caractérisation des microarn dans les muscles locomoteurs des
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CARACTÉRISATION DES MICROARN DANS LES MUSCLES LOCOMOTEURS DES PATIENTS ATTEINTS D’UNE MALADIE PULMONAIRE OBSTRUCTIVE CHRONIQUE Mémoire Alexandra Porlier Maîtrise en médecine expérimentale Maître ès sciences (M.Sc.) Québec, Canada © Alexandra Porlier, 2015 Résumé L’atteinte des muscles locomoteurs est une manifestation systémique de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Ce mémoire a pour objectif général l’étude des microARN (miR) impliqués 1) dans la myogenèse et 2) dans l’angiogenèse musculaire squelettique. Tout d’abord, l’expression de miR-1 influence la myogenèse dans les muscles locomoteurs chez des patients atteints d’une MPOC, un effet qui ne serait pas médié par IGF-1 ni par HDAC4. Ensuite, nous avons montré que l’expression de miR-1 semble négativement reliée à l’expression de VEGF dans le vastus lateralis chez les patients atteints d’une MPOC. L’ensemble de ces résultats suggère que miR-1 joueraient un rôle important dans les voies de signalisation impliquée dans la régulation de la myogenèse et de l’angiogenèse des muscles locomoteurs dans la MPOC. iii Abstract Limb muscle dysfunction is a systemic manifestation of COPD. This master’s thesis has for objective the investigation of microRNAs (miRs) involved 1) in myogenesis and 2) in skeletal muscle angiogenesis of patients with COPD. First, we showed that miR-1 appears to influence myogenesis in COPD, but not through IGF-1 or by HDAC4. We also showed that miR-1 negatively influences protein expression of VEGF in skeletal muscle angiogenesis of patients with COPD. Overall, these results suggest that miR-1 may play an important role in the regulation of limb muscle myogenesis and angiogenesis in COPD. v Table des matières Résumé ............................................................................................................................... iii Abstract ............................................................................................................................... v Table des matières ........................................................................................................... vii Liste des tableaux ............................................................................................................. xi Liste des figures .............................................................................................................. xiii Liste des abréviations ...................................................................................................... xv Dédicace ........................................................................................................................... xix Remerciements ................................................................................................................ xxi Chapitre 1 : Introduction générale .................................................................................... 3 1.1 La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)............................................ 3 1.1.1 Généralités............................................................................................................... 3 1.1.2 Épidémiologie .......................................................................................................... 4 1.1.3 Étiologie ................................................................................................................... 5 1.1.3.1 La cigarette ........................................................................................................ 5 1.1.3.2 Les facteurs environnementaux ........................................................................ 5 1.1.3.3 Déficit en alpha-1 antitrypsine ........................................................................... 6 1.1.4 Pathologie, pathogenèse et physiopathologie de la MPOC..................................... 6 1.1.4.1 Pathologie ......................................................................................................... 6 1.1.4.2 Pathogénèse ..................................................................................................... 7 1.1.4.3 Physiopathologie ............................................................................................... 8 1.1.5 Manifestations cliniques et le diagnostic de la MPOC ........................................... 10 1.1.5.1 Exacerbation ................................................................................................... 11 1.1.6 Traitements ............................................................................................................ 12 1.2 Manifestations systémiques et comorbidités associées à la MPOC ..................... 14 1.2.1 Les maladies cardiovasculaires ............................................................................. 15 1.2.2 L’ostéoporose ........................................................................................................ 15 1.2.3 Le diabète .............................................................................................................. 15 1.3 Muscle squelettique ................................................................................................... 16 1.3.1 Composition structurale du muscle squelettique ................................................... 16 1.3.1.1 La classification des fibres musculaires .......................................................... 18 1.3.2 Signalisation dans le muscle squelettique ............................................................. 19 1.3.2.1 IGF-1/PI3K/AKT .............................................................................................. 19 1.3.2.3 Ubiquitine/protéasome .................................................................................... 20 1.4 Les atteintes des muscles locomoteurs dans la MPOC ......................................... 21 1.4.1 Changements macroscopiques musculaires ......................................................... 22 1.4.2 Changements microscopiques musculaires .......................................................... 22 1.4.3 Les mécanismes de l’atrophie musculaire ............................................................. 23 vii 1.4.3.1 Synthèse et dégradation des protéines dans le muscle périphérique chez les patients atteints d’une MPOC ..................................................................................... 24 1.4.3.2 Autophagie...................................................................................................... 25 1.4.3.3 Apoptose......................................................................................................... 25 1.4.3.4 Déséquilibre entre les facteurs anaboliques et cataboliques ......................... 26 1.4.3.5 Déficit énergétique .......................................................................................... 26 1.4.3.6 Inflammation systémique ................................................................................ 27 1.4.3.7 Stress oxydant ................................................................................................ 27 1.4.3.8 Hypoxie ........................................................................................................... 27 1.4.3.9 Résumé sur l’atrophie musculaire .................................................................. 28 1.5 La myogenèse ............................................................................................................ 29 1.5.1 Généralités ............................................................................................................ 29 1.5.2 La myogenèse et les cellules satellites dans la MPOC ......................................... 30 1.5.3 La pertinence d’étudier la myogenèse .................................................................. 31 1.6 L’angiogenèse ............................................................................................................ 31 1.6.1 Généralités ............................................................................................................ 31 1.6.2 L’angiogenèse au niveau des muscles locomoteurs dans la MPOC .................... 32 1.6.3 La pertinence d’étudier l’angiogenèse .................................................................. 33 1.7 Les microARN ............................................................................................................ 33 1.7.1 Généralités ............................................................................................................ 33 1.7.2 La biogenèse des microARN ................................................................................ 34 1.7.3 Spécificité des microARN ...................................................................................... 36 1.7.3.1 MyomiR........................................................................................................... 36 1.7.3.2 AngiomiR ........................................................................................................ 37 1.7.4 Les miR dans le sang et le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC .... 37 1.7.5 Applications diagnostiques et thérapeutiques ....................................................... 38 1.7.5.1 Applications diagnostiques ............................................................................. 38 1.7.5.2 Applications thérapeutiques ........................................................................... 38 1.7.6 La pertinence d’étudier les miR ............................................................................. 39 Chapitre 2 : Problématique, objectifs et hypothèses de recherche ............................ 43 Chapitre 3 : Matériel et méthodes .................................................................................. 51 3.1 Recrutement des sujets............................................................................................ 51 3.2. Tests de fonctions pulmonaires et mesures anthropométriques ............................. 51 3.3 Une biopsie musculaire ............................................................................................ 51 3.4 Culture de cellules et transfection de miR ................................................................ 52 3.5 Extractions d’ARN et Reverse-Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) ...................................................................................................... 52 3.5.1 RT-qPCR pour l’ARNm ...................................................................................... 53 3.5.2 RT-PCR pour les miR ........................................................................................ 55 3.6 Immunobuvardage par Western blot ........................................................................ 56 3.6.1 Extraction des protéines à partir des échantillons de muscle ............................ 56 3.6.2 Extraction des protéines à partir des SkMC ...................................................... 56 viii 3.6.3 Quantification des protéines et électrophorèse .................................................. 56 3.7 Immunofluorescence pour les fibres musculaires ..................................................... 57 3.8 Immunofluorescence pour les capillaires .................................................................. 58 3.9 Analyses statistiques ................................................................................................ 59 Chapitre 4: Résultats ........................................................................................................ 63 4.1 Caractéristiques des participants .............................................................................. 63 4.2 L’expression des miR dans le vastus lateralis .......................................................... 65 4.3 Microcirculation dans le vastus lateralis.................................................................... 66 4.4 MiR-1 pourrait moduler l’expression protéique de VEGF dans les SkMC ................ 69 4.5 L’expression d’IGF-1, de HDAC4, de SPRED1 et d’AKT dans le vastus lateralis .... 71 Chapitre 5 : Discussion .................................................................................................... 75 5.1 L’expression des myomiR dans le vastus lateralis ................................................... 75 5.2 L’expression de miR-1 semble influencer l’expression de VEGF dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC ..................................................................... 77 5.3 L’expression de miR-126 dans le vastus lateralis ..................................................... 80 5.4 Limites de l’étude ...................................................................................................... 80 Chapitre 6 : Conclusion et perspectives ........................................................................ 85 6.1 Conclusion .................................................................................................................. 85 6.1.1 Pertinence des résultats ........................................................................................ 85 6.2 Perspectives ............................................................................................................... 86 RÉFÉRENCES ................................................................................................................... 91 ix Liste des tableaux Tableau 1 Facteurs qui permettent de différencier l’asthme et la MPOC. 3 Tableau 2 Symptômes cliniques et facteurs de prédisposition pour le diagnostic d'une MPOC. 11 Tableau 3 Classification de la sévérité de la MPOC. 11 Tableau 4 Traitement recommandé selon l’importance des symptômes et des risques d’exacerbation associés à la MPOC. 13 Tableau 5 Principales manifestations systémiques et comorbidités associées à la MPOC. 14 Tableau 6 Résumé des hypothèses spécifiques en fonction des sujets contrôles. 46 Tableau 7 Séquences des amorces utilisées en RT-qPCR. 54 Tableau 8 Amorces utilisées pour la quantification RT-qPCR des miR. 55 Tableau 9 Caractéristiques des sujets de l'étude. 63 Tableau 10 Caractérisation des fibres musculaires et des capillaires dans le vastus lateralis. 64 Tableau 11 Caractérisation de l’expression d’IGF-1, de HDAC4, de SPRED1 et d’AKT dans le vastus lateralis. 71 xi Liste des figures Figure 1 Composition d'un muscle squelettique. 17 Figure 2 Composition d'une fibre musculaire. 18 Figure 3 Régulation de la masse musculaire. 21 Figure 4 Courbes de survie des patients atteints d'une MPOC en fonction de la surface à la mi-cuisse (A) et de l'indice de masse corporelle (B). 22 Figure 5 Réponse d'une cellule satellite en réponse à un dommage musculaire. 30 Figure 6 Processus angiogénique dans un tissu. 32 Figure 7 Biogenèse des miR. 35 Figure 8 Schéma expérimental : Le rôle des miR-1, miR-126, miR-133a et miR-206 dans les muscles locomoteurs des patients atteints d'une MPOC. 45 Figure 9 Schéma expérimental : Impact de miR-1 sur l'expression de VEGF dans un modèle de cellules musculaires (SkMC). 47 Figure 10 L'expression relative de miR-1 (A), miR-206 (B), miR-133a (C) et miR-126 (D) dans le vastus lateralis des sujets contrôles et de patients atteints d'une MPOC GOLD 1 ou GOLD 2-3. 65 Figure 11 L’expression relative de l’ARNm de VEGF-A (A) et l’expression relative protéique de VEGF (B) dans le vastus lateralis de sujets contrôles et de patients atteints d’une MPOC GOLD 1 ou GOLD 2-3. 67 Figure 12 La corrélation entre l’expression relative de miR-1 et l’expression relative protéique de VEGF. 68 Figure 13 Le niveau d’expression de miR-1 a été mesuré dans les SkMC transfectées avec le mimique miR-1 (33,3 ηM) ou son contrôle négatif (33,3 ηM) pendant 24 heures (n =3) (A). Le niveau protéique de VEGF a été mesuré dans les SkMC transfectées pendant 24 heures avec le mimique miR-1 ou son contrôle négatif à une concentration de 3,33 ηM (n = 6) (B). 70 xiii Liste des abréviations % m mg mM mm µm ng µg µM 3’-UTR 4E-BP1 AAT1 AKT AMO Ang-1 AngiomiR AntagomiR ARN ARNc ARNm ARNnc ARNr ARNt ASO ATCC Atrogin1 CRP CS CVF DGCR8 E1 E2 E3 ERK FOXO GNB2L1 GOLD HADH HDAC4 Pourcentage Mètre Milligramme Millimolaire Millimètre Micromètre Nanogramme Microgramme Micromolaire Three prime untranslated region Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 Alpha-1 antitrypsine Protein kinase B Oligonucléotides anti-miR Angiopoïetine-1 Angiogenèse spécifique miR Inhibiteur de miR Acide ribonucléique ARN codant ARN messager ARN non-codant ARN ribosomal ARN de transfert Antisens oligonucleotides/Oligonucléotides anti-sens American Type Culture Collection Muscle-specific atrophy gene-1/muscle atrophy F-box C-reactive protein/Protéine C reactive Citrate synthase Capacité vitale forcée DiGeorge Syndrome critical Region 8 Ubiquitin- activation enzyme Ubiquitin-conjugating enzyme Ubiquitin-ligase enzyme Extracellular signal-regulated kinases Forkhead box O Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1 Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase Histone désacétylase 4 xv HIF-1α HPRT1 HRE HTAP HUVEC IGF-1 IGF1R IMC IL kDa LNA LTB4 MAPK MEF2 MiR MMP9 mTOR MPOC MRF MuRF MyomiR MyHC NEDD4 NF-κB NO NOS pAKT Pax7 PI3K PIGK PRI-miR PRÉ-miR pVHL RISC RNA RNU44 RNU48 ROS RPLP0 RT-qPCR S6K1 xvi Hypoxia-inducible factor 1 alpha Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 Hypoxia responsive element/Élément de réponse à l’hypoxie Hypertension artérielle pulmonaire Human umbilical vein endothelial cell Insulin-like growth factor-1 Insulin-like growth factor receptor 1 Indice de masse corporelle Interleukine Kilodalton Locked nucleic acid/Acides nucléiques bloquants Leucotriène B4 Mitogen-activated protein kinase Myocyte enhancer factor 2 MicroARN Métalloprotéinase matricielle 9 Mammalian target of rapamycin Maladie pulmonaire obstructive chronique Myogenic regulatory factor Muscle-specific Ring Finger E3 Muscle-specific miR Chaîne lourde de myosine Neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 4 Nuclear factor- kappa B Nitric oxide/Oxyde nitrique Nitric oxide synthase/Oxyde nitrique synthase Phosphorylated-AKT Paired box gene-7 Phosphoinositise 3-kinase Placental growth factor MiR primaire MiR précurseur Suppresseur de tumeur de la protéine Von Hippel-Lindau RNA-induced silencing complex Ribonucleic acid Small nuclear RNA, C/D box 44 Small nuclear RNA, C/D box 48 Reactive oxygen species/Espèce réactive de l’oxygène Ribosomal protein, large, P0 Reverse-Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction S6 kinase 1 SAA SEM SERPINA1 SIDA SkMC SLA SPD SPRED1 TNF-α U6 VEGF-A VEGFR2 VEMS VEMS/CVF Sérum amyloïde A Standard error of the mean Inhibiteur d’une sérine protéase en alpha-1 antitrypsine Syndrome d’immunodéficience acquise Human skeletal muscle cells Sclérose latérale amyotrophique Surfactant protein D Sprouty-related, EVH1 domain containing 1 Facteur de nécrose tumorale alpha RNA, U6 small nuclear 1 Vascular endothelial growth factor A Vascular endothelial growth factor receptor 2 Volume expiratoire maximal en 1 seconde Indice de Tiffeneau RÉACTIFS BSA EDTA EGTA H 2O 2 PBS Bovine serum albumin/Albumine de sérum bovin Ethylene diamine tetraacetic acid/Acide éthylène-diaminetétraacétique Ethylene glycol tetraacetic acid/Acide éthylène-glycoltétraacétique Peroxyde d’hydrogène phosphate-buffer saline xvii Dédicace À mes grands-parents et mes parents, À mon amoureux Jo, xix Remerciements Arrivé en mai 2011 au centre de recherche, je ne connaissais pas grand-chose de la recherche et j’étais très loin de me douter que j’allais faire des études graduées. J’ai eu la chance d’être dirigée par deux mentors exceptionnels. Je voudrais d’abord remercier mon directeur et superviseur de maîtrise François Maltais, car il m’a accueilli les bras ouverts dans son équipe de recherche. Il m’a transmis sa passion pour la recherche et a su me faire confiance dans mes projets de recherche. Merci beaucoup François d’avoir cru en moi. J’aimerais également remercier mon codirecteur de maîtrise Richard Debigaré, car il m’a appris la rigueur et la réflexion qui sont deux qualités importantes en recherche. Dès le tout début, j’ai eu la chance d’avoir des gens qui ont vu mon potentiel en me donnant des responsabilités. Annie Dubé a su me faire confiance et je lui serai reconnaissance de m’avoir transmis sa passion et son dévouement pour la recherche. J’ai beaucoup appris avec toi, la rousse, tu es un bon modèle pour moi. Dany Patoine est arrivé dans notre laboratoire en novembre 2013 et m’a transmis son expertise et sa rigueur au travail. Malgré les difficultés rencontrées, Dany a contribué à garder une ambiance joyeuse au sein de l’équipe. J’ai également côtoyé des gens dans le laboratoire qui ont influencé mon choix de carrière et avec qui j’ai aimé travailler. Je pense à Fernanda Ribeiro, Valérie Coats, Mélissa Pagé, Marie-Eve Thériault, Marie-Ève Paré, Marc-André Caron et Bruno Lemire. Un merci tout spécial aux infirmières de recherche, Dominique Auger, Marthe Bélanger, Marie-Josée Breton, Brigitte Jean et Josée Picard, toujours prêtes à nous aider. Sans oublier, tous les collègues du CRIUCPQ avec qui j’ai passé de bons moments autant pour les collaborations de recherche que pour les activités sociales. Il y a des gens importants dans ma vie à qui je ne pourrais passer à côté. Il y a mes parents Odette et Michel qui m’ont toujours encouragé et m’ont appris la persévérance et le travail dès mon jeune âge. Malgré la distance, mon frère Vincent et mes sœurs Sarah et Sandra restent toujours aussi importants dans ma vie. J’espère vous avoir démontré qu’avec le travail et la persévérance, on peut réussir beaucoup de choses. Mes grands-parents, Junille, Marius, William et Rollande, ont toujours été là pour nous et ont contribué à faire grandir la personne que je suis xxi devenue. Merci à mes familles Lévesque et Porlier pour vos mots d’encouragement qui étaient toujours les bienvenus. Un merci spécial à mon oncle, Normand, qui a un amour inconditionnel pour ces nièces et neveux comme si nous étions ses enfants et ça se ressent. Mes beaux-parents, Line et Martin, pour leur amour et l’aide qu’ils nous ont apportés aux cours des dernières années. Je ne peux oublier tous les bons moments passés avec les belles-sœurs, les beaux-frères (Caroline, Mathieu, François et Myriam) et la nièce (bébé Dorothée) on ne se le dit pas souvent, mais je vous aime. Pour tous les beaux moments passés avec mes amis au cours des dernières années, vous ne savez pas à quels points votre présence est importante. À travers les évènements heureux comme les plus tristes, je suis contente de vous avoir dans ma vie. Je pense à mes amis de longue date Dale, Samuel, Myriam, Marie-Chantal, François, Marie-Philip, Mathieu, Marie-Julie et tous les autres que je dois sûrement oublier. Merci! Le mot de la fin s’adresse à celui qui a une des plus grosses responsabilités. Être l’amoureux d’une étudiante à la maîtrise n’est pas une tâche facile. Cela nécessite plusieurs qualités comme être patient, à l’écoute, mais être un bon motivateur. Être une étudiante à la maîtrise, c’est avoir le goût de raconter les bons coups et les expériences qui ne fonctionnent pas. Sérieusement Joël, je ne sais pas comment tu fais. Tu dois vraiment m’aimer fort pour être capable d’endurer tout ça après 8 ans et de vouloir toujours me marier. C’est enfin terminé les études et vive les nouveaux projets! xxii CHAPITRE I INTRODUCTION 1 Chapitre 1 : Introduction générale 1.1 La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) 1.1.1 Généralités La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est une atteinte pulmonaire limitant le passage de l’air dans les voies respiratoires inférieures (2). Contrairement à l’asthme, la MPOC n’est pas entièrement réversible et se diffère par l’âge d’apparition, l’effet du tabac, la présence de symptômes et la portion des poumons touchée par la maladie (Tableau 1). Cette maladie est associée à plusieurs symptômes comme l’essoufflement, la toux et la production accrue de mucus (2). La maladie prend plusieurs années à s’installer et son diagnostic n’est pas toujours fait lors de l’apparition des premiers symptômes. La maladie progresse en sévérité selon l’exposition à l’élément déclencheur et le temps (Tableau 1). Tableau 1 Facteurs qui permettent de différencier l’asthme et la MPOC Facteurs Asthme MPOC Âge d’apparition Moins de 20 ans Plus de 40 ans L’impact du tabagisme Peu d’influence Symptômes Structures touchées L’exposition tabagique est la principale cause Intermittents et généralement réversibles avec la médication Chroniques et partiellement réversibles avec la médication Hyperréactivité des bronches Les bronchioles, les alvéoles et les membranes muqueuses deviennent de plus en plus endommagées Adapté du rapport Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of COPD 2015 de la Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (2, 3) 3 La MPOC regroupe deux types d’atteintes pulmonaires, soit la bronchite chronique et l’emphysème. La bronchite chronique s’accompagne d’une hypersécrétion de mucus qui a pour effet de rétrécir la lumière bronchique. Elle se caractérise par des épisodes de toux chroniques et productives d’un minimum de trois mois observés au cours de deux années successives chez les patients qui ne présentent pas d’autres causes de toux (2). L’emphysème se définit par l’élargissement anormal et permanent des voies aériennes situé en aval des bronchioles terminales et s’accompagne par la destruction des alvéoles pulmonaires laissant l’air emprisonné dans les sacs alvéolaires. Ces dommages permanents au parenchyme pulmonaire contribuent à la perte d’élasticité des tissus et réduisent la capacité de diffusion des gaz (4). L’instabilité des voies aériennes secondaires et la perte d’élasticité limitent la capacité expiratoire et conduisent à l’hyperinflation pulmonaire. La progression des atteintes pulmonaires est associée à la difficulté de respirer (dyspnée), la diminution de l’indice de masse corporelle (IMC) et à l’augmentation du taux de mortalité (5). La MPOC s’accompagne aussi de plusieurs manifestations systémiques comme l’atteinte des muscles locomoteurs et rend plus difficile le quotidien des gens atteints, car ils se voient contraints de réduire leur niveau d’activité physique. Les manifestations systémiques, dont les atteintes des muscles locomoteurs, seront abordées dans la section 1.4. 1.1.2 Épidémiologie Selon un rapport de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), la MPOC, avec trois millions de décès par année, s'est vue attribuer le quatrième rang au classement des causes de mortalité pour la population en général, tous âges confondus (6). Des données récentes de l’OMS prédisent que la MPOC deviendra la troisième cause de mortalité en importance d’ici 2030 (7). Selon de récentes estimations, il a été évalué que 10% de la population mondiale âgée de 40 ans et plus est aux prises avec une MPOC de stade II ou plus avancé (8). Au Canada, 1,5 million de personnes sont atteintes de MPOC; de plus 1,6 million de gens souffriraient de la maladie sans avoir été diagnostiqués (8, 9). Dans un sondage du Canadian Community Health Survey 4 (CCHS) en 2005, 4,4% (329 500) d’hommes et 4,8% (425 300) de femmes rapportaient avoir reçu un diagnostic de MPOC par un professionnel de la santé (10). Les coûts associés au traitement des patients atteints de la MPOC sont considérables. Au Canada, les coûts directs et indirects annuels des traitements atteignaient 4147$ en moyenne par patient en 2012 (11). Ce montant peut même s’élever jusqu’à 10 000$ annuellement en soins et médicaments pour un patient de stade GOLD 4 (12). 1.1.3 Étiologie L’exposition à la fumée de cigarette, à la combustion de biomasse, à la pollution ou à des vapeurs de produits toxiques et certains déficits génétiques sont tous des facteurs de risque reliés à la MPOC (13). Une exposition prolongée à un ou à plusieurs de ces facteurs augmente la réponse inflammatoire dans les poumons (4, 14). 1.1.3.1 La cigarette L’exposition à la fumée de cigarette conduit au développement d’une MPOC et cela représente 70% à 90% des patients atteints de cette maladie (13). Parmi la population mondiale de fumeurs actifs et d’ex-fumeurs, 15% développeront une MPOC et 50% développeront des symptômes d’obstruction des voies respiratoires. (15). La cigarette contient plus de 5000 produits chimiques dont 98 de ces produits sont connus pour leurs effets néfastes sur le système respiratoire (16). L’implication des autres produits chimiques dans la destruction des poumons n’est pas encore connue. 1.1.3.2 Les facteurs environnementaux L’exposition à certains facteurs environnementaux peut conduire au développement d’une MPOC et cela représente de 10% à 20% des cas répertoriés (17). Dans le monde, trois milliards de personnes sont exposés à la pollution provenant de la biomasse ce qui fait accroître le nombre de cas de gens atteints d’une MPOC (14, 18, 19). Les expositions à des vapeurs toxiques de carburants ou de produits chimiques, à des infections pulmonaires, à de la poussière ou à de la fumée sont d’autres exemples de facteurs qui augmentent les risques de développer la maladie (2). 5 1.1.3.3 Déficit en alpha-1 antitrypsine L’alpha-1 antitrypsine (AAT1) est un inhibiteur important des sérines protéases. Cette protéine est fabriquée au foie pour être libérée ensuite dans la circulation sanguine d’où elle rejoint le poumon, son site d’action de prédilection. Le déficit en AAT1 est causé par une mutation du gène codant pour une sérine protéase en alpha-1 antitrypsine (SERPINA1), ce qui entraîne des changements dans sa configuration et empêche sa libération par les hépatocytes (4, 20). Les neutrophiles sécrètent des protéases (élastases, protéinases et cathepsines) responsables de l’apoptose des cellules épithéliales et de la dégradation de protéines de la matrice extracellulaire du poumon (élastine et collagène) (21, 22). La dégradation de l’élastine et du collagène est associée à la destruction des tissus pulmonaires (22, 23). La destruction des tissus cause une perte d’élasticité des tissus pulmonaires (5). La persistance de la réponse inflammatoire aboutit en un déséquilibre protéases/antiprotéases dans le poumon aux dépens des secondes et favorise le développement de l’emphysème (20, 22, 24-26). La proportion de gens qui ont une déficience du gène SERPINA1 représente 1 à 2% de la population atteinte d’une MPOC (4, 20). D’autres études ont été menées dans le but de déterminer des polymorphismes dans certains gènes qui causeraient la MPOC (4). Ces études ont montré que certains gènes ayant subi des modifications comme la métalloprotéinase matricielle 9 (MMP 9) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a) seraient impliqués dans l’emphysème (4, 27). 1.1.4 Pathologie, pathogenèse et physiopathologie de la MPOC 1.1.4.1 Pathologie L’inhalation de la fumée de cigarettes et de substances nocives entraîne une réponse inflammatoire dans les poumons (4, 14, 28). Certains fumeurs ont une réponse anormale qui causera le développement d’une MPOC. La MPOC est caractérisée par des changements pathologiques tels que le remodelage du diamètre des voies respiratoires centrales et périphériques, la destruction du parenchyme pulmonaire et du système vasculaire pulmonaire (28). Ces changements pathologiques touchent principalement les cellules (ex. : hyperplasie des cellules à 6 gobelets et métaplasie des cellules épithéliales) et la structure (ex. : remodelage du diamètre des voies respiratoires et destruction des alvéoles) des poumons (28, 29). 1.1.4.1.1 Les voies respiratoires centrales et périphériques Les voies respiratoires centrales se composent de la trachée, des bronches et des bronchioles ayant un diamètre entre 2 et 4 mm alors que les voies respiratoires périphériques se composent de bronches et des bronchioles ayant un diamètre inférieur à 2 mm (28). Une augmentation de la sécrétion du mucus et du nombre de cellules à gobelet contribue, entre autres, à une accumulation accrue de mucus dans les voies respiratoires centrales et périphériques (28). L’accumulation de ce mucus a pour conséquences d’obstruer la lumière bronchique, de rendre le passage de l’air plus difficile et d’entraîner le remodelage du diamètre des voies respiratoires centrales et périphériques (29). 1.1.4.1.2 Le parenchyme pulmonaire La destruction du parenchyme pulmonaire se caractérise par la dilatation et la destruction des bronchioles et est associée à l’emphysème (28, 30). Le déséquilibre entre les protéases et les antiprotéases, la persistance de la réponse inflammatoire et l’apoptose des cellules épithéliales et endothéliales contribuent à la destruction permanente du parenchyme pulmonaire (22, 30, 31). 1.1.4.1.3 Le système vasculaire pulmonaire Le système vasculaire pulmonaire subit des changements structuraux associés à la MPOC. L’épaississement de la paroi des vaisseaux sanguins pulmonaires s’accompagne de croissance des muscles lisses et d’infiltration des cellules inflammatoires dans la paroi (28, 30). Ces changements peuvent conduire au développement d’anomalies dans les échanges gazeux et d’hypertension pulmonaire. 1.1.4.2 Pathogénèse La réponse immunitaire pulmonaire implique l’activation de divers processus dont la réponse inflammatoire. La persistance de l’inflammation contribue, entre autres, au développement d’un déséquilibre protéase et antiprotéase (section 1.1.3.3) et à l’accroissement du stress oxydant dans les poumons. L’ensemble de ces mécanismes participe aux changements pathologiques retrouvés dans la MPOC (5, 7 32). Par contre, la majorité des mécanismes pathogéniques de la MPOC demeure mal comprise. 1.1.4.2.1 Inflammation De façon générale, la présence de cellules inflammatoires comme les neutrophiles, les macrophages et de lymphocytes est rapportée dans les poumons des patients atteints de MPOC (29). Les cellules inflammatoires et épithéliales larguent des médiateurs de l’inflammation dont les cytokines (IL-8, IL-6 et IL-10), les leucotriènes B4 (LTB4) et le TNF-α (28). Les cytokines sont des petites glycoprotéines responsables des interactions entre les cellules (33). Elles sont sécrétées par les neutrophiles et les macrophages dans le but de recruter des neutrophiles et des lymphocytes T au site inflammatoire (22, 34). Une augmentation de cytokines et de protéines de phase aiguë (protéine C réactive (CRP), le sérum amyloïde A (SAA) et « surfactant protein D » (SPD)) est mesurable dans le sang des patients atteints d’une MPOC et contribuerait au développement de l’inflammation systémique (32). L’inflammation systémique proviendrait d’un débordement de molécules inflammatoires et oxydantes présentent dans les poumons et contribuerait au développement de plusieurs manifestations systémiques et de comorbidités associées à la MPOC (section 1.2) (32, 35). 1.1.4.2.2 Stress oxydant En plus du stress oxydant causé par la fumée de cigarettes, les neutrophiles et les macrophages sécrètent aussi du peroxyde d’hydrogène (H2O2) et de l’oxyde nitrique (NO) (22) et ceux-ci, contribuent aux changements pathologiques observés dans la MPOC (1). Des produits de la peroxydation des lipides et de l’oxydation des protéines pulmonaires sont détectés dans le sang et l’urine des patients atteints de la MPOC (36). Le stress oxydant augmente l’apoptose cellulaire, endommage les tissus pulmonaires et favorise l’activation des protéases dans les poumons des patients atteints d’une MPOC (5, 37). 1.1.4.3 Physiopathologie Les changements pathologiques pulmonaires sont causés par l’inflammation, le stress oxydant et le déséquilibre entre les protéases et les antiprotéases. Ces changements occasionnent des anomalies physiologiques incluant l’hypersécrétion de 8 mucus, la dysfonction des cils, l’obstruction des voies respiratoires, l’hyperinflation pulmonaire, des échanges gazeux anormaux, l’hypertension pulmonaire et des effets systémiques (section 1.2) (28, 30). La toux, la dyspnée et les expectorations résultent des anomalies physiologiques associées à la MPOC. 1.1.4.3.1 L’hypersécrétion de mucus et la dysfonction des cils L’hypersécrétion de mucus et la dysfonction des cils conduisent au développement de la toux chronique et à l’expectoration de sécrétions associées à la bronchite chronique (28, 30). L’hypersécrétion de mucus est causée par la métaplasie squameuse des cellules épithéliales, l’augmentation du nombre de cellules à gobelets et l’hyperplasie des glandes sous-muqueuses bronchiques (30). La dysfonction des cils est causée par la métaplasie squameuse des cellules épithéliales et complique le transport du mucus et la capacité d’expectorer chez les gens atteints de MPOC (30). 1.1.4.3.2 Obstruction des voies respiratoires et hyperinflation pulmonaire L’obstruction des voies respiratoires est causée par l’inflammation persistante, l’accumulation de mucus ainsi que le remodelage et la perte d’élasticité des alvéoles pulmonaires (30). L’obstruction bronchique emprisonne l’air lors de l’expiration et contribue au phénomène d’hyperinflation (30). L’hyperinflation dynamique réduit la capacité inspiratoire et la capacité fonctionnelle résiduelle lors d’une activité physique (30). Le degré d’obstruction des voies respiratoires est mesuré par spirométrie et permet de diagnostiquer la MPOC (30). 1.1.4.3.3 Échanges gazeux anormaux et hypertension pulmonaire De nouveaux changements physiopathologiques apparaissent dans les stades avancés de la MPOC. Les échanges gazeux anormaux sont caractérisés par de l’hypoxémie artérielle et peuvent s’accompagner ou non d’hypercapnie (30). L’hypertension pulmonaire se développe plus tardivement en réponse à l’aggravation des mauvais échanges gazeux (28, 30). Les facteurs contribuant à la progression de l’hypertension pulmonaire sont la dysfonction endothéliale, le remodelage des artères pulmonaires et la destruction des capillaires pulmonaires (30). La persistance de ces facteurs entraîne l’hypertrophie du ventricule droit et le développement d’affection cardiaque (cor pulmonaire) (28, 30). La prévalence du cor pulmonaire dans la MPOC n’est pas connue (28). 9 1.1.5 Manifestations cliniques et le diagnostic de la MPOC Les manifestations cliniques associées à une MPOC se traduisent par la présence des symptômes de toux, d’expectorations chroniques, de dyspnée au repos ou à l’effort, des antécédents de tabagisme ou d’exposition à des poussières ou à des vapeurs toxiques comme résumées dans le Tableau 2. Pour faire suite à la validation de ces symptômes, une mesure des débits expiratoires par spirométrie est effectuée pour établir le diagnostic de la MPOC, déterminer la sévérité de la maladie et évaluer sa progression. Différentes mesures de la fonction pulmonaire sont prises lors de la spirométrie, soit le volume expiratoire maximal en une seconde (VEMS) et la capacité vitale forcée (CVF). Le VEMS est la mesure du volume aérien maximale calculée durant la première seconde d’une expiration forcée. La CVF est la mesure du volume total d’air expulsé lors d’une expiration forcée complète. La présence d’une obstruction bronchique est confirmée lorsque le ratio VEMS sur CVF (indice de Tiffeneau) est inférieur à 70% et que le VEMS est inférieur à 100% (2). La valeur de VEMS est aussi utilisée afin d’évaluer le degré de sévérité de la maladie tel que présenté dans le rapport de la « Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease » (GOLD) (Tableau 3)(3). L’initiative GOLD propose une classification de spirométrie de la sévérité de la maladie qui décrit le niveau d’atteinte d’un sujet (Tableau 3)(3). Les gens atteints d’une MPOC de stade GOLD 1 consultent peu puisqu’ils présentent peu ou pas de symptômes respiratoires. La susceptibilité aux épisodes d’exacerbation augmente avec le degré de sévérité de la maladie. 10 Tableau 2 Symptômes cliniques et facteurs de prédisposition pour le diagnostic d'une MPOC Toux chronique : Production chronique d'expectoration : La dyspnée est : Facteurs de risque : Présence de façon intermittente ou à tous les jours, à un moment de la journée, rarement seulement la nuit Apparition de la production de sécrétion Progressive (s'aggrave avec le temps) Persistante (tous les jours) Décrite comme « une augmentation de l'effort à respirer », « chercher son souffle » Aggravée par l'exercice Aggravée par les infections pulmonaires Histoire tabagique élevée Exposition aux poussières ou aux produits chimiques Exposition à la fumée de combustion Adapté du rapport Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of COPD 2015 de la Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (3) Tableau 3 Classification de la sévérité de la MPOC GOLD 1 GOLD 2 GOLD 3 GOLD 4 Degré de sévérité VEMS/CVF VEMS (% la prédite) MPOC légère MPOC modérée MPOC sévère MPOC très sévère ≤0,70 ≤0,70 ≤0,70 ≤0,70 ≥80 50-79 30-49 <30 Adapté du rapport Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of COPD 2015 de la Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (3) 1.1.5.1 Exacerbation L’exacerbation est une aggravation des symptômes cliniques de la MPOC (Tableau 2) en grande partie de source infectieuse. Les exacerbations favorisent la progression de la maladie et accroissent le taux de mortalité des gens souffrant d’une MPOC (5). Elles peuvent être d’origine virale (les rhinovirus, le virus de l’influenza, les coronavirus et le virus respiratoire syncytial) ou bactérienne (Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis et Streptococcus pneumoniae) et la fréquence des épisodes augmente avec le degré de sévérité de la maladie (38, 39). Chaque année aux ÉtatsUnis, 29.5 milliards de dollars américains sont associés aux coûts des traitements des exacerbations (40). 11 1.1.6 Traitements Des traitements pharmacologiques et non pharmacologiques sont disponibles dans le but de réduire les symptômes d’une MPOC. Le traitement est choisi en fonction des symptômes et des risques d’exacerbations comme le démontre le Tableau 4. Les traitements pharmacologiques sont utilisés pour relaxer les muscles lisses des voies aériennes (bronchodilatateurs), réduire l’inflammation (glucocorticoïdes) et contrôler les infections pulmonaires (antibiotiques) (5). Une supplémentation de l’alpha-1 antitrypsine est disponible pour les patients qui ont une déficience de cette protéine (5). L’oxygénothérapie est prescrite aux patients ayant une MPOC sévère qui s’accompagne d’hypoxémie et permet d’améliorer les chances de survie (5, 41-43). La réadaptation pulmonaire est un programme d’entraînement physique qui a pour but de briser le déconditionnement enclenché lors de la progression de la maladie (44). La réadaptation pulmonaire réduit la dyspnée, augmente la tolérance à l’effort et améliore la qualité de vie des patients atteints d’une MPOC (5). L’éducation thérapeutique a comme objectif principal d’outiller les patients atteints d’une MPOC afin qu’ils puissent cesser de fumer, mieux comprendre la maladie et ses traitements ainsi que d’apprendre les aspects spécifiques liés à l’inhalation des bronchodilatateurs et des anti-inflammatoires (3). L’autogestion de la MPOC est essentielle afin de reconnaître les symptômes et les signes d’une exacerbation pour obtenir rapidement un traitement adéquat (2). 12 Tableau 4 Traitement recommandé selon l’importance des symptômes et des risques d’exacerbation associés à la MPOC Catégorie de patients Caractéristiques Classification spirométrique Cessation tabagique Vaccination contre la grippe et la pneumonie Activité physique Pour tous les groupes A B C D Faible risque d’exacerbations GOLD 1-2 Peu de symptômes Faible risque d’exacerbations GOLD 1-2 Présence de plusieurs symptômes Risque élevé d’exacerbations GOLD 3-4 Peu de symptômes Risque élevé d’exacerbations Présence de plusieurs symptômes Traitement recommandé GOLD 3-4 Bronchodilatateur de courtes actions lorsque nécessaire Traitement régulier avec un ou plusieurs bronchodilatateurs Réadaptation pulmonaire Traitement régulier avec un ou plusieurs bronchodilatateurs Réadaptation pulmonaire Inhalation de glucocorticoïdes Traitement régulier avec un ou plusieurs bronchodilatateurs Réadaptation pulmonaire Inhalation de glucocorticoïdes Adapté du rapport Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of COPD 2015 de la Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (3). 13 1.2 Manifestations systémiques et comorbidités associées à la MPOC L’inflammation et le stress oxydant contribuent au développement de plusieurs manifestations systémiques et comorbidités chez les patients atteints d’une MPOC tels que résumés dans le Tableau 5. Ces manifestations créent de la dyspnée et affectent la capacité fonctionnelle et la qualité de vie des patients atteints de MPOC (32). Les manifestations associées à la MPOC contribuent à l’augmentation du nombre d’hospitalisations et de la mortalité du patient atteint (45). Les manifestations et les comorbidités les plus fréquentes dans la MPOC sont les atteintes musculaires (section 1.4) , les maladies cardiovasculaires, l’ostéoporose et le diabète (32). Tableau 5 Principales manifestations systémiques et comorbidités associées à la MPOC (3, 32, 46) Cancer Poumon, sein, pancréas et œsophage Respiratoire Fibrose pulmonaire, hypertension pulmonaire, apnée du sommeil et infection respiratoire, asthme Cardiovasculaire Hypertension, hyperlipidémie, maladie coronarienne, insuffisance cardiaque congestive, fibrillation auriculaire, maladie artérielle périphérique et accident vasculaire cérébral Gastro-intestinale Reflux gastrique, cirrhose, ulcères gastriques et duodénaux Endocrine Diabète et syndrome métabolique Psychiatrique Anxiété et dépression Maladie rénale Articulations osseuses Ostéoporose et maladie dégénérative des articulations Autres Anémie, dysfonction des muscles locomoteurs, cachexie, dysfonction érectile, hypertrophie bénigne de la prostate, abus d’alcool et/ou drogue Adapté de Barnes et al. 2009. (32) et de Divo et al. 2012. (46). 14 1.2.1 Les maladies cardiovasculaires Les maladies cardiovasculaires sont une cause importante de mortalité chez les patients atteints d’une MPOC (4). Les maladies cardiovasculaires ont des facteurs de risques communs avec la MPOC dont l’exposition à la cigarette, l’âge et la sédentarité (3, 32). Tout comme dans la MPOC, l’inflammation systémique est associée au développement des maladies cardiovasculaires (32). Des études suggèrent qu’un patient ayant une MPOC devrait passer un test pour le dépistage de maladies cardiaques (32). 1.2.2 L’ostéoporose L’ostéoporose se caractérise par la perte de densité osseuse et rend les gens vulnérables aux fractures osseuses (47, 48). L’ostéoporose touche entre 36% et 60% des patients atteints d’une MPOC (48). Sa prévalence est plus élevée chez les gens atteints d’une MPOC sévère (47). De ce fait, la prise de corticostéroïdes est associée à une diminution de la densité osseuse et pourrait avoir un lien avec le développement de l’ostéoporose (3). Tout comme la MPOC, le développement de l’ostéoporose serait causé, entre autres, par l’inflammation systémique et contribuerait à réduire la qualité de vie (48). 1.2.3 Le diabète Le diabète se caractérise par un problème au niveau de la sécrétion de l’insuline ou de l’action de l’insuline et entraîne un excès de glucose sanguin (hyperglycémie) (49). Le diabète touche entre 10% et 25% des gens atteints d’une MPOC (50, 51). Sa prévalence est plus élevée chez les gens atteints d’une MPOC lorsqu’elle est comparée à des sujets sains (45, 52). La prise de corticostéroïdes contribue au développement de la résistance à l’insuline et à la progression du diabète (50). Malgré cette contre-indication relative, les corticostéroïdes sont souvent prescrits pour le traitement de l’exacerbation de la MPOC (50). Les mécanismes de l’association entre la MPOC et le diabète ne sont pas encore connus (32). 15 1.3 Muscle squelettique En plus des muscles lisses et cardiaques, le muscle squelettique fait partie des tissus contractiles retrouvés dans le corps humain et compose les muscles locomoteurs. Ils ont un rôle essentiel dans la locomotion et sont les plus affectés au cours de la progression de la MPOC. Les muscles squelettiques se caractérisent par leur force, leur endurance et leur structure (53). La force musculaire se définit par la capacité maximale du muscle à générer une contraction volontaire contre une résistance (54). L’endurance musculaire est un déterminant permettant d’évaluer la capacité du muscle à maintenir un effort et une force dans le temps. Un ou plusieurs changements macroscopiques et microscopiques de leur structure influencent leur capacité d’adaptation à la croissance, à l’entraînement et à la réparation musculaire (55). 1.3.1 Composition structurale du muscle squelettique Le muscle squelettique représente entre 40 et 50% du poids corporel chez l’humain (56). Son rôle est avant tout de permettre le mouvement du squelette et il assure également la respiration et le maintien de la posture (57). Le muscle est composé de plusieurs types de cellules qui assurent le maintien de sa structure dont les fibres musculaires et les cellules satellites musculaires (58, 59). Ce sujet sera abordé à la section 1.5. Les muscles squelettiques sont reliés aux os par l’intermédiaire d’un tendon comme le montre la Figure 1. L’enveloppe du muscle est formée de tissu conjonctif fibreux nommé épimysium (56, 60). Les faisceaux musculaires regroupent une dizaine de fibres musculaires et sont entourés d’une couche de tissu conjonctif nommé périmysium (56, 60). La fibre musculaire ou myofibre est la cellule musculaire à la base de la structure du muscle squelettique (59). Ce sont des cellules multinucléées dont les noyaux et les mitochondries sont retrouvés à leur périphérie comme le montre la Figure 2. La fibre est recouverte également par une couche de tissu conjonctif, l’endomysium. La fibre musculaire est constituée de myofibrilles qui sont composées d’unités contractiles appelées les sarcomères. Le sarcomère répond aux signaux neuromusculaires (59). Il est composé de myofilaments fins et épais qui se 16 chevauchent lors d’une contraction musculaire. Les myofilaments fins sont composés de molécules d’actines, de troponines et de myotroponines et les myofilaments épais, de molécules de myosines qui interagissent lors de la contraction. Figure 1 Composition d'un muscle squelettique (61) 17 Figure 2 Composition d'une fibre musculaire (61) 1.3.1.1 La classification des fibres musculaires Pour répondre aux nombreuses et diverses tâches physiques quotidiennes, le muscle est composé de plusieurs types de fibres musculaires. Le classement des fibres musculaires est fait selon le type de myosine qu’elles expriment. Dans chaque fibre, on retrouve principalement une des trois isoformes de la chaîne lourde de myosine (MyHC), soit I, IIa, IIx (62). Les fibres de type I, ou fibres à contraction lente, montrent un métabolisme oxydant pour produire leur énergie et sont résistantes à la fatigue (62). Elles sont le type de fibres de prédilection pour des efforts d’endurance, comme la course de longue durée. Les fibres de type IIx, ou fibres à contraction rapide, montrent un métabolisme glycolytique pour produire leur énergie et sont à prédominance anaérobique (62). Elles sont le type de fibres impliquées dans les efforts de haute intensité et de courte durée. Les fibres IIa, également à contraction rapide, démontrent un métabolisme à la fois oxydant et glycolytique (intermédiaire) 18 (62). Elles sont utiles pour des efforts aussi bien d’endurance que de courte durée (63). 1.3.2 Signalisation dans le muscle squelettique Le maintien de l’équilibre biochimique de la masse musculaire passe par la régulation étroite entre les voies de synthèse et de dégradation protéiques telle que résumée à la Figure 3. Différentes voies de signalisations sont impliquées dans le maintien de cet équilibre biochimique dont la voie de l’IGF-1/PI3K/AKT et de l’ubiquitine/protéasome. 1.3.2.1 IGF-1/PI3K/AKT La synthèse des protéines est un mécanisme qui favorise l’hypertrophie de la fibre musculaire et est responsable du remplacement des protéines lorsqu’elles sont endommagées afin d’assurer le maintien de la masse musculaire. La voie de signalisation d’« insulin growth factor -1 » (IGF-1), de l’enzyme « phosphoinositide 3kinase » (PI3K) et de la « protein kinase B » (AKT) contrôle la synthèse des protéines, la myogenèse, la survie et la croissance des fibres musculaires (Figure 3) (64, 65). IGF-1 est un facteur de croissance sécrété par les tissus qui active le récepteur tyrosine kinase « insulin growth factor receptor-1 » (IGFR-1) présent à la surface de tous les types de cellules dont les cellules musculaires (66). L’activation du récepteur IGFR-1 entraîne la phosphorylation de la protéine sérine/thréonine kinase AKT qui est responsable de l’activation de la protéine ribosomale sérine/thréonine kinase « S6 kinase 1 » (S6K1) suite à l’activation de la protéine sérine/thréonine kinase « mammalian target of rapamycin » (mTOR) (non présentée dans la Figure 3) (65). L’activation de S6K1 entraîne une augmentation de la synthèse des protéines musculaires (non présentée dans la Figure 3) (67). De plus, la phosphorylation d’AKT bloque l’activité de la kinase de la protéine sérine/thréonine kinase « glycogen synthase kinase 3 B » (GSK-3B) un inhibiteur de la synthèse protéique (non présentée dans la figure 3) (68). La phosphorylation de la protéine AKT conduit également à l’inhibition de la dégradation protéique en séquestrant le facteur de transcription « forkhead box O » (FOXO) dans le cytoplasme de la cellule en réponse à sa phosphorylation (69, 70). 19 1.3.2.3 Ubiquitine/protéasome Le système ubiquitine/protéasome est une voie de signalisation qui contrôle la dégradation des protéines dans les tissus (71). La cascade de l’ubiquitine/protéasome comprend trois familles d’enzymes clées soit : les enzymes « ubiquitin-activation » (E1), les enzymes « ubiquitin-conjugating » (E2) et les enzymes « ubiquitin-ligase » (E3) (72). Les E3 ligases spécifiques au muscle sont : l’enzyme « muscle-specific Ring Finger 1 E3 » (MuRF1) et l’enzyme « muscle-specific atrophy gene-1/muscle atrophy F-box 1 » (Atrogin1). Elles participent à l’étape finale d’ubiquitination des protéines ciblées et procurent la spécificité du système ubiquitine/protéasome (73-75). La transcription des gènes MuRF1 et Atrogin1 a lieu en présence d’un ou plusieurs de ces facteurs : la déphosphorylation de la protéine AKT, l’inflammation ou le stress oxydant (Figure 3). Le rôle de MuRF1 et d’Atrogin1 a été démontré dans des modèles d’atrophie musculaire chez l’humain et les rongeurs (76). La fonction d’Atrogin1 est de catalyser la dégradation des protéines impliquées dans la synthèse protéique alors que MuRF1 catalyse la dégradation des myofilaments épais et de la myosine (77-79). Les protéines ubiquitinées sont dégradées à l’intérieur du protéasome (75). 20 Figure 3 Régulation de la masse musculaire. Adapté de Maltais et al. 2014. (1). 1.4 Les atteintes des muscles locomoteurs dans la MPOC Les atteintes musculaires se définissent par une perte de force, d’endurance et de la masse musculaire et contraient les patients à réduire voire même arrêter leurs activités quotidiennes en raison de la fatigue musculaire (47, 53). L’endurance et la force musculaire sont réduites de 30% chez les patients atteints d’une MPOC et contribuent à la diminution de leur niveau quotidien d’activité physique et de leur espérance de vie (1, 53, 80-90). De plus, la réduction de la masse musculaire touche entre 4 à 35% des gens atteints d’une MPOC et est caractérisée par la présence de plusieurs changements macroscopiques et microscopiques qui feront l’objet des sections suivantes (91-93). Le programme de réadaptation pulmonaire met l’accent sur l’entraînement physique qui vise à obtenir des gains au niveau de l’endurance, de la force et de la masse musculaire (94-101). Pour le moment, la réadaptation pulmonaire demeure le meilleur traitement qui permet d’améliorer la qualité de vie des gens atteints. 21 1.4.1 Changements macroscopiques musculaires La perte de masse musculaire est une atteinte bien reconnue parmi les chercheurs travaillant sur la MPOC (1). Les techniques d’imagerie ont permis d’observer une réduction significative de la surface à la mi-cuisse chez les patients atteints d’une MPOC en comparaison avec des sujets contrôles ayant une fonction pulmonaire normale (82, 102). La mesure de la surface à la mi-cuisse est un indice prédicateur de la mortalité et de façon plus importante que l’indice de masse corporelle (Figure 4) (1, 102). De plus, les chercheurs ont observé la présence de changements microscopiques dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC qui est associée à la perte de masse musculaire. Figure 4 Courbes de survie des patients atteints d'une MPOC en fonction de la surface à la mi-cuisse (A) et de l'indice de masse corporelle (B) (1). 1.4.2 Changements microscopiques musculaires Plusieurs études ont démontré des changements microscopiques dans le vastus lateralis des patients ayant une MPOC. La première anomalie microscopique du vastus lateralis est le changement dans la proportion des types de fibre. La proportion des fibres de type II est plus grande et celle des fibres de type I est réduite dans le vastus lateralis de patients atteints d’une MPOC comparativement à des contrôles ayant une fonction pulmonaire normale (103-105). La proportion des fibres de type I est inversement associée au degré de sévérité de la maladie et est proportionnelle à l’IMC (104, 105). Il existe une association entre le vieillissement et 22 l’augmentation de la proportion des fibres de type I dans les muscles chez des athlètes, mais cette tendance semble être renversée dans la MPOC (105, 106). Une réduction de la dimension des fibres musculaires a aussi été observée dans le vastus lateralis des patients ayant une MPOC (103). L’atrophie des fibres de type IIx semble plus grande que pour les autres types de fibres (107, 108). D’autres anomalies ont été observées comme la diminution du nombre de capillaires rapporté par la surface de fibres dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC (103, 104). Cette modification fait l’objet d’une section spécifique (section 1.6). La capacité oxydative des muscles locomoteurs est réduite et s’explique par une diminution de l’activité des enzymes oxydatives comme la 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase (HADH) et la citrate synthase (CS) chez les patients atteints d’une MPOC modérée à sévère (53, 103, 105, 109-111). Cette diminution de l’activité des enzymes oxydatives dans les muscles est associée au changement dans le typage des fibres oxydatives vers des fibres glycolytiques (103-105). Finalement, on observe fréquemment une réduction de la surface des fibres musculaires dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC qui contribue à la perte de masse musculaire. Les mécanismes responsables de ce phénomène d’atrophie musculaire seront discutés à la section suivante. 1.4.3 Les mécanismes de l’atrophie musculaire L’atrophie musculaire est un phénomène associé à des maladies chroniques dont la MPOC, le cancer et le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) (112). L’atrophie musculaire se caractérise par une perte de masse musculaire et s’installe lorsque la dégradation protéique est plus grande que la synthèse protéique (75). Des mécanismes cellulaires favorisent la dégradation protéique (l’ubiquitine/protéasome, l’autophagie et l’apoptose) et ils sont activés lors de la présence d’atrophie musculaire (113). D’autres mécanismes cellulaires, dont le déséquilibre entre les facteurs anaboliques et cataboliques, le déficit énergétique, l’inflammation, le stress oxydant et l’hypoxie, sont étudiés dans le vastus lateralis, car ils contribuent à réduire la masse musculaire chez les patients atteints d’une MPOC. 23 1.4.3.1 Synthèse et dégradation des protéines dans le muscle périphérique chez les patients atteints d’une MPOC Plusieurs études tentent de relier l’implication de certaines voies de signalisation cellulaire avec l'étiologie de l’atrophie musculaire observée dans la MPOC. Une étude de Doucet et al. a observé une augmentation des niveaux d’expression de l’ARNm de MuRF1 et d’Atrogin1 et une accumulation de la protéine FOXO dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC sévère (114). Une augmentation de la phosphorylation d’AKT a aussi été démontrée dans l’étude de Doucet et al. et suggère que la régulation de la transcription de MuRF1 et Atrogin1 se produit par l'intermédiaire de FOXO qui est indépendante d’AKT. Une augmentation du niveau de phosphorylation de trois protéines associées à l’hypertrophie musculaire (S6K1, GSK-3β et « eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 » (4EBP1)) a aussi été observée chez les patients atteints d’une MPOC qui ont une faible masse musculaire par rapport à des patients qui ont une masse musculaire préservée (114). Les auteurs ont proposé que cela puisse être le résultat d'une boucle de rétroaction résultant d’une tentative non fonctionnelle de compenser le processus d'atrophie musculaire présent chez ces patients. Une autre étude a permis de mettre en évidence une augmentation d’Atrogin1 et de « neuronal precursor cell expressed developmentally downregulated protein 4 » (Nedd4), une E3 ligase impliquée dans le marquage des protéines endommagées qui seront par la suite dégradées (115). Contrairement aux résultats obtenus dans Doucet et al., cette étude n’a pas démontré des niveaux de phosphorylation d’AKT, de S6K1 et de GSK-3β plus élevés dans le quadriceps des patients ayant une MPOC. Les « mitogen-activated protein kinase » (MAPK) (p38, « extracellular signalregulated kinases » (ERK1/2)) sont activées en réponse à un stress cellulaire comme l’inflammation et le stress oxydant (116). Ils sont connus pour être impliqués dans le processus d’atrophie musculaire dans des modèles de culture cellulaire et d’animaux (117, 118). La p38 MAPK est également un médiateur important dans la réponse au stress oxydant et peut induire l'expression des gènes d’Atrogin1 et MuRF1 ainsi que l’activité du protéasome dans le muscle squelettique (117). Plus récemment, il a été démontré que l’activation des MAPK p38 et ERK1/2 peut également être impliquée 24 dans la dégradation des protéines musculaires dans le vastus lateralis des patients ayant une MPOC (119). 1.4.3.2 Autophagie L’autophagie est un mécanisme responsable de l’élimination de protéines dysfonctionnelles par la formation de vésicules appelées autophagosomes (120). Les autophagosomes transportent leur contenu vers les lysosomes pour y être dégradés (120). L’autophagie semble être activée constitutivement dans les muscles squelettiques en réponse à des stimuli dont le stress oxydant et l’hypoxie (1, 113, 120122). Son rôle et sa régulation ne sont pas encore bien connus dans les muscles locomoteurs (1, 113, 120). Des études faites chez des modèles expérimentaux d’atrophie musculaire ont observé que l’autophagie semble être un mécanisme hautement important de dégradations protéiques (123). Une étude a montré que l’autophagie est augmentée dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC et est associée à l’atrophie musculaire (124). 1.4.3.3 Apoptose L’apoptose est un mécanisme de mort cellulaire programmée dans des cellules mononucléées et pourrait contribuer au processus d’atrophie cellulaire dans les cellules multinucléées (125). L’augmentation de l’apoptose des cellules musculaires est associée à un petit IMC et à une réduction de la tolérance à l’exercice dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC (126). L’apoptose des cellules musculaires passe par l’activation de protéases apoptotiques comme les caspases (ex. : caspase-3) et les calpaïnes (127, 128). Les protéases initient le bris des protéines contractiles afin de faciliter leur dégradation par le protéasome (127, 128). Le rôle de caspase-3 dans les muscles squelettiques est de briser l’actine et les complexes d’actomyosines en fragments d’actine de 14 kDa (127). Les fragments d’actine sont retrouvés dans le muscle des rats ayant une atrophie musculaire et sont un marqueur de la dégradation musculaire dans une lignée de cellules musculaires de rats (ex. : L6) (127). Le rôle des calpaïnes dans les muscles squelettiques est de briser les complexes d’actomyosines et d’autres myofilaments (ex. : desmin, α-actinin, tinin and nebulin) (128). Les fragments d’actine et d’autres protéines sont dégradés par le système ubiquitine-protéasome. Le rôle de l’apoptose dans le vastus lateralis 25 des patients atteints de MPOC ne fait pas consensus quant à son implication dans le développement de l’atrophie musculaire (21, 129). 1.4.3.4 Déséquilibre entre les facteurs anaboliques et cataboliques Le déséquilibre entre les facteurs anaboliques et cataboliques dans la MPOC contribue à l’atrophie des muscles locomoteurs (130). Une réduction du niveau sanguin d’une hormone anabolique (la testostérone) et du facteur de croissance (IGF1) est associée à une diminution de la synthèse des protéines et de la force musculaire chez les patients atteints de la MPOC (131-134). La diminution de la testostérone est aussi associée à la vieillesse (135) et à la présence d’une maladie chronique chez les hommes (136). Une étude a démontré que prendre un supplément de testostérone lors d’un exercice en résistance permet d’augmenter la masse et la force musculaire chez des hommes ayant une MPOC et qui ont un bas niveau de testostérone (137). La cascade catabolique peut-être initiée par les cytokines proinflammatoires dont IL-6 (138). Une augmentation du niveau sanguin d’IL-6 est associée à une activation de la dégradation des protéines musculaires chez les patients atteints d’une MPOC (132). Un déséquilibre entre les facteurs anaboliques et cataboliques est causé par la diminution de facteurs anaboliques et par l’augmentation de facteurs cataboliques et peut être un déterminant important dans la progression de l’atrophie musculaire 1.4.3.5 Déficit énergétique Un déficit énergétique est caractérisé par une dépense énergétique plus grande que l’apport alimentaire et peut contribuer au développement de l’atrophie musculaire (139, 140). Une dépense énergétique élevée provient, entre autres, du travail respiratoire augmenté en raison de l’hyperinflation pulmonaire et de la résistance inspiratoire chez les patients atteints d’une MPOC (141). L’apport alimentaire insuffisant est causé par une réduction de leur appétit d’environ 45% chez les gens atteints d’une MPOC lorsqu’il est comparé à celui des gens ayant un indice normal de masse corporelle (142). La réserve de protéines des muscles squelettiques est alors dégradée pour fournir les nutriments nécessaires (143). Une augmentation de la dégradation des protéines conduit à la réduction de la masse maigre chez les 26 patients atteints d’une MPOC (144). Une étude a démontré qu’il existe de fortes corrélations entre la réduction de l’appétit, l’indice de masse corporelle et la perte de poids chez des sujets atteints d’une MPOC (142). Le déséquilibre énergétique semble contribuer à la perte de la masse maigre chez les patients atteints de la MPOC. La prise de suppléments alimentaires en combinaison avec un programme d’exercice contribue à l’amélioration de la qualité de vie, de la tolérance à l’exercice et du gain de masse maigre dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC (1, 145-147). 1.4.3.6 Inflammation systémique L’inflammation systémique semble être une conséquence découlant de l’inflammation qui persiste dans le poumon et pourrait contribuer à la détérioration des muscles périphériques des patients atteints de la MPOC (32). L’augmentation de la concentration de molécules inflammatoires et de certaines protéines de phase aiguë (SAA et CRP) induit la transcription du « nuclear factor-kappa B » (NF-kB), de FOXO, de protéases apoptotiques et de l’autophagie qui contribuent à l’activation de l’ubiquitine/protéasome (76, 130, 148-151). L’activation de NF-kB dans les muscles des patients MPOC est suffisante pour induire les mécanismes d’atrophie musculaire (152, 153). Des études menées sur des modèles d’animaux ont démontré qu’en inhibant l’expression de NF-kB, il est possible de restaurer la masse musculaire (32). 1.4.3.7 Stress oxydant Le stress oxydant survient lorsqu’il y a un déséquilibre entre la production d’espèces oxygénées réactives (ROS) et la capacité de l’organisme à éliminer ces molécules. L’accumulation des ROS induit l’oxydation des protéines, la peroxydation des lipides et l’apoptose cellulaire dans les muscles des patients atteints d’une MPOC (37). 1.4.3.8 Hypoxie L’exposition chronique à l’hypoxie induit une perte de masse musculaire chez des sujets exposés à une altitude de plus de 5000 m (44, 154). La perte de masse musculaire observée dans le vastus lateralis lors d’une expédition en altitude est comparable à ce qui est observé dans la MPOC (44). L’hypoxie contribue au 27 développement de l’atrophie des muscles locomoteurs chez les patients atteints de la MPOC (44, 155). Dans notre laboratoire, il a été montré que l’hypoxie affecte la voie d’IGF-1/PI3K/AKT, augmente l’expression d’Atrogin-1 et l’activité de l’ubiquitine/protéasome dans un modèle de cellules musculaires de rats en culture (155). Le niveau d’expression d’ARNm d’Atrogin-1, dans un modèle de cellule musculaire en condition hypoxie, est comparable au niveau de cette protéine chez des patients MPOC ayant une atrophie musculaire (114, 155). La réponse cellulaire en réponse à l’exposition à l’hypoxie passe par l’activation de « hypoxia inducible factor-1 alpha » (HIF-1α) un facteur de transcription clé dans la régulation de l’hypoxie. HIF-1α est impliquée dans la régulation de différents processus biologiques dont l’angiogenèse (section 1.6) et le métabolisme énergétique (44). En condition hypoxique, l’activation de HIF-1α est reliée à la diminution de la régulation du suppresseur de tumeur de la protéine « von Hippel-Lindau » (pVHL) (156, 157). En condition normale, l’expression de pVHL, une E3 ligase, forme un complexe d’ubiquitination avec HIF-1α et entraîne la dégradation de HIF-1α au protéasome (156, 157). La dégradation de HIF-1α inhibe l’angiogenèse, car HIF-1α ne peut s’associer à son élément de réponse à l’hypoxie (HRE) bloquant la transcription de « vascular endothelial growth Factor-A » (VEGF-A) (section 1.6). Dans les muscles des membres inférieurs de certains patients atteints de la MPOC, l’expression de pVHL est augmentée et entraîne la dégradation de HIF-1α (158, 159). L’hypoxie entraîne d’autres conséquences comme l’augmentation de la production des ROS et des dommages cellulaires ainsi que la réduction du fonctionnement du métabolisme oxydant dans les muscles squelettiques (44). Elle peut également affecter la myogenèse en limitant la différenciation des myoblastes (160). 1.4.3.9 Résumé sur l’atrophie musculaire Les mécanismes présentés dans cette section jouent un rôle important dans la compréhension de l’atrophie musculaire dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC. Parmi ces mécanismes, certains d’entre eux, dont certaines protéines impliquées dans la balance de synthèse et de dégradation protéiques et l’hypoxie, influencent la régulation de la myogenèse et de l’angiogenèse. La 28 myogenèse et l’angiogenèse sont deux processus biologiques essentiels au fonctionnement du muscle. Certaines études ont démontré que ces processus peuvent être dysfonctionnels et participeraient au processus d’atrophie musculaire du vastus lateralis des patients ayant une MPOC. 1.5 La myogenèse 1.5.1 Généralités La myogenèse est le processus regroupant les évènements cellulaires et moléculaires de la formation, du maintien et de la réparation des muscles squelettiques (Figure 5) (58, 161). Différentes cellules musculaires interviennent afin d’assurer la réparation et l’homéostasie du muscle squelettique (161). Ces cellules sont: les cellules satellites, les myoblastes, les myotubes et les fibres musculaires (58). Les cellules satellites constituent la principale réserve de cellules qui participe à la réparation du tissu musculaire (Figure 5) (162). Elles sont quiescentes et situées à la surface des fibres (163). L’activation des cellules satellites dépend des signaux reçus comme les « paired box gene » (Pax 3/7), les « myogenic regulatory factor » (MRF : MyoD, Myf5, «myogenin» et MRF4), les hormones (ex. : testostérone), les cytokines (ex. : IL-6), neurotransmetteurs et/ou les facteurs de croissance (ex. : IGF-1) suite à un stress cellulaire (ex. : une blessure musculaire ou une activité physique) (55, 59). Les cellules satellites activées migrent vers le centre de la fibre musculaire endommagée pour la réparer (55). Les cellules satellites activées prolifèrent en myoblastes pour être éventuellement différenciées en myotubes ou myocytes (58). Certaines cellules satellites retourneront en état de quiescence afin de maintenir un niveau élevé de cellules dans la niche (58). Par la suite, les myotubes fusionneront entre eux pour devenir une fibre musculaire (58). 29 Figure 5 Réponse d'une cellule satellite en réponse à un dommage musculaire (61) 1.5.2 La myogenèse et les cellules satellites dans la MPOC L’activation de la myogenèse est perturbée dans la MPOC (164, 165). Une étude récente de notre laboratoire a montré que l’expression de certains MRF est atypique dans les cellules satellites isolées de patients atteints de MPOC (165). Cette observation contribuerait à démontrer que la myogenèse est défectueuse chez des patients atteints d’une MPOC sévère (165). Une deuxième étude réalisée dans notre laboratoire suggère que les cellules satellites isolées de patients atteints d’une MPOC sévère et ayant une atrophie musculaire vieillissent prématurément ce qui réduirait leur capacité à participer à la réparation du vastus lateralis (164). Ces observations pourraient contribuer à l’atrophie musculaire chez les patients atteints d’une MPOC. 30 1.5.3 La pertinence d’étudier la myogenèse L’ensemble des observations présentées dans la section 1.5.2 suggère que la myogenèse est déficiente et nécessite une attention particulière dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC. Les mécanismes cellulaires liant ces observations et l’atrophie musculaire ne sont pas connus dans la MPOC. Dans cette étude, il serait pertinent de mesurer les niveaux d’expression de certaines molécules myogéniques impliquées dans l’activation des cellules satellites. Une meilleure connaissance de ce processus biologique aidera à voir les signes avant-coureurs de l’atrophie musculaire du vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC. 1.6 L’angiogenèse 1.6.1 Généralités Les capillaires assurent l’apport en nutriments et en oxygène nécessaire au fonctionnement des cellules. L’angiogenèse est le processus responsable de la formation des capillaires et est un déterminant de la perfusion des muscles périphériques. Elle peut être influencée par la présence de plusieurs facteurs de prédisposition (ex. : le niveau d’exercice (166, 167), l’âge (168)), des stress cellulaires (ex. : hypoxie et le stress oxydant) et des facteurs de croissance (ex. : VEGF-A, «placental growth factor» (PlGF) et angiopoïetine (Ang-1)) (169). En condition d’hypoxie, l’angiogenèse est amorcée par la sécrétion de facteurs angiogéniques comme VEGF-A (Figure 6). VEGF-A est transcrit lorsque HIF-1α rejoint son HRE situé en amont du gène de VEGF-A (170). VEGF-A se lie à son récepteur « vascular endothelial growth factor receptor-2 » (VEGFR-2) présent à la surface des cellules endothéliales et ce couplage se traduit par le recrutement des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales forment l’endothélium, paroi interne des vaisseaux sanguins et recrutent des cellules endothéliales progénitrices afin de prolonger les capillaires (Figure 6) (169). 31 Figure 6 Processus angiogénique dans un tissu (171) 1.6.2 L’angiogenèse au niveau des muscles locomoteurs dans la MPOC Une dysfonction angiogénique contribue au développement de maladies dont l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) (172-174). Différentes études ont observé une diminution du nombre de capillaires par type de fibres et une diminution du nombre de capillaires rapporté par la surface de fibre chez des patients atteints d’une MPOC modérée à sévère (103, 104, 175). Des changements dans le niveau d’expression de VEGF-A ont été observés chez des patients atteints d’une MPOC GOLD 2-3 (176, 177). Une récente étude a démontré qu’une diminution de l’ARNm de VEGF-A est observée dès le stade GOLD 1 (178). Ces changements indiquent la présence de défauts dans la capillarisation des muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC et pourraient contribuer au développement de l’atrophie musculaire (179). 32 1.6.3 La pertinence d’étudier l’angiogenèse Une diminution du nombre de capillaires et du niveau d’expression de VEGF a été observée dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC. Tout comme la myogenèse, les mécanismes qui permettent de relier ces observations et l’atrophie musculaire ne sont pas connus dans la MPOC. Par ailleurs, certaines études ont démontré que l’injection de VEGF dans un modèle de souris contribue à la restauration de la masse musculaire et semble être une avenue thérapeutique intéressante pour la dystrophie de Duchenne (180, 181). L’étude de la régulation de VEGF dans le vastus lateralis dans la MPOC est pertinente afin d’avoir une meilleure compréhension du rôle de l’angiogenèse dans l’atrophie musculaire. 1.7 Les microARN 1.7.1 Généralités Deux grandes classes d’ARN assurent le maintien de l’homéostasie cellulaire, soit les ARN codant (ARNc) ou ARN messager (ARNm) et les ARN non codant (ARNnc). Les ARNm sont traduits en protéines alors que les ARNnc regroupent tous les autres ARN nécessaires à la machinerie responsable de la traduction des protéines. Différents types d’ARNnc contrôlent la traduction des protéines dont l’ARN de transfert (ARNt), l’ARN ribosomal (ARNr) et les microARN (miR). Les miR sont des petites molécules d’ARN possédant entre 21 et 25 nucléotides (182). Les miR s’attachent au bout «three prime untranslated region» (3’— UTR) de l’ARNm afin d’empêcher la synthèse des protéines par la répression traductionnelle ou par la dégradation de l’ARNm (183-185). Le premier miR, lin-4, a été découvert chez le nématode Caenorhabditis elegans en 1993 (186). Depuis ce temps, plusieurs études ont permis de découvrir de nouveaux miR et d’identifier leur rôle dans le génome humain. Chez l’humain, le génome compte plus de 1900 miR (187) qui pourraient réguler l’expression de 30% des gènes (188). Dans le muscle squelettique, l’expression des miR peut être modifiée sous différentes conditions comme l’âge (189), l’exercice (190), pendant l’angiogenèse et la myogenèse musculaire. L’expression de certains miR est altérée lors du développement d’une maladie tel que miR-1 dans la MPOC, miR-206 dans la dystrophie myotonique de type I (DMI) et miR206 la sclérose latérale amyotrophique (SLA) (185, 191, 192). 33 1.7.2 La biogenèse des microARN Le gène codant pour un miR se situe dans l’intron d’un gène codant pour des protéines ou dans l’exon d’un gène d’ARNnc (193). Le miR est initialement transcrit par un ARN polymérase de type II en un miR primaire (PRI-miR) (194). Le PRI-miR subit un premier clivage par l’endonucléase de type III Drosha et par le microprocesseur « DiGeorge Syndrome Critical Region 8 » (DGCR8) comme le montre la Figure 7. DGCR8 se lie sur la structure en forme de boucle et sert de guide pour le clivage du PRI-miR en un miR précurseur (PRÉ-miR) (195). Ce PRÉ-miR est transporté du noyau vers le cytoplasme avec l’aide d’un récepteur nucléaire Exportine 5. Dans le cytoplasme, le PRÉ-miR double brins est clivé par une deuxième endonucléase de type III, DICER, afin d’obtenir un miR mature et un miR complémentaire. Ce brin complémentaire est dégradé alors que le brin mature et DICER s’associent au complexe « RNA-induced silencing complex » (RISC). Le complexe RISC contient une protéine argonaute qui se lie au miR pour permettre l’attachement du miR sur le bout 3’UTR de l’ARNm ciblé et empêche la production de protéines (Figure 7) (196). De plus, un miR peut cibler plus d’un ARNm différent et à l’inverse, un ARNm peut être influencé par plusieurs miR. 34 Figure 7 Biogenèse des miR (197) Abréviations : 3’UTR, three prime untranslated region ; Ago, Argonaute ; DGCR8, DiGeorge Syndrome Critical Region 8 ; DNA, Deoxyribonucleic acid ; mRNA, messenger Ribonucleic acid ; miR, MicroARN ; PRImiR, miR primaire ; PRE-miR, miR précurseur ; RISC, RNA-induced silencing complex. 35 1.7.3 Spécificité des microARN Certains miR sont exprimés spécifiquement dans un tissu. Différentes catégories de miR ont été répertoriées soit les « angiogenesis-specific miR » (angiomiR) impliqués dans la régulation de l’angiogenèse et les « muscle-specific mir » (myomiR) exprimés dans les muscles squelettiques et cardiaques (198). 1.7.3.1 MyomiR Les myomiR sont présents dans les muscles squelettiques et cardiaques (199202). Les myomiR, dont miR-1, miR-133a, miR-206, miR-208a, miR-208b, miR-499 et miR-486, sont impliqués dans le maintien et le développement de la masse musculaire (190). Dans le cadre de ce projet, les myomiR miR-1, miR-133a et miR-206 y ont été étudiés et semblent être impliqués dans la régulation de plusieurs gènes dont IGF-1, HDAC4, VEGF-A et IGFR-1 (198, 201-204). MiR-1 est situé sur le chromosome 18 alors que miR-206 se trouve sur le chromosome 6 (185, 205, 206). IGF-1 est un facteur de croissance et est impliqué dans la différenciation de la plupart des types de cellules (207). Une diminution de l’expression miR-1 et de miR-206 favorise l’expression d’IGF-1 lors de la différentiation des myoblastes de souris (C2C12) en myotubes (185, 202, 206, 208). MiR-1 inhibe aussi l’expression de l’histone désacétylase 4 (HDAC4) qui est un répresseur transcriptionnel de certains gènes dont le facteur de transcription myogénique « myocyte enhancer factor 2 » (MEF2) et la protéine follistatine (201, 209212). Le niveau d’expressions protéiques de HDAC4 est diminué dans le vastus lateralis chez les patients atteints d’une MPOC sévère lorsqu’ils sont comparés à des sujets contrôles (192). Une diminution de l’expression de miR-1 entraîne l’activation d’HDAC4 et conduit à l’inhibition de la différenciation cellulaire au cours de la myogenèse (213, 214). Ce phénomène pourrait réduire la capacité des cellules satellites de participer à la réparation du vastus lateralis chez les patients atteints d’une MPOC (164). MiR-1 et miR-206 sont également impliqués dans la répression de VEGF-A chez le poisson-zèbre (215). VEGF-A est un facteur de croissance proangiogénique, 36 sensible à l’hypoxie et à l’exercice, et est exprimé dans toutes les cellules musculaires (216, 217). La répression de VEGF-A empêche l’activation de l’angiogenèse dans les muscles périphériques. Une augmentation de l’expression de miR-1 et de miR-206 pourrait expliquer l’hypothèse selon laquelle l’angiogenèse semble défectueuse dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC. MiR-133a se trouve sur le chromosome 18 et est un répresseur posttranscriptionnel du récepteur IGFR-1 lors de la différentiation des C2C12 en myotubes (218-220). Une augmentation de l’expression de miR-133a et une diminution du niveau d’expression protéique d’IGFR-1 conduisent à une diminution de la phosphorylation d’AKT au cours de la myogenèse des C2C12 (219). Une diminution de l’expression de miR-133a pourrait expliquer le résultat selon lequel la phosphorylation d’AKT est augmentée dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC qui ont une plus faible masse musculaire. 1.7.3.2 AngiomiR Les angiomiR sont des régulateurs de l’angiogenèse et sont retrouvés dans les cellules endothéliales (221). Parmi ces angiomiR, miR-126 semble jouer un rôle primordial dans l’activation de l’angiogenèse. Il se retrouve sur le chromosome 9 et inhibe l’activité de « sprouty-related, EVH1 domain containing 1 » (SPRED1). SPRED1 est un répresseur angiogénique et contrôle négativement l’expression des MAPK dans les cellules endothéliales (187, 222). Une diminution de l’expression de miR-126 contribue à altérer la réponse angiogénique dans le vastus lateralis de patients atteints d’HTAP (223), mais le rôle de ce miR dans les muscles locomoteurs des gens atteints d’une MPOC n’est pas connu. 1.7.4 Les miR dans le sang et le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC Une augmentation de l’expression des miR-1, miR-133a et miR-206 a été observée dans le sang de patients atteints d’une MPOC de stade sévère (224). Contrairement aux résultats de cette étude, le niveau d’expression de miR-1 est diminué et les niveaux de miR-133a et miR-206 sont inchangés dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC de stade sévère en comparaison avec des sujets contrôles (192). Ces miR méritent tout de même d’être caractérisés dans une 37 MPOC de stade léger en comparaison avec une cohorte de sujets contrôles ayant une fonction pulmonaire normale et des sujets ayant une MPOC de stade modéré à sévère. La présence de problèmes musculaires devient plus grande au fur et à mesure que la sévérité de la maladie augmente et il est important de savoir si les miR sont impliqués dans le développement de ces atteintes musculaires. De plus, l’étude de ces miR au niveau sanguin permettrait de détecter si des changements dans leur expression surviennent au cours d’un stade précis de la maladie. Les facteurs influençant le niveau d’expression des miR dans le vastus lateralis ou le sang des patients atteints d’une MPOC ne sont pas connus. Quelques études ont démontré que la fumée de cigarette influence l’expression de différents miR dans les poumons, le foie, les reins et le colon et est associée à l’activation de certains miR impliqués dans le cancer du poumon (225, 226). L’exposition à la fumée de cigarette est un facteur important dans le développement de la MPOC et est connue pour stimuler l’activation de marqueurs de stress oxydant dans les muscles locomoteurs de fumeurs sains et d’animaux (1, 227, 228). 1.7.5 Applications diagnostiques et thérapeutiques 1.7.5.1 Applications diagnostiques Un biomarqueur est une caractéristique biologique mesurable et doit être lié à une condition normale ou une maladie. Les miR sont des biomarqueurs potentiels dans le diagnostic de maladie, car l’expression des miR est modifiée dans certaines maladies (187). Des changements dans l’expression de certains miR ont été détectés dans les tissus pulmonaires, le plasma, la salive et le quadriceps de patients atteints d’une MPOC (187, 188, 192, 224, 229, 230). Des études sur l’expression de ces miR pourraient permettre de diagnostiquer de façon précoce les signes avant-coureurs d’une atteinte musculaire. 1.7.5.2 Applications thérapeutiques Deux approches thérapeutiques ont été développées dans le but de renverser l’impact négatif des miR dans une maladie (185, 191, 192). La première approche consiste à inhiber l’expression des miR par l’utilisation d’oligonucléotides antisens (ASO) ou de miR éponges (231). Les ASO s’associent avec les miR par appariement 38 des paires de bases et ceci a pour effet d’empêcher le miR de joindre le complexe RISC (231). Trois classes d’ASO peuvent être utilisées soit, les acides nucléiques bloquants (LNA), les oligonucléotides anti-miR (AMO) et des inhibiteurs de miR (antagomiR) (231-234). L’utilisation de la méthode des miR éponges consiste à ajouter des vecteurs contenant des cibles artificielles des miR afin d’empêcher les miR de s’associer à leur cible naturelle (235, 236). La deuxième approche consiste à rétablir l’expression des miR par l’ajout de mimiques des miR. Cette méthode implique l’injection localisée d’un mimique du miR d’intérêt et a été étudiée dans un modèle de muscle squelettique de rat (237). 1.7.6 La pertinence d’étudier les miR Une caractérisation des miR-1, miR-133a, miR-126 et miR-206 permettrait d’établir une comparaison entre les stades léger et modéré à sévère dans la MPOC et des sujets contrôles. De plus, la caractérisation de ces miR et de leurs protéines cibles contribuerait à une meilleure compréhension de la myogenèse et de l’angiogenèse dans l’atrophie musculaire des patients atteints d’une MPOC. Une modulation de l’expression de ces miR permettrait de suivre l’évolution de la maladie et de prévenir l’installation des défauts myogéniques et angiogéniques dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC. 39 CHAPITRE II PROBLÉMATIQUE, OBJECTIFS ET HYPOTHÈSES DE RECHERCHE 41 Chapitre 2 : Problématique, objectifs et hypothèses de recherche Ce mémoire a pour but de mieux comprendre les mécanismes cellulaires qui pourraient contribuer au phénomène d’atteinte du vastus lateralis des gens atteints de stade léger à sévère de la MPOC par l’étude de 1) la myogenèse et de 2) l’angiogenèse. La myogenèse et l’angiogenèse semblent être défectueuses dans le vastus lateralis des patients atteints de la MPOC. Des changements dans la régulation de ces processus pourraient être causés par une modification dans l’expression des miR-1, miR-126, miR-133a et miR-206. Puisque très peu de données sont disponibles, l’étude de ces miR permettra d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de la myogenèse et de l’angiogenèse sur la détérioration de la masse musculaire dans le vastus lateralis des gens atteints d’une MPOC. Objectif général : Caractériser les niveaux d’expression des miR et de leurs protéines cibles dans le vastus lateralis de patients atteints d’une MPOC de stade léger à sévère et de sujets témoins ayant une fonction pulmonaire normale. Hypothèse générale : Une modification de l’expression de certains miR conduit à des changements dans la régulation de la myogenèse et de l’angiogenèse dans le vastus lateralis des patients atteints de MPOC comparativement aux sujets contrôles ayant une fonction pulmonaire normale. 43 À partir de biopsies musculaires (Figure 8): Objectif 1 Mesurer les niveaux d’expression de miR-1, miR-126, miR-133a et miR-206. Hypothèses Dans le vastus lateralis des patients atteints de MPOC comparativement aux sujets contrôles ayant une fonction pulmonaire normale : 1) Une augmentation des niveaux d’expression de miR-1 et de miR-206 sera mesurée; 2) Une diminution des niveaux d’expression de miR-133a et de miR-126 sera mesurée. Objectif 2 Mesurer les niveaux d’expression d’IGF-1, d’AKT, de «phosphorylated-AKT» (pAKT), d’HDAC4, de SPRED1 et de VEGF-A. Hypothèses Dans le vastus lateralis des patients atteints de MPOC comparativement aux sujets contrôles ayant une fonction pulmonaire normale : 1) Une augmentation des niveaux d’expression de pAKT et de SPRED1 sera mesurée; 2) Une diminution des niveaux d’expression d’IGF-1, d’HDAC4 et de VEGF sera mesurée; 3) Un niveau inchangé de l’expression de la protéine AKT sera observé. 44 Figure 8 Schéma expérimental : Le rôle des miR-1, miR-126, miR-133a et miR-206 dans les muscles locomoteurs des patients atteints d'une MPOC 45 Tableau 6 Résumé des hypothèses spécifiques en fonction des sujets contrôles Facteurs à mesurer (hypothèse en fonction des sujets contrôles) MiR MPOC GOLD 1 (stade léger) MPOC GOLD 2-3 (stade modéré à sévère) MiR-1 MiR-133a MiR-206 MiR-126 Protéines cibles IGF-1 HDAC4 AKT pAKT SPRED1 VEGF-A 46 = = À partir de cellules musculaires primaires (SkMC) en culture : Objectif 3 Évaluer le rôle de l’ajout de mimiques ou d’inhibiteurs de miR-1 sur le niveau d’expression de VEGF-A. Hypothèses Dans les cellules musculaires primaires (SkMC) (Figure 9) : 1) La transfection de mimiques de miR-1 (en vert) conduira à une diminution de l’expression de VEGF; 2) À l’inverse, la transfection d’inhibiteurs de miR-1 (en rouge) conduira à une augmentation de l’expression de VEGF. VEGF VEGF VEGF VEGF Mimique miR-1 Inhibiteur miR-1 Figure 9 Schéma expérimental : Impact de miR-1 sur l'expression de VEGF dans un modèle de cellules musculaires (SkMC) 47 CHAPITRE III MATÉRIEL ET MÉTHODES 49 Chapitre 3 : Matériel et méthodes 3.1 Recrutement des sujets Dans le cadre de ce projet, 36 patients atteints d’une MPOC, dont 27 avaient une MPOC de stade GOLD 1 et 9 avaient une MPOC de stade GOLD 2-3, et 20 sujets témoins ont été recrutés. Les participants ayant une MPOC de stade GOLD 2 et 3 ont été mis ensemble en raison de leur nombre. Les participants inclus dans l’étude devaient avoir fumé pendant plus de 10 ans, être âgés entre 50 et 80 ans et être sédentaires (238-240). Les sujets qui présentaient les conditions suivantes ont été exclus de l’étude : certains traitements (oxygénothérapie et/ou corticostéroïdes (< 2 mois)), en exacerbation (< 2 mois), des problèmes neuromusculaires au niveau des muscles locomoteurs, des problèmes cardiovasculaires, d’autres problèmes respiratoires, le diabète, le cancer ou des maladies rénales. Tous les participants ont signé le formulaire de consentement approuvé par le Comité d’éthique de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec (# 20895). 3.2. Tests de fonctions pulmonaires et mesures anthropométriques Une spirométrie a été réalisée selon la méthode usuelle et standardisée (241, 242). Le poids et la taille de chaque participant ont été mesurés selon les méthodes standards (243). Les mesures de la masse maigre et de la masse grasse ont été obtenues avec l’aide d’une balance à bioimpédance (In Body 520, Biospace Co., Berverly Hills, CA). 3.3 Une biopsie musculaire Une biopsie musculaire du vastus lateralis a été réalisée sur la jambe droite de tous les participants. Pour des raisons d’accessibilité et de son importance, le vastus lateralis est muscle locomoteur le plus étudié chez ces patients. Le vastus lateralis des patients atteints de MPOC est marqué par des changements macroscopiques et microscopiques et dans la régulation de sa balance de synthèse et de dégradation protéiques (section 1.4). La méthode de Bergström est utilisée dans notre laboratoire depuis plusieurs années et consiste à prélever un échantillon de muscle d’environ 150 mg dans le vastus lateralis (110, 244). L’échantillon de muscle est immédiatement 51 congelé dans l’azote liquide puis, conservé dans un congélateur à - 80°C pour les analyses futures. 3.4 Culture de cellules et transfection de miR Les cellules SkMC (human Skeletal muscle cells, Lonza, Walkersville, MD, É.U.) ont été maintenues en culture dans un milieu SkBM® (Lonza) additionné de l’hEGF, fétuine, albumine de sérum bovin (BSA), dexaméthasone, insuline, gentamicine - amphotéricine et pénicilline 50 U/ml, streptomycine 50 µg/ml (HyClone, Logan, UT, É.-U.) et incubées à 37oC, dans un incubateur à atmosphère humide, 5% CO2. Après une heure d’incubation, les cellules ont été transfectées par précipitation au calcium-phosphate, avec 3,33 ηM du mimique de miR-1 (Life Technologies, Burlington, ON, Canada), 3,33 ηM de l’inhibiteur de miR-1 (Life Technologies) ou 3,33 ηM de leur contrôle négatif (Life Technologies) dans 250 µl de CaCl2 250 mM. Le mimique de miR-1 ou l’inhibiteur de miR-1 a été transfecté dans les SkMC dans le but d’évaluer si la présence de miR-1 induit respectivement une réduction ou une augmentation de l’expression de VEGF. Les concentrations de mimiques et d’inhibiteurs ont été déterminées par des expériences préalables de courbes doseréponse (résultats non montrés). L’efficacité de la transfection a été vérifiée par RTqPCR. 3.5 Extractions d’ARN et Reverse-Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) L’ARN total a été extrait à partir d’environ 15 mg de tissu musculaire congelé ou de SkMC dans le réactif TRIzol® (Life Technologies). L’intégrité de chaque échantillon d’ARN total a été vérifiée par une électrophorèse sur gel d’agarose dénaturant. Les RT-qPCR ont été réalisés dans un Rotor-GeneTM 6000 (Corbett Life Science, San Francisco, CA, É.-U.). Les amorces ont été optimisées et validées avec des courbes standards afin d’obtenir des rendements entre 90-105%. La quantificative relative a été calculée selon les méthodes de correction pour les différences de rendement d’amplification et l’utilisation de plusieurs gènes de références (245, 246). 52 3.5.1 RT-qPCR pour l’ARNm Les ADNc ont été préparés à partir de 1 µg d’ARN total avec le kit QuantitectTM reverse transcritase Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). Les niveaux d’expression des ARNm ont été obtenus en utilisant la solution PerfeCTa® SYBR® Green SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, É.-U.). Des amorces spécifiques (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, É.-U.) ont été utilisées pour mesurer les gènes d’intérêt (IGF-1, HDAC4, SPRED1 et VEGF-A) et pour les trois gènes de référence (RPLP0, HPRT1 et GNB2L1) (Tableau 7). La stabilité de l’expression des gènes de référence a été vérifiée avec l’aide de l’algorithme geNorm et les gènes ont été sélectionnés lorsque la valeur M était ˂0,5 (246). Les amplicons ont été séquencés afin de confirmer l’identité du fragment. Une courbe de dissociation a été réalisée lors de chaque essai de RT-qPCR afin de s’assurer de la spécificité du produit de PCR. 53 Tableau 7 Séquences des amorces utilisées en RT-qPCR Gène IGF-1-F IGF-1-R HDAC4-F HDAC4-R SPRED1-F SPRED1-R VEGF-A-F VEGF-A-R HPRT1-F HPRT1-R GNB2L1-F GNB2L1-R RPLP0-F RPLP0-R 54 Séquences des amorces (5’ à 3’) GCA GAT AGA GCC TGC GCA ATG G AAG GTG AGC AGG CAC AGC GC TGG AAA TGC AGT GGT TCA GAT AGC TCA AGA ACA AGG AGA AGG GTC CTG CTG ATG CTA GGG CT GCC TGG CTG ACC AAA TGT TA GCA GCT TGA GTT AAA CGA ACG GGT TCC CGA AAC CCT GAG GTA TTC ATT ATA GTC AAG GGC ATA TCC AGA TGG TCA AGG TCG CAA G TGG TCT TCA GCT TGC AGT TAG GCA AAT ACA CTG TCC AGG ATG A TCG TCT TTA AAC CCT GCG TG TGT CTG CTC CCA CAA TGA AAC Taille du produit (bp) Conditions PCR Dénaturation Hybridation 267 95oC, 15 s 60oC, 45 s 129 95oC, 15 s 60oC, 30 s 290 95oC, 15 s 60°C, 45 s 94 95°C, 15 s 60oC, 30 s 128 95oC, 15 s 60°C, 30 s 147 95°C, 15 s 60°C, 30 s 143 95oC, 15 s 60°C, 30 s 3.5.2 RT-PCR pour les miR Les ADNc ont été préparés à partir de 10 ng d’ARN total avec le kit Taqman® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies). Les niveaux d’expression des miR ont été obtenus en utilisant le kit Taqman® Universal Master Mix, No AmpErase® UNG (Life Technologies). Des amorces spécifiques Taqman® MicroRNA Assays (Life Technologies) ont été utilisées pour mesurer les miR d’intérêt (miR-1, miR-126, miR-133a et miR-206) et les trois gènes de référence (U6, RNU44 et RNU48) (Tableau 8). La stabilité de l’expression des gènes de référence a été vérifiée avec l’aide de l’algorithme geNorm et les gènes ont été sélectionnés lorsque la valeur M était ˂0,5 (246). Tableau 8 Amorces utilisées pour la quantification RT-qPCR des miR miR Essai ID Numéro miRBase MiR spécifique au muscle squelettique, myomiR has-miR-1 has-miR-133a 002222 002246 MIMAT0000416 MIMAT0000427 Has-miR-206 000510 MIMAT0000462 MiR spécifique à l’angiogenèse, angiomiR has-miR-126 002228 MIMAT0000445 001973 001094 001006 NR_004394 NR_002750 NR_002745 Gènes de référence U6 snRNA, RNU44 RNU48 55 3.6 Immunobuvardage par Western blot 3.6.1 Extraction des protéines à partir des échantillons de muscle Les protéines ont été extraites à partir de 30 mg de tissu musculaire congelé dans un tampon d’extraction [5 mM de Tris pH 8,0, 1% de Glycérol, 1 mM d’EDTA, 1 mM d’EGTA, 1 mM de 2-Mercaptoéthanol, d’un cocktail d’inhibiteur de protéases (Sigma, Oakville, ON, Canada), d’un cocktail d’inhibiteur de phosphatases 2 (Sigma) et d’un inhibiteur de phosphatases (set III, VWR, Montréal, Canada)] et ont été homogénéisées avec l’aide d’un Polytron PowerGen 125 (Omni International, Marietta, GA, É.-U.). 3.6.2 Extraction des protéines à partir des SkMC Les protéines ont été extraites des SkMC dans un tampon d’extraction RIPA [25 mM de Tris pH 7,6, 150 mM de NaCl, 1% de NP40, 1% de sodium déoxycholate, 0,1 % de SDS, et d’un cocktail d’inhibiteur de protéases et d’inhibiteur de phosphatases (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada)] et ont été homogénéisées aux ultrasons pendant cinq secondes trois fois. 3.6.3 Quantification des protéines et électrophorèse Le dosage des protéines a été obtenu avec le kit DC proteins assay (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada). L’électrophorèse a été réalisée sur des gels 10% miniprotean® TGX Stain-Free™ (Bio-Rad). Les membranes de nitrocellulose ont été bloquées dans une solution de PBS-T (Phosphate-buffer saline - tween-20 0,5%) contenant 0,1% de lait écrémé ou de BSA sur l’appareil SNAP ID® 2.0 selon le protocole du fabricant (EMD Millipore, Bedford, MA, É.-U.). Par la suite, les membranes ont été incubées pendant la nuit à une température de 4oC avec un des anticorps primaires suivant : un anticorps polyclonal de lapin anti-humain pour pAKT (polyclonal rabbit anti-human, Cell signaling technology, Danvers, MA, É.-U.), un anticorps polyclonal de lapin anti-humain pour AKT (polyclonal rabbit anti-human, Cell signaling technology) et un anticorps polyclonal de lapin anti-humain pour VEGF (polyclonal rabbit anti-human, Abcam, Toronto, ON, Canada). Des lavages ont ensuite été effectués dans le PBS-T. Les membranes ont été incubées avec l’anticorps secondaire (IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG (H+L), Mandel, Guelph, ON, Canada) sur l’appareil SNAP ID® 2.0 (EMD Millipore) et ont été lavées dans le PBS. Les 56 membranes ont été exposées sur l’appareil d’imagerie Odyssey® (LI-COR, Mandel) afin de détecter les protéines dans l’infrarouge. La densité des bandes a été obtenue avec l’aide du logiciel Image Studio Lite (Version 4.0, LI-COR, Mandel) et a été normalisée sur la densité de protéines totales mises sur gel selon le protocole du fabricant pour les gels TGX Stain-Free (Bio-Rad) (247, 248). 3.7 Immunofluorescence pour les fibres musculaires Des cryocoupes musculaires de 10 µm ont été fixées dans une solution froide d’acétone et de méthanol 60/40 (v/v) à une température de -20°C pendant 10 minutes. Puis, elles ont été lavées avec une solution de PBS, ont été incubées avec une solution bloquante contenant 10% de sérum de cheval pendant 30 minutes. Les coupes ont été incubées pendant 1 heure à température ambiante avec les anticorps primaires suivant : un anticorps monoclonal (IgM) de souris anti-humain pour MyHCI [dilué 1:500] (monoclonal mouse (IgM) anti-human MHCI, Developmental Studies Hybridoma Bank DSHB, University of Iowa, É.-U.), un anticorps monoclonal (IgG1) de souris anti-humain pour MyHC-2A [dilué 1:2000] (monoclonal mouse (IgG1) antihuman MyHC-2A, DSHB), un anticorps polyclonal de lapin anti-laminine [dilué 1:50] (polyclonal rabbit anti-laminin, Dako, Burlington, ON, Canada) et ont été lavées avec du PBS. Les cryocoupes ont été incubées pendant 1 heure avec les anticorps secondaires suivant : un anticorps de chèvre anti-souris (IgG [Fc]) Dylight 488 [dilué 1:250] (goat anti-mouse (IgG [Fc]) « Dylight » 488, Rockland, Limerick, PA, É.-U.), un anticorps de chèvre anti-souris (IgM) « Dylight » 550 [dilué 1:1000] (goat anti-mouse (IgM) Dylight 550, Fisher) et un anticorps de chèvre anti-lapin (IgG [H+L]) « Dylight » 350 [dilué 1:100] (goat anti-rabbit (IgG [H+L]) Dylight 350, Fisher). Les cryocoupes musculaires ont été lavées une dernière fois avec du PBS et immobilisées avec un milieu de montage Lab Vision™ Permafluor™ Aqueous Mounting Medium (Fisher) et une lamelle. Les images ont été prises avec l’aide d’un microscope Olympus BX50 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan). Le décompte des fibres musculaires a été réalisé avec l’aide du logiciel d’analyse d’image ImageJ (version 1.49s for OS X, National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, É.-U.). L’identification du type de fibres musculaires s’est faite selon les différentes couleurs: type I (coloration rouge) et 57 type II (coloration verte) (249). L’aire transversale de chaque fibre musculaire a été obtenue grâce à l’anticorps laminine (coloration bleue). La proportion de l’aire occupée par un type de fibre se définit par le pourcentage d’aire occupée par un type de fibre par rapport à l’aire totale occupée par l’ensemble des fibres musculaires. 3.8 Immunofluorescence pour les capillaires Pour le décompte des capillaires, des cryocoupes musculaires ont été préparées et analysées comme l’indique le protocole pour le marquage des fibres musculaires (section 3.7). Les coupes ont été incubées avec les anticorps primaires suivant : un anticorps monoclonal de souris anti-humain de CD31 pour les cellules endothéliales [dilué 1:20] (monoclonal mouse anti-human CD31 endothelial cell Clone JC70OA, Dako), un anticorps monoclonal (IgM) de souris anti-humain pour le MyHCI [dilué 1:500] (monoclonal mouse (IgM) anti-human MHCI, DSHB) et un anticorps polyclonal de lapin anti-laminine [dilué 1:75] (polyclonal rabbit anti-Laminin, Dako). Ensuite, les cryocoupes ont été incubées avec les anticorps secondaires suivant : un anticorps de chèvre anti-souris (IgG [Fc]) «Dylight» 488 [dilué 1:75] (goat anti-mouse (IgG [Fc]) Dylight 488, Rockland), un anticorps monoclonal (IgM) de chèvre anti-souris «Dylight» 550 [dilué 1:1000] (goat anti-mouse (IgM) Dylight, Fisher) et un anticorps de chèvre anti-lapin (IgG [H+L]) «Dylight» 350 [dilué 1:100] (goat anti-rabbit (IgG [H+L]) Dylight 350, Fisher). L’identification des différentes structures de la cryocoupe s’est faite selon les colorations suivantes : les capillaires (coloration verte), type I (coloration rouge) et la laminine (coloration bleue). Le nombre de capillaires par fibre musculaire a été calculé selon le ratio du nombre de capillaires sur l’aire de la fibre (capillaires/mm2) et le ratio du nombre de capillaires sur le périmètre de la fibre (capillaires/mm). De plus, la densité des capillaires représente le ratio du nombre de capillaires sur l’aire totale du tissu musculaire (capillaires/mm2 de tissus). 58 3.9 Analyses statistiques Les données sont présentées selon la moyenne ± SEM pour les variables continues. Selon la distribution des données, l’ANOVA à un facteur (post-hoc Tukey) ou le test Kruskall-Wallis ont été utilisés pour comparer les groupes. La normalité a été vérifiée avec l’aide d’un test Shapiro-Wilk et l’homogénéité des variances a été vérifiée avec un test de Levene. L’analyse des corrélations de Spearman a été faite dans le but de vérifier l’association entre l’expression des miR, les mesures d’angiogenèse (VEGF, microcirculation musculaire) et les mesures de la myogenèse (IGF-1, HDAC4, SPRED1, pAKT et AKT). Les résultats sont considérés significatifs lorsque la valeur p < 0,05. Les analyses statistiques ont été réalisées avec l’aide du logiciel statistique SPSS version 22.0. 59 CHAPITRE IV RÉSULTATS 61 Chapitre 4: Résultats 4.1 Caractéristiques des participants Les données de fonctions pulmonaires et anthropométriques de tous les participants sont répertoriées dans le Tableau 9. Lors du recrutement des participants, les groupes ont été appariés pour les variables confondantes afin d’éviter que ces valeurs induisent un biais de sélection lors de notre analyse de données. Cependant, l’âge des patients atteints d’une MPOC de stade modéré à sévère est significativement plus élevé que l’âge du groupe de sujets contrôles. De plus, la proportion des hommes est plus élevée chez le groupe MPOC modérée à sévère que chez les contrôles. Tableau 9 Caractéristiques des sujets de l'étude Témoins MPOC Léger (n = 27) (n = 20) Modérée à sévère (n = 9) 62 13 38 ± / ± 2 7 4 64 18 44 ± / ± 1 9 4 69 8 59 ± / ± 2a 1 12 IMC (kg/m ) Masse maigre (kg) Indice de masse maigre (kg/m2) Masse grasse (kg) Indice de masse grasse (kg/m2) Fonction pulmonaire 26,9 ± 0,9 27,0 ± 0,7 25,9 ± 0,9 55,0 ± 2,5 53,5 ± 2,4 49,3 ± 3,0 19,1 ± 0,6 18,6 ± 0,5 17,3 ± 0,5 22,9 ± 2,0 23,4 ± 1,6 24,6 ± 2,2 8,1 ± 0,8 8,3 ± 0,5 8,6 ± 0,5 VEMS (L) VEMS (% de la prédite) VEMS/CVF (%) 3,13 ± 0,15 2,57 ± 0,12a 1,64 ± 0,60a,b 114 ± 5 100 ± 2a 51 ± 4a,b 75 ± 1 58 ± 1a 52 ± 5a Âge (années) Sexe (H/F) Paquet-années (p-a) 2 Les valeurs sont représentées selon la moyenne ± SEM. a Différence statistiquement significative en comparaison avec les contrôles, p ≤ 0,05. b Différence statistiquement significative en comparaison avec les MPOC légers, p ≤ 0,05. Définition des abréviations : H, homme; F, femme. 63 Les données liées à la distribution, l’aire occupée et la proportion de l’aire occupée par type de fibres sont présentées dans le Tableau 10 et sont similaires entre les groupes. Les résultats des capillaires seront discutés dans la section 4.3. Tableau 10 Caractérisation des fibres musculaires et des capillaires dans le vastus lateralis Témoins MPOC Léger (n = 27) (n = 20) Modérée à sévère (n = 9) Distribution par type de fibres Fibres de type I (% total des fibres) Fibres de type II (% total des fibres) 55 ± 3 62 ± 3 59 ± 4 45 ± 3 38 ± 3 41 ± 4 L’aire occupée par type de fibres 2 Fibres de type I (µm ) 3895 ± 319 4352 ± 283 3879 ± 867 2 2894 ± 240 3077 ± 239 2635 ± 450 Fibres de type II (µm ) Proportion de l’aire occupée par type de fibres Fibres de type I (% aire totale) Fibres de type II (% aire totale) 62 ± 3 70 ± 2 67 ± 6 38 ± 3 30 ± 2 33 ± 6 1,7 ± 0,1 1,6 ± 0,1 1,8 ± 0,3 494 ± 22 438 ± 15 511 ± 53 6,03 ± 0,24 5,68 ± 0,21 6,33 ± 0,41 353 ± 17 328 ± 12 318 ± 15 Capillaires musculaires Capillaires par fibre Capillaires sur l’aire de la fibre musculaire 2 (capillaires/mm ) Capillaires sur le périmètre de la fibre musculaire (capillaires/mm) Densité des capillaires 2 (capillaires/mm ) Les valeurs sont représentées selon la moyenne ± SEM. 64 4.2 L’expression des miR dans le vastus lateralis L’expression de miR-1 est 63% (p ≤ 0,001) moins élevée chez les patients atteints d’une MPOC de stade léger comparativement aux sujets témoins (Figure 10A). Les niveaux d’expression de miR-1 et de miR-206 sont respectivement diminués de 69% (p ≤ 0,001) et 40% (p = 0,02) chez les patients atteints d’une MPOC de stade léger lorsqu’ils sont comparés aux patients atteints d’une MPOC de stade modéré à sévère (Figure 10, A et B). Aucune différence n’a été observée entre les groupes pour les miR-133a et miR-126 (Figure 10, C et D). A B C D Figure 10 L'expression relative de miR-1 (A), miR-206 (B), miR-133a (C) et miR-126 (D) dans le vastus lateralis des sujets contrôles et de patients atteints d'une MPOC de stade léger (GOLD 1) ou modérée à sévère (GOLD 2-3). Les résultats sont représentés selon la moyenne ± SEM. 65 4.3 Microcirculation dans le vastus lateralis Les résultats pour la capillarisation sont semblables entre les différents groupes et ce, même si une correction a été faite en fonction de l’aire, du périmètre de chaque fibre et de la densité des capillaires (Tableau 10). Le niveau d’expression protéique de VEGF augmente significativement de 31% chez les patients atteints d’une MPOC de stade léger lorsqu’ils sont comparés avec les sujets témoins (p = 0,006, Figure 11B). À l’inverse, les niveaux d’expression de l’ARNm et protéique de VEGF diminuent significativement chez les patients atteints d’une MPOC de stade modéré à sévère en comparaison avec les sujets témoins (60% et 64% respectivement; p = 0,002) et les patients atteints d’une MPOC de stade léger (64% et 75% respectivement, p ≤ 0,001) (Figure 11, A et B). 66 A B Figure 11 L’expression relative de l’ARNm de VEGF-A (A) et l’expression relative protéique de VEGF (B) dans le vastus lateralis de sujets contrôles et de patients atteints d’une MPOC de stade léger (GOLD 1) ou modérée à sévère (GOLD 2-3). Chaque bande a été normalisée en fonction de la quantité de protéines totales qui a été déposée sur le gel. Les résultats sont représentés selon la moyenne ± SEM. 67 Les analyses de régression démontrent que le niveau d’expression de miR-1 est négativement associé au niveau d’expression de l’ARNm de VEGF-A (r = -0,467; p ≤ 0,001) et au niveau d’expression protéique de VEGF (r = -0,574; p ≤ 0,001) (Figure 12). De plus, le niveau d’expression de l’ARNm de VEGF-A est associé au VEMS (% valeur prédite) (r = 0,503; p ≤ 0,001). Figure 12 La corrélation entre l’expression relative de miR-1 et l’expression relative protéique de VEGF Légende: Contrôles : points gris pâle (n = 19); MPOC GOLD 1 : points gris foncé (n = 27); MPOC GOLD 2-3 : points noirs (n = 9). 68 4.4 MiR-1 pourrait moduler l’expression protéique de VEGF dans les SkMC Tout d’abord, nous avons vérifié l’efficacité de notre transfection du mimique de miR-1 et de l’inhibiteur de miR-1 dans les SkMC par RT-qPCR. La transfection du mimique a fonctionné, car nous observons une augmentation du niveau d’expression de miR-1 dans les SkMC en comparaison aux SkMC transfectées avec le contrôle négatif (n = 3) (p = 0,043) (Figure 13A). La transfection du mimique de miR-1 dans les SkMC a permis d’observer une diminution de 45% du niveau d’expression protéique de VEGF (n = 6, p = 0,003) en comparaison avec les SkMC qui avaient été transfectées avec le contrôle négatif (Figure 13B). La transfection de l’inhibiteur n’a pas fonctionné et d’autres expériences devront être réalisées (résultats non montrés). Ce résultat permet d’affirmer partiellement que miR-1 peut influencer l’expression de VEGF dans des cellules musculaires SkMC. 69 5’…CUGGCUCCCCAGCACACAUUCCU...VEGFA | ||| | | | 3’……UAUGUAUGAAGAAAUGUAAGGU...miR-1 A B Figure 13 Le niveau d’expression de miR-1 a été mesuré dans les SkMC transfectées avec le mimique miR-1 (33,3 ηM) ou son contrôle négatif (33,3 ηM) pendant 24 heures (n =3) (A). Le niveau protéique de VEGF a été mesuré dans les SkMC transfectées pendant 24 heures avec le mimique miR-1 ou son contrôle négatif à une concentration de 3,33 ηM (n = 6) (B). Les résultats sont représentés selon la moyenne ± SEM. 70 4.5 L’expression d’IGF-1, de HDAC4, de SPRED1 et d’AKT dans le vastus lateralis Les données obtenues pour la mesure des niveaux d’expression de l’ARNm d’IGF-1, de HDAC4 et SPRED1 ainsi que des niveaux d’expression protéique de pAKT et AKT sont similaires entre les groupes (Tableau 11). Tableau 11 Caractérisation de l’expression d’IGF-1, de HDAC4, de SPRED1 et d’AKT dans le vastus lateralis MPOC Témoins (n=20) Expression de l’ARNm d’IGF-1 Expression de l’ARNm de HDAC4 Expression de l’ARNm de SPRED1 Expression protéique d’AKT Expression protéique de pAKT Ratio de l’expression protéique de pAKT/AKT Léger (n=27) Modérée à sévère (n=9) 0,46 ± 0,02 0,57 ± 0,05 0,45 ± 0,04 1,27 ± 0,09 1,24 ± 0,08 2,16 ± 0,75 0,93 ± 0,07 0,95 ± 0,05 1,01 ± 0,11 1,10 ± 0,12 1,09 ± 0,10 1,05 ± 0,13 1,42 ± 0,31 1,29 ± 0,12 1,39 ± 0,25 1,32 ± 0,25 1,29 ± 0,13 1,38 ± 0,21 Les valeurs sont représentées selon la moyenne ± SEM. 71 CHAPITRE V DISCUSSION 73 Chapitre 5 : Discussion Ce mémoire a pour but de mieux comprendre les mécanismes cellulaires qui contribuent au phénomène d’atteinte du vastus lateralis des gens atteints d’une MPOC de stade léger à sévère par l’étude de 1) la myogenèse et de 2) l’angiogenèse. L’hypothèse générale de cette étude était que l’expression de certains miR, dont miR1, miR-126, miR-133a et miR-206, conduit à des changements dans la régulation de de la myogenèse et de l’angiogenèse dans le vastus lateralis des patients atteints de MPOC lorsque comparé aux sujets témoins ayant une fonction pulmonaire normale. Les expériences effectuées ont permis d’observer que i) miR-1 semble être un régulateur de l’expression de VEGF chez les patients atteints d’une MPOC, ii) l’expression des miR-126, miR-133a et miR-206 n’est pas différente dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC en comparaison avec les individus normaux et iii) une modification de l’expression de miR-1 n’est pas associée à un changement de l’expression d’IGF-1 ou d’HDAC4 dans les muscles locomoteurs des sujets atteints d’une MPOC. Ces résultats suggèrent que miR-1 pourrait être impliqué dans la régulation de l’angiogenèse, mais ne sembleraient pas avoir un effet sur la myogenèse des muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC. 5.1 L’expression des myomiR dans le vastus lateralis Des études publiées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que la myogenèse pourrait être compromise dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC (164, 165). Le choix de l’étude des miR-1, miR-133a et miR-206 repose sur l’article de Lewis et al. qui a démontré que dans une analyse de composantes principales, ces miR peuvent être modulés dans le vastus lateralis de patients atteints d’une MPOC de stade sévère (192). De plus, l’étude de Donaldson et al. a observé une augmentation des miR-1, miR-133a et miR-206 dans le sang des patients atteints d’une MPOC (224). Un des objectifs était de caractériser ces myomiR et leurs protéines cibles (IGF-1, HDAC4, pAKT et AKT) chez les patients atteints d’une MPOC de stade GOLD 1 en comparaison avec un groupe de sujets contrôles et des patients atteints d’une MPOC de stade modéré à sévère. Les résultats démontrent que le niveau d’expression de miR-1 et miR-206 est diminué chez les patients atteints d’une MPOC de stade léger en comparaison avec les patients atteints d’une MPOC de stade 75 modéré à sévère. Quant aux autres résultats, les niveaux d’expression de miR-133a et des protéines ciblent IGF-1, HDAC4 et AKT sont similaires entre les patients atteints d’une MPOC et les sujets témoins. Les résultats de miR-133a, de miR-206 et de HDAC4 sont similaires aux données de l’étude de Lewis et al. chez des patients atteints d’une MPOC modérée à sévère lorsque comparés avec les sujets témoins (192). Contrairement à nos résultats, l’étude de Lewis et al. a observé une diminution de l’expression de miR-1 et une augmentation de l’expression d’IGF-1 chez des patients atteints d’une MPOC GOLD 3 (192). Les différences observées peuvent être expliquées par l’exposition à la fumée de cigarette qui était plus grande chez nos sujets témoins par rapport à ceux de Lewis (38 versus 4 paquets-année) (192). L’exposition à la fumée de cigarette est un facteur important dans le développement de la MPOC et son rôle dans la transcription de miR-1 n’est pas connu. Quelques études ont démontré que la fumée de cigarette influence l’expression de différents miR dans les poumons, le foie, les reins et le colon et est associée à l’activation de certains miR impliqués dans le cancer du poumon (225, 226). Dans des études futures, il pourrait être intéressant de vérifier l’impact de l’exposition de la fumée de cigarette sur miR-1, car les facteurs qui affectent l’expression des miR sont peu connus. De plus, la répression traductionnelle par les miR est un mode de régulation de l’ARNm qui pourrait expliquer pourquoi il n’est pas possible de détecter un changement dans le niveau d’expression de l’ARNm d’IGF-1. La répression traductionnelle faite par les miR ne dégrade pas l’ARNm, mais empêche sa traduction en protéine seulement. Dans des études futures, il pourrait être intéressant de vérifier le niveau protéique d’IGF-1 afin de voir si la répression traductionnelle joue un rôle dans la détection de l’ARNm de ce facteur de croissance. Notre résultat quant à l’expression de pAKT est différent de celui de l’étude de Doucet et al. qui a rapporté une augmentation de la phosphorylation d’AKT et une faible masse musculaire chez les patients atteints d’une MPOC de stade sévère (114). Dans notre cohorte de patients, nous n’observons pas de diminution de la masse musculaire globale chez les patients ayant une MPOC modérée à sévère (Tableau 9). Il est ainsi possible que nos patients ne présentent pas d’atrophie du quadriceps, mais 76 la masse de ce muscle n’a pas été évaluée de façon spécifique. Dans des études futures, il serait pertinent d’effectuer la mesure de la surface à la mi-cuisse afin d’avoir une donnée plus exacte au sujet de la perte de masse musculaire et faire une meilleure comparaison par rapport aux études antérieures. La caractérisation des myomiR miR-1, 133a et 206 et de leurs protéines cibles n’a pas permis d’observer des différences sur la myogenèse des muscles locomoteurs dans la MPOC. Il serait pertinent de regarder s’il existe d’autres gènes cibles de miR-1 associés à la myogenèse. De plus, il existe également d’autres myomiR, dont miR208a, miR-208b, miR-499 et miR-486, qui sont impliqués dans le maintien et le développement de la masse musculaire (190). Il a été nécessaire de sélectionner les miR étudiés en raison du temps de l’étude et des coûts des expériences. Leur étude pourrait être pertinente dans l’investigation des mécanismes de l’atrophie dans la MPOC. 5.2 L’expression de miR-1 semble influencer l’expression de VEGF dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC L’angiogenèse est un des processus impliqués dans la formation des capillaires et dans la perfusion des muscles locomoteurs. Quelques molécules angiogéniques, dont VEGF, sont essentielles afin d’activer la cascade de signalisation qui promeut la formation de nouveaux capillaires. Un des objectifs de ce projet était de mesurer les niveaux d’expression de VEGF chez des patients atteints d’une MPOC de stade GOLD 1 à GOLD 3 en comparaison avec des sujets contrôles. D’ailleurs, les résultats obtenus démontrent que les niveaux d’expression de l’ARNm et de protéine de VEGF sont diminués significativement chez les patients atteints d’une MPOC GOLD 2-3 en comparaison avec les sujets témoins et concordent avec ceux de la littérature (176, 177). Cependant, le nombre de capillaires est similaire entre ces deux groupes et ce résultat est contradictoire à ce qu’il a été observé dans les études antérieures. (103, 104, 176, 177). Ceci peut s’expliquer par le fait que les études antérieures ont été réalisées à partir de grandes cohortes de patients comparativement à celle-ci. Malgré ce faible n, ces résultats ouvrent quand même une porte à une dysfonction angiogénique chez les patients atteints d’une MPOC de stade modéré à sévère et 77 nécessitent d’être investigués même si aucune anomalie ne semble évidente dans la capillarisation. Une étude publiée dans notre laboratoire a démontré que le niveau d’expression de VEGF est diminué chez les patients atteints d’une MPOC GOLD 1 lorsqu’on les compare avec des sujets témoins (178). Contrairement à cette étude précédente, le niveau d’expression protéique de VEGF est augmenté significativement chez les patients atteints d’une MPOC GOLD 1 en comparaison avec les sujets contrôles. Pour des raisons techniques, nous n’avons pas utilisé la même protéine de référence que l’étude précédente, car la tubuline, la protéine de référence pour le western blot, variait significativement entre les trois groupes de patients. Tous les gels servant à la quantification des protéines VEGF, pAKT et AKT ont donc dû être refaits et normalisés sur la densité des protéines totales (section 3.6). Il est difficile de bien comparer ces deux études, car les méthodes ont été modifiées depuis la publication de cette dernière. Par ailleurs, les résultats démontrent que le niveau d’expression de l’ARNm de VEGF et le nombre de capillaires sont similaires entre ces deux groupes. Il est possible que la répression traductionnelles soit une raison de la discordance entre le résultat de l’expression protéique et d’ARNm de VEGF. Ces résultats démontrent l’importance d’avoir le résultat de l’expression de la protéine, car il s’agit d’une réponse plus exacte lorsqu’on étudie les miR. La cohorte de patients recrutée pour notre étude était plus petite que l’étude de Gagnon et al. (178) et pourrait expliquer les différences des résultats de capillaires entre ces deux études. Au total, la taille de la cohorte, la répression traductionnelle et l’utilisation d’une nouvelle méthode pour la normalisation des valeurs pourraient expliquer les différences entre les deux études. Dans les prochaines études, il serait important de tenir compte de ces facteurs afin de faciliter les comparaisons avec les études antérieures. Un des objectifs de cette étude était d’étudier l’implication potentielle de miR-1 et de miR-206 dans l’angiogenèse musculaire. Ces deux myomiR ciblent l’ARNm de VEGF dans le génome humain (250). Le niveau d’expression de miR-206 est différent entre les groupes MPOC. Par ailleurs, le niveau d’expression de miR-1 est diminué dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC de stade GOLD 1 en comparaison avec les sujets contrôles et les patients atteints d’une MPOC de stade 78 GOLD 2-3. De plus, le niveau d’expression de miR-1 est inversement associé avec les niveaux d’expression protéique et de l’ARNm de VEGF, ce qui n’est pas le cas pour le niveau d’expression de miR-206. Une interprétation de nos données est que la diminution du niveau de miR-1 pourrait être essentielle pour l’activation de VEGF dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC GOLD 1 comme il a été démontré dans d’autres modèles expérimentaux (201, 202, 215, 218). Ce mécanisme adaptatif semblerait avoir été perdu chez les patients atteints d’une MPOC GOLD 2-3 dont l’expression de miR-1 est comparable à celle observée chez les sujets témoins qui présentaient des niveaux d’expression protéique et de l’ARNm réduits pour VEGF. À long terme, il est possible que la perte de ce mécanisme adaptatif chez les patients avec MPOC GOLD 2-3 puisse affecter la capacité angiogénique des muscles locomoteurs. Ces résultats signifient que la régulation de l’angiogenèse peut être compromise dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC modérée à sévère et serait préservé chez les patients atteints d’une MPOC de stade léger. Il est important de considérer que l’angiogenèse musculaire peut jouer un rôle central dans le maintien de la tolérance à l’exercice et la fatigue musculaire (251) et qu’une meilleure compréhension de ce mécanisme pourrait être pertinent. Afin de documenter le potentiel rôle de miR-1 sur la régulation de VEGF dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC, nous avons transfecté des cellules musculaires in vitro. Le choix de l’étude des cellules musculaires repose sur le fait que miR-1 est spécifique aux cellules musculaires. De plus, les cellules musculaires contribuent à l’angiogenèse, car elles sécrètent des facteurs angiogéniques dont VEGF (252). Les SkMC ont été transfectées avec le mimique ou avec l’inhibiteur de miR-1. Tel que décrit dans le chapitre sur les résultats, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir des résultats avec l’inhibiteur de miR-1. Ces expériences ont été réalisées à la fin de ce projet et le temps a été un facteur limitant. D’autres expériences de mise au point devront être faites pour déterminer la concentration optimale de l’inhibiteur de miR-1 à transfecter aux SkMC. Les SkMC transfectées avec le mimique de miR-1 expriment un niveau protéique diminué de VEGF en comparaison avec le contrôle négatif (Figure 13B) et ce résultat supporte partiellement le rôle de miR-1 dans la régulation de VEGF dans un modèle de cellules musculaires. Il faudra compléter les expériences avec l’inhibiteur de miR-1 afin de 79 confirmer le rôle de miR-1 sur la régulation de VEGF dans les cellules musculaires. L’hypothèse est que la transfection de l’inhibiteur de miR-1 conduira à une augmentation de l’expression de VEGF dans les SkMC. Donc, ces résultats sont des indices clés qui montrent la pertinence de poursuivre des études mécanistiques sur un modèle de cellules musculaires afin de mieux comprendre l’angiogenèse musculaire dans la MPOC. L’effet de ce miR sur la traduction de VEGF nécessite d’être davantage investigué dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC. 5.3 L’expression de miR-126 dans le vastus lateralis Les angiomiR sont retrouvés dans les cellules endothéliales et régulent l’expression de gènes impliqués dans l’angiogenèse. Un article publié a démontré que l’expression diminuée de miR-126 entraînerait une réduction de la réponse angiogénique dans les muscles squelettiques de patients atteints d’hypertension pulmonaire artérielle (HTAP) (223). Par contre, les niveaux d’expression de miR-126 et de SPRED1 sont préservés dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC en comparaison avec les sujets témoins. Donc, ces résultats signifient que ce mécanisme ne mérite pas d’être davantage étudié dans un contexte d’angiogenèse musculaire dans la MPOC. 5.4 Limites de l’étude La limite principale de cette étude est qu’il existe vraisemblablement une hétérogénéité dans l’atteinte musculaire retrouvée dans la MPOC et ceci contribue au fait que nos patients n’ont pas d’atrophie des fibres musculaires ni de réduction de la capillarisation. Il aurait été souhaitable d’avoir des patients avec davantage d’atteinte de la masse et de la capillarisation musculaire pour obtenir une meilleure comparaison avec les études précédentes. Contrairement aux études antérieures, nous ne retrouvons pas de changements entre la proportion des types de fibres et d’atrophie des fibres musculaires lorsque nous comparons les patients atteints d’une MPOC de stade léger à sévère avec des sujets témoins. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que la majorité de nos patients présentait une MPOC légère, une population qui n’exprime pas de telles anomalies musculaires (178). 80 Le deuxième défi rencontré était de se familiariser avec un nouveau sujet au sein de notre laboratoire : l’étude des miR. Il y a eu plusieurs apprentissages à faire au niveau de l’expérimentation et de la théorie. Après un an d’expérimentation, nous nous sommes rendu compte que les amorces utilisées pour mesurer les niveaux d’expression des miR n’étaient pas validées et normalisées pour notre cohorte de patients. Il a été nécessaire de reprendre tous les essais de RT-qPCR pour les 56 participants. Au sujet de la normalisation, nous nous sommes rendu compte qu’en appliquant l’algorithme geNorm, il est nécessaire d’utiliser au minimum deux gènes de référence. Par contre, le gène U6 variait entre les groupes de patients (données non présentées) et il a été nécessaire d’ajouter un troisième gène de référence afin d’être valide selon l’algorithme geNorm. Le troisième défi rencontré était le recrutement de participants. Au départ, cette étude avait été conçue dans le but de recruter des participants afin d’isoler des cellules satellites et endothéliales provenant du vastus lateralis. L’isolement de ces cellules avait pour but de caractériser les miR dans ce modèle cellulaire. Pour des raisons méthodologiques suite au défi 1, nous n’avons dû revoir nos priorités. Au final, l’utilisation de ces cellules devait servir à valider le rôle de miR-1 dans les cellules satellites de patients atteints d’une MPOC en comparaison avec des cellules satellites de sujets contrôles. En raison de la faible quantité de cellules obtenues lors des isolements, la mise au point ne pouvait être faite dans ces lignées précieuses provenant de patients. C’est pour cette raison que les SkMC ont été utilisées comme méthode alternative afin de démontrer notre concept au sujet de miR-1 et VEGF. Des études futures pourront tout de même utiliser les cellules satellites provenant des participants afin de vérifier ce concept. 81 CHAPITRE VI CONCLUSION ET PESPECTIVES 83 Chapitre 6 : Conclusion et perspectives 6.1 Conclusion Les travaux de maîtrise présentés dans ce mémoire ont permis de fournir des éléments d’information qui complémentent les connaissances actuelles au sujet de la myogenèse et l’angiogenèse dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC. Ses travaux serviront de base pour de futurs projets au sein du laboratoire. Au cours des deux dernières années et demie, ses travaux ont montré que : 1) MiR-1 semble être un régulateur négatif de l’expression de VEGF chez les gens atteints d’une MPOC. 2) MiR-126, miR-133a et miR-206 ne sont pas différents dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC en comparaison avec ceux d’individus normaux. 3) Une modification de l’expression de miR-1 n’est pas associée à un changement de l’expression d’IGF-1 ou d’HDAC4 dans les muscles locomoteurs des sujets atteints d’une MPOC. 6.1.1 Pertinence des résultats Tout d’abord, cette caractérisation n’a pas permis de confirmer le rôle des myomiR miR-1, 133a et 206 sur la myogenèse des muscles locomoteurs dans la MPOC. Outre les myomiR étudiés dans le cadre de ce projet de maîtrise, il existe également d’autres myomiR qui sont impliqués dans le maintien et le développement de la masse musculaire (190). À mon avis, l’étude des miR est appropriée dans la myogenèse du vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC, car elle permettrait de mieux comprendre l’évolution de la dysfonction musculaire et d’intervenir avant que celle-ci ne s’installe dès le stade GOLD 1. Ensuite, la caractérisation des miR a permis de montrer que l’expression de miR-1 est inversement associée au niveau de VEGF dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC. Par ailleurs, une diminution de l’expression de miR1 est associée à une augmentation de l’expression de VEGF chez des patients atteints 85 d’une MPOC de stade GOLD 1. Par contre, tous ces niveaux sont inversés chez les patients atteints d’une MPOC de stade GOLD 2-3 lorsque comparés au GOLD 1. À l’aide d’un modèle de culture de cellules musculaires, j’ai pu confirmer partiellement que miR-1 est un modulateur négatif de l’expression de VEGF. Ces résultats sont des indices clés montrant la pertinence de poursuivre des études mécanistiques sur un modèle de cellules endothéliales afin de mieux comprendre l’angiogenèse musculaire dans la MPOC. Au cours des dernières années, des études ont permis de démontrer des changements dans l’expression de certains miR retrouvés dans les tissus pulmonaires, les sécrétions bronchiques, le plasma et le quadriceps de patients atteints d’une MPOC (188, 192, 224, 229, 230). Parmi ces études, Donaldson et al. a observé une augmentation des myomiR miR-1, miR-133a et miR-206 dans le sang des patients atteints d’une MPOC. De plus, une autre étude a démontré qu’une augmentation de l’expression des miR-1, miR-133a et miR-206 dans le sang était associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (253). Les miR circulants pourraient être des biomarqueurs potentiels témoignant de la présence de l’atrophie musculaire ou d’autres comorbidités, dont le diabète, les maladies cardiovasculaires et l’ostéoporose, chez des patients atteints d’une MPOC (188, 192, 224). 6.2 Perspectives Dans ce mémoire, la caractérisation des miR a permis de montrer que l’expression de miR-1 est diminuée dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC de stade GOLD 1 lorsqu’ils sont comparés avec des sujets ayant une MPOC de stade GOLD 2-3 ou des sujets contrôles. Dans la littérature, miR-1 semble jouer un rôle important dans la différenciation des cellules musculaires. Dans la MPOC, le rôle de miR-1 dans la différenciation des cellules musculaires n’est pas connu. Thériault et al. a observé que l’expression de certains facteurs MRF est atypique dans le vastus lateralis des patients atteints d’une MPOC (165). Quel est le rôle de miR-1 dans la différenciation des cellules musculaires des patients atteints d’une MPOC? L’hypothèse est qu’un changement dans l’expression de miR-1 pourrait expliquer les changements dans l’expression de certains MRF impliqués dans la régulation de la myogenèse des muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC. Pour vérifier 86 cette hypothèse, il serait judicieux de tester cette hypothèse sur des cellules satellites isolées à partir de biopsies musculaires. Étant donné que les cellules satellites primaires sont précieuses et en nombre limité, la lignée de cellules musculaires humaines (SkMC) provenant de l’« American Type Culture Collection » (ATCC) pourrait servir à faire des études mécanistiques. Dans les SkMC, l’hypothèse est qu’une augmentation de miR-1 pourrait être associée à une augmentation de l’expression des facteurs de différenciation cellulaire (ex. : MRF4 et « myogenin »). Par contre, une diminution de miR-1 pourrait être associée à une augmentation de l’expression des facteurs de prolifération cellulaire (ex. : Pax7, MyoD et Myf5) dans les SkMC. Par la suite, les résultats obtenus dans les SkMC devront être vérifiés dans les cellules satellites des patients MPOC en comparaison avec des cellules satellites provenant de sujets témoins. Ces expériences permettraient d’associer le rôle de miR1 à la régulation de la myogenèse dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC. L’exposition à la fumée de cigarette est un facteur important dans le développement de la MPOC et est connue pour stimuler l’activation de marqueurs de stress oxydant dans les muscles locomoteurs de fumeurs sains et d’animaux (1, 227, 228). Quelques études ont démontré que la fumée de cigarette influence l’expression de différents miR dans les poumons, le foie, les reins et le colon et est associée à l’activation de certains miR impliqués dans le cancer du poumon (225, 226). L’impact de la fumée de cigarette sur la transcription de miR-1 n’est pas connu dans la littérature. Est-ce que la fumée de cigarette pourrait influencer la transcription de miR1 dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC? Tel que discuté, l’hypothèse est que la transcription de miR-1 pourrait être activée par la fumée de cigarette. Pour vérifier cette hypothèse, il serait pertinent de vérifier le niveau de miR-1 dans les muscles locomoteurs de souris exposées à la fumée de cigarette en comparaison avec des souris non exposées. On s’attend à ce que l’expression de miR-1 soit augmentée chez les souris qui ont fumé lorsqu’elles sont comparées avec les souris qui n’ont pas fumé. Dans le cas où la fumée de cigarette n’augmente pas l’expression de miR-1 dans les muscles locomoteurs de souris, cette expérience permettrait de comprendre que la transcription de miR-1 n’est pas influencée par la fumée de cigarette. Par contre, il pourrait être pertinent d’aller vérifier l’hypothèse dans 87 un autre modèle de souris ayant une inflammation chronique. Cette expérience permettrait de répondre à la question au sujet de la transcription de miR-1 dans les muscles locomoteurs. Plusieurs études ont observé une diminution du nombre de capillaires dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC GOLD 2-3, mais aucune étude n’a identifié le mécanisme cellulaire à l’origine de ce phénomène (103, 104). La caractérisation des miR a permis de montrer que l’expression de miR-1 est inversement associée au niveau de VEGF dans les muscles locomoteurs des patients atteints d’une MPOC. Est-ce que miR-1 peut jusqu’à influencer la formation des capillaires dans les muscles locomoteurs de patients atteints d’une MPOC GOLD 2-3? Afin de mieux comprendre ce qui suit une réduction de VEGF chez ces patients, il serait intéressant de faire des expériences à partir de cellules endothéliales. L’hypothèse est que les cellules endothéliales de patients atteints d’une MPOC de stade modéré à très sévère formeraient moins de branchements que des cellules endothéliales de sujets contrôles. Au cours de mon projet de maîtrise, j’ai isolé des cellules endothéliales provenant de biopsies musculaires de sujets témoins et de patients atteints d’une MPOC du stade GOLD 1 à GOLD 4. Les cellules de patients atteints d’une MPOC sont très précieuses et peu nombreuses. Pour mettre au point un protocole de branchement de cellules endothéliales, il serait pertinent d’utiliser une lignée de cellules endothéliales provenant de cordons ombilicaux appelées HUVEC. Le résultat attendu est que les cellules endothéliales de patients atteints d’une MPOC GOLD 2 à 4 formeront moins de branchements entre elles lorsqu’on les compare avec des cellules de sujets contrôles. Les branchements des cellules endothéliales seraient davantage affectés, entre autres, à cause du niveau réduit de VEGF. Dans les cellules endothéliales de patients atteints d’une MPOC, le niveau d’expression de miR-1 sera inversement associé à leur nombre de branchements. Dans le cas où l’hypothèse ne serait pas vérifiée, ces cellules pourront être caractérisées pour ses facteurs de croissance (ex. : VEGF, PIGF, Ang-1). Ces résultats permettraient de mieux comprendre le rôle de VEGF dans l’angiogenèse des muscles locomoteurs de patients atteints d’une MPOC. 88 Au cours d’un exercice sur le vélo, la diminution de la densité des capillaires est associée à une augmentation de la fatigue du quadriceps chez les patients atteints d’une MPOC (251). Il est également connu que l’exercice contribue à l’augmentation de facteurs qui régulent l’hypertrophie et la myogenèse (90). L’exercice induit des changements dans l’expression des myomiR dans la biologie du muscle (190). Le niveau d’expression des miR varie en fonction du type d’exercice (ex. : endurance et résistance) (190). Est-ce qu’une modification de l’expression de miR-1 peut accentuer la perte de fonction musculaire en réponse à un exercice? L’hypothèse est que les niveaux de miR-1 seront modifiés dans la MPOC par rapport à une cohorte de sujets contrôles. Au cours de cette étude, il serait pertinent de prélever une biopsie musculaire et du sang avant et après l’exercice pour vérifier cette hypothèse. Un changement dans l’expression de miR-1 au cours d’une activité physique pourrait accroître la perte de fonction musculaire dans la MPOC. Dans le cas où l’hypothèse n’est pas vérifiée, il serait intéressant de regarder si d’autres miR peuvent être modifiés à la suite d’une activité physique. Ces expériences permettront de mieux comprendre les mécanismes qui contribuent au développement des atteintes des muscles locomoteurs dans la MPOC. De plus, ces expériences permettront de vérifier si miR-1 peut-être une cible thérapeutique ou un biomarqueur potentiel afin d’améliorer la qualité de vie et le diagnostic des patients qui sont atteints d’une MPOC. 89 RÉFÉRENCES 1. Maltais F, Decramer M, Casaburi R, Barreiro E, Burelle Y, Debigare R, Dekhuijzen PN, Franssen F, Gayan-Ramirez G, Gea J, Gosker HR, Gosselink R, Hayot M, Hussain SN, Janssens W, Polkey MI, Roca J, Saey D, Schols AM, Spruit MA, Steiner M, Taivassalo T, Troosters T, Vogiatzis I, Wagner PD, COPD AEAHCoLMDi. An official American Thoracic Society/European Respiratory Society statement: update on limb muscle dysfunction in chronic obstructive pulmonary disease. 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