Modèles in vitro et in vivo d`étude de la virulence bactérienne
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Modèles in vitro et in vivo d’étude de la virulence bactérienne Dr Catherine Dunyach-Remy; CHU Nîmes & INSERM U1047 Modèles in vitro et in vivo d’étude de la virulence bactérienne 1) Définition de la virulence bactérienne et exemples Virulence bactérienne Bactérie pathogène Survie Adaptation Multiplication Hôte Défenses spécifiques Défenses non spécifiques Échappement aux défenses Invasion Dissémination Facteurs de virulence La virulence d’E. coli Adhésion - Colonisation Fimbriae type I Fimbriae P Fimbriae S Défense de l’hôte Système de capture du fer Entérobactine Yersiniabactine Aérobactine Salmochéline Sit système Johnson JR et al, Clin Microbiol. Research, 1991 Toxines: α-hémolysine, Cnf-1, CDT Capsule La virulence d’E. coli ! L’évolution du génome bactérien : processus par lequel le contenu et l’organisation de l’information génétique change et évolue au cours du temps. Schmidt et al, Clin Microbiol Rev, 2004; Kaper JB et al, Nat Rev Microbiol, 2004 Ilots de pathogénicité: acquisition de gènes F Transferts horizontaux incluent des éléments génétiques mobiles : -plasmides de conjugaison, -bactériophages, -transposons, -îlot de pathogénicité Schmidt et al, Clin Microbiol Rev, 2004; Kaper JB et al, Nat Rev Microbiol, 2004 Ilots de pathogénicité Schmidt et al, Clin Microbiol Rev, 2004; Kaper JB et al, Nat Rev Microbiol, 2004 La virulence de Staphylococcus aureus ADHESION COLONISATION Epiderme MULTIPLICATION locus isd sidérophores Protéases Lipases Nucléases Hyaluronidases Elastase MSCRAMM ECHAPPEMENT AUX DEFENSES DE L’HÔTE Protéine A EXTENSION LOCALE: Derme, hypoderme, Annexes (Os) Capsules Coagulase Toxines CHIPS-SCIN DISSEMINATION: Métastases septiques www.microbes-edu.org/etudiant/staph.html Staphylokinases Modèles in vitro et in vivo d’étude de la virulence bactérienne 2) Modèles d’étude in vitro de la virulence bactérienne Les modèles in vitro d’étude de la virulence bactérienne Exemple de l’étude de la virulence des bactéries intracellulaires en culture cellulaire (protection gentamycine) Les modèles in vitro d’étude de la virulence bactérienne Exemple de l’étude de l’adhésion bactérienne en culture cellulaire Les modèles in vitro d’étude de la virulence bactérienne Exemple de l’étude de l’adhésion d’E.coli uropathogènes en culture cellulaire Garcia-Mendez et al,Int J Exp Pathol, 2016 Modèles in vitro et in vivo d’étude de la virulence bactérienne 3) Modèles d’étude in vivo de la virulence bactérienne Les modèles « classiques » in vivo d’étude de la virulence bactérienne Mammifères Rat – Souris Chien – Chèvre Cochon – Lapin Mouton - Singe… Avantages: Systèmes immunitaires proches de l’homme, Génome séquencé (approches post-génomiques), Nombreux modèles développés (endocardite lapin…) Inconvénients: Éthique, Coût, Animalerie, Cycle de vie long (plusieurs mois), Pas toujours adapté (Brucella et souris) Les modèles « classiques » in vivo d’étude de la virulence bactérienne Modèle de plaies chroniques développé chez le rat Les nouveaux modèles in vivo d’étude de la virulence bactérienne Caractéristiques intéressantes: F Génome bien caractérisé, souvent de faible taille, outils de biologie moléculaire disponibles (manipulation du modèle) F Temps de génération faible avec une descendance nombreuse F Facilité d’élevage ou de culture F Faible encombrement Modèles Invertébrés: Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Modèles Vertébrés: Zebrafish Intérêt des nouveaux modèles F Utilisation du modèle pour cribler, comparer la virulence des pathogènes et leurs mutants F Utilisation du modèle muté pour identifier les déterminants génétiques de l’hôte assurant la sensibilité et la résistance aux infections F Utilisation du système reporter dans le modèle Drosophila melanogaster ¤ Métazoaire ¤ Mouche du vinaigre ¤ Génome séquencé : 180 Mb ¤ Nb de gènes: 13600 ¤ Nb mutants défectifs ¤ Tre 25°C F Modèle d’étude de la réponse immunitaire Système immunitaire inné Pas de système immunitaire adaptatif Mise en action rapide et efficace F Production de nb peptides antimicrobiens Réponse épithéliale locale Mélanisation pour lutter contre l’intrusion bactérienne F Hématocytes ð Phagocytose Système de reconnaissance des bactéries et des Réponse systémique constituants de la paroi ð Activation du système Toll-MAPK ð Réponse Antimicrobienne Principe d’utilisation de D. melanogaster Analyse de mutants Différence de virulence Adulte J2-J4 Injection intra-thoracique Mouche + nourriture Courbe de survie Multiplication bactérienne 6 Log CFU/ml 5 4 3 2 1 0 2 5 24 Time (hours) Pathogènes étudiés: P. aeruginosa, L. monocytogenes, M. marinum 48 Modèle des zebrafish ¤ Dario rerio, petit poisson tropical ¤ Haute fertilité: 1 femelle donne 100 oeufs ¤ Génome séquencé : 1700 Mb ¤ Temps de génération court pour les embryons: 50 h (Adulte 3 mois) ¤ Système immunitaire adaptatif: Ly T, Ly B, MP, PN, Ig, CK, Cpmt ¤ Dvpmt de l’embryon dans le milieu extérieur ¤ Peu coûteux ¤ Entretien facile, espace réduit, Tre 28°C ¤ Facilement manipulable ¤ Petite taille suivi progression bactéries (gfp) Principe d’utilisation de zebrafish Embryon à 28h Post-Fertil. Anesthésie Micro-injection de bactéries Suivi infection en temps réel Suivi dvpmt des embryons ou Broyage des embryons Mise en culture Adulte Anesthésie IM ou I Péritonéal Sacrifice à 48h ou survie Analyse Cœur, Cerveau, Peau Histopathologie Courbe de survie Multiplication bactérienne Espèces étudiées: Streptococcus pyogenes, S. iniae, M. marinum, S. typhimurium, S. aureus, B. cepacia, E. coli Caenorhabditis elegans ¤ Nématode hermaphrodite ¤ Taille: 1mm de Long (adulte) ¤ Génome: 100 Mb ¤ Nb de gènes: 19100 ¤ Habitat: sols ¤ Cycle: 3 jours à 25°C ¤ 1 adulte: 300 – 350 oeufs ¤ Durée de vie: 3 semaines à 25°C ¤ Nourriture de base: OP50 Cycle de développement Principe d’utilisation de C. elegans Ver adulte Traitement par NaOH Oeufs Repiquage sur milieu NGM ≈ 48h (ajout OP50 à 24h) Nématodes au stade L4 Mise en contact des vers et des souches d’E. coli Culture d’E. coli 18h Suivi journalier de la survie des nématodes Courbe de survie Avantage des nouveaux modèles ¤ Robustesse: centrifugation, vortex, congélation (vers) ¤ Conditions de croissance simples ¤ Temps de génération rapides: 55 h ¤ Taille ð Pas d’animalerie ¤ Grande fécondité ¤ Transparence ð Survie des bactéries ou de l’expression de gènes ¤ Élevage peu contraignant ¤ Génome séquencé ¤ Développement de mécanismes de défense contre les bactéries: immunité inné ¤ Gènes homologues à ceux du système Toll (voie de signalisation) (modèle poisson) Inconvénients du modèle « vers » ¤ Modèle très laborieux ¤ Opérateur et ver-dépendant Répétabilité inter-essai X5 Répétabilité intra-essai X3 ¤ Vers: Souches N2 ð ponte à 25°C ð confusion des générations Souches Fer-15 ð ponte à 15°C, stérile à 25°C ¤ Vers: Influence du milieu de culture sur la virulence [sorbitol] ð osmolarité ð sécrétion de toxines ¤ Répartition manuelle des vers ð Mort lors du transport ¤ Chez bactérie, régulation de facteurs de virulence est stricte notamment Tre ð Or 25°C ð certains facteurs ne sont pas exprimés ¤ Absence de système immunitaire adaptatif Or nombreux facteurs de virulence contournent ou neutralisent la réponse immunitaire de l’hôte Modèles in vitro et in vivo d’étude de la virulence bactérienne 4) Exemples d’études in vivo de la virulence bactérienne Etude de la virulence des souches d’E. coli multirésistantes: cas des E. coli CTX-M (BLSE) Canton, Curr Opin Microbiol, 2006 Antibiotiques actifs contre E. coli uropathogènes Fluoroquinolones: Ofloxacine, Ciprofloxacine Cystite Cotrimoxazole Céphalosporines de 3ème génération: Céfotaxime, Ceftriaxone Pyélonéphrite Aminosides: Amikacine Antibiotiques actifs contre E. coli CTX-M Fluoroquinolones: Ofloxacine, Ciprofloxacine Cystite Cotrimoxazole Céphalosporines de 3ème génération: Céfotaxime, Ceftriaxone Pyélonéphrite Aminosides: Amikacine Diffusion mondiale de souches d’E. coli productrices de CTX-M-15 Caractéristiques: Infections urinaires +++ Portage digestif chez les sujets sains Communautaire Schwaber et al, AAC 2006 Problématique ð Étude de la Relation Résistance/Virulence des E. coli uropathogènes dans le but: - de connaître le potentiel de virulence de ces bactéries - d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques Relation Virulence-Résistance F J. Vila et al. (JID, 2004), J. Johnson et al. (AAC, 2005) Relation inverse entre Résistance aux Quinolones/FluoroQ et Virulence F Branger et al. (Emerg Inf Dis, 2005): Association entre CTX-M et résistance aux FQs et absence de Facteurs de virulence (basée sur 4 FVs) Conclusion: Relation entre Résistance et Virulence basée sur la présence/absence de FVs Aucun modèle animal développé pour étudier cette relation in vivo Etude de la virulence des souches d’E. coli multirésistantes Étude in vitro Résistantes Étude in vivo: Modèle C. elegans 100 Sensibles OP 50 DL50 = 10.33 Mort 14.5 jr 90 < 5 FVs 6-9 FVs >10 FVs 13 1 0 TEM Total R 9 10 0 22 11 0 80 27 53 19 70 (p < 0.05) (p < 0.05) % Survival CTX-M CTX-M DL50 = 5.95 Mort 12.5 jr 60 50 40 30 20 10 TEM DL50 = 4.66 Mort 10.25 jr S DL50 = 3.01 Mort 7.5 j 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Time of exposure (days) Les souches d’E. coli productrices de CTX-M sont moins virulentes que les souches sensibles Lavigne et al, Clin Microbiol Infect, 2006 14 15 Etude de la virulence des souches d’E. coli multirésistantes Embryon de zebrafish après 2h d’inj. par souche d’E. coli S Embryon de zebrafish après 3j d’inj. par souche d’E. coli CTX-M Les souches d’E. coli productrices de CTX-M sont moins virulentes que les souches sensibles Lavigne et al, PLoS ONE, 2011 Etude de la virulence des souches d’E. coli multirésistantes Les souches d’E. coli productrices de CTX-M sont responsables d’une infection persistante du fait d’un tropisme neurologique Les infections urinaires et les E. coli producteurs de CTX-M " La capacité de tuer les nématodes et les embryons de poisson est significativement corrélée à la présence de FVs; les souches sensibles aux ATB tuant plus rapidement que les souches sécrétrices de BLSE. # Les profils moléculaires de virulence et le comportement in vivo suggèrent que les souches nosocomiales d’E. coli uropathogènes sécrétrices de CTX-M, bien qu’adaptées pour survivre dans un environnement riche en ATB comme à l’hôpital, ont un potentiel modéré de virulence (Terrain +++) Lavigne et al, Clin Microbiol Infect, 2006 Etude de la virulence de Staphylococcus aureus isolé de plaie chronique Plaie chronique: Perte de substance d'étiologies diverse n'ayant pas tendance à cicatriser spontanément dans un délai de six semaines Trois entités cliniques: Pied Diabétique Escarre de décubitus Ulcère de jambe Problématique: le diagnostic des infections des plaies chroniques Colonisation è Infection localisée è Infection généralisée Ostéite Pas de traitement ATB Traitement ATB Focus sur les souches de S. aureus isolées de plaies chroniques S. aureus et infection cutanée PENETRATION COLONISATION Epiderme MULTIPLICATION ECHAPPEMENT AUX DEFENSES DE L’HÔTE EXTENSION LOCALE: Derme, hypoderme, Annexes (Os) DISSEMINATION: Métastases septiques www.microbes-edu.org/etudiant/staph.html Problématique: intérêt de nouveaux biomarqueurs dans le diagnostic des infections des plaies chroniques Colonisation è Infection localisée è Infection généralisée Ostéite Pas de traitement ATB Traitement ATB Traitement ATB Peau et Tss mous Traitement ATB Os Surconsommation d’ATB = Émergence de BMR Notion de colonisation et d’infection The image cannot be displayed. Your computer may not have enough memory to open the image, or the image may have been corrupted. Restart your computer, and then open the file again. If the red x still appears, you may have to delete the image and then insert it again. Colonisation Infection FProcessus physiologique F Processus pathologique F Présence de bactéries sur le revêtement cutané sans provoquer de dommage pour l’hôte F Modification de la flore cutanée F Bactéries peu virulentes: Flore bactérienne résidente = Flore commensale Flore bactérienne transitoire = Portage de bactéries pathogènes F Manifestations cliniques +++ Extension: os+++ F Bactéries virulentes Bactéries colonisantes / infectantes: Modèle du staphylocoque doré Les souches isolées des plaies chroniques infectées sont significativement plus virulentes que les souches isolées des plaies colonisées 4,5 4 3,5 p<0.05 p<0.05 p<0.05 LT50 (day) 3 2,5 2 Bactéries infectantes 1,5 1 0,5 0 1 2 Grade 1 3 4 5 Grade 2 6 7 8 Grade 3 9 10 11 12 Grade 4 Bactéries colonisantes Marqueurs génétiques: cap8 : bact. colonisantes sea, sei, lukDE, hlgv, edin : bact. infectantes Sotto et al, Diabetes Care, 2007; Sotto et al, Diabetes Care, 2008; Richard et al, Diabetes Metab, 2008; Sotto et al, Diabetes Care, 2012; Messad et al, Clin Microbiol Infect, 2012 (sous presse) Interactions bactériennes et virulence Etude de l’interaction entre S. aureus et Helcococcus kunzi et impact sur la virulence Sotto et al, Diabetes Care, 2007; Sotto et al, Diabetes Care, 2008; Richard et al, Diabetes Metab, 2008; Sotto et al, Diabetes Care, 2012; Messad et al, Clin Microbiol Infect, 2012 (sous presse) Conclusions Comprendre la virulence des bactéries Outils Thérapeutiques Intérêt majeur de nouveaux modèles Génome bien caractérisé, temps de génération rapide Descendance nombreuse, facilité d’élevage C. elegans très intéressant Zebrafish avenir D’autres modèles: embryon de poulet, Arabidopsis thaliana…
