les réactions de nitrosation : - le pH : le pH optimal est en général 3-3,4 (80) - la température : plus la température s’élève, plus la vitesse de réaction augmente. Il est à noter néanmoins que, du fait de la congélation de l’eau, la vitesse de réaction augmente jusqu’à -18°C pour diminuer ensuite (80) - la basicité de l’amine : plus le pKb de l’amine est important, plus la vitesse de réaction augmente (80). 2- Réaction de nitrosation et de nitrosylation dans la charcuterie D’après le schéma de Honickel (figure 5), les nitrites, sous forme d’acide nitreux, peuvent former de l’oxyde d’azote et favoriser ainsi la formation de pigments nitrosylés tels que l’hème nitrosylé (= fer héminique nitrosylé) (81). Néanmoins, l’acide nitreux peut aussi, à pH bas, entrer dans des réactions de nitrosation, formant alors des nitrosamines ou acide nitreux nitrosamides (81). acide nitreux anhydre Oxyde d’azote et dioxide d’azote Réaction avec la myoglobine ou groupement thiol acide nitreux acide nitrique Figure 5 : réaction avec l’acide nitreux (d’après Honickel, 2008 (81)) Le pKa de l’acide nitreux est de 3,4. Au pH moyen des charcuteries (pH=5,5), 99% de l’acide nitreux est sous forme d’ions nitrites NO2-, et 1% est sous forme d’acide nitreux. Ceci 23 montre donc que les réactions de nitrosation sont limitées dans la viande. Par ailleurs, on ajoute à toutes les charcuteries de l’acide ascorbique ou de l’érythorbate pour limiter les réactions de nitrosation selon l’équation suivante : NO2- + acide ascorbique => NO + acide déhydroascorbique (82). La présence d’acide ascorbique dans les charcuteries limite ainsi les réactions de nitrosation, mais favorise les réactions de nitrosylation. C’est pour cela que l’on y retrouve de l’hème nitrosylé en grande quantité (83). 3- Réaction de nitrosation et de nitrosylation dans l’estomac La sécrétion d’acide chlorydrique dans l’estomac diminue le pH gastrique à 2. Par ailleurs, les nitrites issus de l’alimentation ou formé à partir des nitrates vont être présents dans l’estomac. Ces conditions favorisent ainsi la formation de nitrosamines et de nitrosamides au niveau gastrique. Par ailleurs, des réactions de nitrosylation sur les groupements thiols ont lieu dans l’estomac, conduisant à la formation de composés S-thionitrosés (84). 4- Réaction de nitrosation et de nitrosylation dans le côlon Les conditions anaérobiques ainsi que l’augmentation du pH induisent une dissociation des composés S-thionitrosés en disulfiques et en oxyde d’azote (85). L’hème issu de l’alimentation et présent au niveau colique peut donc être nitrosylé. Ceci explique pourquoi Khunle et al. ont dosé une forte quantité de fer nitrosylé dans le côlon, après ingestion de viande rouge ou de charcuterie (85). Certaines nitrosamines non absorbées peuvent se retrouver au niveau du côlon, et exercer leur effet potentiellement mutagène sur l’épithélium colique (86). Elles peuvent aussi induire des adduits à l’ADN (87). En revanche, le pH du côlon, qui est voisin de la neutralité ne permet pas des réactions de nitrosation. VI- Le cancer colorectal et la consommation de viandes Les études effectuées sur la relation entre la consommation de viande rouge et le risque du cancer colorectal ont longtemps été controversées, comme le montre la revue de Parnaud et Corpet (88). La consommation de viande rouge augmente le risque du cancer colorectal, mais toutes les études ne vont pas dans le même sens. Néanmoins, depuis cette 24 revue, trois méta-analyses ont été réalisées et montrent que la consommation de viande rouge est associée au risque du cancer colorectal (89-91). L’effet controversé de la relation entre la consommation de viande rouge et le risque de cancer colorectal vient principalement de l’ambiguïté du terme « viande » utilisé dans les études épidémiologiques, et de l'absence d'effets observés chez les rongeurs dans les études publiées avant 2000. Des études expérimentales ont été réalisées afin de valider ces données épidémiologiques et d’identifier l’agent responsable de la promotion du cancer colorectal. Plusieurs hypothèses ont été émises : - l’hème présent dans les viandes rouges est promoteur du cancer colorectal (92-98) (figure 6). - la consommation de viande rouge augmente la formation « d’apparent total Nnitroso compounds » (ATNC) dans les fécès (84, 85, 99). Les ATNC incluent toutes les molécules ayant un oxide d’azote NO : composés S-thionitrosés, fer héminique nitrosylé ainsi que les composés nitrosés (NOCs). Les NOCs sont des agents mutagènes et forment des adduits à ADN spécifiques aux NOCs au niveau des cellules de la muqueuse colique (87) (figure 6). - la cuisson des viandes rouges provoque la formation d’amines hétérocycliques (AHCs) et d’hydrocarbures aromatiques polycycliques (100-103) (figure 6). Ces composés sont mutagènes et cancérigènes et peuvent agir au niveau de la muqueuse colique. Néanmoins, l’hypothèse que ces composés sont les agents responsables de la promotion du cancer colorectal par les viandes rouges reste controversée. En effet, la viande de poulet, dont la consommation n’est pas associée au risque du cancer colorectal par l’épidémiologie, contient beaucoup d’amines hétérocycliques quand il est frit ou grillé. De plus, les doses d’AHCs utilisées dans les expérimentations animales sont 1000 à 100 000 fois plus importantes que celles auxquelles sont exposés les Hommes. - enfin, d’autres agents ont été étudiés, tels que les acides biliaires, les graisses, les protéines, le fer… mais les études sur ces composés sont controversées et ceux-ci n’apparaissent pas comme les agents principaux responsables de la promotion du cancer colorectal par les viandes rouges. L’épidémiologie suggère que la consommation de charcuterie est associée au risque du cancer colorectal. Une consommation de 25-30g/j de charcuterie augmente le risque du cancer colorectal de 9 à 49%, alors que la consommation de 100-120g/j de viandes rouges 25 l’augmente de 17 à 24% (89-91). Le risque attribué à la consommation de charcuteries est donc plus fort que celui attribué à la consommation de viande rouge. J'ai publié en 2008 dans "Nutrition and Cancer, an International Journal" une revue bibliographique sur la relation entre la consommation de charcuteries et le cancer colorectal (104). Cette revue s’intéresse dans un premier temps aux données épidémiologiques, puis elle discute les principaux composés pouvant jouer un rôle dans le risque du cancer colorectal par les charcuteries. Cette publication est présentée ci-après, suivie d’un paragraphe reprenant les principales conclusions de la revue. A : hème B : nitrosamines C : amines hétérocycliques 2-Amino-1-methyl-6phenylimidazo[4,5-b]pyridine 2-Amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline Figure 6 : schéma de l’hème (A), formule chimique des nitrosamines (B) et exemples d’amines hétérocycliques (C). 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Bilan de la revue "Santarelli et al, 2008" : L’épidémiologie propose une association positive entre la consommation de charcuteries et de viande rouge et le risque du cancer colorectal. Elle suggère que le risque est six fois plus important pour la charcuterie que pour la viande rouge. L’hème et les composés nitrosés/nitrosylés sont les principaux agents qui pourraient expliquer la promotion du cancer colorectal par les charcuteries. L’hème présent dans la viande rouge est promoteur du cancer colorectal (96-98). Nous avons donc émis l’hypothèse que l’hème présent dans les charcuteries pourrait être l’agent responsable du cancer colorectal. Par ailleurs, la forme de l’hème pourrait avoir un effet sur le risque du cancer colorectal. En effet, la plupart des charcuteries contiennent des nitrites et sont cuites. De ce fait, l’hème est libéré de la myoglobine lors de la cuisson et est nitrosylé en présence de nitrites, du fait de la transformation des nitrites en oxyde d’azote NO (105). Il est donc sous la forme d’hème nitrosylé dans les charcuteries cuites et contenant de l’hème (figure 7). La différence de forme entre l’hème de la viande rouge et l’hème nitrosylé des charcuteries pourrait expliquer la différence de risque de cancer colorectal suggérée par les études épidémiologiques. L’hème favorise la formation d’ATNC dans les fécès, et semble être un catalyseur nécessaire à leur formation chez l'Homme (106). Les ATNC reflètent indirectement les NOCs présent dans les fécès, qui sont des composés alkylants et mutagènes. Une consommation de viande rouge ou de charcuteries augmente la quantité d’ATNC dans les fécès, chez le rat et chez l’Homme. Mais aucune étude ne prouve que ces ATNC mesurés dans les fécès sont toxiques sur un épithélium colique. Enfin, les effets d’autres composés tels que les graisses, les protéines, les AHCs ont été discutés par Santarelli et al. Ces composés ne semblent pas être les principaux agents expliquant l’effet promoteur des charcuteries. Figure 7 : schéma de l’hème nitrosylé (d’après Hogg, 2007 (103)). 39 VII- Rôle de l’hème dans la cancérogenèse colique L’hème est une molécule contenant un atome de fer au centre d’un anneau organique appelé porphyrine. L’hème est souvent lié à une protéine (globine) pour former ensuite la myoglobine ou l’hémoglobine. Les viandes rouges ou les charcuteries contiennent de la myoglobine. Dans ces matrices alimentaires, le fer peut se retrouver sous différentes formes (fer ferrique ou ferreux). De même, les procédés de fabrications comme la cuisson vont dissocier l’hème de sa globine (83). Du fait de la présence de fer ainsi que de la porphyrine, l’hème peut interagir avec différentes molécules et favoriser ainsi la peroxydation lipidique ou la formation de composés nitrosés. 1- La peroxydation lipidique La peroxydation lipidique est un phénomène physiologique naturel apparaissant au cours de réactions enzymatiques (via les cyclo-oxygénases ou la lipooxygénases). La peroxydation lipidique des acides gras poly insaturés (AGPIs) conduit à la formation de prostaglandines, thromboxanes ou leucatriènes. Néanmoins, il existe aussi une peroxydation lipidique spontanée. a- Aspect général de l’oxydation des AGPIs n-3 et n-6 L’acide linoléique et l’acide α-linolénique sont deux acides gras poly-insaturés appartenant à la classes des oméga-6 et oméga-3 respectivement (AGPI n-6 et AGPI n-3). Ces AGPIs sont des acides gras essentiels car l’organisme ne peut pas les fabriquer (107). Ils doivent donc être apportés par l’alimentation. Le ratio omega 6/omega 3 est important à prendre en considération, car un déséquilibre peut induire des problèmes cardiovasculaires ou des cancers (107, 108). Du fait de la présence de liaisons insaturées, les AGPIs réagissent avec l’oxygène et des réactions en chaîne vont se dérouler. Ceci se caractérise par trois phases (figure 8): - l’initiation : arrachement d’un atome d’hydrogène (H°) à un groupement méthylène (-CH2) et formation d’un radical libre (R°) puis formation d’un hydroperoxyde (ROO*) en présence d’oxygène - la propagation : l’hydroperoxyde formé attaque un AGPI à proximité, qui, à son tour, donne un radical libre puis un hydroperoxyde. Ceci 40 constitue la réaction en chaîne. Les hydroperoxydes peuvent former aussi des produits de décomposition ou des radicaux alcoxyles (RO°) - la terminaison : deux hydroperoxydes réagissent ensemble (ROOR’+ O2), ou un hydroperoxyde réagit avec un radical libre (ROOR’) ou un radical libre réagit avec un antioxydant. Ceci met fin à la phase de propagation. RH +X° R° XH + R° O2 ROO°+ R’H R’° ROO°+ R’OO° ROO° R’°+ ROOH O2 R’OO° ROOR’ + O ROO° +R’ ROOR’ R°+ Antiox R-Antiox 2 Figure 8 : schéma des étapes de peroxydation lipidique des AGPIs Ces réactions interviennent notamment au niveau des membranes cellulaires, riches en AGPIs. Il en résulte une perte de la fluidité membranaire et une altération des échanges ioniques. Outre la formation de prostaglandines, thromboxanes ou leucatriènes, des alcanes peuvent aussi être générés, tels que l’éthane et le pentane (109). La peroxydation lipidique des AGPIs mène à la formation d’aldéhydes, tels que le malondialdéhyde ou des hydroxyalcénals (exemple du 4-hydroxy-2-nonenal). b- Effet de l’hème sur l’oxydation lipidique La consommation de fer héminique et d’huile de carthame (riche en AGPIs n-6) augmente l’incidence du cancer du colon chez le rats initiés à la N-nitroso-N-méthyluréee (110). Le fer héminique catalyse la formation de radicaux peroxyles ROO° à partir des hydroperoxydes présents dans les lipides, de façon plus importante que le fer inorganique (111). Des travaux in vitro ont montré que ces radicaux sont capables de cliver de l’ADN plasmidique, ce qui supporte leur capacité à induire des dommages à l’ADN (110). Par ailleurs, l’oxydation des AGPIs n-6 conduit à la formation de produits secondaires tels que des aldéhydes, et notamment le 4-hydroxy-2-nonenal (HNE, figure 9). La présence d’hème dans les aliments (viandes rouges) favorise la formation de HNE (112). Le HNE est une molécule réactive du fait de la présence de double liaison C=C, du groupement carbonyl C=O 41 et du groupement hydroxyl OH (113). Il est ainsi très réactif et peut interagir avec les groupements thiols et amines. Il peut donc agir sur les protéines, les lipides, l’ADN et l’ARN. Figure 9 : 4-hydroxy-2-nonenal De même, l’hème catalyse les réactions de peroxydation de la façon suivante : ROOH (hydroperoxyde) + heme → ligand ROOFe → RO° (radical alkoxyl) + °OFe ligands (heme-oxyradical) (114). La présence de radicaux RO° peut alors induire des réactions radicalaires en chaînes. Tous les produits d’oxydation formés par la réaction entre l’hème et AGPIs (ROO°, RO°, aldéhydes…) sont des composés pouvant réagir avec les protéines, les lipides, l’ARN et l’ADN. Ces produits peuvent donc être toxiques et être impliqués lors de la cancérogenèse colique. 2- Heme et composés nitrosés La réduction exogène et endogène des nitrates par des micro-organismes forme des nitrites. Ceux-ci peuvent favoriser les réactions de nitrosation (ajout d’ion nitrosonium NO+ sur une amine ou une amide par exemple, formant des nitrosamines et nitrosamides respectivement) (79). Les nitrosamides sont des composés directement cancérigènes, alors que les nitrosamines nécessitent d’être hydroxylées via le cytochrome P450 (115). Elles peuvent alors être cancérigènes et initier des tumeurs. La N-methyl-N-nitrosurée induit une transition G/A, ce qui engendre des mutations sur le gène k-ras (116). Les nitrites peuvent aussi donner lieu à des réactions de nitrosylation (ajout d’ion NO- sur des métaux ou des composés thiols). L’ensemble de ces composés a été, à tort, regroupé sous le nom de NOCs puisque les NOCs ne représentent sensu stricto que les composés N-nitrosés, donc principalement les nitrosamines et les nitrosamides. C’est pour cela que lorsque l’on dose les NOCs dans les fécès ou les aliments (par denitrosation et mesure de l’oxyde d’azote NO par luminescence), on exprime la quantité de NOCs en « ATNC » (apparent total N-nitroso compound) (115). Les principales sources exogènes de composés nitrosés sont les charcuteries, le tabac et la bière. 42 Les composés nitrosés représentent un facteur de risque pour les cancers gastrointestinaux. Des études épidémiologiques montrent en outre une association positive entre la consommation de ces composés et le risque de cancer colorectal (117). La consommation de viande rouge (riche en hème) chez l’Homme augmente le nombre de NOCs dans les fécès (ou ATNC, de façon dose-dépendante), alors que ce n’est pas le cas de la viande blanche, des protéines et du fer inorganique (106, 118, 119). Le fer héminique favorise donc la formation de composés nitrosés. Dans l’estomac, à pH bas, il y a formation de composés nitrosés. Néanmoins, après un régime riche en viande, on retrouve aussi des composés S-nitrosothiols (84). Puis, lorsque le pH augmente dans l’intestin, les S-nitrosothiols sont instables, formant des composés disulfides et l’oxyde d’azote NO. Ce dernier réagit avec l’hème, pour former l’hème nitrosylé, présent en grande quantité dans fécès après un régime riche en viande (84). L’hème nitrosylé peut alors favoriser les réactions de nitrosylations (l’hème étant un donneur de NO) (84). 3- Etude in vitro sur l’effet de l’hème Le fer héminique (sous forme d’hémoglobine ou d’hémine : forme stabilisée de l’hème par un chlore fixé en axial sur le fer) est cytotoxique et génotoxique sur des cellules de carcinomes HT-29 et des primocultures (120). La peroxydation lipidique est impliquée puisque le diméthyl sulfoxide (un piègeur de radicaux libres) inhibe ces effets toxiques. Par ailleurs, le fer inorganique n’a pas d’effet cytotoxique sur les cellules de carcinomes HT-29 ni sur les cellules d’adénomes humaines LT97, ce qui montre que l’effet est spécifique au fer héminique (121). De même, l’hémoglobine favorise la croissance cellulaire des cellules HT29 de manière dose-dépendante et augmente la quantité de substances réactives à l’oxygène dans ces cellules (122). 4- Etude in vivo sur la relation hème/cancer colorectal Plusieurs études épidémiologiques, mais pas toutes, ont montré que la consommation de fer héminique est associée au risque du cancer colorectal (123-125). Pour étayer ces données, des études in vivo ont été réalisées. Un régime élevé en hémine induit des marqueurs de risques d’apparition de cancer : cytotoxicité des eaux fécales, hyperprolifération de l’épithélium colique et inhibition de 43 l’exfoliation des colonocytes (92-95, 126). L’effet semble être spécifique de la forme héminique du fer puisque le citrate de fer n’a pas d’effet sur la cytotoxicité des eaux fécales ni sur l’hyperprolifération de l’épithélium colique. Par ailleurs, des régimes riches en hémine et en hémoglobine augmentent la taille des foyers de cryptes aberrantes (FCA), considérés comme des lésions précancéreuses, d’une manière dose-dépendante, chez les rats induits par l’azoxyméthane (AOM) dans le cadre d’un régime pauvre en calcium (96). De même, des viandes apportant différentes concentrations en hème (poulet, pauvre en hème, bœuf et boudin, riches en hème) ont été testées sur l’induction des FCA et des foyers déplétés en mucine (FDM) considérés comme de meilleurs marqueurs de lésions prénéoplasiques que les FCA (97, 127). Toutes les viandes augmentent le nombre de FCA, y compris le poulet, mais l’effet est significativement supérieur pour les viandes contenant de l’hème. De même, seules les viandes rouges augmentent le nombre de FDM, plus prédictifs de la cancérogenèse colique. L’hème semble donc être l’agent promoteur de la cancérogenèse colorectale. L’effet toxique de l’hémoglobine pourrait être lié au 4-hydroxy-2-nonenal : un régime de bœuf induit une plus forte cytotoxicité des eaux fécales de rats sur des cellules saines Apc +/+ par rapport à des cellules mutés Apc Min/+, de façon comparable à celle du HNE (128). VIII- Modèle expérimental de cancérogenèse colorectale 1- Les modèles de cancérogenèse colorectale Au cours de ma thèse j'ai utilisé comme modèle animal des rats ayant reçu une injection d'un produit cancérigène par voie intra péritonéale. Les rongeurs ne développent pas spontanément de cancer colorectal, c’est pourquoi il faut leur injecter un cancérigène spécifique du côlon pour initier la cancérogenèse. Plusieurs cancérigènes peuvent être utilisés : - la diméthylhydrazine (DMH) et son métabolite l’azoxyméthane (AOM). Ce sont les deux cancérigènes coliques les plus utilisés. La DMH est métabolisée dans le foie en AOM, qui est ensuite transformée en methylazoxymethanol. Ce dernier métabolite forme alors des ions methyl-carbonium CH3+, un électrophile qui provoque des mutations par mésappariements au niveau G-T sur l’ADN. Les tumeurs induites par l’injection d’AOM chez le rat portent des mutations sur le gène K-ras et ß-catenin et 44 ont une instabilité des microsatellites comme les tumeurs coliques de l’Homme (129, 130). Néanmoins, l’induction par l’AOM ne cause pas de mutations sur le gène Apc (adenomatous polyposis coli) ni sur le gène p53. Pour l’induction de lésions précancéreuses ou de tumeurs, l’AOM est plus utilisé que la DMH, cependant, elle est plus dangereuse pour l’opérateur car c'est une poudre électrostatique (131, 132). Les souches de rats utilisés sont en général les rats Wistar, les rats Sprague-Dawley ou les rats Fisher F344 (132). Pour les études de moyen terme (100 j) de ma thèse, j’ai effectué une injection de DMH intra péritonéale pour initier des rat F344 (figure 10). Nous avons décidé de ne faire qu’une seule injection, alors que, de façon générale, au moins deux injections sont réalisées. En effet, une seule injection de DMH suffit à promouvoir des tumeurs de façon dose-dépendante (133). De même, des études montrent qu’une seule injection de DMH suffit à avoir un effet protecteur des aliments (134). 7j.7j. H3C NH DMH NH CH3 Régime base j0 100j. Régimes expérimentaux DMH Randomisation sacrifice Récolte fécès et urines Figure 10 : protocole expérimental lors des études de moyen terme (100 j) avec initiation à la diméthylhydrazine (DMH) - la méthylnitrosourée (MNU) ou la n-Methyl-n-Nitro-n-Nitrosoguanine (MNNG), appartenant à la classe des nitrosamines, donc aussi des NOCs. La MNU doit être administrée de façon intra rectale, car c'est un cancérigène direct qui agit au point d'injection sur les cellules rencontrées, sans avoir besoin d'activation métabolique. Par ailleurs, les nitrosamines induisent moins de tumeurs que la DMH ou l’AOM : quatre injections successives de MNNG (0.5 mL d’une solution à 5 mg/mL) deux fois par semaines durant deux semaines induisent 80% d’incidence et seulement une à deux tumeurs par animal chez le rat Wistar (132, 135). Comparées à la DMH ou l’AOM, les nitrosamines sont donc moins pratiques d’utilisation, moins spécifiques (la MNU induit des tumeurs sur différents sites) et moins efficaces. - les amines hétérocycliques (AHCs) telles que le 2-amino-1-methyl-6- phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP), le 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline et le 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline. Ce sont des cancérigènes coliques 45 qui sont produits par l'action de hautes températures sur du muscle : on les trouve donc dans les viandes et les poissons grillés ou cuits au four. Le PhIP induit 50% d’incidence de tumeurs colorectales chez le mâle F344 après 52 semaines de régime contenant 400 ppm de la molécule (132). Aucun carcinome colique n’est observé après deux ans de régimes contenant 25 ppm de PhIP. Les AHCs sont beaucoup plus chères que l’AOM ou la DMH, induisent moins de lésions précancéreuses par côlon et sont moins pratiques d’utilisation. Un autre type de modèle animal du cancer colorectal est très utilisé : le modèle génétique. Ce modèle utilisé pour l’étude de la cancérogenèse colique est apparu dans les années 1990 avec la découverte de la souris Min (Multiple Intestinal Neoplasia) mutée sur le gène Apc (136). Ces souris portent une mutation sur le gène Apc comme l’on peut retrouver cette mutation dans les tumeurs intestinales chez l’Homme. Après l’étude plus approfondie de ce modèle, Su et al. ont observé une mutation germinale non sens au niveau du codon 850 du gène Apc (137). Cette mutation engendre une transition T-A. Lors de la traduction, la mutation induit la transformation d’une leucine en un codon stop, et donc l’obtention d’une protéine APC tronquée. Les adénomes (stade non invasif) se situent principalement au niveau de l’intestin grêle et certains progressent en adénocarcinomes (stade invasif). Il n’y a pas de lésions précancéreuses dans ce modèle, contrairement à ce que l’on peut trouver chez l’Homme. Récemment, un nouveau modèle de souris a été réalisé, la souris Apc∆14/+ (138). La principale différence avec la souris Min est la localisation des lésions cancéreuses dans le côlon et rectum. D’autres modèles induisant la formation de la protéine APC tronquée en position 716, 1309, 1638, etc. existent (129). Par ailleurs, des modèles encore mutés sur les gènes Msh2 (MutS homolog) ou Mlh1 (MutL homolog) sont présents. Ces gènes appartiennent à la famille des gènes impliqués dans le système de réparation des mésappariements de l’ADN (MMR pour mismatch repair). Ces gènes sont impliqués lors de la cancérogenèse colorectale, modèle du syndrome HNPCC (Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer). Enfin, il existe aussi un modèle muté sur la β-caténine avec quelques lésions précancéreuses spontanées : modèle A33∆Nbcat (139). Le modèle muté pour le futur est peut-être le rat « Apc mutated » avec une répartition des polypes assez proche de celle observée chez l’Homme (140). Les modèles murins mutants sont de bons instruments pour l’étude de la cancérogenèse colorectale. Ils ont permis de mieux comprendre les mécanismes génétiques 46 mis en jeu. De même, ces modèles ont permis l’étude de facteurs environnementaux et ont permis de tester de nombreux agents pharmaceutiques et alimentaires pour la prévention du risque du cancer colorectal. L’avantage d’un tel modèle est qu’il évite la manipulation de produits cancérigènes tels que l’AOM ou la DMH. L’apparition spontanée d’adénomes chez ce modèle permet de réaliser des études jusqu'au stade adénome, plus rapidement qu'avec les tumeurs induites chimiquement (environ 30 jours pour l’apparition d’adénomes contre 200 jours avec des tumeurs chimio-induites). L’avantage de tels modèles animaux est leur contexte génétique maîtrisé et connu. Par ailleurs, ce contexte génétique est proche de celui de l’Homme lors de la cancérogenèse colorectale. Néanmoins, les lésions développées sont localisées principalement au niveau de l’intestin grêle, ce qui est contraire à ce que l’on trouve chez l’Homme. 2- Etude des lésions pré-cancéreuses La muqueuse du côlon ne comporte pas de villosités (contrairement à l'intestin grêle) mais uniquement des invaginations, qui portent le nom de cryptes ou cryptes de Lierberkühn (141) (figure 11). Le côlon est un épithélium formé d’environ 10 millions de cryptes contenant plus d’un millier de cellules (142). Les cellules formant la crypte sont de types différents : - les cellules de Paneth : elles auraient un rôle anti-bactérien, et elles interviendraient dans la régulation de l’apoptose. - les cellules en gobelet (ou caliciforme) ; elles sécrètent le mucus qui lubrifie la muqueuse et facilite ainsi le transit intestinal. Le mucus contient des mucines, des glycoprotéines. - Les colonocytes (ou entérocytes du côlon) : ces cellules ont un rôle d’absorption, mais on donne aussi ce nom aux cellules en gobelet. - Les cellules endocrines : elles sont peu nombreuses au sein d’une crypte (environ 5-10 par crypte). D’autres types de cellules existent au niveau du côlon, telles que les cellules M. Ce sont des cellules placées entre les entérocytes et leur forme dégage une cavité où viennent migrer des lymphocytes et des macrophages. Les cellules M sont capables de faire de 47 l’endocytose et permettent le transit de molécules (antigéniques) jusqu’aux cavités existant dans les espaces intestinaux. Ces cellules sont localisées au niveau des plaques des Peyer. Légende : CL : Cryptes de Lieberkühn GC: les cellules en gobelet (ou caliciforme) E : Epithélium BL : Lamina basale LP : Lamina propria TM : tuniques muqueuses LMM : muscularis muqueuse G : ganglions Figure 11 : schéma de cryptes du côlon (d’après Krstic, 1991 (141)). L’injection des cancérigènes cités ci-dessus engendre, probablement après l'induction de mutation, et avant l'émergence de tumeurs macroscopiques, la formation de lésions prénéoplasiques. Les premières lésions observées ont été les foyers de cryptes aberrantes (FCA) découvertes par Bird et al. (143) (figure 12). Les FCA sont observables dès deux semaines après l’injection du cancérigène, en colorant la muqueuse colique au bleu de méthylène (144). Les FCA ont des cryptes plus intensément colorées en bleu et ont une zone péricryptale plus importante que les cryptes ordinaires. Ils sont généralement sur-élevés par rapport à la muqueuse colique et ont une ouverture de crypte plus allongée et plus dilatée que les cryptes normales (145). Les FCA possèdent des marqueurs moléculaires de cancérogenèse colorectale. On observe une expression de la prolifération cellulaire (sur-expression du gène c-fos). On observe aussi des mutations sur le gène Apc (146, 147). Ils présentent enfin des caractères d’hyperplasie, 48 tels que la présence de gros noyaux, l’absence de polarité des cellules, une augmentation des mitoses et l'absence de mucine (146). Les FCA contiennent de deux à plus de vingt cryptes aberrantes, et certains peuvent évoluer en adénocarcinomes (148, 149) (figure 13). Foyer Crypte aberrante Figure 12 : photo d’un foyer de cryptes aberrantes (FCA, avec plus de 20 cryptes aberrantes), recopiée sur le site du Pr. D.E Corpet (http://www.inra.fr/reseau-nacre/sci-memb/corpet/indexan.html) Figure 13 : transformation d’une crypte normale en un adénocarcinome en passant par le stade de foyer de cryptes aberrantes (http://www.inra.fr/reseau-nacre/sci-memb/corpet/indexan.html). Plus récemment, les foyers déplétés en mucine (FDM) ont été découverts et sont considérés aussi comme des lésions pré-néoplasiques (127) (figure 14). Ils sont observables par une coloration à « high-iron diamine alcian blue » (HIDAB) et caractérisables par l’absence ou une production nulle ou limitée de mucine. De plus, les cryptes sont plus petites que les cryptes normales, on observe une distorsion de la lumière colique qui est aplatie et allongée au lieu d’être ronde (127, 150). Les FDM sont visibles sept semaines après une injection d’AOM. Les FDM sont beaucoup moins nombreux que les FCA, ce qui est plus cohérent avec le nombre de tumeurs observées sur un côlon (plus de 100 FCA, moins de dix FDM, et environ 2 tumeurs par côlon en moyenne) (150). De plus, l’augmentation d’injection de DMH induit une augmentation du nombre de FDM par côlon. Des mutations sur le gène codant pour la β-caténine ou sur le gène Apc ont été observées dans les FDM, similaires à celles trouvées dans des tumeurs coliques (151, 152). 49 Foyer Crypte Figure 14 : photo d’un foyer déplété en mucine (FDM, avec plus de 6 cryptes), recopiée sur le site du Pr. D.E Corpet (http://www.inra.fr/reseau-nacre/sci-memb/corpet/indexan.html) Les FDM sont plus difficiles à compter que les FCA, mais sont plus dysplasiques et présentent des mutations plus proches des tumeurs macroscopiques : ils semblent donc plus prédictifs de la cancérogenèse colique que les FCA (127). Ces deux types de lésions précancéreuses sont retrouvés chez l’Homme et sont utilisés dans les études de moyen terme (100 jours) sur des rats initiés (153-155). D’autres types de lésions existent, telles que les Beta-Catenin-Accumulated Crypts (BCAC). Elles sont détectées après marquage immunohistochimique de coupe de tissu (156, 157). IX- Rôle du gène Apc dans la cancérogenèse colorectale La mutation sur le gène Apc est un évènement précoce lors de la cancérogenèse colorectale. Elle intervient dans les types de cancer colorectal sporadique (les plus nombreux) et dans la polypose adénomateuse familiale ou PAF (moins de 1% des cancers colorectaux) (158). 1- Structure de la protéine APC Le gène Apc se localise sur le chromosome 5(q21). Il contient 15 exons et code pour une protéine de 300 kDa (protéine APC) composée de 2843 acides aminés (159). Cette protéine cytoplasmique et nucléique est constituée de différents domaines (figure 15). Dans sa partie N-terminale se situe un domaine d’homodimérisation. A proximité de ce domaine, on retrouve le domaine « d’Armadillo » avec des séquences répétées permettant une association avec le cytosquelette de la cellule (réseau avec l’actine pour la motilité). La partie C-terminale présente un domaine de liaison aux microtubules (large proportions d’arginine et de lysine). De même, cette dernière partie possède un site de fixation à une protéine EB1, dont la fonction serait associée au cycle cellulaire (159). Enfin, elle contient un autre site de fixation à la protéine humaine homologue de la protéine DLG « Discs Large Gene » de la drosophile. 50 La partie centrale de la protéine contient un site de fixation à la β-caténine ainsi qu’un domaine régulant cette fixation (site kinase-régulateur). Figure 15 : Protéine APC et ses différents domaines (d’après Narayan et Roy, 2003 (112)). Légende : Oligomerization domain : domaine homodimérisation Armadillo repeat domaine : domaine d’Armadillo avec des séquences d’acides aminés répétées β-catenin binding et β-catenin binding and down regulation : domaine de fixation et de régulation de la fixation à la β-caténine microtubule binding site (basic domain) : domaine de fixation aux microtubules, riche en arginine et lysine h-DLG binding site : site de fixation à la protéine humaine homologue de la protéine DLG « Discs Large Gene » de la drosophile. A proximité de ce domaine se localise le site de fixation à la protéine EB1. 2- Fonction de la protéine APC a- Régulation du pool de β-caténine via le signal Wnt La voie de signalisation Wnt-1 (équivalent de la voie Wingless chez la drosophile) intervient lors de l’organogenèse, la prolifération cellulaire, la motilité et le devenir des cellules embryonnaire (160, 161). La voie de signalisation Wnt-1 intervient dans l’association d’un complexe protéique : l’axine, APC, β-caténine et la glycogène synthase-3 β kinase (GSK3 β). Dans une cellule colique normale, APC permet d’assurer un niveau cytosolique faible de β-caténine, en stimulant sa dégradation. APC forme en effet un complexe avec l’axine, la β-caténine et la GSK3β, favorisant ainsi la phosphorylation de la β-caténine. Sa phosphorylation permet ainsi son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome (162). Dans une cellule normale non stimulée par Wnt-1, la phosphorylation de ce complexe permet ainsi la dégradation de la β-caténine (figure 16). Lorsque la voie Wnt-1 est activée, il y a inhibition de la phosphorylation, le complexe APC/β-caténine est stabilisé, et il y a une augmentation du pool de la β-caténine libre (figure 17). Cette dernière protéine va donc s’associer avec des facteurs de transcription Tcf/Lef (T cell factor/Lymphoid enhancer factor), et notamment Tcf4 dans les cellules coliques. Le complexe Tcf4/β-caténine régule alors les proto-oncogènes et régulateurs du cycle cellulaire c-Myc (impliqué dans la prolifération 51 cellulaire), ainsi que la cycline D1 (163). Ainsi, la troncation de la protéine APC ne permet pas la formation du complexe APC/β-caténine (figure 18). Le pool de la β-caténine libre va donc augmenter dans la cellule et va ainsi favoriser la formation du complexe β-caténine/Tcf4 dans les cellules coliques. Ce complexe va alors activer en permanence la transcription de cMyc ou de la cycline D1, et favoriser ainsi la prolifération incontrôlée de la cellule. b- Adhésion cellule-cellule et motilité Les E-cadhérines sont des protéines membranaires responsables des liaisons cellules/cellules calcium dépendantes. Elles sont surtout localisées dans la partie apicale des cellules. Les E-cadhérines ont un domaine en C-terminal interagissant avec la β-caténine, mais aussi avec γ-caténine et α-caténine (159). Ce complexe s’associe aussi avec l’actine du cytosquelette (figure 16). L’association de toutes ces protéines permet la stabilité des adhésions cellules/cellules. La protéine APC prend part dans ce complexe puisqu’elle se lie aux caténines (159). Dans une cellule normale, lorsque la voie de signalisation Wnt est activée, on obtient une augmentation de pool de β-caténine qui va s’associer aux facteurs de transcription Tcf/Lef. Ce complexe va inhiber la transcription de gène codant pour les cadhérines, ce qui limite les adhésions cellule/cellule et favorise la prolifération cellulaire (figure 17). Dans une cellule où la protéine APC est tronquée, le complexe cadhérine/caténines/APC sera instable, ce qui diminuera les adhésions cellule/cellule, et isolera la cellule des autres cellules (figure 18). Par ailleurs, APC semble aussi être impliquée dans la migration cellulaire puisqu’elle se lie aux protéines de la famille des kinosines (164). APC s’associe aussi aux microtubules au niveau des régions de la membrane cytoplasmique impliquées dans la migration cellulaire. De même, APC se lie à EB1, une protéine nécessaire à l’intégrité des microtubules (165). 52 Wnt-1 Axine GSK-3β β-caténine E-cadhérines APC α-caténine microtubules actine P APC APC APC β-caténine dégradée Tcf/Lef Tcf/Lef Gènes cibles EB1 APC Bub1 Microtubules Kinétochore Chromosome Centromère Figure 16 : Rôle de APC dans une cellule normale sans activation de la voie Wnt-1 (d’après la thèse de F.Pierre, 1999 (166)). Légende : GSK-3 : glycogène synthase-3 β kinase Tcf/Lef : T cell factor/Lymphoid enhancer factor EB1: protéine associée au cycle cellulaire Bub1 : protéine assciée au cycle cellulaire En l’absence d’activation de la voie Wnt-1, la phosphorylation du complexe APC/β-caténine/GSK-3/axine permet la dégradation de la β-caténine par le protéosome. La β-caténine est ainsi dégradée et ne s’associe donc pas aux facteurs de transcription Tcf/Lef. La transcription de gène tel que c-Myc ou la cycline D1 n’est donc pas activée, d’où l’absence de prolifération cellulaire. Par ailleurs, la β-caténine forme un complexe avec APC, l’actine, l’α-caténine, la γ-caténine et les cadhérines. Ce complexe permet une stabilisation des jonctions inter cellules, et donc une meilleure adhésion cellule/cellule. Enfin, APC s’associe aux microtubules lors de la mitose via EB1, ce qui crée un pont entre les microtubules et les chromosomes. Au moment de la métaphase, APC (associée à d’autres protéines telles que Bub1 et Bub3) intervient notamment l'attachement des microtubules sur les kinétochores, et permet ainsi le partage des chromosomes en deux lots identiques. 53 Wnt-1 n tio bi hi In GSK-3β β-caténine Axine E-cadhérines APC APC α-caténine Taux de β-caténine contrôlé actine Tcf/Lef Activation contrôlée Gènes cibles EB1 APC Bub1 Microtubules Kinétochore Chromosome Centromère Figure 17 : Activation par la voie Wnt-1 dans une cellule normale (d’après la thèse de F. Pierre, (166)). Légende : GSK-3 : glycogène synthase-3 β kinase Tcf/Lef : T cell factor/Lymphoid enhancer factor EB1: protéine associée au cycle cellulaire Bub1 : protéine assciée au cycle cellulaire Lors de l’activation de la voie Wnt-1, la GSK-3 est inhibée, ce qui stabilise le complexe APC/β-caténine est stabilisé, et il y a une augmentation du pool de la β-caténine libre. La β-caténine va s’associer aux facteurs de transcription Tcf/Lef, ce qui active la transcription de gènes impliqués dans la prolifération cellulaire (cMyc/cycline D1). L’association de la β-caténine avec les facteurs de transcription inhibe aussi la transcription de gène des cadhérines. Il y a donc une sous-expression de ces protéines, et donc une diminution des jonctions inter cellules, ce qui favorise la prolifération cellulaire. La bonne conformation de la protéine APC permet une bonne ségrégation des chromosomes lors de la métaphase, et donc une stabilité chromosomique. c- Rôle dans l’instabilité chromosomique Dans les cellules cancéreuses, l’aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) est fréquente. L’aneuploïdie caractérise environ 85% des cancers colorectaux et se produit lors de mitoses. APC peut jouer un rôle dans l’instabilité chromosomique puisqu’en s’associant aux microtubules lors de la mitose via EB1, elle crée un pont entre les microtubules et les chromosomes (159) (figure 16, 17). Au moment de la métaphase, la protéine APC (associée à d’autres protéines telles que Bub1 et Bub3) intervient notamment dans l'attachement des 54 microtubules sur les kinétochores, permettant ainsi le partage des chromosomes en deux lots identiques. La troncature de la protéine APC ne permet donc plus l’association microtubules/kinétochores lors de la mitose, ce qui peut alors entraîner une ségrégation anormale des chromosomes (figure 18). Wnt-1 Axine GSK-3β β-caténine E-cadhérines APC APC α-caténine Taux de β-caténine incontrôlé APC actine Tcf/Lef Activation incontrôlée Gènes cibles Apc tronquée Figure 18 : Implication de la mutation sur le gène Apc dans une cellule initiée (d’après la thèse de F.Pierre (166)). Légende : GSK-3 : glycogène synthase-3 β kinase Tcf/Lef : T cell factor/Lymphoid enhancer factor EB1: protéine associée au cycle cellulaire Bub1 : protéine assciée au cycle cellulaire Une mutation sur le gène Apc peut entraîner une troncature de la protéine APC. Dans ce cas, il n’y a pas formation du complexe β-caténine/GSK-3/axine, et il y a une accumulation incontrôlée du pool de β-caténine. La β-caténine s’associe donc aux facteurs de transcription Tcf/Lef. La transcription de gène tel que c-Myc ou la cycline D1 est activée, ce qui engendre une prolifération cellulaire. Par ailleurs, la protéine non fonctionnelle ne permet pas la stabilité des jonctions inter cellules, ce qui limite les adhésions cellule/cellule et favorise la prolifération cellulaire. APC ne peut pas s’associer aux cytosquelettes de la cellule, ce qui provoque une désorganisation du cytosquelette de la cellule. Enfin, lors de la métaphase, la troncature de la protéine APC ne permet pas l’association entre les chromosomes et les microtubules, ce qui peut alors crée une ségrégation anormale des chromosomes, d’où une instabilité chromosomique. 55 X- Objectifs et enjeux de la thèse Ma thèse est une convention CIFRE entre l’INRA et l’Institut du Porc (IFIP). Elle est intégrée dans un projet de recherche financé par le Programme National de Recherches en Alimentation – Nutrition Humaine (PNRA) de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR). Ce projet sur lequel j’ai travaillé associait différents partenaires : - L’INRA et l’ENVT, associés dans l’UMR1089 Xénobiotiques (Toulouse). Les études expérimentales in vivo sur rats se sont déroulées dans ce laboratoire, ainsi que la mesure des biomarqueurs fécaux et urinaires corrélés à la promotion par l’hème. - L’Institut du Porc (IFIP à Paris) : l’IFIP a fabriqué les aliments à base de viandes saumurées destinés aux rats lors des études expérimentales. - Le Centre de Recherche en Nutrition Humaine (CRNH à Clermont-Ferrand) : l’un des objectifs de ma thèse était de valider chez l’Homme les résultats expérimentaux trouvés chez le rat. Le CRNH prend en charge l’étude humaine, dont les résultats seront connus trop tard pour être intégrés à la thèse. - La Fédération française des Industriels Charcutiers, Traiteurs et transformateurs de viandes (FICT à Paris). Il s’agit d’un syndicat de filière qui intervient lors des communications auprès des industriels. Hors projet ANR, d’autres collaborations ont été réalisées : - Biopolymères, Interactions & Assemblages (UR INRA BIA, à Nantes). L’équipe est intervenue sur la mesure de l’oxydation et de l’oxydabilité des aliments et des viandes saumurées. Plusieurs prestataires de service sont intervenus : - L’atelier d’analyses nutritionnelles des viandes et produits carnés (ADIV à Clermont-Ferrand). Cet atelier a caractérisé l’état d’oxydation des aliments. - Le laboratoire de Recherche Alimentaire (LAREAL, à Vannes). Ce laboratoire privé a analysé différents paramètres sur les aliments et les viandes saumurées. - Le laboratoire de Pollock and Pool Ltd., Reading RG5 4DX, United Kingdom. Ce laboratoire privé a dosé les ATNC dans les fécès de rats. 56 Les enjeux de ma thèse sont triples : • Enjeux scientifiques : ma thèse a été construite afin de (i) tester l’effet promoteur du cancer colorectal de viandes saumurées, (ii) comprendre les mécanismes mis en jeu dans cette promotion, (iii) identifier les agents responsables de cette promotion, (iv) mesurer des biomarqueurs précoces modulés par la consommation de charcuteries et (v) trouver des composés protecteurs limitant ou inhibant la promotion du cancer colorectal par des viandes saumurées. • Enjeux économiques : le WCRF recommande d’éviter de consommer des charcuteries. Ceci pose un problème pour la filière charcutière qui risque de voir son marché en baisse. L’identification de composés protecteurs inhibant l’effet promoteur de viandes saumurées permettrait d’établir des recommandations alimentaires concernant la consommation de charcuteries avec le composé protecteur identifié. Ceci permettrait d’éviter une baisse du marché et le maintien de la filière charcutière. • Enjeux de santé publique : avec l’identification de composés inhibant l’effet promoteur des charcuteries, il serait possible de diminuer l’incidence du risque du cancer colorectal à long terme. 57 Les objectifs de la thèse sont : - Démontrer l’effet promoteur des charcuteries dans un modèle animal de cancérogenèse. L’épidémiologie montre qu’il y a une association positive entre la consommation de charcuteries et le risque du cancer colorectal (104). Néanmoins, peu d’études expérimentales ont été réalisées sur des charcuteries « processed meats » et peu d’entre elles montrent un effet promoteur de la cancérogenèse intestinale. Le boudin noir et le jambon lyophilisé sont promoteurs des lésions précancéreuses (97, 167). Nous voulons tester d’autres types de « processed meats », sous forme de charcuteries du commerce ou de viandes saumurées modèles et évaluer leur effet promoteur sur la cancérogenèse colorectale. L’utilisation d’un modèle expérimental adapté pour l’étude de la relation entre la consommation de charcuterie et le cancer colorectal permettra d’une part de valider les données épidémiologiques observées chez l’Homme, et d’autre part d’identifier les mécanismes mis en jeu lors de la cancérogenèse colorectale. - Trouver des composés protecteurs inhibant l’effet promoteur des charcuteries. Sur la base des travaux déjà réalisés sur la relation entre la consommation de viande rouge et le risque du cancer colorectal, nous avons déjà montré que le calcium inhibe l’effet promoteur de l’hème de la viande rouge (98). La toxicité d’un composé (hème de la viande rouge) peut donc être inhibée par un autre composé (calcium). Nous voulons donc suivre ce concept et l’appliquer pour les charcuteries.Il est possible d’intégrer le composé protecteur: (i) directement dans la charcuterie, en incorporant le composé durant la fabrication, (ii) en incluant le composé dans le régime alimentaire. - Evaluer la toxicité des aldéhydes issus de l’oxydation des AGPIs sur les cellules saines Apc +/+ et Apc Min/+. Les études réalisées sur l’effet des viandes rouges sur la cancérogenèse colique montrent que la peroxydation lipidique est impliquée (96-98). Le 4-hydroxy-2-nonenal, issu de l’oxydation de la famille des omégas 6 pourrait expliquer l’effet promoteur de la viande rouge, car il induit une plus forte toxicité sur les cellules saines Apc +/+ que sur les Apc Min/+ et est présent dans les eaux fécales de rat ayant consommé de la viande de bœuf. Nous voulons donc tester la toxicité d’autres aldéhydes afin d’évaluer leur effet potentiel sur la cancérogenèse colorectale. 58 Etude 1 : Effet de viandes saumurées (charcuteries modèles) sur la cancérogenèse colorectale chez le rat Introduction Les travaux du laboratoire sur la relation entre la consommation de viande rouge et le risque de cancer colorectal ont montré que l’hème est le principal agent responsable de l’effet promoteur du cancer colorectal par les viandes rouges (96-98). La consommation de viande rouge ou d’hème induit une lipoperoxydation (mesurée par le test des TBARs, substances réactives à l’acide thiobarbiturique), une cytotoxicité des eaux fécales qui sont des extraits de fécès (mesurée par le test du 4,5-dimethyldiazol-2-yl-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) et la mesure du DHN-MA urinaire (1,4-dihydroxynonene mercapturic acid, qui reflète le 4hydroxynonenal (HNE), formé dans l’alimentation et in vivo). Ces paramètres sont considérés comme des biomarqueurs corrélés à la promotion par l’hème. Nous avons proposé que l’hème nitrosylé serait l’agent responsable de l’effet promoteur du cancer colorectal par les charcuteries (104). En effet, presque toutes les charcuteries contiennent des nitrites, et beaucoup sont cuites. La cuisson induit la dissociation de l’hème de la myoglobine, et la présence de nitrites conduit à sa nitrosylation. Nous avons aussi supposé que la consommation de charcuteries pourrait moduler les mêmes biomarqueurs précoces corrélés à la promotion par l’hème De ce fait, pour étudier la relation entre la consommation de charcuterie et le risque du cancer colorectal, à partir des travaux de Pierre et al., nous disposons d’une hypothèse H1 et de deux outils d’étude (O1-O2) : - H1 : l’hème nitrosylé serait l’agent responsable de la promotion du cancer colorectal par les charcuteries - O1 : nous comptons utiliser des biomarqueurs précoces corrélés à la promotion par l’hème (cytotoxicité et lipoperoxydation), qui sont aussi modulés par l’hème nitrosylé (167). Ils sont modulés dès 14 jours et semblent prédictifs de la cancérogenèse colorectale d’après les travaux de l’équipe. - O2 : nous disposons d’un modèle animal pour l’étude de la cancérogenèse colorectale et qui développe des lésions pré-néoplasiques : le rat F344 chimio-induit par un 59 cancérigène spécifique de l’intestin, l’azoxyméthane (AOM) ou la diméthylhydrazine (DMH). Lors de la fabrication des charcuteries, les viandes subissent divers traitements technologiques, notamment broyage, ajout de sel, de nitrate ou de nitrite, et cuisson. Nous avons donc voulu tester l’impact de certains facteurs de fabrication sur la cancérogenèse colorectale. Les quatre facteurs choisis sont des facteurs « importants » et usuels lors de la fabrication des charcuteries. Ce sont : - la quantité d’hème présent dans la viande, avec deux types de muscles de porc, l’un très rouge, l’autre très clair : l’épaule supraspinatus et infraspinatus, contenant 15 à 17 mg/100 d’hème et la longe longissimus dorsi, contenant 0,36 à 2 mg/100g d’hème (168, 169). Les abréviations utilisées pour ce facteur sont ‘D’ pour l’épaule (Dark=riche en hème) et ‘L’ pour la longe (Light=peu d’hème). - la cuisson de la viande : viande cuite à 70°C ou viande dite « crue » (chauffée à 50°C seulement) dans un bain-marie. Les abréviations utilisées pour ce facteur sont ‘C’ pour les viandes cuites et ‘R’ pour les viandes crues (Raw=crue). - le type de sel : sel ordinaire ou sel nitrité à 0,6%. Dans l’étude décrite ci-après, les viandes cuites à 70°C contenaient 2% de sel, alors que les viandes dites « crues » (en fait, chauffées à 50°C) contenaient 2.5% de sel. En effet, la cuisson favorise et facilite la diffusion du sel dans la viande, c’est pourquoi nous avons choisi pour les viandes cuites une concentration saline inférieure aux viandes « crues ». Les abréviations utilisées pour ce facteur sont ‘Z’ pour l’absence de nitrite (Zero nitrites) et ‘N’ pour les viandes avec nitrites. - l’état d’oxydation de la viande : les viandes dites « oxydées » ont été laissées à l’air 5 jours à 4°C dans l’obscurité, alors les viandes dites « anaérobies » ont été emballées sous vide en sac plastique étanche, directement après la cuisson. Les abréviations utilisées pour ce facteur sont ‘O’ pour les viandes « oxydées » et ‘A’ pour les viandes « anaérobies ». Par exemple, la charcuterie modèle DCNO correspond à l’épaule cuite avec des nitrites et oxydée. En croisant ces facteurs 2x2, nous disposions de 16 viandes saumurées, dites « charcuteries modèles », que nous avons comparées à un témoin expérimental. Nous avons d’abord réalisé une étude de court terme afin de mesurer l’effet de ces charcuteries modèles sur la modulation des biomarqueurs précoces corrélés à la promotion par 60 l’hème. A l’aide d’un outil statistique, l’analyse en composante principale, nous avons sélectionné quatre charcuteries modèles sur leur capacité à moduler les biomarqueurs. Ces charcuteries modèles ont alors été testées lors d’une étude de moyen terme (100 j) chez des rats initiés à la DMH avec l’étude les foyers de cryptes aberrantes (FCA) et les foyers déplétés en mucine (FDM). Résumé de l’article A1 La consommation de charcuterie est associée au risque du cancer colorectal. L’objectif de ce travail était d’étudier l’effet de traitements impliqués dans la fabrication des charcuteries sur la promotion du cancer colorectal. Nous avons ainsi réalisé une étude de court terme (14 j) avec des viandes saumurées (charcuteries modèles), en croisant 2x2 quatre facteurs : la couleur de la viande (reflétant la quantité d’hème), la cuisson, la présence de nitrites et l’état d’oxydation de la viande. Des groupes de rats femelles Fischer F344 ont été nourris avec ces régimes durant 14 jours et nous avons étudié les biomarqueurs corrélés à la promotion par l’hème : la lipoperoxydation des eaux fécales et des urines et la cytotoxicité des eaux fécales Une analyse en composante principale nous a permis de sélectionner quatre charcuteries modèles afin de les étudier dans une étude de moyen terme (100j). Ces régimes ont été donnés à des rats initiés à la dimethylhydrazine. A la fin de l’étude, les côlons ont été prélevés pour le comptage des lésions précancéreuses : les FCA (foyer de cryptes aberrantes) et les FDM (foyer déplété en mucine). Les quatre charcuteries modèles ont significativement augmenté le nombre de FCA par côlon par rapport au témoin expérimental (p=0.002). Seule la charcuterie modèle cuite, avec des nitrites, oxydée et riche en hème a significativement augmenté le niveau de composés nitrosés (NOCs, mesurés en ATNC) et le nombre de FDM par côlon par rapport au témoin (p<0.05). La présence de nitrite augmente le nombre de FDM quand on compare la charcuterie modèle avec nitrite avec la même charcuterie modèle sans nitrite (p=0.03). De même, l’oxydation augmente aussi le nombre de FDM quand on compare la charcuterie modèle emballée sous vide 5 jours après exposition à l’air libre avec la même charcuterie modèle directement emballée sous vide (p=0.004). Ces résultats montrent qu’une charcuterie modèle comparable à de l’épaule cuite est promotrice du cancer colorectal chez le rat. Les nitrites et l’oxydation augmentent aussi l’effet promoteur. Il semble que la promotion induite par la charcuterie modèle soit liée à la présence d’ATNC dans les fécès. Cette étude montre qu’il est possible d’effectuer des modifications de traitements lors de la fabrication des charcuteries afin de réduire la promotion du cancer colorectal par les charcuteries. 61 Meat processing and colon carcinogenesis: Cooked, nitritetreated and oxidized high-heme cured meat promotes mucin depleted foci in rats Raphaëlle L. Santarelli1,2, Jean-Luc Vendeuvre2, Nathalie Naud1, Sylviane Taché1 , Françoise Guéraud1 , Michelle Viau3, Claude Genot3, Denis E. Corpet1 , Fabrice H.F. Pierre1 Authors’ Affiliations : 1 Université de Toulouse, ENVT, INRA, UMR1089 Xénobiotiques, BP-87614, 23 Ch. des Capelles, F-31076 Toulouse, France 2 IFIP-Institut du Porc, 149 rue de Bercy, F-75595 Paris Cedex 12 3 UR1268, Biopolymères Interactions Assemblages, INRA, BP 71627, F-44316 Nantes, France Running Title: Processed meat and colon cancer Request for reprints: Fabrice H.F. Pierre Université de Toulouse, ENVT, INRA, UMR1089 Xénobiotiques, BP87614, 23 Ch. des Capelles, F-31076 Toulouse, France. Phone: +33 561 193 289; Fax : +33 561 491 263; Email: [email protected] Key word: cured meat colorectal cancer preneoplastic lesions lipoperoxidation cytotoxicity Abstract Processed meat intake is associated with colorectal cancer risk, but no experimental study supports the epidemiological evidence. To study the effect of meat processing on carcinogenesis promotion, we first realized a 14-day study with 16 models of cured meat. Studied factors, in a 2x2x2x2 design, were: muscle color (a proxy for heme level), processing temperature, added nitrite and packaging. F344 rats were fed these 16 diets and we evaluated fecal and urinary fat oxidation and cytotoxicity, three biomarkers of heme-induced carcinogenesis promotion. A principal component analysis allowed us to select four cured meats for inclusion into a promotion study. These selected diets were given for 100d to rats pretreated with 1,2-dimethylhydrazine. Colons were scored for preneoplasic lesions: aberrant crypt foci (ACF) and mucin depleted foci (MDF). Cured meat diets significantly increased the number of ACF/colon compared to a no-meat control diet (p = 0.002). Only the cooked nitrite-treated and oxidized high-heme meat significantly increased the fecal level of apparent total N-nitrosocompounds (ATNC) and the number of MDF per colon, compared to the no-meat control diet (p<0.05). This nitrite-treated and oxidized cured meat specifically increased the MDF number compared with similar non-nitrite-treated meat (p = 0.03), and with similar nonoxidized meat (p = 0.004). Thus, a model cured meat, similar to ham stored aerobically, increased the number of preneoplastic lesions, which suggests colon carcinogenesis promotion. Nitrite and oxidation increased this promoting effect, which was linked with fecal ATNC level. This study could lead to process modifications to make nonpromoting processed meat. 62 Introduction Colorectal cancer is one of the main causes of death in affluent countries. Environmental factors are involved in this cancer, particularly diet. Modifications in dietary habits could reduce this cancer burden up to 70% (170). In its 2007 report, the World Cancer Research Fund panel judges that "the evidence that red meat and processed meat are a cause of colorectal cancer is convincing" (2). The panel thus recommends: “Limit intake of red meat and avoid processed meat”, which is a challenge for the meat processing industry (171). Epidemiological studies indeed suggest that red meat and processed meat intake increases the risk of colorectal cancer. Three recent meta-analyzes show that consumption of red or processed meat is associated with the risk of colorectal cancer (90, 91, 172). The average relative risk associated with consumption of red meat is modest but significant in the three studies (relative risk = 1.17, 1.35 and 1.28, respectively), as is the risk associated with consumption of processed meat (relative risk = 1.49, 1.32 and 1.20, respectively). We have estimated, from these metaanalyzes, that one gram of processed meat increases the risk of colorectal cancer eleven times, six times or twice more than one gram of fresh red meat respectively for the three meta-analyzes (104). Thus processed meat seems more closely associated with the risk of colorectal cancer than fresh red meat. Several mechanisms have been assumed to explain the relationship between the risk of colorectal cancer and red meat intake. Red meat enhances the formation of putative carcinogenic Nnitroso compounds in human feces (99, 106, 173). But N-nitroso compounds brought into the rat intestine by a baconbased diet did not initiate nor promote preneoplastic lesions in rat colon (174). Meat cooked at a high temperature contains mutagenic heterocyclic aromatic amines that induce colon, mammary and prostate tumors in rodents and monkeys (74). But these aromatic amines might not play an important role in colorectal cancer incidence, since (i) chicken intake is a major contributor of aromatic amines intake, but it is not associated with the risk (175), and (ii) doses of aromatic amines that induce cancer in animals are 1000 to 100,000 times higher than the doses found in human food (176). Red meat also contains heme, the iron-bearing prosthetic group of myoglobin. Dietary hemin (heme stabilized by a chlorine atom, also called Ferriprotoporphyrin IX chloride) increases colonic epithelial proliferation and induces cytotoxicity of fecal water in rats (92). Dietary hemin, hemoglobin, and heme in meat promote dose-dependently the formation of preneoplastic lesions in the colon, aberrant crypt foci (ACF) and mucin depleted foci (MDF) (96-98). In addition, dietary heme increases amounts of lipid hydroperoxides in fecal water and cytotoxicity of fecal water (96, 97). Since fecal water hydroperoxides and cytotoxicity were associated with hemeinduced carcinogenesis, we have proposed to use these biomarkers in short term experiments to screen meat-induced promotion of colon cancer (98). Processed meats cited in epidemiological studies include sausages, meat burgers, ham, bacon, and salami (104). Most frequent processes include salting, curing (adding sodium nitrite), smoking, cooking and drying. Through processing, the heme molecule is nitrosylated by sodium nitrite and the nitrosyl heme can be released from myoglobin during cooking (83, 177). We assumed that nitrosylated heme is more toxic than native heme, which would explain why the consumption of processed meat is more closely associated with the risk of colorectal cancer than the intake of fresh red meat (104). No experimental study has ever been conducted to clarify the effect of meat processing on colorectal carcinogenesis, 63 using preneoplastic or tumor endpoints. However, we recently showed that freezedried cooked ham promotes colon carcinogenesis in carcinogen-injected rats (167). Here, we first investigated in a 14day study the impact of meat processing on early biomarkers associated with promotion of heme-induced colorectal carcinogenesis in rats (98). We then measured in a 100-day study the promoting effect of four processed meats selected from the 14-day study. Carcinogenesis endpoints were 1,2-dimethylhydrazineinduced preneoplasic lesions (ACF and MDF) in rats. The results show that a model cured meat, similar to ham, can increase the number of preneoplastic lesions in the colon of a rodent model of carcinogenesis. Materials and Methods General Design Two sequential studies were performed: a 14-day study investigated the effect of 16 cured meat models on early fecal and urinary biomarkers in rats, and a 100-day study measured the promoting effect of four cured meat models, selected among the 16 models, on preneoplastic lesions in carcinogen-initiated rats. Fourteen-day study: animals and design Ninety female Fischer 344 rats were purchased at four weeks of age from Charles River (Saint Germain l’Arbresle, France). Animal care was in accordance with the guidelines of the European Council on animals used in experimental studies. Rats were kept in an animal colony with temperature of 22°C and 12:12h lightdark cycle. They were allowed free access to tap water and the standard AIN76-diet (178). Rats were housed individually into metabolic cages. After 2 days of acclimatization, rats were randomly allocated to 17 groups (five rats per experimental group, but ten rats in the control group) and fed experimental diets for 14 days. Body weights were monitored on days 2, 7 and 14. Food and water intakes were measured at days 6-7 and 1213. Feces were collected during the last two days and were frozen at -20°C. Urines were collected on day 13 and processed immediately. Processed meats were analyzed for nitrosyl heme, pH, hexanal and pro-oxidant activity. The pro-oxidant activity of meat samples was also determined in an oilwater emulsion. Fecal water samples were analyzed for heme, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), and cytotoxic activity on three cell lines. Urine samples were analyzed for 1,4dihydroxynonane mercapturic acid (DHNMA). A Principal Component Analysis of data was then done to help selecting four processed meats that would be included in the 100-day carcinogenicity study. Fourteen-day study: Diets Pork processed meats and experimental diets were made in a specialized workshop by IFIP-Institut du Porc (Paris, France). Freeze-drying increases the formation of lipid oxidation products in meat (112). Thus processed meat was added as such (moist) to an AIN 76-base powder (UPAE, INRA, Jouy, France), so that each diet contained 55 g of processed meat dry matter per 100 g (dry weight, Table 1). Each diet contained one of 16 models of cured meat of pig, in a 2x2x2x2 design where four factors were crossed: (i) high heme (dark meat) content vs. low (light meat), (ii) cooking temperature 70°C (cooked meat) vs. 50°C (raw meat), (iii) added nitrite (with nitrite) vs. none, and (iv) exposure to air (oxidized) vs. anaerobic packaging (anaerobic). The sixteen experimental processed meats and diets were thus named as follows: [light cooked meat with nitrite, anaerobic], [dark cooked meat with nitrite, anaerobic], [light raw meat with nitrite, anaerobic], [dark raw meat with nitrite, anaerobic], 64 [light cooked meat, anaerobic], [dark cooked meat, anaerobic], [light raw meat, anaerobic], [dark raw meat, anaerobic], [light cooked meat with nitrite, oxidized], [dark cooked meat with nitrite, oxidized], [light raw meat with nitrite, oxidized], [dark raw meat with nitrite, oxidized], [light cooked meat, oxidized], [dark cooked meat, oxidized], [light raw meat, oxidized], [dark raw meat, oxidized]. Dark meat was obtained from supraspinatus and infraspinatus pig muscles, which contains 15 to 17 mg heme/100 g, while light meat came from longissimus dorsi which contains 0.36 to 2 mg heme/100 g (169, 179). Cooked meat was heated at 70°C for one hour in vacuum-sealed plastic bags in a water bath while “raw meat” was heated at 50°C : Raising temperature to 70°C denatures myoglobin which detaches from the heme (83). Nitrite-treated meat was cured with salt (NaCl) containing 0.6 g sodium nitrite /100 g salt, while non-nitrite-treated meat was cured with ordinary salt without sodium nitrite. Cooked cured meat contained 2 g salt /100 g of meat whereas raw cured meat contained 2.5 g salt/100 g of meat. Anaerobic meat was packaged under vacuum immediately after processing, in plastic bags with low oxygen permeability (40 ml O2/m²/24h at 23°C and 75% relative humidity; VF90, Soussana, Orly, France). Packaging was efficient to prevent oxidation, since “anaerobic” meat contained 0.5 mg MDA equivalent per 100 g of anaerobic meat, compared with 1.8 mg MDA equivalent per 100 g of oxidized meat (Wilcoxon’s test p = 0.04, full data not shown). Pieces of cured meat (25 g) were kept at 4°C in the dark without any packaging for five days after cooking to obtain oxidized cooked cured meat. The 16 experimental diets were compared to a control diet containing 10 g fat /100 g of diet. The control diet, made by UPAE (INRA, Jouy), had the same protein, fat and iron contents than meat diets (Table 1). According to Pierre et al (98), all diets were low-calcium (0.27 g calcium phosphate /100 g diet) and n-6 fatty acids were provided by 5 g/100 g safflower oil (MP Biomedicals, Illkirch, France). All diets were vacuum-packaged to avoid further lipid oxidation and were stored at –20°C. They were given to rats every day around 5:00 p.m. during 14 days. One-hundred-day Design study: Animals and Ninety rats (same strain, gender and age as above) were housed in stainless steel, wire bottomed-cage of two rats. After five days of acclimatization to the animal colony and to the AIN 76 diet, each rat received a single i.p. injection of 1,2dimethylhydrazine (Sigma Chemical, St Quentin, France; 180 mg/kg i.p.) in NaCl (9g/l). We chose to initiate all rats with the carcinogen, since the study was designed to show dietary promotion. Seven days later, they were randomly allocated to five groups (10 rats per group) and fed the experimental diets described below. Body weights were monitored every week during first four weeks, and then every two weeks. Food and water intakes were measured at days 20, 60 and 80. Feces were collected between days 90 and 95, and frozen at 20°C. Urines were collected between days 84 and 88 and frozen at -20°C (each rat was put in a separate metabolic cage to collect the urine). Animals were killed on days 98 and 99. Colons were removed and fixed in 10% buffered formalin (Sigma Chemical) between two sheets of filter paper with a blinding code. Aberrant crypt foci (ACF) and mucin depleted foci (MDF) were then scored. Fecal water samples (preparation described below) were analyzed for heme, TBARS and cytotoxicity. Urine samples were analyzed for DHN-MA. One-hundred-day study: Diets Four processed meats were selected from the data of the 14-day study: [dark cooked 65 meat, oxidized]; [dark cooked meat with nitrite, oxidized]; [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] and [dark raw meat, anaerobic]. Processed meats and diets were made by IFIP (Maison Alfort, France). Modified AIN-76 powdered diet was prepared and formulated by UPAE (INRA, Jouy, France). Each diet was a lowcalcium diet (2.7 g calcium phosphate /kg) with 5 g of safflower oil /100 g of dry matter (Table 1, lower panel). Diets were balanced to contain identical proportion of fat (15 g lipids /100 g) and protein (40 g proteins/100 g). They were compared with a control diet containing 15 g of lipids /100 g and 40 g of casein /100 g. The diets were divided into daily portions that were stored separately at –20°C in air-tight plastic bags sealed under vacuum to avoid lipid oxidation. They were given to the rats around 5:00 p.m. every day during 100 days. Characterization of Processed Meats Meat composition Processed meats were analyzed for nitrosyl heme (180) and pH by an ISO-17025 accredited laboratory (LAREAL, Vannes, France). Pro-oxidant activity of meat samples Protein-stabilized oil-in-water emulsions prepared at acid pH were taken as a model food. The propensity of the ground meat products, added to the emulsions, to increase their rate of oxidation, was used to evaluate their pro-oxidant activity. Development of oxidation was followed by measurement of oxygen consumption by the ground meat products-emulsions mixtures kept in closed vials at 37 °C in the dark. Oil-in-water emulsions were prepared with safflower oil (30 g oil ; SICTIA, Marseille, France) and 10 g.L-1 Bovin Serum Albumin (ref 103703; ICN Biochemicals- Inc, Aurora, OH, USA) in sodium phosphate buffer 0.1 M ; pH = 6.0 ; NaN3 0.2g/l as previously described (181, 182). The mean surface diameter (d3,2) of droplets was around 1 µm. Droplet size distribution was determined with a Mastersizer 3600 (Malvern Instruments, Worchester, UK) and it was stable when the emulsions were stored at 37 °C. Meat samples that were kept at –80°C until use were thawed at 4°C overnight and minced with a house meat-grinder. Four g of ground samples (all samples except the dry sausage) were homogenized for 2 min with Polytron homogeniser in 40 mL of 0,1 M, pH = 6.0 phosphate buffer, NaN3 0.2 g/l and the homogenates distributed (1 mL) in 22.4 mL headspace vials. The ground dry sausage was directly weighted (100 mg) and dispersed in 1 mL of the phosphate buffer. Three mL of freshly prepared emulsions were then added to the vials that were sealed with Teflon/silicon septa and aluminum crimp caps and rotated in the dark at 37 ± 1 °C. One vial was then taken from the chamber at regular time intervals for measurement of oxygen consumption that was measured by gas chromatography (183). The results were expressed in millimoles of consumed O2 (mmol O2) and the time needed to consume the oxygen initially present in the vials was evaluated from the time plots. The kinetics was performed at least in duplicate. Hexanal concentration in meat products Hexanal was selected as a specific and reliable marker of secondary products of lipid oxidation in meat products. It was analyzed by gas chromatography of the volatile compounds sampled in the headspace of the samples dispersed in phosphate buffer equilibrated at 37°C, with a solid phase micro extraction fiber (183, 184). Fiber coated with polydimethylsiloxane (PDMS ; 100 µm film thickness, Supelco, Bellefonte, PA) or carboxen/PDMS (75 µm film thickness, Supelco, Bellefonte, PA) was used 66 according to the required sensitivity, that depended on the sample and its oxidation level. The quantification was achieved through standard addition method as follows: five hundred mg of ground samples prepared, as described above, were weighted in headspace vials and 3 mL of 0.1 M, pH = 6.0 phosphate buffer containing known amounts of hexanal, added in each vial. For every meat product six concentrations of hexanal were added to obtain hexanal amounts varying from 0 to 30 µg with PDMS fiber and 0 to 4.4 µg for carboxen/PDMS fiber. The tightly sealed vials were equilibrated for 30 min at 37°C under magnetic stirring. The solid phase micro extraction fiber was then exposed in the headspace for 5 min at 37 ± 1 °C. Gas chromatography analysis was then performed as described in Villière et al. (184). Peaks areas of hexanal were integrated and the volatile concentrations in the samples (pg/g) calculated from linear regressions that included the area measured with the sample with no addition of known amount of hexanal (six concentrations per sample). Final values were means of two determinations Fecal and Urinary Measures Preparation of Fecal Water Fecal pellets were collected under each cage of two rats for 24 h, thus leading to five samples per group. To prepare fecal water, 1 ml of water was added to 0.3 g of dried feces. Samples were then incubated at 37˚C for one hour, stirred thoroughly every 20 min and then centrifugated at 20 000 x g for 15 min. The supernatant (fecal water) was collected and kept at –20˚C until use. Heme and TBARs in Fecal Water Fecal water was analyzed because the soluble fraction of colon content would interact more strongly with the mucosa than the insoluble fraction (185). Heme concentration of fecal water was measured by fluorescence according to Van den Berg et al. (186) as described in Pierre et al. (96). We supposed that processed meat would induce lipid oxidation in fecal water as already shown with red meat, and lipid oxidation products present in fecal water are cytotoxic against colon cells (128). We thus measured TBARS in fecal water as a global measure of fecal lipid oxidation products. TBARS were measured in fecal water according to Ohkawa et al. (187), as previously described (98), and results are given as malondialdehyde (MDA) equivalent. Cytotoxicity Assay of Fecal Water Cytotoxicity of fecal water was quantified for three cell lines according to Bonneson et al. (188) as previously described (98). The three lines were: cancerous mouse colonic epithelial cell line, CMT93 (ECAC); colon epithelial cell lines derived from C57BL/6J mice (Apc +/+) and Min mice (Apc Min/+). This triple cellular model can contribute to understand the biological effects of fecal water on normal (Apc +/+), premalignant cells (Apc Min/+) and cancerous cells (CMT93). CMT 93 cells were seeded in 96-well microtiter plates at 37°C (1.6 x 104 cells per well in 200 µL of DMEM culture medium). At confluence, cells were treated for 24 h with fecal water sample diluted 10-fold by the culture medium and filtered (0.22µm). Cells were then washed with phosphate-buffered saline (PBS). Cytotoxicity of fecal water was quantified by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide test (MTT, 0.45mg/ml in PBS). One hundred microliters of MTT was added to each well. After incubation in the dark (3h 37°C), 100 µL of a 10% SDS-0.1 mol/L NaOH mixture was added and the absorbance of the reaction product (purple formazan) measured at 570 nm with a plate reader (188). 67 Apc +/+ and Apc Min/+ cells harbor a temperature-sensitive mutation of the simian virus 40 large tumor antigen gene (tsA58), under the control of interferon γ. These cells are ‘immortalized’, that is, they express active SV40 at the permissive temperature (33°C). Cells were cultured at permissive temperature of 33°C in Dulbecco-modified essential medium (DMEM) supplemented with 10% (v/v) fetal calf sera, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, and 10 U/ml interferon g. The experiments were performed at non-permissive temperature of 37°C, and without interferon γ, to inhibit the SV40 transgene and limit proliferation. Apc +/+ and Apc Min/+ were seeded into a 96-well culture plates at the seeding density of 104 cells in DMEM culture medium. Cells were grown at 33°C with interferon γ for 72h until subconfluence. They were then transferred at 37°C without interferon γ for 24h. 35%HBr in acetic acid). A further portion of each sample was pre-treated with sulfamic acid to destroy nitrite. After reaction for 5 min, 50 µl was injected into the refluxing mixture. NNitrosodipropylamine (160 ng) was injected into the system after the analysis of each sample as an internal standard to allow quantification of the —NNO group. The nitric oxide released as a result of denitrosation of the sample was passed into a thermal energy analyser (Thermal Electron Company, Waltham, MA, USA) in a stream of nitrogen gas where the amount of ATNC in the sample was quantified. The method detects ATNC though nitrolic acid, nitrosyl-hemoglobin and thionitrite are also denitrosated under these conditions. Results are expressed as the concentration of the common unit of structure, NNO, as mg/kg. Urinary DHN-MA Rats were killed by CO2 asphyxiation in a random order at day 99 or 100. Colons were coded, fixed in formalin and scored for ACF incidence by Bird’s procedure (143). Briefly, numbers of ACF per colon and of crypts per ACF were counted under light microscope at x 40 magnification in duplicate by two readers, blinded for the origin of the colon. Colons were stained for 6 min in a 0.05% filtered solution of methylene blue and ACF scoring criteria were: larger than normal crypts, microscopically elevated, a thick epithelial lining that stains darker than normal crypts, with a large pericryptal zone. Colons were then stained with the highiron diamine alcian blue procedure (127). Two investigators, blinded for the rat treatment, evaluated the number of MDF per colon and the number of crypts per MDF. MDF scoring criteria were: focus with at least three crypts with no or very little apparent mucin, and two of the following: crypts with distorted lumen, elevated lesion above the mucosa level (127). The 24-hour urine was collected under each individual metabolic rat cage. Urinary DHN-MA indicates the in vivo- and in diet-formation of 4-hydroxy-nonenal. DHN-MA assay was performed by competitive enzyme immunoassay as previously described (189), using DHNMA-linked acetylcholinesterase enzyme (190). Each urine sample was assayed in duplicate. ATNC analysis Fecal samples were stored at -20°C before they were transported on dry ice to Pollock and Pool Ltd, Reading, UK, for ATNC determination (191). Fecal samples were prepared for analysis by macerating feces with 10 times their weight of water and centrifuging. Supernatants were used for ATNC analysis. A total of 50 µl of the supernatant to be analyzed was injected directly into a refluxing mixture of propyl acetate and hydrogen bromide (added as ACF and MDF assays 68 Stastitical Analysis Results were analyzed using Systat 10 software for Windows and all data reported as mean ± SD. Values were considered firstly using one-way analysis of variance (ANOVA). If a significant difference was found between groups (p<0.05), comparison of each experimental group with the control group was made using Dunnett’s test. To analyze ACF and MDF data, we used a two-ways ANOVA (groups and readers): The interaction group x reader was never significant, thus data from the two readers were pooled. When total ANOVA was significant (p<0.05), pairwise differences between groups were analyzed using Fisher’s least-significant-difference test. Data from the 14-day study were analyzed by Principal Component Analysis with SIMCA-P 8.0 software. The aim of this analysis is to compress (or simplify) highdimensional data by finding a linear combination of the original variables. The variance is maximized and new uncorrelated variables are created: the principal components. The number of principal components to retain in the model was kept as low as possible. Results 1-Fourteen-day Study General observation The final body weight of rats was 141±10 g, without significant difference between groups (p>0.1). [Light cooked meat with nitrite, anaerobic] and [dark raw meat with nitrite, anaerobic]-fed rats ate significantly more food than control-fed rats (13.0±1.9, 11.6±0.7 and 9.4±0.3 g/day, respectively, p<0.05). Rats given an oxidized diet drank significantly more water than control-fed rats (p<0.05), likely because of meat drying by air exposure. Fecal cytotoxicity and lipid peroxidation biomarkers (TBARS and DHN-MA) Fecal waters from processed meat-fed rats contained twice to five times more lipid oxidation products than control rats (71±156 vs. 34±19 µM MDA equivalent, all values significantly different from control, p<0.05, Table 2). Dark meat as compared to light meat, cooking and aerobic storage significantly increased TBARS value in fecal water, while the addition of nitrite reduced this value (p<0.01). The intake of three processed meat out of four was associated with increased cytotoxicity of fecal water on the three cell lines. Median cytotoxicity was the highest in fecal water from rats given [dark raw meat, anaerobic] and [light raw meat with nitrite, oxidized] diets. In contrast, compared with values found with control diet, [dark raw meat with nitrite, anaerobic], [dark raw meat with nitrite, oxidized], [light raw meat, anaerobic] and [light raw meat, oxidized] diets did not enhance cytotoxicity of fecal water on the three cell lines (Table 2). DHN-MA urinary excretion was 12- to 37-times higher in processed meat-fed rats than in control rats (Table 2). Four-factor ANOVA demonstrated that (i) the four factors modified significantly TBARS in fecal water, (ii) cooking temperature and added nitrite modified cytotoxicity on Apc +/+ cell line, (iii) no factor had a significant effect on cytotoxicity on Apc +/- cell line , (iv) only cooking temperature modified cytotoxicity on CMT93 cell line and urinary DHN-MA. Processed meat characterization Mean pH value was 6.0±0.2. Among the 16 processed meats, pH was higher in dark meats than in light meats (pH 6-6.4, median 6.15 vs. 5.7-6, median 5.85, respectively, Table 3) and it was higher in cooked meats than in raw meats (pH 5.96.4, median 6.13 vs. 5.7-6.1, median 5.88, 69 respectively, Table 3). Heme and NO from nitrite can form nitrosyl heme (104), and we speculated that nitrosyl heme is the promoting factor in processed meat. Low concentrations of nitrosyl heme (between 2 and 6 mg/kg) were found in meat without added nitrite (Table 3). The highest concentrations of nitrosyl heme were found in [dark cooked meat with nitrite, oxidized] and [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] (51 and 40 mg/kg, respectively), and less than half theses values were found in [light cooked meat with nitrite, oxidized] and [light cooked meat with nitrite, anaerobic] (21 and 17 mg/kg). However, the effect of meat color on nitrosyl heme concentration did not reach significance (p>0.05). Pro-oxidant activity of the processed meats was measured by the time needed to consume oxygen in a closed vial in the presence of an oxidizable emulsion: high pro-oxidant activity leads to fast oxygen disappearance. All processed meat sampled exhibited prooxidant activity: the time needed to consume all oxygen in the vials was 22 to 90 h in vials with processed meat, but more than 500 h in standard emulsion vials. The pro-oxidant activity of dark meat was higher than this of light meat, of raw meat higher than this of cooked meat, and of meat with nitrite higher than meat without nitrite (hours to consume all oxygen: D<L, R<C, N<Z; all p<0.01, Table 3). In contrast, no effect of aerobic or anaerobic storage of the meats on pro-oxidant activity was observed (Table 3). Table 3 showed that [light cooked meat, oxidized] and [light cooked meat, anaerobic] exhibited the lowest pro-oxidant activity while this activity was the highest for [dark raw meat with nitrite, anaerobic] and [dark cooked meat with nitrite, oxidized]. Meat peroxidation was measured by hexanal concentration. Concentration of hexanal in processed meat ranged from 1.3 µg/g in [dark cooked meat, oxidized] sample to 18 µg/g in [dark raw meat with nitrite, oxidized] sample. Four-factor ANOVA demonstrated that (i) color of meat (or heme level) and cooking temperature modified significantly pH, (ii) added nitrite modified nitrosyl heme concentration, (iii) the four factors except oxidation had a significant effect on prooxidant activity and, (iv) added nitrite modified hexanal concentration (p < 0.01), but no other factor. Choice of processed meats for the 100day study: Statistical analysis with Principal Component Analysis The above 14-day study evaluated the effect of four factors (muscle darkness i.e., a proxy for heme content, cooking temperature, added nitrite and anaerobic packaging) upon three biomarkers linked to promotion of carcinogenesis by heme: TBARS in fecal water, cytotoxicity of fecal water and urinary DHN-MA. A Principal Component Analysis was performed to simplify the data set so that we could choose few contrasting diets for inclusion in a long term study. We also wanted to identify clustering of fecal and urinary biomarkers to explain difference between experimental groups. The variables included in the Principal Component Analysis were: body weight, intake of diet and water, volume of urine and weight of feces, fecal water cytotoxicity and TBARS, and urinary DHN-MA. The three first Principal Component Analysis axes (3 principal components) explained 92% of the total variability of the data set (52%, 31% and 9% for axis 1, 2 and 3, respectively). From the scores plot (Fig. 1, A and B) of the second vs. first principal components and third vs. second components, the distinct groups can be identified. This confirms that this analysis allows to explain difference between the dietary groups. From the loadings plot (Fig. 1, C and D) it is possible to explain that the dietary groups are separated thanks to variances in TBARs and cytotoxicity of fecal water (first and second axes) and 70 difference between cytotoxicity of fecal water (third axis) against non-mutated cells (Apc+/+ cells, top) to the cytotoxicity against cancer cells (CMT93 cells, bottom). Principal Component Analysis led us to select [dark cooked meat, oxidized], [dark raw meat, anaerobic], [dark cooked meat with nitrite, oxidized] and [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] processed meats, and CON-10 control diet, to be included into the 100 day carcinogenesis study. The rationale was to choose contrasting groups: CON-10 and [dark raw meat, anaerobic] (or [light raw meat with nitrite, oxidized]) were at both ends of axis 1, [dark raw meat, anaerobic] and [dark cooked meat, oxidized] (or [light cooked meat, oxidized]) at both ends of axis 2, and [dark cooked meat with nitrite, oxidized] and [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] on top of axis 3 (Fig. 1). In addition, fecal water TBARS and specific cytotoxicity on Apc+/+ cells have been independently linked to promotion in previous studies (96-98, 192). It supported the choice of [dark cooked meat, oxidized] (high TBARS, Table 2) and of [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] (high cytotoxicity against Apc+/+, Table 2). Last, we decided to exclude light colored muscles, so that comparison could be made between groups differing by only one factor, and only dark groups were kept. 2-One-hundred-day study General observations The final body weight of rats was 212 ± 9 g, without significant difference between groups (p>0.05). As expected, diet intake was higher, and water intake lower, in processed meat-fed rats than in controls, a normal finding since meat-based diets were moist (p<0.05, data not shown). ACF All processed meat diets increased the number of ACF, and the number of aberrant crypts per colon, compared to control diet (p = 0.002, Table 4; and p = 0.001, data not shown). During scoring, some advanced ACF were noticed: in those ACF the number of aberrant crypts was difficult or impossible to count, and they were more elevated than usual above the mucosa. All these “advanced ACF” were found in oxidized diets [dark cooked meat with nitrite, oxidized] and [dark cooked meat, oxidized]-fed rats, but none in anaerobic diets [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] and [dark raw meat, anaerobic]-fed rats (Fisher exact test p = 0.02, data not shown). MDF Compared with control rats, [dark cooked meat with nitrite, oxidized]-fed rats had more Mucin Depleted Crypts per colon (p = 0.046) and more MDF per colon (p = 0.02, Table 4). No other group was different from control. [Dark cooked meat with nitrite, oxidized]-fed rats had significantly more Mucin Depleted Crypts per colon and more crypts per MDF than [dark cooked meat with nitrite, anaerobic]fed rats (p = 0.003 and p = 0.001 respectively), which suggests that oxidized meat favors MDF growth. [Dark cooked meat with nitrite, oxidized]-fed rats had significantly more Mucin Depleted Crypts per colon than [dark cooked meat, oxidized]-fed rats (p = 0.027) which suggests that nitrite in meat favors MDF growth. Fecal and urinary biomarkers As expected, no heme was detected in fecal water from control rats (Table 4), in contrast to fecal waters from meat-fed rats. Surprisingly, heme in fecal water of [dark cooked meat with nitrite, oxidized]-fed rats 71 was higher than in other meat-fed rats. Lipid oxidation markers, fecal TBARS and urinary DHN-MA, were correlated (Pearson r = 0.5, p = 0.01). Meat-based diets increased these oxidation markers, with a higher effect of [dark cooked meat, oxidized] than of [dark cooked meat with nitrite, oxidized] (Table 4). Fecal water from meat-fed rats was more toxic to CMT93 cells than fecal water from control rats, but the effect was significant only in [dark cooked meat, oxidized]- and [dark raw meat, anaerobic]-fed rats. Fecal level of ATNC was low in all groups of rats (e.g., control group, 47 ± 14 µM) except for [dark cooked meat with nitrite, oxidized]-fed rats (424 ± 92 µM, p<0.001, see Table 4 and Fig. 2). To summarize, [dark cooked meat with nitrite, oxidized]-fed rats differed from the other meat-fed rats: they showed more heme and more ATNC in fecal water, but less lipid oxidation products and lower cytoxicity. Discussion This study shows that a processed meat that contains heme and nitrite, and has been cooked at 70°C and exposed to air for five days at 4°C, can increase the number of preneoplastic lesions in rats, which suggests colon carcinogenesis promotion. This provides the first experimental evidence of promotion by cured meat, and it matches epidemiological results. Promotion of carcinogenesis was evidenced on two putative precancerous endpoints: ACF and MDF (127, 143). Results for ACF and MDF were partially discordant. Actually, all tested cured meat diets increased the number of ACF per colon compared to control diet with no meat, whereas only the [dark cooked meat with nitrite, oxidized] diet increased the number of MDF per colon (Table 4). Several cases of contradictory results between ACF and MDF results have already been published. Colonic MDF and tumors are suppressed by synbiotic, comprising the prebiotic Raftilose (a derivative of inulin) and two probiotic strains, a Lactobacillus and a Bifidobacterium, but ACF are not (127). Colonic MDF and tumors are promoted by cholic acid but ACF are not (150). MDF thus seem better predictors of colon carcinogenesis than ACF are. However, we decided to show both MDF and ACF data, since ACF have already been used in more than one thousand published studies. The MDF-promoting [dark cooked meat with nitrite, oxidized] meat was a cooked shoulder of pork supplemented with sodium nitrite, and kept unwrapped at 4°C for five days: it models a piece of cooked ham which has been kept in a refrigerator. Pork shoulder is used to make cooked hams and sausages, the most frequently consumed processed meats in the USA and in Europe (193, 194). No experimental study has been published yet on the effect of this kind of processed meat on colorectal carcinogenesis. Our team recently showed that freeze-dried cooked ham promotes colon carcinogenesis in carcinogen-injected rats (167), but the freeze-drying process dramatically enhances fat oxidation and 4-hydroxynonenal yield. The present study shows that fresh moist processed meat also can increase the number of preneoplastic lesions in rats, which suggests colon carcinogenesis promotion. The oxidation of cured meat increased MDF promotion, compared with the same kind of cured meat directly packaged after it was processed: there were more MDF in rats given [dark cooked meat with nitrite, oxidized] than in rats given [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] (Table 4). To make [dark cooked meat with nitrite, anaerobic], meat was directly packaged once processed, whereas to make [dark cooked meat with nitrite, oxidized], meat was stored unwrapped five days at 4°C in the dark. We speculated that the difference between [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] and [dark cooked meat 72 with nitrite, oxidized] effects on promotion of preneoplastic lesions could be due to oxygen radical species formed in [dark cooked meat with nitrite, oxidized] during the air exposure. Oxidation of polyunsaturated fat produces aldehydes such as malondialdehyde and 4hydroxynonenal, which form mutagenic DNA-adducts and may explain the observed MDF promotion. Greater oxidation of fat occurs in unwrapped meat, which may lead to volatile compounds and to radical oxygen species such as peroxyl and alkoxy radicals. These are found when heme is added to oil rich in n-6 polyunsaturated fatty acids, the composition of which is close to pork fat (110, 114). American country ham contains many volatile compounds due to fat oxidation such as hexanal (195). Animal-fat oxidation products such as oxysterols and aldehydes may act as a primary mechanism of cancer progression in the digestive tract through modulation of TGF-beta-1 signaling (196). However, in this study we did not detect any differences between [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] and [dark cooked meat with nitrite, oxidized], regarding hexanal concentration and pro-oxidant activity of processed meat (Table 3) or TBARs and DHN-MA in rats feces and urine (Table 3 and 4). These results thus do not support the hypothesis that different peroxidation levels could explain the difference in MDF promotion in [dark cooked meat with nitrite, anaerobic]- and [dark cooked meat with nitrite, oxidized]-fed rats. There were more MDF in rats given [dark cooked meat with nitrite, oxidized] than in rats given nitrite-free [dark cooked meat, oxidized] (Table 4). Nitrites are nitrosating agents and can interact with secondary amino compounds to form Nnitroso-compounds. Parnaud et al. (174, 197) showed that rats fed fried bacon excrete 10 to 20 times more ATNC in feces than controls, but these ATNC do not initiate ACF in rats, nor do they promote ACF in azoxymethane-initiated rats. Haorah et al. showed that hot-dogs contain 10 times more ATNC than fresh red meat (198). Mice given a 18% hot-dog diet had 5 times more ATNC in feces than no-meat fed controls (199, 200), feeding heme increased ATNC levels in feces of mice also fed nitrite (201). Lewin et al. showed that in human volunteers fecal ATNC concentrations correlate with N-nitrosospecific adducts, O6 carboxymethylguanine (87). The [dark cooked meat with nitrite, oxidized] diet, which contained more nitrosyl heme than the other diets (Table 3), led to a nine-fold increase in fecal ATNC excretion (Table 4, Figure 2). Fecal ATNC may not promote ACF formation (174, 197), but may explain the MDF promotion observed here. Red meat promotion is associated with lipid oxidation and cytotoxicity of fecal water (92, 93, 96-98). We measured these biomarkers, assuming that red meat and cured meat would promote carcinogenesis by similar heme-induced mechanisms. Here, [dark cooked meat with nitrite, oxidized]-fed rats had much more heme in fecal water and more MDF per colon than the other groups, which supports the hypothesis that heme (or nitrosyl heme) is responsible for cured meat induced promotion. It also suggests that processing can change heme bioavailability in feces. Fecal water from [dark cooked meat with nitrite, oxidized]fed rats also contained more lipoperoxides and cytotoxic activity than fecal water from control rats, but less than fecal water from other meat-fed rats. This means that these biomarkers do not predict promotion in cured meat-fed rats. Assuming the biomarkers would predict promotion, our choice of four processed meats for the 100day study was based on ACP analysis of biomarker data from the 14-day study. Because these biomarkers did not correlate with MDF promotion it is likely that mechanism of cured-meat promotion differs from mechanism of red meat promotion. Following Bingham’s and Mirvish’s hypotheses, we agree that cured 73 meat promotion can be in part due to heme-induced formation of N-nitroso compounds, measured as ATNC (84, 173, 202) Dietary heme enhances intestinal ATNC formation (106, 173, 201). According to Kuhnle et al (203) and Hogg (103), the major part of fecal ATNC following heme intake would be nitrosylheme. However since nitrosyl-heme contains Fe-NO bound but not N-NO bound, it may not be part of ATNC (S. Mirvish, personal communication). Cured meat (like [dark cooked meat with nitrite, oxidized]) is a high nitrite/high heme food, and, as suggested by Hogg, “a high nitrite/high heme diet could be particularly problematic” (103). Lastly, ACF promotion by processed meat here seems similar to ACF promotion by red meat (97, 98): all the tested processed meat diets ([dark cooked meat with nitrite, oxidized], [dark cooked meat with nitrite, anaerobic], [dark cooked meat, oxidized] and [dark raw meat, anaerobic]) increased the number of ACF, fat peroxidation (fecal TBARs and urinary DHN-MA) and fecal water cytotoxicity (Table 4). In contrast, [dark cooked meat with nitrite, oxidized] was the only MDF-promoting diet, and the only fecal ATNC-enhancing diet: Although it was not our starting hypothesis, these data strongly support Bingham and Mirvish’s hypothesis that the pro-cancer factor in processed meat belongs to N-nitroso-compounds (99, 199). The experimental processed meats that have been given to rats have been made without ascorbate addition, but sodium ascorbate or erythorbate are currently added to most processed meat to reduce NOCs production in the meat (204). It would thus be interesting to test, in a future study, if ascorbate can prevent promoting effects of [dark cooked meat with nitrite, oxidized]. In conclusion, this study is the first to show that a moist model of cured meat diet can increase the number of preneoplastic lesions in carcinogen initiated rats, which suggests colon carcinogenesis promotion. This kind of oxidized cooked red meat with nitrite corresponds to badly packaged cooked ham. Packaging of processed meat seems to decrease, and addition of nitrite seems to increase, the promoting potency of cured meat. We are now searching processes and food additives which could suppress the promoting effect of cured meat on colorectal carcinogenesis. ACKNOWLEDGMENTS The authors thank the help of Sidney Mirvish (University of Nebraska, Omaha, Nebraska) who carefully read the manuscript and proposed many changes to improve the text. We thank Xavier Blanc (UPAE) and Jean-Luc Martin (IFIP) for the preparation of experimental diets, Raymond Gazel and Florence Blas Y Estrada for the care of the animals. References 1. Cummings JH, Bingham SA. Fortnightly review - diet and the prevention of cancer. British Medical Journal 1998;317(7173):1636-40. 2. WCRF WCRF. Food, nutrition, physical activity, and the prevention of cancer: a global perspective. WCRF and American Institute for Cancer Research, Washington DC 2007:1-537. 3. Demeyer D, Honikel K, De Smet S. 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Meat Meat diets dry AIN76 Ferric Safflower oil Lard Casein Sucrose citrate weight) base (g) (g) (g) (g) (g) (g) 55a 40b 5 0 0 0 0.000 c 5 5 40 0 0.012 (g 14-day Modified study CON-10 0 50 100-day Meat diets 47d 43e 5 0 5 0 0.000 e 5 10 40 2 0.012 study CON-15 0 43 a- 190 to 219 g of processed meat was added to each diet, depending on its water content. b- Modified AIN76 base composition (g/100 g): sucrose, 59.5; corn starch, 15; cellulose, 12.5, AIN76 calcium free mineral mix, 8.7; AIN76 vitamin mix, 2.5; methionine, 0.75; calcium phosphate, 0.53; choline bitartrate, 0.5. c - Modified AIN76 base composition (%): sucrose, 67.5; corn starch, 12; cellulose, 10, AIN76 calcium free mineral mix, 7; AIN76 vitamin mix, 2; methionine, 0.6; calcium phosphate, 0.54; choline bitartrate, 0.4. d- 175 g of processed meat was added to each diet, depending on water content. e- Modified AIN76 base composition (%): sucrose, 64.6; corn starch, 11.6; cellulose, 11.6, AIN76 calcium free mineral mix, 8.1; AIN76 vitamin mix, 2.3; methionine, 0.70; calcium phosphate, 0.49; choline bitartrate, 0.47. 78 Table 2: Effect of the experimental diets on lipid oxidation products and cytotoxicity of fecal water, and urinary DHN-MA, in rats given one of 16 experimental diets for 14 days (values are means ± SD, n = 5 or 10 for CON10). TBARS in Number of fecal water (MDA Diet rats µM) CON-10 control 10 34±19* Urinary Cytotoxicity of fecal water on cells DHN-MA eq., Apc+/+ (%) a 0±8 68±8 Apc+/- CMT93 (%) (%) 1±5 a 44±4 (µg/24h) 0±9 a 32±6 0.2±0.05 a 6.5±1.2 a [light cooked meat with nitrite, anaerobic] 5 84±13 [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] 5 102±17 a 73±15 a 47±5 a 34±10 a 6.3±2.4 a [light raw meat with nitrite, anaerobic] 5 72±7 a 30±10 a 22±3 a 22±9 a 3.7±0.9 a [dark raw meat with nitrite, anaerobic] 5 85±23 a 0±18 16±4 a 26,±6 a 4.0±1.0 a [light cooked meat, anaerobic] 5 78±10 a 25±6 a 8±4 14±6 a 3.4±0.6 a [dark cooked meat, anaerobic] 5 88±25a 49±14 a 33±7 a 26±3 a 3.5±0.8 a [light raw meat, anaerobic] 5 58±16 a 12±19 22±6 a 15±12 a 2.3±0.6 a [dark raw meat, anaerobic] 5 80±11 a 59±17 a 81±2 a 87±6 a 3.2±0.9 a [light cooked meat with nitrite, oxidized] 5 81±21 a 68±12 a 47±10 a 48±9 a 4.0±0.7 a [dark cooked meat with nitrite, oxidized] 5 71±12 a 45±10 a 40±6 a 3±12 4.0±3.0 a [light raw meat with nitrite, oxidized] 5 81±17 a 53±15 a 85±2 a 85±3 a 2.7±1.4 a [dark raw meat with nitrite, oxidized] 5 93,±19 a 0±17 0±5 5±14 3.4±1.0 a [light cooked meat, oxidized] 5 156±25 a 36±7 a 41±3 a 31±4 a 6.3±1.7 a [dark cooked meat, oxidized] 5 143±30 a 43±9 a 39±4 a 12±4 a 6.7±0.9 a [light raw meat, oxidized] 5 100±24 a 3±11 6±5 0±6 5.6±1.6 a [dark raw meat, oxidized] 5 124±17 a 13±8 10±2 33±4 a 3.7±0.6 a Color (light/dark) p<0.01 p>0.1 p>0.5 p>0.1 p>0.05 Cooking (cooked/raw) p<0.01 p<0.01 p>0.1 p<0.05 p<0.01 Nitrite (with/without nitrite) p<0.01 p<0.01 p>0.1 p>0.05 p>0.2 Oxidation (oxidized/anaerobic) p<0.01 p>0.1 p>0.1 p>0.05 p>0.05 ANOVA p values Factor Values are means ± SD. Processed meats name (e.g., [light cooked meat with nitrite, anaerobic]): with nitrite, sodium nitrite was added to meat; anaerobic, meat was anaeobically packaged; oxidized, meat pieces were kept at 4°C in the dark without any packaging for five days; see table 1 and Material and Methods section for more details. a: significantly different from control diet, CON-10 (p<0.05) 79 Table 3: pH, nitrosyl heme concentration, pro-oxidant activity, and hexanal concentration in processed meats Processed pH meat Nitrosyl heme Pro-oxidant activity (mg/kg) (H to consume all (µg/g) oxygen) Hexanal [light cooked meat with nitrite, anaerobic] 6.0 17 31 ±3 15.0 ±3.0 [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] 6.3 40 24 ±2 7.0 ±2.0 [light raw meat with nitrite, anaerobic] 5.7 13 25 ±1 11.0 ±2.0 [dark raw meat with nitrite, anaerobic] 6.1 6 21 ±2 14.0 ±5.0 [light cooked meat, anaerobic] 5.9 2 92 ±9 3.0 ±1.0 [dark cooked meat, anaerobic] 6.2 3 47 ±7 5.0 ±2.0 [light raw meat, anaerobic] 5.7 3 54 ±8 3.0 ±2.0 [dark raw meat, anaerobic] 6.0 5 23 ±2 2.0 ±0.5 [light cooked meat with nitrite, oxidized] 5.9 21 35 ±5 11.0 ±4.0 [dark cooked meat with nitrite, oxidized] 6.4 51 22 ±4 5.0 ±2.0 [light raw meat with nitrite, oxidized] 5.7 4 39 ±5 11.0 ±5.0 [dark raw meat with nitrite, oxidized] 6.0 6 24 ±1 18.0 ±3.0 [light cooked meat, oxidized] 6.0 5 81 ±5 11.0 ±3.0 [dark cooked meat, oxidized] 6.3 4 41 ±3 1.0 ±0.4 [light raw meat, oxidized] 5.8 6 49 ±9 6.0 ±2.0 [dark raw meat, oxidized] 6.0 5 25 ±4 8.0 ±1.0 ANOVA p values Color (light/dark) Cooking (cooked/raw) Nitrite (with/without nitrite) Oxidation (oxidized/anaerobic) p<0.01 p<0.01 p>0.05 p>0.05 p>0.05 p>0.05 p<0.01 p>0.05 p<0.01 p<0.01 p<0.01 p>0.05 p>0.05 p>0.05 p<0.01 p>0.05 All experimental diets contained 55% processed meat. Processed meats name: see note to Table 2. 80 60 A LRNO LCNO DRZA LRZA LRNA LCZA DCNO 20 0 LCNA DCZA DCNA DRNA DRNO DRZO LRZO -20 -40 -60 20 DCNO -80 -20 LCNA CON-10 . LRZA LRZO LCZO DRZO -20 0 20 -30 40 60 80 -80 -60 -40 -20 LRNO 0 20 40 60 80 Axis 2: 31% C 30 60 DRZA DRNA DRNO Axis 1: 52% 80 LCNO DCZA LCZA LRNA 0 . DCNA DCZO 10 -10 DCZO LCZO -60 -40 B . CON-10 40 Axis 2: 31% 30 Axis 3: 9% 80 Cytotox D Cytotox Apc +/+ 20 Axis 3: 9% Axis 2: 31% 40 20 0 -20 10 0 Cytotox TBARs ApcMin/+ -10 -40 TBARS -20 -60 -80 Cytotox CMT -30 -60 -40 -20 0 20 Axis 1: 52% 40 60 80 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 Axis 2: 31% Fig.1: Principal Components score plot 1 vs 2 (A) and 2 vs 3 (B) related to data the matrix, and PC loading plot 1 vs 2 (C) and 2 vs 3 (D). Groups are represented by the plot labels Abbreviations of biomarker names: TBARs = TBARs of fecal water; Cytotox. = Cytotoxicity of fecal water, Cytotox.Apc+/+ = Cytotoxicity of fecal water on Apc+/+ cells; Cytotox.ApcMin/+ = Cytotoxicity of fecal water on Apc Min/+ cells; Cytotox. CMT = Cytotoxicity of fecal water on CMT93 cells. Abbreviations of diet names: CON-10, control diet; All experimental diets contained 55% processed meat: LCNA, [light cooked meat with nitrite, anaerobic]; DCNA, [dark cooked meat with nitrite, anaerobic]; LRNA, [light raw meat with nitrite, anaerobic]; DRNA, [dark raw meat with nitrite, anaerobic]; LCZA, [light cooked meat, anaerobic]; DCZA, [dark cooked meat, anaerobic]; LRZA, [light raw meat, anaerobic]; DRZA, [dark raw meat, anaerobic]; LCNO, [light cooked meat with nitrite, oxidized]; DCNO, [dark cooked meat with nitrite, oxidized]; LRNO, [light raw meat with nitrite, oxidized]; DRNO, [dark raw meat with nitrite, oxidized]; LCZO, [light cooked meat, oxidized]; DCZO, [dark cooked meat, oxidized]; LRZO, [light raw meat, oxidized]; DRZO, [dark raw meat, oxidized]. 81 Table 4: Effect of processed meat diets on ACF and MDF formation, in the colon of rats 106 d after the injection of 1,2-dimethylhydrazine, and fecal and urinary biomarkers after 80 d on experimental diets. (values are means ± SD) 2.9 ± 1.9 4.2 ± 1.2 3.9 ± 1.5 8 ± 8b 18 ± 13a 11 ± 8 MD crypts /colon 81 ± 18 4.1 ± 2.9a 2.7 ± 1.7a,b 10 ± 11b Crypts /MDF control diet 100 ± 16a 2.1 ± 2.0 3.5 ± 1.2 14 ± 10 MDF /colon [dark cooked meat with nitrite, oxidized] 102 ± 25a 2.8 ± 2.8 3.9 ± 1.9 ACF /colon [dark cooked meat with nitrite, anaerobic] 106 ± 21a 3.4 ± 2.6 [dark cooked meat, oxidized] 101 ± 17a [dark raw meat, anaerobic] Heme in fecal water (µM/24h) 0±0 324 ± 112a 137 ± 50a,b 74 ± 43a,b 79 ± 92b 130 ± 15a,b 102 ± 23a 88 ± 22a 58 ± 9 5.2 ± 3.7a 9.7 ± 4.4a,b 5.3 ± 4.2a 3.4 ± 3.9 0.5 ± 1.2 DHN-MA in urine (µg/24h) 53 ± 25a,b 35 ± 10a 25 ± 10 11 ± 17 0 ± 30 Cytotoxicity of fecal water on CMT93 (% dead cells) TBARS in fecal water (µM MDA eq.) 104 ± 16a 31 ± 14 64 ± 25 88 ± 25 424 ± 92 a 47 ± 14 ATNC Concentratio n (µM as NNO) Detailed composition of diets is given in the Material and Methods section. Diets name, see note to table 2. Values are means ± SD a: significantly different from control diet b: significantly different from [dark cooked meat with nitrite, oxidized] 82 ATNC in feces (µM) 600 * 500 400 300 200 100 0 CON DRZA DCZO DCNA DCNO Diets Fig. 2: Fecal N-nitroso-compounds (ATNC) in rats given experimental diets for 80d after a 1,2dimethylhydrazine injection. (values are means ± SD, n = 5)a Diets contained 55% processed meat: DCNO, Dark-Cooked-With Nitrite and Oxidized; DCNA, Dark-CookedWith Nitrite and kept Anaerobic; DCZA, Dark-Cooked-Without Nitrite Oxidized; DRZA, Dark-Raw-Without Nitrite and kept Anaerobic. Detailed compositions are given in the Material and Methods section. N-nitrosocompounds were assessed as apparent total N-nitroso compounds (ATNC) by Pollock (UK). *: significantly different from all other groups (P<0.001, n = 5) 83 Bilan de l’article A1 Cette étude montre que seule la charcuterie modèle DCNO (épaule cuite riches en nitrites et oxydée) est promotrice à la fois des FCA et des FDM. La charcuterie modèle DCNO est une viande saumurée contenant de l’hème et des nitrites. De ce fait, l’hème est sous forme d’hème nitrosylé. Les résultats de l’étude supportent donc notre hypothèse initiale impliquant l’hème nitrosylé dans la promotion du cancer colorectal. L’étude montre à la fois que les nitrites peuvent être impliqués dans l’effet promoteur des charcuteries lorsque l’on compare la charcuterie modèle DCNO avec la charcuterie modèle sans nitrite DCZO (épaule cuite sans nitrites et oxydée). De même, l’état d’oxydation de la charcuterie est impliqué dans l’effet promoteur du cancer colorectal par les charcuteries quand on compare la charcuterie modèle DCNO avec la même charcuterie modèle emballée sous vide DCNA (épaule cuite avec nitrites et anaérobie). Ceci permet d’envisager deux modifications de traitements lors de la fabrication des charcuteries : diminuer la quantité de nitrites et éviter l’oxydation à l’air des charcuteries, notamment par emballage sous vide. Ce travail montre aussi que les biomarqueurs corrélés à la promotion par l’hème ne sont pas associés avec les marqueurs de cancérogenèse (FCA/FDM). En revanche, les ATNC présents dans les fécès peuvent expliquer la promotion des FDM car seule la viande saumurée modèle DCNO induit une augmentation du niveau des ATNC dans les fécès et du nombre de FDM par côlon. A la suite de cette étude démontrant qu’une charcuterie modèle, comparable à de l’épaule cuite, était promotrice à la fois des FCA et FDM, nous avons voulu valider cette conclusion avec des charcuteries du commerce. 84 Etude 2 : Effet de charcuteries du commerce sur la cancérogenèse colorectale chez le rat Introduction L’étude précédente a montré que l’épaule cuite, contenant des nitrites et oxydée augmente à la fois le nombre de FCA par côlon et le nombre de FDM par côlon. De même, nous avons observé un effet promoteur des nitrites et de l’état d’oxydation. Néanmoins, cette étude a été réalisée avec des charcuteries modèles, et les conclusions qui en sont issues demandent à être validées avec des charcuteries du commerce. Le protocole expérimental permettant l’étude de la consommation de charcuteries du commerce et le cancer colorectal suit le même plan que celui de l’étude précédente : étude de diverses charcuteries du commerce lors d’une expérimentation de court terme (14 j) avec l’analyse de la modulation des biomarqueurs fécaux et urinaires corrélés à la promotion par l’hème. Puis nous avons sélectionné les charcuteries qui modulent le plus les biomarqueurs afin de les étudier lors d’une expérimentation de moyen terme (100 j) chez des rats initiés à la DMH. Résumé de l’article A2 Les études épidémiologiques suggèrent que la consommation de charcuterie est associée au risque du cancer colorectal, mais peu d’expérimentations étayent ces études. L’objectif de cette expérimentation est d’étudier l’effet de charcuterie du commerce sur la promotion de ce cancer. Pour cela, nous avons tout d’abord réalisé une étude de 14 jours avec neuf charcuteries du commerce. Celles-ci ont été comparées à deux témoins ayant 10% et 25% de lipides, afin de comparer les charcuteries maigres avec le témoin à 10% de lipides et les charcuteries grasses avec le témoin à 25% de lipides. Des groupes de cinq rats femelle Fischer 344 ont été nourris avec ces régimes durant 14 jours et nous avons mesuré les biomarqueurs associés à la promotion par l’hème : la lipoperoxydation et la cytotoxicité des eaux fécales ainsi que la lipoperoxydation des urines. Après l’analyse de ces biomarqueurs, nous avons sélectionné deux charcuteries du commerce : saucisse type hot-dog et saucisson sec afin de les étudier lors d’une expérimentation de moyen terme (100 j). Les deux régimes ont été donnés à des rats initiés à la DMH durant 100 j. Les rats ayant mangé ces charcuteries ont été comparés à des rats ayant consommé un témoin gras. A la fin de l’expérimentation, les 85 côlons ont été prélevés afin de compter les lésions pré-néoplasiques : FCA et FDM. Ces deux charcuteries n’ont pas augmenté le nombre de FCA par côlon comparé au témoin expérimental (p>0,05). La saucisse type hot-dog a significativement augmenté le nombre de FDM par côlon (p=0.005) et le nombre de cryptes de FDM par côlon (p=0.002) comparé au témoin expérimental. Le saucisson sec a augmenté le nombre de FDM par côlon et le nombre de cryptes de FDM par côlon de façon presque significative (p=0.06 et p=0.076 respectivement). Cette étude montre donc qu’une saucisse type hot-dog est promotrice du cancer colorectal chez le rat. 86 Hot Dog Promotes the Formation of DimethylhydrazineInduced Mucin-Depleted Foci in Rat Colon Raphaelle L. Santarelli*°, Nathalie Naud*, Sylviane Taché*, Françoise Guéraud*, Jean-Luc Vendeuvre°, Denis E. Corpet*, Fabrice H.F. Pierre* * Université de Toulouse, ENVT, INRA, UMR1089 Xénobiotiques, BP-87614, 23 Ch. des Capelles, F-31076 Toulouse, France ° IFIP-Institut du Porc, 149 rue de Bercy, F-75595 Paris Cedex 12 Corresponding author: [email protected] Key word: cured meat, colorectal cancer hot dog sausage preneoplastic lesions lipoperoxidation cytotoxicity Abstract Epidemiology suggests that processed meat intake is associated with colorectal cancer risk, but few experimental studies support this association. Our aim was to study the effect of various types of cured meat on carcinogenesis promotion. We first did a 14-day study with nine types of cured meat from a supermarket to select the diets that are effective in modifying biomarkers correlated with heme induced promotion. They were compared to two control diets (10% and 25% fat). So eleven groups of five F344 rats were fed these diets for 14 days and biomarkers were measured: lipid oxidation products in feces and urines and cytotoxicity of fecal water. From this first study results, we chose to include hot dog and raw dry sausage into diets given for 99 days to rats pretreated with dimethylhydrazine, an inducer of colon cancer, and compared with a 30% fat control diet. Colons were then scored for preneoplasic lesions: ACF (aberrant crypt foci) and MDF (mucin depleted foci). The number of ACF/colon was not different in the three groups of rats. Hot dog-fed rats had more MDF and more MDF crypts per colon than control diet-fed rats (p<0.005). MDFpromotion by raw dry sausage was marginally significant (p=0.06). This study shows that hot dog promoted colon carcinogenesis in a rodent model, independently of fecal cytotoxicity and peroxides. Since promotion by red meat is correlated with fecal cytotoxicity and peroxides, we thus propose that mechanisms of promotion by curedmeat and by red meat are different. 87 Introduction Colorectal Cancer is the second cause of cancer death in affluent countries, particularly in U.S and Western Europe. This cancer is strongly influenced by environmental factors, such as diet (1). In its 2007 report, the World Cancer Research Fund panel judges that "the evidence that red meat and processed meat are a cause of colorectal cancer is convincing" (2). The panel thus recommends: “Limit intake of red meat and avoid processed meat”. Demeyer et al. suggest that it is a challenge for meat industry to consider this recommendation (3). Epidemiological studies showed a positive association between the risk of colorectal cancer and intake of red meat or processed meat. Three meta-analyses found that intake of red and processed meat increases the risk of colorectal cancer (4-6). The association is stronger for processed meat than for red meat, for the same quantity of meat (7). In contrast, consumption of white meat and fish is not associated with colorectal cancer risk. Four major hypotheses may explain how cured meat would increase cancer risk. These hypotheses are (i) that high-fat diets promote carcinogenesis via intestinal bile acids; (ii) that cooking meat at high temperature forms mutagenic and carcinogenic heterocyclic amines (HCAs) and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs); (iii) that potentially carcinogenic N-nitroso compounds (NOCs) are formed in food and/or endogenously by nitrosation of amines and amides. In feces, NOCs are expressed as “apparent total N-nitroso compounds” (ATNC); (iv) that heme iron in red meat can promote carcinogenesis because it increases cell proliferation in colonic mucosa, through lipoperoxidation and/or cytotoxicity of fecal water (7). Hypotheses (iii) and (iv) have received more experimental support, and could better explain cured meat toxicity than fresh red meat toxicity. Heme is not the same in red meat and in cooked cured meat. In cooked cured meat, heme is partly nitrosylated by nitrite and free from myoglobin by cooking. Free nitrosylheme in cured meat might be more cytotoxic than myoglobin in red meat (7), and we indeed showed that free heme in the form of hemin is more toxic than hemoglobin (8, 9). Few experimental carcinogenesis studies have been done directly with processed meat and results remained controversial. Parnaud et al. failed to show a promotion of colorectal cancer by bacon: 30% bacon diets decrease the aberrant crypt foci (ACF) multiplicity compared to control diets (10). Bacon diet dramatically increases fecal ATNC level, but does not induce any ACF in the colon of rats. In addition, bacon diet reduces the number of large ACF and the ACF multiplicity in azoxymethane (AOM) initiated rats (11), but in Parnaud’s studies the diets contained a high level of calcium, which clearly antagonizes red meat promotion (12). In contrast, Pierre et al. showed that a blood sausage (black pudding) based diet increases the number of preneoplastic lesions in the colon of AOM-initiated rats, more than beef and chicken meat diets, suggesting that heme is the promoting factor (13). Recently we showed that a model cured meat (oxidized cooked red meat with sodium nitrite) increases the number of MDF/colon in initiated rats (14). This model of cured meat is similar to cooked ham, and we recently published that a freeze-dried cooked ham can promote colon carcinogenesis in a rodent model (9). Colonic MDF promotion by red meat or by cooked ham was associated with increased lipid oxidation products and cytotoxicity in fecal water. Since fat oxidation and cytotoxicity of fecal water were associated with heme-induced carcinogenesis and speculating that nitrosylheme was responsible for the promoting effect of cured meat, we use here of the fecal and urinary biomarkers previously correlated with heme-induced promotion we have proposed to use these 88 fecal and urinary biomarkers to study the effect of cured meat on colorectal carcinogenesis. To study the effect of processed meat on colorectal cancer, we tested the dietary effect of nine types of processed meats in a 14 day study, and we measured the biomarkers correlated with hemeinduced promotion: lipoperoxidation in feces and urines and cytotoxicity of fecal water. From the results of this short term study, we chose to test the promoting effect of hot dog and raw dry sausage in carcinogen-initiated rats. Results showed that hot dog significantly increased the number of MDF/colon compared to the control diet. Materials and Methods 1-Short-term Study Animals Fifty-five Fischer 344 female rats were purchased at four weeks of age from Charles River (St.Germain l’Arbresle, France). Animal care was in accordance with the guidelines of the European Council on animals used in experimental studies. They were kept in a temperature of 22°C and 12/12h light-dark cycle, and were allowed free access to food and tap water. The rats were distributed individually into metabolic cages. After 2 days of acclimatization to a dry powdered standard AIN76 diet (15) and tap water, rats were randomly allocated to 11 groups (five rats per group) and fed experimental diets during 14 days. Body weights were monitored at day 2, day 7 and day 14. Food and water intakes were measured at days 67 and day 12-13. Feces were collected the last five days and were frozen at -20°C. Urines were collected one day before the end of the experiment. Experimental Diets Experimental diets were produced by IFIP (Paris, France) using a 40% modified AINbase powder made by UPAE (INRA, Jouy, France). Each diet contained 55% processed meat (dry weight) as shown in Table 1. Meat was not freeze-dried, to avoid fat peroxidation (9, 16). To meet the 55% DW target, the actual weight of moist meat was calculated before inclusion into each diet, after measuring the water % in each type of cured meat. Nine types of cured meat were tested: cooked ham (CHM), raw dry ham (RDH), pâté “de campagne” (PAT), liver pâté (LPA), fresh sausage “chipolata” type (CHI), hot dog (HDG), salami (SAL), white chicken ham (WCH) and raw dry sausage “saucisson” (RDS). Experimental diets were not balanced for fat, but to match lean ones and fatty ones two control diets were prepared with 10 and 25% fat (10%-CON and 25%-CON, table 1). Control diets contained casein (40%) and ferric citrate (0.012%). Lean cured meats (CHM, RDH, WCH) were compared to the 10%-CON diet, while high fat diets (PAT, LPA, CHI, HDG, SAL and RDS) were compared to the 25%-CON diet. Because calcium inhibits heme-induced promotion (12), all diets were low-calcium (0.27% calcium phosphate) and contained n-6 fatty acids provided by 5% safflower oil (MP Biomedicals, Illkirch, France). The diets were maintained at –20°C in vacuumsealed plastic bags to avoid fat oxidation, and were given to each rat every evening during 14 days. 2- Long-term Study Animals Rats strain, gender, age, and provider, were the same as in the first study, room temperature and light cycle also, and same European guidelines were adhered to. 89 Thirty rats were housed 2 rats/stainless steel, wire bottomed-cage. After 5 days of acclimatization to the AIN76 powdered diet, each rat received a single i.p. injection of dimethylhydrazine (Sigma Chemical, St Quentin, France; 180 mg/kg i.p.) in NaCl (9g/l). Seven days later, they were randomly allocated to three groups of ten rats and fed the experimental diets for 99 days. Body weights were monitored every week during the four first weeks, and every two weeks until the end of the study. Food and water intakes were measured at days 20, 60 and 80. Feces were collected between days 90-95 and were frozen at 20°C. Urines were collected between days 84-88 of the study and were frozen at 20°C (each rat was placed into a metabolic cage for urine collection). Animals were killed on days 98 and 99. Colons were removed and fixed in 10% buffered formalin (Sigma Chemical) between filter papers bearing a blinding code, before aberrant crypt foci (ACF) and mucin depleted foci (MDF) scoring. Diets Two types of cured meat were chosen among the nine types studied in the short term experiment, hot dog (HDG) and raw dry sausage (RDS), and compared to a control diet. As in the first study, diets and AIN powder base were made by the same providers, and contained little calcium and 5% safflower oil (Table 2). The two meat diets and the control diet were balanced for fat (30%) and protein (20%). As in the first study, moist meat was included into the diet, after measuring the % water. HDG and RDS diets contained 40% and 50% cured meat (w/w dry matter) respectively, to balance diets for fat and protein. Thus HDG and RDS diets composition was not identical in the short-term and in the longterm study. Diets were maintained at -20°C in vacuum-sealed plastic bags to avoid lipid oxidation, and were given every evening during 99 days. Characterization of Processed Meats Processed meats were analyzed for heme and nitrosylheme by an ISO-17025 accredited laboratory (LAREAL, Vannes, France). Preparation of Fecal Water Fecal pellets were collected under each cage of two rats for 24 h, thus leading to five samples per group. Preparation of fecal water was achieved by adding 1 mL of sterilized water to 0.3 g of freeze-dried feces. Samples were then incubated at 37˚C for one hour, stirring thoroughly every 20 min, followed by centrifugation at 20 000g for 15 min. The aqueous phase (supernatant) which is fecal water was collected and conserved at –20˚C until use. TBARs of fecal water We measured characteristics of fecal water because, according to bile acids studies, the soluble fraction of colonic contents would interact more strongly with mucosa than the insoluble fraction (17). Thiobarbituric acid reactive substances (TBARs) were measured in fecal water according to Ohkawa et al., exactly as previously described (18). Cytotoxicity Assay of Fecal Water Cytotoxicity of fecal water was quantified on three cell lines according to Bonneson et al., and as previously described (8, 19). The three cell lines were: a cancerous mouse colonic epithelial cell line, CMT93 (ECAC); two colon epithelial cell lines derived from C57BL/6J mice Apc +/+ and Min mice Apc +/- (20, 21). This cellular model can contribute to an understanding of biological effects of fecal water on normal (Apc +/+), premalignant cells (Apc Min/+) or cancerous cells (CMT93). CMT 93 cells were seeded in 96-well microtiter plates at 37°C (1.6 x 104 cells 90 per well in 200 µL of DMEM culture medium). At confluence, cells were treated for 24 h with fecal water sample diluted at 10% (v/v) in the culture medium. Cells were then washed with phosphate-buffered saline. Cytotoxicity of fecal water was quantified by the 3-(4,5-dimethyldiazol-2yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide test (0.9mg/ml in phosphate-buffered saline). The reaction product was solubilized in 100µl lysis buffer (sodium dodecyl sulfate 10%, NaOH 0.1M) before color of reaction product was quantified using a plate reader at 570 nm. Apc +/+ and Apc Min/+ cells harbor a temperature-sensitive mutation of the simian virus 40 large tumor antigen gene (tsA58), under the control of interferon γ. These cells are ‘immortalized’, that is, they express active SV40 at the permissive temperature (33°C). Cells were cultured at permissive temperature of 33°C in Dulbecco-modified essential medium (DMEM) supplemented with 10% (v/v) fetal calf sera, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, and 10 U/ml interferon γ. The experiments were performed at non-permissive temperature of 37°C and without interferon γ, to inhibit the SV40 transgene and limit proliferation. Apc +/+ and Apc Min/+ were seeded into a 96-well culture plates at the seeding density of 104 cells in DMEM culture medium. Cells were grown at 33°C with interferon γ for 24h until subconfluence. They were then transferred at 37°C without interferon γ for 24h. Urinary DHN-MA The 24-hour urine was collected under each cage of one rat thirteen days after the beginning of the study, thus leading to five samples per group. DHN-MA assay was done by competitive enzyme immunoassay as previously described, using DHN-MAlinked acetylcholinesterase enzyme (22). Each urine sample was assayed in duplicate. Heme in fecal water Heme content of fecal water was measured by fluorescence according to Van den Berg et al. and Sesink et al., respectively, as already described (23-25). ACF and MDF assays Rats were killed by CO2 asphyxiation in a random order at day 98 or 99. Colons were coded, fixed in formalin and scored by Bird’s procedure (26). Numbers of ACF per colon, and of crypts per ACF, were counted under light microscope at x 40 magnification in duplicate by two readers, blinded for the origin of the colon. Colons were then stained with the highiron diamine alcian blue procedure. Two investigators, blinded for the rat treatment, evaluated the number of MDF per colon and the number of crypts per MDF. MDF scoring criteria were focus with at least two crypts with no or very little apparent mucin, and two of the following: crypts with distorted lumen, elevated lesion above the mucosa level, three or more crypts per focus (27). Statistical Analysis Results were analyzed using Systat 10 software for Windows and all data reported as mean ± SD. For the short term study, lean cured meats (CHM, RDH, WCH) were compared to the 10%-CON diet, while high fat diets (PAT, LPA, CHI, HDG, SAL and RDS) were compared to the 25%-CON diet. Values were considered firstly using one-way analysis of variance (ANOVA). If a significant difference was found between groups (p<0.05), comparison of each experimental group with the control group was made using Dunnett’s test. To analyse ACF and MDF data, we used a two-ways ANOVA (groups and readers): the interaction group*reader was never significant, thus data from the two readers 91 were pooled. When total ANOVA was significant (p<0.05), pairwise differences between groups were analyzed using Fisher’s least-significant-difference test. Results 1- Fourteen-day study General observations The mean body weight of rats at the beginning of the experiment was 92±5g and the final body weight of rats was 128±14g. White chicken ham-fed rats gained less weight and ate less food (food wasting) than the matching 10% fat control rats (p<0.05, data not shown). In contrast, hot dog-, liver pâté- and pâté de campagnefed rats were slightly heavier than the 25% fat control rats (non significant). Rats fed cooked ham and white chicken ham drank more water per day than matching controls (p<0.05). Fecal cytotoxicity and TBARs and urinary DHN-MA Data are shown in table 3. Liver pâté, pâté de campagne and raw dry sausage had the highest level of heme, but only the two pâtés had the highest level of (table 3). These two last processed meats had the highest rate of nitrosylation (82.4 and 89.1% for PAT and LPA respectively). Raw dry ham, liver pâté, pâté de campagne, salami raw dry sausage diets increased TBARs in the fecal water of rats, compared with their respective control diet (103-179 vs 28-59 µM MDA equivalent, table 3). Cytotoxicity of fecal water of both control groups was low on normal Apc +/+ cells, high on cancerous CMT93 cells, and only fecal water of the high-fat control-fed rats was cytotoxic on ApcMin/+ precancerous cells. Fecal water of raw dry sausage-, white chicken ham- and hot dogfed rats were highly cytotoxic on the three cell lines (cytotoxicity: HDG: 66-79%; WCH: 47-74%; RDS: 94-97 %, Table 3). Finally, control diet-fed rats had low level of urinary DHN-MA. Only hot dog- and fresh sausage “chipolata fed-diet rats excreted little urinary DHN-MA (1.11.4µg/24h, table 3), while all other cured meat increased urinary DHN-MA compared to control diets, particularly salami diet (9±0.1ng/24h, table 3). Choice of cured meat for inclusion in the one-hundred day study We could not afford a 100 daycarcinogenesis study with eleven dietary groups, and we had to select two types of cured meat. The choice of these two cured meat was done according to two criteria: (i) modulation of biomarkers correlated with colorectal carcinogenesis (Table 3), and (ii) level of intake in western countries. We thus decided to select raw dry sausage because it strongly raised the early biomarkers of carcinogenesis (highest TBARs and cytotoxicity in Table 3). We also selected hot dog because it is among the preferably consumed types of cured meat in American and European cohorts, and it raised cytotoxicity without increasing lipoperoxidation of fecal water and urine (28). 2- One hundred-day study General observations The final body weight was 211±9g without any significant difference between groups (p>0.05). Diet intake was not significantly different between groups (p>0.05), but raw dry sausage-fed rats drank less water than control rats (data not shown, p<0.05). ACF and MDF Cured meat diets did not increase the number of ACF nor the number of aberrant crypt per colon compared to the control diet (p = 0.4, table 4). Hot dog-fed rats had more MDF per colon (p=0.005) and more 92 MDF crypts per colon (p=0.002, figure 1 and table 4) than control rats. Raw dry sausage marginally increased the number of MDF per colon and the number of MDF crypts per colon (p=0.06 and p=0.08 respectively, table 4). Fecal and urinary biomarkers As expected, no heme was detected in fecal water from control rats, but it was present in fecal water from cured meat-fed rats (table 4). Meat-based diets increased lipoperoxidation (urinary DHN-MA and TBARs in fecal water) and cytotoxicity of fecal water (p<0.05, table 4). Discussion This study shows that hot dog promoted colorectal carcinogenesis in rats. Our team already showed that freeze-dried ham promotes ACF and MDF in the colon of rats and that an oxidized cooked highheme cured meat significantly increases the number of MDF/colon in rats (9, 14). However, several other tested cured meat products do not promote chemically induced colorectal carcinogenesis, or do not modulate fecal and urinary biomarkers of heme-induced promotion. It is thus important to know why some cured meat types promote carcinogenesis while others do not. Results on ACF and MDF were discordant here: hot dog and raw dry sausage did not increase the number of ACF while they increased the number of MDF/colon (table 4). Femia et al. showed that ACF and MDF results do not always match, and that MDF would better predict colorectal cancer risk than ACF (29). A major evidence is that frequency of Apc mutated MDF is similar to frequency of Apc mutated tumors, while ACF are seldom Apc mutated (29, 30). Thus MDF promotion by hot dog could be more meaningful than lack of ACF promotion. Hot dog is the preferably consumed type of cured meat in northern Europe and in North-America (28). Raw dry sausage marginally promoted the number of MDF in this study (p=0.06, table 4), suggesting it could be less toxic than hot dog. A major difference between hot dog and raw dry sausage is the cooking process: raw dry sausage undergoes a fermentation process at 30°C, while hot dog is cooked to an internal temperature of 60-80°C. Denaturation of myoglobin in meat takes place between 55 and 65°C, and is complete by 75°C (31). In cured meat, heme is partly nitrosylated by nitrite and it is freed from myoglobin during cooking (32). As a result, in raw dry sausage nitrosylated heme is bound to globin, as dark red nitrosylmyoglobin. In contrast, in hot dog it is free from globin, as pink nitrosylheme. Since we demonstrated that free hemin is more toxic than hemoglobin, this difference might explain why hot dog seems slightly more potent than raw dry sausage to promote MDF (table 4). Another difference lies in the use of Lactobacillus sakei for fermentation of raw dry sausage: this bacteria needs heme for its oxidative status (33). This reduces heme availability in meat, as suggested by the lower heme concentration in fecal water from raw dry sausage-fed rats than from hot dog-fed rats compared to heme concentration in meats (table 4). We speculated that the mechanism of promotion by cured meat was related to heme intake, and as observedwith fresh red meat, may be linked to the increased peroxidation and cytotoxicity of fecal water: we thus quantified these biomarkers here (8, 12, 13). Hot dog-fed rats had twice more heme in fecal water, and more MDF per colon, than dry sausage-fed rats, which supports the hypothesis that heme is responsible for the promoting effect. In contrast, no correlation was seem between fecal water heme and cytotoxicity or TBARs (all r<0.16, all p>0.05). Moreover, the non-promoting raw dry sausage diet led to higher values of the above cited 93 biomarkers that the promoting hot dog diet (table 4). These results suggest that these biomarkers do not predict accurately carcinogenesis promotion by cured meat: cured meat promotion mechanisms would thus differ from those of red meat promotion (12, 13). One mechanism that could explain the promotion of colorectal cancer by cured meat is that heme can induce the formation of apparent total N-nitroso compounds (ATNC, not measured here). In a previous study, we have demonstrated that a diet containing cooked, nitrited and oxidized high-heme meat, significantly increased the fecal level of ATNC and the number of MDF per colon, compared to a control diet (14). Mirvish et al. showed that hot dog diets increased the number of total ATNC and their precursors in gastrointestinal and feces of rats and mice (34, 35). They also showed that diet with hemin associated with nitrites in water increase 2-4 times ATNC level compared to nitrite alone (36). They conclude that nitrites alone cannot explain the etiology of colorectal cancer by processed meat, but heme as hemin enhances the formation of ATNC. Hot dog diet is a high nitrite/high heme food and this can form ATNC in feces including nitrosyl heme. ATNC, includind NOCs or nitrosyl heme, are carcinogenic and mutagenic, and they can induce the formation NOCs-specific adducts, such as O6-carboxymethylguanine (37). In human, heme in red meat or cured meat enhances the formation of ATNC in gut (38-40). However, previous results demonstrate that fecal ATNC do not initiate ACF in rats, nor do promote ACF in azoxymethaneinitiated rats. Parnaud et al. showed that fried bacon-fed rats excrete 10 to 20 times more ATNC in feces than controls, but these ATNC do not initiate ACF in rats, nor do they promote ACF in azoxymethane-initiated rats (11). We have already observed that there may be different results between ACF and MDF, so it is likely that Parnaud et al. could have observed different results between ACF and MDF. The first aim of the 14-day study of nine cured meat products was to choose two of them for the 99-day carcinogenesis study. An additional unexpected result of this short-term study was high cytotoxicity of fecal water from white chicken ham-fed rats, although this cured meat contains little heme (26 mg/kg, table 3). How could this high cytotoxicity of chicken ham be explained? The amino-peptidase in poultry meat is highly active, more than in beef and pork meat, and it yields high levels of free amino-acids when meat matures (41). The amino-acids can be decarboxylated (by bacterial enzymes?) to amines that are efficiently nitosated by nitrite added to cure chicken meat. Most N-nitroso-amines are toxic and carcinogen to rodents and their presence would explain the cytotoxicity of fecal water from white chicken ham here. However, this speculation should be tested by assaying the ATNC content of chicken ham, and by testing the promoting effect of chicken ham in a carcinogenesis study. In conclusion, the present study shows that hot dog promoted, and raw dry sausage marginally promoted, the formation of preneoplastic lesions, MDF, in chemically induced rats. This study supports the hypothesis that the pro-cancer factor in processed meat eaters is related to heme and N-nitroso-compounds.. We are now searching processes and food additives which could suppress the promoting effect of cured meat on colorectal carcinogenesis. ACKNOWLEDGMENTS We thank Xavier Blanc (UPAE, INRA) and Jean-Luc Martin (IFIP) for the preparation of experimental diets, Raymond Gazel and Florence Blas Y Estrada for the care of the animals, and Michelle Viau and Claude Genot (UR1268 94 BIA, INRA) for discussion and assays of food peroxidation status (data not shown). References 1. Cummings, J. H., and Bingham, S. A. Diet and the prevention of cancer. Bmj, 317: 1636-40, 1998. 2. WCRF, W. C. R. F. Food, nutrition, physical activity, and the prevention of cancer: a global perspective. 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Controla 10%-CON Controlb 25%-CON Processed meatc CHM to RDS Processed meat (dry matter) 0 0 55 Casein 40 40 0 Lard 5 20 0 Safflower oil 5 5 5 Corn starch 6 6 6 Sucrose 33.7 18.7 23.86 Cellulose 5 5 5 Methionin 0.3 0.3 0.3 Mineral Mix* 3.5 3.5 3.5 Vitamin Mix 1 1 1 Choline bitartrate 0.2 0.2 0.2 Calcium phosphate 0.27 0.27 0.21 ferric Citrate 0.012 0.012 0 * Mineral mix without CaHPO4-2H2O a : control diet with 10% fat brought by safflower oil (5%) and lard (5%) b : control diet with 25 % fat brought by safflower oil (5%) and lard (20%) c : Cooked ham (CHM), raw dry ham (RDH), pâté “de campagne” (PAT), liver pâté (LPA), fresh sausage “chipolata” type (CHI), hot dog (HDG), salami (SAL), white chicken ham (WCH) and raw dry sausage (RDS). Table 2: Composition of long-term study diets, g/100 g of diet. Meat Groups* (g dry weight) C30 AIN76*** Safflower oil Lard g g g Casein g Sucrose g Ferric citrate g 0,03 43 5 20 7 HDG 40** 43 5 25 9,33 2,67 RDS 50 43 5 1,81 0,19 * Groups: C30, 30%-fat control diet; HDG, hot dog diet; RDS, raw dry sausage diet ** 70 to 90 g of processed meat was added to each diet, depending on its water content. *** AIN76 base composition (%): sucrose, 64.6; corn starch, 11.6; cellulose, 11.6, AIN76 calcium free mineral mix, 8.1; AIN76 vitamin mix, 2.3; methionine, 0.70; calcium phosphate, 0.49; choline bitartrate, 0.47. 98 Table 3: heme and nitrosylheme in processed meat (PM) and effect of cured meat diets on fat oxidation and cytotoxicity in fecal water (FW) and on urinary DHN-MA for lean and fat cured meats. Diets* 10%-CON CHM RDH WCH 25%-CON PAT LPA CHI HDG SAL RDS 80 42 26 Heme in PM (mg/g) 122 90 6 53 21 58 45 18 12 Heme-NO in PM (mg/g) 59±16 b 110±25 b 103±40 93±67 98±38 b 124±40 b 179±70 (MDA equivalent, µM) 28±7** 85±34 a 166±85 63±33 23±20 0±19 16±14 27±21 b 79±3 10±20 b 94±2 (%) 19±10 37±14 34±33 a, 74±5 56±10 51±2 b 31±8 a 55±11 b 74±5 b 37±1 b 97±1 on Apc Min/+ (%) 12±7 a 63±6 16±5 a 74±7 74±3 b 44±6 b 45±6 b 58±6 66±8 b 29±7 b 95±7 (%) 63±16 52±6 a 39±2 a 47±6 0.7±0.3 b 3.3±0.7 b 6.0±1.1 1.4±0.6 1.1±0.5 b 9.0±0.1 b 4.4±0.7 (µg/24h) 0.7±0.5 a 11.5±0.4 a 11.2±4.2 a 5.2±3.5 TBARs in FW of rats 5 5 5 5 148 101 99 86 47 115 Number 5 5 5 5 5 5 5 Cytotoxicity of FW on Apc+/+ Cytotoxicity of FW Cytotoxicity of FW on CMT93 Urinary DHNMA * Dietary groups, see composition of diet table 1 **: values are means ± SD a : significantly different from 10%-fat control diet b: significantly different from 25%-fat control diet Control diet with 10% fat, 10%-CON, Control diet with 25 % fat, 25%-CON, Cooked Ham, CHM; dry Raw Ham, RDH; pâté de Campagne, PAT; liver Pâté, LPA; sausage, CHI; hot dog, HDG; salami, SAL; cooked white ham, WCH and dry sausage, RDS. 99 Table 4: Effect of hot dog and of raw dry sausage on preneoplastic lesions (ACF and MDF) in the colon of rats 99d after the injection of dimethylhydrazine, and on fecal and urinary biomarkers after 80d on experimental diets. ACF MDF crypts /colon /colon /MDF CON* 110±17 1,2±1.4 2.6±2.4 a a HDG 108±32 3.0±1.7 4.7±2.4 RDS 102±25 2.4±2.4 3.2±2.2 MDF crypts /colon 4.6±5 a 14.3±10.3 9.0±10.5 heme in fecal water (µM/24h) 0±0 a 44±50 20±19 TBARs in fecal water (µM MDA eq.) 52±10 70±17 a 124±23 DHN-MA in urine (µg/24h) 0.4±0.3 a 2.7±1.5 a 3.1±1.6 Cytotoxicity of fecal water on CMT93 (% dead cells) 0±4 a 21±16 79±18 a a: significantly different from the control diet *CON: 30% fat control diet; HDG, hot dog (40%) diet; RDS, raw dry sausage (50%) diet. 100 Number of MDF/colon 6 5 * 4 3 2 1 0 CON HDG RDS Fig.1: effect of cured meat on mucin-depleted foci per rat colon 99 d after the injection of dimethylhydrazine. Values are means with their standard deviations depicted by vertical bars (n=10). *: significantly different from control CON: 30% fat control diet; HDG, hot dog (40%) diet; RDS, raw dry sausage (50%) diet. 101 Bilan de l’article A2 Cette étude montre que seule la charcuterie saucisse type hot-dog augmente le nombre de FDM par côlon de façon significative (p=0,005). Le saucisson sec augmente le nombre de FDM de façon presque significative (p=0,06). Cette différence de promotion des FDM entre les deux charcuteries par rapport au témoin expérimental peut s’expliquer par la forme de l’hème. Le saucisson sec est une charcuterie crue et l’hème reste donc lié à la myoglobine. En revanche, la saucisse type hot-dog est une charcuterie cuite et l’hème est libéré de la myoglobine. Des différences entre hème libre et hème lié à la myoglobine ont déjà été observées dans d’autres études : l’hémine (hème libre stabilisé par un chlore axial) augmente la taille et le nombre des FCA par côlon de façon dose-dépendante (96). De plus, à dose d’hème égale, l’hémine augmente plus la taille des FCA que l’hémoglobine (1,5µmol d’hème sous forme d’hémine induit 11,4±1,1 aberrantes cryptes par foyer, alors que 1,5 µmol d’hème sous forme d’hémoglobine induit seulement 3,3±0,4 aberrantes cryptes par foyer). Enfin, l’hème libre promeut la formation de « MFCA » (FCA au contour mal défini constitué de nombreuses cryptes), alors que l’hémoglobine n’induit pas ce genre de lésions (96). L’hème libre semble donc être plus toxique que l’hème lié à la myoglobine. De même, un régime à base de jambon lyophilisé a les mêmes effets sur la modulation des biomarqueurs qu’un régime contenant de l’hémine (167). Ces deux régimes ont la même teneur en hème, 2,21 et 2,25 µmol/g d’hème respectivement. En revanche, l’hémoglobine (3µmol/g d’hème) induit aussi les biomarqueurs, mais de façon plus faible que l’hémine et le jambon lyophilisé. La lipoperoxydation des eaux fécales est comparable pour le groupe jambon et hémine (278 et 284 µM eq. MDA respectivement), alors que le régime hémoglobine n’induit que 110 µM eq. MDA. Ces résultats montrent que l’hème libre sous forme d’hémine est un bon modèle pour l’étude de la relation entre la consommation de charcuterie et le cancer colorectal. Ces divers travaux suggèrent donc que la forme de l’hème pourrait expliquer la différence de promotion entre la saucisse type hot-dog et le saucisson sec. La cuisson d’une charcuterie permet la libération de l’hème de sa globine, ce qui le rendrait plus toxique que l’hème lié à la myoglobine présent dans les charcuteries crues ou les viandes rouges. Les deux études précédentes ont montré qu’une charcuterie du commerce telle qu’une saucisse type hot-dog, ainsi que la charcuterie modèle type épaule contenant des nitrites, cuite et oxydée sont promotrices de lésions précancéreuses. 102 L’un des objectifs de la thèse était de trouver des moyens de limiter la promotion du cancer colorectal induit par la consommation de charcuteries. Lors de la première étude, nous avons déjà montré que l’absence de nitrites et l’emballage sous vide pouvaient diminuer le nombre de lésions pré-cancéreuses. Ceci permet donc d’envisager des modifications de procédé de fabrications afin de produire, à terme, des charcuteries non promotrices. D’autres moyens de préventions sont envisageables. L’ajout d’éléments protecteurs lors du procédé de fabrication des charcuteries est possible et rendrait la charcuterie non promotrice. De même, des recommandations alimentaires pour les consommateurs de charcuteries seraient aussi envisageables. Le calcium est un agent chélateur qui permet la précipitation de l’hème dans les fécès. La consommation d’un régime riche en calcium avec l’hème (en molécule purifiée ou présent dans la viande rouge) permet une diminution de la cytotoxicité des eaux fécales et de la prolifération cellulaire, une normalisation des biomarqueurs corrélés à la promotion par l’hème ainsi qu’une réduction de la promotion des lésions pré-cancéreuses (94, 98). La promotion par l’hème est corrélée avec la lipoperoxydation des eaux fécales des rats. La limitation de l’oxydation est donc un moyen envisageable pour diminuer la promotion du cancer colorectal par les charcuteries. Il est connu que la consommation de viande rouge avec un mélange d’antioxydant (butyl-hydroxyanisole et rutine à 0.05% chacun) permet une diminution de la promotion des FDM (98). Nous avons donc testé différents agents protecteurs sur la charcuterie modèle DCNO. Ces agents sont ajoutés selon deux voies : - par modifications du procédé de fabrication, en incorporant directement l’élément protecteur dans la charcuterie lors de sa fabrication - par supplémentations, en ajoutant l’élément protecteur dans le régime alimentaire. Les supplémentations ont été ajoutées sur la charcuterie modèle DCNO, dont la fabrication nous semble maîtrisée et la composition relativement répétable, ce qui limite les biais entre les études successives. 103 Etude 3 : Agents potentiellement antagonistes de l’effet promoteur d’une viande saumurée sur la cancérogenèse colorectale chez le rat Introduction Les expérimentations précédentes ont montré que seule la viande saumurée DCNO (épaule cuite avec nitrite et oxydée) était promotrice des deux types de lésions prénéoplasiques FCA et FDM. D’autre part, la saucisse de type hot-dog est promotrice des FDM. L’un des objectifs de notre thèse est de trouver des moyens d’inhiber l’effet promoteur des charcuteries. La première étude a déjà montré que l’absence de nitrites permet de diminuer l’effet promoteur des charcuteries (comparaison entre la viande saumurée DCNO et la même charcuterie modèle DCZO sans nitrite). De même, le fait d’emballer la charcuterie sous vide permet aussi de diminuer l’effet promoteur (comparaison entre la viande saumurée DCNO et la même charcuterie modèle DCNA directement emballée sous vide et sans phase d’oxydation). L’étude décrite ci-après avait pour but de tester des agents potentiellement antagonistes de l’effet promoteur d’une viande saumurée. Nous avons mesuré in vivo l’effet de suppléments alimentaires (le carbonate de calcium pour chélater l’hème et l’inuline utilisée en industrie charcutière comme substitut de lipides afin de diminuer la densité calorique et l’apport lipidique, d’après les travaux d’Archer et al. (205)) ou de modifications du procédé de fabrication (ajout de rutine, carnosol, α-tocophérol ou pH tamponné de la viande ; pour limiter la peroxydation) sur les biomarqueurs associés à la promotion induite par l’hème. Nous avons suivi le même type de protocole expérimental que dans nos études précédentes: étude des éléments protecteurs sur la charcuterie modèle DCNO (appelée CONH dans cette étude) avec l’étude de la modulation des biomarqueurs fécaux et urinaires dans étude de court terme (14 j) ; choix des éléments protecteurs qui diminuent le plus les biomarqueurs mesurés et étude de ces additifs lors d’une expérimentation de moyen terme (100 j) sur rats initiés à la DMH. Dans cette dernière expérimentation, nous avons aussi ajouté deux groupes de rats, nourris de saucisse de type hot-dog dans un régime pauvre ou riche en calcium. 104 Résumé de l’article A3 Les études épidémiologiques suggèrent que la consommation de charcuterie est associée avec le risque du cancer colorectal, mais peu d’expérimentations étayent ces études. Nous avons déjà montré qu’une charcuterie modèle (épaule cuite, oxydée et avec des nitrites), une saucisse type hot dog (HDG) et un jambon lyophilisé sont promoteurs de lésions prénéoplasiques : FCA (foyer de cryptes aberrantes) et FDM (foyer déplété en mucine) chez le rat. Il a été montré que le calcium inhibe l’effet promoteur de la viande rouge et normalise la lipoperoxydation et la cytotoxicité des eaux fécales. Nous voulons tester dans cette étude si des agents de prévention sont efficaces contre la promotion induite par la charcuterie modèle. Pour cela, nous avons testé la charcuterie modèle dans une étude court terme (14 j) avec des supplémentations dans le régime : carbonate de calcium (150µmol/g) ou inuline (4.5%) ou des additifs directement intégré lors du procédé de fabrication : rutine (0.1%), carnosine (0.07%) ou α-tocopherol (0.05%). Nous avons aussi testé la charcuterie modèle avec une viande à pH tamponné par l’addition de pyrophosphate trisodique (0.8%) afin de limiter la péroxydation. A la fin de l’expérimentation, nous avons mesuré les biomarqueurs associés à la promotion par l’hème (lipoperoxydation et la cytotoxicité des eaux fécales). Après l’analyse de ces biomarqueurs, nous avons sélectionné le calcium α-tocopherol afin de les étudier lors d’une expérimentation de moyen terme (100 j) sur rats initiés à la DMH. Lors de cette étude de cancérogenèse, nous avons aussi intégré un groupe saucisse type hot-dog et cette saucisse avec du carbonate de calcium (150µmol/g). A la fin de l’expérimentation, les côlons ont été prélevés afin de compter les lésions pré-néoplasiques : FCA et FDM. Le calcium et le tocophérol ont diminué de façon significative le nombre de FDM par côlon par rapport à la charcuterie modèle (p<0.01). Seul le calcium a diminué tous les biomarqueurs induits par cette charcuterie modèle. De même, le calcium a diminué le nombre de FDM par côlon par rapport à la saucisse type hot-dog (p=0.01). Les résultats suggèrent que le calcium et le tocophérol pourraient réduire le risque de cancer colorectal chez les consommateurs de viandes et de charcuteries. 105 Cured Meat Promotion of Dimethylhydrazine-Induced MucinDepleted Foci is Suppressed by Calcium and Tocopherol in Rat Colons Raphaelle L. Santarelli*°, Nathalie Naud*, Sylviane Taché*, Françoise Guéraud*, Jean-Luc Vendeuvre°, Denis E. Corpet*, Fabrice H.F. Pierre* * Université de Toulouse, ENVT, INRA, UMR1089 Xénobiotiques, BP-87614, 23 Ch. des Capelles, F-31076 Toulouse, France ° IFIP-Institut du Porc, 149 rue de Bercy, F-75595 Paris Cedex 12 Corresponding author: [email protected] Key word: Abstract cured meat colorectal cancer prevention calcium tocopherol, preneoplastic lesions fat oxidation cytotoxicity Epidemiology suggests that processed and red meat intake is associated with colorectal cancer risk, but few experimental studies support these epidemiological results. We have previously shown that beef, a model of cured meat, hot dog and freeze-dried ham promote carcinogeninduced preneoplasic lesions such as ACF (aberrant crypt foci) and MDF (mucin depleted foci) in rats. We have also shown that carbonate calcium supplementation in diet inhibits beef meat promotion, and normalizes fecal lipoperoxydes and cytotoxicity, two biomarkers of heme-induced promotion. Here we tested if supplementations in cured meat based-diet or directly in cured meat are efficient to protect against processed meat promotion. In a 14-day study we tested dietary compounds on their capacity to modulate fecal and urinary biomarkers. Carbonate calcium (150µmol/g) and inulin (4.5%) were added in diet. Rutin (0.1%), carnosin (0.07%) and α-tocopherol (0.05%) were added during meat processing. We also tested cured meat with buffered pH of muscle by incorporating trisodique pyrophosphate (0.8%). The analyses of modulation of the biomarkers lead us to select carbonate calcium and α-tocopherol for inclusion into a long term study. The two selected compounds were given for 100 d to rats pretreated with dimethylhydrazine. Colons were scored for preneoplasic lesions: ACF and MDF. We also tested hot dog with or without carbonate calcium supplementations (150µmol/g). Carbonate calcium and α-tocopherol supplementations significantly decreased the number of MDF/colon (p=0.01). The results suggest that calcium supplementation in diet and α-tocopherol supplementations in cured meat can reduce colorectal cancer in cured meat-eaters. 106 Introduction Colorectal cancer incidence is higher in Australia, US and New-Zealand than in Africa or Asia (1). This cancer is the third cancer of incidence and mortality in US after lung-bronchus and prostate cancer in men and after lung-bronchus and breast in women (2). Environmental factors are involved in the etiology of this cancer, and particularly food (3). In its 2007 report, the World Cancer Research Fund panel judges that "the evidence that red meat and processed meat are a cause of colorectal cancer is convincing" (4). The panel thus recommends: “Limit intake of red meat and avoid processed meat”. Epidemiological studies indeed suggest that there is an association between colorectal cancer and intake of cured meat (5-7). Demeyer et al. proposed that it is a challenge for meat industry to maintain “industrial activity without damaging public health” (8). The risk associated with consumption of one gram of processed meat was two to ten times higher than the risk associated with one gram of fresh red meat (9). Few studies have been done to understand the relation between colorectal cancer and processed meat. Freeze-dried ham, hot dog and a model of cured meat, i.e a low fat cooked and oxidized nitrited heme-meat, promote preneoplasic lesions in DMH (dimethylhydrazine)-initiated rats (10-12). The study with models of cured meat leads us to propose process modifications to produce non-promoting processed meat and reduce, in the long term, colorectal cancer incidence (11). Indeed, non-nitrited meat-fed rats, or nonoxidized meat-fed rats have less MDF (mucin depleted foci)/colon than nitrited or oxidized meat-fed rats. Some hypotheses have been proposed to explain the relationship between colorectal cancer and processed meat intake (9). The main ones are (i) that high-fat diets could promote carcinogenesis; (ii) that cooking meat at high temperature forms mutagenic and carcinogenic heterocyclic amines (HCAs) and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs); (iii) that potentially carcinogenic N-nitroso compounds (NOCs) are formed in food and/or endogenously by nitrosation of amines and amides. In feces, NOCs are expressed as “apparent total N-nitroso compounds” (ATNC); (iv) that heme iron in red meat promotes carcinogenesis because it increases cell proliferation in colonic mucosa, through lipoperoxidation and/or cytotoxicity of fecal water. Hypotheses (iii) and (iv) have received more experimental support, and could better explain cured meat toxicity than fresh red meat toxicity. A high red meat or cured meat diet induces in human volunteers, mice and rats an increase of ATNC level in feces (11, 13, 14). Lewin et al. showed that fecal atnc in human volunteers correlate with N-nitrosospecific adducts, O6 carboxymethylguanine (15). We recently observed that MDF promotion by a model of cured meat is associated with a high level of NOCs in feces (11) Dietary hemin, hemoglobin, and heme in red meat promote dosedependently the formation of preneoplastic lesions in the colon, ACF (aberrant crypt foci) and MDF. In addition, dietary heme increases amounts of fat oxidation products in fecal water and cytotoxicity of fecal water (16-18). Since fecal water lipid peroxidation was associated with hemeinduced carcinogenesis, we have proposed to use it as biomarker in short term studies to screen heme-induced promotion of colon cancer (18). But heme has not the same form in red meat and in cooked cured meat. In cooked cured meat, heme is partly nitrosylated by nitrite and free from myoglobin by cooking. Free nitrosylheme in cured meat might be more cytotoxic than myoglobin in red meat, and we indeed showed that free heme in the form of hemin is more toxic than hemoglobin (9, 10). 107 Some protective strategies can suppress the promoting effect of heme. Hemin-induced colonic cytotoxicity and epithelial hyperproliferation and heminand beef-induced colon carcinogenesis are inhibited by calcium supplementations in rat diet (16, 18, 19). The trapping of heme by calcium abolished carcinogenesis promotion and suppress heme-induced fecal water fat oxidation and cytotoxicity. The results suggest that calcium supplementation can reduce colorectal cancer risk in meat-eaters. This result supports the concept that the toxicity associated with the excess of intake of a nutrient like iron heme for red meat may be prevented by another nutrient like calcium (18, 20). Another strategy implies the use of antioxidant to reduce heme-induced promotion. Indeed, the antioxidant mix (butylated hydroxyanisole and rutin) added in the diet inhibits the beef- and hemininduced promotion of carcinogenesis (16, 18). Here we first investigated the effect of different compounds on a low fat model of cured meat and on hot dog, of which we recently demonstrate a positive effect on colon carcinogenesis promotion in rats (11, 12). Speculating that nitrosylheme was responsible for the promoting effect of cured meat, we use here the fecal and urinary biomarkers previously correlated with heme-induced promotion to study the effect of different supplementations. Several compounds were tested using two ways: (i) by modification of the process of cured meat and (ii) by supplementation in the diet. Then, we selected two efficient compounds for inclusion in a colorectal cancer study (100-day study) to test their protective effect on preneoplasic lesions. In this long-term study, we tested the effect of calcium supplementation in hot dog diet. Results showed that carbonate calcium supplementations in diet and αtocopherol supplementations in cured meat decreased the number of MDF/colon. These data suggest that intake of these two compounds could reduce colorectal cancer risk in meat-eaters. This could lead to process modifications or supplementations to reduce colon carcinogenesis induced by cured meat. Materials and Methods General Design Two sequential studies were performed. A 14-day study was achieved to test the potential protective effect of supplementation in cured meat or in diet on early fecal and urinary biomarkers in rat. Then a 100-day study was done to test the potential protective effect of two selected compounds from the short term study. In this long term study, we also tested the effect of calcium carbonate supplementation in hot dog diet. Fourteen-day study: animals and design 40 Fischer 344 female rats were purchased at five weeks of age from Charles River (St.Germain l’Arbresle, France). Animal care was in accordance with the guidelines of the European Council on animals used in experimental studies. Rats were housed individually into metabolic cages. They were kept in a temperature of 22°C and light-dark cycle, and were allowed free access to the standard AIN76-diet and tap water. After two days of acclimatization, rats were randomly allocated to eight groups (five rats per group) and fed experimental diets. Body weights were monitored on days 0, 7 and 14. Food and water intakes were measured at days 6-7 and 12-13. Feces were collected the last two days and were frozen at -20°C. Urines were collected on day 13 and processed immediately. Fourteen-day study: Diets Experimental diets were produced by IFIP (Paris, France) using a 40% modified 108 AIN76-base powder made by UPAE (INRA, Jouy, France). AIN76-base powder composition was (g/100g): sucrose, 59.6; corn starch, 14.9; cellulose, 12.5; AIN76 calcium free mineral mix, 8.7; AIN76 vitamin mix, 2.5; methionine, 0.8; calcium phosphate, 0.53; choline bitartrate, 0.5. Each diet contained 55% processed meat (dry weight, DW). Meat was not freezedried, to avoid fat oxidation (10, 21). To get the 55% DW target, the actual weight of moist meat was calculated before inclusion into each diet, after measuring the water % in meat. We tested a cooked and oxidized-nitrited heme meat (CONH), a model of cured meat because we have already shown that this model of cured meat promotes the number of MDF/colon (11). Muscle was taken from supraspinatus pig muscle 5 which contains 15 to 17 mg heme mg/100g (22) ; cooking was achieved by heating meat at 70°C for one hour in a vacuum-sealed plastic bag in a bain-marie. Raising temperature to 70°C denatures myoglobin which separates from the heme (23). Meat was cured with 2 g/100g salt containing 0.6 g/100g sodium nitrite. Cured meat was kept at 4°C in the dark without any packaging for five days after cooking to get oxidized cured meat. We tested different potentially protective compounds on CONH diet by two different ways: supplementation in diet or in cured meat. The two supplementations in diet were: calcium carbonate CACB (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) added at 150µmol/g in diet and inulin INUL (or Orafti HP, Azelis, Oreye, France) added at 4.5%. Rutin (RUTI) at 0.1%, (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), carnosin (CARN) at 0.07% (Naturex, Avignon, France), αtocopherol (TOCO) at 0.05% (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) were incorporated during meat processing. We also tested CONH with buffered pH (BUFF) of muscle by incorporating trisodique pyrophosphate (La Bovida, le Subdray, France) at 0.8% to limit fat oxidation during processing. Diets contained 40% protein, 15% fat, 45% carbohydrate. Each diet, except CACB, was a low-calcium diet (2.7g/kg), and all the diets contained 5% safflower oil. The diets were stored at –20°C, under vacuum, to avoid fat oxidation. They were given the rats every day at 5:00 p.m. during all the study. One hundred-day study: Animals and Design 56 Fischer 344 female rats were purchased at five or four weeks of age from Charles River (St.Germain l’Arbresle, France). Animal care was in accordance with the guidelines of the European Council on animals used in experimental studies. Rats were housed 2 rats/stainless steel, wire bottomed-cage. They were kept in a temperature of 22°C and light-dark cycle, and were allowed free access to the standard AIN76-diet and tap water. After 20 days of acclimatization, rats received a single i.p. injection of dimethylhydrazine (Sigma Chemical, St Quentin, France; 180 mg/kg i.p.) in NaCl (9g/l). Seven days later, they were randomly allocated to five groups and fed experimental diets. Body weights were monitored every week during the 4 first weeks, and every two weeks until the end of the study. Food and water intakes were measured at day 15, 59 and 94. Feces were collected between days 8595 of the study and were frozen at -20°C. Urines were collected between days 70-74 of the study and were frozen at -20°C (rats were put in metabolic cages for collection of urine). Animals were killed 98-99 days after the start of the experimental diets. Colons were removed and fixed in 10% buffered formalin (Sigma Chemical) before aberrant crypt foci (ACF) and mucin depleted foci (MDF) scoring. Diets As in the first study, diets and AIN76 powder base were made by the same providers, and contained little calcium and 109 5% safflower oil (Table 1). As in the first study, moist meat was included into the diet, after measuring the % water. We tested a cooked and oxidized-nitrited heme meat (CONH), as already described above. Moreover, 150µmol/g calcium carbonate (CACB) was added in CONH-diet (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France). α-tocopherol TOCO (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) was added during meat processing at 0.05 %. In the same study, we tested hot dog (HDG) diet and calcium carbonate supplementation in this diet (HGCA, 150µmol/g). CONH group had 16 rats while all the other groups had 10 rats. Low fat diets (CONH, CACB, TOCO) were balanced with 40% protein, 15% fat, 45% carbohydrate and the high fat diets (HDG, HGCA) were balanced with 20% protein, 30% fat, 50% carbohydrate (table 1). Diets were stored at –20°C, under vacuum, to avoid fat oxidation. They were given the rats every day at 5:00 p.m. during all the study. Fecal and Urinary Assays Preparation of Fecal Water Fecal pellets were collected under each cage of rats for 24 h. Preparation of fecal water was done by adding 1 mL of sterilized water to 0.3 g of dried feces. Samples were then incubated at 37˚C for one hour, stirring thoroughly every 20 min, followed by centrifugation at 20 000g for 15 min. Fecal water which is the aqueous phase (supernatant) was collected and conserved at –20˚C until use. TBARs of Fecal Water We measured characteristics of fecal water because according to studies on bile acids the soluble fraction of colonic contents would interact more strongly with the mucosa than in insoluble fraction (24). Thiobarbituric acid reactive substances (TBARs) were measured in fecal water according to Ohkawa et al., exactly as previously described (25). Cytotoxicity Assay of Fecal Water Cytotoxicity of fecal water was quantified on three cell lines according to Bonneson et al. as previously described (18, 26). The three lines were: cancerous mouse colonic epithelial cell line, CMT93 (ECAC); colon epithelial cell line derived from C57BL/6J mice (Apc +/+) and Min mice (Apc Min/+). This cellular model can contribute to the understanding of biological effects of fecal water on normal (Apc +/+), premalignant cells (Apc Min/+) or cancerous cells (CMT93). CMT 93 cells were seeded in 96-well microtiter plates at 37°C (1.6 x 104 cells per well in 200 µL of DMEM culture medium). At confluence, cells were treated for 24 h with fecal water sample diluted at 10% (v/v) in the culture medium. Cells were then washed with phosphate-buffered saline (PBS). Cytotoxicity of fecal water was quantified by the 3-(4,5dimethyldiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide test (0.45mg/ml in PBS). The reaction product was solubilized in 100µl lysis buffer (SDS 10%, NaOH 0.01M) before color of reaction product was quantified using a plate reader at 570 nm and 690nm. Apc +/+ and Apc Min/+ cells have a temperature-sensitive mutation of the simian virus 40 large tumor antigen gene (tsA58), under the control of interferon γ. These cells are ‘immortalized’, as they express active SV40 at the permissive temperature (33°C). Cells were cultured at permissive temperature of 33°C in Dulbecco-modified essential medium (DMEM) supplemented with 10% (v/v) fetal calf sera, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, and 10 U/ml interferon γ until subconfluence. The studies were performed at non-permissive temperature of 37°C, and without interferon γ, to inhibit the SV40 transgene and limit proliferation. Apc +/+ and Apc 110 The 24-hour urine was collected under each cage of one rat after thirteen days the beginning of the study. DHN-MA assay was done by competitive enzyme immunoassay as previously described, using DHN-MA-linked acetylcholinesterase enzyme (27). Each urine sample was assayed in duplicate. means ± SD. MDF scoring was done in duplicate. MDF variables were tested first using 2-way (groups and readers) ANOVA. The (group x reader) interaction was never significant, and when total ANOVA was significant (p<0.05), pairwise differences between groups were analyzed using Fishers’s least-significant-difference test. For the low fat diets, ACF variables and all other data were analyzed using one-way analysis of variance ANOVA. If a significant difference was found between groups (p<0.05), comparison of each experimental group with the control group was made using Dunnett’s test. For the high fat diets, all variables were analyzed with a t-test Student. Heme in Fecal Water Results Heme content of fecal water was measured by fluorescence according to Van den Berg et al. and Sesink et al. as already described by Pierre et al. (17, 28, 29). 1- Fourteen-day Study General observations Min/+ were seeded into a 96-well culture plates at the seeding density of 104 cells in DMEM culture medium. Cells were grown at 33°C with interferon γ for 72h until subconfluence. They were then transferred at 37°c without interferon γ for 24h. Urinary DHN-MA ACF and MDF assays Rats were killed by CO2 asphyxiation in a random order at day 99 or 100. Colons were coded, fixed in formalin and scored by Bird’s procedure (30). Numbers of ACF per colon, and of crypts per ACF were counted under light microscope at x 40 magnification in duplicate by two readers, blinded for the origin of the colon. Colons were then stained with the highiron diamine alcian blue procedure. Two investigators, blinded for the rat treatment, evaluated the number of MDF per colon and the number of crypts per MDF. MDF scoring criteria were focus with no or very little apparent mucin, and two of the following: crypts with distorted lumen, elevated lesion above the mucosa level, three or more crypts per focus (31). Statistical Analysis Results were analyzed using Systat 10 software for Windows and reported as At the end of the study, the body weight of rats were from 110±7 to 145±11 g. RUTIand TOCO-fed rats significantly gained more weight than control-diet fed rats (p<0.05). Diet intake was about 9.9±2 g after 14 days of experimental diets. There was not any difference of diet intake between groups (p>0.05). Water intake was 25.5±6 ml at the end of the study, and there was no difference between groups (p>0.05). Fecal water oxidation, cytotoxicity and urine oxidation All the supplementations significantly decreased fecal water oxidation and urinary DHN-MA (p<0.05, table 2). Carbonate calcium, rutin, and α-tocopherol supplementations were more cytotoxics on Apc Min/+ than on Apc +/+ in a no significant way. These results suggested that these fecal water enhanced viability of wild cell and not of the mutated cells. Carbonate calcium, rutin, carnosin, αtocopherol supplementations and buffered pH of muscle significantly decreased 111 cytotoxicity on CMT 93. Inulin supplementation was highly cytotoxic on Apc +/+ and CMT93, but not on Apc Min/+. 2- One hundred-day study General observations For the low fat diets (CONH, TOCO and CACB), the final body weight of rats was 217±1 g. Diet intake was significantly higher for CONH-fed rats only in the end of the study (p<0.05). Water intake was not different between groups (p>0.05). For the high fat diets (HDG and HGCA), the final body weight of rats was 235±3 g, without any significant difference between the two groups (p>0.05). Diet intake was significantly higher for HGCA-fed rats only in the end of the study (p=0.01). There was not any difference between groups for diet and water intake (p>0.05). ACF For the low fat diets, the number of ACF/colon was not significant between groups (table 3, p=0.9). For the high fat diets, there was not any difference between the two groups (table 3, p=0.16) MDF For the low fat diets, supplementation of carbonate calcium in diet and supplementation of α-tocopherol in cured meat significantly reduced the number of MDF/colon (p=0.01 for both the protective compounds, table 3). For the high fat diet, calcium supplementation significantly decreased the number of MDF/colon (p=0.01). TBARs, Cytotoxicity and Heme of Fecal Water and Urinary DHN-MA CONH-fed rats had more heme in fecal water than the other low-fat diets had. There was no detectable heme in fecal water of high-fat diets. For the lean diet, calcium supplementation in diet decreased all the biomarkers and heme level (urinary DHN-MA: 0.2±0.1 vs 1.3±0.6 µg/24h, TBARs in fecal water: 23±11 vs 70±8 µM MDA equivalent and cytotoxicity in fecal water: 24±16 vs 57±7 %, heme in fecal water: non detectable value vs 32±16 p<0.05, table 3) while calcium supplementation in diet only decreased TBARs of fecal water for fat diets (6±11 vs 74±30 µM MDA eq., p<0.05, table 3). Tocopherol supplementation in cured meat decreased the heme of fecal water and urinary DHN-MA (heme in fecal water: 5.7±7.6 vs 31.9±16.4 µM, urinary DHNMA: 0.5±0.2 vs 1.3±0.6 µg/24h, p<0.05, table 3). Discussion The present study is the first study to show that promotion of MDF by a model cured meat can be suppressed by calcium and αtocopherol supplementation in diet or in cured meat respectively. Promotion of MDF by hot dog can be suppressed by calcium supplementation in diet. As already observed in previous study, results on ACF and MDF are discordant (11). We decided to focus on MDF results because MDF are more predictive of colorectal cancer (31). Calcium supplementation inhibited the promoting effect of CONH. Experimental studies have already shown a protective effect of calcium supplementation on heme-induced predictive marker of risk of colorectal cancer and on heme induced preneoplastic lesions (16, 18, 19). We decided to use carbonate calcium supplementation because the nature of the calcium salt must influence the effect on carcinogenesis. Indeed, we recently observed that calcium carbonate is more effective than calcium phosphate is, used in our previous in vivo studies, to trap heme in vitro (data not shown). Calcium binds heme in fecal water of cured meatfed rats as already observed with red meat diet. Indeed, calcium added in meat diet and hemin diet normalizes the number of ACF/colon and MDF/colon (16, 18). In 112 feces of rats given the high-calcium meat diet, heme concentration was high in feces and low in fecal water. Calcium carbonate precipitates heme in the gut, and little heme remains available in fecal water to induce fat oxidation, as previously showed with hemin and beef diets (16, 18). Fecal water of high-calcium meat diet thus contains fewer fat oxidation products and shows little cytotoxic activity (Table 3). The trapping of heme by calcium decrease the number of MDF/colon, as observed in the 100d study (table 3). The prevention of colorectal carcinogenesis by dietary calcium in this study may explain why Parnaud et al. failed to show a promoting effect by bacon (32). In this study, diet contained a high level of calcium, which could inhibit an eventual promoting effect by bacon. Calcium supplementation decreased all the biomarkers compared to CONH while this supplementation only decreased TBARs in fecal water compared to HDG. This difference may be linked to heme concentration in fecal water. Indeed, intake of CONH diet induced a high level of heme in fecal water (31.9±16.4, table 3) while intake of HDG diet induced a non detectable level of heme in fecal water (table 3). At a high concentration of heme in fecal water, heme induced all the biomarkers correlated with heme-induced promotion since calcium supplementation decreased all of them. At low concentration of heme in fecal water, heme only modulated TBARs in fecal water since calcium supplementation only decreased this biomarker. We thus proposed that TBARs in fecal water would be more predictive of colorectal cancer than urinary DHN-MA and cytotoxicity of fecal water are. We also speculated that the only decrease of TBARs in fecal water would be efficient enough to protect against cured meat promotion. Supplementation of α-tocopherol (vitamin E) in cured meat inhibits the promoting effect of CONH on the number of MDF per colon. This inhibition is correlated with the decrease of urinary DHN-MA in the 100d study (r=0.51, n=26, p<0.01). An unexpected result of the study is the difference of effect of α-tocopherol supplementations on the TBARs level in fecal water between short term and long term study. The preparation of diets was independent for these two studies and we did not explain why tocopherol decreased the TBARs level only for the 14 d study. One of the mechanisms of heme-induced promotion may be linked to fat oxidation (16-18). Sawa et al. showed that fat and red meat induce the formation of fat peroxyl radicals which could contribute to the high incidence of colon cancer (33). Free and coordinated heme catalyses oxidation reaction (34). This leads to damage proteins and DNA and other nucleic acids and various components of biological systems. These heme-catalyzed oxidations could initiate colon, breast and prostate cancers, heart disease and other diseases (34). Pierre et al. tested the effect of fecal water from beef-fed rats on normal (Apc +/+) and premalignant colonic cells (Apc Min/+) of mice (35). The single Apc mutation rendered the cells strongly resistant to heme-induced cytotoxicity and fat oxidation. This gave a clear survival advantage to premalignant cells when they were subjected to the action of lipid oxidation products such as HNE (4hydroxy-2-nonenal), which at the same time can act as a selective factor. Selection of mutated cells by cytotoxic lipoperoxides may explain heme-induced promotion of colon carcinogenesis. α-Tocopherol inhibits the formation of NOCs in lipophilic conditions (36, 37). In these conditions, nitrosation reactions are inhibited by 93%, while vitamin C inhibits by 97% the nitrosation reactions in aqueous solution. Mirvish suggests using a combination of vitamin C and vitamin E to inhibit the formation of NOCs in lipidwater mixtures like fried bacon. In our study, α-tocopherol supplementation may have inhibited the formation of mutagenic 113 NOCs in part, leading thus to a protective effect on colorectal promotion. A disappointing result of this study relates to inulin supplementation. This is a soluble fiber well used in food industry because inulin is considered as a functional food ingredients (38). Inulin is easy to add in food or in processed food as fat substitute (39). Red meat increases levels of colonic DNA damages (double strands breaks) measured by comet assay, and fiber like high-amylose maize starch protects against these damages (40). In our study, there was a difference of cytotoxicity of fecal water of inulin group-fed rats on Apc +/+ and Apc Min/+ (table 2). This justified the fact that we did not select inulin supplementation for inclusion into the long term study. Indeed, as already observed for HNE, the Apc mutation rendered the cells resistant to inulin-induced cytotoxicity, with a survival advantage to premalignant cells and a possible risk of promotion (35). Recent in vivo studies in Min mice have observed a promoting effect on colon carcinogenesis of inulin supplementation in the diet (41). In conclusion, the present study shows that calcium carbonate supplementation in diet and α-tocopherol supplementation in cured meat decreased MDF promotion induced by a cooked and oxidized nitrited-heme meat. Calcium supplementation in diet decreased MDF promotion induced by hot dog. As Pierre et al., this paper supports the concept that a nutrient (calcium/tocopherol) can inhibit the promoting effect of food (18). This paper also supports the concept that we can modify cured meat processes by incorporating a protective nutrient to inhibit the promoting effect of processed meat. This leads to protective strategies to decrease colorectal cancer either by modification of process by incorporation of tocopherol in meat or by nutritional recommendation with calcium supplementations for meat-eaters. ACKNOWLEDGMENTS We thank Xavier Blanc (UPAE, INRA) and Jean-Luc Martin (IFIP) for the preparation of experimental diets, Raymond Gazel and Florence Blas Y Estrada for the care of the animals. This work was supported by COST B35. References 1. Parkin, D. International variation. Oncogene., 23: 6329-40, 2004. 2. Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, and MJ., T. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin., 59: 225-49, 2009. 3. Willett, W. The search for the causes of breast and colon cancer. Nature, 338 : 389-394, 1990. 4. WCRF, W. C. R. F. Food, nutrition, physical activity, and the prevention of cancer: a global perspective. WCRF and American Institute for Cancer Research, Washington DC: 1-537, 2007. 5. Sandhu, M. S., White, I. R., and Mcpherson, K. 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Br J Nutr. , 99: 963-70, 2008. 116 Table 1: Composition of the experimental diets (dry basis) for the long term study c Meat (g dry a weight) 47 AIN76 base b (g) 43 Safflower oil (g) 5 casein (g) 5 TOCO 47 43 5 CACB HDG 47 40 43 45 HGCA 40 45 CONH c sucrose (g) 0.0 Carbonate calcium in diet (g) 0.0 0.00 5 0.0 0.0 0.05 5 5 3.5 9.3 0.0 0.7 1.5 0.0 0.00 0.00 5 7.8 0.7 1.5 0.00 α-tocopherol in cured meat (%) a- 88 to 175 g of processed meat was added to each diet, depending on its water content. b-AIN76 base composition (%): sucrose, 66.7; corn starch, 11.1; cellulose, 11.1, AIN76 calcium free mineral mix, 7.8; AIN76 vitamin mix, 2.2; methionin, 0.7; calcium phosphate, 0.5; choline bitartrate, 0.4. c-cooked and oxidized nitrited-heme meat, CONH; CONH with α-tocopherol supplementation in cured meat (0.05%), TOCO; CONH with carbonate calcium supplementation in diet (150µmol/g), CACB; Hot dog, HDG; HDG with carbonate calcium supplementation (150µmol/g), HGCA. Table 2: Effect of experimental diets on fat oxidation, cytotoxicity of fecal water and urinary DHN-MA CONH CACB INUL RUTI CARN TOCO BUFF TBArs in fecal water (µM MDA eq.) 93±12 46±19 a 52±24 a 43±9 a 49±21 a 39±12 a 55±9 a Cytotoxicity of Cytotoxicity of fecal fecal DHN-MA in water on Apc +/+ water on Apc Min/+ urine (ng/24h) (% dead cells) (% dead cells) 5317±1906 49±15 58±9 668±541 a 30±8 52±5 237±137 a 66±45 0±11 a 1634±702 a 37±12 58±10 a 195±118 43±51 17±21 a a a 183±90 13±21 43±12 a a 152±39 10±10 18±10 a Cytotoxicity of fecal water on CMT93 (% dead cells) 50±5 21±8 a 87±9 a 21±6 a 14±9 a 12±9 a 21±12 a values are means ± SD a, : significantly different from CONH (p<0.05) Cooked and oxidized nitrited heme-meat, CONH; CONH with carbonate calcium supplementation in diet (150µmol/g), CACB; CONH with rutin supplementation in cured meat (0.1%), RUTI; CONH with carnosin supplementation in cured meat (0.07%), CARN; CONH with α-tocopherol supplementation in cured meat (0.05%), TOCO; CONH with pH buffered of meat by trisodique pyrophosphate (0.8%), BUFF and CONH with inulin supplementation in diet (4.5%), INUL. 117 Table 3: Effect of processed meat diets on ACF and MDF formation, in the colon of rats 98-99d after the injection of dimethylhydrazine, and fecal and urinary biomarkers Cytotoxicity FW TBARs MDF crypts MDF crypts /colon CONH* 126±20 /colon 2.7±2.1 /MDF 3.7±1.3 /colon FW (µM) 10.1±7.9 32±16 TOCO 125±15 1.4±1.5 a 2.4±2.1 5.1±5.6 CACB 124±24 1.4±1.6 a 2.5±1.4 4.6±5.7 HDG HGCA 136±25 118±19 2.3±1.4 b 1.4±1.3 3.5±0.6 3.2±1.8 8.4±8.1 6.6±6.2 ACF heme in 6±8 a ND ND ND ** DHNMA in FW (µM MDA eq.) 70±8 of on CMT93 23±11 urine (µg/24h) (% dead cells) 1.3±0.6 57±7 0.5±0.2 a 51±10 0.2±0.1 a a 24±17 74±30 b 6±11 0.2±0.1 0.2±0.1 64±10 a 44±12 43±13 Detailed compositions are given in the Material and Methods section. Values are means ± SD * Experimental diets contained 47% processed meat for the low fat meat and 40% for the high fat meat: cooked and oxidized nitrited-heme meat, CONH; CONH with α-tocopherol supplementation in cured meat (0.05%), TOCO; CONH with carbonate calcium supplementation in diet (150µmol/g), CACB; Hot dog, HDG; HDG with carbonate calcium supplementation (150µmol/g), HGCA. **ND: non detectable (< 1.5µM) a: significantly different from CONH b: significantly different from HDG 118 Bilan de l’article A3 Les résultats montrent donc que le calcium et le tocophérol diminuent le nombre de FDM par rapport à la charcuterie modèle (épaule cuite contenant des nitrites et oxydée) : il y a donc une protection par chacun des deux agents. Le calcium diminue aussi le nombre de FDM dans le côlon des rats quand on l’ajoute au régime contenant la saucisse type hot-dog ; il y a donc aussi une protection contre la cancérogenèse. De plus, le calcium diminue tous les biomarqueurs induits par la charcuterie modèle, alors qu’il ne diminue que les TBARs des eaux fécales induits par la saucisse type hot-dog. Cette différence peut être liée à la concentration d’hème dans les eaux fécales. La consommation de la charcuterie modèle induit 31.9±16.4 µM d’hème dans les eaux fécales, alors qu’on ne retrouve pas d’hème dans les eaux fécales de rats ayant consommé la saucisse type hot-dog. Ceci montre que dans un contexte avec de l’hème dans les eaux fécales, l’hème induit tous les biomarqueurs. En revanche, dans un contexte à faible teneur d’hème dans les eaux fécales, l’hème n’induit que les TBARs dans les eaux fécales puisque la supplémentation en calcium ne diminue que ce biomarqueur. Par ailleurs, les TBARs semblent être les biomarqueurs les mieux corrélés à la cancérogenèse colorectale induite par les charcuteries puisque leur suppression par supplémentation en calcium suffit à diminuer la promotion des lésions précancéreuses. Le tocophérol agirait différemment, en inhibant la lipoperoxydation, notamment la formation du HNE, puisqu’il ne diminue que le DHN-MA urinaire sans changer le niveau des TBARs. Par ailleurs, le tocophérol est un inhibiteur de la formation de composés nitrosés (206). Ce composé pourrait donc être protecteur en limitant la formation des composés nitrosés dans les fécès et/ou dans les charcuteries. Les résultats de cette étude montrent qu’il est possible de diminuer l’effet promoteur des charcuteries : - d’une part en modifiant le procédé de fabrication des charcuteries, en ajoutant du tocophérol par exemple - d’autre part en établissant des recommandations alimentaires, visant à favoriser la consommation de calcium pour les consommateurs de charcuteries. 119 De plus, cette étude montre aussi le concept suivant : il est possible de contrer la toxicité d’un aliment par un nutriment. La promotion induite par les charcuteries peut donc être inhibée par des supplémentations en calcium ou par l’incorporation de tocophérol dans les charcuteries. Les études montrent qu’une saucisse de type hot-dog et une charcuterie modèle comparable à de l’épaule cuite, contenant des nitrites et oxydée sont promotrices du cancer colorectal. Pour expliquer ce lien entre la consommation de charcuteries et le cancer colorectal, nous avons supposé que l’hème nitrosylé présent dans les charcuteries avec des nitrites et cuites induisait une lipoperoxydation des acides gras polyinsaturés (AGPIs). Certains aldéhydes terminaux issus de la lipoperoxydation des AGPIs sont connus pour être cytotoxique et génotoxique, et notamment le 4-hydroxy-2-nonénal (HNE) issu de la peroxydation des AGPIs n-6. De ce fait, nous avons voulu étudier l’effet in vitro de produits finaux de la lipoperoxydation sur un modèle cellulaire adapté à la cancérogenèse colorectale : cellules épithéliales coliques de souris au génotype sain pour le gène adenomatous polyposis coli (Apc +/+) et cellules épithéliales coliques de souris pré-cancéreuses mutée sur un allèle du gène Apc (Apc Min/+). L’obtention de ces cellules immortalisées a été établie par Fabrice Pierre (207). La technique consiste en une immortalisation des cellules via le transfert par transfection d’un gène conditionnellement immortalisant, l’antigène T du virus 40 de singe (AgT SV40). L’AgT est thermolabile, ce qui permet d’avoir des cellules immortalisées à une température permissive (33°C) mais capable de différenciation lorsque l’antigène T est inactivé (à 37°C). De plus, pour éliminer les problèmes liés au site d’intégration du gène, les auteurs ont intégré le ts A 58 (antigène thermosensible) sous le contrôle du promoteur CMH I H-2K interféron γ inductible dans un ovocyte de souris CBA/Ca x C57 BL/10. La lignée de souris obtenue est connue sous le nom de ‘Immortomouse’. L’immortalisation des cellules isolées à partir de cette lignée de souris est donc à la fois sous contrôle de la température et de l’interféron γ inductible. Les cellules de l’épithélium colique ainsi obtenues expriment les mêmes 120 marqueurs de différenciation une fois l’antigène T inactivé. En croisant ces lignées de souris avec des souris Min, dont toutes les cellules sont mutées sur un des allèles du gène Apc, on obtient une lignée cellulaire de l’épithélium colique mutées pour le gène Apc (208). L’avantage d’une telle technique est : - d’éviter de travailler sur des cellules issues d’adénocarcinome, affectées de nombreuses mutations, mal adaptées à l’étude de phases précoces de la cancérogenèse colorectale - d’éviter de travailler sur des primo-cultures, car les primo-cultures de cellules épithéliales se maintiennent mal en culture - l’immortalisation par un antigène T thermolabile permet une immortalisation des cellules à une température permissive, alors que les cellules se rapprochent de la situation in vivo à la température non permissive. L’objectif du travail est de tester différents aldéhydes issus de l’oxydation lipidique des AGPIs n-6 ou n-3 et de voir leur effet sur des cellules mutées ou non sur le gène Apc. 121 Etude 4 : Effet des aldéhydes terminaux de l’oxydation lipidiques des acides gras polyinsaturés sur des cellules épithéliales coliques saines ou précancéreuses, mutées sur le gène Apc Introduction L’un des évènements précoce de la cancérogenèse colorectale est la mutation sur le gène Apc. Le HNE (4-hydroxynonenal) issu de l’oxydation lipidique des AG n-6 est plus cytotoxique sur les cellules saines Apc +/+ que sur les cellules mutées Apc Min/+ (Pierre et al., 2007). Par ailleurs, les eaux fécales de rat ayant mangé de la viande rouge sont plus cytotoxiques sur les cellules saines Apc +/+ que sur les cellules mutées Apc Min/+ (128). Dans ces eaux fécales, du HNE a été dosé et pourrait donc expliquer le différentiel de cytotoxicité observé. Le HNE est donc présent dans les eaux fécales de rats ayant mangé de la viande rouge ou de la charcuterie, conduisant alors à un différentiel de cytotoxicité favorisant les cellules ayant déjà subi une mutation sur un allèle du gène Apc (128). Cependant, les acides gras d’autres familles sont présents dans l’alimentation, notamment dans les charcuteries, et peuvent aussi induire une modulation de la cancérogenèse coloerctale (209). De ce fait, d’autres aldéhydes issus de la lipoperoxydation de ces acides gras sont formés in vivo après la consommation de viande rouge ou de charcuteries, comme le montre l’augmentation importante du niveau des TBARs dans les selles. Ces aldéhydes pourraient être cytotoxiques/génotoxiques au niveau de l’épithélium colique comme l’est le HNE. L’identification d’un ou des aldéhyde(s) toxique(s) au niveau de l’épithélium colique permettrait d’identifier la famille de lipides (oméga 3/oméga 6) impliquée dans la cancérogenèse colique. Si une famille paraît plus toxique que l’autre, ceci permettrait de proposer une modification bénéfique de la composition des viandes et/ou charcuteries. Pour cela, nous avons voulu caractériser la réponse de cellules saines ou cellules mutées sur le gène Apc par rapport aux aldéhydes de la lipoperoxydation de différents AGPIs : le HNE, issu des AG n-6 ; le 4-hydroxy-héxénal ou HHE issu des AG n-3, et le malondialdéhyde ou MDA issu de la lipoperoxydation des AGPIs comportant plus de 3 doubles liaisons. 122 Résumé de l’article A4 Les études épidémiologiques suggèrent que la consommation de viande rouge est associée avec la promotion du cancer colorectal. Une des hypothèses expliquant cette association est liée à la présence de fer héminique dans la viande rouge. L’hème dans la viande rouge est promoteur des lésions pré-cancéreuses chez le rat à qui l’on a donné un régime bas calcium. Il a déjà été montré que l’oxydation lipidique est un biomarqueur précoce corrélé à la promotion par l’hème. Du 4-hydroxynonenal (HNE) a déjà été trouvé dans les eaux fécales de rats consommant de la viande rouge. Le HNE est plus toxique sur des cellules de l’épithélium coliques murines saines [adenomatous polyposis coli (Apc +/+)] que sur des cellules précancéreuses (Apc Min/+). Pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la promotion induite par l’hème, nous avons testé l’effet de différents aldéhydes issus de l’oxydation des AG n- 6 (comme le HNE) ou issus de l’oxydation des AG n-3 [comme l’héxénal (HHE) et le malondialdehyde (MDA)] sur la cytotoxicité, la génotoxicité et l’apoptose sur les deux lignées cellulaire Apc +/+ et Apc Min/+. De plus, nous avons mesuré l’effet du HNE sur la capacité de métabolisation des cellules. Nous avons montré que la mutation sur le gène Apc rend les cellules plus résistantes à la toxicité du HNE et du HHE, alors que la mutation Apc est sans effet sur la toxicité du MDA. Le HNE et le HHE sont aussi plus génotoxiques sur les cellules Apc +/+ que sur les cellules Apc Min/+, et y induisent une plus grande expression de la caspase. La résistance des cellules Apc Min/+ peut être expliquée par le fait que ces cellules mutées métabolisent le HNE plus rapidement que les cellules saines Apc +/+. En conclusion, les aldéhydes issus de l’oxydation des AG n-3 et AG n-6 peut être impliqués dans la promotion par l’hème. 123 Apc Mutation Induces Resistance of Colonic Cells to cytotoxicity, genotoxicity and apoptosis caused by 4-hydroxy-2nonenal and 4-hydroxy-2-hexenal Raphaelle L. Santarelli*°, Nathalie Naud*, Maryse Baradat*, Sylviane Taché*, Marc Audebert*, Françoise Guéraud*, Fabrice H. Pierre* * Université de Toulouse, ENVT, INRA, UMR1089 Xénobiotiques, BP-87614, 23 Ch. des Capelles, F-31076 Toulouse, France ° IFIP-Institut du Porc, 149 rue de Bercy, F-75595 Paris Cedex 12 Corresponding author: [email protected] Key word: colorectal cancer meat Apc 4-hydroxy-2-nonenal 4-hydroxy-2-hexenal malondialdehyde Abstract Epidemiological studies suggest that high red meat intake is associated with promotion of colorectal cancer. Previous experimental studies showed that heme in beff promotes precancerous lesions in rat colon. The mechanism is correlated with fat oxidation considered as a biomarker of heme-induced promotion. 4-hydroxy-2-nonenal (HNE) is formed by the n-6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) oxidation. We have already found HNE in fecal water of beef-fed rats. We have shown that HNE was more cytotoxic to normal [adenomatous polyposis coli (Apc +/+)] than to premalignant cells (Apc Min/+). However, other aldehydes of fat oxidation may be involved in red meat promotion of colorectal cancer. 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) is produced by the n-3 PUFAs oxidation and malondialdehyde (MDA) is formed by PUFAs oxidation with three or more double bonds. Here we tested toxicity of HNE, HHE and MDA on the two cells lines Apc +/+ and Apc Min/+ with the measure of cytotoxicity, genotoxicity and apoptosis. Moreover, we tested metabolization capacity of the two cell lines towards HNE. HNE and HHE increased cytotoxicity from 10 to 80 µM and apoptosis on Apc +/+ compared to Apc Min/+ at 40 and 80µM. Only HNE increased the genotoxicity on Apc +/+ compared to the mutated ones at 20µM. The heterozygote Apc mutation renders the cells resistant to HNE and HHE. The resistance of Apc Min/+ might be explained by the fact that these mutated cells are able to metabolize HNE more rapidly than wild cells do. In conclusion, both aldehydes formed by oxidation of n-3 and n-6 PUFAs are toxic to colon epithelial cells, but HNE seem to be more toxic than HHE is. These end products of PUFAs oxidation might be involved in red meat promotion. 124 Introduction Colorectal cancer is the third cancer for incidence and mortality in US after lung-bronchus and prostate cancer in men and after lung-bronchus and breast in women [1]. Environmental factors are involved in the etiology of this cancer, particularly diet [2]. Epidemiological studies suggest that there is a positive association between colorectal cancer and intake of red meat [3-5]. The mechanisms explaining the relationship between colorectal cancer and red meat intake involve heme. Heme, as a purified molecule or in red meat, promotes preneoplasic lesions, aberrant crypt foci and mucin depleted foci, in the colon of dimethylhydrazine-initiated rats given a low-calcium diet [6-8]. This promotion is correlated with fat oxidation and cytotoxicity of fecal water, considered as two biomarkers of heme-induced promotion. In these studies, safflower oil (rich in n-6 PUFAs) is used in diet. Oxidation of n-6 PUFAs leads to the formation of 4-hydroxy-2-nonenal (HNE). HNE induces genotoxicity on human adenoma cells and apoptosis in many cell lines through caspase 3 activation [9-13]. In addition, HNE has been found in fecal water of beef-fed rats [14]. In this study, HNE induces the same differential of cytotoxicity between normal epithelial colon cells and premalignant epithelial cells than fecal water of beef-fed rats induces. The authors suggested that this compound, or other hydroxyalkenals produced by fat oxidation, could be the link between oxidative stress and selection of Apc mutated cells. HNE present in fecal water of beef-fed rat may be involved in red meat-induced promotion. Oxidation of n-3 PUFAs, such as docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid, generates a closely related compound, 4-hydroxy-2hexenal (HHE). HHE exerts genotoxic effects in cells and forms 1,N2-propano adducts with deoxyguanosine at high concentrations [15]. Furthermore, malondialdehyde (MDA) is one of the most abundant carbonyl products of fat oxidation. MDA is formed by oxidation of PUFAs with three or more double bonds [16]. MDA is a well know mutagenic compound which reacts with DNA to form adducts with deoxyguanosine, deoxyadenosine and deoxycytidine [16]. The choice of the in vitro model is essential to understand the relationship between the fecal compounds and the etiology of colorectal cancer. Up to now, cell line studies have only been performed on human or mouse carcinoma cell lines. These transformed cell lines are poorly suited to investigate the biological effect of compounds in fecal water, since normal or premalignant epithelial cells are the physiological targets of these components [17]. Hence, mechanistic conclusions for cancer promotion could not really be extrapolated from these in vitro studies. Colon cancer is a multistep model as descript by Fearon and Volgestein [18]. Mutation in the adenomatous polyposis coli (Apc) gene on chromosome 5q21 locus is considered to be the earliest event in the initiation of colorectal cancer [19]. The Apc mutation is found in vivo in preneoplastic lesions and in tumor colon of rat [20]. We have some intestinal cell line derived from C57BL/6J mice (Apc +/+) and Min mice (Apc Min/+) which retains the heterozygous Apc genotype and the disordered actin cytoskeleton network for the Apc Min/+ cell lines [21-23]. This cellular model can contribute to a better understanding of biological effects of promoters on normal (Apc +/+) or premalignant cells (Apc Min/+). Indeed, the comparison between normal colonic cells and Apc-mutated cells is interesting to understand the mechanisms involved in early step of colorectal cancer. The importance of such cell culture systems modeling different stages of carcinogenesis in comprehension of mechanisms by which dietary compounds impact cancer progression has been described by Fenton et al. [24]. Indeed, with this cellular model, 125 we have recently demonstrated that Apc Min/+ cells have a greater potency to metabolically bio-activate 2-Amino-1methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP), than Apc +/+ cells. This result can thus explain the promoting effect of this heterocyclic aromatic amine by a higher probability to generate new in situ mutations [25]. The aim of this study was to test the effect of aldehydes formed by oxidation of n-6 and n-3 PUFAs on normal (Apc +/+) or premalignant cells (Apc Min/+). We measured cytotoxicity, genotoxicity and apoptosis when cells are in contact with these aldehydes to test if end products of n6 PUFAs oxidation are more toxic than those of n-3 PUFAs oxidation as n-3 PUFAs are considered to have a rather protective effect face to carcinogenesis. Material and methods Cell lines Apc +/+ and Apc Min/+ cells harbor a temperature-sensitive mutation of the simian virus 40 large tumor antigen gene (tsA58), under the control of interferon γ, as previously described [21-23]. These cells are ‘immortalized’, that means they express active SV40 at the permissive temperature (33°C). Cells were cultured at permissive temperature of 33°C in Dulbecco-modified essential medium (DMEM) supplemented with 10% (v/v) fetal calf sera, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, and 10 U/ml interferon γ. The studies were performed at non-permissive temperature of 37°C, and without interferon γ, to inhibit the SV40 transgene and limit proliferation. Chemicals 4-hydroxy-2-nonenal (HNE) and 4hydroxy-2-hexenal (HHE) dimethylacetal were synthesized as described by Chandra and Srivastava [26]. Just before use, the dimethylacetal derivative was hydrolyzed with 1 mM HCl for 1 h at room temperature. The aqueous solution was vortex-extracted five times with dichloromethane. The organic phase containing HNE or HHE was filtered on a phase-separation filter (Whatman SP1, Maidstone, UK) and evaporated under vacuum without heating. The liquid residue was resolubilized in distilled water and the HNE or HHE concentration was spectrophotometrically determined at 223 nm. [4-3H]HNE (purity >95%, specific activity 222 GBq/mmol) was synthesized at CEA Service des Molécules Marquées CEN (Saclay, France) in its diethyl acetal form, according to the method developed in our laboratory for the deuterated compound [27]. Malondialdehyde (MDA) was made as described by Fenaille et al. [28]. Briefly, tetramethoxypropane (TMP, SigmaAldrich, Saint Quentin Fallavier, France) was diluted in HCl 0.1 N. The solution was incubated at 40°C for 40min to induce the hydrolysis of TMP to MDA. Concentration of MDA was spectrophotometrically determined at 244 nm. Cytotoxicity assay Two cytotoxicity assays were done: MTT luciferase-coupled ATP assay and quantification assay. Cells were seeded into 96-well culture plates at a seeding density of 5*103 cells per well in Dulbecco-modified essential medium (DMEM) supplemented with 10% (v/v) fetal calf sera, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, and 10 U/mL interferon γ at permissive temperature of 33°C. After 72h, cells were transferred at 37°C without interferon γ for 24h. Culture medium was then replaced by different concentrations of aldehydes at 2.5, 5, 10, 20, 40 and 80 µM diluted in the culture medium without interferon γ and without fetal calf sera. Untreated control wells were wells with culture medium without fetal calf sera and without interferon γ. After 24h of contact, cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS). 126 Cytotoxicity of aldehydes was quantified by the 3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide test (MTT) at 0.9mg/ml in PBS. The reaction product was solubilized in 100µl lysis buffer (SDS 10%, NaOH 0.1M) before color of reaction product was quantified using a plate reader at 570 nm and 690 nm. Results are expressed in % of dead cells relative to untreated wells. These assays were performed in triplicate. Cytotoxicity was also measured after 6h of contact at 5, 10 and 20µM, to have the same time of exposition than the genotoxicity assay. Cells were treated as described above. Cell viability was measured using a luciferasecoupled ATP quantification assay (CellTiter-Glo; Promega). In this assay, luminescent signal is proportional to the amount of ATP and consequently to the number of viable cells. At the end of treatment, 100 µL of CellTiter-Glo reagent was added and plates were shaked for 2 minutes on an orbital shaker. Plates were then incubated at room temperature for 10 min, and the luminescence intensity of each well was determined using an INFINITEM200 plate reader (TECAN). Results are expressed in % of dead cells relative to untreated wells. These assays were performed in triplicate. Genotoxicity assay Genotoxicity was measured on Apc +/+ and Apc Min/+ by in cell western according to Audebert et al. [29]. Doublestrand breaks induce histone H2AX phosphorylation into the so-called γ-H2AX, and the H2AX phosphorylation reflects a global genotoxic insult resulting from diverse type of DNA damage [30]. Cells were dispensed in the same way as in the cell viability assay (5x103 cells//well) and were treated with aldehyde (5, 10 and 20 µM) and vehicle in duplicate within a 96-well cell culture plate. Culture medium without interferon γ and without fetal calf sera was used for untreated control wells. After 6 hours treatment, cells were washed in PBS and directly fixed in the plate with 2% paraformaldehyde in PBS for 10 min at RT and then washed in PBS for 5 min. Paraformaldehyde was neutralized with 20mM NH4Cl for 2 min and then washed in PBS for 5 min. Cells were permeabilized with 0.2% Triton X-100 in PBS for 5 min and washed in PBS, 2% fetal calf serum, 0.2% Triton X-100 (PST buffer). Cells were blocked with 10% fetal calf serum, 2% bovine serum albumin, 0.2% Triton in PBS for 60 min at RT, followed by 30 min incubation with mouse anti γ-H2AX (1:200) in PST buffer. After three 5 min washes in PST, secondary detection was carried out using a infrared fluorescent dye conjugated donkey antibodies absorbing at 800 nm (IRDye™ 800CW, Rockland) (1:500) in PST buffer. For DNA labelling, 1:500 dilution of TOPRO-3 iodide (Molecular Probes) in PST was used in conjugation with the secondary antibody. After 30 min of incubation and three 5 min washing in PST, the DNA and the γ-H2AX were simultaneously visualized using the Odyssey Infrared Imaging Scanner (Li-Cor ScienceTec, Les Ulis, France) with the 680 nm fluorophore (red color) and the 800 nm fluorophore (green dye). Relative fluorescence units from the scanning allowed a quantitative analysis. Relative fluorescent units for γ-H2AX per cell (as determined by γ-H2AX divided by DNA content) were divided by vehicle controls to determine percent change in phosphorylation of H2AX levels relative to control. Statistical analysis was performed to determine significant genotoxicity effects due to aldehyde treatment. This assay was done in triplicate. Apoptosis Apotosis was measured by using a luminescent assay (Caspase-Glo3/7; Promega). In this assay, luminescent signal is proportional to the amount of caspase activity present. Briefly, the assay provides a luminogenic caspase 3/7 substrate which contains the tetrapeptide DEVD linked to a luciferase. Cells were treated 6 h with 127 aldehydes. After lysis of cell followed by caspase cleavage with the reagent given by the kit, there is a luminescent signal produced by luciferase. At the end of treatment, 100 µL of Caspase-Glo3/7 reagent was added, and plates were mixed using a plate shaker at 300-500rpm for 30 seconds. Plates were incubated at RT for 2 hours and the luminescence intensity of each well was determined using an INFINITEM200 plate reader (TECAN). This measure was performed in triplicate with the aldehydes at 2.5, 5, 10, 20, 40 and 80µM. HNE metabolization assays In order to understand why mutated cells seem to be more resistant to cytotoxic aldehydes than wild type ones, HNE metabolization assays were performed on both cell lines. Both cells lines were incubated with different concentrations of radiolabelled HNE in culture medium and for different incubation times. Culture supernatants were collected and 0.88µM of acetic acid was added to improve HNE storage. Supernatants were analyzed by HPLC at 1ml/min and remaining HNE was quantified. An HPLC system consisted of a 420 Kontron pump (Zurich, Switzerland) equipped with a 500 µL loop and a Spherisorb ODS2 column (5 µm, 250x4.6 mm) protected by a precolumn (Kromasil C18 10 µm) and connected to a Packard Flo-One on-line radioactivity analyzer. Two mobile phases were used: A containing 2.5% acetonitrile and 97.5% acetic acid (0.1%, v/v) and B containing 60% acetonitrile and 40% acetic acid (0.1%, v/v), using the following gradient : 0 min : 15% B, 10 min: 25%B, 20 min : 26% B, 40 min: 65% B, 45 min: 65%B, 50 min: 15% B, 65 min: 65% B. In this eluent system, retention time for HNE was 36.5 min. Statistical analysis Results were analyzed using Systat 10 software for Windows and all data were reported as mean ± SD. For each cell line and each test, values were considered firstly using one-way analysis of variance (ANOVA). If a significant difference was found between groups (p<0.05), comparison of each experimental group with the control was made using Dunnett’s test. Secondly, the effect of each concentration of aldehyde on Apc +/+ cell line was compared with the effect on Apc Min/+ using Student’s t-test. Results Cytotoxicity of aldehydes We determined cytotoxicity of aldehydes with two different assays: measure of cytotoxicity with the MTT assay and with the Cell titer Glo assay after 24h of exposure. Addition of HNE in the medium of culture induced a strong dose-dependent increase in cytotoxicity on Apc +/+ from 10 to 80µM, and a significant increase of cytotoxicity on Apc Min/+ only for 40 and 80µM (table 1, figure 1, p<0.05; for the two test). MDA did not show any significant cytotoxicity on the two lines (p>0.05, table 1, figure 1; for the two test). HHE induced a significant increase in cytotoxicity on Apc Min/+ for 40 and 80µM (table 1, figure 1, p<0.05 for the two test), and a significant increase of cytotoxicity on Apc +/+ from 10 to 80µM with Cell titer Glo assay but only for 40 and 80 for MTT assay (table 1, figure 1, p<0.05). Thus, there was a significant difference between Apc +/+ and Apc Min/+ with HNE from 10 to 80 µM with MTT test (table 1, figure 1, p<0.05) and from 20 to 80 with Cell titer Glo assay (table 1, figure 1, p<0.05). HHE was significantly more cytotoxic on Apc +/+ than on Apc Min/+ at 40 and 80 µM with MTT assay, and from 20µM to 80 µM with Cell titer Glo assay 128 (table 1, figure 1, p>0.05; for the two test). There was no difference between the two lines for MDA (table 1, figure 1, p>0.05; for the two test) No cytotoxicity was observed on the two cell lines after 6h of exposition for the three aldehydes (data not shown). Genotoxicity of aldehydes Genotoxicity of aldehydes were determined by the measure of the phosphorylation of histone H2AX. Addition of HNE in the medium of culture induced a significant increase in genotoxicity on Apc +/+ at 20 µM while there was no effect on Apc Min/+ (table 1, figure 1, p<0.05). MDA and HHE did not show any significant genotoxicity on the two lines (p>0.05, table 1, figure 1). There was a significant difference between Apc +/+ and Apc Min/+ with HNE at 20 µM (table 1, figure 1, p<0.05). Apoptosis of aldehydes Apoptosis were determined by the measure of the expression of caspase 3/7. Addition of HNE and HHE to the culture medium of culture induced a significant increase of expression of caspase 3/7 on Apc +/+ at 40 and 80 µM while addition of HNE at 80 µM was necessary to induce apoptosis on Apc Min/+ (table 1, figure 1, p<0.05). MDA did not induce apoptosis on the two cell lines (p>0.05, table 1, figure 1). There was a significant difference between Apc +/+ and Apc Min/+ for HNE and HHE at 80 and 40 µM (table 1, figure 1, p<0.05). There was no difference between the two lines for MDA (table 1, figure 1, p>0.05). HNE metabolization For a concentration of 40 µM, that induces the highest difference between cell lines for cytotoxicity, four incubation times were tested. For an incubation time of 30 min, four concentrations were tested. Figure 2 shows that for each incubation time tested and for each concentration tested, remaining HNE concentration in the supernatants is always higher for wild type cells than for mutated ones. It is interesting to note that for mutated cells, remaining HNE is around 5% whatever the concentration of HNE added while for wild cells, when the concentration of added HNE increased, the concentration of remaining HNE in the supernatant increased too. Discussion The aim of this study was to compare three aldehydes formed by the oxidation of n-6 and n-3 PUFAs on cytotoxicity, genotoxicity and apoptosis on colon normal epithelial cells Apc +/+ and premalignant cells Apc Min/+. In the present study, HNE and HHE were more cytotoxic on Apc +/+ than on Apc Min/+, and they induced more apoptosis on the normal cells than on the mutated ones. Only HNE was more genotoxic to Apc +/+ than to Apc Min/+, with a more important effect on Apc +/+. On the opposite, MDA did not show any effect on these cells. HNE can be formed endogenously and can be present in food, particularly in food with both heme iron and n-6 PUFAs [31]. HNE has been also found in smoked pork [32]. Cytotoxicity of HNE has been already tested on the Apc +/+ and Apc Min/+ cell lines [14]. In this paper, the single Apc mutation renders the cells strongly resistant to HNE. HNE is a highly reactive compound which can react particularly with thiol and amino groups [33]. As a result, HNE exhibits a high reactivity with proteins and nucleic acids. That is why we measured genotoxicity on Apc +/+ and Apc Min/+ with the H2AX assay. Gamma-H2AX formation is a rapid and sensitive cellular response to the presence of DNA double-stranded breaks [30]. This event is characterized as an early reaction to a genotoxic context like 129 oxidative stress [34,35]. This assay has been tested on the genotoxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons [29]. In this study, measure of H2AX phosphorylation seems to be suitable assay to screen genotoxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons, with a better sensitivity than the COMET assay. Our results showed that HNE 20 µM induced higher genotoxicity at low concentration on the normal cells than on the premalignant cells (table 1, figure 1). The measure of the H2AX signal reflected only genotoxicity, and not cytotoxicity, since we did not show any cytotoxicity after 6h of exposition (data not shown). These results suggest that at high concentration, HNE select mutated cells, and at low concentration, HNE creates mutations on the wild cells. HNE would enhance formation of DNA double-stranded breaks on the wild cells while it would not have any genotoxic effect on the mutated ones. As Pierre et al. showed that HNE would have a potential promoting effect of colorectal cancer by red meat intake, our results suggest that HNE would have an initiating effect as well [14]. In Apc Min/+ cells, Apc can not associate with the complex and do not allow a reparation of DNA. Results of cytotoxicity and genotoxicity showed that HNE killed wild type cells and enhanced mutations in these cells, suggesting that HNE could have a major role in colorectal cancer in meat eaters. The phosphorylation of this histone is linked to caspase-controlled DNA fragmentation during apoptosis [36], that is why we measured caspase expression on the two cells lines. Apoptosis results showed that HNE induced a greater expression of caspase 3/7 on Apc +/+ than on Apc Min/+ (table1 and figure 1). These results are similar to those obtained by the measure of apoptosis induced by fecal water of beef-fed rats assessed by flow cytometry with the anti-ssDNA Mab [14]. In this previous study, fecal water of beeffed rats contains HNE and induces higher caspase 3 activity on Apc +/+ than on Apc Min/+. In the same way, this compound has already been shown to induce apoptosis in many cell lines, and caspase 3 activation is likely to be involved [9]. The different results showed that the Apc mutation rendered the cells strongly resistant to HNE for cytotoxicity, genotoxicity and the expression of caspase. This leads to a “selection” of the premalignant cells. In addition, HNE metabolization studies on both cell lines clearly show that mutated cells are able to metabolize HNE more rapidly than wild cells do. This increased metabolization capacity is independent from HNE concentration. Taken together, these results show that mutated cells are well adapted to a “peroxidative” environment induced by meat. HHE is formed by the oxidation of n-3 PUFAs. As HNE, HHE is more cytotoxic and induced a greater expression of caspase 3/7 on Apc +/+ than on Apc Min/+ (table 1, figure 1). However, HHE did not show any genotoxicity activity on cells. Other studies have shown that HHE is a cytotoxic and genotoxic compound at concentrations which were shown to be biologically effective in vitro [15]. Primary rat colon mucosa cells are particularly sensitive to HHE compared to other cell lines. Taken together, our results suggest that HHE formed by the oxidation of n-3 PUFAs exerts greater toxicity on normal colon cell than on premalignant cell. As for HNE, we had a selection of the Apcmutated cells as observed with the cytotoxicity assay. But HHE seems to be less toxic than HNE since HHE did not induce genotoxicity on cells. Other authors found that HNE exerts higher toxicity than HHE does [37]. HHE may exert toxicity on colon mucosa, but it is less potent than HNE is. Several studies have been done to improve pork meat quality, and particularly its n-3 PUFAs content, by including extruded linseed in animal feed [38]. This study showed that the incorporation of linseed in the ration increases n-3 PUFAs levels in the 130 Longissimus dorsi muscle of pork. Meat rich in n-3 PUFAs could increase toxicity on colonic tissue by the oxidation of fat and formation of HHE in digestive tract, as suggested by our results on cytotoxicity. Unfortunately, we have not managed yet to measure HHE level in fecal water of meatfed rats. Surprisingly, MDA did not exert any toxicity on both Apc +/+ and Apc Min/+. Our results are contradictory with previous results since MDA is a well-known mutagenic and carcinogenic compound. Marnett reported that MDA reacts with guanosine to form pyrimidopurinone, abbreviated M1G [16]. M1G has been found in rodents and in humans. This adduct is also present in human colorectal mucosa [39]. In this study, high intake of beer, alcohol and white meat is correlated with adducts level in men, but the effect of red meat intake was not studied. In our study, we decided to choose MDA because red meat promotes preneoplastic lesions in rat [6-8]. This promotion is correlated with fat oxidation in fecal water measured by TBARs assay. We thus speculated that synthesized MDA would exert toxicity on cells in vitro. Marnett et al. tested mutagenicity of MDA and side products formed during its chemical synthesis on mutagenic to Salmonella typhimurium strain his D 3052 [40]. The major mutagenic compound produced from tetraethoxypropane is beta-ethoxy-acrolein (90 to 100 revertants/mumol) and not malondialdehyde (3 to 5 revertants/mumol). In the same way, Esterbauer reported that MDA has weak toxicity since 1000µmol MDA/L and did not lyse skin fibroblasts [41]. Fisher et al. do not find any toxicity of MDA on SENCAR mouse skin model [42]. Taken all together, results on toxicity of MDA remain controversial. Toxicity of MDA seems to be dependant on its concentration, the in vitro model and on the other side products formed during its synthesis. The present study showed 4hydroxyalkenals formed by the oxidation of n-6 and n-3 PUFAs exert toxicity on epithelial colon cells. Apc-mutated cells seem to be more resistant than the normal cells face to these compounds. A “peroxidized” environment in colon lumen could give a selective advantage to already mutated cells, thereby explaining the promoting effect of such an environment. AKNOWLEDGMENT We thank Isabelle Jouanin (UMR1089 Xénobiotiques, INRA) for the synthesis of 4-hydroxy-2-nonenal. This work was supported by COSTB35. References 1. 2. 3. 4. 5. 6. Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J and MJ., T. (2009) Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin., 59, 225-49. Willett, W. 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Apoptosis on Apc Min/+ with Apoptosis Genotoxicity Cytotoxicity on Apc +/+ with Cytotoxicity (relative to DMEM) Genotoxicity Cytotoxicity (relative to DMEM) Cytotoxicity ,a γ-H2AX phosphorylation γ-H2AX phosphorylation ,a on Apc +/+ on Apc Min/+ on Apc +/+ on Apc Min/+ on Apc +/+ on Apc Min/+ Cell Titer Glo Cell Titer Glo assay assay MTT assay MTT assay Caspase Glo 3/7 assay Caspase Glo 3/7 assay (% dead (% dead cells) cells) (% dead cells) (% dead cells) (relative to DMEM) (relative to DMEM) ,a 2.30±0.49* ,a 1.73±0.39* 1.14±0.10 1.07±0.06 0.96±0.08 1.06±0.08 nt nt 0.96±0.08 0.96±0.03 52.4±9.6* 21.9±9.4* 9.6±9.4 12.4±7.3 5.4±7.1 2.9±5.6 nt nt ,a 1.31±0.12* 1.00±0.06 75.0±6.9* ,a 50.7±6.9* ,a 27.5±5.1* 18.5±4.3* 10.7±10.3 6.6±2.8 0.96±0.04 nt 67.0±12.8* 28.6±13.2* 3.5±1.9 0.1±5.6 3.0±1.6 6.5±3.2 0.97±0.03 nt 89.1±1.9* ,a 70.8±12.3* ,a 26.6±13.3* ,a 13.1±9.5* 4.1±3.2 7.4±1.9 1.46±0.18* 1.00±0.07 1.00±0.11 0.98±0.05 0.97±0.07 1.01±0.03 HNE80 HNE40 HNE20 HNE10 HNE5 HNE2.5 1.04±0.14 0.97±0.08 1.00±0.12 0.98±0.04 0.99±0.06 1.00±0.23 nt nt 4.7±1.0 3.3±3.1 4.6±2.0 4.3±3.0 10.1±2.7 6.3±2.9 nt nt 7.4±3.1 12.0±8.4 10.2±6.7 11.1±5.6 11.4±6.9 10.0±3.9 1.00±0.01 1.01±0.03 0.97±0.01 nt 10.2±8.2 5.2±2.7 5.7±7.5 6.7±5.6 6.1±3.2 6.4±6.7 1.05±0.02 0.99±0.02 1.03±0.03 nt 8.6±3.2 1.7±1.4 2.5±2.6 5.0±2.1 3.9±5.9 4.8±3.0 1.11±0.09 1.04±0.05 1.05±0.04 0.99±0.14 1.00±0.09 1.01±0.10 MDA80 MDA40 MDA20 MDA10 MDA5 MDA2.5 ,a 1.19±0.08 1.03±0.03 1.02±0.05 1.00±0.06 0.94±0.06 0.86±0.17 ,a 1.78±0.25* ,a 1.38±0.10* 1.08±0.17 0.97±0.10 0.97±0.11 0.92±0.03 ,a 45.8±12.6* 23.6±5.7* 6.3±5.0 5.0±3.0 6.6±5.5 5.2±2.1 nt 66.0±4.2* ,a 45.4±7.4* ,a 25.5±10.9* 11.7±13.6* 9.8±4.9 4.5±2.4 nt nt 1.04±0.07 0.99±0.06 1.05±0.07 52.7±17.0* 25.6±13.0* 14.5±7.4 10.2±1.3 9.8±6.5 2.0±2.9 nt 82.2±1.6* ,a 54.3±13.9* 15.0±14.0 a 1.1±3.9 a 0.1±3.0 7.2±5.6 nt nt 1.12±0.07 1.13±0.12 1.01±0.03 HHE80 HHE40 HHE20 HHE10 HHE5 HHE2.5 Values are means ± SD of three repetitions *: Different from control samples using Dunnett’s test (p<0.05) a : significant difference between Apc +/+ and Apc Min/+ using Student’s test (p<0.05) nt: non tested 135 A * a, 40 a, * * * 20 0 2.5 5 10 20 100 100 80 80 * 80 60 * %of cytotoxictyby MTT assay %of cytotoxictyby MTT assay a, 40 %of cytotoxicty by MTT assay a, 100 60 40 20 0 2.5 80 5 10 20 40 80 a, a, * 40 a, 20 a, * * 0 2.5 -20 5 10 20 40 80 µM HHEin DMEM B * 80 a, * 60 * a, * 40 * * 20 0 2.5 5 10 20 40 100 % o f cyto to xicity b y lu ciferase-co u p led A T P q u an tificatio n assay a, % o f cyto to xicity b y lu ciferase-co u p led A T P q u an tificatio n assay % o f cyto to xicity b y lu ciferase-co u p led A T P q u an tificatio n assay 100 100 80 60 40 20 0 80 2.5 5 µM HNE in DMEM 10 20 40 80 a, * 60 * a, * 40 * a, * * 20 0 2.5 80 5 10 20 40 80 µM HHE in DMEM µM MDA in DMEM 2,5 ,* a ,* 2,0 * 1,5 1,0 0,5 2.5 5 10 20 40 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 2.5 80 20 40 80 2,5 a ,* 2,0 a, 1,5 * * 1,0 0,5 2.5 5 10 20 40 80 µM HHE in DMEM a HNE 5 HNE10 µM HNE HNE 20 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 F o ld in d u c t io n o f H 2 A X p h o s p h o ry la t io n p e r c e ll c o m p a re d t o m e d iu m c u lt u re ,* 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 F o ld in d u c t io n o f H 2 A X p h o s p h o ry la t io n p e r c e ll c o m p a re d t o m e d iu m c u lt u re F o ld in d u c t io n o f H 2 A X p h o s p h o ry la t io n p e r c e ll c o m p a re d t o m e d iu m c u lt u re 10 3,0 µM MDA in DMEM µM HNE in DMEM D 5 E x p r e s s io n o f c a s p a s e 3 /7 r e la t iv e t o c o n t r o l a E x p r e s s io n o f c a s p a s e 3 / 7 r e la t iv e t o c o n t r o l E x p r e s s io n o f c a s p a s e 3 /7 r e la t iv e t o c o n t r o l C 3,0 MDA 5 MDA 10 MDA 20 * 60 µM MDA in DMEM µM HNEin DMEM * * 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 HHE 5 µM MDA HHE 10 HHE 20 µM HHE Fig.1 Dose-effect of HNE, MDA and HHE on Apc +/+ (hatched line) and on Apc Min/+ (solid line) A: cytotoxicity using MTT test after 24h of exposition B: cytotoxicity using luciferase-coupled ATP quantification assay after 24h of exposition C: apoptosis measured by the expression of caspase 3/7 after 6h of exposition D: genotoxicity measured by the phosphorylation of H2Ax after 6h of exposition *: Different from control samples using Dunnett’s test (p<0.05) a : significant difference between Apc +/+ and Apc Min/+ using Student’s test (p<0.05) 136 80 a, * a, * 60 40 a, 40 HNE remaining % HNE remaining % 100 * * 20 a, * * 0 a, 20 a, * a, * * * * * * * 10 20 0 5 10 30 incubation time (min) 90 5 40 HNE concentration (µM) Fig. 2: HNE remaining in culture medium according to (A) time incubation (Apc +/+: hatched line/Apc Min/+: solid line) and (B) HNE concentration (Apc +/+: hatched line/Apc Min/+: solid line), *: Different from control samples using Dunnett’s test (p<0.05) *: Different from control samples using Dunnett’s test (p<0.05) a : significant difference between Apc +/+ and Apc Min/+ using Student’s test (p<0.05) 137 Bilan de l’article A4 Cette étude montre que le HNE et le HHE sont nettement plus cytotoxiques, génotoxiques, et pro-apoptotiques sur les cellules épithéliales Apc +/+ que sur les cellules Apc Min/+. De même, les cellules épithéliales Apc Min/+ métabolisent plus vite le HNE que les cellules épithéliales Apc +/+. En revanche, le MDA a le même effet sur les deux lignées cellulaires, pour tous les tests effectués. Ceci est contradictoire avec les données bibliographiques, mais peut venir (i) des concentrations choisies, (ii) d’une détoxification du MDA par les deux lignées ou (iii) des produits secondaires formés lors de la synthèse du MDA. L’étude montre donc que des aldéhydes issus de l’oxydation des AGPIs n-3 ou AGPIs n-6 sont plus toxiques sur les cellules Apc +/+ que sur les cellules Apc Min/+. Tout en gardant à l’esprit que ces données sont issues de travaux in vitro, les conclusions de cette étude semblent supporter l’hypothèse qu’un enrichissement de la viande de porc en AGPIs n-3 ou AGPIs n-6 (par modification de l’alimentation des porcs) ne modifierait pas la toxicité liée à sa consommation. En conclusion, cette étude montre que les produits d’oxydation des acides gras alimentaires sont toxiques pour l’épithélium colique. Par ailleurs, les acides gras sont impliqués dans d’autres types de cancer, tels que le cancer du sein (210). Il est donc important de prendre en considération notre apport lipidique, et notamment de « surveiller » notre ratio oméga 6/ oméga 3, bien que l’étude in vitro présentée ci-dessus ne montre pas de différence toxique entre ces deux familles. Notre étude in vitro peut apporter des éléments de réponses appropriés à des questions concernant les mécanismes de toxicité et la capacité d'une molécule à provoquer des processus pouvant déclencher des phénomènes de toxicité chez l'animal. Cependant, la contribution des études in vitro à l'évaluation du risque pour l'homme reste pour le moment assez limitée et l’extrapolation de ces résultats n’est envisageable qu’avec la réalisation d’une étude in vivo. 138 Discussion générale de la thèse Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la problèmatique de la relation entre la consommation de charcuteries et le risque du cancer colorectal. Pour répondre à cette problématique de santé publique mais aussi économique, nous avons effectué des études in vivo, sur un modèle animal initié avec un cancérigène colique, et des études in vitro, à la fois pour mettre en évidence l’association consommation/risque et pour comprendre les mécanismes mis en jeu. Le modèle animal que nous avons utilisé, dont la séquence histopathologique est comparable à celle observée chez l’Homme, est adapté pour quantifier l’effet de la consommation des charcuteries sur la promotion de la cancérogenèse colorectale. De même, ce modèle animal nous a permis d’identifier des moyens de contrer l’effet promoteur de charcuteries avec des additifs alimentaires ou par modifications du procédé de fabrication des charcuteries. Le modèle in vitro constitué de cellules épithéliales colorectales murines saines ou mutées sur le gène adenomatous polyposis coli (Apc) est adapté pour comprendre les mécanismes mis en jeu de façon précoce lors de la cancérogenèse colorectale. Nous nous intéresserons en premier lieu aux modèles expérimentaux que nous avons utilisés (rats initiés par une injection de diméthylhydrazine (DMH), cellules mutées ou non sur le gène Apc). Puis nous discuterons de la démarche expérimentale que nous avons adoptée, associant des études à court et long terme. L’interprétation de nos principaux résultats nous permettra (i) d’identifier les composés des charcuteries et des viandes rouges susceptibles de promouvoir la cancérogenèse colorectale et (ii) de proposer des agents qui pourraient être utilisés chez l’Homme pour prévenir cette promotion. Enfin, nous discuterons de la pertinence des biomarqueurs biochimiques utilisés pour prédire l’effet promoteur. Nous proposerons des perspectives pour continuer ce travail. Nous terminerons enfin sur une conclusion générale afin de mesurer la portée de ce travail de thèse. 1- Les modèles d’études Lors des études in vivo, nous avons travaillé sur le rat. Ce rongeur ne développe pas spontanément de cancer colorectal, c’est pourquoi il est initié à la DMH, qui est ensuite métabolisée en azoxymethane (AOM) et en methylazoxymethanol. L’AOM induit des tumeurs au niveau du côlon qui ont des caractéristiques histologiques similaires à celles 139 trouvées chez l’Homme (129). On retrouve ainsi des mutations sur les gènes K-ras et ßcatenin, indiquant ainsi que la voie de signalisation Wnt est impliquée chez les rats initiés (211). Par ailleurs, on observe les mêmes modulations pour les enzymes associées à l’inflammation, telles que les cyclo-oxygénases et la NO-synthase inductible (211). Ce modèle présente des lésions pré-cancéreuses au niveau du côlon, telles que les FCA (foyers de cryptes aberrantes) et les FDM (foyers déplétés en mucine), que l’on retrouve chez l’Homme (153-155). Les mutations sur le gène Apc des FDM (l’un des évènements les plus précoces dans la cancérogenèse colorectale) sont présentes avec une fréquence similaire à celle des tumeurs (152). Les FDM semblent ainsi être plus prédictifs de la cancérogenèse colorectale que les FCA (150). En revanche, le modèle induit ne présente jamais de métastase. Ce modèle présente aussi des avantages par rapport à des modèles murins mutants (Souris Min mutées sur le gène Apc, souris Apc∆14/+, modèles mutés sur les gènes Msh2 ou Mlh1) qui sont utilisés dans l’étude de la relation alimentation-cancer. Le modèle chimio-induit reflète assez bien ce qui se passe chez l’Homme (histologiquement et génétiquement), en présentant à la fois des lésions pré-néoplasiques et des tumeurs au niveau du côlon. En outre, les tumeurs n’ont pas toutes le même profil de mutations, ce qui reflète la diversité des tumeurs trouvées chez l’Homme. Nous avons aussi utilisé le modèle cellulaire in vitro, dont le gène Apc est muté ou non, afin de comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la cancérogenèse. En effet, la mutation sur le gène Apc est considérée comme l’un des évènements les plus précoces lors de la cancérogenèse colorectale (159). Ainsi, les différents tests effectués en parallèle sur la lignée saine Apc +/+ et sur la lignée mutée Apc Min/+ permettent de comparer les réponses des cellules saines à celles des cellules précancéreuses. Le laboratoire avait montré que l’un des produits terminaux de l’oxydation des acides gras n-6, le 4-hydroxy-2-nonenal (HNE) est plus cytotoxique sur la lignée saine Apc +/+ que sur la lignée mutée Apc Min/+ (128). La mutation sur le gène Apc semble donc rendre les cellules plus résistantes face à un stress oxydant. La comparaison entre les cellules saines et les cellules mutées sur le gène Apc permet de comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la transition entre le tissu sain et le tissu néoplasique (212). Néanmoins, le principal inconvénient des études in vitro tient au caractère indirect des informations obtenues. Il est impossible d'établir une corrélation directe entre les effets observés sur ce modèle in vitro et les états pathologiques réellement observés chez des humains ou chez les rongeurs. Les études in vitro se limitent à fournir des informations détaillées sur les facteurs affectant la promotion de la cancérogenèse colorectale 140 et à compléter la caractérisation des mécanismes mis en jeu. Elles peuvent difficilement être considérées comme un moyen direct d’extrapolation à l’Homme. L’utilisation d’un modèle in vitro et d’un modèle in vivo reste pertinente pour l’étude de la relation entre la consommation de charcuteries et le cancer colorectal pour non seulement établir l’effet des charcuteries sur le cancer du côlon, mais aussi pour comprendre les mécanismes liant la charcuterie au cancer colorectal. 2- La démarche expérimentale Pour chaque étude in vivo, nous avons suivi la démarche expérimentale suivante : - une intervention nutritionnelle de 14 j pour tester différentes charcuteries (viandes saumurées ou charcuteries du commerce) associées ou non à différents composés potentiellement protecteurs (5 rats par groupe expérimental), - analyse des biomarqueurs fécaux et urinaires corrélés à la promotion de la cancérogenèse colorectale par l’hème : oxydation lipidique (TBARs des eaux fécales/ DHN-MA urinaire) et cytotoxicité des eaux fécales (test MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) effectué sur trois lignées cellulaires), - sélection des charcuteries ou viandes saumurées qui modulent le plus les biomarqueurs ainsi que des composés potentiellement protecteurs qui diminuent le plus les biomarqueurs, - étude de cancérogenèse colorectale de 100 j sur rat chimio-induits avec les charcuteries ou composés potentiellement protecteurs sélectionnés avec l’étude des lésions pré-cancéreuses (10 rats par groupe expérimental). Cette démarche expérimentale a été choisie suite aux études réalisées par le laboratoire sur la relation entre la consommation de viande rouge et le cancer colorectal (96-98, 167). Le laboratoire avait montré que l’hème de la viande rouge est l’agent responsable de la promotion de la cancérogenèse colorectale. Cette promotion est corrélée à une augmentation de la peroxydation lipidique et de la cytotoxicité des eaux fécales des rats après seulement quelques jours de régimes expérimentaux (14 j). Par ailleurs, des supplémentations en calcium dans un régime à base de viande rouge normalise la peroxydation lipidique et la cytotoxicité des eaux fécales (98). Enfin, la consommation de viande riche en hème augmente le DHNMA urinaire chez l’Homme (190). Le laboratoire avait alors proposé que ces paramètres 141 mesurés (peroxydation lipidique et cytotoxicité des eaux fécales) soient utilisés comme biomarqueurs précoces corrélés à la promotion par l’hème. Pour étudier la relation entre la consommation de charcuteries et le cancer colorectal, nous avons émis l’hypothèse que l’hème nitrosylé des charcuteries serait l’agent responsable de la promotion de la cancérogenèse colorectale. Nous avons ainsi utilisé les biomarqueurs (peroxydation lipidique et cytotoxicité des eaux fécales) validés pour l’étude de la relation entre la consommation de viande rouge et le cancer colorectal. Ceci nous a permis de tester de nombreuses charcuteries ou composés potentiellement protecteurs dans des études de court terme (14 j). L’analyse des biomarqueurs nous a aidés à sélectionner deux à quatre charcuteries ou composés potentiellement protecteurs pour les intégrer dans une étude de moyen terme (100 j) sur rats initiés à la DMH. Les travaux sur la viande rouge ont permis d’impliquer les produits terminaux de la peroxydation lipidique tels que le 4-hydroxy-2-nonénal (HNE) dans la promotion de la cancérogenèse colorectale. En effet, une concentration d’environ 350 ng/24h de HNE est retrouvée dans les fécès de rat consommant de la viande rouge (128). Par ailleurs, le laboratoire a montré que (i) les eaux fécales des rats consommant un régime riche en bœuf et que (ii) le HNE sont plus cytotoxiques sur les cellules saines Apc +/+ que sur les Apc Min/+. Ces mêmes eaux fécales ainsi que le HNE induisent une augmentation de l’expression de la caspase 3 (impliquée dans l’apoptose) préférentiellement chez les cellules saines, ce qui explique ce différentiel de cytotoxicité (128). Notre hypothèse initiale pour expliquer l’effet promoteur des charcuteries sur le cancer colorectal implique l’hème et les produits terminaux de la peroxydation. Nous avons ainsi développé en parallèle aux études in vivo, une étude in vitro visant à étudier l’effet cytotoxique, pro-apoptotique et génotoxique de produits terminaux de l’oxydation lipidiques des acides gras polyinsaturés (AGPIs) tels que le HNE, le 4-hydroxy-2-héxénal (HHE) issu de l’oxydation des acides gras n-3, et du malondialdéhyde (MDA) issu de l’oxydation des acides gras poly-insaturés ayant plus de trois doubles liaisons. 3- Quels sont les composés des viandes et charcuteries qui favorisent le cancer colorectal ? A partir des résultats obtenus dans ce travail, nous avons réalisé un schéma récapitulant les composés, présents dans les charcuteries, susceptibles d’être responsables de la promotion de la cancérogenèse colorectale (figure 19). 142 O2 Nitrite b Charcuterie AGPI NOCs a Aliment > > f Hème -NO > Hème b Lipides oxydés Hème Calcium α-Tocoph érol Huile AGPI Hème Hème c g d > Hème -NO Estomac/ intestin NOCs b Lipides oxydés INITIATION k ? > e Pas d’association PROMOTION Côlon Mutation MDF Figure 19 : les principaux agents favorisant le cancer colorectal par la consommation de charcuteries Légende : Donne > Favorise Action hypothétique Inhibe Relation établie par le laboratoire Références : a : Haorah et al., 2001 (213) b : Etude 1 c : Bingham et al., 1996 ; 2002 ; Cross et al., 2003 ; 2003 ; Lunn et al., 2007 (99, 106, 173) d : Kuhnle et al., 2007 ; Hogg, 2007; Joosen et al., 2009 (84, 103, 214) e : Sasffhill et al., 1985, Mirvish et al., 2002, Lewin et al., 2006 (87, 199, 215) f : Sawa et al, 2008 ; Tappel, 2006 (114, 216) g : Pierre et al., 2003 ; 2004 ; 2008 (96-98) k : Etude 1, 2, 3 Les agents susceptibles d’avoir un effet sur le cancer colorectal sont l’hème (ou l’hème nitrosylé formé), les nitrites, les AGPIs et l’état d’oxydation de la viande. Les charcuteries avec nitrites telles que la saucisse de Francfort contiennent des composés nitrosés (213). Les vitamines C et E inhibent les réactions de nitrosations en phase aqueuse et lipidique respectivement (82, 206). Ainsi, pour la fabrication des viandes 143 saumurées modèles, nous n’avons pas intégré ces anti-oxydants afin de favoriser la formation de composés nitrosés dans l’aliment. Par ailleurs, une faible quantité d’acide nitreux peut se transformer en oxyde d’azote qui réagit avec l’hème pour former de l’hème nitrosylé. Le schéma est représentatif des charcuteries cuites, largement plus nombreuses que les charcuteries crues, dans lesquelles l’hème est sous forme libre. Dans les charcuteries crues, l’hème est lié à la myoglobine, et sa nitrosylation forme la myoglobine nitrosylée. Le pH bas de l’estomac induit la formation de nitrosamines et/ou nitrosamides, mais pourraient également favoriser la formation de composés S-nitrosothiols (85, 103). Puis, les nitrosamines issues de la formation au niveau de l’estomac peuvent se retrouver au niveau du côlon. En revanche, du fait du pH du côlon ainsi que de la faible quantité de nitrites, il n’y a pas de réactions de nitrosation (84). Les composés thio-nitrosés provenant de l’estomac deviennent instables et se dissocient en oxyde de nitrite NO et en disulfides. L’hème qui se retrouve dans l’intestin réagit avec le NO afin de former l’hème nitrosylé (85, 214). Dans le cadre de notre étude, nous avons observé chez le rat que la consommation de la charcuterie modèle DCNO favorisait la formation de NOCs fécaux (mesurés en ATNC, étude 1). Il semblerait que le principal composé mesuré dans les fécès d’Homme ayant consommé de la viande rouge ou des charcuteries soit de l’hème nitrosylé (84) Par ailleurs, les ATNC présents au niveau colique sont des agents mutagènes et alkylants qui réagissent avec l’ADN (199, 215). Des adduits à ADN spécifiques aux NOCs (O6-guanine-ADN (O6-CMdG)) sont retrouvés dans la muqueuse de volontaires humains consommant de la viande rouge (87). Ainsi, la présence d’ATNC peut expliquer la relation entre la consommation de charcuteries et le cancer colorectal. Nos travaux ont ainsi permis de démontrer que la présence d’ATNC était associée à la promotion de la cancérogenèse colorectale chez le rat chimio-induit (étude 1). En ce qui concerne l’hème nitrosylé, peu de données sont établies concernant sa toxicité. Stevanovic et al. ont montré une faible génotoxicité (test d’Ames) des pigments de charcuteries cuites synthétisés (217). Même si nous supposons que l’hème nitrosylé présent dans les charcuteries est l’un des composés principaux expliquant l’effet promoteur du cancer colorectal, sa toxicité et son effet cancérigène restent à démontrer. L’hème libre présent dans le côlon pourrait aussi être toxique, et il serait d’après Sesink et Van der Meer à l’origine d’un composé cytotoxique non identifié responsable de la cancérogenèse colorectale (92, 93). Par ailleurs, l’hème catalyse la peroxydation des lipides (AGPIs issus de la charcuterie et du régime) au niveau de la charcuterie et au niveau de l’intestin (110, 114). Les produits d’oxydation se retrouvent enfin dans le côlon et peuvent y exercer une activité cytotoxique et 144 génotoxique (étude 4). Néanmoins, les études 1 et 2 (effet des charcuteries modèles ou du commerce sur la cancérogenèse colorectale) s’opposent à notre hypothèse initiale. En effet, ces études montrent que la promotion de la cancérogenèse colorectale par des viandes saumurées n’est pas corrélée à une augmentation de l’oxydation lipidique des eaux fécales. L’étude 1 montre que la charcuterie modèle sans nitrite DCZO n’est pas promotrice de la cancérogenèse colorectale, alors qu’elle induit les biomarqueurs de lipoperoxydation fécaux et urinaires. En revanche, la charcuterie modèle avec nitrites DCNO est promotrice de la cancérogenèse colorectale, sans que cette promotion soit corrélée à l’augmentation de ces mêmes biomarqueurs fécaux et urinaires. Toutefois, des supplémentations en calcium inhibent l’augmentation des biomarqueurs fécaux et urinaires par les charcuteries (étude 3), dont la peroxydation lipidique. La peroxydation lipidique ne semble pas être le seul facteur expliquant la promotion de la cancérogenèse colorectale par les charcuteries. L’effet protecteur de l’α-tocophérol dans l’étude 3 (effet de supplémentations sur la cancérogenèse colorectale) pourrait être dû en effet à la fois à son effet antioxydant ou son effet antinitrosylant. Enfin, l’état d’oxydation de la viande peut avoir un effet sur la cancérogenèse colorectale (étude 1). En effet, la comparaison entre la viande saumurée modèle DCNO (laissée 5 jours à l’air à 4°C après cuisson) et la même viande saumurée modèle directement emballée sous vide après fabrication (DCNA) montre que l’état d’oxydation a un effet sur la promotion des lésions précancéreuses : la charcuterie modèle oxydée DCNO induit plus de lésions pré-cancéreuses que la charcuterie directement emballée sous vide DCNA (étude 1). Ce résultat n’est cependant pas lié à la peroxydation des eaux fécales puisqu’il n’y a pas de différence d’oxydation entre les eaux fécales de rats ayant consommé DCNO ou DCNA. En revanche, il y a une plus forte quantité d’ATNC dans les fécès de rats ayant consommé la charcuterie modèle DCNO que ceux ayant consommé la charcuterie modèle DCNA. L’hypothèse initiale selon laquelle l’oxydation des lipides serait responsable de la promotion de la cancérogenèse colorectale par les charcuteries est à pondérer car les composés nitrosés (mesurés en ATNC) sembleraient être les agents principaux impliqués dans cette promotion. Pour comparer l’effet promoteur des charcuteries à celui des viandes rouges, nous avons réalisé un schéma récapitulant les principaux agents favorisant le cancer colorectal par la consommation de viandes rouges, établi notamment à partir des travaux effectués par le laboratoire (96-98) (figure 20). 145 VIANDE ROUGE Hème Calcium Aliment AGPI (Myoglobine) a b > Huile Lipides oxydés Nitrite salive c Hème e AGPI f > Lipides oxydés d > h Estomac/ intestin NOCs Hème-NO HNE MDA g HHE m k HNE + i HHE Colon 0 Sélection Mutation INITIATION HHE HNE MDF PROMOTION Figure 20 : les principaux agents favorisant le cancer colorectal par la consommation de viandes rouges Légende : Donne > Favorise Action hypothétique Inhibe Relation établie par le laboratoire Références : a : Sawa et al, 2008 ; Tappel, 2006 (114, 216) b : Sesink et al., 2001 ; Pierre et al., 2004 ; 2008 (94, 96-98) c : Mirvish et al., 2000 (218) d : Kuhnle et al., 2007 ; Hogg, 2007; Joosen et al., 2009 (84, 103, 214) e: Bingham et al., 1996 ; 2002 ; Cross et al., 2003 ; 2003 ; Lunn et al., 2007 (99, 106, 173) f : Sesink et al., 2000 ; 2001 ; Pierre et al., 2003 ; 2004 ; 2008 (93, 96) g : Sasffhill et al., 1985, Mirvish et al., 2002, Lewin et al., 2006 (87, 199, 215) h : Pierre et al., 2007 (128) i : Etude 4, Gölzer et al., 1996, Knoll et al., 2005 (219, 220) k : Etude 4, Pierre et al., 2007 (128) m : Pierre et al., 2003 ; 2004 ; 2008 (96-98) La viande rouge est riche en hème. Comme pour les charcuteries, l’hème catalyse l’oxydation des lipides tels que les AGPIs (présents dans les viandes ou dans le régime) aussi bien au niveau de l’aliment que dans le tube digestif (221). De nombreux produits d’oxydation sont alors formés, tels que le HNE, le HHE et le MDA. Le HNE, issu de la lipoperoxydation des AGPIs n-6, est retrouvé dans les fécès de rats ayant consommé un 146 régime riche en viande rouge (128). Le HNE est un composé génotoxique (étude 4) (220). Il peut donc agir au niveau de l’initiation. C’est aussi un composé cytotoxique (étude 4) (128). Il sélectionne donc les cellules précancéreuses. Comme le HNE, le HHE est un composé cytotoxique et pro-apototique (étude 4). Du fait de sa génotoxicité, le HHE pourrait lui aussi agir au niveau de l’initiation. Par ailleurs, du fait de sa cytotoxicité différentielle entre les Apc +/+ et les Apc Min/+, le HHE pourrait aussi agir sur l’étape de sélection (étude 4). En revanche, le MDA ne semble pas avoir un rôle sur ces étapes, puisqu’il ne montre aucun effet cytotoxique, génotoxique et pro-apoptotique in vitro (étude 4). Enfin, les études précédentes du laboratoire sur la relation entre la consommation de viande rouge et le cancer colorectal montrent que la peroxydation des lipides joue aussi un rôle sur la promotion la cancérogenèse colorectale (96-98). L’hème présent dans la viande rouge peut aussi favoriser la formation de composés nitrosés. Néanmoins, contrairement à la charcuterie, la formation de ces composés induite par l’hème de la viande rouge est endogène : du fait de l’absence de nitrites dans la viande rouge, il n’y a pas de formation exogène. Enfin, les nitrites présents dans la salive peuvent, au niveau gastrique, réagir avec des amines (ou amides) afin de former des NOCs endogènes. Les nitrites de la salive sont formés par la réduction des nitrates en nitrites. On estime donc qu’environ 5 % des nitrates ingérés sont réduits en nitrites par l’activité microbienne de la salive chez l’Homme (222, 223). Cette réduction se fait par l’intermédiaire d’une enzyme : la nitrate réductase. Chez le rat, la réduction des nitrates en nitrite est presque inexistante, du fait de la faible sécrétion de nitrate salivaire d’une part, et de la plus faible expression de la nitrate réductase d’autre part (224). De ce fait, chez les rats, il n’y a pas de formation de composés nitrosés endogènes au niveau gastrique. Ceci pourrait expliquer l’absence d’ATNC dans les fécès de rats ayant consommé de la viande de bœuf (197). En revanche, chez l’Homme, la consommation de viande rouge augmente la quantité d’ATNC dans les fécès, du fait de la présence de nitrates et de nitrites salivaires et de l’hème de la viande rouge (99, 106, 173). Une étude épidémiologique souligne l’importance des nitrites salivaires dans la cancérogenèse colorectale (225). Toutes ces données montrent les limites de notre modèle animal : contrairement à l’Homme, les rats ne sécrètent pas de nitrate salivaire, et ce modèle ne permet pas la formation de NOCs endogènes (particulièrement au niveau gastrique). Dans un rapport publié par l’AFSSA (agence française de sécurité sanitaire des aliments), l’utilisation du rat comme modèle pour l’étude de la toxicologie des nitrates et des nitrites n’est pas pertinente pour l’évaluation du risque chez l’Homme (226). Pour l’étude de la relation entre la 147 consommation de viande rouge et le cancer colorectal, il faudrait rajouter une quantité de nitrates dans l’eau de boisson (par exemple) comparable à celle que l’on retrouve au niveau de la salive chez l’Homme. Les conclusions des études réalisées sur la relation entre la consommation de viande rouge et le cancer colorectal chez le rat sont donc à temporiser. Seule l’oxydation lipidique des eaux fécales était quantifiable. Les études précédentes seraient peut être à compléter en ajoutant une quantité de nitrites dans l’eau de boisson afin de voir si les ATNC mesurés dans les fécès pourraient aussi avoir un effet lors de la promotion induite par la consommation de viande rouge, et pour avoir un contexte en nitrite similaire à celui de l’Homme. Pour l’étude de la relation entre la consommation de charcuterie et le cancer colorectal, la quantité de nitrites apportée par les charcuteries semble être suffisante pour que l’on retrouve des ATNC dans les fécès (197) (étude 1). Les schémas montrent qu’il y a des constituants communs susceptibles d’agir sur le cancer colorectal pour la charcuterie et la viande rouge. Ces composés communs sont l’hème, les ATNC et l’oxydation des AGPIs. Pour la charcuterie, les ATNC exogènes ainsi que l’état d’oxydation de la viande peuvent aussi agir sur le cancer colorectal. En conclusion, nos résultats montrent que les ATNC pourraient être les composés principaux impliqués dans le cancer colorectal induit par la consommation de charcuteries. En revanche, les travaux précédents du laboratoire avaient montré que les produits d’oxydation seraient les composés principaux expliquant la relation entre la consommation de viande rouge et le cancer colorectal. Toutefois, le fait que l’on retrouve beaucoup d’ATNC chez les Hommes ayant consommé de la viande de rouge, et la différence de nitrates salivaires entre Hommes et rats incite à pondérer cette conclusion. Pour cet aliment, l’hypothèse que les NOCs (mesurés en ATNC) sont les agents responsables de la promotion la cancérogenèse colorectale serait à tester dans le même modèle animal, mais avec des nitrates dans l’eau de boisson pour mimer le cycle entéro-salivaire des nitrates chez l’Homme. 4- Pertinence de l’utilisation des biomarqueurs utilisés lors des études in vivo L’hème, sous forme de molécule purifiée ou présent dans la viande rouge, est promoteur de lésions pré-néoplasiques (96-98). La peroxydation lipidique et la cytotoxicité des eaux fécales sont des marqueurs corrélés à la promotion de la cancérogenèse colorectale par l’hème, ainsi que le marqueur urinaire reflétant l’oxydation des AGPIs n-6 (le DHN-MA 148 urinaire). Par ailleurs, le DHN-MA est un marqueur qui est aussi modulé chez l’Homme, suite à la consommation de viande rouge ou de boudin noir (190). L’intérêt de ces biomarqueurs réside dans le fait qu’ils sont modulés très tôt (dès un jour après la consommation de régimes riches en hème pour le DHN-MA, qu’ils sont prédictifs de l’effet promoteur de l’hème sur le cancer colorectal et qu’ils sont non-invasifs (190). Pour l’étude de la relation entre la consommation de charcuteries et le cancer colorectal, nous avons suggéré d’utiliser ces mêmes biomarqueurs fécaux et urinaires. Ceci suppose que l’hème nitrosylé des charcuteries pourrait moduler ces biomarqueurs, comme l’hème sous forme purifiée ou présent dans les viandes rouges. Néanmoins, les charcuteries testées qui modulent le plus ces biomarqueurs ne sont pas les plus promotrices des lésions précancéreuses (étude 1 et 2). Même si ces biomarqueurs sont modulés par la consommation de charcuteries, et que le calcium qui est protecteur les normalise ; ils ne sont pas les mieux adaptés pour l’étude de la relation entre la consommation de charcuteries et le cancer colorectal. La mesure des ATNC dans les fécès a été envisagée au cours de la thèse. Ce marqueur semble être plus prédictif de la promotion des lésions précoces de la muqueuse, particulièrement les FDM (étude 1). Les ATNC fécaux pourraient donc être un marqueur prédictif de la promotion de la cancérogenèse colorectale par les charcuteries, mais aussi par la viande rouge (présence de nitrates dans la salive pour l’Homme). Par ailleurs, ce sont des composés mutagènes (102). Il faudrait donc associer à la mesure des ATNC fécaux des tests de mutagénicité, tels que le tests d’Ames ou le test de mutagenicité sur des fibroblastes BigBlue (199). Enfin, puisque la consommation de viande rouge augmente le nombre d’adduits spécifiques aux NOCs, (6)-carboxymethyl guanine chez l’Homme, il pourrait être judicieux de doser ces adduits à ADN afin de tester si leur augmentation par une consommation de charcuterie est corrélée à la quantité d’ATNC dans les fécès ainsi qu’au nombre de FDM chez le rat (87). 5- Les moyens de prévention L’un des objectifs de ce travail de thèse était d’élaborer une stratégie pour contrer l’effet promoteur des charcuteries. Le schéma 1 ci-dessous indique qu’il est possible d’intervenir à plusieurs niveaux : 149 Au niveau des NOCs (ou ATNC) : - en diminuant la quantité de nitrites dans les charcuteries (étude 1). Leur présence dans la charcuterie permet de limiter la multiplication bactérienne (en particulier la sporulation et la toxinogenèse de Clostridium botulinum). Les nitrites ont aussi un rôle organoleptique puisqu’ils donnent une couleur rose/rouge et le goût très apprécié des charcuteries. De ce fait, les nitrites semblent être des agents indispensables dans les charcuteries. Néanmoins, il est possible de les remplacer, au moins en partie, par d’autres agents (171). Par exemple, il existe des additifs alimentaires donnant une couleur acceptable pour le consommateur et autorisés par l’union européenne, tels que la porphyrine liée au zinc. Cette dernière a déjà été utilisé dans le jambon de Parme en l’absence de nitrites (227). D’autres moyens cités par Demeyer existent, tels qu’une diminution de l’activité de l’eau ou une réfrigération continue pour limiter le développement bactérien (171). - par l’ajout de composés inhibant la formation des NOCs. L’acide ascorbique (vitamine C) s’est révélé efficace pour réduire la formation de NOCs en phase aqueuse (82). L’acide ascorbique réagit avec les nitrites pour former du NO et de l’acide déhydroascorbique (82, 228). Ceci limite ainsi la formation de nitrosamines et de nitrosamides, mais pas la nitrosylation du fer héminique. Néanmoins, d’autres auteurs ont montré que des supplémentations en acide ascorbique dans un régime à base de viande rouge ou de charcuterie ne diminue pas la quantité de NOCs dans les fécès, probablement des nitrosothiols et du nitrosyl-hème mais pas des composés N-nitrosés.(173). De plus, en présence de fer, l’acide ascorbique a des propriétés pro-oxydante (229). Le tocophérol (vitamine E) inhibe la formation de NOCs en phase lipidique (schéma 1) (82, 206, 230). Les vitamines C et E agissent donc comme des agents « anti-nitrosants ». L’étude 4 montre que le tocophérol diminue la promotion des FDM par rapport à la charcuterie modèle DCNO, et ceci pourrait être lié à son effet anti-nitrosant. Il serait en outre intéressant de tester des supplémentations en vitamines E+C puisque ces vitamines agissent en phase lipidique et aqueuse respectivement. Enfin, la consommation de soja permet la diminution de NOCs endogènes (mesurés par les ATNC) dans les fécès (231). Les fibres, sous forme de légumes, 150 son ou amidon résistant, ne diminuent pas la quantité d’ATNC dans les fécès (119). Néanmoins, elles modulent le transit intestinal et augmentent la masse fécale, ce qui réduit le contact des ATNC avec la muqueuse colique (232). Enfin, l’omeprazole, une molécule qui bloque les canaux (pompes à protons) par lesquels l'acide passe des glandes sécrétrices à la poche de l'estomac, diminue la formation de NOCs de 65% (233). Des supplémentations en soja, en fibres ou en omeprazole dans un régime à base de charcuterie pourraient être testées afin de vérifier leur effet protecteur sur le cancer colorectal. Au niveau de l’hème : - le phosphate de calcium précipite l’hème (sous forme d’hémine), ce qui inhibe son effet cytotoxique (94). De plus, il normalise la peroxydation lipidique des eaux fécales induite par la consommation d’hème. La consommation d’hème (sous forme de molécule purifiée ou présent dans la viande rouge) associée à une consommation de calcium inhibe la formation de lésions précancéreuses et normalise le peroxydation lipidique et la cytotoxicité des eaux fécales par rapport à une consommation d’hème sans supplémentations en calcium (96, 98). L’étude 3 de ma thèse est la première étude qui montre que le calcium peut contrer l’effet promoteur d’une viande saumurée. Cette protection est associée à une diminution de tous les biomarqueurs corrélés à la promotion de la cancérogenèse colorectale par l’hème (peroxydation lipidique et cytotoxicité des eaux fécales). Néanmoins, les résultats précédents montrent que ces biomarqueurs ne sont pas toujours corrélés à la promotion FCA et des FDM, et que les NOCs fécaux (mesurés en ATNC) sont associés à la promotion des lésions précancéreuses (étude 1). Il serait donc important de doser les ATNC dans les groupes avec les supplémentations en calcium pour vérifier leur normalisation. Il n’est pas possible de rajouter du calcium directement dans les charcuteries, car le calcium intervient lors de la contraction des fibres musculaires. L’ajout de calcium dans la charcuterie aurait donc des conséquences organoleptiques puisqu’il rendrait la charcuterie très sèche. Seule l’association de consommation de calcium (sous forme de suppléments ou présent dans des produits laitiers) pourrait donc diminuer l’effet promoteur des charcuteries. - l’ajout d’anti-oxydants peut aussi avoir un effet indirect sur l’hème. Selon nos hypothèses mécanistiques, l’hème induit une peroxydation des eaux fécales, 151 considérée comme un biomarqueur prédictif de la promotion de la cancérogenèse colorectale par l’hème (96, 98). Une supplémentation en anti-oxydant dans un régime viande rouge diminue la promotion des lésions pré-cancéreuses (96). L’étude 3 de ma thèse montre que l’α-tocophérol inhibe l’effet promoteur des FDM de la charcuterie modèle DCNO. Néanmoins, cet effet inhibiteur de la promotion de la cancérogenèse colorectale n’est accompagné que d’une diminution du DHN-MA urinaire (qui reflète le HNE formé pendant la digestion et aussi de façon endogène), contrairement au calcium qui diminue tous les biomarqueurs. L’α-tocophérol pourrait donc être protecteur en limitant la toxicité du HNE sur la muqueuse colique, mais aussi en inhibant la nitrosation endogène, et donc la formation de NOCs. Ces agents peuvent être ajoutés directement lors du procédé de fabrication (exemple de l’αtocophérol) ou dans le régime alimentaire (exemple du calcium, contenu dans des produits laitiers). Ceci élargit les moyens de prévention pour réduire l’effet promoteur du cancer colorectal par les charcuteries. En revanche, pour la viande rouge, dans laquelle on ne peut pas inclure d’additif, ces composés doivent être ajoutés dans le régime alimentaire. Au niveau de l’état d’oxydation de la charcuterie (étude 1). La consommation de la charcuterie modèle DCNO, laissée 5 jours à 4°C hors emballage, induit plus de FDM par côlon que la charcuterie modèle DCNA, directement emballée sous vide après fabrication. De nombreuses charcuteries sont déjà emballées sous vide après leur fabrication, mais certaines d’entre elles restent encore vendues à l’étalage. L’intérêt de l’emballage des charcuteries sous vide semble être une étape de fabrication importante pour la qualité de la viande. Par rapport à des viandes emballées sous atmosphère modifiée, les viandes emballées sous vide ont un statut oxydatif et une couleur plus stables (234). Au-delà des études expérimentales réalisées durant ma thèse, d’autres moyens de prévention sont envisageables. En effet, les études épidémiologiques suggèrent que la consommation de 20/25 g de charcuterie par jour ou de 100/120 g de viande rouge par jour augmente le cancer colorectal (89-91). Il serait tout à fait envisageable de réduire la consommation de ces aliments. Par exemple, la consommation d’environ une fois par jour de viande rouge augmente le risque relatif de 50% de façon significative (235). En revanche, la consommation de viande rouge 152 deux fois par semaine tend à augmente le cancer colorectal de 20 à 30%. Le WCRF recommande de limiter notre consommation de viande rouge et suggère de ne pas consommer plus de 500g de viande rouge par semaine (2). A long terme, le WCRF suggère de ne consommer qu’environ 300g de viande rouge par semaine. Associée à la consommation d’autres aliments, cette quantité serait suffisante pour couvrir des besoins en vitamines B12 par exemple. En effet, les besoins en cette vitamine sont de 14 à 42 µg par semaine. Or, la viande apporte 20 à 50 µg pour 100g. De ce fait, la consommation de viande rouge deux fois par semaine est suffisante pour couvrir les besoins en vitamine B12. Pour le fer, les besoins sont différents selon les populations : par exemple, les adolescentes, les femmes et surtout les femmes enceintes ont besoin de 9 à 25 mg de fer par jour. Or, la viande rouge apporte 2 à 4 mg/100 g de fer. Si l’on consomme moins de viande rouge, il sera nécessaire de consommer d’autres aliments riches en ce minéral, tels que du poisson, des lentilles… Il en est de même pour la consommation de charcuterie : une consommation quotidienne de charcuteries augmente le cancer colorectal de 40 à 60% (235). En revanche, une consommation de charcuteries une ou deux fois par semaine augmente le cancer colorectal de 10%. Alors que le WCRF propose d’éviter toute consommation de charcuteries, il serait tout à fait envisageable de diminuer notre consommation de charcuterie, en l’associant à un régime plus équilibré en fruits et légumes. Il me semble que la recommandation du WCRF est légèrement excessive puisqu’il existe des alternatives par des supplémentations alimentaires ou des modifications du procédé de fabrication. Enfin, comme nous l’avons montré dans l’introduction, d’autres facteurs sont impliqués dans le cancer colorectal: l’obésité, la consommation d’aliments trop riches, le manque d’activité physique…(2) . La consommation de viande rouge et de charcuterie est une des causes principales du cancer colorectal, mais pas la seule (figure 3). Il faut considérer le cancer colorectal dans sa globalité. Suivre les recommandations du WCRF dans leur ensemble permettrait de diminuer l’incidence des cancers, y compris le cancer colorectal. 153 Perspectives Les études précédentes ont été conduites chez le rat, avec l’hypothèse que l’hème nitrosylé des charcuteries serait l’agent responsable de la promotion de la cancérogenèse colorectale. Suite à ces travaux, plusieurs perspectives peuvent être envisagées : 1- Effet promoteur de viandes saumurées sur les tumeurs colorectales et stratégie préventive chez le rat Les études réalisées durant ma thèse ont été des études de moyen terme (100 j) ayant comme marqueurs de cancérogenèse colorectale les lésions précancéreuses. Il faut donc envisager de réaliser une étude expérimentale de long terme (environ 200 j) sur rat initié à la DMH ou sur des souris Min. La durée plus longue de cette étude permettrait alors de tester l’effet de la consommation des charcuteries sur l’incidence tumorale, et non plus sur l’incidence des lésions précancéreuses. Nous pourrions ainsi tester l’effet de la consommation de la viande saumurée DCNO (épaule cuite contenant des nitrites et de l’hème), de DCNO avec de l’α-tocophérol ou associé à la consommation de carbonate de calcium sur la promotion de tumeurs colorectales. De même, dans cette étude, nous testerions l’effet de la consommation de la saucisse de Strasbourg supplémentée ou non en calcium sur la promotion des tumeurs. Ceci viendrait compléter les données obtenues sur les marqueurs de cancérogenèse colorectale (étude 4). Par ailleurs, il serait intéressant de tester l’effet de tous ces aliments sur un autre modèle adapté à l’étude de la cancérogenèse colorectale, comme par exemple sur le modèle murin mutant Min. Enfin, lors des interventions nutritionnelles de 14 j, nous avons analysé la peroxydation lipidique et la cytotoxicité des eaux fécales afin de choisir les charcuteries qui modulent le plus ces deux biomarqueurs et de les tester dans une étude de moyen terme (étude 1, 2, 3). Nous avons alors montré que ces deux marqueurs ne sont pas bien corrélés à la promotion des lésions précancéreuses, alors que les ATNC fécaux sont associés à cette promotion (étude 1). Il serait donc pertinent de doser les ATNC fécaux lors des interventions nutritionnelles de 14 j. Il faudrait alors tester les charcuteries qui modulent le plus ce marqueur fécal dans ces études de court terme et de sélectionner celles qui modulent le plus ce paramètre. Il faudrait alors évaluer l’effet promoteur de ces charcuteries sélectionnées dans une étude de moyen terme, puis dans une étude de cancérogenèse colorectale. 154 2- Effet du taux de nitrosylation du fer héminique sur la promotion de la cancérogenèse colorectale Nous avons montré que les charcuteries contenant de l’hème et des nitrites sont promotrices de lésions pré-néoplasiques (étude n°1 : effet de la consommation de charcuteries modèles sur la promotion de la cancérogenèse colorectale, et étude n°2 : effet de charcuteries du commerce sur la promotion de la cancérogenèse colorectale). Néanmoins, nous ne pouvons pas affirmer que l’hème nitrosylé est l’agent responsable de cet effet promoteur. Pour étudier la relation entre l’hème nitrosylé et le cancer colorectal, il faudrait utiliser l’hème nitrosylé sous forme de molécule purifiée. Mais l’hème nitrosylé purifié est instable, donc il n’est pas possible de travailler directement avec cette molécule. Pour pallier ce problème, nous avons envisagé de travailler avec des charcuteries modèles ayant un gradient en hème nitrosylé. On a mis en place une étude avec des viandes qui apportent à la fois un gradient d’hème et un gradient de nitrosylation. Cette étude devrait nous permettre de préciser si l’hème est effectivement le principal agent responsable de la promotion de la cancérogenèse colorectale et de juger de l’importance de la nitrosylation dans la promotion de la cancérogenèse colorectale. Une étude de moyen terme (100 j) a été réalisée sur des rats chimio-induits à la diméthylhydrazine. Pour l’étude du premier point, une charcuterie modèle cuite nitritée à base de longe (pauvre en hème) et une charcuterie modèle cuite à base d’épaule (riche en hème) ont été fabriquées. L’effet de leur consommation sur la promotion des lésions précancéreuses nous permettra de conclure sur l’importance de l’hème présent dans les charcuteries. Par ailleurs, pour l’étude du deuxième point, des charcuteries modèles au rendement de nitrosylation variable ont été fabriquées. Le gradient de nitrosylation a été obtenu en comparant une charcuterie modèle cuite à base d’épaule sans nitrites, une charcuterie modèle crue à base d’épaule (diminution du taux de nitrosylation), une charcuterie modèle cuite à base d’épaule (nitrosylation classique) et une charcuterie modèle cuite à base d’épaule avec une nitrosylation optimisée. La comparaison de l’effet de leur consommation sur la promotion des lésions précancéreuses permettra de tester l’impact de la nitrosylation sur le cancer colorectal. Enfin, il faudrait aussi que nous re-fassions les études de court terme des études 1 et 2 précédentes afin de doser les ATNC fécaux des rats ayant consommé des charcuteries modèles et du commerce. Suite à ce dosage, nous sélectionnerons les charcuteries qui modulent le plus ce paramètre afin de les tester dans une étude de cancérogenèse colorectale. 155 3- Identification des ATNC promoteurs de la cancérogenèse colorectale et identification de biomarqueurs corrélés à la promotion par les ATNC Nos travaux montrent que les ATNC sont susceptibles d’être impliqués dans la relation entre la consommation de charcuterie et le cancer colorectal. La caractérisation des ATNC dans les fécès de rats ayant consommé de la charcuterie permettrait de voir lesquels sont susceptibles d’être impliqués dans le cancer colorectal : il semble que l’hème nitrosylé et les composés thio-nitrosés sont les principaux ATNC formés dans le tube digestif (84, 103). Ainsi, on pourrait envisager de tester ces composés sous forme de molécule purifiée (si les molécules trouvées sont assez stables pour être données aux rats) afin de vérifier leur implication dans le cancer colorectal. Comme les NOCs sont des agents mutagènes, nous pourrions envisager de faire une étude sur l’initiation et une étude sur la promotion de la cancérogenèse colorectale. Par ailleurs, il faudrait trouver des marqueurs corrélés à la toxicité de ATNC. Lewin et al. ont montré que, chez l’Homme, la consommation viande rouge augmente les NOCs dans les fécès et que le pourcentage d’adduits à ADN spécifiques aux NOCs ((6)-carboxymethyl guanine) est aussi augmenté dans les cellules coliques exfoliées (87). Nous pourrions donc envisager de mettre au point le dosage des adduits à ADN spécifiques aux NOCs chez le rat. Il faudrait ensuite vérifier la validité de ce dosage sur les muqueuses coliques mais aussi les cellules coliques exfoliées de rats ayant consommé un régime augmentant les ATNC dans les fécès. Ceci permettrait d’utiliser cette mesure, non-invasive avec les cellules exfoliées, comme marqueur de la présence d’ATNC dans les fécès. Des tests de génotoxicité des eaux fécales de rats ayant mangé un régime augmentant les ATNC fécaux pourraient aussi être mis en place, notamment avec la mesure de la phosphorylation de l’histone H2Ax. Enfin, l’un des objectifs de ma thèse était de trouver des agents de prévention inhibant l’effet promoteur de la charcuterie. Le calcium et l’α-tocophérol inhibent l’effet promoteur de charcuteries. D’autres composés pourraient être testés, tels que le soja, qui diminue les ATNC dans les fécès de volontaires ayant consommé de la viande rouge (231). De même, les composés sulfurés inhibent la formation d’ATNC (236). Nous pourrions donc envisager d’étudier la relation entre la consommation de charcuteries avec du soja, de l’oignon ou ail (les deux derniers aliments sont riches en composés sulfurés) et le cancer colorectal. Il est important aussi de doser les ATNC dans les interventions nutritionnelles de 14 j, notamment celle sur les supplémentations afin de tester si certaines d’entre elles peuvent diminuer la quantité de ATNC fécaux. 156 A plus long terme, si l’on modifie le procédé de fabrication des charcuteries par l’ajout d’un élément protecteur (exemple de l’α-tocophérol qui est un anti-oxydant et un inhibiteur de la formation de NOCs), il faudrait ensuite vérifier si un panel de consommateurs est prêt à consommer ces charcuteries modifiées, estimer les conséquences organoleptiques et économiques pour savoir si elles sont commercialisables. 4- Etude de la consommation de charcuteries et de polyphénols Les polyphénols sont des composés qui pourraient inhiber l’effet promoteur des viandes rouges et des charcuteries. Les polyphénols présents dans les vins rouges inhibent en effet l’oxydation lipidique induite par la viande rouge (237, 238). Or, d’après le schéma 2, il semble que la peroxydation lipidique induite par la consommation de viande rouge est un facteur déterminant dans le cancer colorectal. La catéchine (présente notamment dans le thé) inhibe aussi la peroxydation lipidique induite par la myoglobine de la viande rouge à pH bas (239). Par ailleurs, les polyphénols inhibent la formation d’amines hétérocycliques, qui sont des composés potentiellement impliqués dans la cancérogenèse colorectale (240). Les polyphénols sont des composés que l’on retrouve dans le thé, le vin et les fruits. Une étude pourrait donc être établie afin de tester si les polyphénols contrent l’effet promoteur des charcuteries. 5- Intervenion nutritionnelle chez l’Homme et étude épidémiologique Toutes nos études sur la relation entre la consommation de charcuteries (avec ou sans agents de prévention) et le cancer colorectal ont été réalisées chez le rat. Afin d’établir des recommandations pour l’Homme, il est nécessaire de tester l’effet de ces aliments supplémentés ou non chez des volontaires humains. Il est donc envisagé de tester chez l’Homme de l’épaule cuite (comparable à la charcuterie modèle DCNO) soit avec de l’αtocophérol directement intégré dans la charcuterie, soit avec du carbonate de calcium (apporté en suppléments alimentaire). Cette étude est en cours d’élaboration et elle met en collaboration notre laboratoire (prise en charge des mesures des biomarqueurs dans les fécès et urines), l’IFIP (fabrication des charcuteries) et le Centre de Recherche en Nutrition Humaine (CRNH) à Clermont-Ferrand (prise en charge de l’expérimentation humaine). L’étude sera conduite sur des volontaires sains, qui alterneront des périodes de consommation de charcuterie type épaule cuite (160g/j), puis des périodes de consommation de cette même 157 charcuterie avec une supplémentations en carbonate de calcium (sous forme de comprimée, apport de 1 à 1.5g/repas) et une période de consommation de la charcuterie enrichie en αtocophérol (80mg/j). Durant chaque période, fécès et urines seront prélevés. Nous testerons alors l’effet de ces régimes sur les marqueurs urinaires et fécaux corrélés à la promotion de la cancérogenèse colorectale par l’hème (DHN-MA urinaire, TBARS et cytotoxicité des eaux fécales) et sur les ATNC fécaux. L’étude a été soumise au Comité de Protection des Personnes dont dépend le CRNH de Clermont, et a été récemment acceptée. Si l’on constate que le carbonate de calcium ou l’α-tocophérol diminue effectivement les biomarqueurs étudiés ainsi que les composés nitrosés dans les fécès, nous pourrions effectuer une étude épidémiologique afin d’étudier les facteurs charcuteries/calcium et α-tocophérol au sein d’une population. L’idéal serait de réaliser une étude de cohorte. Les facteurs étudiés seraient : la quantité de charcuteries et de viandes rouges consommée ; les aliments riches en vitamine E (les huiles notamment particulièrement riches en vitamines E) et leur mode de consommation ; les aliments riches en calcium (tous les produits laitiers, particulièrement le lait et les yaourts). Si les trois méta-analyses sur lesquelles nous nous appuyons ont recueilli ces données, nous pourrions alors utiliser leur résultat afin de vérifier l’effet protecteur du calcium et de la vitamine E sur le risque de cancer colorectal chez les consommateurs de charcuteries (59-61). Autrement, nous pourrions tenter de réaliser notre propre étude épidémiologique. Des groupes de consommateurs seraient alors établis selon leur régime : ceux qui mangent des charcuteries sans aliment riches en vitamines E ou calcium et ceux qui mangent des charcuteries avec de la vitamine E ou avec du calcium. En plus de ces groupes, des groupes « témoins » seraient aussi constitués afin de tester l’effet de chaque composé/aliment (charcuterie/vitamine E/calcium). Après quelques années, nous pourrions évaluer le nombre de polypes apparus chez les personnes de chaque groupe. De ce fait, afin de valider l’effet protecteur de l’α-tocophérol et du carbonate de calcium chez les consommateurs de charcuteries, nous disposerions d’études expérimentales, chez le rat et chez l’Homme, ainsi que d’études épidémiologiques. Ceci permettrait d’avoir des résultats robustes concernant la relation entre la consommation de charcuterie, le carbonate de calcium et l’αtocophérol et le cancer colorectal. Les données recueillies permettraient alors d’établir des recommandations alimentaires pour l’Homme afin de diminuer le cancer colorectal. 158 6- Relation entre la consommation de charcuteries et la cancérogenèse d’autres organes Il serait intéressant de voir si les charcuteries peuvent avoir un effet sur d’autres organes. En effet, le WCRF estime que le lien entre la consommation de charcuterie et les cancers de l’œsophage, du poumon, de l’estomac et de la prostate est suggestif (2). Des études épidémiologiques ont montré que la consommation de viande rouge et de charcuteries augmente le risque de cancer colorectal, de cancer de l’œsophage, du foie, du sein, de la prostate et des poumons (241-243). Ainsi, pourrait-on vérifier expérimentalement ces données épidémiologiques chez le rat et tester aussi si des composés (calcium, α-tocophérol) peuvent contrer l’effet éventuel de ces charcuteries sur le risque de cancer d’autres organes. Pour cela, plusieurs modèles expérimentaux devront être utilisés. L’un des modèles animaux pour l’étude du cancer du sein est le rat induit chimiquement par l’hydrocarbure aromatique polycyclique diméthylbenzanthracène (DMBA) ou par des agents alkylants comme la Néthyl-N-nitrosurée (NMU) (244). Suite à une dose de cancérigène, des adénocarcinomes se développent en une vingtaine de jours chez les jeunes rats. Des métastases existent dans ce modèle, mais seulement dans des tissus environnants. D’autres modèles existent pour l’étude d’autres cancers : modèle du cancer de la prostate (Souris transgenic adenocarcinoma of mouse prostate TRAMP), modèle du cancer du foie avec l’utilisation du rat Long Evans Cinnamon LEC (245), modèle du cancer du poumon (traitement à l’urethane ou 3methylcholanthrene MCA). Par ailleurs, il serait possible de traiter les rats avec différents carcinogènes (DMH, NMU, DEN…) afin de tester l’effet de la consommation de charcuteries sur la promotion de différents cancers (colorectal, sein, foie…) sur un même rat (246, 247). 7- Effet de la consommation d’huile riches en AGPIs n-3 et des AGPIs n-6 sur la cancérogenèse colorectale Pour finir, les produits issus des voies d’oxydation des AGPIs n-3 et des AGPIs n-6, tels que le HHE et le HNE, sont toxiques au niveau de l’épithélium colique. Ces résultats sont des résultats in vitro, et une étude in vivo viendrait compléter et valider ces résultats. Pour cela, nous pourrions favoriser une alimentation riche en AGPIs n-3 (apportés par l’huile de poisson) ou AGPIs n-6 (apportés par l’huile de carthame) chez des rats initiés. Nous pourrions envisager de favoriser l’oxydation lipidique par l’ajout d’hème dans les régimes. Nous 159 comparerions alors l’effet de ces régimes sur la promotion de la cancérogenèse colorectale (avec l’étude des lésions précancéreuses FCA et FDM). De même, nous pourrions mesurer l’apoptose, la génotoxicité et la cytotoxicité des eaux fécales sur les cellules Apc+/+ et Apc Min/+ afin de voir si les effets observés in vivo sont similaires à ceux obtenus in vitro. 8- Test de tumorigénécité avec les aldéhydes issus de la lipoperoxydation des AGPIs n-3 et des AGPIs n-6 et caractérisation du système enzymatique L’équipe d’Andreassen a travaillé sur l’effet de l’amine hétérocyclique PhIP sur les modifications génétiques et sa tumorigénécité induites sur les cellules mutées ou non sur le gène Apc (248). Nous pourrions envisager d’effectuer les mêmes tests avec les aldéhydes testés lors de l’étude 4, c est-à-dire le 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), le 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) et le malondialdéhyde (MDA). Pour cela, les cellules seraient exposées aux aldéhydes, puis nous effectuerions un test de clonogénécité. Ce test permettrait alors de sélectionner des colonies de cellules, afin de faire une injection sub-cutanée à des souris nude. Nous verrions ainsi la capacité de ces colonies à induire des tumeurs alors qu’elles ont été exposées à des aldéhydes issus de la lipoperoxydation lipidique. De même, nous vérifierons si le gène Apc des cellules saines Apc +/+ est muté suite à l’exposition aux aldéhydes HNE, HHE et MDA. Il faudrait alors effectuer une analyse allélique du gène Apc par PCR (Polymerase Chain Reaction). Nous pourrions également vérifier l’intégralité du cytosquelette sur ces cellules par cytométrie de flux. Par ailleurs, après les tests de toxicité effectués lors de l’étape 4 ainsi que les tests cités ci-dessus, nous pourrions ensuite tester des molécules protectrices. De premiers résultats, non présentés dans la thèse, ont montré que la N-Acétyl-L-Cystéine (NAC) à 40 µM réduisait toute la cytotoxicité du HNE sur les cellules saines Apc +/+, de façon plus efficace que le glutathion (GSH) à la même concentration. Mais ces résultats préliminaires restent à appronfondir, non seulement sur les concentrations à tester (réaliser un gradient de concentrations pour trouver la concentration seuil), sur les tests à effectuer (élargi les tests à la génotoxicité et l’apoptose) mais aussi sur les molécules à tester (ce premier test n’a été effectué que sur le HNE d’une part, et qu’avec la NAC et le GSH ; il faudrait faire ces tests avec le HHE aussi, et tester d’autres molécules protectrices afin de trouver les plus efficaces). Enfin, il serait intéressant d’appronfondir le métabolisme des cellules Apc +/+ et Apc Min/+ suite à l’exposition aux aldéhydes observé dans l’étude 4, en essayant de caractériser les enzymes impliquées dans ce différentiel de métabolisme (étude 4). Ceci permettrait de comprendre en quoi les voies de métabolisme des deux lignées cellulaires diffèrent. 160 Conclusion générale Les études épidemiologiques suggèrent que la consommation de viande et de charcuteries est associée au risque du cancer colorectal. Par ailleurs, le WCRF préconise de limiter la consommation de viande rouge et d’éviter de manger de la charcuterie. Néanmoins, ces deux aliments sont des sources de fer et de vitamines notamment. Il faut donc être vigilant afin d’éviter des carences nutritionnelles chez certaines personnes (personnes âgées, adolescents et jeunes filles). En outre, de telles recommandations peuvent avoir des conséquences économiques et sociales importantes pour les filières agro-alimentaires importantes. Il existe des alternatives aux recommandations du WCRF. C’est dans ce contexte que s’est établi la thèse. Les objectifs étaient de démontrer l’effet promoteur de charcuteries et de trouver des composés protecteurs inhibant l’effet promoteur des charcuteries. Les résultats de ma thèse ont montré que de l’épaule cuite contenant des nitrites et oxydée, ainsi qu’une charcuterie type hot-dog sont promotrices de lésions pré-cancéreuses. Par ailleurs, le carbonate de calcium et l’α-tocophérol sont des composés inhibant l’effet promoteur des charcuteries. Les résultats obtenus lors de ma thèse sont donc réellement encourageants pour la prévention nutritionnelle du cancer colorectal. Ces résultats sont motivants pour continuer les recherches concernant la relation entre la consommation de charcuteries et le cancer colorectal. En ce qui concerne la prédiction du cancer colorectal suite à la consommation de charcuteries, les biomarqueurs précoces que nous avons utilisés ne semblent pas être les plus adaptés, ce qui implique qu’il y a encore des points à éclaircir, et que les mécanismes mis en jeu ne sont pas tout à fait établis. A long terme, ces premiers résultats sur la prévention du cancer colorectal sont aussi très encourageants pour diminuer l’incidence du cancer colorectal. Chez les consommateurs de charcuteries, la consommation d’aliments riches en vitamines E ou en calcium permettrait en effet de limiter fortement le risque de cancer du côlon. Au-delà du cadre de ma thèse, ceci démontre qu’une alimentation équilibrée est indispensable pour prévenir non seulement le cancer colorectal, mais aussi le risque de nombreux autres cancers. On estime qu’en France, 1/3 de la population est touchée par des cancers. Des changements dans les habitudes alimentaires pourraient nettement diminuer le taux de mortalité liée à cette maladie. Il s’agit cependant d’un travail de très long terme, car des changements dans les habitudes alimentaires sont très difficiles à obtenir auprès d’une population entière. Il est, à mon avis, important de sensibiliser les personnes très tôt, dans les écoles ou par les médias par exemple, 161 afin qu’elles prennent conscience du risque de cancer lié à une alimentation déséquilibrée. Le Programme National Nutrition Santé (PNNS) a ainsi communiqué récemment sur les recommandations du WCRF et pourra tout à fait être un support adapté lorsque les recommandations seront établies. Pour faire suite à cette thèse (étayer et parfaire les recommandations entrevues en vue de diminuer l’incidence du cancer colorectal), je caresse l’espoir de continuer à travailler sur ce sujet, car il y a encore beaucoup de points à explorer. Lorsque le WCRF a publié ses recommandations alimentaires en 2007, nous avons été très surpris de celle concernant la relation entre la consommation de viande rouge, de charcuteries et le cancer colorectal. En effet, le terme « éviter » est un mot fort en nutrition. Ceci montre que la relation entre la consommation de viande rouge ou de charcuterie et le cancer colorectal est un sujet d’actualité comportant encore des « zones » d’ombre. Le rapport du WCRF nous a vraiment encouragés et motivés à continuer à travailler sur cette relation. Si nous avons effectivement montré que certaines charcuteries sont promotrices du cancer colorectal, il reste néanmoins encore de nombreux points à éclaircir : l’implication relative de l’hème/hème nitrosylé et des ATNC/NOCs, les mécanismes mis en jeu, l’effet sur le cancer proprement dit (et non sur les lésions précancéreuses)… Enfin, bien que mon sujet de thèse ne soit pas innovateur, car il reprend principalement les travaux sur la relation entre la consommation de la viande rouge et le cancer colorectal, il est cependant l’un des premiers à tester l’effet de la consommation de charcuteries sur la promotion des lésions précancéreuses. Il traite d’un problème actuel, de santé publique et socio-économique. Bien que nous ayons travaillé sur des animaux, nous avons toujours eu en tête l’importance de mimer ce qu’il peut se passer chez l’Homme. Néanmoins, certains biais restent présents, d’où l’importance de la perspective d’effectuer une expérimentation chez l’Homme. Ceci conduira alors non seulement à des recommandations alimentaires, mais ceci permettra aussi de valider notre modèle animal pour l’étude de la relation entre la consommation de charcuteries et le cancer colorectal. Ma thèse m’a beaucoup apporté, aussi bien d’un point de vue professionnel que d’un point de vue personnel. Du premier point de vue, la thèse m’a permis d’apprendre le métier de chercheur, allant de l’élaboration d’un protocole à la rédaction d’un article. Elle m’a montré qu’un chercheur doit sans cesse prendre du recul sur ses résultats, mais aussi sur ses propres idées. J’ai aussi appris à travailler seule et en équipe. Mon encadrement m’a laissé la liberté de réaliser des expérimentations de ma propre initiative. Mais j’ai toujours évolué au sein de l’équipe en 162 prenant part notamment aux diverses discussions qui m’ont sans cesse enrichie et orientée. Enfin, j’ai pris une certaine confiance en moi, à l’oral notamment, et dans toutes les facettes qui concernent le métier de chercheur. J’ai eu la chance d’être toujours soutenue dans mes projets et mes communications orales, et ceci m’a réellement aidé à asseoir mon assurance. D’un point de vue personnel, la thèse m’a permis de savoir prendre du recul sur certains problèmes. Elle m’a aussi appris à mieux m’organiser et à aller à l’essentiel quelles que soient les situations. Enfin, la thèse m’a permis de surmonter un peu de ma timidité naturelle, ce qui représentera aussi un avantage dans ma vie me semble-t-il. Enfin, mon expérience de thèse m’a montré que la recherche est une activité professionnelle qui me plaît et me convient. Elle offre une multitude de tâches à réaliser : expérimentations animales et in vitro, travail bibliographique, écriture d’article, présentations orales… Elle génère diverses tâches à réaliser, ce qui rend le travail passionnant. Par ailleurs, cette diversification permet d’appréhender le travail sous différents aspects, et de ce fait, d’aborder la problématique à traiter sous différents angles. Toutes ces tâches permettent donc d’approfondir les connaissances sur un sujet, et d’en suivre toutes les ramifications et les implications sur d’autres domaines, et cela rend la recherche plus enrichissante. La recherche offre aussi la possibilité de travailler à la fois seule et en équipe. Cela signifie que nous sommes autonomes, tout en évoluant au sein d’une équipe. Je remercie encore très chaleureusement Denis Corpet, Fabrice Pierre, Sylviane Taché, Nathalie Naud, ainsi que Françoise Guéraud, Maryse Baradat et Marc Audebert pour m’avoir autant soutenue, encadrée et « supportée » (« Ce n’est pas facile tous les jours ! » comme dit Fabrice !) durant ces trois dernières années. Je souhaite à Nadia Bastide, la nouvelle thésarde du laboratoire, de passer trois années aussi agréables qu’elles l’ont été pour moi. 163 Références bibliographiques 1. Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, and MJ., T. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin., 59: 225-49, 2009. 2. WCRF, W. C. R. F. Food, nutrition, physical activity, and the prevention of cancer: a global perspective. WCRF and American Institute for Cancer Research, Washington DC: 1537, 2007. 3. Boyle, P., Tubiana, M., Autier, P., Boffetta, P., and Hill, C. Les causes du cancer en France. Rapport de l'Académie Nationale de Médecine, l'Académie de Sciences, le CIRC/IARC/OMS, la FNCLCC, l'INCa et l'INVS: 1-44, 2007. 4. Bugat, R. Le Cancer. Privat-Les Classiques Santé. 160 p, 2000. 5. Parkin, D. International variation. Oncogene., 23: 6329-40, 2004. 6. Burkitt, D., and Trowell, H. Dietary fibre and western diseases. Ir Med J. , 70: 272-7, 1977. 7. Sharma, S., and O'Keefe, S. 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Processed meat, added with nitrite and aerobically stored, promotes DMH-induced mucin depleted foci in the rat colon & freeze-dried ham promotes colon carcinogenesis in rats. 100th Annual Meeting of the AACR, American Association for American Research, Denver (US), 18-22 avril 2009. Raphaelle L. Santarelli, Nathalie Naud, Sylviane Taché, Françoise Guéraud, Jean-Luc Vendeuve, Denis E. Corpet, Fabrice H Meat processes involved in the promoting effect of cured meat on preneoplastic lesions. Séminaire SAS (Symposium Aliment et Cancer), Toulouse, 21 et 22 janvier 2009. Depeint F, Taché S, Naud N, Santarelli R, Pierre F, Bruce W.R, Corpet D.E. Does cooked western diet iniate colon carcinogenesis in rats. 20th meeting of the European Association for Cancer Research, Lyon, 5 juillet 2008. 183 Raphaelle L. Santarelli, Nathalie Naud, Sylviane Taché, Françoise Guéraud, Jean-Luc Vendeuve, Viau Michelle, Génot Claude, Denis E. Corpet, Fabrice H. Pierre. Effet des charcuteries sur la cancérogenèse colorectale, étude des mécanismes, choix de stratégies préventives. Présentation du projet ANR-PNRA 2005 HemeCancer au Comité de Programmation APRIVIS (Association pour la promotion de la recherche et l’innovation dans la transformation des viandes et la salaison), Paris, 19 février 2008. Raphaelle L. Santarelli, Nathalie Naud, Sylviane Taché, Françoise Guéraud, Denis E. Corpet, Fabrice H. Pierre. Faut-il encore manger de la viande rouge ? Présentation lors de Journée de la Recherche Scientifique (JRS) à l’ENVT de Toulouse, 6 décembre 2007. Raphaelle L. Santarelli, Nathalie Naud, Sylviane Taché, Françoise Guéraud, Jean-Luc Vendeuve, Viau Michelle, Génot Claude, Denis E. Corpet, Fabrice H. Pierre. Effet des charcuteries modèles sur les biomarqueurs de carcinogenèse colique: analyse statistique. Réunion du comité scientifique du projet ANR-PNRA 2005 HemeCancer (IFIP, ENVT, INRA Xénobiotiques, INRA de Nantes, CRNH de Clermont Ferrand), Paris, 4 décembre 2007. F. Pierre, D. Corpet, F. Guéraud, R. Santarelli, S. Taché, N. Naud, M. Baradat. Effects of processed meat on colon carcinogenesis. Studies of Mechanisms. Choice of preventive strategies. Premier séminaire ANR-PNRA-2005, Paris, 26 et 27 septembre 2007. Cours à des Master II Recerche à l’ENVT de Toulouse. Moyen d’étude de la relation viande rouge-charcuterie et cancer colorectal au Master II Recherche « Agro Food Chain » Elaboration de la Qualité et Sécurité Alimentaire, Toulouse, 1h. 22 octobre 2008. 184 Processed Meat and Colorectal Cancer. Dietary Additives and process inhibiting the promoting effect in rats. Consumption of cured meat is associated with increased risk of colorectal cancer. The aim of this thesis was (i) to validate this promotive in a rodent model and (ii) to find compounds that inhibit this promoting effect. A pork shoulder, rich in heam, cured with nitrited salt, cooked and oxidized (5d in a fridge) promoted preneoplasic lesions in dimethylhydrazine-initiated rat. This promotion was associated high level of fecal N-nitroso compounds. When diet was added with calcium carbonate, or when cured meat was added with α-tocopherol, meat-induced promotion was inhibited. Besides, hot dog sausage promotes preneoplasic lesions in rats, and dietary calcium inhibited this promotion. We think cancer incidence could be reduced by increasing calcium intake, or by changing cured meat process. Key words: colorectal cancer, cured meat, heme, calcium carbonate, α-tocopherol, N-nitroso compounds Ecole doctorale : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB). Axe : Pathologie, Toxicologie, Génétique & Nutrition UMR1089 INRA-ENVT, « Equipe Aliment, Péroxydes et Cancer », 23 ch. des Capelles, F-31076 Toulouse Auteur : Raphaelle SANTARELLI Titre : Charcuteries et cancérogenèse colorectale. Additifs alimentaires et procédés de fabrication inhibant la promotion chez le rat. Directeur de Thèse : Professeur Denis E. Corpet Lieu et Date de soutenance : le 22 février 2010 à l’Ecole Vétérinaire de Toulouse Résumé La consommation de charcuterie est associée au risque de cancer colorectal. L’objectif de cette thèse était (i) valider l’effet promoteur des charcuteries dans un modèle animal de cancérogenèse et (ii) de trouver des composés antagonistes de cet effet promoteur. De l’épaule de porc riche en hème, salée et nitritée, puis cuite et oxydée (à l’air 5 j à 4°C) est promotrice des lésions précancéreuses chez le rat chimio-induit par la diméthylhydrazine. Cette promotion s’accompagne d’une augmentation de composés N-nitrosés fécaux. L’ajout de calcium dans le régime ou d’α-tocophérol dans la viande inhibe la promotion induite par cette viande saumurée. Par ailleurs, la saucisse de type hot-dog est promotrice des lésions précancéreuses, cette promotion étant aussi inhibée par le calcium du régime. Nous pensons donc que l’on pourrait diminuer l’incidence du cancer par la consommation de produits riches en calcium ou par des modifications du procédé de fabrication des charcuteries. Mots clés : cancer colorectal, charcuteries, hème, carbonate de calcium, α-tocophérol, composés nitrosés Ecole doctorale : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB). Axe : Pathologie, Toxicologie, Génétique & Nutrition UMR1089 INRA-ENVT, « Equipe Aliment, Péroxydes et Cancer », 23 ch. des Capelles, F-31076 Toulouse
