in situ

Applications du NGS à la
pathologie tumorale
Dre Bettina Bisig
Institut de Pathologie
CHUV
Lausanne
29 septembre 2016
PATHOLOGIE
TUMORALE
HE
Examen
macroscopique
Bloc FFPE
Coupes
Lames blanches
(non colorées)
FFPE = formalin-fixed paraffin-embedded
Morphologie
(HE)
Morphologie
(HE)
Examen
macroscopique
Bloc FFPE
Coupes
Lames blanches
(non colorées)
FFPE = formalin-fixed paraffin-embedded
Analyses
moléculaires
Sequençage
Mutations
petites insertions/délétions
enrichissement
sur lame
Translocations
in vitro (ADN)
in situ (ADN)
Immunohistochimie
Analyses d’expression
in situ (protéines)
Copy number variations
in situ (ADN)
FISH
Sequençage
Mutations
petites insertions/délétions
enrichissement
sur lame
Translocations
in vitro (ADN)
BIOMARQUEURS
in situ (ADN)
DIAGNOSTIQUES
Immunohistochimie
PRONOSTIQUESCopy number variations
Analyses d’expression
PREDICTIFS
in situ (protéines)
in situ (ADN)
FISH
Biomarqueurs
PRONOSTIQUES
Prédisent la survie
indépendamment
grade
du traitement
LVI
Biomarqueurs
PREDICTIFS
Prédisent la réponse à
un traitement
déterminé
MÉDECINE PERSONNALISÉE
BIOMARQUEURS PREDICTIFS
Bayer Healthcare
ADENOCARCINOMES
PULMONAIRES
Env. 15%:
mutation EGFR
EGFR
Mutation activatrice du domaine
tyrosine kinase de l’EGFR
 Activation constitutive de la
signalisation
 Prolifération, survie, invasion,…
Hudis CA, NEJM 2007
ADENOCARCINOMES
PULMONAIRES
Env. 15%:
mutation EGFR
EGFR
Inhibiteurs de l’EGFR:
Gefitinib / erlotinib
Hudis CA, NEJM 2007
groupe EGFR muté
= meilleure survie avec
gefitinib
(versus chimio standard)
(progression-free survival
= survie sans progression)
groupe EGFR wild-type
= moins bonne survie
avec gefitinib
(versus chimio standard)
ADENOCARCINOMES
PULMONAIRES
Env. 15%:
mutation EGFR
EGFR
= BIOMARQUEUR
PREDICTIF
Hudis CA, NEJM 2007
ADENOCARCINOMES
PULMONAIRES
TCGA, Nature 2014
ADENOCARCINOMES
PULMONAIRES
T Mitsudomi, Nat Rev Clin Oncol 2013
CARCINOMES PULMONAIRES:
Médicaments disponibles ou en cours de développement
Thérapies
Ciblées
Sequençage
Mutations
petites insertions/délétions
“on-slide”
tumor
enrichment
Translocations
in vitro (DNA)
THERAPIES CIBLEES
in situ (DNA)
Immunohistochemistry
BIOMARQUEURS
PREDICTIFS
Expression analysis
in situ (proteins)
Copy number variations
in situ (DNA)
FISH


Bloc épuisé
Nombre croissant
d’altérations
moléculaires
« actionnables »
Nombre croissant
d’analyses
moléculaires
Taille de plus en
plus petite des
échantillons
Techniques moins
invasives de
prélèvement
Augmentation des
délais (TAT)
Augmentation des
coûts
Epuisement des
échantillons tissulaires /
cellulaires
Sensibilité technique
relativement faible
(20-30% cell. tum.)
Nombre croissant
d’altérations
moléculaires
« actionnables »
Augmentation des
délais (TAT)
Nombre croissant
d’analyses
moléculaires
Augmentation des
coûts
Epuisement des
SOLUTION?
échantillons tissulaires /
Taille de plus en
plus petite des
échantillons
Techniques moins
invasives de
prélèvement
cellulaires
Sensibilité technique
relativement faible
(20-30% cell. tum.)
NEXT GENERATION SEQUENCING
(NGS)
Multiples altérations
moléculaires dans un
seul run
Multiples
échantillons
dans le même
run
Gestion optimale des
échantillons
tissulaires/cellulaires
Sensibilité
analytique
élevée
Délais et coûts
diminués
Remplace le
séquençage
classique et …
Sensibilité
accrue
(5-10% cell. tum.)
NEXT GENERATION SEQUENCING
(NGS)
Capable de détecter:
‐ Mutations
‐ Insertions/deletions
‐ Translocations
‐ Gains / pertes (CNV)
GENOME
Simon and Roychowdhury,
Nat Rev Drug Discover 2013
EXOME
« HOTSPOTS »
SEQUENÇAGE CIBLÉ
(TARGETED SEQUENCING)
TRANSCRIPTOME
SPECIFICITÉS DU NGS SUR TISSU TUMORAL
- Tissu fixé (FFPE): ADN dégradé
- Biopsies: quantité limitée
- Tissu hétérogène:
• hétérogénéite génétique
• cellules tumorales et non
Fréquences alléliques
très variables
Enrichissement en
cellules tumorales
(manuel / laser)
- Altérations somatiques versus germinales
CARCINOMES PULMONAIRES:
Médicaments disponibles ou en cours de développement
Thérapies
Ciblées
ADENOCARCINOMES PULMONAIRES
EGFR
HER2
ROS1
ALK
BRAF
RET
KRAS
MET
PIK3CA
NTRK1
NRG1
……
FGFR1
1ère LIGNE
de TTT
(=TTT STANDARD)
2ème LIGNE
de TTT
TTT dans des
ETUDES
(évt. OFF-LABEL) CLINIQUES
PANELS
DE
BIOMARQUEURS
LIGNES
DE
TRAITEMENT
PETIT
PANEL
1ère
LIGNE
de TTT
PANEL
MOYEN
2ème
LIGNE
de TTT
GRAND
PANEL
TTT dans des
ETUDES
CLINIQUES
PLATEFORME NGS - STRATEGIE IPA LAUSANNE
PHASE 1
Pathology target
population
Classical
Sequencing
Molecular oncology
reports, consult.,
tumor boards
Next Generation
Sequencing
Clinical Trials
Small cancer panel
(50 genes)
Large cancer panel
(400 genes)
Ion Torrent PGM
Smaller number of genes, 10ng DNA
PHASE 2
Illumina MiSeq
Larger number of genes, 50-200ng DNA
PETIT PANEL TUMEURS SOLIDES - 52 GENES
Séquenceur
Panel de gènes
Ion Torrent PGM
Ion AmpliSeq Custom Cancer Hotspot Panel IPA
(Cancer Hotspot Panel v2 lég. modifié)
‐ 52 gènes (hotspots), 218 amplicons
‐ 2’800 mutations/indels, 23.9 Kb
‐ 10 ng ADN par échantillon
ABL1
CDH1
ERBB2
FGFR3
HRAS
KIT
NOTCH1
PTPN11
SRC
AKT1
CDKN2A
ERBB4
FLT3
IDH1
KRAS
NPM1
RB1
STK11
ALK
CSF1R
EZH2
GNA11
IDH2
MAP2K1
NRAS
RET
TP53
APC
CTNNB1
FBXW7
GNAQ
JAK2
MET
PDGFRA
SMAD4
VHL
ATM
DDR2
FGFR1
GNAS
JAK3
MLH1
PIK3CA
SMARCB1
BRAF
EGFR
FGFR2
HNF1A
KDR
MPL
PTEN
SMO
PETIT PANEL GENES DE FUSION - 4 GENES / >50 TRANSCRITS
Séquenceur
Panel de gènes
Ion Torrent PGM
Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Panel
- 4 gènes, >50 transcrits de fusion
‐ 85 amplicons
‐ 10 ng ARN par échantillon
ALK
RET
ROS1
NTRK1
>50 transcrits de fusion
GRAND PANEL TUMEURS SOLIDES - 400 GENES
Séquenceur
MiSeq / Illumina
Panel de gènes
LARGE CANCER PANEL
400 gènes (exons)
‐ mutations/indels
‐ translocations
‐ gains/pertes
(50 ng ADN)
Amplicon-based
Ion Torrent, Life Technologies
Capture-based
PANEL LYMPHOMES T PERIPHERIQUES
Séquenceur
Panel de gènes
Ion Torrent PGM
Custom Panel Ion AmpliSeq
‐ 9 gènes (hotspots ou séq. codantes)
‐ 262 amplicons, 28.7 Kb
‐ 20 ng ADN par échantillon (2x10 ng)
Gènes
CD28
DNMT3A
IDH2
PLCG1
RHOA
SETD2
STAT3
STAT5B
TET2
Exons
Ex 2&4
Plusieurs
(16x)
Ex 4
Tous
(21x)
Ex 2
Tous
(21x)
Ex 20
& 21
Ex 16
Tous
(11x)
Cible
Hot
spots
Hot
spots
Hot
spots
Séq.
Hot
codante spots
Séq.
codante
Hot
spots
Hot
spots
Séq.
codante
PANEL BRCA1 + BRCA2
Séquenceur
Panel de gènes
MiSeq / Illumina
BRCA Tumor MASTRTM Plus Dx
(Multiplicom)
Gènes BRCA1 + BRCA2
(séquences codantes
complètes)
(80-200 ng ADN)
Sequençage
Mutations
small insertions/délétions
“on-slide”
tumor
enrichment
Translocations
in vitro (DNA)
in situ (DNA)
Copy number variations
NEXT
GENERATION
SEQUENCING
in situ (DNA)
FISH
DÉFIS
Stockage des
données
INFORMATIQUE
SOCIETE SUISSE
DE PATHOLOGIE
MOLECULAIRE
GROUPES DE TRAVAIL
REGIONAUX/NATIONAUX
Analyse des
données
RESEAU
PATHOLOGIE /
ONCOLOGIE
SWISS INSTITUTE
BIOINFORMATICS
Altérations à basse
fréq. allélique
DONNEES DE
SEQUENÇAGE
Hétérogénéité
tumorale
Traduction dans la
prise en charge
clinique
BIOINFO / PIPELINES
ANALYTIQUES
MODELISATION
PROTEINES
Nouvelles
altérations
Découverte fortuite
altérations germinales
GENETIQUE
DEVELOPPEMENTS: BIOPSIES LIQUIDES
ADN TUMORAL
CIRCULANT
(ctDNA)
Bettegowda et al, Sci Transl Med 2014
DEVELOPPEMENTS: IMMUNOTHERAPIE
CHARGE
MUTATIONNELLE
(MUTATIONAL LOAD)
REPONSE A
L’IMMUNOTHERAPIE
Dr E. Missiaglia
DEVELOPPEMENTS: IMMUNOTHERAPIE PERSONNALISEE
NEOANTIGENES
TUMORAUX
EXPANSION EX VIVO
DE LYMPHOCYTES T
SPECIFIQUES
ou
VACCINS SPECIFIQUES
CONCLUSIONS
CONCLUSIONS
NGS EN PATHOLOGIE TUMORALE:
- Multiples biomarqueurs et multiples échantillons
- Mutations, translocations, gains, pertes
- Sensibilité accrue
- Remplace les techniques habituelles et au delà
- Recherche clinique et translationnelle
- Défis et développements…
REMERCIEMENTS
INSTITUT DE PATHOLOGIE, CHUV
Prof. Laurence de Leval
Labo de biologie moléculaire
Dr sc. Edoardo Missiaglia
Dr sc. Audrey Letourneau
Dr sc. Nathalie Scamuffa
Véronique Roux
Samuel Rappo
Paola Izzo
Robin Russi
Véronique Vocat
Dr sc. Patricia Hornitschek
Soheyb Sellah
Jérémy Vidal
Labo de FISH
Labo d’immunohistochimie
Labo d’histologie
DEPARTEMENT D’ONCOLOGIE, CHUV
Prof. Olivier Michielin
Dr K. Homicsko